Klinische Mikrobiologie

AKH Wien

> Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 <

Neues aus der Sepsis-Diagnostik

Petra Apfalter

Kennen Sie dieses Szenario?

Fiebernder, vortherapierter ICU-Patient

Infektion?Sepsis = SIRS durch Infektion

Wenn ja, welche?

Gefragt wäre rasch ein relevanter Befund Erreger, Empfindlichkeitsprofil

Warum ist Sepsis-diagnostik wichtig?

Haupttodesursache auf nichtkardiologischen ICU

Direkte Behandlungskosten in D: 1,1 bis 2,45 Milliarden Euro/Jahr

Therapie oft empirisch 11% - 46% ICU Patienten initial falsch therapiert 1, 2, 3

Zeitfaktor essentiell für Outcome

Letalität hoch (40%)1 Kollef M, Chest, 1999

2 Garnacho-Montero J, CCM, 2003 3 Byl B, CID, 1999

Von welchen Infektionen geht eine Sepsis am häufigsten aus? Lunge 44.0% Harnwege 9.1% Bauchorgane 8.6% Wunden und Weichteile 6.6% Katheter 2.2% ZNS 0.8% Herzklappen 0.6% Andere (z.B. Sinus) 10.8%

Bakterien im Blut (positive Blutkultur)17.3%

(Angus DC, Crit Care Med 2001; 29:1303-1310)

Anteil positiver Blutkulturen AKH Wien 2005

n=15.636

88%

12%

Butkulturen ohne Wachstum Positive Blutkulturen

Krankenhaushygiene, AKH Wien

Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik

Blutkultur (BK)

Diagnostik - NeuPNA-FISH aus BKLight Cycler®SeptiFAST aus EDTA-BlutrDNA-Sequenzanalyse

Diagnostik - In Entwicklung

Chip-Techniken

Alt, aber gut: die BK

Blutmenge ist DER entscheidende Faktor!

Bakteriämie: Erwachsene <1-10 KBE/ml Kinder 10->100 KBE/ml

Gesamtvolumen: 15-20 ml (Kinder 1-5 ml)

Standard: 1 aer. + 1anaer. Fl. od. 2 aer. Flaschen

Wann BK abnehmen?

Möglichst früh bei Symptomen, die auf eine Sepsis hinweisen

Vor Behandlungsbeginn, ansonsten am Ende eines Antibiotika – DI

2-3 Kulturen in rascher Folge

Bei negativem Ergebnis nach 24h WH!

Keine „Überwachungs-BK“

Keine „follow-up“ BK nach Diagnosestellung

Diagnostischer Zeitrahmen BK

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7Tag 28

PILZE

Blutkultur

GramID + AB

Empirische AB-Therapie

Anpassen – De-Eskalieren

Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik

Blutkultur (BK)

NeuPNA-FISH aus BKLight Cycler® SeptiFAST aus EDTA-BlutrDNA-Sequenzanalyse

In Entwicklung

Chip-Techniken

PNA-FISH

Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ Hybridization

Fluoreszierende PNA Sonde hybridisiert mit ribosomaler RNA

Blut-Kultur Identifikation in 2.5 h

Für in vitro Diagnostik

Diagnostischer Zeitrahmen PNA-FISH vs. BK: - 1d

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7Tag

28 -> PILZE

Blutkultur

GramID + AB

Empirische AB-TherapieAnpassen – De-Eskalieren

!

PNA-FISH: Target rRNA

Hoch konserviert103-105 Kopien/Zelle (natürliche Amplifikation)

rRNA Sequenzen = taxonomische Referenz

Schnell-ID positiver BK

S. aureus PNA FISH

Yeast

GPCC

Gram Gram Fbg.Fbg.

GPCPC

C. albicans PNA FISH

E. faecalis PNA FISH

Light Cycler® SeptiFAST aus EDTA-Blut

Multiplex Real-time PCR am Light Cycler 2.0 (Roche)

Dia

gn

osti

cs

The LightCycler SeptiFast Test Hypothesis: DNA in human blood?

KulturPCR

human DNA

freie DNA

lebende Bakterien/Pilze

tote Bakterien/Pilze

phagozytierte Bakterien/Pilze

lebende Bakterien/Pilze

lebende, phagozytierte Bakterien/Pilze (?)

Dia

gn

osti

cs

Single Copy Genes• No enhancement• Less investigated

Spacer Region (ITS*) • Multiple copies• Well investigated• Especially suited for

Species testingRibosomal Genes• Multiple copies• Well investigated• Especially suited for

Group testing* ITS = internal transcribed spacer

The LightCycler SeptiFast Test Target Region – Internal Transcribed Spacer

Multiple specific HybProbe probes

Multiple specific HybProbe probes D

iag

nosti

cs

Das HybProbe Prinzip 2 Sonden = benachbart

hybridisierendes Oligopaar

Signal (FRET) nur wenn beide nebeneinander binden

Sequenz-spezifische Detektion +

Mutationsanalyse in der Hybprobe-Targetsequenz durch Schmelzkurvenanalyse möglich!

