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MADX-IFU-CUS-501-DE, R04 2016/09

MassARRAY Dx Colon Panel Gebrauchsanweisung, MADX-IFU-CUS-501-DE, R04 2016/09

Das MassARRAY® Dx Colon Panel ermöglicht die Erkennung und Identifizierung der häufigsten

KRAS-, BRAF-, NRAS- und PIK3CA-Genmutationen, die das Ansprechen auf Therapien gegen

Kolorektalkarzinome beeinflussen, unter Verwendung des MassARRAY® Dx Systems (Agena

Bioscience, Inc., San Diego, California, USA), basierend auf der MALDI-TOF-Massenspektrometrie

(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight).

Für die Verwendung zur In-vitro-Diagnostik

40110

120 Tests

2016/09

Agena Bioscience GmbH

Mendelssohnstr. 15d – 22761 Hamburg, Deutschland

Amtsgericht Hamburg HRB 57315

Tel. +49 (0)40 899 676 0 Fax +49 (0)40 899 676 10

[email protected] www.agenabio.com

www.agenabio.com

mailto:[email protected]

http://www.agenabio.com/

2

MassARRAY® Dx Colon Panel 40110 MADX-IFU-CUS-

501-DE, R04 2016/09

INHALT

1) VERWENDUNGSZWECK .......................................................................................................................................... 3

2) VERFAHRENSPRINZIP ............................................................................................................................................. 3

3) KLINISCHE BEDEUTUNG ......................................................................................................................................... 3

4) MITGELIEFERTE REAGENZIEN ............................................................................................................................... 4

5) ERFORDERLICHE GERÄTE UND AUSSTATTUNG (NICHT IM LIEFERUMFANG)................................................. 7

6) ERFORDERLICHE ZUSÄTZLICHE AUSSTATTUNG (NICHT IM LIEFERUMFANG)................................................ 8

7) ONLINE VERFÜGBARE DOKUMENTE ..................................................................................................................... 8

8) STABILITÄT UND LAGERUNG.................................................................................................................................. 9

9) SYMBOLE .................................................................................................................................................................. 9

10) GRENZEN DER VERWENDUNG DES PRODUKTES ........................................................................................ 10

11) VORSICHTSMAßNAHMEN UND ANFORDERUNGEN AN DIE HANDHABUNG ............................................... 10

12) ANALYSEVERFAHREN ...................................................................................................................................... 11

A. AUSWAHL DER BIOLOGISCHEN PROBEN ...................................................................................................... 12

B. DNA-EXTRAKTION ............................................................................................................................................. 12

C. AMPLIFIKATION .................................................................................................................................................. 13

D. BEHANDLUNG MIT SAP ..................................................................................................................................... 14

E. EXTENSIONSREAKTION MIT IPLEX PRO ......................................................................................................... 16

F. KONFIGURATION DER PLATTE IN DER TYPER-SOFTWARE ......................................................................... 18

G. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY ......................................... 20

H. SPEKTRENAUFZEICHNUNG IM MASSARRAY DX ANALYZER ....................................................................... 27

I. ERGEBNISANALYSE .......................................................................................................................................... 31

13) GRENZEN DES VERFAHRENS .......................................................................................................................... 37

14) FEHLERBEHEBUNG ........................................................................................................................................... 37

15) VALIDIERUNGSTESTS ....................................................................................................................................... 44

16) ANHANG A: LISTE DER MIT DEM MASSARRAY DX COLON PANEL DETEKTIERBAREN MUTATIONEN .... 47

17) ANHANG B: VERWENDUNG DER RECALL-FUNKTION ................................................................................... 51

18) ANHANG C: ERSTELLUNG EINER XML-DATEI ................................................................................................ 52

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501-DE, R04 2016/09

1) VERWENDUNGSZWECK

Das MassARRAY® Dx Colon Panel ermöglicht die Erkennung und Identifizierung der häufigsten KRAS-, BRAF-, NRAS-

und PIK3CA-Genmutationen, die das Ansprechen auf Therapien mit monoklonalen Antikörpern gegen EGFR (Anti-

EGFR MoAb) beim Kolorektalkarzinom beeinflussen.

Der hohe Multiplexgrad des MassARRAY Dx Colon Panel basiert auf der iPLEX®-Reaktion zur Einzelbasenverlängerung

und der MALDI-TOF-Massenspektrometrie (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) im MassARRAY®

Dx System (Agena Bioscience, Inc., San Diego, California, USA).

In Anhang A „Liste der detektierbaren Mutationen“ sind die Mutationen aufgeführt, die mit dem MassARRAY Dx Colon

Panel erkannt werden können.

2) VERFAHRENSPRINZIP Das MassARRAY Dx Colon Panel ermöglicht die Erkennung der häufigsten somatischen Mutationen, die das

Therapieansprechen beim Kolorektalkarzinom beeinflussen. Die aus Tumorgewebe extrahierte DNA wird in einer

Multiplex-PCR amplifiziert. Hierbei werden mithilfe von 8 verschiedenen Primer-Gemischen (Primer Mixes) Fragmente

gewonnen, die alle relevanten polymorphen Genloci beinhalten. Die Amplifikationsprodukte werden mit Shrimp Alkaline

Phosphatase behandelt (SAP-Reaktion), um Nukleotidreste zu inaktivieren. Dem folgt eine Primer-Verlängerungs-

reaktion (iPLEX-Reaktion) in Anwesenheit von Extensionsprimern neben jedem polymorphen Locus und von

massenmodifizierten Stopp-Nukleotiden (Termination Mix). Zu jedem polymorphen Locus werden daher ein oder

mehrere Analyte gewonnen, deren Masse bekannt ist. (Sie entspricht der Summe der Massen des Extensionsprimers

und des massenmodifizierten Stopp-Nukleotids, die am polymorphen Locus eingefügt werden.) Die Analyse im

Massenspektrometer liefert jeweils einen Peak bei der bekannten Masse dieser Analyten, von denen jeder mit einem

bestimmten vollständig oder partiell mutierten Genotyp eines Wildtyps aus der analysierten Probe verknüpft ist.

3) KLINISCHE BEDEUTUNG

Das MassARRAY Dx Colon Panel ermöglicht die Erkennung und Identifizierung der häufigsten Mutationen der Gene

KRAS (Codons 12, 13, 59, 61, 117, 146), BRAF (Codons 594, 600, 601), NRAS (Codons 12, 13, 18, 59, 61, 117, 146)

und PIK3CA (Codons 38, 81, 88, 93, 108, 118, 345, 420, 539, 542, 545, 546, 549, 1021,1025, 1043, 1047, 1049), die

den Erfolg von Therapien mit monoklonalen EGFR-Antikörpern beim Kolorektalkarzinom beeinflussen können.

Das KRAS-Gen weist bei ca. 35 % aller Kolorektalkarzinome eine Mutation auf. Bei den betreffenden Patienten

beeinträchtigt die Daueraktivierung des KRAS-Proteins das Ansprechen auf Anti-EGFR-Therapien mit monoklonalen

Antikörpern, die gegen den EGF-Rezeptor (Epidermal Growth Factor Receptor) gerichtet sind, wie Panitumumab oder

Cetuximab1–4.

Aktuelle klinische Studien haben gezeigt, dass Patienten mit metastasiertem Kolorektalkarzinom und einer Mutation in

den KRAS- oder NRAS-Exons 2, 3 oder 4 nicht auf Anti-EGFR-Therapien ansprechen. Bei diesen Mutationen handelt es

sich in der Regel um exklusive (sich gegenseitig ausschließende) Mutationen.5

Das mutierte BRAF-Gen ist bei ca. 10 % der Patienten mit Kolorektalkarzinom vorhanden und scheint für die Fälle

verantwortlich zu sein, in denen Patienten mit dem KRAS-Gen vom Wildtyp nicht auf eine Anti-EGFR-Therapie

ansprechen.6, 7

Der Mutationsstatus des PIK3CA-Gens erlaubt die Identifizierung einer zusätzlichen Gruppe von Patienten mit

Darmkrebs mit Wildtyp-KRAS, deren Erkrankung gegen Anti-EGFR-Therapien resistent ist.8–10 Im Unterschied zu den

KRAS-, BRAF- und NRAS-Genen schließen sich Mutationen des KRAS- und des PIK3CA-Gens nicht gegenseitig aus.

Der Mutationsstatus der Tumor-DNA eines Patienten bildet somit einen wesentlichen Faktor für die Wahl des geeigneten

Therapiekonzepts.

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501-DE, R04 2016/09

Literatur

1. Lievre A et al., KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer

Res 66:3992–3995 (2006).

2. Amado RG et al., Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer.

J Clin Oncol 26:1626–1634 (2008).

3. Van Krieken JHJM et al., KRAS mutations testing for predicting response to anti-EGFR therapy for colorectal

carcinoma: proposal for an European quality assurance program. Virchows Arch (2008).

4. Raccomandazioni per l’analisi mutazionale del gene KRAS nel carcinoma del colon-retto (AIOM-SIAPEC-IAP

Aggiornamento, 10.11.2010).

5. Douillard JY et al., Panitumumab-FOLFOX4 treatment and RAS mutations in colorectal cancer. New England

Journal of Medicine 369;11 (2013).

6. Benvenuti S et al., Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic

colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res 67:2643-2648 (2007).

7. Di Nicolantonio F et al., Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic

colorectal cancer. J Clin Oncol 26: 5705–5712 (2008).

8. Sartore-Bianchi A, Martini M, Molinari F, Veronese S, Nichelatti M, Artale S, Di Nicolantonio F, Saletti P, De

Dosso S, Mazzucchelli L, Frattini M, Siena S, Bardelli A. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with

clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer Res. 69(5): 1851–7 (2009).

9. Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, Nichelatti M, Molinari F, De Dosso S, Saletti P, Martini M, Cipani T,

Marrapese G, Mazzucchelli L, Lamba S, Veronese S, Frattini M, Bardelli A, Siena S. Multi-determinants analysis of

molecular alterations for predicting clinical benefit to EGFR-targeted monoclonal antibodies in colorectal cancer.

PLoS One. 4(10):e7287 (2009).

10. Perrone F, Lampis A, Orsenigo M, Di Bartolomeo M, Gevorgyan A, Losa M, Frattini M, Riva C, Andreola S,

Bajetta E, Bertario L, Leo E, Pierotti MA, Pilotti S.PI3KCA/PTEN deregulation contributes to impaired responses to

cetuximab in metastatic colorectal cancer patients. Ann Oncol. 20(1):84–90 (2009).

4) MITGELIEFERTE REAGENZIEN Das MassARRAY Dx Colon Panel enthält alle erforderlichen Reagenzien für die Durchführung von 120 Tests, aufgeteilt

in 10 unabhängige Analysen mit jeweils 10 klinischen Proben und 2 Reaktionskontrollen.

Box Mitgelieferte Reagenzien und Komponenten Menge

Box 1/4

MassARRAY® Dx Colon Panel

Verbrauchsmaterialien für die

Amplifikation

P/N 40111

Verwendung:

AMPLIFIKATIONSUMGEBUNG

Lagertemperatur: +2/+35 °C

SQ tube 1.5

1,5-ml-Röhrchen für die Herstellung des PCR-Mastermix 1 x 25 Stück

SQ 8-strip tubes & caps

8er-Streifen von Reaktionsgefäßen mit Deckeln für

Analysen mit weniger als 10 klinischen Proben

1 x 10 Stück

SQ 8-strip caps

Zusätzliche Deckel für 8er-Streifen 1 x 20 Stück

SQ plate – skirted

Reaktionsplatte mit 96 Vertiefungen für das gesamte

Analyseverfahren

4 x 5 Stück

SQ sealing foil

Selbsthaftende Abdeckfolien für die 96-Well-

Reaktionsplatte (SQ plate – skirted)

4 x 5 Stück

SQ pipette tips 10

10-µl-Spitzen für das Aufbringen von Reagenzien und

Proben auf die Reaktionsplatte (SQ plate – skirted) mithilfe

einer Mehrkanal-Pipette

4 x 96 Stück

SQ AMP rack

96er-Plattenständer zur Platzierung der Reaktionsgefäß-

Streifen „Colon status AMP strip II“

1 x 1 Stück

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19223544?itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum&ordinalpos=3






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501-DE, R04 2016/09

Box 2/4


Verbrauchsmaterial für die Extension

P/N 40112

Verwendung:

POSTAMPLIFIKATIONSUMGEBUNG

Lagertemperatur: +2/+35 °C

SQ tube 1.5

1,5-ml-Röhrchen für die Herstellung des SAP-Cocktails

und des Extensions-Mastermix

1 x 25 Stück

SQ 8-strip tubes & caps

8er-Streifen von Reaktionsgefäßen mit Deckeln für

Analysen mit weniger als 10 klinischen Proben

1 x 10 Stück

SQ 8-strip caps

Zusätzliche Deckel für 8er-Streifen 1 x 20 Stück

SQ sealing foil

Selbstklebende Folien zum Abdecken der

Reaktionsplatte

16 x 5 Stück

WATER MS plus

DNase/RNase-freies Wasser, ideal für die

Massenspektrometrie, zum Verdünnen der

Extensionsprodukte vor der Behandlung mit

Ionenaustauscher-Harz und zum Ausspülen des

Reservoirs für die Kalibriersubstanz

4 x 20 ml

0.1 M NaOH

Für die wöchentliche Pflege der Nanodispenser-Nadeln

zu verwendende Lösung (Anleitung siehe MassARRAY

Dx Nanodispenser RS1000 Benutzerhandbuch)

1 x 25 ml

SQ repeater tip 0.1

Spitzen für Mehrfachdispenser zum Aufbringen des

SAP-Cocktails

4 x 5 Stück

SQ pipette tips 10

10-µl-Spitzen zur Verwendung mit einer Mehrkanal-

Pipette für das Aufbringen des

Extensionsreaktionscocktails

10 x 96 Stück

SQ pipette tips 200

200-µl-Spitzen zur Verwendung mit einer Mehrkanal-

Pipette für das Aufbringen von WATER MS plus auf der

Post-iPLEX-Extensionsreaktionsplatte

2 x 96 Stück

SQ reagent tray

Behälter, aus dem WATER MS plus mit einer

Mehrkanal-Pipette auf die Post-iPLEX-

Extensionsreaktionsplatte transferiert wird

4 x 5 Stück

SQ EXT rack

96er-Plattenständer zur Platzierung der Reaktionsgefäß-

Streifen „Colon status EXT strip II“

1 x 1 Stück

SpectroCHIP II G96 & Resin kit

Kit mit einem speziellen Ionenaustauscher-Harz für die

Entsalzung der Proben von Ionen und 10 SpectroCHIP-

Arrays, auf die, mithilfe des MassARRAY Dx

Nanodispensers, die Extensionsprodukte transferiert

werden

1 x 1 Stück

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501-DE, R04 2016/09

Box 3/4


Reagenzien für die

Amplifikation

P/N 40113

Verwendung:

AMPLIFIKATIONSUMGEBUNG

Lagertemperatur:

-35/-20 °C

Colon status AMP strip II

Roter Streifen mit 8 verschiedenen Primer-Gemischen

(Primer Mixes), die Genfragmente von KRAS, BRAF, NRAS,

PIK3CA amplifizieren, in denen alle Loci der zu

analysierenden Mutationen enthalten sind

1 x 10 Stück

Control DNA

Reaktionskontrolle (Amplifikation/SAP/iPLEX-Extension) mit

genomischer DNA (Human) vom Wildtyp für alle Loci der zu

analysierenden Mutationen

4 x 95 µl

WATER (small)

DNase/RNase-freies Wasser für die Herstellung des PCR-

Mastermix und als negative Kontrolle

5 x 0,5 ml

PCR Enzyme

Taq-Polymerase, Enzym für die Herstellung des PCR-

Mastermix

5 x 50 µl

10x PCR Buffer

10x Reaktionspuffer für den PCR-Mastermix 5 x 200 µl

dNTP Mix

Nukleotidgemisch für den PCR-Mastermix 5 x 30 µl

MgCl2

Magnesiumchloridlösung für den PCR-Mastermix

5 x 100 µl

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501-DE, R04 2016/09

Box 4/4


Reagenzien für die Extension

P/N 40114

Verwendung:

POSTAMPLIFIKATIONSUMGEBUNG

Lagertemperatur:

-35/-20 °C

Colon status EXT strip II

Grüner Streifen mit 8 verschiedenen Extensionsprimer-

Gemischen, die zur Erkennung der zu analysierenden

KRAS-, BRAF-, NRAS-, PIK3CA- Mutationen dienen

1 x 10 Stück

WATER

DNase/RNase-freies Wasser für den SAP-Cocktail und

den Extensions-Mastermix

5 x 1,5 ml

SAP Enzyme

Shrimp Alkaline Phosphatase, Enzym für die

Herstellung des SAP-Cocktails

5 x 80 µl

SAP Buffer

Spezifischer Reaktionspuffer für den SAP-Cocktail 5 x 200 µl

Termination Mix

Gemisch aus massenmodifizierten Stopp-Nukleotiden

für die Herstellung des Extensions-Mastermix

5 x 52 µl

Thermosequenase

Thermosequenase, Enzym für die Herstellung des

Extensions-Mastermix

5 x 10 µl

Buffer Plus (10x)

Spezifischer Reaktionspuffer für Thermosequenase, für

die Herstellung des Extensions-Mastermix zu

verwenden

5 x 200 µl

3-Pt Calibrant

Gemisch aus 3 Oligonukleotiden mit bekannter Masse,

das zur Kalibrierung des Massenspektrometers dient

2 x 62 µl

5) ERFORDERLICHE GERÄTE UND AUSSTATTUNG (NICHT IM

LIEFERUMFANG) Materialien Beschreibung

DNA-Extraktion

Reagenzien für die Extraktion

Zur Aufreinigung von DNA aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten

Gewebeschnitten. Kieselgelmembran-basierte Aufreinigung von

Nukleinsäuren aus Geweben, Tupfern, Liquor, Blut, Körperflüssigkeiten

oder aus dem Urin isolierten gewaschenen Zellen

Bei Verwendung von Paraffin-

Schnitten:

Xylen

Reines Ethanol

Xylen für die histologische Verwendung

Analysequalität

Messzylinder Volumen 250 ml

Sterilisierte Spitzen mit DNase- und

RNase-freiem Filter Volumen 1–1000 µl

Pipette Mit einstellbarem Volumen (1–1000 µl)

Handschuhe Puderfreie Einmalhandschuhe

Deionisiertes Wasser Für die Verwendung im Labor (zum Waschen wiederverwendbarer

Verbrauchsmaterialen)

Ethanol Reines Ethanol HPLC-Qualität

Reinstwasser Mit einem Widerstand von 18,2 MΩ/cm

Nukleinsäure-Dekontaminationsmittel

Amplifikation

Labor-Thermocycler mit einem oder

mehreren 96-Well-Thermoblöcken

Geeignet für Mikrotiterplatten mit Rahmen und Rand (full-skirted), mit

Heizdeckel, Temperatur mindestens 105 °C, Deckelanpressdruck

mindestens 120 Newton

UV-Spektrophotometer

Geeignet für Messungen im Spektralbereich von DNA/RNA (260 nm) und

Proteinen (280 nm) und die Berechnung des 260/280-Verhältnisses sowie

für die Handhabung von Mikrovolumina

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501-DE, R04 2016/09

Pipetten

Mindestens eine Reihe Einkanalpipetten mit variablem Volumen zwischen

0,5 und 1000 µl.

Mindestens eine Mehrkanalpipette mit variablem Volumen zwischen 0,5

und 10 µl.

Spitzen DNase- und RNase-freie sterile Filterspitzen, passend für die verwendeten

Pipetten, Volumen zwischen 0,5 und 1000 µl

Mikrozentrifuge für PCR-Platte Zentrifuge, die 96-Well-Platten mit Rahmen aufnehmen kann.

Geschwindigkeit mindestens 1500 rpm.

