Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)Methode zur Bestimmung von Mischungsenthalpien und damitverbundenen thermodynamischen Größen (Diss. H. Heerklotz)
ITC-Einheit
Die Probenzelle und die identische Referenzzelle (münzenförmigesVolumen 1,4 mL) befinden sich in einer wärmeisolierten Hülle.Die Referenzzelle wird mit sehr geringer konstanter elektrischerLeistung geheizt (R.O.) und die Probenzelle wird gleichzeitig mit derLeistung CFB (0...418 µW) so geheizt, dass ihre Temperatur gleichder der Referenzzelle ist, d. h. dass stets ∆T1≈ 0 gilt. Eine Injektion, die in der Probenzelle zur Wärmeentwicklung führt, erzeugt einen abwärts gerichteten Peak im CFB-Signal. Ist der durchdie Injektion verursachte Prozess endotherm, zeigt der Peak nach oben.Die Temperatur der wärmeisolierten Hülle wird so geregelt, dass siedie Temperatur der Zellen besitzt (∆T2 ≈ 0 ). Die Regelung funktioniert nur, wenn der externe Thermostat bei höherer Temperaturarbeitet als die wärmeisolierte Hülle.
ITC-MessgrößeDas CFB-Signal des Kalorimeters wird durch definierte elektrischeHeizleistung der Referenzzelle kalibriert, so dass das über die Zeitintegrierte CFB-Signal einer Injektion genau der Mischungsenthalpiezwischen Zellinhalt vor der Injektion und dem Inhalt des injiziertenVolumens bei dem Druck p und der Temperatur T des Experiments entspricht:
),,(),,(),,(d)(CFB scsc0
TpNHTpNHTpNNHQtt −−+=∆≡∫∞
Enthalpie des Zellinhalts vorder InjektionEnthalpie der Mischung
von Zellinhalt und Injektion.Die Durchmischung wird durch Rührender Injektionsnadel unterstützt, deren Spitze eine Rührschaufel ist.
Enthalpie desInjektions-volumens
Das Volumen einer Injektion (Vs , hier 1...30 µL) ist immer klein gegenüber dem Volumen der Probenzelle (Vc , hier 1,345 mL), ebenso wie die Zahl Ns der injizierten Mol(ekül)e klein ist gegenüber der Zahl Nc der Mol(ekül)e in der Zelle vor der Injektion. Die Detektions-Empfindlichkeit liegt bei ca. 0,2 µJ/s.
Aus den primären Messdaten ∆Q (p,T,Nc) können dann wichtigethermodynamische Parameter der bei den Injektionen ablaufendenReaktionen (Aggregationen, chemische Bindungen, Phasenumwandlungen) ermittelt werden wie z. B. Bindungskon-stanten, kritische Konzentrationen, Umwandlungsenthalpien und-entropien.
Thermodynamische GrundlagenExtensivität und Partielle molare GrößenWir betrachten ein makroskopisches System bestehend aus Φunterschiedlichen Phasen ϕ = 1,2,..., Φ, wobei sich in der Phase ϕ von der Substanz (= ‚Komponente‘) κ die Menge N κ ϕ (Molzahl) befindet.Für eine extensive Größe H (gekennzeichnet durch unterstrichenes Symbol) dieses Systems bei gegebenem Druck p und gegebener Temperatur T gilt dann mit der beliebigen positive Zahl α die Gleichung
),,(),,( κκ TpNHTpNH ϕϕ αα =
Bildet man die Ableitung nach α an der Stelle α = 1, so erhält man
),,(),,(),,(
κκ'κ
κκκ ,,κ
κκ
'κ'
TpNHTpxHNN
TpNHN
TpN
ϕϕϕ
ϕϕϕ ϕ
ϕϕ
ϕ
=≡
∂∂
∑∑
Die durch Überstreichen gekennzeichneten partiellen molaren Größen
TpNN
TpNHTpxH
,,κ
κκκ
'κ'
),,(),,(
ϕϕ
ϕϕϕ
∂∂
≡
hängen nur noch von den Molenbrüchen
∑=≡
κ'κ'
κκκ
ϕ
ϕ
ϕ
ϕϕ N
NNN
x
der Komponenten in der jeweiligen Phase ab.
