26. JAHRESTAGUNG DER DEUTSCHENGESELLSCHAFT FÜR REPRODUKTIONSMEDIZIN5.–7. OKTOBER 2006, REGENSBURG(ABSTRACTS*)
* Begutachtet und zusammengestellt vom wis-senschaftlichen Kongreßkomitee (lokales Or-ganisationskomitee, DGRM-Vorstand sowieVorstand bzw. Sprecherinnen der DGRM-AGsReproduktionsgenetik und ÄRE)
Andrologie
P01SELEKTION CHROMATIN-INSTABILER SPER-MIEN IM OVIDUKT DES SCHWEINES
D. Waberski1, F. Ardon1, E. Töpfer-Petersen2
1Reproduktionsmedizinische Einheit derKliniken und 2Institut für Reproduktions-biologie, Tierärztliche Hochschule Han-nover
Einleitung: Erhöhtes Vorkommen Chro-matin-instabiler Spermien ist bei Menschund Tier mit Sub- oder Infertilität assozi-iert. Für die Einschätzung der Befruch-tungsrelevanz eines spermatologischenParameters ist es prinzipiell von Bedeu-tung, ob dafür im weiblichen GenitalSelektionsmechanismen existieren. Zielder Studie war es, mit In-vitro- und In-vivo-Modellen die Selektionsfähigkeitfür chromatin-instabile Spermien imweiblichen Genitale am Modell desSchweins zu untersuchen.
Methoden: Percoll-gewaschenes Spermavon vier Ebern mit unterschiedlicherChromatinstabilität (DNA-Fragmenta-tionsindex [DFI] 2–16 %) wurde imOvidukt-Explant-Assay an Oviduktepi-thel in vitro gebunden (30 Min. Co-Inku-bation; 39 °C; 5 % CO2), die ungebun-denen Spermien entfernt und anschlie-ßend die fest gebundenen Spermiendurch Schockgefrierung in flüssigem N2abgelöst. Der Prozentsatz chromatin-in-stabiler Spermien im Ejakulat und in deran Ovidukt-Explante gebundenen Sper-mienpopulation wurde mittels des mo-difizierten fluoreszenzmikroskopischenSpermienchromatinstruktur-Assays ver-glichen. In einem weiteren In-vivo-Ver-such wurde das Jungsau-Modell-Hanno-ver angewendet. Jungsauen wurden mitSperma zweier Eber mit bekanntemChromatinstatus (DFI 2–9 %) besamtund die Chromatinstabilität in der Popu-lation der akzessorischen Spermien inder Zona pellucida von Tag 3–5 Embry-onen bestimmt. Akzessorische Spermien
gelten als befruchtungskompetent, da siedie wesentlichen Schritte der Befruch-tungskaskade bis zum Eindringen in dieZona pellucida vollzogen haben.
Resultate: Im Ovidukt-Explant-Assaywar der Prozentsatz Chromatin-instabi-ler Spermien bei gebundenen Spermiensignifikant (p < 0,05) niedriger als impercoll-gewaschenen Ejakulat; ebensowar die Inzidenz Chromatin-instabilerSpermien in der akzessorischen Spermi-enpopulation signifikant (p < 0,05) ver-mindert.
Schlußfolgerungen: Es läßt sich schluß-folgern, daß Chromatininstabilität mitFunktionsstörungen der Plasmamembraneinhergeht, die zu einer herabgesetztenBindungsfähigkeit an das Eileiterepithelführen. Chromatin-instabile Spermiensind somit kaum an der Etablierung desfunktionellen Spermienreservoirs imweiblichen Genitale beteiligt und habenin vivo nur geringe Chancen, auf eineEizelle zu treffen.
P02VOLUMENREGULATIONS- UND OVIDUKT-BINDUNGSASSAY ALS FUNKTIONELLE TESTSDER PLASMAMEMBRANINTEGRITÄT VONBULLENSPERMIEN
E. Sahin1, A. Petrunkina1, E. Töpfer-Petersen2, D. Waberski1
1Reproduktionsmedizinische Einheit derKliniken und 2Institut für Reproduktions-biologie, Tierärztliche Hochschule Han-nover
Einleitung: Die sogenannte idiopathischeSubfertilität ist bei Mensch und Tier einverbreitetes Phänomen. Standardsperma-tologische Parameter sind oft unzurei-chend, um die komplexen fertilitätsrele-vanten Eigenschaften von Spermien zuuntersuchen. Unter In-vivo-Bedingungenist die funktionelle Integrität der Spermi-enplasmamembran von maßgeblicherBedeutung für die Fertilität. Ziel war eszu testen, ob mit dem Volumenregula-tions- und Ovidukt-Explant-Assay alsfunktionelle Tests der Plasmamembran-integrität Fertilitätsunterschiede bei nor-mospermen Bullen erklärt werden kön-nen.
Methoden: Tiefgefriersperma von dreifertilen Bullen (Non-Return-Rate 72 %)
und drei subfertilen Bullen (Non-Return-Rate 58 %) wurde wie folgt untersucht:standardspermatologisch (progressiveMotilität, Morphologie), flowzytometri-sche Evaluierung der Plasmamembran-und Akrosomintegrität nach Färbungmit den Fluoreszenzfarbstoffen Propidi-umjodid und FITC-PNA, Volumenregu-lationstest im iso- und hypotonen Medi-um mit dem CASY-1-System sowie diequantitative Bestimmung gebundenerSpermien an Eileiterepithel im Ovidukt-Explant-Assay.
Resultate: Die standardspermatologi-schen und flowzytometrischen Unter-suchungen zeigten keine Unterschiedezwischen den Bullengruppen. DieVolumenregulation unterschied sichnach 5 Minuten Inkubation der Sper-mien im hypotonen Medium signifikant(p < 0,05) zwischen fertilen und sub-fertilen Bullen. Dabei entsprachen dieModalwerte der Volumenverteilung inder fertilen Gruppe bekannten Refe-renzwerten für Bullensperma. Unterhypotonen Bedingungen war das Sper-mienvolumen der subfertilen Bullensignifikant höher (p < 0,05) als bei fer-tilen Bullen. In der Gruppe der fertilenBullen lag der Bindungsindex im Ovi-dukt-Explant-Assay höher als in dersubfertilen Gruppe (p < 0,01).
Schlußfolgerungen: Es läßt sich schluß-folgern, daß der Volumenregulationstestund der Ovidukt-Explant-Assay alsfunktionelle Tests der Spermienplasma-membran ein höheres fertilitätsdiagno-stisches Potenzial als standardspermato-logische Tests und die flowzytometri-sche Analyse der Membranintegritäthaben.
P03EXPRESSION UND ZELLULÄRE LOKALISATIONDES ESTROGENREZEPTORS-ALPHA (ER-A)IM HODEN VERSCHIEDENER SÄUGER
O. Lekhkota, M. BergmannInstitut für Veterinär-Anatomie, -Histo-logie und -Embryologie, Universität Gie-ßen
Einleitung: In den Leydig-Zellen einigerSpezies werden unterschiedliche Estro-genmengen synthetisiert, die in peri-pherem Blutplasma, Tubulusflüssigkeitund Ejakulat nachgewiesen werden
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können. Daraus ergibt sich die Frage,ob die Estrogene eine funktionelle Be-deutung für die Hodenfunktion haben.So weisen Hengste im peripheren Blut-plasma Estrogenkonzentrationen vonbis zu 400 ng/ml, Männer 68 pg/ml undHunde 10–40 pg/ml auf. Die Daten hin-sichtlich der exakten Lokalisation vonEstrogenrezeptoren im Hoden sindwidersprüchlich. So wird bei Nagerndie Expression von ER-α-Protein im-munhistochemisch sowohl in Keim-zellen als auch in somatischen Sertoli-und Leydig-Zellen beschrieben, beimHund in Leydig- und peritubulärenZellen sowie beim Mann nur in denLeydig-Zellen.
Methoden: In dieser Studie wurde dieER-α-mRNA-Expression mittels RT-PCRam Hodenhomogenat und die zelluläreLokalisation mittels In-situ-Hybridisie-rung, In-situ-PCR und UV-Laser-Cell-Picking bei Mensch, Maus, Hund undPferd nachgewiesen.
Resultate: Die RT-PCR für ER-α an Ge-samthomogenat ergab ein spezifischesPCR-Produkt. Im Unterschied zu denimmunhistochemischen Untersuchun-gen läßt sich die zelluläre Lokalisationvon ER-α-mRNA bei Mann, Maus undPferd in Spermatogonien und primärenSpermatozyten bis zum Mid-Pachytänund beim Hund in Spematogonien undallen primären Spermatozyten nachwei-sen. Die interstitiellen Leydig- und peri-tubulären Zellen sowie die Spermatidensind negativ.
Schlußfolgerungen: Die zelluläre Loka-lisation des ER-α weist darauf hin, daßEstrogene an der Proliferation und Dif-ferenzierung von Spermatogonien undprimären Spermatozyten beteiligt sind.