Postamplifikation

Labor-Thermocycler mit einem oder

mehreren 96-Well-Thermoblöcken

Geeignet für Mikrotiterplatten mit Rahmen (skirted), mit Heizdeckel,

Temperatur mindestens 105 °C, Deckelanpressdruck mindestens

120 Newton

Labor-Zentrifuge

Mit geeignetem Rotor für Mikrotiterplatten (96-Well-Platten mit Rahmen).

Die Geschwindigkeit muss mindestens 560 g betragen. Eine Kühlung der

Proben ist nicht erforderlich.

Pipetten

Mindestens eine Reihe Einkanalpipetten mit variablem Volumen zwischen

0,5 und 1000 µl.

Mindestens ein Mehrfachdispenser, der 2 µl abgeben kann.

Mindestens eine Mehrkanalpipette mit variablem Volumen zwischen 0,5

und 10 µl.

Mindestens eine Mehrkanalpipette mit variablem Volumen zwischen 5 und

100 µl.

Spitzen

DNase- und RNase-freie Spitzen, passend für die verwendeten Pipetten,

Volumen zwischen 0,5 und 1000 µl

DNase- und RNase-freie Spitzen für den Mehrfachdispenser, die 0,1 ml

fassen

Rotator Zur Rotation einer Mikrotiterplatte 360° um die Längsachse mit einer

Drehgeschwindigkeit von unter 10 rpm.

Es wird empfohlen, standardisierte Proben zu verwenden (z. B. Qualitätssicherungsschemata VEQ – EQAS, Proben von

Horizon Diagnostics), um die Genauigkeit des MassARRAY Dx Colon Panel zu prüfen.

6) ERFORDERLICHE ZUSÄTZLICHE AUSSTATTUNG (NICHT IM

LIEFERUMFANG)

Postamplifikation

Erforderliche zusätzliche Ausstattung Artikelnummer und Anbieter

MassARRAY Dx System, bestehend aus:

MassARRAY Dx Nanodispenser RS1000 (mit

6 Nadeln)

MassARRAY Dx Analyzer 4 (96)

40010, Agena Bioscience, Inc., San Diego, California,

USA

iGenetics®-Software: Software zur Verarbeitung der

Ergebnisse der Primärsoftware (MassARRAY

Typer 4.0.22 oder höher; im Lieferumfang des

MassARRAY Dx Analyzer 4 enthalten)

Agena Bioscience GmbH

7) ONLINE VERFÜGBARE DOKUMENTE

Auf unserer Website www.agenacx.com sind folgende Dokumente zu finden:

Gebrauchsanweisung für MassARRAY Dx Colon Panel (Product Support > Documentation > MassARRAY Dx

System) [das vorliegende Dokument]

Sicherheitsdatenblätter (Material Safety Data Sheets, MSDS) (Product Support > Material Safety Data Sheet >

MSDS – MassARRAY Dx Products)

MassARRAY Dx Panel Sample Grid; Lung and Colon: Konfiguration der Reaktionsplatte und zu verwendende

klinische Proben in den einzelnen Analysedurchgängen (Product Support > Application Updates > MassARRAY Dx)

http://www.diatechpharmacogenetics.com/area-riservata

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501-DE, R04 2016/09

Datei mit dem Assay-Design: MassARRAY Dx Colon Panel.txt (Product Support > Application Updates >

MassARRAY Dx)

Weitere Einzelheiten beim Kundendienst von Agena Bioscience (E-Mail: [email protected]).

8) STABILITÄT UND LAGERUNG

Die Reagenzien sind gemäß den Anweisungen auf ihrer Verpackung zu lagern. Insbesondere gilt:

Box 1/4

Alle mitgelieferten Materialien in der Originalverpackung bei +2/+35 °C lagern.

Box 2/4

Alle mitgelieferten Materialien in der Originalverpackung bei +2/+35 °C lagern.

Box 3/4

Alle mitgelieferten Reagenzien in der Originalverpackung bei -35/-20 °C lagern.

Einzelne Röhrchen mit Kontroll-DNA nicht öfter als fünfmal auftauen, da sonst ihre Funktionsfähigkeit vermindert

sein kann.

Colon status AMP strip II sowie einzelne Röhrchen der Reagenzien für die Amplifikation (PCR Enzyme, 10x PCR

Buffer, dNTP Mix und MgCl2) nicht öfter als zwei Mal auftauen, da sonst ihre Funktionsfähigkeit vermindert sein

kann.

Bei ordnungsgemäßer Lagerung sind die Reagenzien bis zu dem auf der Einzelverpackung angegebenen

Verfallsdatum stabil.

Box 4/4

Alle mitgelieferten Reagenzien in der Originalverpackung bei -35/-20 °C lagern.

Colon status EXT strip II sowie einzelne Röhrchen der Reagenzien für die Amplifikation (SAP Enzyme, SAP Buffer,

Termination Mix, Thermosequenase und Buffer Plus (10x)) nicht öfter als zwei Mal auftauen, da sonst ihre

Funktionsfähigkeit vermindert sein kann.

Einzelne Röhrchen mit 3-Pt Calibrant nicht öfter als fünfmal auftauen, da sonst ihre Funktionsfähigkeit vermindert

sein kann.

Bei ordnungsgemäßer Lagerung sind die Reagenzien bis zu dem auf der Einzelverpackung angegebenen

Verfallsdatum stabil.

9) SYMBOLE

Bestellnummer (Produktcode)

Negative Kontrolle

Lotbezeichnung

Wichtiger Hinweis

WARNUNG

Inhalt ausreichend für <n>

Tests

Instrumentensystem

Für die Verwendung zur In-

vitro-Diagnostik Box Nr. 1 von 4

Verfallsdatum Box Nr. 2 von 4

Inhalt der Box Box Nr. 3 von 4

Liste der Komponenten Box Nr. 4 von 4

Anzahl der Aliquote

Gebrauchsanweisung beachten.


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Lagertemperaturbereich

Hersteller

Positive Kontrolle

Dieses Produkt erfüllt die Anforderungen der Europäischen Richtlinie 98/79 EG an In-vitro-Diagnostika.

Gebrauchsanweisung Menge pro Aliquot

10) GRENZEN DER VERWENDUNG DES PRODUKTES

Das MassARRAY Dx Colon Panel darf nur von geschultem Fachpersonal verwendet werden.

Bei der Arbeit mit dem Produkt sind die allgemeinen Grundsätze der Guten Laborpraxis (GLP) und die Hinweise in

der vorliegenden Gebrauchsanweisung zu beachten.

Reagenzien, die ihr Verfallsdatum überschritten haben oder nicht ordnungsgemäß gelagert wurden, dürfen nicht

mehr verwendet werden.

Das MassARRAY Dx Colon Panel ist zur Verwendung zusammen mit dem MassARRAY Dx System (Agena

Bioscience, Inc., San Diego, California, USA) vorgesehen.

Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse hängt außerdem von den Verfahrensschritten ab, die der DNA-Amplifikation und

der spektrometrischen Analyse vorausgehen.

Alle mittels dieses Verfahrens gewonnenen diagnostischen Ergebnisse müssen unter Bezugnahme auf andere

klinische Befunde oder Laborergebnisse interpretiert werden.

11) VORSICHTSMAßNAHMEN UND ANFORDERUNGEN AN DIE

HANDHABUNG

Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen

Wie bei jedem Testverfahren ist eine gute Laborpraxis für die ordnungsgemäße Durchführung dieses Assays

unerlässlich. Um die korrekte Durchführung und zuverlässige Ergebnisse sicherzustellen, ist die in Abschnitt 12:

„Analyseverfahren“ beschriebenen Vorgehensweise anzuwenden.

Auf unserer Website www.agenacx.com stehen Sicherheitsdatenblätter (Material Safety Data Sheets, MSDS) zur

Verfügung.

Die Proben sind als potenziell infektiös und gemäß den Vorschriften für sicheres Arbeiten im Labor, wie in „Biosafety

in Microbiological and Biomedical Laboratories“ und im CLSI-Dokument M29-A4 beschrieben, zu behandeln.

Um eine Fehlinterpretation von Ergebnissen zu vermeiden, sind unbedingt die in Tabelle I.1, Abschnitt 12.I:

„Ergebnisanalyse“ enthaltenen Warnhinweise zu beachten.

Das MassARRAY Dx Colon Panel darf nur in Verbindung mit der iGenetics-Software verwendet werden.

In jedem Lauf müssen Wildtyp- und negative Kontrollen mitgeführt werden.

Das MassARRAY Dx Colon Panel ermöglicht lediglich die Erkennung und Identifizierung der häufigsten KRAS-,

BRAF-, NRAS- und PIK3CA-Genmutationen, die das Ansprechen auf Therapien mit monoklonalen Antikörpern

gegen EGFR (Anti-EGFR-MAB) beim Kolorektalkarzinom beeinflussen, und ist nicht für die Diagnostik bei anderen

Erkrankungen geeignet.

Vor der routinemäßigen Verwendung des Panels muss eine Validierung mit bekannten Mutationen erfolgt sein.

Es wird empfohlen, DNA-freie und sterile Einmalpipettenspitzen zu verwenden.

Sollte der Warnhinweis „contact support“ angezeigt werden, bitte Kontakt aufnehmen mit support-

[email protected]

WARNUNG! Auf das Layout der Reaktionsplatte und die Verteilung der Proben achten, um eine Verwechslung

von Proben zu vermeiden.

Gute Laborpraxis

Nicht mit dem Mund pipettieren.

In den Arbeitsbereichen des Labors nicht essen, trinken oder rauchen.

Nach dem Umgang mit Proben und Testreagenzien gründlich die Hände waschen.



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501-DE, R04 2016/09

Beim Umgang mit Reagenzien Schutzbrille, Laborkittel und Laborhandschuhe tragen. Haut, Augen und

Schleimhäute vor Kontakt mit diesen Materialien schützen. Bei Kontakt sofort mit reichlich Wasser abspülen.

Unbehandelt können Verätzungen entstehen. Verschüttete Flüssigkeiten vor dem Aufwischen zunächst mit Wasser

verdünnen.

Es wird empfohlen, standardisierte Proben zu verwenden (z. B. Qualitätssicherungsschemata VEQ – EQAS, Proben

von Horizon Diagnostics), um die Genauigkeit des MassARRAY Dx Colon Panel zu prüfen.

Kontamination

Um Kontaminationen zu vermeiden, müssen Handschuhe getragen und zwischen der Handhabung von Proben und

MassARRAY Dx Colon Panel-Reagenzien gewechselt werden. Darauf achten, dass die Handschuhe beim Umgang

mit Proben nicht kontaminiert werden.

Handschuhe regelmäßig wechseln, um das Kontaminationsrisiko zu senken.

Die Handschuhe müssen vor dem Verlassen von DNA-Isolierungsbereichen gewechselt werden oder wenn ein

Verdacht auf Kontakt mit Lösungen oder einer Probe besteht.

Kontamination der Reagenzien und Proben durch Mikroorganismen und Ribonuklease vermeiden.

Die für die Amplifikation und Detektion genutzten Arbeitsbereiche vor Beginn sorgfältig reinigen. Materialien und

Ausrüstung sind den einzelnen Tätigkeiten zuzuordnen und dürfen nicht für andere Tätigkeiten verwendet oder von

einem Arbeitsbereich in einen anderen gebracht werden. Beispielsweise dürfen Pipetten und Materialien, die für die

DNA-Isolierung verwendet wurden, nicht für die Herstellung der Mixe für die Amplifikation und Detektion verwendet

werden und umgekehrt.

Es wird dringend empfohlen, die Arbeitsabläufe im Labor unidirektional zu gestalten, sodass eine Tätigkeit

abgeschlossen ist, bevor mit der nächsten Tätigkeit begonnen wird. So sollte z. B. die DNA-Isolierung

abgeschlossen sein, bevor Amplifikation und Detektion beginnen. Die DNA-Isolierung ist räumlich getrennt von der

Amplifikation und der Detektion durchzuführen. Um eine Kontamination des verwendeten Mastermix mit DNA-

Proben zu vermeiden, müssen die für die Amplifikation und Detektion genutzten Arbeitsbereiche vor der Mastermix-

Herstellung gründlich gereinigt werden.

Integrität

Kits nach ihrem Verfallsdatum nicht mehr verwenden.

Reagenzien aus verschiedenen Kits oder Chargen (Lots) nicht zusammenmischen.

Einmalprodukte nach ihrem Verfallsdatum nicht mehr verwenden.

Alle Einmalprodukte sind für den Einmalgebrauch vorgesehen und dürfen nicht mehrmals verwendet werden.

Alle Geräte müssen gemäß den Herstelleranweisungen gewartet werden.

Marken

Unter anderem sind die folgenden patentierten Verfahren und Produkte von Agena Bioscience (Kalifornien, USA)

zur massenspektrometrischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen durch das US-amerikanischen Patentrecht

geschützt: 6,024,925; 6,440,705; 6,558,623; 6,569,385; 6,730,517; 6,979,425; 6,994,969; 7,019,288; 7,025,933;

7,232,688; 7,285,422; 7,332,275; 7,390,672; 7,501,251; 7,888,127; 7,917,301; 8,003,317; 8,315,805; 8,349,566;

9,249,456; und 9,310,378,; angemeldete Patente (unter anderem): US20130017960; außerhalb der USA

entsprechend (unter anderem): EP1173622B1, EP1727911B1, EP1546385B1, EP1332000B1, EP1613723B1,

EP1660680B1, and EP2107129B1. [0516].

Agena Bioscience®, MassARRAY®, iPLEX® und SpectroCHIP® sind eingetragene Marken von Agena Bioscience,

Inc. (Kalifornien, USA). Agena Bioscience ist eine Marke von Agena Bioscience, Inc.

iGenetics® ist eine eingetragene Marke von BiMind S.a.s. (Jesi, Italien).

Die in diesem Dokument erwähnten Namen und Marken sind auch dann gesetzlich geschützt, wenn dies nicht

ausdrücklich angegeben ist.

12) ANALYSEVERFAHREN A. AUSWAHL DER BIOLOGISCHEN PROBEN

B. DNA-EXTRAKTION

C. AMPLIFIKATION

D. BEHANDLUNG MIT SAP

E. EXTENSIONSREAKTION MIT IPLEX PRO

F. KONFIGURATION DER PLATTE IN DER TYPER 4.0 SOFTWARE

F1. IMPORT DER ASSAY-DESIGN-DATEI MIT DEM MASSARRAY TYPER ASSAY EDITOR

12


501-DE, R04 2016/09

F2. ANLEGEN EINER VIRTUELLEN PLATTE IM MASSARRAY TYPER PLATE EDITOR

G. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY

G1. VORBEREITEN DES MASSARRAY DX NANODISPENSER RS1000

G2. ENTSALZUNG DER PRODUKTE DER EXTENSIONSREAKTION MIT IONENAUSTAUSCHER-HARZ

(CLEAN RESIN)

G3. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY

H. SPEKTRENAUFZEICHNUNG IM MASSARRAY DX ANALYZER 4

H1. AUSWAHL DER ANALYSEPARAMETER MITHILFE DER CHIP-LINKER-SOFTWARE

H2. SPEKTRENAUFZEICHNUNG MITHILFE DER SPECTROACQUIRE-SOFTWARE

H3. ARBEITSVORGÄNGE NACH DER SPEKTRENAUFZEICHNUNG

I. ERGEBNISANALYSE

I.1 ERGEBNISANALYSE MIT DER MASSARRAY-TYPER-SOFTWARE

I.2 ERGEBNISANALYSE MIT DER IGENETICS-SOFTWARE

I.3 ÜBERPRÜFUNG DER SPEKTRENQUALITÄT/SICHTPRÜFUNG DER SPEKTREN IM MASSARRAY

TYPERANALYZER

I.4 WIEDERHOLUNG DER PROBENANALYSE

A. AUSWAHL DER BIOLOGISCHEN PROBEN

Die auf Mutationen der Gene KRAS, NRAS, BRAF und PIK3CA hin zu analysierenden biologischen DNA-Proben

müssen aus Gewebe des Primärtumors und/oder der Metastasen eines infiltrativen Karzinoms bestehen. Gewebe

von adenomatösen Läsionen oder nichtinvasiven Karzinomen sollte nicht verwendet werden. Auch entzündete oder

nekrotische Areale, gesunde Gewebeteile (z. B. Fett-, Muskel- oder Drüsengewebe) sowie desmoplastisches

Stroma sind zu vermeiden.

Die mittels einer Biopsie, Zytologie oder aus chirurgisch reseziertem neoplastischem Gewebe gewonnenen Proben

können entweder unmittelbar oder nach dem Einfrieren bei -80 °C bzw. in flüssigem Stickstoff oder auch nach der

Fixierung mit Formalin und der Einbettung in Paraffin verarbeitet werden.

Das zu untersuchende Gewebe muss mindestens 50 % Tumorzellen enthalten. Liegt der Anteil der Tumorzellen in

der biologischen Probe unter 50 %, sollte das Gewebe durch eine manuelle Makrodissektion auf dem Objektträger

oder direkt aus dem Paraffinblock oder durch eine Laser-Mikrodissektion angereichert werden. Die Verwendung von

Proben mit einem Gehalt von weniger als 100 neoplastischen Zellen wird nicht empfohlen.

Für die Analyse der Gene KRAS, NRAS, BRAF und PIK3CA sind 3–5 Schnitte kolorektales Gewebe von 10–20 µm

Dicke auf nicht silanisierten Objektträgern oder in 2-ml-Reaktionsgefäßen ausreichend.

In Paraffin eingebettete Gewebeschnitte müssen vor der DNA-Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel

entparaffiniert, mit Alkohol gespült und getrocknet werden.

B. DNA-EXTRAKTION

Das Verfahren ist in einer speziell für die DNA-Extraktion und die Verdünnung der DNA-Lösung vorgesehenen Umgebung mittels spezieller Materialien und Geräte durchzuführen.

Das MassARRAY Dx Colon Panel beinhaltet keine Reagenzien für die Extraktion von genomischer DNA (Human).

Es wird empfohlen, handelsübliche Kits zu verwenden, die mit Kieselgelmembranen oder Magnetkügelchen

funktionieren. Manuelle Extraktionsmethoden, bei denen Phenol eingesetzt wird oder Gewebematerial in basischer

Lösung im Autoklav gekocht wird und bei denen keine Aufreinigung erfolgt, sind zu vermeiden.

Bei der DNA-Extraktion sind die Hinweise zum Kit strikt zu befolgen.

Wenn das Extraktionsprotokoll die Verwendung ethanolhaltiger Waschpuffer vorsieht, ist es ratsam, vor der

abschließenden Elution eine weitere Zentrifugierung durchzuführen, um jegliche Ethanolspuren zu entfernen. Auf

diese Weise lässt sich eine potenzielle durch Ethanol bedingte Hemmung der Reaktion vermeiden.

Nach der Extraktion/Aufreinigung der DNA unverzüglich mit der Amplifikationsreaktion fortfahren oder die extrahierte

DNA bei -20 °C in Aliquote aufgeteilt lagern, um für den Fall, dass der Test mit derselben Probe wiederholt wird,

gleichbleibende Versuchsbedingungen zu gewährleisten.

Die Konzentration und die Qualität der extrahierten DNA werden mit einem Spektrophotometer bestimmt. Dabei ist

Folgendes zu beachten:

a. Eine geringere Menge der extrahierten Probe verwenden, sodass der Rest für die erforderlichen

Amplifikationsreaktionen ausreicht.

b. Proben verdünnen, bis die Konzentration im Linearitätsbereich des verwendeten Spektrophotometers liegt. (Es

wird dringend empfohlen, Geräte zu verwenden, die mit Mikrovolumen des extrahierten Materials funktionieren.)

c. Bitte beachten: Die Quantifizierung einer DNA-Probe ist unzuverlässig, wenn die verwendete

Extraktionsmethode die Zugabe einer Träger-RNA oder ähnlicher Moleküle im Lysepuffer erfordert.