Gibbs-Duhem-GleichungDa eine extensive Größe eine homogene Funktion erster Ordnungin den Stoffmengen ist,
),,(),,( κ'κ
κκκ TpxHNTpNH ϕϕ
ϕϕϕ ∑=
folgt0
κ ,,'κ'κ
'κ'
≡
∂∂∑
ϕ ϕ
κϕϕ
ϕ TpNNHN Gibbs-Duhem-Gleichung
Wir beweisen diese Gleichung durch Nachrechnen:
∑ ∑ ∑
∑ ∑ ∑∑ ∑
∑ ∑∑ ∑
∑∑∑
≡
∂∂−
∂∂
=
∂∂−
∂∂=
−
∂∂=
=
−
∂∂=
∂∂
∂∂=
=
∂∂=
∂∂∂=
∂∂
ϕ κϕϕκ
κ ϕ
ϕκϕ
ϕ
ϕκϕ
ϕ κϕ ϕ
ϕκ
κ ϕ
ϕκϕ
ϕϕ
ϕκϕ
ϕ ϕ
ϕκ
ϕ
κκ
κ ϕ
ϕκϕ
ϕ ϕ
ϕκ
ϕ
κκ
ϕκϕϕ
ϕ
ϕκϕ
ϕ ϕκ κϕ
ϕ
ϕ
ϕκϕ
ϕ ϕ
ϕκϕ
ϕ ϕϕϕ
ϕ ϕ
κϕϕ
ϕϕϕ
κ''
'' 'κ'
'κ
κ
'κ
κ
''
'' 'κ'
'κ
κ
'κ
κ2''''
'' 'κ'
'κ
κ2
'
'''
'
''
''''
''κ'
''κ
κ '''
''κ'
''κ'
''κ
κ ,,κ
''κ
κ ,,'κ'κ
2
κκ ,,'κ'
κ
0
1δ
δδ
'''κ''''κ''''κ'
xxHx
xHx
Nx
xHN
NxHN
N
NNx
HN
N
NNx
HNNx
xHN
NHN
NNHN
NHN
TpNTpNTpN
mit
∑
∑=
≡
≡
κϕ
κϕϕ
ϕ
ϕϕ
1κ
κ
κκ
x
NN
NN
x
Beispiel: Vollständige Mischbarkeit in einer binären PhaseZwei Substanzen (z. B.‘1‘ = H2O und ‚2‘ = D2O) in einer flüssigenPhase:
Gesamtanzahl der Mole
xNNx
xNNx
NNN
−==
≡=
+=
122
11
21
Molenbrüche der Komponenten 1 und 2 in der Mischung
Enthalpie der Mischung)()()(),( 221121 xHNxHNxHNNNH ⋅=+=
)()1()()( 21 xHxxHxxH −+= Molare Enthalpie der binären Mischung
Die Ableitung der molaren Enthalpie nach dem Molenbruch x ergibt
)()(d
)(d21 xHxH
xxH −= 0
d)(d)1(
d)(d 21 ≡−+
xxHx
xxHxdenn
Kennt man H(x), dann kann man auf einfache Weise die partiellen molaren Enthalpien ermitteln:
Geometrisch:Analytisch:
xxHxxHxH
xxHxxHxH
d)(d)()(
d)(d)1()()(
2
1
−=
−+=
0 1x
)(2 xH
)(1 xHH(x)
x
Welches ITC-Signal ∆Q(x,xs) misst man, wenn sich in der Probenzelle die Mischung beim Molenbruch x befindet und man dazu mit der Spritze eine Mischung mit dem Molenbruch xs dazu titriert? Die sich auf die Spritze beziehenden Größen erhalten den Index s.