P04UNTERSUCHUNG DES SPERMATOGENESE-PHÄNOTYPS BEI TRANSGENEN MÄUSEN MITSERTOLI-ZELL-SPEZIFISCHEM KNOCKOUTDES CONNEXIN43-GENS
M. Zeiler1, M. Kibschul2, E. Winterhager2,K. Willecke3, F. Guillou4, K. Steger5,L. Konrad6, M. Bergmann1, R. Brehm1
1Institut für Veterinär-Anatomie, -Histo-logie und -Embryologie, UniversitätGießen, 2Institut für Anatomie, Universi-tätsklinikum Essen, 3Institut für Genetik,Universität Bonn, 4INRA-CNRS, Univer-sität Tours-Haras, Nouzilly, Frankreich,5Urologische Klinik, Universität Gießen,6Klinik für Urologie, Universität Marburg
Einleitung: Zell-Zell-Verbindungen über„gap junctions“, die Connexin43 (Cx43)enthalten, kommen im Keimepithel desHodens zwischen benachbarten Sertoli-Zellen sowie zwischen Sertoli- undKeimzellen vor. Sie werden mit derKeimdrüsenentwicklung und mit derpubertären Initiierung der Spermato-genese bei verschiedenen Spezies wieMaus, Ratte und Mensch in Verbindunggebracht.
Methoden und Resultate: Da Mäuse miteinem generalisierten Connexin43-Knockout aufgrund von Herz-Kreislauf-Mißbildungen nicht lebensfähig sind,wurde erfolgreich eine konditionaleCx43-Knockout-Mauslinie (SCCx43KO)unter Einsatz des Cre/LoxP-Rekombina-sesystems generiert, bei der nach Ver-paarung von Cx43 gefloxten Mäusenmit AMH-Cre-Mäusen die Deletion desCx43-Gens auf Sertoli-Zellen beschränktist. Ein Fertilitätsassay ergab, daß diehomozygoten SCCx43KO-Tiere dieserLinie steril waren aber Libido zeigten,während die heterozygoten SCCx43KOund Wildtyp-Mäuse fertil waren. Mitdiesem Tiermodell können nun die Fol-gen des zellspezifischen Verlustes desCx43-Gens auf die postnatale Differen-zierung der Sertoli- und Keimzellen ge-zeigt werden. Nach der Genotypisierungmittels Schwanzspitzenbiopsie wurdedas erfolgreiche Ausschneiden desCx43-Gens im Hoden mit Hilfe einerRT-PCR und dem indirekten immun-histochemischen Nachweis der nuklea-ren β-Galaktosidase bestätigt. Der Phä-notyp homozygoter SCCx43KO-Mäusezeigte im Vergleich zu heterozygotenSCCx43KO- oder Wildtyp-Mäusen ein
vermindertes Hodengewicht (0,06 %des Körpergewichts vs. 0,23 % bei hete-rozygoten SCCx43KO- und 0,32 % beiWildtyp-Mäusen) und einen Arrest derSpermatogenese auf der Stufe der Sper-matogonien mit Ausbildung primärerSpermatozyten in vereinzelten Keim-tubuli. Um den Differenzierungszustandder Sertoli-Zellen näher charakterisie-ren zu können, wurden mittels In-situ-Hybridisierung die Synthese von Cx43mRNA und immunhistochemisch dasVorkommen des Cx43-Proteins unter-sucht. Auffallend war dabei, daß wederin Sertoli-Zellen noch in Keimzellen dasProtein, aber in Spermatogonien dieCx43-mRNA detektiert wurde. Wie müs-sen also Sertoli- und Keimzellen mitein-ander kommunizieren, damit ein voll-ständiges Cx ausgebildet wird? Bei einemTeil der homozygoten SCCx43KO-Mäusefand sich außerdem in bis zu 10 % derTubuli eine zumindest qualitativ intakteSpermatogenese.
Schlußfolgerungen: Zusammenfassenddeuten die bisherigen Ergebnisse auf dasVorliegen eines somatischen Mosaikshin.
P05GENEXPRESSION DES TESTIS-SPEZIFISCHENHISTONS (H1T) IN DER SPERMATOGENESEDES PFERDES
M. Oliveira Cavalcanti1, M. Bergmann1,J. Geyer2
1Institut für Veterinär-Anatomie, -Histo-logie und -Embryologie und 2Institut fürPharmakologie und Toxikologie, Univer-sität Gießen
Bei Säugetieren werden in den Sper-matogonien und Spermatozyten Histo-ne exprimiert. Die Histone werden inKor- (H2A, H2B, H3 und H4-) undLinker-Histone (H1.1-5, H1t und H1)eingeteilt. Das H1t ist ein hodenspezifi-sches Histon und wird nur in den Keim-zellen exprimiert. Die Expression dieserKernproteine ist beim Pferd bisher nichtuntersucht worden. Beim Pferd war dieH1t-Sequenz bisher unbekannt. DurchBioinformatikanalysen sind Primer aus-gesucht worden. Das equine H1t-Genist kloniert und die H1t-Sequenz ist inder Genbank eingetragen (Accessionnumber AJ865320). Die mRNA-Expres-sion konnte durch RT-PCR in Hoden-
homogenaten sowie durch eine H1t-mRNA-Sonde mittels In-situ-Hybridisie-rung nachgewiesen werden. Es hat sichgezeigt, daß in der normalen Spermato-genese H1t-mRNA in primären Sperma-tozyten bis zum „Mid“-Pachytän expri-miert wird. Das H1t-Protein ist durchWesternblot in der normalen Spermato-genese am Hodenhomogenat mit Hilfeeines polyklonalen Antikörpers gegenH1t-Peptid LITEALSVSQER identifiziertund sequenziert worden. Das Proteinhat ein Molekulargewicht von 21 kDa.In einem Expressionsprofil wurde fest-gestellt, daß H1t tatsächlich hodenspe-zifisch ist. Quantitative Real-Time-PCRsowie Westernblots an Homogenatenskrotaler Hoden mit normaler Sperma-togenese sowie inguinal kryptorcherHoden, die einen Arrest der Spermato-genese auf der Stufe der fetalen Prä-spermatogonien bzw. Spermatogonienaufweisen, zeigen, daß Präspermatogo-nien und Spermatogonien im Vergleichzur primären Spermatozyten eine gerin-ge mRNA-Expression aber noch keineProteinexpression aufweisen. DieseDaten zeigen, daß, ebenso wie bei derMaus, das equine H1t auf RNA-Ebenein geringen Mengen bereits in Sperma-togonien exprimiert und mit dem Be-ginn der Meiose hochreguliert wird. Inweiteren Untersuchungen soll geklärtwerden, ob eine geringe Spermatogene-se-Effizienz mit einer geänderten H1t-Expression korreliert.
P06MOSAIK DES ANDROGENREZEPTORS DERSERTOLI-ZELLE
K. Handte, S. Hartmann, K. Herde,M. BergmannInstitut für Veterinär-Anatomie, -Histo-logie, und -Embryologie, UniversitätGießen
Der Androgenrezeptor (AR) enthält imExon 1 in der N-terminalen Transaktiva-tionsdomäne eine polymorphe Polyglut-aminwiederholung der Basen CAG. Diephysiologische Variationsbreite beträgt9–36 „Repeats“. Lange Repeats (> 26)korrelieren mit Spermatogenesestörun-gen, die durch eine geringere Affinitätdes Rezeptors für Androgen bedingt ist.Der kausale Zusammenhang zwischengenomischem AR-Polymorphismus undInfertilität ist unbekannt. Bisherige Da-
ten beruhen auf Untersuchungen derDNA in Lymphozyten. Wir untersuchenerstmals die Möglichkeit des somati-schen Mosaiks des AR in bezug auf denDifferenzierungsgrad der Sertolizellen(SZ) bei Patienten mit bunter Atrophieder Spermatogenese. Sowohl Keimzel-len als auch SZ verfügen über genomi-sche DNA. Deshalb wurde der CAG-Polymorphismus an mRNA untersucht,da innerhalb der Keimtubuli nur die SZden AR exprimiert.
An Paraffinschnitten wurden mittels UV-Laser-gestützter-Mikrodissektion Tubulimit qualitativ intakter Spematogeneseund präpubertäre Stränge ausgeschnit-ten, RNA isoliert, amplifiziert, kloniertund sequenziert. Dabei entspricht einKlon dem Amplifikat aus einer SZ.
Zur Charakterisierung des SZ-Differen-zierungsgrades wurden immunhistoche-mische Färbungen gegen Anti-Müller-Hormon (AMH), Zytokeratin 18 und ARangefertigt.
Die bisherigen Untersuchungen zeigen,daß SZ aus Proben jedes einzelnen Pati-enten sowohl assoziiert mit intakterSpermatogenese als auch in präpuber-tären Keimsträngen ein Mosaik unter-schiedlicher CAG-Repeatlängen bis zu4 Repeats aufweisen.
Die Repeatlänge liegt bei allen Probenmit 24–26 (intakte Spermatogenese)bzw. 25–27 (präpubertäre Keimstränge)innerhalb der physiologischen Variation.
Die Immunhistologie zeigt eine hetero-gene SZ-Population innerhalb präpuber-tärer Stränge auf. Dabei zeigen SZ inpräpubertären Keimsträngen im Ver-gleich zu SZ bei intakter Spermato-genese eine Expression von AMH undeine nur geringe Expression des AR.
Die vorliegenden Daten belegen erst-mals das somatische Mosaik des AR aufzellulärer Ebene und geben Hinweisedarauf, daß die geringere AR-Expressionin undifferenzierten SZ bei adulten Pati-enten mit der Länge des Repeats korre-lieren könnte.