13


501-DE, R04 2016/09

Die Konzentration des amplifizierbaren Targets in DNA-Proben, die aus paraffiniertem Gewebe (FFPE) extrahiert

wurden, wird bei stark fragmentierter DNA zu hoch eingeschätzt. Das liegt daran, dass der Absorptionsmesswert

proportional zur Gesamtmenge der tatsächlichen DNA ist, unabhängig von der Länge der Moleküle.

Es wird empfohlen, für die Amplifikationsreaktion 2,5 bis 25 ng/μl DNA zu verwenden.

C. AMPLIFIKATION

Das Verfahren im PCR-Vorbereitungsbereich mithilfe der dafür vorgesehenen Materialien und Geräte durchführen.

Vor der Herstellung des PCR-Mastermix die Pipetten und die Laboroberflächen mit speziellen

Dekontaminationsmitteln behandeln und nach Möglichkeit 30 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlen.

Die DNA-Proben sind im Verwendungszeitraum bei 4 ˚C zu lagern.

Die folgenden Thermocycling-Reaktionsbedingungen wurden unter Verwendung der im MassARRAY Dx Colon Panel

enthaltenen Reagenzien für die Amplifikation (Box 3/4 – Reagenzien für die Amplifikation) optimiert. Es wird ein PCR-

Mastermix hergestellt und dann jedem der 8 PCR-Primer zugegeben, um die 8 PCR-Cocktails herzustellen. In jede

Vertiefung der Reaktionsplatte werden 3 μl PCR-Cocktail und danach 2 μl DNA eingebracht (siehe Darstellung unten).

Daraus ergibt sich ein Ansatz von 5 μl für die PCR-Amplifikationsreaktion.

1. Alle Reagenzien vor der Verwendung auftauen.

2. Reaktionsgefäße und -streifen vor der Verwendung leicht auf dem Vortexer mischen und zentrifugieren.

3. Auf der Reaktionsplatte (SQ plate – skirted) markieren, welche Vertiefungen verwendet werden sollen. Hierbei

darauf achten, dass bei jedem Lauf mindestens eine negative Kontrolle (WATER) und eine positive Kontrolle

(Control DNA) mitgeführt werden.

4. Einen Colon status AMP strip II (PCR-Primer) vertikal auf dem entsprechenden SQ AMP rack platzieren. Die auf

dem Streifen aufgeprägte Nummer muss nach oben zeigen.

Jede Probe und jede Kontrolle muss parallel mit den 8 verschiedenen PCR-Primern amplifiziert werden, die

in den 8 Reaktionsgefäßen jedes Colon status AMP strip II (rot gekennzeichnet) enthalten sind.

Das nachstehende Schema zeigt eine volle Platte mit 10 klinischen Proben (DNA1–DNA10) und den Reaktionskontrollen (Control DNA, WATER). Das Probenraster „MassARRAY Dx Colon Panel Sample Grid; Lung and Colon“ (von AgenaCx.com heruntergeladen) mit dem Namen der 10 klinischen Proben beschriften.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

PCR MIX

1

B DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

PCR MIX

2

C DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

PCR MIX

3

D DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

PCR MIX

4

E DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

PCR MIX

5

F DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

PCR MIX

6

G DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

PCR MIX

7

H DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

PCR MIX

8

5. Den PCR-Mastermix in einem 1,5-ml-Röhrchen herstellen, wie in Tabelle C1 dargestellt. Die Werte sind für eine

volle 96-Well-Platte berechnet. Die Kalkulation berücksichtigt einen Überhang von 25 %.

Tabelle C1: Herstellung des PCR-Mastermix

14


501-DE, R04 2016/09

Volumen

für

1 Reaktion

[in µl]

VOLLE PLATTE

Volumen für 8 Plexe x 12 Proben

(96 Reaktionen einschließlich 25 %

Überhang)

[in µl]

Kontrollspalte:

Reagens

hinzugefügt

WATER (small) 1,3 156,0

10x PCR Buffer 0,5 60,0

MgCl2 0,4 48,0

dNTP Mix 0,1 12,0

PCR Enzyme 0,2 24,0

Gesamtvolumen 2,5 300,0

6. Den PCR-Mastermix auf dem Vortexer mischen und abzentrifugieren.

7. Zur Herstellung des PCR-Cocktails in jede der 8 Vertiefungen des Colon status AMP strip II (PCR-Primer) 35 μl des

PCR-Mastermix geben.

8. Jedes Mal durch Auf- und Abpipettieren mischen.

Auf die Orientierung des Streifens achten. (Die auf dem Streifen aufgeprägte Nummer des Reaktionsgefäßes mit dem PCR MIX 1 muss in der ersten der obigen Vertiefungen platziert werden.)

9. Mit einer Mehrkanalpipette (0,5–10 µl) in jede Vertiefung der Reaktionsplatte (SQ plate – skirted) 3 µl des

entsprechenden PCR-Cocktails geben (siehe Darstellung des Layouts oben). Es ist nicht erforderlich, die Spitzen zu

wechseln.

10. In den Spalten 1–10 jeweils 2 µl der DNA-Proben in die Vertiefung geben. Die DNA Probe und den PCR-Cocktail

durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren mischen und die Spitzen wechseln. Es kann eine für 0,2–2 µl oder für 0,5–

10 µl geeignete Pipette verwendet werden.

11. In Spalte 11 jeweils 2 µl Control DNA als Wildtyp-Kontrolle in die Vertiefungen geben. Die DNA Probe und den PCR-

Cocktail durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren mischen und die Spitzen wechseln. Es kann eine für 0,2–2 µl

oder für 0,5–10 µl geeignete Pipette verwendet werden.

12. In Spalte 12 jeweils 2 µl WATER als negative Kontrolle in die Vertiefungen geben. Den Inhalt jeder Vertiefung durch

mehrfaches Auf- und Abpipettieren mischen und die Spitzen wechseln. Es kann eine für 0,2–2 µl oder für 0,5–10 µl

geeignete Pipette verwendet werden.

Das Endvolumen in jeder Vertiefung beträgt 5 µl.

13. Zum Schluss die Platte sorgfältig mit SQ sealing foil verschließen.

14. Die Platte kurz zentrifugieren.

15. Die Platte in den Thermocycler stellen.

16. Den Anweisungen in der Gebrauchsanleitung des Thermocyclers folgend das folgende PCR-Zyklusprofil einstellen.

Alternativ dazu die im Gerät gespeicherte Datei – sofern bereits vorhanden – abrufen. Nochmals überprüfen, ob die

Parameter korrekt eingestellt sind:

PCR-Profil für MassARRAY Dx*

Schritt 1 2 Minuten lang 95 °C

45 Zyklen

30 Sekunden lang 95 °C





Schritt 4 10 °C unbegrenzt lange (∞)

*Die Deckelheizung des Geräts auf 105 °C einstellen.

Nachdem die Amplifikationsreaktion abgeschlossen ist, mit dem nächsten Schritt (SAP-Behandlung) fortfahren oder die PCR-Platte bei -35/-20 °C bis zu zwei Wochen lang lagern.

D. BEHANDLUNG MIT SAP

Das Verfahren im Post-PCR-Bereich mithilfe der dafür vorgesehenen Materialien und Geräte durchführen. Zuvor die Pipetten und die Laboroberflächen mit speziellen Dekontaminationsmitteln behandeln und nach

Möglichkeit 30 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlen.

15


501-DE, R04 2016/09


enthaltenen Reagenzien (Box 4/4 – Reagenzien für die Extension) optimiert. Den SAP-Cocktail herstellen und in jede

Vertiefung der Reaktionsplatte 2 μl davon geben.


2. Alle Reagenzgefäße vor der Verwendung leicht auf dem Vortexer mischen und zentrifugieren.

3. Falls die Platte mit den Amplifikationsprodukten bei -35/-20 °C gelagert wurde, die Platte auftauen und kurz

zentrifugieren.

4. Den SAP-Cocktail gemäß der nachstehenden Tabelle D3 herstellen. Die Werte sind für eine volle 96-Well-Platte

berechnet. Die Kalkulation berücksichtigt einen Überhang von 25 %.

16


501-DE, R04 2016/09

Tabelle D3: Herstellung des SAP-Cocktails

Volumen für

1 Reaktion

[in µl]

VOLLE PLATTE

Volumen für 8 Plexe x

12 Proben (96 Reaktionen

einschließlich

25 % Überhang) [in µl]

Kontrollspalte:

Reagens

hinzugefügt

WATER 1,53 183,6

SAP Buffer 0,17 20,4

SAP Enzyme 0,30 36,0


5. Den SAP-Cocktail durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren oder auf dem Vortexer mischen, anschließend kurz

zentrifugieren.

6. SQ sealing foil sehr vorsichtig von der Reaktionsplatte abziehen.

7. Um eine Kreuzkontamination durch Amplicons zu vermeiden, die SQ sealing foil sofort entsorgen, ohne sie auf eine

Arbeitsfläche zu legen/kleben.

8. Mit einem Mehrfachdispenser in jede Vertiefung derselben Platte 2 μl des SAP-Cocktails geben. Dieselbe 0,1-ml-

Spitze verwenden. Darauf achten, weder die Flüssigkeit in den Vertiefungen noch die Innenfläche der Vertiefungen

mit dem unteren Ende der Spitze zu berühren.

Gesamtreaktionsvolumen: 7 µl (5 µl PCR + 2 µl SAP).



11. Die Platte in den Thermocycler stellen und die Proben gemäß dem nachstehenden Programm inkubieren. Nochmals

überprüfen, ob die Parameter korrekt eingestellt sind:

SAP-Profil für MassARRAY Dx*






Nachdem die SAP-Reaktion abgeschlossen ist, mit dem nächsten Schritt (Extensionsreaktion mit iPLEX Pro) fortfahren oder die PCR-Platte bei -35/-20 °C bis zu zwei Wochen lang lagern.

E. EXTENSIONSREAKTION MIT IPLEX PRO

Das Verfahren im Post-PCR-Bereich mithilfe der dafür vorgesehenen Materialien und Geräte durchführen. Zuvor die Pipetten und die Laboroberflächen mit speziellen Dekontaminationsmitteln behandeln und nach

Möglichkeit 30 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlen.


enthaltenen Reagenzien (Box 4/4 – Reagenzien für die Extension) optimiert. Es wird ein Extensions-Mastermix

hergestellt und dann jedem der 8 Extensions-Primer zugegeben, um die 8 Cocktails für die Extensionsreaktion

herzustellen. In jede Vertiefung der Reaktionsplatte werden 2 μl des Cocktails für die Extensionsreaktion eingebracht

(siehe Darstellung unten).


2. Alle Reaktionsgefäße vor der Verwendung leicht auf dem Vortexer mischen und zentrifugieren.

3. Falls die Platte mit den mit SAP behandelten Amplifikationsprodukten bei -35/-20 °C gelagert wurde, die Platte

auftauen und kurz zentrifugieren.

4. Einen Colon status EXT strip II vertikal auf dem entsprechenden SQ EXT rack platzieren. Die auf dem Streifen

aufgeprägte Nummer muss nach oben zeigen.

Jede Probe und jede Kontrolle muss parallel mit den 8 verschiedenen Extensions-Primern verlängert werden, die in den 8 Reaktionsgefäßen jedes Colon status EXT strip II (grün gekennzeichnet) enthalten

sind. Das nachstehende Schema zeigt eine volle Platte mit 10 klinischen Proben (DNA1–DNA10) und den

Reaktionskontrollen.

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501-DE, R04 2016/09

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

EXT

MIX 1

B DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

EXT

MIX 2

C DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

EXT

MIX 3

D DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

EXT

MIX 4

E DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

EXT

MIX 5

F DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

EXT

MIX 6

G DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

EXT

MIX 7

H DNA

1

DNA

2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

EXT

MIX 8

5. Den Extensions-Mastermix gemäß der nachstehenden Tabelle E1 herstellen. Die Werte sind für eine volle 96-Well-

Platte berechnet. Die Kalkulation berücksichtigt einen Überhang von 25 %.

Tabelle E1: Herstellung des Extensions-Mastermix

Volumen

für

1 Reaktion

[in µl]

VOLLE PLATTE

Volumen für 8 Plexe x 12 Proben

(96 Reaktionen einschließlich

25 % Überhang)

[in µl]

Kontrollspalte:

Reagens

hinzugefügt

WATER 0,56 67,2

Buffer Plus (10x) 0,20 24,0

Termination Mix 0,20 24,0

Thermosequenase 0,04 4,8


6. Den Extensions-Mastermix auf dem Vortexer mischen und abzentrifugieren.

7. Zur Herstellung der Cocktails für die Extensionsreaktion in jede der 8 Vertiefungen des Colon status EXT strip II

(Extensions-Primer) 14 μl des Extensions-Mastermix geben.

8. Den Inhalt jeder Vertiefung durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren mischen.

Auf die Orientierung des Streifens achten.

9. SQ sealing foil sehr vorsichtig von der Reaktionsplatte abziehen.

10. Um eine Kreuzkontamination durch Amplicons zu vermeiden, die SQ sealing foil sofort entsorgen, ohne sie auf eine


11. Mit einer Mehrkanalpipette (0,5–10 µl) in jede Vertiefung der Reaktionsplatte 2 µl des entsprechenden Cocktails für

die Extensionsreaktion geben (siehe Darstellung des Layouts oben). Nach jedem Transfer die Spitzen wechseln.

Gesamtreaktionsvolumen: 9 µl (5 µl PCR + 2 µl SAP + 2 µl iPLEX-Extensionsreaktion).



14. Die Platte in den Thermocycler stellen und die Proben gemäß dem nachstehenden Programm inkubieren. Nochmals

überprüfen, ob die Parameter korrekt eingestellt sind:

Profil der Extensionsreaktion mit MassARRAY iPLEX*

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501-DE, R04 2016/09

Schritt 1 30 Sekunden lang 94 °C

40

Zyklen


5

Zyklen







Nachdem die Extensionsreaktion abgeschlossen ist, mit dem nächsten Schritt (Ionenaustauscher-Harz-Behandlung) fortfahren oder die Platte bei -35/-20 °C bis zu zwei Wochen lang lagern.

F. KONFIGURATION DER PLATTE IN DER TYPER-SOFTWARE

F1. Import der Assay-Design-Datei mit dem MassARRAY Typer Assay Editor

Die folgenden Schritte müssen nur bei der erstmaligen Verwendung des MassARRAY Dx Colon Panel ausgeführt werden.

1. Die Assay-Design-Datei (MassARRAY Dx Colon Panel.txt) von AgenaCx.com herunterladen (Product Support >

Application Updates > MassARRAY Dx System).

2. Die MassARRAY Typer V 4.0 Software aufrufen, die unter folgendem Pfad zu finden ist:

Desktop/MassARRAY/Typer4.0.

3. Auf das Symbol Assay Editor klicken.

4. Daraufhin wird ein Anmeldefenster geöffnet. Als Benutzerkennung (User ID) „charles“ und als Passwort „darwin“

eingeben. Der Name der Datenbank ist „AgenaDB“. Auf die Schaltfläche Connect klicken.

5. Mit der rechten Maustaste auf das Wurzelknoten-Symbol Assay Project/Assay Group/Plex Assay klicken und

Project Administrator wählen.

6. Daraufhin wird das Fenster Assay Project Administrator geöffnet. Um ein neues Projekt anzulegen, im oberen Feld

(Add new Assay Project) den Panel-Namen 40110_MassARRAY_Colon eingeben, dann auf Add und anschließend

auf Close klicken.

7. Im Fensterbereich Database Browser (linke Seite des Fensters) erscheint daraufhin ein neues Assay-Project-

Symbol .

8. Auf das Assay-Project-Symbol klicken und Import Assay Group in Designer Format wählen.

9. Das Fenster Import Assay/SNP Group in Design Format wird geöffnet. Die Kästchen für Design Summary und SNP

Group deaktivieren. Sicherstellen, dass neben Assay Group ein Häkchen gesetzt ist. Auf die Schaltfläche Browse

für die Assay-Gruppe (Assay Group) klicken.

10. Zu der in Schritt 1 heruntergeladenen Datei MassARRAY Dx Colon Panel.txt navigieren und auf Open klicken.

11. Import wählen.

12. Daraufhin erscheint folgende Meldung: Import completed. OK wählen.

13. Auf das Plus-Symbol neben dem Assay-Project-Symbol klicken, um die Unterordner anzuzeigen.

14. Durch Klicken auf das Assay-Group-Symbol werden alle in der betreffenden Assay-Gruppe (Assay Group)

gespeicherten Plexe angezeigt. Durch Klicken auf das Plex-Symbol werden alle im betreffenden Plex

gespeicherten Assays angezeigt.

F2. Anlegen einer virtuellen Platte im MassARRAY Typer Plate Editor

Schritt 5 ist nur beim ersten Lauf erforderlich und wenn ein weiterer Kunde oder ein weiteres Projekt angelegt

werden muss. Wenn die Kunden und Projekte bereits vorhanden sind, mit Schritt 6 beginnen.

Schritt 9 ist nicht erforderlich, wenn die entsprechenden Kunden (Sample Customers) und Projekte (Sample

Projects) bereits vorhanden sind.

Die Schritte 10–11 sind nicht erforderlich, wenn die Textdatei für die DNA-Proben-Gruppe bereits angelegt und

in die Datenbank importiert wurde.

1. Die MassARRAY Typer V 4.0 Software aufrufen, die unter folgendem Pfad zu finden ist:


2. Auf das Symbol Plate Editor klicken.



4. In der linken unteren Ecke die Registerkarte Plate wählen.

19


501-DE, R04 2016/09

5. In der Datenbank einen Kunden und ein Projekt wählen, sofern nicht bereits geschehen:

5.1. Auf der Registerkarte Plate mit der rechten Maustaste auf das Wurzelknoten-Symbol klicken und New

Customer wählen.

5.2. Das Dialogfeld Create New Customer wird angezeigt. Eine Kunden-ID (Customer ID) eingeben und OK

wählen.

5.3. Auf der Registerkarte Plate erscheint die Kunden-ID aus dem vorangegangenen Schritt neben dem Customer-

Symbol .

5.4. Mit der rechten Maustaste auf das Customer-Symbol klicken und New Project wählen.

5.5. Das Dialogfeld Create New Project wird angezeigt. Die Projekt-ID (Project ID) 40110_MassARRAY_Colon

eingeben und auf OK klicken.

5.6. Auf der Registerkarte Plate erscheint unter dem Customer-Symbol das Project-Symbol mit der Projekt-ID

40110_MassARRAY_Colon.

6. Eine Platte anlegen:

6.1. Mit der rechten Maustaste auf das Project-Symbol klicken und New Plate wählen.

6.2. Im Dialogfeld Create New Plate die Platten-ID (Plate ID) eingeben.

6.3. Als Plattentyp 96 Well Plate wählen.

6.4. OK wählen.

6.5. Im Fensterbereich Plate Layout erscheint eine leere Platte (Plate-Symbol ).

7. Der Platte Assays zuordnen:

7.1. In der linken unteren Ecke die Registerkarte Assay wählen.

7.2. Zur Gruppe MassARRAY Dx Colon Panel navigieren. Auf das Symbol + neben dem Knoten klicken, um

diesen aufzuklappen, bis das Multiplex-Symbol erscheint. Multiplex 1–8 enthält die Assay-Informationen zu

jedem der 8 Plexe.

7.3. Die Platte gemäß dem Plattenlayout-Schema (Abbildung F1) anlegen: Auf der Registerkarte Plate Layout eine

oder mehrere Vertiefungen auswählen. Auf der Registerkarte Assay mit der rechten Maustaste auf den

Plex klicken, der den ausgewählten Vertiefungen zugeordnet werden soll, und Add plex wählen. Der

Hintergrund für die Vertiefungen ist jetzt eingefärbt, wobei die Farbe vom Multiplex Level abhängt.

