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Mikrobio Skript Mittelstufe - helmholtz- · PDF fileBeim mikrobiologischen Arbeiten...

Date post:18-Sep-2018
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  • Kleines Mikrobiologisches Praktikum Skriptum

    Skriptversion: 28.06.2005

    Name: Datum:

  • Groes Mikrobiologisches Praktikum fr Leistungskurse Biologie Warum soll man Obst vor dem Essen waschen? Ist Zhneputzen wirklich ntig? Warum reicht Hnde waschen allein nicht, sondern ist auch das Abtrocknen enorm wichtig? berall in unserer Umwelt befinden sich Bakterien, die unser Leben stndig beeinflussen. Ziel der Versuche in diesem groen, mikrobiologischen Praktikum ist es, den Schlerinnen und Schlern die Mglichkeit zu geben, den experimentellen Umgang mit Bakterien im Labor zu erproben. Zustzlich lernen die Leistungskursler das Verfahren der Genbertragung durch Plasmide als modernes Instrument in der biochemischen Forschung kennen. Experimente 1. Prinzipien des sterilen Arbeitens / Herstellung von Agarplatten 2. Nachweis und Auswertung von Luftkeimen 3. Nachweis und Auswertung von Keimen in verschiedenen Wassersorten 4. Mikroskopieren von Bakterien 5. Frbung von Bakterien 6. Bakterien am Krper und Hygieneregeln 7. Wachstum von Bakterien Inhalte: Markus Frg, Dirk Stiebler, Udo Kummer, Melanie Odenigbo Copyrights 2004: GSF-Forschungszentrum fr Umwelt und Gesundheit GmbH, Neuherberg

  • Mikrobiologie Versuch 1A Steriles Arbeiten

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    Grundstze fr mikrobiologisches (steriles) Arbeiten Mikroorganismen sind allgegenwrtig. Um Kulturen, sterile Lsungen und sterile Gerte vor Verunreinigungen (Kontaminationen) zu schtzen, mssen einige Regeln beachtet werden. Nur so knnen korrekte mikrobiologische Ergebnisse gewhrleistet werden. Unter Sterilitt (v. lat. steril: keimfrei, unfruchtbar) versteht man den Zustand absoluter Keimfreiheit (= Nichtvorhandensein vermehrungsfhiger Mikroorganismen). Dazu bedient man sich physikalischer und chemischer Verfahren. In den nachfolgenden Arbeitsschritten fhrst Du die verschiedenen Sterilisationsverfahren durch. Als physikalisches Sterilisationsverfahren verwendet man das Autoklavieren (v. lat. clavis: Schlssel, Riegel). Diese Methode wird zur Sterilisation von hitzestabilen Kulturmedien, Lsungen und Gegenstnden, die eine Temperatur ber 130 C nicht vertragen (z. B. Plastik), verwendet. Die zu sterilisierenden Gegenstnde werden fr mindestens 20 Minuten einer Wasserdampfatmosphre von 121 C ausgesetzt; vergleichbar ist dies mit einem Dampfdrucktopf. Bei der Desinfektion hingegen wird nicht immer ein vollstndiges Abtten pathogener (krankheitserregender) Keime erzielt, sondern erreicht oftmals nur eine Reduzierung (Verminderung) der Keimzahl.

    Material: Petrischalen, Impfse, Drygalsk ispate l, Reagenzglser mit Steril isierk appen, Bunsenbrenner, Pasteur pipetten

    Chemik alien: Desinfektionsmittel, Seife

    Versuchsablauf Bemerkungen

    1. chemisches Verfahren:

    Hndedesinfektion (nur wenn ohne Handschuhe gearbeitet wird) Vor und nach jedem mikrobiologischen Arbeiten mssen die Hnde mit speziell dafr vorgesehenem Desinfektionsmittel desinfiziert werden.