P07EXPRESSION VERSCHIEDENER CONNEXINE INSERTOLI- UND KEIMZELLEN IN DER NORMA-LEN UND GESTÖRTEN SPERMATOGENESE DESHUNDES
C. Rüttinger1, M. Bergmann1, S. Pesch2,K. Seitz3, A. Trautmann3, R. Brehm1
1Institut für Veterinär-Anatomie, -Histo-logie und -Embryologie und 2Klinik fürGeburtshilfe, Gynäkologie und Androlo-gie der Groß- und Kleintiere, UniversitätGießen, 3Tierärztliche Klinik Dr. Kaiser,Stadtoldendorf
„Gap junctions“, die Connexin (Cx) 43enthalten, sind im Hoden des Mannesintratubulär zwischen benachbartenSertoli-Zellen und zwischen Sertoli-Zel-len und Keimzellen lokalisiert. Sie wer-den im Keimepithel wahrscheinlichzum ersten Mal ab der Pubertät expri-miert, assoziiert mit dem Beginn derSpermatogenese. Weiterhin ist bekannt,daß die Entwicklung humaner Keimzell-tumoren (aus präinvasivem Carcinomain situ) mit einer Sertoli-Zell-Dedifferen-zierung sowie einer Herunterregulierungder Cx43-Genexpression einhergeht.
Mittels Reverse-Transkriptase-Polymerase-kettenreaktion (RT-PCR), UV-Laser-assi-stierter Mikrodissektion, In-situ-Hybridi-sierung, Immunhistochemie und Western-blot wurde erstmals das mögliche Auftre-ten von Cx43 auf mRNA- und Protein-ebene im Hoden von präpubertären Hun-den, adulten Hunden mit normaler Sper-matogenese und bei verschiedenen For-men kaniner Hodentumoren untersucht.
In präpubertären Keimsträngen konntezwar Cx43-mRNA, jedoch kein Cx43-Protein nachgewiesen werden. Unter-suchungen im Keimepithel des adultenHundes mit normaler Spermatogenesezeigten, daß Cx43-mRNA in Sertoli-Zel-len sowie in Keimzellen und Cx43-Pro-tein zwischen Sertoli-Zellen des „Ser-toli-Sertoli-junctional-Komplex“ lokali-siert ist. In Hodentumoren zeigte sichein differenziertes Verteilungs- und Ex-pressionsmuster. So konnte Cx43-mRNAsowohl im kaninen Seminom als auchim Sertoli-Zelltumor detektiert werden,wohingegen Cx43-Protein nur nochzwischen neoplastischen Sertoli-Zellendes Sertoli-Zelltumors, aber nicht mehrzwischen neoplastischen Keimzellendes Seminoms zu finden war.
Erste Ergebnisse mittels RT-PCR zeigteneine klare Expression von Cx43-mRNAim kaninen Hoden.
Da Cx43 als pubertärer Marker im Ser-toli-Zelltumor scheinbar nicht herunter-reguliert wird, sollen weitere Untersu-chungen dazu beitragen, eine Aussageüber den Differenzierungszustand derneoplastischen Sertoli-Zellen machenzu können.
Diese Studie wird gefördert durch die Justus-Liebig-Universität, Gießen.
Assistierte Reproduktion
P08MECHANISMEN DER EIZELLREIFUNG BEIMPFERD
C. Reich1, S. Kölle1, G. Duchamp2,C. Lahuec2, M. Caillaud2, G. Goudet21Institut für Veterinär-Anatomie, -Histo-logie und -Embryologie, Universität Gie-ßen, 2INRA-CNRES, Universität Tours-Haras, Nouzilly, Frankreich
Die Erfolgsraten für die In-vitro-Matura-tion (IVM) und In-vitro-Fertilisation (IVF)von equinen Oozyten liegen bei 20–30 %. Ziel der Studie war es daher, dieMechanismen der Eizellreifung beimPferd näher zu charakterisieren und dieReifung in vivo und in vitro zu verglei-chen. Unreife Cumulus-Oozyt-Complexe(COCs) wurden durch Follikelpunktionund Slicing von Ovarien von Pferdennach der Schlachtung gewonnen. In vivogereifte COCs wurden durch ultraschall-geführte transvaginale Aspiration vonpräovulatorischen Follikeln von 26 Pony-stuten gewonnen. Die IVM erfolgte in„Tissue Culture Medium 199“ mit 20 %Kälberserum und 50 ng/ml EGF. UnreifeCOCs sowie in vivo und in vitro gereifteCOCs wurden mit Hilfe der Lichtmikro-skopie, Rasterelektronenmikroskopie,Immunzytochemie und Histochemieverglichen. Die unreifen COCs weisenzahlreiche runde, dichtgepackte Cumu-luszellen auf, die nur durch wenige kur-ze Fortsätze verbunden sind. Nach derReifung ex vivo weist der COC einehohe Anzahl an Cumuluszellen auf, diedurch eine große Menge extrazellulärerMatrix (ECM) voneinander getrennt,jedoch durch lange zytoplasmatischeFortsätze miteinander verbunden sind.
Die ECM besteht zu einem großen An-teil aus Hyaluronsäure, die in unreifenCOCs nur in geringem Maße, nach derMaturation in hoher Menge sowohl vonder Eizelle wie von den Cumuluszellengebildet wird. Zusätzlich lassen sichsaure und sulfatierte Glyksaminoglykane(GAGs) nachweisen, die in unreifenCOCs nur in geringem Maße in der Ei-zelle, nach der Reifung in vivo in hohemMaße sowohl in der Eizelle wie in denCumuluszellen synthetisiert werden.
Nach IVM ist die Zahl der Cumulus-zellen und die Menge der gebildetenECM deutlich geringer als nach derIn-vivo-Maturation. Die Synthese vonHyA ist in Eizelle und Cumuluszellenreduziert, die Produktion von GAGs istin der Eizelle vermindert. Die Cumu-luszellen sind nur durch wenig Fort-sätze verbunden und weisen eine unre-gelmäßige Form auf. Während die Zonapellucida (ZP) der Eizelle bei in vivogereiften Eizellen ein dreidimensiona-les Netzwerk mit gleichmäßig angeord-neten, ovalen Poren aufweist, zeigt sienach der IVM lediglich wenige, unre-gelmäßige Poren.
Unsere Studien zeigen, daß die Cumu-luszellen für die Eizellreifung des Pfer-des durch Bildung großer Mengen was-serbindender extrazellulärer Matrix eineessentielle Rolle spielen. Veränderun-gen in Zahl und Funktion der Cumulus-zellen führen zu Störungen in der Syn-theseleistung der Oozyte und in derStruktur der ZP.
P09ELEKTRONENMIKROSKOPISCHER NACHWEISVON LÄSIONEN DER SPERMIEN-ZENTRIOLEALS URSACHE FÜR ZELLTEILUNGSARRESTIM PRONUKLEUSSTADIUM NACH INTRAZYTO-PLASMATISCHER SPERMIENINJEKTION(ICSI)
J. Schröder1, F. Hofstädter1, M. Bals-Pratsch2, B. Paulmann2, S. Seifer 2,B. Seifert2
1Institut für Pathologie der UniversitätRegensburg, 2Zentrum für Gynäkologi-sche Endokrinologie, Reproduktions-medizin und Humangenetik, Regensburg
Einleitung: Bei Paaren mit unerfülltemKinderwunsch zeigt sich unter den The-
rapien der „assistierten Reproduktion“das ICSI-Verfahren als besonders erfolg-versprechend. Dessen Effektivität kannjedoch durch zahlreiche Dysfunktionendes Spermiums nachteilig beeinflußtwerden.
Die reife humane Oozyte besitzt keinZentrosom; ist die Fähigkeit des pater-nalen Zentrosoms zur Induktion derersten Teilungsspindel in der Zygotebeeinträchtigt, bleibt die Syngamie derPronuklei (PN) aus, was zu einem Arrestin der Embryonalentwicklung führt.
Methoden: Natives Ejakulat (P-Motilität:50 %) eines 40jährigen Mannes wurdeKarnovsky-fixiert, in Kunststoff einge-bettet und elektronenmikroskopischuntersucht. Vorausgegangenen warenzwei erfolglose ICSI-Zyklen (37 Eizel-len: 25-PN-Stadien; Kryo von 12-PN-Stadien), die im Arrest des PN-Stadiumsder Zygote endeten (Frau: intakte Funk-tion der reifen Eizelle, Nachweis durchsog. „spindle-view“ des Polkörpers;ein Embryotransfer mit fraglicher Zell-teilung).
Resultate: Zur Darstellung kamen zahl-reiche abnorme Spermien (80 %) mitAberrationen des Akrosomenkomplexes(Agenesie, Dysgenesie, Kraterbildung,Vakuolen/membranöse Inklusionen),Kopfdeformationen (Rundformen, Spitz-formen, Doppelköpfe, unkompaktiertesChromatin) sowie multiplen Läsionendes Zentrosoms.
Bei 8 von 11 untersuchten Spermienmit optimal einsehbaren Zentrosomen(73 %) kamen im Querschnitt der Zen-triole ein Verlust der Mikrotubuli- (MT-)Tripletten, deren Reduktion zu MT-Dou-bletten/Monomeren bzw. zusätzlicheZentriolstrukturen zur Darstellung. Inlängs getroffenen Zentriolen zeigtensich überlange MT, die quer aus demSpermienhals herausragten.