8. In der linken unteren Ecke die Registerkarte Sample wählen.

9. In der Datenbank einen Kunden und ein Projekt wählen, sofern nicht bereits geschehen: 9.1. Auf der Registerkarte Sample mit der rechten Maustaste auf das Wurzelknoten-Symbol klicken und Add

New Sample Customer wählen.

9.2. Das Dialogfeld Add New Sample Customer wird angezeigt. Eine Kunden-ID (Sample Customer ID) eingeben

und OK wählen.

9.3. Mit der rechten Maustaste auf das Symbol Sample Customer ID klicken. Add New Sample Project

wählen.

9.4. Das Dialogfeld Add New Sample Project wird angezeigt. Eine Probenprojekt-ID (Sample Customer ID)

eingeben und OK wählen.

10. Eine Probenliste (als Textdatei) anlegen, sofern noch nicht geschehen: Excel oder Notepad öffnen und die Probennamen untereinander auflisten. Eine Überschrift ist nicht erforderlich. Die Datei als Textdatei (.txt) speichern.

11. Eine Probengruppe anlegen, sofern noch nicht geschehen: 11.1. Mit der rechten Maustaste auf die eben angelegte Probenprojekt-ID klicken. Add New Sample Group

wählen.

11.2. Daraufhin wird ein Dialogfeld angezeigt. Unter Group ID den Namen der Probenliste eingeben, die importiert

werden soll. Das Öffnen-Symbol wählen und zu der zuvor angelegten Probenliste (Textdatei) navigieren.

Wenn der Import erfolgreich war, zeigt das Feld unten die Proben in der Spalte Sample ID. OK wählen.

12. Der Platte Proben zuordnen:

12.1. Auf das Symbol + neben dem Knoten klicken, um diesen aufzuklappen, bis das Sample-Symbol erscheint.

12.2. Auf der Registerkarte Plate Layout eine oder mehrere Vertiefungen auswählen.

12.3. Auf der Registerkarte Sample mit der rechten Maustaste auf die Probe klicken, die den ausgewählten

Vertiefungen zugeordnet werden soll, und Add Sample wählen. Das X in den betreffenden Vertiefungen

verschwindet.

13. Nachdem die Platte angelegt wurde, auf das Symbol Save klicken. Wenn ein Lauf mehrere Platten umfassen soll,

eine weitere Platte wie oben beschrieben anlegen. Nachdem die Konfiguration der Platte(n) im Plate Editor

abgeschlossen ist, das Programm schließen.

20


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Full plate

Plate

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

MIX

1

B DNA

1

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2

DNA

3

DNA

4

DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

10

Control

DNA Water

MIX

2

C DNA

1

DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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Control

DNA Water

MIX

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D DNA

1

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

6

DNA

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DNA

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DNA

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DNA

10

Control

DNA Water

MIX

4

E DNA

1

DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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Control

DNA Water

MIX

5

F DNA

1

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DNA

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DNA

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DNA

5

DNA

6

DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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Control

DNA Water

MIX

6

G DNA

1

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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Control

DNA Water

MIX

7

H DNA

1

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DNA

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DNA

5

DNA

6

DNA

7

DNA

8

DNA

9

DNA

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Control

DNA Water

MIX

8

Assay

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Plex 1 Plex 1 Plex 1 Plex 1 Plex 1 Plex 1 Plex 1 Plex 1 Plex 1 Plex 1 Plex 1 Plex 1

B Plex 2 Plex 2 Plex 2 Plex 2 Plex 2 Plex 2 Plex 2 Plex 2 Plex 2 Plex 2 Plex 2 Plex 2

C Plex 3 Plex 3 Plex 3 Plex 3 Plex 3 Plex 3 Plex 3 Plex 3 Plex 3 Plex 3 Plex 3 Plex 3

D Plex 4 Plex 4 Plex 4 Plex 4 Plex 4 Plex 4 Plex 4 Plex 4 Plex 4 Plex 4 Plex 4 Plex 4

E Plex 5 Plex 5 Plex 5 Plex 5 Plex 5 Plex 5 Plex 5 Plex 5 Plex 5 Plex 5 Plex 5 Plex 5

F Plex 6 Plex 6 Plex 6 Plex 6 Plex 6 Plex 6 Plex 6 Plex 6 Plex 6 Plex 6 Plex 6 Plex 6

G Plex 7 Plex 7 Plex 7 Plex 7 Plex 7 Plex 7 Plex 7 Plex 7 Plex 7 Plex 7 Plex 7 Plex 7

H Plex 8 Plex 8 Plex 8 Plex 8 Plex 8 Plex 8 Plex 8 Plex 8 Plex 8 Plex 8 Plex 8 Plex 8

Sample

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A DNA

1

DNA

2

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3

DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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Control

DNA Water

B DNA

1

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3

DNA

4

DNA

5

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6

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9

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Control

DNA Water

C DNA

1

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2

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3

DNA

4

DNA

5

DNA

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DNA

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DNA

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9

DNA

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Control

DNA Water

D DNA

1

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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Control

DNA Water

E DNA

1

DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

6

DNA

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DNA

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9

DNA

10

Control

DNA Water

F DNA

1

DNA

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DNA

3

DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

10

Control

DNA Water

G DNA

1

DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

6

DNA

7

DNA

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DNA

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DNA

10

Control

DNA Water

H DNA

1

DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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DNA

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9

DNA

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Control

DNA Water

Abbildung F1: Plattenschema für eine volle 96-Well-Platte

G. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY

Das Verfahren im Post-PCR-Bereich mithilfe der dafür vorgesehenen Materialien und Geräte durchführen.

Ausführlichere Informationen und wichtige Informationen zur Wartung sind dem MassARRAY Dx Nanodispenser

RS1000 User Guide zu entnehmen.

21


501-DE, R04 2016/09

G1. VORBEREITEN DES MASSARRAY DX NANODISPENSER RS1000

1. Aus reinem Ethanol (HPLC-Qualität) und Reinstwasser 100 ml Ethanol 50 % (v/v) herstellen.

2. 3-Pt Calibrant auftauen, auf dem Vortexer mischen und kurz zentrifugieren.

3. Den Abfalltank entleeren: Die Schnellkupplung des Abwasserschlauches in den Abwasseranschluss einstecken. Die

Kupplung so weit hineinschieben, bis sie mit einem Klicken einrastet. Die Entleerung beginnt, sobald die Kupplung

eingesteckt wurde. Sicherstellen, dass ein Auffangbehälter bereitsteht. Zum Entleeren des Abfalltanks werden keine

Softwarebefehle über den Berührungsbildschirm des Geräts eingegeben.

4. Den MassARRAY Dx Nanodispenser RS1000 einschalten.

5. Auf dem Computer mit dem Benutzernamen „Administrator“ und dem Passwort „admin“ anmelden. Die

Anwendungssoftware MassARRAY Dx Nanodispenser wird automatisch gestartet und zeigt einen

Anmeldebildschirm.

6. Auf das Feld type your user name des Anmeldebildschirms tippen und den Benutzernamen „actis“ eingeben, um

sich bei der Anwendungssoftware MassARRAY Dx Nanodispenser anzumelden. Auf das Feld type your password

tippen und das eigene Passwort eingeben. Siehe Abbildung G4. Das Fenster Main Menu wird angezeigt. Siehe

Abbildung G5.

Falls eine Warnmeldung angezeigt wird, bitte überprüfen, ob der Benutzername und das Passwort gültig sind.

7. Die Schaltfläche STATUS (am oberen Rand der meisten Bildschirme) überprüfen.

Wenn sie blinkt, bedeutet das, dass der Füllstand des Vorratstanks niedrig und/oder der Abfalltank voll ist. Auf die Schaltfläche STATUS tippen. Auf dem daraufhin angezeigten Bildschirm Machine Status (Abbildung G6) auf die Registerkarte Page 2 (am unteren Bildschirmrand) tippen. Sich vergewissern, dass die Anzeigen neben den

Füllstandsmeldungen für die verschiedenen Tanks nicht hellgrün leuchten.

3

Abbildung G1: (1) SCOUT-Platte, (2) MTP-Position 1, (3) MTP-Position 2

Abbildung G2: (1) Vorratsflasche für Ultraschallwaschstation, (2) Ultraschallwaschstation, (3) Spülstation, (4) Trockenstation, (5) Kalibrantenreservoir, (6) SCOUT-Platte mit zwei SpectroCHIP-Arrays

Abbildung G3: (1) Dimple Plate speziell für Platten mit Rahmen und Rand, (2) Dose mit Ionenaustauscher-Harz Clean Resin, (3) Löffel und Schaber für das Ionenaustauscher-Harz

Abbildung G4: Anmeldebildschirm (Login)

Abbildung G5: Hauptmenü (Main Menu)

1

2 3 4

5

6

22


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8. Zu Beginn jedes Tages, an dem das Gerät betrieben wird, den Vorratstank auffüllen. In der Regel reicht eine

komplette Füllung des Vorratstanks für die Verarbeitung von acht bis zehn 96er-SpectroCHIP-Arrays aus. So viel

Wasser in den Tank füllen, wie für die am jeweiligen Tag geplante Anzahl von SpectroCHIP-Arrays benötigt wird.

8.1. Das Filterende des Einfüllschlauches (5/16" AD) mit der Metallarmatur in einen sauberen Behälter mit de

ionisiertem Wasser (18,2 MΩ/cm) einführen. – Für eine komplette Füllung reichen ca. 11 Liter (drei Gallonen).

Das offene Ende des Schlauchs fest in den Anschluss einschieben, bis es richtig sitzt (ca. 2 cm weit hinein).

8.2. Den Bildschirm Maintenance aufrufen. (Siehe Abbildung G7; auf einem beliebigen Bildschirm auf Back und

dann im Main Menu auf MAINTENANCE tippen.)

8.3. Im Bildschirm Maintenance auf SUPPLY TANK Kill tippen. Es wird eine Meldung angezeigt. Noch nicht auf

OK tippen. Das geschieht erst einige Schritte später.

8.4. Die Fronttür öffnen und die Frontklappe anheben, um die Steuerventile des Tanks zugänglich zu machen.

Immer wenn die Fronttür oder die Frontklappe geöffnet oder die rote Stopp-Taste gedrückt wird, löst ein Sicherheitsschalter aus und verhindert so den Betrieb des Geräts. Es erscheint die Meldung „Safety interlock is disengaged“ (siehe Abbildung G8). Um das Gerät weiter zu betreiben, die Fronttür und/oder die Frontklappe schließen oder die Stopp-Taste erneut drücken, sodass sie in ihre ursprüngliche Stellung zurückkehrt. In der Meldung über die Auslösung des Sicherheitsschalters auf HOME tippen. Der Dispensierkopf bewegt sich

daraufhin in die Startposition und das Gerät ist betriebsbereit.

8.5. Zum Befüllen des Vorratstanks die Tankventile auf „A2“ stellen, wie in der Meldung dargestellt (siehe

Abbildung G9).

WARNUNG! Die Ventilhebel der Tankventile nicht nach oben gestellt lassen, da in dieser Stellung der

Flüssigkeitsfluss gesperrt ist. Die Pumpen des Geräts werden beschädigt, wenn das Gerät bei dieser Hebelstellung

betrieben wird. Die Hebel müssen je nach gerade durchgeführtem Vorgang immer nach A oder B bzw. 1 oder 2 zeigen.

Abbildung G6: Seite 2 des Gerätestatus (Machine Status, Page 2)

Abbildung G7: Wartungsmenü (Maintenance Menu)

Abbildung G8: Warnung bezüglich der Auslösung des Sicherheitsschalters

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501-DE, R04 2016/09

8.6. Die Frontklappe und die Fronttür schließen.

8.7. Auf OK tippen. Daraufhin beginnt eine Pumpe, das entionisierte Reinstwasser (18,2 MΩ/cm) in den

Vorratstank zu fördern. Warten, bis der Vorratstank voll ist. Ein interner Sensor überwacht den Tankfüllstand

und hält die Pumpe an, sobald der Tank voll ist. Es dauert ca. 15 Minuten, einen völlig leeren Tank zu füllen.

8.8. Falls die in den Tank gepumpte Flüssigkeitsmenge bereits ausreicht, auf Cancel tippen.

8.9. Nachdem der Tank komplett befüllt wurde, erscheint eine Aufforderung. Die Ventile in die Stellung „B1“ für den

normalen Betrieb bringen. Siehe Abbildung G10.

8.10. Die Frontklappe und Fronttür schließen und auf OK tippen. Die Zulaufleitungen werden vorgespült, um sie zu

entlüften.

8.11. Den Schlauch vom Einfüllanschluss lösen. Hierzu den inneren Ring gegen das Anschlussgehäuse drücken

und den Schlauch herausziehen. Es kann erforderlich sein, den Schlauch beim Herausziehen hin und her zu

drehen.

9. Die

Nadeln reinigen:

9.1. Im Bildschirm Maintenance auf SONICATOR SOLUTION Drain tippen. Der Rest der Ultraschalllösung fließt

aus der Ultraschallwaschstation ab.

9.2. Auf SONICATOR SOLUTION Fill tippen. Der Dispensierkopf bewegt sich nach rechts und gibt den Zugang zur

Ultraschallwaschstation frei.

9.3. Die Fronttür öffnen.

9.4. Die Ultraschallwaschstation manuell mit Ethanol 100 % befüllen.

9.5. Die Fronttür schließen und das Gerät in die Ausgangsstellung bringen.

9.6. Im Bildschirm Maintenance auf CLEAN DAILY tippen.

9.7. Daraufhin werden die Nadeln 30 Minuten lang in Ethanol getaucht. Siehe Abbildung G11.

10. Die Vorratsflasche für die Ultraschallwaschstation befüllen:

10.1. Mindestens 100 ml einer Lösung aus deionisiertem Reinstwasser und Ethanol 100 % im Volumenverhältnis

50 : 50 herstellen.

10.2. Im Bildschirm Maintenance auf SONICATOR SOLUTION Drain tippen.

10.3. Im Bildschirm Maintenance auf SONICATOR SOLUTION Fill tippen.

10.4. Die Vorratsflasche für die Ultraschallwaschstation aus dem Waschstationsbereich der Reinigungsstation

nehmen. Sobald die Vorratsflasche aus dem Waschstationsbereich gehoben wird, verschließt der

Kugelstopfen die Öffnung.

10.5. Die Vorratsflasche so drehen, dass die Reservoiröffnung nach oben zeigt, und sie mit der 50 : 50-Lösung aus

Wasser und Ethanol befüllen.

10.6. Die Vorratsflasche über ein Spülbecken halten und die Öffnung mit dem Daumen verschließen. Dann die

Vorratsflasche so drehen, dass die Reservoiröffnung nach unten zeigt. Der Kugelstopfen sinkt nun ab.

Abbildung G11: Tägliche Reinigung der Nadeln

Abbildung G12: Vorbereitung der Nadeln

Abbildung G13: Nadeln in Ethanol tauchen (SOAK)

Abbildung G9: Ventilstellung beim Befüllen des Vorratstanks – A2

Abbildung G10: Entleeren des Vorratstanks, Stellung während des normalen Betriebs – B1

24


501-DE, R04 2016/09

10.7. Den Daumen von der Öffnung nehmen, wenn sich der Kugelstopfen an der Flaschenöffnung befindet. Der

Kugelstopfen verschließt nun die Öffnung. Während der Kugelstopfen die Flasche verschließt, kann eine kleine

Menge der Lösung aus der Flasche austreten.

10.8. Die Vorratsflasche (mit der Öffnung nach unten) wieder auf den Waschstationsbereich der Reinigungsstation

stellen und fest einsetzen, sodass der O-Ring den Übergang zwischen Flasche und Waschstation abdichtet.

10.9. Nun füllt sich die Ultraschallwaschstation mit Flüssigkeit aus der Vorratsflasche. Der größte Teil des

Flascheninhalts fließt in die Ultraschallwaschstation.

10.10. Die Fronttür schließen.

11. Die Nadeln eintauchen:

11.1. Im Bildschirm Maintenance auf COMPLETE CYCLE tippen.

11.2. Im daraufhin angezeigten Fenster wash cycles 10 volle Zyklen (cycles) auswählen und auf OK klicken. Siehe

Abbildung G12.

11.3. Im Bildschirm Maintenance auf CLEAN DAILY tippen.

11.4. Im Fenster daily pin cleaning auf SOAK tippen. Der Zähler hält an und die Nadeln bleiben in der Flüssigkeit.

Siehe Abbildung G13.

Falls der Nanodispenser an diesem Tag bereits benutzt wurde und am selben Tag noch weitere Transfers von Proben auf einen SpectroCHIP-Array erfolgen sollen, kann Schritt 9 (Nadeln reinigen) entfallen. Allerdings muss mithilfe der Funktion SOAK sichergestellt werden, dass die Nadeln die ganze Zeit über in Flüssigkeit

getaucht bleiben.

G2. ENTSALZUNG DER PRODUKTE DER EXTENSIONSREAKTION MIT IONENAUSTAUSCHER-HARZ (CLEAN RESIN)

Bei der Handhabung jeglicher Ausrüstungsgegenstände, Komponenten und Reagenzien wie etwa Clean Resin

müssen Handschuhe und eine Schutzbrille getragen werden. Solange Clean Resin nicht gebraucht wird, den Behälter fest verschlossen halten. Andernfalls trocknet das

Ionenaustauscher-Harz aus. Diese Arbeitsschritte auf einer sauberen Kunststoffunterlage durchführen. Das von der Dimple-Plate

abgeschabte überschüssige Ionenaustauscher-Harz fällt auf die Kunststoffunterlage und kann zur späteren Verwendung direkt wieder in den zugehörigen Behälter gegeben werden.

Vor der Verwendung des Ionenaustauscher-Harzes überprüfen, ob sich dessen Farbe und Beschaffenheit gegenüber dem ursprünglichen Zustand nicht verändert haben.

1. Die Reaktionsplatte erforderlichenfalls auf Raumtemperatur auftauen lassen.

2. Die Reaktionsplatte kurz zentrifugieren.

3. 3 Löffel Clean Resin auf eine saubere, trockene Dimple-Plate transferieren (15 mg Ionenaustauscher-

Harz/Vertiefung). Sicherstellen, dass die Dimple-Plate für Platten mit Rahmen geeignet ist.

4. Das Clean Resin mit dem Schaber auf der Dimple-Plate verteilen, sodass es sich gleichmäßig in allen

Vertiefungen absetzt.

5. Überschüssiges Ionenaustauscher-Harz mit dem Schaber von der Dimple-Plate schaben.

6. Die Platte mit dem Ionenaustauscher-Harz 5–10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen, bis die Farbe

des Ionenaustauscher-Harzes etwas heller wird und es eher gelb als braun aussieht. Das kann je nach

Luftfeuchtigkeit unterschiedlich lange dauern.

7. SQ sealing foil sehr vorsichtig von der Reaktionsplatte abziehen. Um eine Kreuzkontamination durch Amplicons

zu vermeiden, die SQ sealing foil sofort entsorgen, ohne sie auf eine Arbeitsfläche zu legen/kleben.

8. Während die Platte mit dem Ionenaustauscher-Harz trocknet, in jede Vertiefung der Reaktionsplatte 41 µl

WATER MS plus zugeben. Das Endvolumen pro Vertiefung beträgt 50 µl (5 µl PCR + 2 µl SAP + 2 µl iPLEX-

Extensionsreaktion + 41 µl Water MS plus).

9. Um in jeder Vertiefung das getrocknete Ionenaustauscher-Harz hinzuzufügen, die Probenplatte vorsichtig über

Kopf drehen, auf die Dimple-Plate herabsenken und darauf absetzen. Dabei müssen die Vertiefungen der

Probenplatte auf die harzgefüllten Vertiefungen ausgerichtet sein.

10. Die Probenplatte und die Dimple-Plate weiter zusammenpressen und umdrehen, sodass jetzt die Dimple-Plate

auf der Probenplatte liegt.

