Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
Michael R. KoblischkaMichael R. Koblischka
FR Experimentalphysik, Universität des SaarlandesFR Experimentalphysik, Universität des Saarlandes
Konfokale LaserKonfokale Laser--ScanningScanning MikroskopieMikroskopie3D3D--Darstellung Darstellung dicker dicker Proben mit SubmikrometerProben mit Submikrometer--AuflösungAuflösungin in Reflektion Reflektion und und FluoreszenzFluoreszenz
PrinzipPrinzip::LaserLaser--MikrostrahlMikrostrahl
Strahl wird beugungsbegrenzt fokussiert Strahl wird beugungsbegrenzt fokussiert ((ObjektivObjektiv))Spotdurchmesser Spotdurchmesser 200 nm 200 nm –– 500 nm500 nm
ScanningScanning--EinheitEinheitStage scan Stage scan –– Beam scanBeam scanHöchstgeschwindigkeitHöchstgeschwindigkeit: 3 : 3 BilderBilder/s/szz--Verstellung Verstellung in 40 nmin 40 nm--Schritten möglichSchritten möglich
KonfokaleKonfokale DetektionDetektionPinhole (Pinhole (LochblendeLochblende))outout--ofof--focus focus Signale werden nicht detektiertSignale werden nicht detektiert
Konfokales Konfokales Scanning Scanning MikroskopMikroskop
Marvin Marvin Minsky Minsky (MIT)(MIT)Studium Studium in Harvard und Princetonin Harvard und Princeton((MathematikMathematik, , NeurophysiologieNeurophysiologie, , EmbryologieEmbryologie, , NeuroanatomieNeuroanatomie,,PyschologiePyschologie, , MechanikMechanik))
PostPost--Doc in Harvard:Doc in Harvard:Studium der Hirnfunktion Studium der Hirnfunktion ((imim LymanLyman--PhysiklaborPhysiklabor))
ProblemProblem Keine optische Keine optische 3D3D--DarstellungDarstellung vonvon gefärbtengefärbtenNeuronen möglich infolge MehrfachNeuronen möglich infolge Mehrfach--StreuungStreuung
LösungLösung KonfokaleKonfokale Abbildung Abbildung ((AbrasternAbrastern derder Probe)Probe)LichtquelleLichtquelle: : BogenlampeBogenlampe, , ObjektscanningObjektscanning: : RoboterarmRoboterarmBrief Brief vom vom 18.11.195518.11.1955 mit Apparaturmit Apparatur--BeschreibungBeschreibungan an seinen Schwager seinen Schwager ((PatentanwaltPatentanwalt))
Patentanmeldung Patentanmeldung 7.11.1957, 7.11.1957, Erteilung Erteilung 19.12.196119.12.1961
Konfokales Konfokales Laser Scanning Laser Scanning Mikroskop Mikroskop (CLSM, LSCM)(CLSM, LSCM)
1. Laser (1. Laser (PunktquellePunktquelle))Gaslaser Gaslaser (He(He--NeNe, , ArAr+, +, ArAr+/Kr+)+/Kr+)Festkörperlaser Festkörperlaser ((NdNd:YAG):YAG)
2. x,y2. x,y--ScanningScanning--EinheitEinheitBeamBeam--ScanningScanning
kHzkHz--GalvanospiegelGalvanospiegel, , RotationsspiegelRotationsspiegelPiezoablenkerPiezoablenker, AO, AO--AblenkerAblenker
ObjektObjekt--ScanningScanningTischverstellung Tischverstellung ((SchrittmotorSchrittmotor))
3. Pinhole (3. Pinhole (BlendeBlende))kreisförmigkreisförmig, , rechteckigrechteckig> 50 µm, > 50 µm, variabelvariabel, , vor Detektorvor Detektor
LaserLaser--ScanningScanning--MikroskopMikroskop
GrundgerätGrundgerät: : Aufrechtes oder umgekehrtes ForschungsmikroskopAufrechtes oder umgekehrtes ForschungsmikroskopVerfahrenVerfahren::
-- konventionell konventionell ((mit Okularbeobachtungmit Okularbeobachtung))TransmissionTransmissionReflektionReflektionFluoreszenzFluoreszenzübliche Kontrastverfahrenübliche Kontrastverfahren: : PhakoPhako, DIC, DIC
-- LSMLSM--ModusModusTransmissionTransmissionReflektionReflektion//FluoreszenzFluoreszenzconfocal confocal ((mitmit pinhole)pinhole)
3D3D-- MikroskopieMikroskopiemechanical sectioningmechanical sectioning
ZerschneidenZerschneiden derder Probe in Probe in DünnschnitteDünnschnitteUltradünnschnittUltradünnschnitt: 25 nm < d < 100 nm: 25 nm < d < 100 nmSemiSemi--Dünnschnitt Dünnschnitt 0.1 µm < d < 1 µm0.1 µm < d < 1 µmNormalschnittNormalschnitt: 1 µm < d < 100 µm: 1 µm < d < 100 µm
MikrotomMikrotom: 1 µm < d < 30 µm x n: 1 µm < d < 30 µm x nVibratomVibratom: 10 µm < d < 2 mm: 10 µm < d < 2 mmKryostatKryostat: 1 µm < d < 210 µm: 1 µm < d < 210 µm
optical sectioningoptical sectioningAbbildenAbbilden von zvon z--Ebenen der Ebenen der intaktenintakten ProbeProbe
SchnittdickeSchnittdicke: 40 nm < d < : 40 nm < d < ProbendickeProbendickeBegrenzungBegrenzung: : Lichteindringtiefe Lichteindringtiefe –– SignalaustrittstiefeSignalaustrittstiefezz--VerstellungVerstellung: : Probentisch oder ObjektivProbentisch oder Objektiv
Neue EntwicklungenNeue Entwicklungen und und AusblickAusblick
-- SNOM (Scanning NearSNOM (Scanning Near--field Optical Microscopefield Optical MicroscopeAbstand Abstand d << d << Wellenlänge Wellenlänge (nm(nm--BereichBereich))Glasfaser als SondeGlasfaser als Sonde, , Analogie zu Analogie zu RasterRaster--TunnelTunnel--MikroskopieMikroskopie
-- MultiphotonenmikroskopieMultiphotonenmikroskopiebesbes. 2 . 2 --Photonenanregung im Photonenanregung im NIRNIRFluoreszenz im SichtbarenFluoreszenz im Sichtbaren
-- 4D4D--MikroskopieMikroskopiezeitliche Auflösung im zeitliche Auflösung im 3 D3 D-- RaumRaum
LSM LSM BilddarstellungBilddarstellungEinzelbildEinzelbild
einkanalig einkanalig T, R, FlT, R, Flmehrkanaligmehrkanalig: : Überlagerung Überlagerung T, R, Fl (T, R, Fl (bisbis 5 5 KanäleKanäle))
Bildsequenzen Bildsequenzen ((SchnittstapelSchnittstapel) und ) und deren Darstellung alsderen Darstellung alsGalleryGallery
3D3D--BilderBilderFarbFarb--Höhenkarte Höhenkarte ((FalschfarbenzuordnungFalschfarbenzuordnung))Schnitte Schnitte xx--y (z = const.)y (z = const.)
