MIKROSKOPIE

Griechisch

mikro = klein

skopien = zu beobachten

“Das Beobachten von kleinen Objekten“

PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - I

MIKROSKOPISCHE VERFAHREN PRODUZIERENLEDIGLICH KONTRASTUNTERSCHIEDE IM ENDBILD

LM: Selektive Absorption daher Färbung

EM: Unterschiedliche Bindung Schwermetallatome; grundsätzlich Schwarz-Weiß wegen der Wellenlänge

PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - II

INTERAKTIONEN ZWISCHEN STRAHL UND DEM OBJEKT

- Unterschiedliche Absorption (Änderung der Amplitude) Normale Lichtmikroskopie

- Unterschiedliche Geschwindigkeit (Änderung der Wellenlänge) Phasenkontrastmikroskopie

- Unterschiedliche Brechungsindizes (Änderung in Schwingungsrichtung) Polarisationsmikroskopie

-Unterschiedliche Streuungskapazitäten (Einlagerung vonSchwermetallatomen) Transmissionselektronenmikroskopie

MIKROSKOPISCHEMETHODEN:EIN ÜBERBLICK

KONTRASTERZEUGUNG IN DER LMie

1. MITTELS AMPLITUDEN-ÄNDERUNG

DURCH UNTERSCHIEDLICHEN ABSORPTIONEN

- Natürlich vorkommende Chromophoren (z.B. Chlorophyll)- Zellfremde Chromophoren (z.B. Safranin, Resorcinblau)

Durch Anwendung von:

- Chromophoren (z.B. Vital-Farbstoffe)

- Chromophor-Konjugaten (z.B. fluoreszierende Antikörper, Green Fluorescent Protein)

Absorption: „kurzwellig“Austrahlung: „langwellig“

KONTRASTERZEUGUNG IN DER LMie

2. MITTELS FLUORESZENZ

FLUORESZENZMIKROSKOPIE

„CONFOCAL LASER SCANNING“ MIKROSKOPIE -1

„CONFOCAL LASER SCANNING“ MIKROSKOPIE - 2

FLUORESZIERENDE PROTEINE

Aequorea victoria

GFP- MolekuleLebende Bakterien die 8 verschiedenenFluorescent-Proteine exprimieren

Grün: Mikrotubuli Rot: Chloroplasten

SCHLIESSZELL-PAAR (BLATT EPIDERMIS)

KONTRASTERZEUGUNG IN DER LMie

1. MITTELS PHASEN-VERSCHIEBUNG

NORMALES LM PHASEN KONTRAST

PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE

DIFFERENZIELLE INTERFERENZKONTRAST MIKROSKOPIE (DIC)

KONTRAST-ERZEUGUNG IM EM -I

Schwermetallatome verursachen einerStreuung von Elektronen. Solche Elektronen werden durch eine Ringblendevom Endbild ausgegrenzt

KONTRASTERZEUGUNG IN DER EMie

Durch Streuung auf Grund von Schwermetallatomen.

Abgelenkte Elektronen werden abgeschirmt undTragen nicht zum Endbild bei.

KONTRASTIERUNGSMÖGLICHKEITEN IN DER ELEKTRONENMIKROSKOPIE

- EINFÜHRUNG/AUFTRAGEN VON SCHWERMETALLEN

z.B. Blei, Gold, Osmium, Uran, Platin

- ART DER ZUGABE (PRÄPARATIONSVORGANG):

Positivkontrastierung (Ultradünnschnitte)

Negativkontrastierung (Suspensionspräparate)

(Schräg)Bedampfung (Gefrierbruch)

HERSTELLUNGVON ULTRADÜNN-SCHNITTENFÜR DIE EMie

DER GOLGI-APPARAT IM DÜNNSCHNITT

BEARBEITUNG VON SUSPENSIONS -PRÄPARATEN FÜR DIE EMie

a) Bedampfung b) Negativkontrastierung

DER GOLGI-APPARAT NACH NEGATIVE KONTRASTIERUNG

DIE GEFRIER-BRUCHMETHODE

- Supra-schnelles Einfrieren- Aufbrechen- Abdrück-Herstellung

DER GOLGIAPPARAT NACH GEFRIERBRUCH

BESONDERHEITEN DER ELEKTRONENMIKROSOPIE

VORBEDINGUNGEN FORDERUNGEN AN INTERPRETATIONS- DAS PRÄPARAT PROBLEME

Vakuum Wasserfrei (Tot!!) Zelldynamik

Durchdringlichkeit Probendicke (<100 nm) Zellrekonstruktion

Wechselwirkung Schwermetall- Zellstrukturmit dem e-Strahl kontrastierung

PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - III

KEINE VERGRÖßERUNG OHNE FOKUSSIERUNG!

LM - Sammellins aus Glas EM - Elektromagnetische Polschuhlinse

MAßSTÄBE IN DER MIKROSKOPIE - I

AUFLÖSUNGSVERMÖGEN

Definition: Der Begriff AV bezeichnetdie Unterschiedbarkeit feiner Strukturen,also den kleinst- und noch wahrnehmbarenAbstand zweier Punkte.

d = 0,5 d = Auflösungsvermögen;

sin = Wellenlänge = halber Öffnungswinkel

d (Auge) = 0.1 mm d (LM) = 500 nm ( = 600 nm; = 70-80º)d (EM) = 0.3 nm ( = 0.004 nm; = 0°20‘)

MAßSTÄBE IN DER MIKROSKOPIE - II

VERGRÖßERUNG

Numerisch: Objektiv x (Zwischenlins) x Okular

LM: 100 20 = 2000

EM: 50 20 20 20 = 400,000

„Brauchbare Vergrößerung“:

Die Vergrößerung ber der die Auflösungsvermögen erreicht ist.Darüber hinaus gibt es keine Verbessurung der Auflösung!

ART DER MIKROSKOPIE

„DURCHSTRAHL“: Transmissionsmikroskopie (LM; EM)

Normale EMie (bis 120 kVolt) Hochspannungs EMie (1-2 mVolt)

„RASTERSTRAHL“: Confocal-Laser Scanning Mikroskopie (CLSM)

Raster-Elektronenmikroskopie (SEM/REM)

TRANSMISSIONSMIKROSKOPIE

EM LM

MIKROSKOPIE: Raster-EM

MIKROSKOPIE ALS SOZIALES WISSENSCHAFT