11. Leicht auf die Dimple-Plate klopfen, damit das Ionenaustauscher-Harz in die Vertiefungen mit den Proben fällt.

12. Die Dimple-Plate abnehmen.

13. Die Reaktionsplatte mit SQ sealing foil verschließen und kurz zentrifugieren, um jegliche Luftblasen zu

entfernen.

14. Die Reaktionsplatte mindestens 15 Minuten lang 360° um ihre Längsachse drehen. Sicherstellen, dass sich das

Ionenaustauscher-Harz gut mit der Reaktionslösung vermischt.

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501-DE, R04 2016/09

15. Die Platte mindestens 15 Minuten lang bei 560 x g zentrifugieren.

Wenn nicht gleich mit dem Transferschritt fortgefahren wird, die Reaktionsplatte bis zu zwei Wochen lang bei -35/-20 °C lagern.

G3. TRANSFER DER EXTENSIONSPRODUKTE AUF EINEN SPECTROCHIP-ARRAY

1. Die SQ sealing foil sehr vorsichtig von der Reaktionsplatte abziehen, um jegliche Kreuzkontamination zwischen den

Vertiefungen zu vermeiden; die Folie auf sich selbst falten und sofort entsorgen, ohne sie auf irgendeine


2. Die Fronttür öffnen.

3. Die Reaktionsplatte auf der Position MTP 1 des Nanodispensers platzieren. Die Position A1 zeigt nach unten links.

Die Position MTP 1 ist die Position links auf dem Gerät.

4. Den SpectroCHIP-Array aus der Originalverpackung nehmen und den Barcode in der linken unteren Ecke beachten.

5. Den SpectroCHIP-Array auf Position 1 der SCOUT-Platte (oben links auf der SCOUT-Platte) platzieren. Den

SpectroCHIP-Array so positionieren, dass sich der Barcode in der linken unteren Ecke befindet.

Bei der Handhabung von SpectroCHIP-Arrays müssen immer neue Handschuhe getragen und die bereitgestellte Pinzette verwendet werden. Die Oberfläche des SpectroCHIP-Arrays auf keinen Fall berühren.

6. Die SCOUT-Platte so auf der Arbeitsfläche ausrichten, dass die abgeschrägten Ecken nach rechts zeigen.

7. 60 µl 3-Pt Calibrant in das Kalibrantenreservoir pipettieren.

8. Die Fronttür des Nanodispensers schließen.

9. Die Funktion SOAK (Eintauchen der Nadeln) abbrechen.

10. Auf HOME tippen.

11. Auf Back tippen, um ins Hauptmenü (Main Menu) zurückzukehren.

12. TRANSFER wählen.

13. Um den Inhalt einer (1) Reaktionsplatte auf einen (1) SpectroCHIP-Array zu transferieren, MTP 1 auswählen und auf

Continue tippen. Siehe Abbildung G14.

14. Um den Inhalt von zwei Reaktionsplatten auf zwei SpectroCHIP-Arrays zu transferieren, MTP 1 and 2 auswählen

und auf Continue tippen.

15. Die MTP-Position mit Continue bestätigen oder mit Back zum vorangegangenen Bildschirm zurückkehren, um dort

die andere Option auszuwählen. Siehe Abbildung G15.

16. Die SpectroCHIP-Position mit Continue bestätigen oder mit Back zum vorangegangenen Bildschirm zurückkehren,

um dort die andere Option auszuwählen. Siehe Abbildung G16.

17. Auf run tippen, um den Transfer zu starten.

Überprüfen, ob der oben links in der Ecke angezeigte Methodendateiname der gewünschten Transfermethode (MTP 1 und 2 bzw. MTP 1) entspricht.

18. Der Bildschirm zur Vorbereitung der Spülstation (rinse station preparation) erscheint. Auf OK tippen und

überwachen, wie die Spülstation kurz anläuft. Wenn aus den Aufstiegsröhren der Spülstation Wasser fließt, arbeitet

die Spülstation ordnungsgemäß.

Abbildung G14: Je nachdem, ob ein oder zwei Platten transferiert werden sollen, eine Vorgehensweise wählen

Abbildung G15: MTP-Position bestätigen

Abbildung G16: SpectroCHIP-Position bestätigen

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501-DE, R04 2016/09

19. Danach erscheint eine Aufforderung (siehe Abbildung G19):

• Auf YES tippen, wenn die Spülstation ordnungsgemäß gearbeitet hat.

• Auf RETRY tippen, um den Test der Spülstation zu wiederholen.

• Auf NO tippen, wenn die Spülstation nicht ordnungsgemäß gearbeitet hat.

Der Transfer beginnt, nachdem bestätigt wurde, dass die Spülstation ordnungsgemäß arbeitet. Bei Verwendung des

Standard-Array-Formats mit 6 Nadeln dauert es ca. 20 Minuten, den Transfer von einer 96-Well-Mikrotiterplatte zu einem

96er-SpectroCHIP-Array durchzuführen.

Der Transfer kann jederzeit mithilfe der Schaltfläche STOP angehalten werden. Bevor der automatischen Betrieb

stoppt, wird der letzte Vorgang abgeschlossen. Bitte alle teilweise gespotteten SpectroCHIP-Arrays verwerfen und

überprüfen, ob das auf der Reaktionsplatte vorhandene Volumen ausreicht, um den Transfer mit einem neuen

SpectroCHIP-Array zu wiederholen. Andernfalls die Vertiefungen bis zum ursprünglichen Niveau auffüllen. Um das Gerät

sofort anzuhalten, die rote STOPP-Taste am Gerät – neben dem Bildschirm – drücken. Dadurch wird jede Bewegung

sofort gestoppt.

20. Nach Abschluss des

Dispensiervorgangs zeigt der Bildschirm im MTP-Diagramm alle Vertiefungen, aus denen Proben transferiert

wurden, und alle gespotteten Felder im Diagramm für den SpectroCHIP-Array. Die Schaltfläche RUN wird nicht

mehr als deaktiviert (grau) dargestellt. Siehe Abbildung G20.

21. Am Ende des Transfers erscheint ein Dialogfeld mit einer Warnmeldung – wie in Abbildung G21 dargestellt – falls

der Messwert des aufgebrachten Volumens in einem Feld den zulässigen Bereich für einen ordnungsgemäßen

Dispensiervorgang überschreitet. Auf OK klicken, um fortzufahren. Die Position der betroffenen Vertiefungen für

eine spätere Fehlerbehebung dokumentieren.

22. Im Bildschirm TRANSFER auf BACK tippen.

23. Im Bildschirm Main Menu auf VOLUME tippen. Daraufhin werden die Daten zu den gespotteten Volumina

angezeigt. Jeder Transfer wird mit der ID des zugehörigen SpectroCHIP-Arrays bezeichnet. Siehe Abbildung G22.

open wählen, um das gespottete Volumen anzuzeigen, oder cancel wählen, um zum Hauptbildschirm

zurückzukehren.

24. In einem beliebigen Bildschirm auf die Schaltfläche PARK tippen, um den Dispensierkopf anzuhalten. Der

Dispensierkopf bewegt sich und gibt den Zugang zur Arbeitsfläche frei.

25. Die Fronttür öffnen.

26. Die gefederten Positionshalter von der SCOUT-Platte wegziehen und diese von der Arbeitsfläche heben.

27. Die SpectroCHIP-Arrays mit einer Pinzette von der SCOUT-Platte abnehmen und in den Chip-Träger des

MassARRAY Analyzer einsetzen, um sie sofort zu messen.

28. Die Reaktionsplatte(n) von der SCOUT-Platte nehmen und für weitere Dispensiervorgänge aufbewahren oder

entsorgen. Die Reaktionsplatte kann bis zu zwei Wochen bei -35/-20 °C gelagert werden.

Abbildung G17: Transfer von der MTP zum SpectroCHIP-Array

Abbildung G18: Vorbereitung der Spülstation 1

Abbildung G19: Vorbereitung der Spülstation 2

Abbildung G20: Transfer abgeschlossen

Abbildung G21: Volumenwarnung Abbildung G22: Volumendaten

27


501-DE, R04 2016/09

29. Die SCOUT-Platte wieder auf die Arbeitsfläche stellen und die Fronttür schließen.

30. Das Kalibrantenreservoir leeren und den Kalibranten für die zukünftige Verwendung in den

Kalibrantenvorratsbehälter zurückgeben. Den Kalibranten bei -20 ºC lagern. Das Kalibrantenreservoir mit WATER

MS plus reinigen.

3-Pt Calibrant aus dem Kit darf nicht öfter als 5 Mal eingefroren und aufgetaut werden.

31. Die Fronttür schließen.

32. Auf die Schaltfläche HOME tippen. Warten, bis sich der Dispensierkopf in die Startposition bewegt hat.

33. Im Bildschirm Maintenance auf COMPLETE CYCLE tippen.

34. Im daraufhin angezeigten Fenster wash cycles 3 volle Zyklen (cycles) auswählen und auf OK klicken.

35. Im Bildschirm Maintenance auf CLEAN DAILY tippen.

36. Im Fenster daily pin cleaning auf SOAK tippen. Der Zähler hält an und die Nadeln bleiben in der Flüssigkeit.

Falls am selben Tag noch weitere Transfers geplant sind, müssen die Nadeln bis zum nächsten Transfer in der

Flüssigkeit bleiben.

Falls das Gerät an diesem Tag nicht mehr gebraucht wird, die Vorratsflasche 50%igem Ethanol auffüllen, damit

die Nadeln über Nacht mit der Funktion SOAK in die Flüssigkeit eingetaucht werden können. Die Waschstation

vorher nicht leeren. Siehe die Schritte 10–11 in Abschnitt G1 (Vorratsflasche für Ultraschallwaschstation füllen

und Nadeln eintauchen).

Falls das Gerät länger als einen Tag nicht verwendet werden soll, das Gerät ausschalten. Dabei müssen die

Nadeln in die Ultraschalllösung der Waschstation getaucht und die Vorratsflasche mit 50%igem Ethanol

komplett gefüllt sein.

H. SPEKTRENAUFZEICHNUNG IM MASSARRAY DX ANALYZER

H1. AUSWAHL DER ANALYSEPARAMETER MITHILFE DER CHIP-LINKER-SOFTWARE

1. Die Chip-Linker-Software öffnen .

2. Das Passwort Darwin und den Benutzernamen Charles eingeben und Connect wählen. Das Fenster Chip Linker

wird angezeigt.

3. Im linken Fenster die zu analysierende Platte auswählen.

4. Folgende Optionen einstellen:

− Terminator Chemistry: iPLEX

− Process Method: Allelotype

− Dispenser: Nanodispenser 96 to 96

− Experiment name: Den Namen der ausgewählten Platte eintragen

− Chip barcode: Den Code eintragen, der auf der linken unteren Ecke des verwendeten SpectroCHIP-

Arrays steht

5. Add wählen. 6. Create und dann Exit wählen.

H2. SPEKTRENAUFZEICHNUNG MITHILFE DER SPECTROACQUIRE-SOFTWARE

1. Mit einem Doppelklick auf das Symbol Start All auf dem Desktop die Anwendungen AnalyzerControl, MassARRAY

Caller und SpectroACQUIRE starten. Auf dem Desktop erscheint das SpectroACQUIRE-Fenster.

Das Gerät MassARRAY Dx Analyzer 4 und alle drei Anwendungen müssen immer laufen. Sollte es erforderlich sein, sie auszuschalten bzw. zu beenden, bitte an den Kundendienst von Agena Bioscience wenden (E-Mail: [email protected]).


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2. In der Symbolleiste von SpectroACQUIRE auf Probe Sample In/Out klicken, um den Chiphalter zur Probenkammer

(Position „sample out“) zu bewegen. Alternativ dazu die Taste für die manuelle Steuerung des Probentisches an der

Gerätefront drücken (siehe Abbildung H1).

3. Wenn die Taste für die manuelle Steuerung des Probentisches aufgehört hat zu blinken, den Deckel der

Probenkammer öffnen (Abbildung H2) und den Chiphalter herausnehmen (Abbildung H3). Die SpectroCHIP-Arrays

aus dem vorangegangenen Lauf mit einer Pinzette aus dem Chiphalter entnehmen.

4. Die zu verarbeitenden SpectroCHIP-Arrays mit einer Pinzette in den Chiphalter einsetzen (Position 1 ist links,

Position 2 rechts).

Das Logo von Agena Bioscience auf dem SpectroCHIP-Array muss sich an der Unterkante des Chiphalters befinden, und jeder SpectroCHIP-Array muss korrekt eingesetzt sein, sodass der Chiphalter mit der Oberfläche der SpectroCHIP-Arrays eben abschließt. Außerdem ist vor dem Beladen sicherzustellen, dass die Proben getrocknet sind und sich auf dem SpectroCHIP-Array, dem Chiphalter sowie in der gesamten Probenkammer einschließlich des O-Rings keine Flüssigkeit und kein Staub befinden (siehe Abbildungen H2/H3).

Es ist wichtig, dass sich während eines Laufs immer zwei SpectroCHIP-Arrays im Chiphalter befinden. Wenn nur ein SpectroCHIP-Array verarbeitet werden soll, diesen in Chip-Position 1 einsetzen und den zuvor verarbeiteten SpectroCHIP-Array in Position 2 lassen.

5. Den Chiphalter mit dem zu analysierenden SpectroCHIP-Array wieder korrekt in der Probenkammer platzieren.

6. Den Deckel der Probenkammer fest herunterdrücken und in der Symbolleiste von SpectroACQUIRE Probe Sample

In/Out wählen.

7. Den Deckel heruntergedrückt lassen, bis das Zischgeräusch aufhört.

Die Taste für die manuelle Steuerung des Probentisches hört auf zu blinken, sobald sich der Chiphalter zur Position „sample in“ bewegt hat. Die Bereitschaftsanzeige des Analyzer 4 leuchtet, wenn ein Unterdruck von 5 x 10-6 mbar erreicht ist. Das dauert ungefähr zwei Minuten.

8. Auf der Registerkarte Automatic Run Setup das Kästchen neben Chip 1 und – sofern der zweite Chip analysiert

werden soll – das Kästchen neben Chip 2 markieren. Sicherstellen, dass im Bereich Geometry Use Calibration

Wells und Auto Teach Geometry ausgewählt sind.

Aus Sicherheitsgründen immer die Option Turn off HV after last chip is complete aktivieren, damit nach

Abschluss der Datenaufzeichnung automatisch die Hochspannung ausgeschaltet wird.

Abbildung H1: Manuelle Steuerung des Probentisches

Abbildung H2: Deckel der Probenkammer

Abbildung H3: Chiphalter und O-Ring der Probenkammer

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9. Überprüfen, ob die Bereitschaftsanzeige Ready auf der frontseitigen Anzeige des Geräts inzwischen grün leuchtet

und ein Unterdruck von mindestens 3 x 10-6 mbar erreicht wurde, damit der Lauf gestartet werden kann.

10. In der Symbolleiste von SpectroACQUIRE auf die Schaltfläche Start Autorun klicken.

Während der automatischen Verarbeitung zeigt die Registerkarte Automatic Run ein farbcodiertes Bild der beiden Chip-Positionen. Gelb zeigt den derzeit verarbeiteten SpectroCHIP-Array an; Grün zeigt an, dass die Verarbeitung abgeschlossen ist, und Rot zeigt einen Fehler an.

Am Ende der Aufzeichnung werden die erzeugten Spektren automatisch gespeichert und stehen sofort für die Analyse mit der MassARRAY Typer und iGenetics ® Software zur Verfügung.

Abbildung H4: Registerkarte Automatic Run Setup

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H3. ARBEITSVORGÄNGE NACH DER SPEKTRENAUFZEICHNUNG

MassARRAY Dx Nanodispenser RS1000

1. Die Dimple-Plate und den Schaber über einer sauberen Kunststoffunterlage leicht ausschütteln, um alle

Ionenaustauscher-Harz-Rückstände zu beseitigen. (Das geht leichter, wenn die Ionenaustauscher-Harz-Rückstände

getrocknet sind.)

Von Zeit z u Zeit müssen diese Platten mit Reinstwasser gereinigt und vor der nächsten Verwendung getrocknet werden.

2. Im Bildschirm Main Menu auf SHUT DOWN tippen.

3. Im eingeblendeten Dialogfenster zum Herunterfahren auf SHUT DOWN tippen. Daraufhin wird eine Meldung

angezeigt. Angeben, ob die Gerätekonfigurationsdatei (DispenseCONFIG.xml) gespeichert werden soll. Die Datei

DispenseCONFIG.xml enthält Konfigurationsparameter für das Gerät (zum Beispiel die derzeit geladenen

Verfahrens- und Dispensiereinstellungen).

YES: Speichert die aktuelle Gerätekonfiguration in der Datei DispenseCONFIG.xml. Die

Parametereinstellungen in der Konfigurationsdatei werden beim nächsten Start des Geräts verwendet. In der

Regel empfiehlt es sich, die Konfigurationsdatei zu speichern, sodass das Gerät die zuletzt verwendeten

Einstellungen der Konfigurationsparameter verwendet. Falls Unsicherheit besteht, ob Änderungen an den

Parametern vorgenommen wurden, oder falls unabsichtlich Änderungen vorgenommen wurden, NO wählen.

Beim nächsten Programmstart werden dann die letzten bekannten (und wahrscheinlich funktionierenden)

Einstellungen wieder geladen.

NO: Die aktuelle Konfiguration wird nicht gespeichert. Die zuletzt in der Datei DispenseCONFIG.xml

gespeicherten Konfigurationsparameter werden beim nächsten Einschalten des Geräts verwendet.

5. Nach der Wahl von YES oder NO wird Windows beendet und der eingebaute Computer ausgeschaltet. Es dauert

ungefähr eine Minute, den eingebauten Computer herunterzufahren. Dann erscheint auf dem Berührungsbildschirm

folgende Meldung: PC NO INPUT SIGNAL

6. Den Netzschalter des Geräts auf OFF (O) stellen, um das Gerät ganz auszuschalten.

7. Die Fronttür öffnen. Sicherstellen, dass sich der Dispensierkopf in der Parkposition befindet. Den Dispensierkopf

vorsichtig nach unten in das Flüssigkeitsreservoir drücken, sodass die Nadelhohlräume vollkommen mit Flüssigkeit

gefüllt sind.

Die Nadeln dürfen zwischen den Transfers nie der Luft ausgesetzt sein.

MassARRAY Dx Analyzer 4

Die analysierten SpectroCHIP-Arrays müssen im Gerät verbleiben und können bei der nächsten Verwendung ersetzt

und entsorgt werden.

Aus Sicherheitsgründen muss immer überprüft werden, ob die Hochspannung nach Abschluss der

Datenaufzeichnung ausgeschaltet wurde. (Siehe Abbildung H4: Es sollte immer Turn off HV after last chip is complete

ausgewählt werden.)

Abbildung H5: Herunterfahren Abbildung H6: dispenseCONFIG.xml speichern?

Abbildung H7: Korrekte Stellung des Dispensierkopfes nach dem Herunterfahren

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501-DE, R04 2016/09

I. ERGEBNISANALYSE

I.1 ERGEBNISANALYSE MIT DER MASSARRAY-TYPER-SOFTWARE

Nach der Analyse des SpectroCHIP-Arrays werden die Daten automatisch an den Datenbankserver übertragen. Dieser

Vorgang kann einige Minuten dauern.

1. Die MassARRAY Typer 4.0 Software aufrufen, die unter folgendem Pfad zu finden ist:


2. Das TyperAnalyzer-Symbol wählen.



4. Der TyperAnalyzer Project Explorer (in der linken oberen Ecke des Fensters) zeigt alle in der Datenbank

enthaltenen Ergebnisse nach Datum, Assay oder Kunde geordnet. Auf das +-Symbol klicken, um einen Knoten

aufzuklappen und zum gewünschten SpectroCHIP-Array zu navigieren.

5. Auf den gewünschten SpectroCHIP-Array in der Verzeichnisstruktur des Project Explorer doppelklicken, um diesen

SpectroCHIP-Array in die Liste der Chips (Chip List, im Fenster TyperAnalyzer links in der Mitte) aufzunehmen.