s
s1s2s1ss N
NxNNN =+=
)()()'()(),( sss xHNxNHxHNNxxQ s−−+=∆
δ⋅−+=+
++
=++= )(' s
s
ss
ss
1s1 xxxNN
NxNN
NxNNNNx Molenbruch in der Zelle
nach der Mischung
mit der infinitesimalen Größe 1s
s <<+
≡NN
Nδ
Daher gilt
( )δd
)(d)()'( s xxxxHxHxH −⋅+≈ und man erhält
−⋅−+≈
≈−−
⋅−++≈∆
)(d
)(d)()(
)()(d
)(dδ)()()(),(
sss
ssss
xHxxHxxxHN
xHNxNHxxHxxxHNNxxQ s
Die auf die Anzahl der injizierten Mole bezogene ITC-Wärme ist damit
)(d
)(d)()(),(),( sss
ss xH
xxHxxxH
NxxQxxq −⋅−+≈∆≡ (1)
Drückt man die molare Enthalpie durch ihre partiellen molaren Bestandteile aus, so ergibt sich
( ) )()1()()()()()()1()(),( s2ss1s21s21s xHxxHxxHxHxxxHxxHxxxq −−−−⋅−+−+≈
( ) ( ))()()1()()(),( s22ss11ss xHxHxxHxHxxxq −⋅−+−≈ (2)
Aus Gl. (1) erkennt man, dass mit Hilfe von ITC die molare Enthalpieeiner binären Mischung mit Ausnahme des Funktionswerts selbst und des Werts der ersten Ableitung nach dem Molenbruch x bestimmt werden kann:
∑∞
=
⋅−−=−⋅−+≈2k
k
(k)ks
sss d)(d
!k)()(
d)(d)()(),(
xxHxxxH
xxHxxxHxxq (1a)
Aus Gl. (2) sieht man, dass für xs = 0 oder 1 (in diesen Fällen titriert man die reine Komponente 2 oder die reine Komponente 1zur Mischung beim Molenbruch x) die normierte ITC-Wärme die Differenz zwischen der partiellen molaren Enthalpie der Komponente beim Molenbruch x und der molaren Enthalpie derreinen Komponente ist:
)1()()()1,(
)0()()()0,(
111s
222s
HxHxqxxq
HxHxqxxq
−≈≡=
−≈≡= (2a)
Man führt daher zweckmäßigerweise die molare Exzessenthalpie alsDifferenz zwischen der molaren Enthalpie der realen Mischungund der molaren Enthalpie bei idealer Mischung ein:
[ ] [ ])()1()(
)0()()1()1()()(
2exc1exc
21exc
xHxxHx
HxHxHxHxxH
−+=
=−−+−≡
Daher ist die bei Titration der reinen Komponente 2 gemessenenormierte ITC-Wärme gerade die Partielle molare Exzessenthalpiedieser Komponente.
)()(
)()(
exc11
2exc2
xHxq
xHxq
≈
≈(2b)
Bei einer idealen Mischung verschwindet die Exzessenthalpie und damit auch die Mischungswärme.
Thermodynamische Konsistenzbedingung für ITC-Wärmen
Da die ITC-Wärmen q1(x) und q2(x) partielle molare Exzessenthalpiendarstellen, sind sie nicht unabhängig voneinander. Es gilt die Gibbs-Duhem-Gleichung
0d
)(d)1(d
)(d 21 ≡−+xxqx
xxqx
woraus man die folgenden Beziehungen herleiten kann:
( )∫∫
∫∫
−+
−−=
−−=
+−−=−−=
xxx
x
qxqx
xqxq
qxqx
xqxq
02
11
1
02
1
22
22
11
d1
)()(1
dd
)(d1
)(
d)()(1dd
)(d1)(
ξξξξ
ξξ
ξξ
ξξξξ
ξξ
ξξ
Weiterhin gilt
0d)(d)(dd
)(d)1(dd
)(d 1
02
1
01
1
0
21
0
1 ≡+−=−+ ∫∫∫∫ ξξξξξξξξξ
ξξξ qqqq
d. h. dass die Flächen unter den beiden Kurven q1(x) und q2(x) gleich seinmüssen, wenn die Messung fehlerfrei durchgeführt wurde.