    Hnde erst mit Seife waschen, dann desinfizieren. Beispiele fr andere chemische Sterilisationsmittel sind: Antibiotika, C hemotherapeutika etc

    2. physikalisches Verfahren: Arbeitsmaterialdesinfektion. Beim mikrobiologischen Arbeiten mssen die verwendeten Arbeitsgerte und -materialien jeweils vor und nach Gebrauch sterilisiert werden, so dass man keine Keime auf das zu untersuchende Objekt verschleppt.

    Wege der physikalischen Sterilisation: A. Temperatur: ausglhen, abflammen B. mechanisch: filtrieren C. Strahl ung: radi oaktiv, UV

    2 a) AUSGLHEN Sterilisation der Impfse durch Ausglhen in einer Flamme: Entznde den Bunsenbrenner. Halte dann die Impfse schrg nach unten in den nicht leuchtenden Teil der Flamme bis sie glht. Ziehe danach den Impfsenhals einige Male durch die Flamme. Anschlieend lass die Impfse abkhlen, bevor du Material aufnimmst.

    Impfse: Werkzeug zur Entnahme von kleinen Mengen Kultur material, sowie zum Bei mpfen von Kultur medien.

  • Mikrobiologie Versuch 1A Steriles Arbeiten

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    2 b) ABFLAMMEN

    Tauche den Drygalskispatel kurz in das abgedeckte Becherglas mit Alkohol. Verschliee das Becherglas wieder mit der Petrischale. Entznde den Drygalskispatel nur kurz an der Bunsenbrennerflamme und halte dabei den brennenden Drygalskispatel neben dem Bunsenbrenner leicht schrg nach unten bis die Flamme erlischt. Anschlieend nimm die Schraubverschlussflasche mit dem sterilen Wasser. ffne die Flasche neben der Bunsenbrennerflamme und zieh die Flaschenmndung kurz zweimal durch die Flamme. Gie jetzt etwas Wasser aus, zieh die Flaschenmndung und die Innenseite des Verschlusse s wieder kurz durch die Flamme und verschliee die Flasche. MERKE DIR!!! Je schneller du arbeitest, desto lnger bleiben die verwendeten Materialien steril.

    Drygalskisp atel: Werkzeug zum Ausstreichen von Kultur material auf Nhrbden in Petrischalen. Glasgerte knnen nicht ausglhen, sie knnen nur oberflchlich s terilisiert werden.

  • Mikrobiologie Versuch 1B Steriles Arbeiten

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    Herstellung von Agarplatten

    Du brauc hst: Kulturmedium (Nhragar), Bunsenbrenner, Petrischalen, Arbeitshandschuhe

    Versuchsablauf Bemerkungen

    Das Kulturmedium (Nhragar) wurde von uns schon durch Autoklavieren sterilisiert und in Schraubverschlussflaschen vorbereitet. Besorge dir den frisch aufgekochten Nhragar aus der Mikrowelle.

    Kultur medi um = ein N hrboden, der die fr das Bakterienwachstum nti gen Stoffe beinhaltet. Hier: Nhragar = enthlt ei nen Fleischextrakt als Bakteriennahrung und Agar zum F estwerden des Nhrbodens

    1. Verschluss der Schraubverschlussflasche vorsichtig entfernen

    und Rand kurz abflammen. Arbeitshandschuhe tragen!!!

    2. Insgesamt acht Petrischalen (jede Gruppe) neben dem

    Bunsenbrenner bereitstellen. Die Wrme der Flamme lsst Luft aufsteigen und bewirkt, dass bei m Eingie en des Kultur mediums keine Kei me aus der Luft hineinfall en knnen.

    3. Deckel der Petrischalen anheben und soviel eingieen, dass der

    gesamte Boden vollstndig bedeckt ist (ca. 30 ml). Whrend des Gieens den Deckel der Petrischale schrg ber das Unterteil halten.

    Das Halten des D eckels whrend des Gieens soll verhi ndern, dass sich Kei me aus der Luft i n den N hrboden mischen.

    4. Eventuell entstandene Luftblschen durch kurzes Befcheln (von

    oben) mit der entleuchteten Bunsenbrennerflamme entfernen.