The LightCycler SeptiFast Test Negative Control / Internal Control

- MagNA Lyser Instrument

- Sample Preparation

Lig

htC

ycl

er

In

str

um

en

t

Sample or Negative Control

Purified NA

Internal Control

Lysis

Extraction

The LightCycler SeptiFast

Kit

50 µl eluate each

Gram (-)

Gram (+)

Fungi

Dia

gn

osti

cs

The LightCycler SeptiFast Test

Channel distribution Gram (+)

t [°C]

CoNS from SML

Staphylococcus aureus

S. spp from SML (670)

Streptococcus pneumoniae

S.pneu

S.aureus

S.spp

S. spp. from SML (610)

CoNS

S.spp

Internal ControlEnterococcus faeciumEnterococcus faecalis

IC E.fum E.fis

Channel 610

Channel 640

Channel 670

Channel 705

Dia

gn

osti

cs

Gram (-)

•Enterobacter (cloacae / aerog.)

•Klebsiella (pneumoniae/oxytoca)

•Escherichia coli

•Serratia marcescens

•Proteus mirabilis•Pseudomonas aeruginosa

•Acinetobacter baumannii 3

•Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) Fungi•Candida albicans

•Candida tropicalis

•Candida parapsilosis

•Candida glabrata

•Candida krusei

•Aspergillus fumigatus

•Streptococcus spp. 2

•Enterococcus faecium•Enterococcus faecalis

• Each bullet point represents a specific melting point, species in brackets are not differentiated

•Staphylococcus aureus•CoNS 1

•Strep. pneumoniae

SeptiFast Master List

1 Coagulase Negative Staphylococci (Species which represent the group are listed in the PI).

2 Species which represent the group Streptococcus spp. are listed in the

PI.

3 Species referred as A. calcoaceticus- A.baumannii are not detected.

Keimspektrum AKH Wien 2005Sepi 25%Sau 12%

46

21

6 6 4 52

05

101520253035404550

Staphylo

kokken

Entero

bakterie

n

Streptoko

kken

Enteroko

kken

Pseudomonas

Candida

Andere

E. coli 9%Klebsiella 5%Enterobacter 3%

%

Krankenhaushygiene, AKH Wien

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7Tag

28 -> PILZE

Blutkultur

GramID + AB

Empirische AB-Therapie

Anpassen – De-Eskalieren

!

6 h

SeptiFAST

rDNA-Sequenzanalyse

Real-time PCR + Sequenzierung

rDNA-Sequenzanalyse

16S rDNA für Bakterien

18S, 28S rDNA & ITS1 & 2 Region für Pilze

Direkt von Patientenprobe

Amplifikation mit universellen Primern

Sequenzieren der Amplicons

Alignment mit Datenbank

Real-time PCR-Amplifikation 16S rDNA

Universelle Primer

5S16S tRNA tRNA 23SrDNA Operon:

1. Amplifikation eines Pools von 16S rDNA Fragmenten mittels 16S rDNA-spezifischen Primern

341f

518r 907r

3. Reamplifikation mittels 16S rDNA-spezifischen Primern

341fGC

518r

907r

GC-clamp

341f

25%

55%

Figur 1: Experimentelle Schritte in der Identifizierung einer bakteriellen Gemeinschaft

16S rDNA insert

341f

907r

plasmid

SP6

T7518r

plasmid

2. Klonierung der 16S rDNA Fragmente und Amplifikation der Inserts mitels Plasmid-spezifischen

Primern

3. Screenen nach verschiedenen Klonen und 4. Analyse der bakteriellen Gemeinschaften

mittels DGGE3. 4.

rDNA Operon

16S rDNA = universelles bakterielles Gen

Konservierte Regionen … Primertarget

Hypervariable Regionen (zB V3) … Phylogenetische Analyse

Zielgene

Sequenzreaktion & Aufreinigung

MicroSeq KomponentendRhodamine dye Terminatoren, cycle sequencing

G

A

C T

dR110

dR6G

dTAMRA dROX

Überblick Sequenzreaktion

Editieren der Sequenz

Analyse der Daten

TechnikAnfordern:

Besuchen Sie uns!http://www.meduniwien.ac.at/akh/

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Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik

Blutkultur (BK)

NeuPNA-FISH aus BKSeptiFAST aus EDTA-BlutrDNA-Sequenzanalyse

In Entwicklung

Chip-Techniken

Microarrays

Detektion hunderter Mikroorganismen simultan (100.000e Gene)

Detektion wichtiger Resistenzgene Bestimmung von verschiedenen Genotypen,

Mutationen Quantifikation möglich

Oligo-shotgun-ChipAustrian Research Center Seibersdorf

genomic 16S rRNA gene- fragments

Cloning of interesting genes in

E.coli ( plasmids) Amplicons(oligos) of all gene fragments spotted onto chip = probes

DNA* extraction from specimen (*incl. unknown bacterial DNA)

-> PCR (whole bacterial DNA tagged with Cy3)

Hybridization

Patterns of green spots identify

species + resistence present in sample

Diagnostischer Peptidchip Anwendung in

Körperflüssigkeiten

Simultane Detektion verschiedener Erreger & Resistenzen:

Protein/Epitop am Chip detektiert spezifische Immunantwort

Peptidchip - Strategie

Funded by: Co-Operate ViennaWiener Wirtschaftförderungsfond

Collection of Sera Sera from patients (with

bacterial infections) Sera from healthy persons

Prediction of Bacterial Antigens in silico

Whole genome B cell epitopes

Bacterial Epitope Identification Peptide Synthesis Peptide ELISA with Sera

Validation of Antigens Peptide ELISA Peptide Chip

Besuchen Sie uns!http://www.meduniwien.ac.at/akh/

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