6. Um die Ergebnisse anzuzeigen, neben dem SpectroCHIP-Array in der Chip List ein Häkchen setzen.

7. Um das Spektrum anzuzeigen, die Schaltfläche View in der Symbolleiste und dann den Bereich Details wählen.

Alternativ dazu eine Probenposition im Bereich Traffic Light auswählen, mit der rechten Maustaste klicken und

Details wählen. (Abbildung I1 zeigt die TyperAnalyzer-Software mit dem Bereich Details.)

Abbildung I1: TyperAnalyzer-Software mit dem Bereich Details

8. Das Kalibrantenspektrum auswerten:

8.1. Im Fenster Details auf das Symbol klicken, um das Spektrum des 3-Pt Calibrant anzuzeigen (siehe

Abbildung I2).

8.2. Es müssen drei Peaks mit den folgenden Massen vorhanden sein:

5044,4 Da (Kalibrant 1)



8.3. Überprüfen, ob das Spektrum bei der halben Masse der Kalibrantenpeaks 2 und 3 (4243 Da und 4988 Da)

Peaks mit einer geringen Intensität aufweist. Die Anzeige stellt das Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) dar.

Doppelt geladene Ionen können bei der halben Masse des einfach geladenen Analyten angezeigt werden; das

heißt, das Kalibrantenpeak 2 tritt auch bei 8486,6/2 = 4.243,3 Da auf und das Kalibrantenpeak 3 auch bei

9977,6/2 = 4.988,8 Da.

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501-DE, R04 2016/09

8.4. Kurz vor und nach den Peaks 1, 2 und 3 müssen Peaks mit sehr geringer Intensität (noch niedriger als bei den

genannten doppelt geladenen Ionen) vorhanden sein. Hierbei handelt es sich um Depurinierungen und

Depyrimidierungen der Kalibranten 1, 2 und 3 (-111/-135 Da) sowie um zweifach decarboxylierte 3-HPA-

Addukte zu jeder der drei Kalibrantenpeaks (+189 Da).

8.5. Die in Schritt 8.3 und 8.4. erwähnten Peaks sind Artefakte des Analyseverfahrens MALDI-TOF.

8.6. Falls die Intensität (Höhe) des Kalibranten 1 weniger als 100 beträgt, überprüfen, ob das 3-Pt-Calibrant-Aliquot

nicht öfter als fünfmal eingefroren/aufgetaut wurde, und bei der nächsten Analyse ein frisches Aliquot 3-Pt

Calibrant verwenden. Sollte die Intensität weiterhin niedrig sein, an den Kundendienst wenden (E-Mail:

[email protected]).

Abbildung I2: Kalibrantenspektrum

Bitte beachten, dass es nicht möglich ist, das Kalibrantensignal für eine Qualitätskontrolle der Analyse zu verwenden.

9. Um den Bereich Plate Data anzuzeigen, in der Symbolleiste View und dann Plate Data Pane wählen.

10. In der Symbolleiste des Bereichs Plate Data das Diskettensymbol wählen, um die Daten zur betreffenden Platte zu

sichern.

11. Im daraufhin angezeigten Dialogfeld auswählen, wo die Datei gespeichert werden soll. Die Datei als CSV-Datei

(durch Trennzeichen getrennte Datei, Dateiergänzung .csv) unter dem Namen des Experiments bzw. der Platte

speichern. Save wählen.

Im nächsten Schritt wird die CSV-Datei mithilfe der iGenetics-Software verarbeitet, um die Ergebnisse auszuwerten

und einen Bericht zu erstellen.

I.2 ERGEBNISANALYSE MIT DER IGENETICS-SOFTWARE

1. Auf das Symbol doppelklicken, um die Software zu öffnen. (Das Symbol ist normalerweise auf dem Desktop zu

finden.)

2. Ein Anmeldefenster wird geöffnet; Als Benutzerkennung (User ID) „user“ und als Passwort „user“ eingeben. Auf die

Schaltfläche OK klicken.

3. Daten importieren und analysieren:

3.1. In der Symbolleiste die Schaltfläche MassARRAY Dx und dann Run Processing wählen. Das Fenster Plate

Data Processing wird geöffnet.

3.2. Auf das Symbol Plate Data Pane klicken, um die Datei mit den Plattendaten (CSV-Format) zu importieren,

die zuvor im TyperAnalyzer erstellt wurde. Im daraufhin angezeigten Dialogfeld Import zur CSV-Datei

navigieren und Open wählen.

3.3. Auf die Schaltfläche Data Reading klicken. Nun erscheint die Datentabelle im Dialogfeld.

3.4. Die Schaltfläche Uploading and processing run data wählen, um die Analyse zu starten.

3.5. Nach Abschluss der Analyse wird automatisch die Tabelle mit den Ergebnissen des Laufs (Run Result Table)

geöffnet. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse für jeden Marker und jede DNA-Probe.

3.6. Überprüfen, ob bei allen Markern das Ergebnis für die Negativkontrolle (NTC, non-template control) FAILED –

BAD WELL lautet.

3.7. Überprüfen, ob bei allen Markern das Ergebnis für die Wildtyp-Kontrolle WT (Wildtyp-Genotyp) lautet.

3.8. Auf eine Zeile doppelklicken, um ausführliche Informationen anzuzeigen. Das Fenster Marker Results View

wird geöffnet.


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3.9. Um zur Tabelle Run Result Table zurückzukehren, das Symbol Exit wählen.

3.10. Um eine bestimmte Probe oder einen bestimmten Marker zu suchen, das Lupensymbol wählen. Eine

Proben- oder Assay-ID eingeben und auf Search klicken. Es ist auch möglich, nach teilweisen

Übereinstimmungen und unter Verwendung des Prozentsymbols (%) als Platzhalter zu suchen.

3.11. Um die analysierten Daten zu exportieren, auf das Symbol Export results in Excel format klicken. Im

daraufhin erscheinenden Fenster mit der Meldung „Document created“ OK wählen. Um den Ordner zu öffnen,

in dem alle Berichte vorübergehend gespeichert werden, die Tasten Alt + X drücken. Es wurden zwei

Ausgabedateien erstellt: eine Excel-Datei und eine PDF-Datei. Um die Dokumente dauerhaft zu speichern, die

Dokumente öffnen und an einem anderen Ort/in einem anderen Ordner speichern.

4. Mit bereits in der Datenbank vorhandenen Daten arbeiten:

4.1. In der Symbolleiste die Schaltfläche MassARRAY Dx und dann Run Management wählen. Das Fenster Table

Plate Data Management wird geöffnet.

4.2. Die gewünschte Datei auswählen und auf das Symbol View the Run Result Table klicken. Es ist auch

möglich, nach dem Dateinamen oder dem Datum des Analyselaufs zu suchen.

4.3. Zur Datenauswertung die obigen Schritte 3.8 bis 3.11 ausführen.

Tabelle I1 zeigt eine Liste sämtlicher möglichen Ergebnisse und Warnmeldungen, die im iGenetics-Bericht erscheinen

können. Bei jeder gemeldeten Mutation muss eine manuelle Überprüfung des Spektrums im TyperAnalyzer (wie im

nachfolgenden Abschnitt I.3 beschrieben) durchgeführt werden, um den Mutationsstatus zu verifizieren. Darüber hinaus

muss eine manuelle Überprüfung des Spektrums im TyperAnalyzer erfolgen, wenn eine der in Tabelle I1 aufgeführten

Warnmeldungen erscheint.

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Tabelle I1: Liste der möglichen Warnmeldungen/Beschreibungen, nach Ergebnissen geordnet

Mögliche

Ergebnisse

(Spalte mit

Markerwerten)

Warnmeldung/Beschreibung

Beschreibung des

Ergebnisses in der

Software

Mögliches Vorgehen zur

Bestimmung

des Endergebnisses

WT

Wildtyp-Marker (nicht

mutiert)

WT SPECTRUM QUALITY

CHECK

Wildtyp-Marker (nicht

mutiert)

Manuelle Überprüfung des

Spektrums im TyperAnalyzer

(siehe Abschnitt I.3).

AA MUTATION

code

SPECTRUM VISUAL

INSPECTION

Marker mit der

beschriebenen Mutation

Eine Mutation muss immer durch

eine manuelle Überprüfung des

entsprechenden Spektrums

bestätigt werden, wenn die

Warnmeldung „Spectrum visual

inspection“ erscheint – unabhängig

davon, ob auch die Warnmeldung

„Spectrum quality check“

angezeigt wird.

AA MUTATION

code

SPECTRUM QUALITY

CHECK

Marker mit der

beschriebenen Mutation

UNSPECIFIED

SPECTRUM VISUAL

INSPECTION

Nicht spezifizierter Marker Wenn die Warnmeldung

„Spectrum visual inspection“

erscheint, sollte versucht werden,

den nicht spezifizierten Status der

Probe durch eine manuelle

Überprüfung des Spektrums zu

bestätigen – unabhängig davon,

ob auch die Warnmeldung

„Spectrum quality check“

angezeigt wird.

UNSPECIFIED SPECTRUM QUALITY

CHECK

Nicht spezifizierter Marker

FAILED BAD WELL Analyse von Composite-

Assays aufgrund einer

unerwarteten Genotyp-

Kombination

fehlgeschlagen.

Falls die Probe bei allen anderen

Markern das Ergebnis „WT“ liefert,

die komplette Analyse der Probe

ab der PCR wiederholen.

Falls die Probe bei einem der

anderen Marker eine Mutation

aufweist, ist eine Wiederholung der

Analyse nur erforderlich, wenn der

bereits identifizierte

Mutationsstatus keinen Aufschluss

über die relevante Analyse gibt.

FAILED BAD QUALITY Analyse aufgrund

unzureichender

Qualitätseigenschaften

fehlgeschlagen (z. B.

Massenverschiebung,

Raster und UEP

[unextended primer, nicht

verlängerter Primer]

außerhalb des zulässigen

Bereichs; Assays mit der

Beschreibung „Bad

spectrum“ oder „No-

Alleles“ in der Analyse

durch die Typer 4.0

Software).

FAILED BAD SNR Analyse fehlgeschlagen,

weil das Signal-Rausch-

Verhältnis (signal-to-noise

ratio, SNR) niedriger ist als

für alle möglichen Allele

und den nicht verlängerten

Primer (unextended

primer, UEP) zulässig.

INVALID Analyse fehlgeschlagen,

weil zwei oder mehr nicht

spezifizierte Assays für

Versuchen, den nicht spezifizierten

Status der Probe durch eine

manuelle Überprüfung des

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501-DE, R04 2016/09

denselben Marker

vorhanden sind.

entsprechenden Spektrums zu

bestätigen.

Empty CONTACT SUPPORT Allelkombination wird von

der Software nicht

unterstützt.

Den Kundendienst kontaktieren

([email protected])

5. In der iGenetics Software können Mutationsmeldungen („Calls“) korrigiert werden. Das kann erforderlich sein, wenn

der Benutzer beispielsweise einen Peak im TyperAnalyzer-Spektrum als Artefakt (Salzaddukt oder nicht

spezifizierter Peak) identifiziert.

5.1. In der Ansicht Marker Results (Tabelle mit Detailinformationen) die Schaltfläche Manual Call wählen. Nun

kann der Inhalt der Spalte „Call“ verändert werden. Zum Speichern der Änderungen auf Apply klicken. Die

Änderungen werden in der Spalte „Trail“ verfolgt. Bei jeder manuellen Änderung einer Mutationsmeldung wird

in der betreffenden Zeile ein Hinweis (Ausrufezeichen in einem Dreieck) hinzugefügt.

5.2. Um zur Tabelle Run Result Table zurückzukehren, in der Symbolleiste das Symbol Exit wählen.

5.3. Nachdem alle Änderungen durchgeführt wurde, müssen die Daten nochmals verarbeitet werden. In der

Symbolleiste MassARRAY Dx und dann Run Management wählen. Das Fenster Table Plate Data

Management wird geöffnet. Auswählen, welche Daten neu analysiert werden sollen, und auf das Symbol Run

Data Processing klicken. Elaborate wählen. Daraufhin wird ein Fenster mit der Meldung „Run data

already processed. Analyze them anyway?“ angezeigt. Auf Yes klicken. Nach Abschluss der erneuten Analyse

erscheint ein Fenster mit der Meldung „Process Completed“. Auf OK klicken und das Fenster schließen.

5.4. Die Datei mit den neu berechneten Daten öffnen, wie in Schritt 4.2 beschrieben.

I.3 ÜBERPRÜFUNG DER SPEKTRENQUALITÄT/SICHTPRÜFUNG DER SPEKTREN IM MASSARRAY TYPERANALYZER

1. Im Diagramm der analysierten Platte die Vertiefung mit dem zu überprüfenden Assay auswählen.

2. Die Qualität des gesamten Spektrums überprüfen; ein gutes Spektrum (Abbildung I3) erfüllt folgende Kriterien:

Flache Basislinie

Geringes Hintergrundrauschen

Geringe Massenverschiebung, erwartete Peaks entsprechen der detektierten Peakmasse

Keine oder nur wenige Addukt-Peaks zu sehen

Etwaige Addukte erzeugen Extrapeaks, die den erwarteten Massen entsprechen. Die am häufigsten vorkommenden Addukte sind nachstehend aufgeführt:

Ursprung des

Addukts

Zusätzliche

Masse gegenüber

dem erwarteten

Peak

Effekt

Natrium + 22 Da Der unerwartete Peak kann sich mit dem

Mutationspeak einer Mutation von C zu A

(Massendifferenz 24 Da) überlagern.

Kalium + 38 Da Der unerwartete Peak kann sich mit dem

Mutationspeak einer Mutation von G zu T

(Massendifferenz 40 Da) überlagern.

Kohlensäure + 63 Da Unerwartete Peaks, die im Spektrum auftreten

und sich mit einem anderen Assay überlagern

oder die Allelfrequenz eines anderen Assays im

Spektrum verändern können.

Matrix-Addukte + 95 Da

+ 138 Da

+ 189 Da

Unerwartete Peaks, die im Spektrum auftreten

und sich mit einem anderen Assay überlagern

oder die Allelfrequenz eines anderen Assays im

Spektrum verändern können.

Anmerkungen

(1) Das übermäßig hohe Vorkommen von Addukten ist darauf zurückzuführen, dass die

Behandlung der Reaktionsprodukte mit Clean Resin ineffektiv war. Zur Lösung dieses

Problems siehe den Abschnitt Fehlerbehebung.

(2) Addukte entstehen durch die Bindung von Salzen und Molekülen aus der Matrix des

SpectroCHIP-Arrays an das Extensionsprodukt und führen zum Auftreten unerwarteter

Peaks im Spektrum nach den einzelnen Analyten und/oder zu einem UEP-Peak.


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I3: Spektrum mit guter Qualität

I4: Spektrum mit schlechter Qualität

3. In den Bereich des Spektrums hineinzoomen, der den zu überprüfenden Assay enthält, und anhand folgender

Aspekte die Übereinstimmung mit dem von der iGenetics-Software ermittelten Ergebnis kontrollieren:

Ausreichende DNA-Qualität und -Quantität – dadurch zu bestätigen, dass kein oder nur ein geringer UEP-Peak

vorhanden ist.

Zuverlässigkeit der von der Software angezeigten Peaks – zu ermitteln durch folgende Maßnahmen:

a. Vergleich jedes Peaks mit den entsprechenden Peaks der Control DNA. b. Sorgfältige Kontrolle der Zentrierung der Peaks an der Stelle der erwarteten Masse (gepunktete Linie),

um sicherzustellen, dass der Peak, auf dem das Ergebnis beruht, kein Addukt darstellt. c. Kontrolle der Peakmorphologie: Gelegentlich können unerwartete Peaks geringer Intensität erzeugt

werden, die mit einer charakteristischen Einbuchtung vor den Hauptpeaks einhergehen (siehe Abbildung I5) und nicht auf einen echten Mutationspeak, sondern auf ein Artefakt hindeuten.

I5: Kontrolle der Peakmorphologie. Die Pfeile zeigen auf Artefakte.

I.4 WIEDERHOLUNG DER PROBENANALYSE

1. Alle Proben, bei denen die Analyse fehlgeschlagen ist oder ein unklares Ergebnis geliefert hat (wie in Tabelle I1

oder Abschnitt 14: Fehlerbehebung beschrieben) müssen – beginnend mit der DNA-Amplifikation – nochmals

getestet werden. Die Notwendigkeit zur Wiederholung einzelner Assays ist auf der Grundlage folgender Kriterien zu

beurteilen:

Obligatorisch, wenn eine Probe nach Abschluss aller Überprüfungsmaßnahmen in Bezug auf einen

Marker „UNSPECIFIED“ oder „FAILED“ und für alle anderen Marker „WT“ ist. Nach Ermessen des Bedieners, wenn eine Probe in Bezug auf einen oder mehrere Marker

„UNSPECIFIED“ oder „FAILED“ ist, aber gleichzeitig bei anderen Markern, die mit der zu untersuchenden krebsbezogenen Pharmakogenetik eng verknüpft sind, eine Mutation aufweist.

Nicht erforderlich, wenn die Qualitätskontrolle des Spektrums zu der Beurteilung führt, dass alle zu dem

nichtspezifizierten Assay gehörenden Peaks Hintergrund- oder Addukt-Artefakte darstellen. 2. Wenn die Qualitätskontrolle des Spektrums zu der Beurteilung führt, dass eines der Peaks eines IND-Assays

(indeterminate, unbestimmter Assay) das Vorhandensein eines mutierten Allels anzeigen könnte, an den

Kundendienst von Agena Bioscience wenden ([email protected]).

Wenn eine als UNSPECIFIED bezeichnete Probe nach der wiederholten Testung weiter „UNSPECIFIED“ ist, muss

sie mit anderen Verfahren untersucht werden.


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13) GRENZEN DES VERFAHRENS Eine mit dem MassARRAY Dx Colon Panel als Wildtyp identifizierte Probe (d. h. Genotyp wurde bei allen Assays als

Wildtyp identifiziert) könnte im KRAS-, BRAF-, NRAS- oder PIK3CA-Gen oder in anderen Genen Mutationen aufweisen,

auf die das Kit nicht testet.

14) FEHLERBEHEBUNG A. FEHLERBEHEBUNG MASSARRAY DX NANODISPENSER

PROBLEM MÖGLICHE URSACHE LÖSUNG

Das gemessene Volumen eines Transfers liegt

außerhalb des zulässigen Bereichs für einen

ordnungsgemäßen Dispensiervorgang.

Volumen unter 3,5 nl Zugrunde liegende Ursache

beheben (siehe unten) und den

Transfer von der MTP auf den

Chip mit denselben

SpectroCHIP Arrays

durchführen.

Volumen über 40 nl SpectroCHIP Arrays entsorgen,

zugrunde liegende Ursache

beheben (siehe unten) und den

Transfer von der MTP auf den

Chip wiederholen.

Unzureichende Reinigung

der Nadeln

Die Reinigung täglich

durchführen.

Die Nadeln waren längere

Zeit der Luft ausgesetzt/der

Nanodispenser war über

einen längeren Zeitraum im

Ruhezustand.

Nach jedem Transferlauf die

Funktion SOAK zum

Eintauchen der Nadeln

benutzen. (Die Nadeln des

Dispensierkopfes immer in der

Ultraschalllösung mit 50 %

Ethanol eingetaucht lassen.)

Wenn die Nadeln der Luft

ausgesetzt waren, 16

zusätzliche vollständige

Reinigungszyklen durchführen.

Verstopfte Nadeln Die Nadeln wöchentlich mit

0,1 M NaOH behandeln. (Siehe

den Abschnitt zur Wartung im

MassARRAY Dx

Nanodispenser RS1000 User

Guide.)

Fehlerhafte Positionierung

der Reaktionsplatte auf der

Arbeitsfläche.