Man kann demnach aus der Messung der Größe q1(x) die Größeq2(x) berechnen und umgekehrt. Die thermodynamische Konsistenzder gemessenen Daten kann mit Hilfe dieser Gleichungen überprüftwerden.
Bei der Herleitung der obigen Gleichungen wurde berücksichtigt,dass gilt 0)0()1( 21 == qqweil die Titration zweier gleicher Substanzen keinen Wärmeeffekt ergibt.
Binäre Reguläre Lösung
Der einfachste nichttriviale Ansatz für die molare Exzessenthalpie ist
mit der Konstanten h0)1()( 0exc xxhxH −=
Im Ansatz wurde berücksichtigt, dass die Exzessenthalpie für diereinen Substanzen verschwindet.
0exc )21(d
)(d hxx
xH −=Man erhält dann mit für die ITC-Wärmen:
( )
02exc
excexc22
02exc
excexc11
d)(d)()()(
1d
)(d)1()()()(
hxx
xHxxHxHxq
hxx
xHxxHxHxq
=−==
−=−+==
Allgemein gilt für die reguläre Mischung
02
ss )(),( hxxxxq −= (s. Gl. (1))
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0Reguläre Lösung
h0=1 kJ/mol q2(x)q1(x)
Hexc(x)
kJ/m
ol
x
Bemerkung: In einer regulären Lösung verschwindet die Mischungsentropie
Quasibinäre Lösungen
Wir betrachten Substanzen, die in wässriger Lösung Aggregate (Vesikel, Mizellen) bilden. Bei genügend hoher Aggregatkonzentration (≈ mM) vernachlässigt man die in der Lösung noch vorhandenen Monomere (CMC ≈ µM). Mischt man zwei dieser Substanzen, dann erfolgt die Mischung in denAggegaten. Man spricht von quasibinären Mischungen, und ignoriert den Einflussdes im Überschuss vorliegenden Wassers auf die Mischung der beiden Komponentenin den Aggregaten.Beispiel:C12E3+POPC, H.Heerklotz et al. J. Phys. Chem. B102 5363 (1998)
ITC-Rohdaten
Experimentelle undgefittete Exzess-enthalpien
ITC-Experiment:10µL-Injektionen einer39 mM C12E3-Vesikel-dispersion titriert zu einer2,45 mM POPC-Vesikel-dispersion.
TD-Konsistenz der Messdaten
Datenfit mit Ansatz
[ ]...)1()( 33
2210E ++++⋅−= xhxhxhhxxxH
Koeffizienten hm mit Information über kooperative WW im Mischvesikel
Phasenumwandlung in quasibinären MischungenBeispiel: D=C12E7 (Mizellen)+L=POPC(Vesikel)
Zwei-pha-sen-Be-reich
Injektion von POPC-Vesikelnzu Mischung mit Molenbruch
LD
D
NNNx+
=
Injektion von C12E7-Mizellen
TD-konsistente Gesamt-Exzess-Enthalpie der Mischung kann zerlegt werden in Exzessenthalpiender Mischphasen (Mischvesikel,Mischmizellen)
Misch-Vesikel
Misch-Mizellen
ITC solubilization protocolMicelles are injected into vesicle suspension. Heerklotz et al. (1995)
Chem. Phys. Lett. 235, 517
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0
1
2
3 k
cal/m
ol
X
ITC reconstitution protocolVesicles are injected into micelles. Heerklotz et al. (1996) J. Phys.
Chem. 100, 6764
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
0
1
2
3δh
/δn L
0 (k
cal/m
ol)
Xb
ITC PartitionierungsprotokollLipidvesikel werden in eine Ligandenlösung injiziert.Aus der Lösung nehmen sie solange Liganden auf, bis Gleich-gewicht herrscht. Aus ITC-Messungen kann der Verteilungs-koeffizient des Liganden bestimmt werden.