    5. Deckel schrg auflegen und in waagrechter Position erstarren

    lassen. (ca. 5 min) Dies soll verhindern, dass Kondensw asser vom Deckel i n die Platten tropft und Bakterien wegschwemmt

    Die Petrischalen nicht mehr bew egen, da sonst der Nhragar nicht erstarrt.

    6. Nach Erkalten und Erstarren des Nhrmediums (erkennbar an einer leichten Trbung des Nhragars) werden die Petrischalen umgekehrt, mit Deckel nach unten und Boden nach oben, aufgestellt und fr Versuch 2 verwendet.

  • Mikrobiologie Versuch 2 Luftkeime

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    Nachweis von Keimen in der Luft

    A) Beimpfen der Platten (Versuche A und B mssen nacheinander durchgefhrt werden) Definitionen: Beimpfen: Behandeln einer Lsung durch Ei nbringen von Kei men Inkubation: [v. lat . incubar e: in ( oder auf) etwas liegen] die Bebr tung, entwicklungsfrdernde Er wrmung v.a. von Z ellen und Organismen

    Material: Kulturmedium in Petrischalen, Folienstifte, Stoppuhr

    Versuchsablauf Bemerkungen

    Vorarbeiten: Die Beschriftung der Agarplatten erfolgt ausschlielich auf der Unterseite der Petrischale. Zu notieren sind:

    - der Versuch (Nw von Luftkeimen) - das Datum, an dem die Platte beimpft worden ist - Standort (z.B. Tisch innen, Boden, Fensterbank,) - Expositionszeit

    1. Stelle alle drei Agarplatten an einem Platz auf, z.B.

    - im Abzug oder - auen auf der Fensterbank oder - innen an einem Arbeitstisch oder - etc. (eigene Ideen!)

    2. ffne die Agarplatten gleichzeitig und starte den Countdown auf

    der Stoppuhr. Verschliee nach 30, 60 und 90 min die jeweilige Agarplatte.

    Bereite die Stoppuhr vor!

    3. Zum Abschluss drehe die Agarplatten um, mit Deckel nach unten

    und Boden nach oben.

    4. Gib die fertig beschrifteten Agarplatten in den Brutschrank. Die

    Platten werden dann bei 30 C fr 2-3 Tage inkubiert (bebrtet). Positioniere die Agarplatten folgendermaen: Der Boden der Agarplatte muss leicht schrg auf dem Deckel zu liegen kommen. Bitte Betreuer fragen!!!

    Fragen: 1. Warum werden die Petrischalen v or der Auswertung mit Tesafilm v erschlossen? 2. Wie entsteht eine Kolonie von Keimen auf der Agarplatte? Begrnde!

  • Mikrobiologie Versuch 2 Luftkeime

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  • Mikrobiologie Versuch 2 Luftkeime

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    Nachweis von Keimen in der Luft

    B) Auswertung der inkubierten Platten

    Definition Kolonien-Morphologie: (Morphologi e: Lehr e von der Struk tur und For m der Or ganismen; v. griech. Lehre von der Gestalt) Das Wach stum von Keimen auf Agarplatten resultiert in der Bildung von Kolonien, die ein ganz verschiedenartiges Aussehen haben knnen. Diese Kolonien-Morphologie ist oft sehr charakteristisch fr entsprechende Bakterien und kann zur groben ersten Identifizierung einen ersten Anhaltspunkt bieten.

    ACHTUNG!!! Bitte achte darauf, dass du die inkubierten Agarplatten v or der Auswertung sorgfltig am Rand mit Tesafilm zuklebst. Es knnten sich eventuell pathogene Keime in grerer Menge gebildet haben und dich infizieren!

    Material ien: bewac hsene Platten der Vor gruppen, Farbatlas der Mikrobio log ie

    Arbeitsgang Bemerkungen

    1. Besorge dir drei bebrtete Anstze (30, 60, 90 min) eines

    bestimmten Standortes und notiere Datum und Versuch. Verschliee die Platten bev or du sie auswertest, indem du den gesa

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