Die Platte korrekt auf der

Arbeitsfläche positionieren.

Vor einem Lauf blinkt das Symbol für die

Statusanzeige rot.

Auf die rote Schaltfläche STATUS tippen, um den

Bildschirm Machine Status anzuzeigen.

Tankvolumen außerhalb

des zulässigen Bereichs.

Wenn neben „waste tank level

(high)“ ein hellgrünes Licht

angezeigt wird, den Abfalltank

entleeren.

Wenn neben „supply tank level

(low)“ ein hellgrünes Licht

angezeigt wird, den Vorratstank

befüllen.

Temperaturwert außerhalb

des zulässigen Bereichs.

Den Kundendienst von Agena

Bioscience kontaktieren.

Wert der Luftfeuchtigkeit

außerhalb des zulässigen

Bereichs.



Während eines Laufs wird eine Fehlermeldung

angezeigt, dass der Wasserstand im Vorratstank

niedrig ist.

Der Wasserstand im

Vorratstank ist niedrig.

Mit dem Transfer fortfahren und

den Tank nach Abschluss des

Transfers sofort mit ca. 2 Litern

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füllen. Bitte beachten: 1 Liter ist

ausreichend für einen

vollständigen Transfer.

Bei der Sichtprüfung der Arbeitsfläche des

Nanodispensers stellt sich heraus, dass die Spülstation

nicht ordnungsgemäß arbeitet.

Niedriger Flüssigkeitsstand

in der Zulaufleitung zur

Spülstation.

Im Dialogfeld auf retry tippen.

Falls das Problem dadurch

nicht gelöst wird, den

Kundendienst von Agena

Bioscience kontaktieren. Wenn

das Problem nicht sofort

behoben wird, kann es zu einer

Kreuzkontamination kommen.

Falsche Ventilstellung Stellung der Ventile überprüfen.





Die Ultraschalllösung läuft auf den entsprechenden

Befehl hin nicht aus der Ultraschallwaschstation ab und

es bleibt Flüssigkeit im Reservoir.

Leitungen oder Anschlüsse

sind nicht luftdicht.

Mehrmals versuchen, das

Reservoir zu leeren; hören, ob

die Ablaufpumpe der

Ultraschallwaschstation läuft.





Abfluss verstopft.

Ablaufpumpe außer

Funktion.

Falsche Anzahl von Referenzmarkierungen (d. h.

falsche Ausrichtung des SpectroCHIP-Arrays) erkannt.

Der SpectroCHIP-Array

wurde nicht korrekt

eingesetzt.

Sicherstellen, dass der

SpectroCHIP-Array korrekt auf

der SCOUT-Platte sitzt und die

SCOUT-Platte korrekt auf der

Arbeitsfläche sitzt. Falls das

Problem dadurch nicht gelöst

wird, einen neuen Versuch mit

einem neuen SpectroCHIP-

Array machen.

Eine oder mehrere

Referenzmarkierungen

können nicht abgelesen

werden.

Mit komprimiertem

Stickstoffgas den Schmutz vom

Bereich um das Feld A1

blasen.

Barcode des SpectroCHIP-Arrays kann nicht gelesen

werden.

Über den 2D-Barcode

schaben.

Nochmals versuchen, den

Dispensiervorgang zu starten.


nicht gelöst wird, einen neuen

Versuch mit einem neuen

SpectroCHIP-Array machen.

Die linke untere Ecke des

SpectroCHIP-Arrays ist

abgebrochen.

Das Gerät ist langsam und macht Pausen zwischen

den Bewegungen.

Das Gerät neu starten.

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B. FEHLERBEHEBUNG MASSARRAY DX ANALYZER 4


Das Gerät braucht länger als drei Minuten, um den

erforderlichen Unterdruck (5 x 10-6 mbar) aufzubauen.

Abbildung A

Die Probenkammer ist

nicht dicht

verschlossen.

Die Dichtfläche des Deckels

der Probenkammer mit einem

fusselfreien Tuch abwischen,

das mit Ethanol 50 %

angefeuchtet wurde. Den

Deckel der Probenkammer

geöffnet lassen, bis die

Oberfläche trocken ist

(Abbildung A). Der O-Ring darf

nicht mit Alkohol in Berührung

kommen.

Den O-Ring auf Partikel,

Fusseln und Wimpern

absuchen und diese ggf.

entfernen.

Defekter O-Ring Den O-Ring auf Risse

absuchen. Falls Risse

vorhanden sind, beim


Bioscience Ersatz anfordern.

Der Barcode-Bericht ist fehlerhaft oder kann nicht erstellt

werden.



Die Peak-Intensitäten sind zu niedrig. Die Laserenergie ist zu

niedrig.

Vor der Verarbeitung des

SpectroCHIP-Arrays im

Analyzer einen der

Kalibrantenspots beschießen

und überprüfen, ob der Peak

für den Kalibranten eine

Intensität > 100 aufweist. Den



Die Detektorspannung

ist zu niedrig.

Das auf ein Feld

aufgebrachte Volumen

liegt außerhalb des

zulässigen Bereichs.

Daten zum Volumen im

aktuellen Analyselauf aufrufen

und prüfen, ob rote

Kennzeichnungen vorhanden

sind. Den Kundendienst von

Agena Bioscience kontaktieren.

Keine Peak-Spektren, Kalibrantenspektrum vorhanden. Ionenaustauscher-Harz

wurde auf einen Spot

aufgebracht.

MTP abzentrifugieren und

vorsichtig auf die Arbeitsfläche

des Nanodispensers stellen.

Den Transfer von der MTP zum

SpectroCHIP-Array

wiederholen. Den



Die Form des Peaks ist zu breit. Der MassARRAY

Analyzer ist nicht

korrekt eingestellt.



Peaks passen nicht zu den erwarteten

Mutationsmeldungen.

Möglicherweise ist in

der SpectroACQUIRE-

Software die

Kalibrierung nicht

aktiviert.

Sicherstellen, dass der

Kalibrant auf den SpectroCHIP-

Array transferiert wurde.

Sicherstellen, dass die

Kalibrierung aktiviert ist. Falls

das Problem dadurch nicht

gelöst wird, den Kundendienst

von Agena Bioscience

kontaktieren.

Der MassARRAY

Analyzer ist nicht

korrekt eingestellt.

Kontaktfläche des

Deckels der

Probenkammer

O-Ring in der Nut

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Keine Genotypen detektiert. Der SpectroCHIP-Array

wurde nicht korrekt mit

einer Platte/Dispensier-

methode verknüpft.

Überprüfen, ob der

SpectroCHIP-Array in der

Datenbank korrekt mit einem

Experiment verknüpft ist.

In den Spektren sind

zwar Peaks vorhanden,

aber nicht bei den

erwarteten Massen,

weil der MassARRAY

Analyzer nicht genau

eingestellt ist.



C. FEHLERBEHEBUNG BEI DER DATENANALYSE


Die TyperAnalyzer-Software ist gesperrt. Es wurde mehrmals

hintereinander ein

falsches Passwort

eingegeben.

Sicherstellen, dass

das richtige Passwort

aus der vorliegenden

Gebrauchsanweisung

eingegeben wird.

Den Kundendienst

von Agena Bioscience

kontaktieren.

Wenn man auf das Symbol klickt, wird nicht das

Kalibrantenspektrum angezeigt.

Im Kalibrantenreservoir

wurde kein 3-Pt Calibrant

eingefüllt.

Den Kalibranten ins

Kalibrantenreservoir

füllen, wie in Schritt 7

des Abschnitts 12.G.3

beschrieben.

Der Kalibrant hat sich

infolge einer

unsachgemäßen

Lagerung zersetzt.

Den Kalibranten bei -

20 °C lagern und nicht

öfter als fünfmal

einfrieren/auftauen.

Nachdem in Typer 4.0 der zu analysierende SpectroCHIP-Array

ausgewählt wurde, zeigt der Ampelbereich eine Platte mit

weißen Vertiefungen. Die Analyse kann nicht durchgeführt

werden.

Der Vertiefung bzw. den

Vertiefungen in der Platte

wurden bei der Erstellung

der Platte im Plate Editor

keine Probennamen

zugewiesen.

Im Plate Editor eine

neue Platte mit

Probennamen für die

betreffenden

Plattenpositionen

erstellen.

Die RECALL-Funktion

in Chip Linker

verwenden, um die

erhaltenen Rohdaten

der neuen Platte

zuzuweisen (siehe

Anhang B).

Zu viel Ionenaustauscher-Harz in einer Vertiefung. Ungleicher Transfer von

Reagenzienmix/Wasser

oder Ionenaustauscher-

Harz.

Vorsichtig etwas

Ionenaustauscher-Harz

herauspipettieren, nur so

viel entfernen wie nötig.

Der Flüssigkeitsstand in einer Vertiefung ist weniger als 2,5 mm

über dem Ionenaustauscher-Harz.

Ungleicher Transfer von



Harz.

Mit einer Pipette

entionisiertes

Reinstwasser

hinzufügen, um den

Flüssigkeitsstand

anzuheben.

In manchen Vertiefungen ist der Flüssigkeitsstand niedriger als

in anderen.

Ungleicher Transfer von



Harz.

Mit einer Pipette

entionisiertes

Reinstwasser

hinzufügen, um den

Flüssigkeitsstand in den

41


501-DE, R04 2016/09

weniger hoch gefüllten

Vertiefungen

anzuheben.

Überprüfung der Spektrenqualität/Sichtprüfung der Spektren auf

Addukte

Bei einer oder mehreren Vertiefungen der Platte weist das

Spektrum immer wieder Addukte auf, die von der iGenetics-

Software fälschlicherweise als Einzel- oder Mehrfachmutationen

identifiziert werden (schwarze Pfeile im nachfolgend

dargestellten Spektrum).

In die Vertiefung(en) der

Dimple-Plate wurde kein

oder nicht ausreichend

Clean Resin eingebracht.

In alle Vertiefungen

der Dimple-Plate

Clean Resin

einbringen.

Sicherstellen, dass

alle Vertiefungen der

Dimple-Plate

vollständig mit Clean

Resin gefüllt sind.

Sicherstellen, dass

das Clean Resin aus

den einzelnen

Vertiefungen Dimple-

Plate an die

entsprechenden

Positionen auf der

Reaktionsplatte

transferiert wurde.

Das Clean Resin wurde

nicht mit den

Reaktionsprodukten

gemischt.

Nach dem Zufügen

des

Ionenaustauscher-

Harzes die

Reaktionsplatte kurz

zentrifugieren, um

jegliche Luftblasen

zwischen der

Flüssigkeit und dem

Ionenaustauscher-

Harz zu entfernen.

Sicherstellen, dass

sich die

Reaktionsprodukte

tatsächlich mit dem

Ionenaustauscher-

Harz vermischt haben.

Clean Resin wurde

unsachgemäß gelagert.

Kontakt des

Ionenaustauscher-

Harzes mit der Luft

vermeiden.

Die Flasche mit dem

Ionenaustauscher-

Harz nach jedem

Gebrauch fest

verschließen.

Keine

Ionenaustauscher-

Harz-Reste aus

vorhergehenden Kits

verwenden.

Falschpositive Ergebnisse, weil die Spektren zusätzliche Peaks

zeigen [erwarteter Peak + 22 Da (Na) und/oder + 38 Da (K)].

Clean Resin ist zu trocken

oder wurde der Platte

nicht zugefügt.

Sicherstellen, dass

Clean Resin zugefügt

wurde. Das

Ionenaustauscher-Harz

nicht länger als 5–

10 Minuten trocknen

lassen. Die Platte

42


501-DE, R04 2016/09

weitere 30–45 Minuten

drehen.

Ergebnis FAILED (BAD QUALITY)

Eine oder mehrere Vertiefungen der Platte weisen ein abnormes

Spektrum mit unerwarteten Peaks (Durchläufer) auf.

Den PCR-Produkten

wurde kein SAP-Cocktail

zugegeben.

Das Verfahren ab der

Amplifikation

wiederholen.

Fehler bei der Herstellung

des SAP-Cocktails.


Amplifikation

wiederholen.


Eine oder mehrere Vertiefungen der Platte zeigen Peaks, die

sich nicht an den erwarteten Stellen für Mutationen befinden.

Möglicherweise ist in der

SpectroACQUIRE-

Software die Kalibrierung

nicht aktiviert.

Sicherstellen, dass die

Kalibrierung aktiviert

ist.

Den Kundendienst von

Agena Bioscience

kontaktieren.

Ergebnis FAILED (BAD SNR)

Eine oder mehrere Vertiefungen der Platte weisen ein abnormes

Spektrum ohne Peaks für Analyten und Extensionsprimer (UEP)

auf.

Der Cocktail für die

Extensionsreaktion wurde

nicht zugegeben oder

nicht korrekt hergestellt.


Amplifikation

wiederholen.

Nach kurzem

Zentrifugieren der

Platte das

Reaktionsvolumen in

jeder Vertiefung visuell

kontrollieren.


In allen Vertiefungen der Platte erhalten die Proben und

Kontrollen die Identifikation „No Alleles“. Es sind

Extensionsprimer(UEP)-Peaks, aber keine Analytenpeaks

vorhanden.

Der PCR-Cocktail wurde

nicht korrekt hergestellt

und/oder der Platte nicht

zugegeben.


Amplifikation

wiederholen.

Der Platte wurden keine

DNA-Proben zugegeben.


Amplifikation

wiederholen.

Die Probe enthält einen

PCR-Inhibitor (z. B.

EDTA).


DNA-Extraktion

wiederholen. Ein

Extraktionsverfahren

ohne PCR-hemmende

Reagenzien anwenden.

Für Vertiefungen mit Negativkontrollen (NTC) (negative

Kontrollen/Wasser) gibt es Mutationsmeldungen.

PCR-Kontamination. Sicherstellen, dass die

Vorbereitungsschritte

vor der PCR in einer UV-

sterilisierten Kammer

durchgeführt werden.


In einer oder mehreren Vertiefungen der Platte werden die

Proben als „No Alleles“ identifiziert oder weisen bei einigen der

In den Proben ist ein

PCR-Inhibitor vorhanden.

Die Amplifikation

wiederholen und die

Probe im Verhältnis

43


501-DE, R04 2016/09

Assays einen niedrigen Umsatz von Extensionsprimern auf

(unter 50 %).

1 : 5 oder 1 : 10

verdünnen. Alternativ

dazu die Extraktion

wiederholen und dabei

sicherstellen, dass das

Extraktionsprotokoll

strikt befolgt wird.

Falls bei der DNA-

Extraktion ein

Verfahren mit Ethanol

verwendet wird, vor

der abschließenden

Elution einen

zusätzlichen

Zentrifugierungsschritt

durchführen.

Die initiale DNA-Menge ist

unzureichend.

Die Menge der

extrahierten DNA

bestimmen und die

verwendete

Amplifikation im

empfohlenen

Konzentrationsbereich

von 2,5 bis 25 ng/µl

wiederholen.

Falls die verwendete

DNA-Menge bereits

bei der ersten Analyse

im empfohlenen

Bereich lag, eine

konzentriertere DNA-

Probe verwenden (bis

max. 50 ng/µl), um

Probleme infolge einer

übermäßigen

Fragmentierung der

DNA aus

paraffiniertem Gewebe

zu verhindern.

Die Probenextraktion

wiederholen und das

Volumen der

abschließenden

Elution reduzieren.

Verwendung falscher

Cyclerprogramme oder

eines Programms mit

falschen Einstellungen.

Vor Beginn nochmals

das bzw. die

Cyclerprogramm(e)

überprüfen. Das

Experiment ab der

Amplifikation

wiederholen.


In einer oder mehreren Vertiefungen der Platte werden die

Proben als „No Alleles“ identifiziert und im Spektrum treten

Peaks bei unerwarteten Massen auf.

Fehlerhafte Zuordnung

des Plexes zur Platte im

Plate Editor.

Recall-Vorgang

durchführen (siehe

Anhang B).

Fehlerhafte Einstellung

der Dispenser-Option in

der Chip-Linker-Software.

44


501-DE, R04 2016/09

Fehler bei der Zuordnung

des Cocktails für die

Extensionsreaktion zum

entsprechenden PCR-

Cocktail.

Das gesamte Verfahren

ab der Amplifikation

wiederholen und dabei

sicherstellen, dass die

beiden Colon status

AMP strip II und Colon

status EXT strip II

Streifen korrekt

aneinander ausgerichtet

sind.

Nach der Analyse der Ergebnisse in der iGenetics-Software

werden in mehreren Proben mehr als zwei Mutationen

nachgewiesen.

Vorliegen eines

bestimmten Peaks

aufgrund einer

Kontamination der DNA-

Proben.


Amplifikation

wiederholen.

Sollte das beim ersten

Test erhaltene

Mutationsmuster

bestätigt werden,

könnte die Probe

während der

Extraktion

kontaminiert worden

sein. Daher ist es

ratsam, das Verfahren

von diesem Schritt ab

erneut zu beginnen.

Falls die Probleme auch nach der Anwendung des oben beschriebenen Vorgehens weiter bestehen oder anderweitiger

Klärungsbedarf bzw. andere Probleme vorhanden sind, bitte an den Kundendienst von Agena Bioscience wenden:

E-Mail: [email protected]

Telefon: +49 (0)40 899 676 0

Fax: +49 (0)40 899 676 10

15) VALIDIERUNGSTESTS

Bei der Validierung des MassARRAY Dx Colon Panel wurden folgende Reagenzien verwendet:

DNA-Amplifikation: mit dem MassARRAY Dx Colon Panel gelieferte Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (Box 3/4

– Reagenzien für die Amplifikation und Box 1/4 – Verbrauchsmaterialien für die Amplifikation).

SAP-Behandlung und iPLEX-Extensionsreaktion: mit dem MassARRAY Dx Colon Panel gelieferte Reagenzien und

Verbrauchsmaterialien (Box 4/4 – Reagenzien für die Extension und Box 2/4 – Verbrauchsmaterialien für die

Extension).

Transfer der Extensionsprodukte auf einen SpectroCHIP-Array: mit dem MassARRAY Dx Colon Panel gelieferte

Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (Box 4/4 – Reagenzien für die Extension und Box 2/4 – Verbrauchsmaterialien

für die Extension).

Alle Validierungsexperimente wurden nach dem in der vorliegenden Gebrauchsanweisung beschriebenen Verfahren

mithilfe folgender Geräte durchgeführt:

MassARRAY Dx System (Agena Bioscience, Inc., San Diego, California, USA) bestehend aus:

MassARRAY Dx Nanodispenser RS1000 (mit 6 Nadeln)

MassARRAY Dx Analyzer 4 (96)

iGenetics-Software (Diatech Pharmacogenetics) für die weitere Auswertung der von der MassARRAY Typer 4.0

Primärsoftware gelieferten Ergebnisse

Klinische Spezifität

Die Spezifität des MassARRAY Dx Colon Panel wurde durch die Testung von 378 DNA-Proben aus Tumorgewebe

(FFPE-Schnitte) evaluiert – mit einer geeigneten DNA-Startmenge und vorhandenen nachweisbaren Mutationen,

qualifiziert mittels Pyrosequencing [verwendete Kits: Anti-EGFR MoAb response® (KRAS status) Cod. UP032, Anti-

EGFR MoAb response® (BRAF status) Cod. UP033, Anti-EGFR MoAb response® (NRAS status) Cod. UP038, Anti-

EGFR MoAb response® (PIK3CA status) Cod. UP036 (Diatech Pharmacogenetics)] oder mittels Massenspektrometrie


45


501-DE, R04 2016/09

[verwendete Kits: Myriapod® Cancer status Cod. SQ020 (Diatech Pharmacogenetics)] oder mittels direkter

Sequenzierung und Myriapod® Colon Status Cod. SQ010 (Diatech Pharmacogenetics).