Schlußfolgerungen: Die beobachtetenzentriolären Abberationen sind wahr-scheinlich Ursache für eine frühe Stö-rung der Embryonalentwicklung.
Zur Zeit ist bei einer Zentriolenstörungim homologen System keine Therapiemöglich. Über erste heterologe Versu-che zur Restaurierung der Zentriolen-funktion humaner Spermien unter Ein-satz Zytoskelett-stabilisierender Sub-stanzen wurde berichtet.
P10FRÜHEMBRYONALE ENTWICKLUNGSPAUSEMIT NACHFOLGEND NORMALEM GESTATIONS-VERLAUF NACH ICSI UND EMBRYOTRANSFER:EIN FALLBERICHT
R. Ochsenkühn, W. Fait, K. Friese,C. ThalerKlinik und Poliklinik für Frauenheilkundeund Geburtshilfe, Klinikum der Universi-tät München-Großhadern
Im Rahmen der ICSI und nachfolgen-dem Embryotransfer (ET) ergibt sich derKonzeptionstermin einer resultierendenSchwangerschaft aus dem Zeitpunkt derFollikelpunktion. Dadurch ist im Regel-fall eine sehr exakte Bestimmung desGestationsalters möglich. Demgegen-über erfolgt die Festlegung des Konzep-tionstermins bei spontanen Schwanger-schaften meist nur nach der Zyklus-anamnese, was oft Unklarheiten mitsich bringt. In diesen Fällen erlaubendie frühe embryonale Sonobiometriesowie die serielle Bestimmung des müt-terlichen Serum beta-hCG eine weitge-hend exakte Festlegung des Gestations-alters.
Wir berichten über den frühen Schwan-gerschaftsverlauf einer 39jährigen Pati-entin, bei der nach ICSI und Embryo-transfer (ET) zunächst eine 5tägige Ver-zögerung von SSL-Entwicklung undhCG-Dynamik auftrat. Im Anschluß andiese Entwicklungpause setzte eineregelrechte Weiterentwicklung dersonographisch dokumentierbaren Em-bryogenese sowie ein normaler hCG-Verlauf ein. Bei der Patientin bestehtaktuell eine unauffällige Gravidität im2. Trimenon.
Der in Relation zum Punktionsterminum 5 Tage verspäteten Embryogenesekönnte eine vorübergehende Entwick-lungspause zugrunde liegen. Dieserbiologische Mechanismus ist bei ver-schiedenen Säugetieren gut untersuchtund wird als Diapause bezeichnet. Bis-her gibt es einige wenige Fallberichte,die das Vorkommen einer Diapauseauch im Rahmen der menschlichenFortpflanzung nahe legen. Die wissen-schaftliche Untersuchung einer mögli-chen humanen Diapause könnte inter-essante Konzepte zu den Vorgängen beiregelhafter oder gestörter Implantationergeben. Der Fallbericht weist auch auf
mögliche Probleme des frühzeitigenSchwangerschaftsnachweises im Zu-sammenhang mit assistierten Reproduk-tionstechniken hin.
P11NEUES SONOGRAPHISCHES OVARSCORINGZUR PRÄDIKTIVEN EINSCHÄTZUNG DER OVA-RIELLEN REAKTION IM ERSTEN ART-ZYKLUS
B. Wetzka, A. Maechtel, F. Botsch,A. Wacker, A. Ochsner, F. GeisthövelCERF Freiburg
Studiendesign: Zur prädiktiven Ein-schätzung der ovariellen Reaktion aufdie Gonadotropinstimulation im nach-folgenden ersten ART-Zyklus wurde einneues sonographisches Scoring derfunktionellen Reserve des unstimulier-ten Ovars angewendet. Anhand diesesOvarscores (OS) wurde die entspre-chende Gonadotropindosierung mitdem Ziel gewählt, die Abbruchrate zuminimieren, eine ausreichende Anzahlvon Oozyten zu gewinnen und einovarielles Überstimulationssyndrom(OHSS) zu vermeiden.
Methoden: Das Ovarscoring wurde bei61 Frauen (33,2 ± 5,0 Jahre; BMI 23,7 ±4,4 kg/m2) zwischen dem 3. und 7. Zy-klustag (Tag A) mittels Vaginalsonogra-phie durchgeführt. Der OS lag zwi-schen +2 und –2, dabei wurde ein OSvon +2 definiert als max. ovariellerDurchmesser (MOD) von > 30 mm,mehr als 8 Antralfollikel und einer zen-tralen Echodensität von > 1/3 der Ovar-fläche, während ein OS von –2 beieinem MOD von < 20 mm und wenigerals 3 Antralfollikeln vergeben wurde.Für die Auswertung wurde der mittlereOS (mOS) der beiden Ovarien einerPatientin verwendet. Mit Hilfe diesesprätherapeutischen OS wurde die initialeGonadotropindosis im anschließendenersten ART-Zyklus gewählt, z. B. eineniedrige Dosierung von < 100 IU FSH/dbei Frauen mit mOS von +2 („very highresponder“) und eine hohe Dosis von> 250 IU FSH/d bei einem mOS von –2(„very low responder“). Neben dem OSwurden die Serumkonzentrationen vonFSH, LH, Inhibin B (Inh) und Testosteron(T) mittels Immunoassays bestimmt. DieFollikelzahl (FZ) am 6. Stimulationstag(Tag B), die bei der Punktion gewonneneOozytenzahl (OZ) (Tag C) und der MOD
der Ovarien am Tag 10 nach der hCG-Injektion (Tag D) wurden zusammen mitden entsprechenden Serumhormonspie-geln dokumentiert. Am Tag D wurde zu-sätzlich der Hämatokrit (Hkt) bestimmt.Die statistische Evaluation wurde mit-tels der Spearman-Korrelation durchge-führt (Korrelationskoeffizient, p). DieErgebnisse sind als Mittelwert ± Stan-dardabweichung dargestellt.
Ergebnisse: Der mOS beider Ovarienam Tag A lag bei –0,01 ± 1,10. Die fol-genden Korrelationskoeffizienten bezie-hen sich auf den mOS: Das Alter, derFSH/LH- und der FSH/Inh-Quotient wa-ren negativ korreliert (–0,32; p = 0,013;–0,49; p < 0,0001; –0,26; p = 0,04).Die LH- und T-Serumspiegel zeigteneine positive Korrelation (0,36; p = 0,004;0,28; p = 0,02). Die initiale FSH-Dosis/d(80–300 IU) und die Gesamt-FSH-Men-ge/Zyklus (820–4275 IU) korreliertennegativ (–0,88; p < 0,0001; –0,65;p < 0,0001). Am Tag B zeigte der Serum-FSH-Spiegel eine negative (–0,71;p < 0,0001) und die FZ (13,0 ± 9,7)eine positive (0,57; p < 0,0001) Korrela-tion. Die OZ (9,7 ± 4,5) am Tag C (0,30;p = 0,01) und der MOD am Tag D (0,38;p = 0,0026) korrelierten positiv. Dermaximale Hkt lag bei 42 % (36,7 ± 3,1).
Obwohl die Ergebnisse der ART-Zyklenkeine direkten Ziele der Studie waren,werden sie als Referenz im folgendendargestellt: Bei 61 Behandlungszyklengab es ein Fertilisationsversagen undeine fehlende Follikelentwicklung.Es resultierten 25 fortlaufende Schwan-gerschaften (21 Einlinge, 4 Zwillinge)und 2 Aborte. In 38 Zyklen wurden2-PN-Zellen kryokonserviert.
Schlußfolgerungen: Das neue sono-graphische OS, das die aktuelle funk-tionelle Reserve des unstimuliertenOvars evaluiert, sagt zuverlässig dieovarielle Reaktion im anschließendenersten ART-Zyklus voraus. Durch dieAnwendung dieses einfachen klini-schen Hilfsmittels kann die adäquateinitiale Gonadotropindosis genauerkalkuliert werden, so daß die Abbruchs-rate minimiert und die Entwicklungeines OHSS vermieden werden kann.In der praktischen Anwendung hatsich diese Methode auch bei endo-krinologischen Fragestellungen wieAbklärung einer Oligo-Amenorrhöoder des Perimenopausenstatus be-währt.
P12INTRAZYTOPLASMATISCHE SPERMIEN-INJEKTION (ICSI) MIT KRYOSPERMA NACHKRYOKONSERVIERUNG VOR ONKOLOGISCHERBEHANDLUNG
B. Paulmann, M. Bals-Pratsch, D. Seifert,B. SeifertZentrum für Gynäkologische Endokrino-logie, Reproduktionsmedizin und Human-genetik, Regensburg
Einleitung: Effektive Tumortherapien(TuT) führen beim Mann nicht seltenzu Einschränkungen oder komplettemVerlust der Fertilität. Die Spermakryo-konservierung (SKK) ist ein Routine-verfahren der Reproduktionsmedizinund sollte jedem Patienten (Pat.) voreiner TuT zur Fertilitätsprotektion (FP)angeboten werden. Die Lebensqualitätkann hierdurch erhalten oder gesteigertwerden. Weitere Indikationen für dieSKK sind Ejakulationsstörungen oderChemotherapie z. B. bei chronischenErkrankungen.