60 1200.0
0.7
1.4
Zeit (min)
(µca
l/sec
)
Verteilung von C10E7 als Monomer im Puffer und eingebaut in 100 nm-POPC-Vesikel Heerklotz/Seelig BBA(2000)
Fits zweier experimentellerTitrationskurven. Fitresultat:K=770 M-1
kcal/mol5,6bwD =∆ →H
10 mM POPC titriert zu150 µM C10E7, beide im gleichen Puffer
Aufsummierte ITC-Wärmender ITC-Peaks von A
Berechnete Konzentrationdes gebundenen C10E7
CMC(C10E7) ≈ 850 µM
Puffer:100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH = 7,4
L0
L0D0cell
i
1k
bwDk
L0
L0D0bD,
fD,
L0
bD,
fD,bD,D0
1δ
1
KCKCCVHh
KCKCCC
CC
C
KCCC
+∆=
+=→≡+=
∑=
→
ITC DemizellisierungsprotokollMizellen werden in einen Puffer injiziert
0 60 12012.0
12.5
13.0
13.5
14.0
14.5
15.0
T ime (m in)
µcal
/sec
CMC
Praktikumsversuch„Thermodynamik der Mizellbildung“
M5,55CMC
ln
c
c
≈
=∆−∆=∆
X
XRTSTHG Änderung der molaren freien Enthalpie bei derSelbstaggregation .
Demizellisierungsexperiment
ITC-Signale bei Injektion vonC12E8-Mizellen in Wasser
Integrierte ITC-Signale liefernDemizellisierungsenthalpie∆H
Genauere Lokalisierungdes CMC-Bereichs: HierCMC = 90+/-20 µM
Heerklotz/Seelig BBA (2000)
Bestimmung der CMC am Beispiel des Detergenten C12E8
2,5 mM C12E8-Lösung in Wasser wird in reines Wasser injiziert.
1 10 100-10
-8
-6
-4
-2
0
2
δh/δ
n su
(kca
l/mol
)
CSu (µM)
Der Anstieg von ∆Hüber der Temperaturliefert ∆Cp, die Änderung der molaren Wärmekapazitätbei Demizellisierung
0 0 4
10
CM
C/µ
M
T (°C)
0
2
4
6
8
10
5
20
∆H(k
cal/m
ol)
10 20 3 0 50
Thermodynamik der Selbstaggregation
Gleichheit der chemischen Potentiale der Teilchen in den unterschiedlich großen Aggregaten
...3
ln32
ln2
ln 303
2021
01 =+=+=+ XkTXkTXkT µµµ
Annahme einer idealen Lösung von N-Aggregaten
XM ist der Molenbruch der M-Aggregate multipliziert mit M
Annahme, dass Aggregate der Aggreationszahl N>>1 dominieren
−−=
+=+
N01
0NN
1N
N0N1
01
expN
2ln
2ln
kTXX
XkTXkT
µµ
µµ
Bei der kritischen Mizellkonzentration soll gelten
1Nc XXX == woraus folgt
−≈
−−
=
−
kT
kTX
01
0N
1N1
N01
0N
c expN
expµµ
µµ
d. h.
001
0NAc )(ln GNXRT ∆≡−= µµ
Thermodynamische Konsistenz der Demizellisierungsdaten
Es gilt die Gibbs-Helmholtz-Gleichung
TTG
TTGTGSTGH
∂
∆∂−=
∂∆∂−∆=∆+∆=∆
0
20
0000
Wegen
)(ln c0 TXRTG =∆
muss gelten
TTX
TXRT
TRTG
RTHd
)(d)(
1 c
c
2
0
20 −=∂
∆∂−=∆ (1)
THC p d
d∆=∆Ist die Änderung der molaren Wärmekapazität
unabhängig von der Temperatur, dann kann Gl. (1) integriertwerden zu
−
∆−∆
=
∆
TTRTCTH
TTTXTX pR
C p
11)(exp)()(
0
00
00cc
Die Abhängigkeit der CMC Xc(T) von der Temperatur kann unabhängig von ∆H(T) gemessen werden.