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zu sehen:

Genotyp im

MassARRAY Dx

Colon Panel

Getestete

Proben

Proben, die mindestens

einer alternativen

Identifizierung

entsprechen

KRAS mutiert 129 129/129

BRAF mutiert 16 16/16

NRAS mutiert 21 21/21

PIK3CA mutiert 18 18/18

Wildtyp 194 194/194

Erforderliche Mindestmenge an DNA

Zur Evaluierung der analytischen Sensitivität des MassARRAY Dx Colon Panel wurden die folgenden Proben mit

variierender Replikationsanzahl in unabhängigen Experimenten getestet:

1) Human-DNA vom Wildtyp, standardisiert auf 100 ng/Reaktion und 1 ng/Reaktion (DNA aus kommerziell erhältlichem

menschlichem Placentagewebe – Cod. D7011, Sigma).

2) Drei DNA-Proben für die interne Verwendung, mit bekannten Mutationen (durch die Mischung der DNA mehrerer

Tumorzelllinien gewonnen), analysiert in unterschiedlich hoher Menge/mit variierender Replikationsanzahl, wobei die

DNA-Menge bis auf 1 ng/Reaktion gesenkt wurde.

Alle Proben wurden durch eine spektrophotometrische Analyse mit OPTIZEN POP BIO (Mecasys Ltd) quantifiziert.

Die erforderliche Mindestmenge an DNA betrug 1 ng/Reaktion.

Sensitivität (Nachweisgrenze eines mutierten Allels)

Die Sensitivität des MassARRAY Dx Colon Panel wurde für ausgewählte Mutationen evaluiert. Zur Bestimmung des

erforderlichen Mindestanteils der nachweisbaren mutierten Allele wurden Verdünnungsreihen mutierter DNA in

unterschiedlichen Mischungsverhältnissen mit Wildtyp-DNA getestet. Es wurden Mutationshäufigkeiten von 20 %, 10 %,

5 % und 2,5 % getestet. Die Ergebnisse belegen, dass das System in der Lage ist, Mutationen ab einer Häufigkeit von

2,5 % zu detektieren.

46


501-DE, R04 2016/09

Die nachstehende Tabelle enthält Beispiele:

Mutation (Veränderung der Nukleotidsequenz) Sensitivität für mutierte Allele (in %) ID

Cosmic

KRAS G12V (35G>T) 2,5 520

BRAF V600E (1799T>A) 10 476

NRAS Q61K (181C>A) 5 580

NRAS G12D (35G>A) 5 564

PIK3CA E542K (1624G>A) 5 760

Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit

Zur Evaluierung der Reproduzierbarkeit und der Wiederholbarkeit der Testergebnisse mit dem Kit „Myriapod® Colon

status prototype“ wurde dieselbe Probenplatte aus dem Test der analytischen Sensitivität mit „prototype“-Kits aus zwei

verschiedenen Lots in vier unabhängigen Analyseläufen getestet. Die Analyseläufe wurden von drei Bedienern an vier

verschiedenen Tagen durchgeführt. Alle Wildtyp- und Mutationsproben und deren Replikate wurden in allen Analyseläufen gemäß der Gebrauchsanweisung

für Myriapod Colon status mit einer Reproduzierbarkeit von 100 % korrekt genotypisiert.

Folgende Proben wurden getestet:

1) Human-DNA vom Wildtyp, standardisiert auf 100 bzw. 1 ng/Reaktion (DNA aus kommerziell erhältlichem menschlichem Placentagewebe – Cod. D7011, Sigma);

2) Mutationsproben A, B, C und D, hergestellt durch Mischen der DNA mehrerer Tumorzelllinien und standardisiert auf 1 ng/Reaktion.

Probe Genotyp Anzahl der

Replikate

Anzahl der

Analyseläufe Ergebnis

H-DNA Placenta Wildtyp 4 4 16/16 Wildtyp für alle

Targets

A

KRAS G12V (35G>T)

2 4

8/8 mutiert für die

spezifischen Targets,

Wildtyp für die anderen

Targets

KRAS Q61L (182A>T)

PIK3CA E542K (1624G>A)

NRAS G12D (35G>A)

B

BRAF V600K (1798_1799delGTinsAA)

2 4




Targets

NRAS Q61R (182A>G)

PIK3CA E545K (1633G>A)

KRAS G13D (38G>A)

PIK3CA H1047R (3140A>G)

C

BRAF V600E (1799T>A)

2 4




Targets

KRAS G12A (35G>C)

NRAS Q61K (181C>A)

D

NRAS G13D (38G>A)

1 4




Targets

KRAS G12C (34G>T)

PIK3CA H1047L (3140A>T)

47


501-DE, R04 2016/09

16) ANHANG A: LISTE DER MIT DEM MASSARRAY DX COLON PANEL(1, 2)

DETEKTIERBAREN MUTATIONEN

Analysierte häufige Mutationen Nachweisbare

Sekundärmutationen

Gen

NCBI

-Ref.-

Seq.

Exon

HGVS-Nomenklatur Ergebnis lt.

iGenetics-

Software

HGVS-Nomenklatur

CDS-Mutation AA-Mutation CDS-

Mutation

AA-

Mutation

KR

AS

NM

_004985.3

2

c.34G>A p.(Gly12Ser) p.G12S

c.33_34delT

GinsTA p.(Gly12Ser)

p.A11>

?

c.34_36delG

GTinsAGA p.(Gly12Arg) p.G12R

c.34_35delGGinsAT p.(Gly12Ile) p.G12I

c.34_35delGGinsAA p.(Gly12Asn) p.G12N

c.34G>T/c.34_36delGG

TinsTGC p.(Gly12Cys) p.G12C

c.34_36delG

GTinsTGG p.(Gly12Trp)

p.G12

W

c.34_35delGGinsTA p.(Gly12Tyr) p.G12Y

c.34_35delGGinsTT p.(Gly12Phe) p.G12F

c.34_35delGGinsCT p.(Gly12Leu) p.G12L

c.34G>C p.(Gly12Arg) p.G12R

c.35_36delGTinsAA/c.3

5_36delGTinsAG p.(Gly12Glu) p.G12E

c.35_36delG

TinsAC p.(Gly12Asp) p.G12D

c.35G>T p.(Gly12Val) p.G12V

c.35_36delGTinsTC/c.3

5delG

p.(Gly12Val)/p.(Gly1

2fs*3)

p.G12V

(c.35_36GT>

TC)/p.G12fs*

3

c.35G>C p.(Gly12Ala) p.G12A

c.35G>A p.(Gly12Asp) p.G12D

c.38G>C p.(Gly13Ala) p.G13A c.36_37insG

CG

p.(Gly12_Gly1

3insAla)

p.G12_

G13ins

A

c.37G>T/c.36_37delTGi

nsAT p.(Gly13Cys) p.G13C



c.38G>T/c.38_39delGCi

nsTG/c.38_39delGCins

TT

p.(GLy13Val) p.G13V

c.38G>A/c.38_39delGCi

nsAT p.(Gly13_Asp) p.G13D

c.38_40delG

CGinsACA

p.(Gly13_Val1

4delinsAspIle)

p.G13_

V14>DI

c.38_39delG

CinsAG p.(Gly13_Glu) p.G13E

c.38_39delG

CinsAA p.(Gly13_Glu) p.G13E

48


501-DE, R04 2016/09

KR

AS

NM

_004985.3

3

c.175G>T p.(Ala59Ser) p.A59S

c.175G>A p.(Ala59Thr) p.A59T

c.175G>C p.(Ala59Pro) p.A59P

c.176C>A p.(Ala59Glu) p.A59E

c.176C>G p.(Ala59Gly) p.A59G

c.176C>T p.(Ala59Val) p.A59V

c.181C>A/c.180_181del

TCinsCA/c.180_181del

TCinsAA

p.(Gln61Lys) p.Q61K

c.181C>G p.(Gln61Glu) p.Q61E

c.182A>C p.(Gln61Pro) p.Q61P

c.182A>T p.(Gln61Leu) p.Q61L

c.182A>G p.(Gln61Arg) p.Q61R

c.183A>C p.(Gln61His) p.Q61H

c.183A>T p.(Gln61His) p.Q61H c.182_183del

AAinsGT p.(Gln61Arg) p.Q61R

c.183A>G p.(Gln61Gln) p.Q61=

KR

AS

NM

_004985.3

4

c.349A>G p.(Lys117Glu) p.K117E

c.349A>C p.(Lys117Gln) p.K117Q

c.349A>T p.(Lys117Ter) p.K117*

c.351A>T p.(Lys117Asn) p.K117N

c.351A>C p.(Lys117Asn) p.K117N

c.351A>G p.(Lys117Lys) p.K117=

c.350A>G p.(Lys117Arg) p.K117R

c.350A>T p.(Lys117Ile) p.K117I

c.350A>C p.(Lys117Thr) p.K117T






c.437C>A p.(Ala146Glu) p.A146E

BR

AF

NM

_004333.4

15

c.1781A>G p.(Asp594Gly) p.D594G

c.1781A>T p.(Asp594Val) p.D594V

c.1781A>C p.(Asp594Ala) p.D594A

c.1798G>A p.(Val600Met) p.V600M c.1797_1798i

nsACA

p.(Thr599_Val

600insThr)

p.T599

_V600i

nsT

c.1798G>T/c.1798_179

8delGinsTACA

p.(Val600Leu)/p.(Va

l600delinsTyrMet)

p.V600L/p.V6

00>YM

c.1798G>C p.(Val600Leu) p.V600L

c.1798_1799ins18

p.(Thr599_Val600in

sAspPheGlyLeuAla

Thr)

p.T599_V600i

nsDFGLAT

c.1799_1800delTG>ins

AT/c.1799_1800delTG>

insAC/c.1799_1800delT

G>insAA

p.(Val600Asp)/p.(Va

l600Glu)

p.V600D/p.V6

00E

c.1799_1814

delinsA

p.(Val600_Ser

605delinsAsp)

p.V600

_S605>

D

c.1799_1814

delinsATGT

p.(Val600_Ser

605delinsAsp

Val)

p.V600

_S605>

DV

c.1799_1815

delinsAAAAG

p.(Val600_Ser

605delinsGluL

ys)

p.V600

_S605>

EK

c.1799_1804

delTGAAATin

sATA

p.(Val600_Ser

602delinsAspT

hr)

p.V600

_S602>

DT

c.1797_1799delAGTins

GAG p.(Val600Arg) p.V600R

c.1798_1799delGTinsA

A p.(Val600Lys) p.V600K

c.1798_1799delGTinsA

G p.(Val600Arg) p.V600R

c.1798_1799delGTinsC

G p.(Val600Arg) p.V600R

49


501-DE, R04 2016/09

c.1798_1799delGTinsC

A p.(Val600Gln) p.V600Q

c.1799T>A p.(Val600Glu) p.V600E c.1799_1800

delTG

p.(Val600fs*11

)

p.V600f

s*11

c.1799T>C p.(Val600Ala) p.V600A

c.1799T>G p.(Val600Gly) p.V600G

c.1799_1801delTGA p.(Val600_Lys601d

elinsGlu)

p.V600_K601

>E


PIK

3C

A

NM

_006218.2

1

c.113G>A p.(Arg38His) p.R38H

c.113G>T p.(Arg38Leu) p.R38L

c.241G>A p.(Glu81Lys) p.E81K

c.241G>C p.(Glu81Gln) p.E81Q

c.263G>A p.(Arg88Gln) p.R88Q


c.263G>C p.(Arg88Pro) p.R88P

c.277C>T p.(Arg93Trp) p.R93W

c.277C>A p.(Arg93Arg) p.R93R

c.277C>G p.(Arg93Gly) p.R93G

c.323G>A p.(Arg108His) p.R108H

c.323G>C p.(Arg108Pro) p.R108P


PIK

3C

A

NM

_006218.

2

2 c.353G>A p.(Gly118Asp) p.G118D

PIK

3C

A

NM

_006218.2

4

c.1035T>A p.(Asn345Lys) p.N345K

c.1035T>G p.(Asn345Lys) p.N345K

c.1035T>C p.(Asn345Asn) p.N345=

PIK

3C

A

NM

_006218.2

7

c.1258T>C p.(Cys420Arg) p.C420R

c.1258T>A p.(Cys420Ser) p.C420S

c.1258T>G p.(Cys420Gly) p.C420G

PIK

3C

A

NM

_006218.2

9

c.1616C>G p.(Pro539Arg) p.P539R

c.1616C>A p.(Pro539His) p.P539H

c.1624G>A p.(Glu542Lys) p.E542K c.1624_1625

delGAinsAG p.(Glu542Arg)

p.E542

R


c.1624G>T p.(Glu542Ter) p.E542*

c.1645G>A p.(Asp594Asn) p.D549N

c.1645G>C p.(Asp594His) p.D549H

c.1645G>T p.(Asp594Tyr) p.D549Y

c.1633G>A p.(Glu545Lys) p.E545K


c.1633G>T p.(Glu545Ter) p.E545*

c.1634A>C p.(Glu545Ala) p.E545A

c.1634A>G p.(Glu545Gly) p.E545G

c.1634A>T p.(Glu545Val) p.E545V

c.1635G>C p.(Glu545Asp) p.E545D

c.1635G>T p.(Glu545Asp) p.E545D

c.1635G>A p.(Glu545Glu) p.E545=

c.1636C>A p.(Gln546Lys) p.Q546K


c.1636C>T p.(Gln546Ter) p.Q546*




PIK

3C

A

NM

_006218

.2

20

c.3062A>G p.(Tyr1021Cys) p.Y1021C

c.3062A>T p.(Tyr1021Phe) p.Y1021F

c.3062A>C p.(Tyr1021Ser) p.Y1021S

c.3073A>G p.(Thr1025Ala) p.T1025A

50


501-DE, R04 2016/09

c.3073A>T p.(Thr1025Ser) p.T1025S

c.3073A>C p.(Thr1025Pro) p.T1025P

c.3075C>T p.(Thr1025Thr) p.T1025=

c.3075C>A p.(Thr1025Thr) p.T1025=

c.3127A>G p.(Met1043Val) p.M1043V

c.3127A>T p.(Met1043Leu) p.M1043L

c.3127A>C p.(Met1043Leu) p.M1043L

c.3129G>A p.(Met1043Ile) p.M1043I

c.3129G>C p.(Met1043Ile) p.M1043I

c.3129G>T p.(Met1043Ile) p.M1043I

c.3139C>T p.(His1047Tyr) p.H1047Y

c.3139C>G p.(His1047Asp) p.H1047D

c.3139C>A p.(His1047Asn) p.H1047N

c.3140A>C p.(His1047Pro) p.H1047P

c.3140A>G p.(His1047Arg) p.H1047R

c.3140A>T p.(His1047Leu) p.H1047L

c.3145G>A p.(Gly1049Ser) p.G1049S

c.3145G>C p.(Gly1049Arg) p.G1049R

c.3145G>T p.(Gly1049Cys) p.G1049C

NR

AS

NM

_002524.4

2



c.34G>T p.(Gly12Cys) p.G12C


c.34_35delGGinsCC p.(Gly12Pro) p.G12P




c.35G>T p.(Gly12Val) p.G12V



c.37G>T p.(Gly13Cys) p.G13C





c.38G>T/c.38_39delGTi

nsTC p.(Gly13Val) p.G13V




NR

AS

NM

_002524.4

3

c.181C>A p.(Gln61Lys) p.Q61K


c.181_182delCAinsAG p.(Gln61Arg) p.Q61R

c.181_182delCAinsTT p.(Gln61Leu) p.Q61L

c.181_183delCAAinsAA

G p.(Gln61Lys) p.Q61K




c.182_183delAAinsGG/

c.182_183delAAinsTG

p.(Gln61Arg)/p.(Gln

61Leu)

p.Q61R/p.Q6

1L c.183A>G p.(Gln61Gln) p.Q61Q

c.183A>C p.(Gln61His) p.Q61H

c.183A>T p.(Gln61His) p.Q61H




c.176C>A p.(Ala59Asp) p.A59D



NR

AS

NM

_002524.4

4


c.349A>C p.(Lys117Gln) p.K117Q

c.349A>T p.(Lys117Ter) p.K117*

c.350A>G p.(Lys117Arg) p.K117R

c.350A>C p.(Lys117Thr) p.K117T

c.350A>T p.(Lys117Met) p.K117M

51


501-DE, R04 2016/09

c.351G>C p.(Lys117Asn) p.K117N

c.351G>T p.(Lys117Asn) p.K117N

c.351G>A p.(Lys117Lys) p.K117=




c.437C>A p.(Ala146Asp) p.A146D



Hinweis 1: Durch Schrägstrich „/“ getrennte Mutationsbezeichnungen stellen nicht unterscheidbare Mutationen dar.

Hinweis 2: In derselben Zeile beschriebene Mutationen sind nicht unterscheidbar.

17) ANHANG B: VERWENDUNG DER RECALL-FUNKTION Die Recall-Funktion der Chip-Linker-Software wird verwendet, nachdem ein SpectroCHIP-Array mit fehlerhaften

Einstellungen verarbeitet wurde – wenn z. B. einer oder mehreren Vertiefungen einer Platte der oder die falschen

Assay(s) bzw. der oder die falschen Probe(n) zugewiesen wurden. Hierfür muss im Plate Editor eine neue Platte mit den

korrekten Informationen erstellt werden. Wenn hingegen beispielsweise in der Chip-Linker-Software die Optionen

Process Method und/oder Dispenser falsch eingestellt waren, braucht keine neue Platte erstellt zu werden (Schritt 1

überspringen).

1. Wenn die Plattenkonfiguration im Plate Editor fehlerhaft war, also der oder die falschen Assay(s) bzw. die falschen

Probe(n) verwendet wurden, muss eine neue Platte erstellt werden, die die korrekten Informationen enthält.

2. Auf dem Windows-Desktop des Computers im MassARRAY Dx Analyzer 4 auf das Symbol Chip Linker

doppelklicken, um die Anwendung zu starten.

3. Daraufhin wird das Fenster MassARRAY Typer Chip Linker angezeigt. Als Benutzerkennung (User ID) „charles“ und

als Passwort „darwin“ eingeben, um sich bei der Datenbank anzumelden. In der Dropdownliste den DB-Host

auswählen („AgenaDB“) und auf Enter klicken.

4. Im Auswahlfenster die neue, korrekte Platte in der Verzeichnisstruktur auswählen.

5. Im rechten oberen Teil des Fensters die geeigneten Analyseeinstellungen auswählen und einen Barcode oder einen

Namen für die Platte eingeben.

6. Auf die Schaltfläche Recall klicken.

7. Daraufhin erscheint das Dialogfeld Select Recall Chip. Den nochmals zu verarbeitenden SpectroCHIP-Array

auswählen (dargestellt durch das Symbol ).

8. Auf die Schaltfläche Recall klicken.

Der Vorgang zum erneuten Aufruf des SpectroCHIP-Arrays kann eine kurze Zeit dauern.

52


501-DE, R04 2016/09

18) ANHANG C: ERSTELLUNG EINER XML-DATEI Zur Fehlerbehebung oder wenn die Interpretation eines Spektrums unklar ist, können die Daten aus dem TyperAnalzyer

mit dem Kundendienst von Agena Bioscience ausgetauscht werden. Hierzu werden alle oder die vom Benutzer

ausgewählten Vertiefungen im aktiven Chip in eine XML-Datei exportiert, die an den Kundendienst gesendet werden

kann. Die XML-Datei kann in die TyperAnalyzer-Software geladen werden.

1. In TyperAnalyzer die zu exportierende Platte auswählen.

2. In der Menüleiste File Save All Wells to File wählen.

3. Im daraufhin angezeigten Dialogfeld ein Zielverzeichnis auswählen, einen Dateinamen (.xml) eingeben und auf

Save klicken.

XML-Dateien sind in der Regel sehr groß. Aufgrund der Größenbeschränkungen für E-Mails die Datei bitte in komprimierter Form (gezippte Datei) senden.

Date post:	18-Sep-2018
Category:	Documents
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MassARRAY Dx Colon Panel - agenacx.com€¦ · bestimmten vollständig oder partiell mutierten...

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