Methoden: Im Zeitraum von 01/2001bis 12/2005 führten wir bei 113 Pat. dieSKK durch. Bei 75 Pat. erfolgte die SKKvor einer onkologischen Behandlung(35× Hoden-Tumor [Tu], 17× Lympho-me, 14× Leukämie, 3× Gehirn-Tu, 2×Prostata-Tu, 2× Kolon-Tu, 1× Blasen-Tu,1× Thymus-Tu). Die Pat. waren zumZeitpunkt der TuT und SKK 15–63 Jahrealt (Median: 26 J.). 7 Pat. (12 %) kamen1 Monat bis 3 Jahre (Median: 1 J.) späterzur ICSI mit Kryosperma (bei TuT 25–63Jahre; Median: 33).
Resultate: Bei den 7 Pat. (Alter bei ICSI-Behandlung 30–63 Jahre; Median: 34)wurden 12 ICSI-Kryospermazyklen und3 Kryozyklen (3× Hoden-Tu, 1× MorbusHodgkin, 1× Blasen-Tu, 1× Gehirn-Tu,1× Leukämie) 07/2002 bis 05/2006durchgeführt. Es konnten 8 Schwanger-schaften (SS) bei 5 Paaren erreicht wer-den (1 Frühabort). Die Patientinnen wa-ren bei der ICSI-Behandlung zwischen23 und 38 Jahre alt (Median: 34). 7 Kin-der (1× Gemini) wurden bereits gebo-ren. Darüber hinaus besteht eine fort-laufende SS.
Schlußfolgerungen: Trotz sehr guter TuT-Behandlungserfolge machen derzeitjüngere Tumor-Pat. mit noch nicht be-gonnener oder abgeschlossener Famili-
enplanung nur in geringem Umfang vonder FP Gebrauch [1, 2]. Eine Ursacheliegt sicher in der unzureichenden ärzt-lichen Aufklärung vor der TuT sowie dasungenügende Wissen der onkologischtätigen Ärzte über die heutigen sehr er-folgreichen Möglichkeiten der ICSI-Me-thode.
Literatur:1. Tournaye H. Storing reproduction for onco-logical patients. Mol Cell Endocrinol 2000;27: 133–6.2. Revel A, Haimov-Kochmann R, Porat A,Lewin A, Simon A, Laufer N, Gino H, MeirowD. In vitro fertilization-intracytoplasmaticsperm injection success rates withcryopreserved sperm from patients with ma-lignant disease. Fertil Steril 2005; 84: 118–22.
S. Fink, N. Geneidy, M. Bals-Pratsch,B. SeifertZentrum für Gynäkologische Endokrino-logie, Reproduktionsmedizin und Human-genetik, Regensburg
Einleitung: Das PCOS ist ein komplexesKrankheitsbild und häufig mit metaboli-schen Störungen assoziiert. Oft sind dieSchwangerschaftsraten (SSR) bei ARTniedriger als bei Patientinnen (Pat.) ohnePCOS. Die Begleitmedikation mit Met-formin bei PCOS im Rahmen von ART-Zyklen ist heutzutage klinische Routine.
Methodik: In einer retrospektiven Studiewurden die Ergebnisse bei ART bei 275Pat. mit PCOS und 3166 Pat. ohne PCOSverglichen. Es wurden 8187 aufeinan-derfolgende Zyklen zwischen 1998 und2005 mit der In-vitro-Fertilisation (IVF)und intrazytoplasmatischen Spermien-injektion (ICSI) ausgewertet.
In einer Subanalyse wurde der Einflußvon Metformin auf die Ergebnisse vonPCOS-Pat. mit Insulinresistenz (Insulin-sensitivitätsindex ISI < 6) untersucht(94 Behandlungszyklen mit vs. 252 ohneMetformin).
Resultate: PCOS-Pat. hatten einen signi-fikant höheren Body-Mass-Index, jünge-res Alter, weniger andere Sterilitätsursa-
chen, längere Stimulationsdauer, niedri-gere Gonadotropindosen und mehr reifeOozyten.
Die SSR über alle Zyklen wie auch nachIVF war bei PCOS-Pat. höher (32,9 % vs.25,3 % bzw. 38,1 % vs. 28,3 %). Beson-ders unter- und übergewichtige Pat. mitPCOS hatten signifikant bessere Ergeb-nisse als Pat. ohne PCOS. Die SSR nahmkontinuierlich mit der Anzahl der ART-Zyklen bei Pat. ohne PCOS ab, nichtaber bei PCOS.
Bei PCOS-Pat. erbrachte die Begleit-medikation mit Metformin eine Steige-rung der klinischen SSR, die jedochkein Signifikanzniveau erreichte. Be-merkenswert war allerdings eine Sen-kung der Frühabortrate von 24,5 % auf17,6 %.
Schlußfolgerungen: Das Alter der PCOS-Pat. war in > 50 % der Fälle < 30 Jahre.Pat. ohne PCOS waren durchschnittlich31,7 Jahre alt. Bei diesen Pat. lagen sig-nifikant mehr andere Sterilitätsfaktoren,Tubenfaktor oder Endometriose vor.PCOS-Pat. haben somit eine günstigePrognose bei ART.
Reproduktionsendokrinologie
P14NON-HLA-ANTIKÖRPER BEI PATIENTINNENMIT REZIDIVIERENDEN SPONTANABORTEN
N. Rogenhofer, R. Assef, M. Fileki,K. Friese, C. ThalerKlinik und Poliklinik für Frauenheilkundeund Geburtshilfe, Klinikum der Universi-tät München-Großhadern
Einleitung: Eine Gruppe von Patientin-nen (Pat.) mit rezidivierenden Spontan-aborten (RSA) produziert Antikörper(AK), die offenbar pathogenetisch rele-vant sind. Wichtig ist die Abgrenzungdieser Antikörper gegenüber anti-pater-nalen AK gegen klassische anti-HumanLeukocyte Antigens-(HLA-) A, -B, -C, dadiese häufig im dritten Trimenon nor-maler Schwangerschaften auftreten.Chorionkarzinomzellen JEG-3 sindnegativ für klassisches HLA, jedochexprimieren sie das weitgehend mono-morphe HLA-G. Wir haben untersucht,ob RSA-Pat. vermehrt anti-Trophoblast-AK (non-HLA-A, -B, -C) produzieren und
Material und Methoden: Wir analysier-ten Seren von 105 RSA-Pat. mit minde-stens 2 konsekutiven Spontanabortenvor der 20. Schwangerschaftswoche.Als Kontrolle dienten 60 gesundeSchwangere ohne Fehlgeburten. In allenFällen diente die Durchflußzytometrieals Untersuchungsmethode (FACS-Scan;Beckton Dickinson, Heidelberg). DieJEG-3-Expression für klassisches HLAwurde mittels des monoklonalenTP25.99 AK (Maus IgG1, von Dr. S.Ferrone, Roswell Park Cancer Institute,Buffalo, NY) analysiert, die HLA-G-1-und HLA-G-5-Expression mittels desMEM-G/9- (Maus IgG1-) Antikörpers(Abcam, Cambridge, UK). Zusätzlichwurde die Anti-JEG-3-Aktivität vonRSA- und Kontrollseren analysiert. Umeine HLA-G-Spezifität in den RSA-Serenzu untersuchen, wurde ein durchfluß-zytometrischer Blocking-Assay verwen-det: Hierbei wurden JEG-3-Zellen zu-nächst mit den Seren reaktiver Patient-innen inkubiert und anschließend aufeine verminderte Reaktivität gegenüberMEM-G9-AK getestet. Die statistischeAuswertung erfolgte nach einem 95 %-Konfidenzintervall und Fisher’s-Exact-Test.
Ergebnisse: Unsere Untersuchungenbestätigten, daß JEG-3-Zellen HLA-G1und -G5 exprimieren, aber negativ fürHLA-A, -B, -C sind. RSA-Patientinnenreagierten signifikant stärker mit JEG-3-Zellen als die Kontrollgruppe (16,2 % vs.3,3 %; p = 0,011). Im Blocking-Assayfand sich kein Hinweis auf eine Reak-tivität JEG-3-positiver RSA-Seren gegenHLA-G1 oder -G5.
Schlußfolgerungen: Patientinnen mitwiederholten Fehlgeburten produzierenim Gegensatz zu Kontrollpatientinnenohne Fehlgeburten anti-Trophoblast-An-tikörper. Diese Antikörper sind offenbarweder gegen klassisches HLA (-A,-B,-C)noch gegen das trophoblast-spezifischeHLA-G1 oder -G5 gerichtet.