xx--z (y = const.)z (y = const.)yy--z (x = const.)z (x = const.)
ZeitfunktionenZeitfunktionenZeitserienZeitserien
Time scan (Time scan (entlang einer Linie entlang einer Linie --FluoreszenzabklingzeitFluoreszenzabklingzeitTime spot (zTime spot (z--Richtung bei PunktanregungRichtung bei Punktanregung))
LSM LSM BildverarbeitungBildverarbeitung, , BildbearbeitungBildbearbeitung
MessfunktionenMessfunktionen
AbständeAbstände, , FlächenFlächen, , WinkelWinkelFalschfarbendarstellungFalschfarbendarstellungHistogrammauswertungHistogrammauswertungMessungen Messungen in ROIin ROI
Speichern Speichern und Laden vonund Laden von Bildern oder SerienBildern oder Serien(PC(PC--SchnittstelleSchnittstelle))
Bildbearbeitung ist Bildbearbeitung ist äusserst wichtigesäusserst wichtiges Hilfsmittel fürHilfsmittel für die LSCMdie LSCM--UntersuchungenUntersuchungen..
Problem: Problem: Datensätze sind recht Datensätze sind recht gross!gross!
Was Was kann kann manman mit konfokaler Mikroskopie messenmit konfokaler Mikroskopie messen??
BeispieleBeispiele::IdentifizierungIdentifizierung vonvon StoffwechselmetabolitenStoffwechselmetabolitenNachweisNachweis von Proteinvon Protein--ProteinProtein--Interaktionen Interaktionen (FRET)(FRET)Visualisierung subzellulärer ProteinverteilungVisualisierung subzellulärer ProteinverteilungBeobachtungBeobachtung vonvon Zellteilungszyklen oderZellteilungszyklen oder
cytoplasmotischer Ionenverteilungen cytoplasmotischer Ionenverteilungen (lifetime)(lifetime)Intrazelluläre Messung physiologischer Intrazelluläre Messung physiologischer Parameter (pH, Parameter (pH, pCapCa, pO, pO22,etc.),etc.)
Beispiele für EinsatzgebieteBeispiele für Einsatzgebiete::BiopharmazieBiopharmazie
BakterienBakterien in in GesteinGesteinQualitätssicherungQualitätssicherung vonvon DruckpapierDruckpapier
HalbleiterforschungHalbleiterforschung
LSCM LSCM –– Menschliche ArterieMenschliche Arterie
Bilder bestehen aus Bilder bestehen aus 81 81 individuellen Schnittenindividuellen Schnitten, , jeder Schnitt jeder Schnitt 1 MB1 MBGesamter DatensatzGesamter Datensatz: 81 MB: 81 MBProbleme bei der Bildbearbeitungin EchtzeitProbleme bei der Bildbearbeitungin Echtzeit
LSCMLSCM--Abbildung derAbbildung der Arterie einer RatteArterie einer Rattein in drei unterschiedlichen Abbildungsmodendrei unterschiedlichen Abbildungsmodena.) a.) maximale Intensitätmaximale Intensitätb.) rendering, b.) rendering, Aufsicht im hohen WinkelAufsicht im hohen Winkelc.) c.) nur Oberfläche betontnur Oberfläche betontd.) d.) Blick innerhalb der Oberfläche Blick innerhalb der Oberfläche in den in den DatensatzDatensatz
von c.)von c.)
Zeitaufgelöste Beobachtung einer Tetrahymena-Zelle
Zeitabstand: 125 msLaserlicht 488 nm
grüne und rote Fluoreszenz in der Zellekann beobachtet werden
Auge Auge des des WasserflohsWasserflohs
a.) a.) idealeideale konfokalekonfokale KonfKonf..b/c/d.) b/c/d.) Bildbearbeitung Bildbearbeitung undund
Öffnen der IrisblendeÖffnen der Irisblende
Saccharomyces cervisiaeSaccharomyces cervisiaeim Hopfenim Hopfen