P15METFORMIN VS. ACARBOSEANWENDUNG BEIFRAUEN MIT POLYZYSTISCHEM OVARSYNDROM(PCOS): PROSPEKTIV-RANDOMISIERTEDOPPELBLINDSTUDIE
A. Hanjalic-Beck1, B. Gabriel 2,C. Niemeyer1, C. Keck2, M. Schories3,C. Tempfer4, H. Zahradnik1
1Universitäts-Frauenklinik Freiburg,2Serono International, Genf, Schweiz,3Klinik für Endokrinologie, Bethesda Spi-tal, Basel, Schweiz, 4Universitäts-Frauen-klinik, AKH Wien, Österreich
Einleitung: Das polyzystische Ovarsyn-drom (PCOS) stellt eine der häufigstenendokrinologischen Erkrankungen beiFrauen im reproduktionsfähigen Alterdar (ca. 5–10 % ). Sie ist häufig durcheine Hyperinsulinämie gekennzeichnet.Infolgedessen kommt der Behandlungder Hyperinsulinämie beim PCOS be-sondere Bedeutung zu. Ziel dieser Stu-die war es, die Wirkung und die Ver-träglichkeit zweier Antidiabetika – Met-formin und Acarbose – bei Patientinnenmit PCOS hinsichtlich der Ovulationund der metabolischen/hormonellenVeränderungen zu überprüfen.
Methoden: Es wurden 75 Patientinnenmit PCOS (NIH 1990) rekrutiert, für dieprospektive Anwendung mit Metformin(n = 37) (1700–2550 mg/d) vs. Acarbose(n = 38) (200–300 mg/d) randomisiertund insgesamt über 12 Wochen behan-delt. Bei allen Patientinnen wurden vorund nach der Therapie ein oraler Glu-kosetoleranztest mit Insulinbestimmungdurchgeführt sowie metabolisches undhormonelles Profil bestimmt. Die Ovu-lationsrate wurde durch regelmäßigeProgesteronkontrollen bestimmt. DasMenstruationsmuster und die subjekti-ven Nebenwirkungen wurden vor undnach der Therapie abgefragt.
Resultate: Body-Mass-Index (BMI) undAlter beider Gruppen waren vor derTherapie gleich. Die Ovulationsrate be-trug am Ende der Studie in der Metfor-mingruppe 70 % und in der Acarbose-gruppe 55 % (p = 0,185). Entsprechendbesserte sich auch die Zyklusregelmä-ßigkeit (67 % unter Metformin vs. 76 %unter Acarbose; p = 0,321). Obwohl inder Metformingruppe eine signifikanteReduktion des BMI, der Nüchtern-Insu-lin/Glukose-Ratio und des Cholesterin-
spiegels beobachtet wurde, konntenwahrscheinlich aufgrund der kurzenBehandlungsdauer keine signifikantenUnterschiede bezüglich der metaboli-schen Parameter oder der Hormonwertezwischen den Gruppen festgestelltwerden. Die Verträglichkeit der Thera-pie mit Acarbose war besser im Ver-gleich zu Metformin, die Abbruchratewar jedoch in beiden Therapiegruppengleich.
Schlußfolgerungen: In dieser Studiezeigte sich sowohl unter Metformin alsauch unter Acarbosebehandlung einedeutliche Verbesserung der Ovulations-rate und der Zyklusregelmäßigkeit. DieBehandlung mit Acarbose wurde im Ver-gleich zu Metformin besser vertragen.Signifikante Veränderungen der hormo-nellen oder der metabolischen Parame-ter konnten wir bei dieser relativ kurzenBehandlungsdauer nicht feststellen.
P16VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN ZUWACHSTUM UND DIFFERENZIERUNG INRINDERPLAZENTOMEN AUS MOET- BZW.IVF-TRÄCHTIGKEITEN
M. Gruhn1, M. Kowalewski1, S. Kölle2,S. Hiendleder3, H. D. Reichenbach4,M. Weppert4, B. Hoffmann1, G. Schuler1
1Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologieund Andrologie der Groß- und Kleintieremit Tierärztlicher Ambulanz und 2Insti-tut für Veterinär-Anatomie, -Histologieund -Embryologie, Universität Gießen,3Institut für Molekulare Tierzucht undBiotechnologie, Ludwig-Maximilians-Universität München, 4Institut für Tier-zucht, Bayerische Landesanstalt fürLandwirtschaft, Grub
Einleitung: Beim Rind wird als Folge derAnwendung verschiedener biotechnolo-gischer Verfahren, wie der In-vitro-Fertili-sation (IVF), der In-vitro-Produktion (IVP)sowie des somatischen Klonens bei denresultierenden Graviditäten gehäuft einSyndrom verschiedener Anomalitätenbeobachtet, welches vor allem durcheinen teilweise erheblichen fetalenÜberwuchs gekennzeichnet ist (Large-offspring-Syndrom, LOS). Die Patho-genese des LOS ist immer noch weit-gehend unklar, offensichtlich beruht siejedoch auf einer Störung epigenetischerMechanismen während der Reprogram-
mierung des Genoms in der frühen em-bryonalen Phase. Über die im Rahmendes LOS auftretenden Aberrationen derPlazenta sowie deren mögliche Bedeu-tung für den fetalen Überwuchs liegenbisher nur wenige Informationen vor.Gegenstand der eigenen Untersuchun-gen an Plazenten aus LOS-positivenbzw. -negativen Graviditäten warendaher Parameter mit bekannter bzw.vermuteter Beziehung zu plazentaremWachstum und Differenzierung.
Methoden: LOS-Graviditäten (n = 11)wurden mittels IVF erzeugt. Die Kon-trollträchtigkeiten (n = 5) entstammtenaus Embryotransfers nach Superovula-tion („multiple ovulation embryo trans-fer“, MOET). Die Entnahme von Plazen-tomen erfolgte bei allen Versuchstierenunmittelbar nach der Schlachtung am80. Graviditätstag.
Resultate: Signifikante Gruppenunter-schiede ergaben sich für die mittelsRealtime-RT-PCR gemessene EstrogenReceptor Related Receptor β- (ERRβ-)spezifische mRNA-Konzentration sowiefür die – nach Immunfärbung für dieaktivierte Caspase 3 – ausgezählte Apo-ptosehäufigkeit mit jeweils höherenWerten bei den LOS-Trächtigkeiten. Beiden radioimmunologisch in Allantois-bzw. Amnionflüssigkeiten gemessenenKonzentrationen an freien und konju-gierten Estrogenen sowie an Progeste-ron waren keine signifikanten Unter-schiede feststellbar. Auch die mittelsRealtime-RT-PCR gemessenen ErbB3-bzw. wachstumshormonrezeptorspezifi-schen mRNA-Konzentrationen sowieder nach Lektinfärbung bestimmte An-teil der Trophoblastriesenzellen (TGC)an der Gesamtzahl der Trophoblastzel-len wiesen keine signifikanten Unter-schiede auf.
Schlußfolgerungen: Aufgrund der beianderen Spezies nachgewiesenen Be-deutung des ERRβ für die Trophoblast-zelldifferenzierung kann vermutet wer-den, daß das LOS des Rindes mit einerAlteration der TGC-Differenzierungassoziiert ist. Darauf deutet auch dieerhöhte Apoptosehäufigkeit in denPlazentomen hin, da die terminal dif-ferenzierten schwach invasiven TGCdes Rindes nach Invasion in das müt-terliche Epithel apoptotisch zugrundegehen.
P17ZYKLUSSPEZIFISCHE UNTERSCHIEDE IN DEREXPRESSION THROMBOZYTÄRER UND ENDO-THELIALER MIKROPARTIKEL
B. Toth1, K. Nikolajek1, A. Rank2,R. Nieuwland3, P. Lohse4, K. Friese1,C. Thaler1
1Klinik und Poliklinik für Frauenheil-kunde und Geburtshilfe, 2MedizinischeKlinik III und 3Institut für Klinische Che-mie, Klinikum der Universität München-Großhadern, 4Institut für Klinische Che-mie, AMC Amsterdam, Niederlande
Einleitung: Mikropartikel (MP) sindkleinste Membranpartikel, welche beiAktivierung oder Apoptose von zirkulie-renden Blutzellen und Endothelzellenfreigesetzt werden. MP sind in der Lage,die Gerinnung aktiv und passiv zu sti-mulieren sowie bioaktive Moleküle inandere Zellen zu transferieren. In dieserprospektiven Studie wurden erstmalszyklusspezifische Unterschiede in derMP-Expression und Subtypisierung un-tersucht.
Methoden: Bei 23 gesunden Frauen(keine Pille, kein Nikotin, keine Throm-bose) wurde anhand der Menstruations-anamnese und der Progesteronwerte dieEinteilung in die follikuläre (Zyklustag1–10, Progesteron ≤ 1 ng/ml; n = 14)oder luteale Phase (letzte 14 Zyklustage,Progesteron ≥ 6 ng/ml; n = 9) vorgenom-men. Zusätzlich wurden die Thrombo-zytenwerte bestimmt. MP wurden an-hand der charakteristischen durchfluß-zytometrischen Verteilung identifiziertund mit Hilfe der CellQuestTM Softwareanalysiert. Zellspezifische Marker dien-ten der Analyse des Ursprungsortes derMP (Thrombozyten: CD61; aktivierteThrombozyten: CD62P, CD63; Endo-thelzellen: CD144; aktivierte Endothel-zellen: CD62E). Die statistische Aus-wertung erfolgte mit Hilfe des Mann-Whitney-U-Tests.
Resultate: Das Durchschnittsalter betrug31 Jahre. Die Thrombozytenkonzentra-tion war bei Frauen in der Lutealphase(Mittelwert 247 G/l, 190–350 G/l) stati-stisch signifikant höher im Vergleich zuFrauen in der Follikularphase (314 G/l,233–404 G/l) (p = 0,013). Die Konzen-tration an Annexin-, CD61-, CD62E-,CD62P- und CD63E-positiven MP warbei Frauen in der Lutealphase gegenüber
der Follikularphase statistisch signifikanterhöht: (Median ± Standardabweichung,Follikularphase vs. Lutealphase), Anne-xin-positiv: (4,7 × 109/l ± 2,3 vs. 7,6 ×109/l ± 2,1; p = 0,04), CD61-positiv:(2,7 × 109/l ± 1,5 vs. 6,2 × 109/l ± 2,3;p = 0,001), CD63-positiv: (0,08 × 109/l± 0,1 vs. 0,5 × 109/l ± 2,9; p = 0,01),CD62P-positiv: (0,05x109/l ± 0,07 vs.0,2 × 109/l ± 0,2; p = 0,02), CD62E-po-sitiv: (0,3 × 109/l ± 1,6 vs. 0,5 × 109/l ±0,3; p = 0,05). Durchschnittlich 72 %der MP waren thrombozytären und15 % endothelialen Ursprungs.
Schlußfolgerungen: Gegenüber der Fol-likelphase steigt in der Lutealphase dieKonzentration an thrombozytären undendothelialen MP an. Dieser Effekt fin-det sich auch für die Subgruppe MP-ak-tivierter Thrombozyten und aktivierterEndothelzellen. Möglicherweise sindMP wesentliche Faktoren, welche dasGerinnungssystem vor Beginn einerMenstruationsblutung oder in Vorberei-tung einer Schwangerschaft prokoagula-torisch beeinflussen. Der Trigger dieserEffekte, insbesondere der Einfluß einzel-ner Sexualsteroide auf die MP-Expres-sion, ist Gegenstand unserer aktuellenUntersuchungen.
P18INZIDENZ EINES GESTATIONSDIABETES(GDM) BEI FRAUEN MIT POLYZYSTISCHEMOVARSYNDROM (PCOS)
M. Blasi1, M. Bals-Pratsch1, B. Zietz2,B. Seifert1, J. Nusser3
1Zentrum für Gynäkologische Endokrino-logie, Reproduktionsmedizin und Human-genetik, 2Abteilung für Innere MedizinII, Goldberg-Klinik, Kelheim GmbH,3Diabetologische Schwerpunktpraxis,Regensburg
Einleitung: PCOS, mit ca. 10 % eine derhäufigsten Infertilitätsursachen, ist oftvon Insulinresistenz, Gestationsdiabetes(GDM) und Typ-II-Diabetes (DM) beglei-tet. Die Inzidenz eines GDM bei PCOSist bisher nicht bekannt.
Methoden: 73 (45 primär; 28 sekundär)infertile Patientinnen (Pat.) mit PCOS,Alter: 22–40 Jahre (J) (Median: 31 J) undBody-Mass-Index (BMI) 18,3–43,2 (Me-dian: 27,3) erhielten von 5/2003 bis8/2005 einen oralen Glukosetoleranz-
test (oGTT) mit Bestimmung der Insulin-sensitivität: 43 waren insulinresistent(Insulinsensitivitätsindex (ISI) < 6, 2 hat-ten einen manifesten DM. Die nachfol-genden spontanen oder durch Kinder-wunschbehandlung erzielten Schwan-gerschaften (SS) und Geburten dieserPat. wurden in einem retrospektivenFollow-up bis 11/05 ausgewertet.55 Pat. wurden diabetologisch beraten.18 Pat. ohne Insulinresistenz mit unauf-fälligem oGTT präkonzeptionell wurdennicht diabetologisch mitbetreut.
Resultate: Bei 58 der 73 PCOS-Pat. tra-ten 101 SS auf, davon 9 Mehrlings-SS(8 Gemini-, 1 Drillings-SS) ferner 31Aborte. Bei diesen 58 Pat. konnten69 Geburten mit insgesamt 79 Kindernverzeichnet werden. 17 Pat. wurdenspontan schwanger, 8 nach Ovarstimu-lation (OI), 17 nach OI und intrauteri-ner Insemination (IUI), 17 nach In-vitro-Fertilisation (IVF), 30 nach IVF + intra-zytoplasmatischer Spermieninjektion(ICSI) und 12 nach einem Kryoembryo-transfer. Bei 14 Pat. wurde ein GDMfestgestellt (11 Frauen mit Insulinresi-stenz [ISI < 6], 3 mit normaler Insulin-sensitivität [ISI > 6]). Der Median fürdas Geburtsgewicht betrug 2985 g(Range: 825–4630 g). 8 Kinder (6 Müt-ter) hatten ein Geburtsgewicht von> 4000 g, wobei 2 Mütter präkonzep-tionell einen ISI < 6 und 4 Mütter einenISI > 6 zeigten. Jeweils eine Mutter miteinem ISI > 6 bzw. < 6 entwickelteeinen GDM.
Schlußfolgerungen: Jede 5. Pat. mitPCOS entwickelt einen GDM, sodaßein Screening für dieses Risikokollektivnotwendig ist. Da ein generelles Scree-ning auf GDM bislang nicht Bestandteilder Vorsorge bei Schwangeren ist, mußvon einer hohen Dunkelziffer uner-kannter und unbehandelter GDM-Fällebei PCOS und/oder Infertilität ausge-gangen werden.
Gynäkologie
P19PROGESTERONEINFLUSS AUF DEN GEFÄSS-FLÄCHEN- UND GEFÄSSDICHTEINDEX DESHUMANEN ENDOMETRIUMS AUF DERCHORIOALLANTOISMEMBRAN
I. Juhasz-Böss1, O. Ortmann1, E. Malik2
1Klinik für Frauenheilkunde und Ge-burtshilfe der Universität Regensburgam Caritas Krankenhaus St. Josef, Uni-versität Regensburg, 2Oldenburger Frauen-klinik, Klinikum Oldenburg GmbH,Oldenburg
Einleitung: Die Chorioallantoismembran(CAM) ist ein mögliches Modell zumStudium der Implantation des Endometri-ums. Eine wichtige Voraussetzung für dieImplantation ist die Angiogenese, dieeiner komplexen Steuerung u. a. durchSteroide und Zytokine unterliegt. Unter-sucht wurde der Einfluß von Progesteronauf die Gefäßdichte und die Gefäßflächeim Zeitverlauf.
Methoden: Endometrium von 9 gesun-den Patientinnen aus der Proliferations-phase wurde für 24 h je zur Hälfte innormalem und in progesteronhaltigemNährmedium kultiviert und anschlie-ßend auf die CAM transplantiert. Je 6Präparate von normalem und Progeste-ron ausgesetztem Endometrium jederPatientin sowie native CAM wurden fürweitere 24 h, 48 h, 72 h und 96 h kulti-viert. Eine computergestützte Auswer-tung des Gefäßflächenindex (GFI) undGefäßdichteindex (GDI) wurde vorge-nommen.
Resultate: Sowohl der GFI als auch derGDI des normalen und des Progesteronausgesetzten Endometriums sowie dernativen CAM steigen im Zeitverlauf signi-fikant an. In progesteronhaltigem Nähr-medium kultiviertes Endometrium hatnach 48 h einen signifikant höheren GDIals normales Endometrium (p < 0,05),dieser Unterschied ist jedoch im weite-ren Zeitverlauf nicht mehr nachweisbar.Hinsichtlich des GFI unterscheiden sichdie beiden Endometriumgruppen zukeinem Zeitpunkt der Beobachtung sig-nifikant voneinander. Beide Endometri-umgruppen unterscheiden sich jeweilssignifikant bzgl. des GDI und GFI vonder nativen CAM (p < 0,05).
Schlußfolgerungen: In Progesteronmedi-um kultiviertes Endometrium induziertvergleichbar mit normalem Endometri-um eine Angiogenese auf der CAM. DerGDI des Progesteron ausgesetzten En-dometriums steigt nach 48 h signifikantgegenüber normalem Endometrium an.Progesteron hat neben weiteren Fakto-ren einen Einfluß auf die Angiogenesevon Endometrium.
P20AUSWIRKUNGEN VON LEISTUNGSSPORT(SCHWIMMEN) AUF DIE SEXUALFUNKTIONBEI JUNGEN FRAUEN
B. Zietz1, S. Schnabel2, A. Schäffler2,J. Schölmerich2
1Abteilung für Innere Medizin II, Gold-berg-Klinik Kelheim GmbH, 2Klinik undPoliklinik für Innere Medizin I, Univer-sität Regensburg
Einleitung: Bei Leistungssportlerinnenist das Syndrom der „female athletetriad“ mit den Symptomen Eßstörungen,Zyklusstörungen und Osteoporose be-kannt.
Methoden: Bei 23 Leistungsschwimmer-innen (10–19 Jahre) untersuchten wirin 5 verschiedenen Trainingsphasen(Ruhe- [Ru], Ausdauer- [A], Sprint- [Sp]und Wettkampfphase [W]) vor und wäh-rend der Qualifikation für die Bayer-ischen Meisterschaften im Schwimmen17β-Estradiol (E), IGF-1, Cortisoltages-rhythmik im Speichel, Leptin und IL-6ermittelten die tägliche Kalorienauf-nahme und bestimmten die Körperzu-sammensetzung mittels Bioimpedanz-analyse.
Resultate: Bei mittlerem Menarchealtervon 12,3 Jahren hatten 7 Schwimmerin-nen noch keine Regelblutung. Von den16 Schwimmerinnen mit Menstruationnahmen 7 Kontrazeptiva ein, 7 gabenZyklusstörungen an. E nahm währendder A-, Sp- und W-Phase gegenüber Runicht signifikant ab (30,3 pg/ml [Ru],25,4 pg/ml [A], 25,5 pg/ml [Sp], 27,7 pg/ml [W]). Es fanden sich Korrelationenzwischen BMI und E (p = 0,044 [S]) unddem Fettanteil in der Nahrung und E(p = 0,034). E war positiv zu IGF-1 (p =0,003 [Sp]) und der Cortisolkonzentra-tion im Tagesprofil (p = 0,031 [S]) kor-reliert, nicht jedoch zu IL-6 und Leptin.
Schlußfolgerungen: Die Hormonsynthe-sevorgänge im Fettgewebe (insbesonde-re E) scheinen in der Genese des Über-lastungssyndroms beim Leistungssport-ler und der Genese von Zyklusstörun-gen beim „female athlete triad“ einenicht unwesentliche Rolle zu spielen.
S. Jaspers1, 3, B. Gellersen2, R. Kempf 2,A. Samaleco 2, M. Bergmann1, K. Steger3
1Institut für Veterinär-Anatomie, -Histo-logie und -Embryologie, UniversitätGießen, 2Endokrinologikum Hamburg,3Klinik für Urologie und Kinderurologie,Universität Gießen
Einleitung: Es ist bekannt, daß der Trans-kriptionsfaktor cAMP-responsive elementmodulator (CREM) eine essentielle Rollefür die Spermatogenese spielt. Durchalternative Promotorverwendung, alter-natives Spleißen, und alternative Trans-lationsinitiation entstehen bei der CREM-Genexpression funktionell unterschied-liche CREM-Proteine mit aktivierendemoder reprimierendem Potential auf dieZielgenexpression [1]. Kürzlich habenwir zwei neue Isoformen (CREM-θ2-F-G-H-Ib und CREM-θ2-G-H-Ib) in ver-schiedenen Keimzelltypen bei normalerund gestörter Spermatogenese beschrie-ben [2], bei denen das bekannte offeneLeseraster unterbrochen ist [3]. Ziel derUntersuchung war es, diese Isoformenunter dem Aspekt der Bindungsfähigkeitund einer Aktivator- bzw. Repressor-funktion näher zu charakterisieren.
Methoden: Im Westernblot wurdensowohl in vitro als auch in vivo vonhumaner Hoden-RNA (BD Biosciences)exprimierte Proteine der IsoformenCREM-θ2-F-G-H-Ib und CREM-θ2-G-H-Ibanalysiert. Eine sequenzspezifische DNA-Bindungsfähigkeit der in vitro translatier-ten Proteine wurde daraufhin mittelsGelshiftanalyse nach Inkubation miteiner fluoreszenzmarkierten CRE-Se-quenz überprüft. Weiterhin wurde dieSpezifität der Protein-DNA-Komplexedurch Kompetitionsexperimente und
Supershiftanalysen bestimmt. Die funk-tionelle Aktivität der Isoformen wurdein Transfektionsexperimenten unter Ver-wendung eines Luziferase-Reportergensgetestet.
Resultate: Während von der IsoformCREM-θ2-F-G-H-Ib ein Protein vollerLänge mit Translationsinitiation in Exonθ2 sowie eine kürzere Form exprimiertwurde, entstanden von der IsoformCREM-θ2-G-H-Ib Proteine erst ab ExonG. Translationsprodukte beider CREM-Isoformen wiesen eine sequenzspezifi-sche DNA-Bindungsfähigkeit auf. DieLuziferase-Reportergen-Analyse zeigte,daß die Proteinkinase-A-abhängige Sti-mulierung nach Co-Expression vonCREM-θ2-F-G-H-Ib nicht, aber vonCREM-θ2-G-H-Ib inhibiert wurde.
Schlußfolgerungen: Obwohl das be-kannte Leseraster bei den oben genann-ten Isoformen unterbrochen ist, wurdedurch die Nutzung eines zusätzlichenATGs in 5 Richtung zum bekanntenStartcodon ein Protein synthetisiert, dasan die DNA binden kann. Die Luzifera-se-Reportergen-Analyse wies auf einevorwiegende Repressorfunktion der vonIsoform CREM-θ2-F-G-H-Ib translatier-ten Proteine hin.
Literatur:1. Behr R, Weinbauer GF. cAMP response ele-ment modulator (CREM): an essential factorfor spermatogenesis in primates? Int J Androl2001; 24: 126–35.2. Blöcher S, Fink L, Bohle RM, Bergmann M,Steger K. CREM activator and repressor iso-form expression in human male germ cells.Int J Androl 2005; 28: 215–23.3. Gellersen B, Kempf R, Sandhowe R, Wein-bauer GF, Behr R. Novel leader exons of thecyclic adenosine 3’,5’-monophosphate re-sponse element modulator (CREM) gene, tran-scribed from promoters P3 and P4, are highlytestis-specific in primates. Mol Hum Reprod2002; 8: 965–76.
Molekulare Biomedizin
P22BEDEUTUNG DES WACHSTUMSHORMON-REZEPTORS BEI DER EMBRYOMATERNALENUND FETOMATERNALEN INTERAKTION
S. Kölle1, M. Gruhn2, M. Kowalewski 2,B. Hoffmann2, G. Schuler2
1Institut für Veterinär-Anatomie, -Histo-logie- und Embryologie und 2Klinik fürGeburtshilfe, Gynäkologie und Andro-logie der Groß- und Kleintiere, Universi-tät Gießen
Das Wachstumshormon (GH) beeinflußtZellwachstum und Zelldifferenzierungvor und nach der Geburt. Die Rolle vonGH für die frühe embryomaternaleKontaktaufnahme sowie für die Ausbil-dung der Karunkeln und Kotyledonenin der bovinen Plazenta ist bisher unge-klärt. Ziel der Studie war es daher, dieExpression der für den Wachstumshor-monrezeptor kodierenden mRNA imVerlauf der Trächtigkeit zu quantifizie-ren und die Translation des GHR-Pro-teins in den maternalen und fetalenAnteilen der Plazenta zu lokalisieren.Zu diesem Zweck wurden die Uterus-schleimhaut von 2,5; 3,5; 4,5 und 5,5Tage trächtigen Kühen sowie die Pla-zentome von Kühen mit einer Trächtig-keitsdauer von 80, 110, 120, 140, 150,160, 180, 220, 240 und 260 Tagen unddie Plazentome von Kühen unmittelbarvor und nach der Geburt untersucht.Die präpartale Phase 24–36 Stundenvor der Geburt wurde durch Analysedes Progesteronwertes bestimmt. Mittelsquantitativer Real-time-RT-PCR konntenwir zeigen, daß das GHR-Transkriptbereits 2,5 Tage p. c. im Endometriumsynthetisiert wird. Zu diesem Zeitpunktwird die für GHR kodierende mRNAauch in den Blastomeren des frühenEmbryos produziert. Im Endometriumist das GHR-Protein im Epithel, in denDrüsen und in der glatten Muskulaturder Gefäße lokalisiert. Nach Ausbildungder Plazenta steigt die Produktion derfür GHR kodierenden mRNA in denPlazentomen bis zum 180. Tag derTrächtigkeit an und bleibt dann zunächstkonstant. Das GHR-Protein wird zuBeginn der Trächtigkeit sowohl in denfetalen einkernigen Trophoblastzellenwie in den maternalen Karunkelepithel-zellen in gleichem Maße synthetisiert.
Die Riesenzellen sind stets GHR-nega-tiv. Mit zunehmender Trächtigkeitsdauerwird die GHR-Synthese zunehmendvon den fetalen Zellen übernommen.24–36 Stunden vor der Geburt steigt dierelative Genexpression von GHR in denPlazentomen um das Dreifache. Das Re-zeptorprotein wird zu diesem Zeitpunkt
fast ausschließlich vom fetalen Anteilder Plazenta produziert, das maternaleEpithel ist weitgehend zurückgebildet.
Unsere Ergebnisse weisen darauf hin,daß das Wachstumshormon bereits inden ersten Tagen des embryonalenLebens die Interaktion zwischen Kon-
zeptus und maternalem Epithel modu-liert. Während der gesamten Trächtig-keit ist GHR bei der Entwicklung derPlazentome involviert. Da die GHR-Genexpression präpartal deutlich an-steigt, ist davon auszugehen, daß GHauch an der Induktion des Geburtsvor-gangs beteiligt ist.
Die in unseren Webseiten publizierten Informationen richten sich ausschließlich an geprüfte und autorisierte medizinische Berufsgruppen und entbinden nicht von der ärztlichen Sorg-faltspflicht sowie von einer ausführlichen Patientenaufklärung über therapeutische Optionen und deren Wirkungen bzw. Nebenwirkungen. Die entsprechenden Angaben werden von den Autoren mit der größten Sorgfalt recherchiert und zusammengestellt. Die angegebenen Do-sierungen sind im Einzelfall anhand der Fachinformationen zu überprüfen. Weder die Autoren, noch die tragenden Gesellschaften noch der Verlag übernehmen irgendwelche Haftungsan-sprüche.
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