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BIOspektrum | 06.13 | 19. Jahrgang

GUNNAR HUEP, NILS KLEINBÖLTING, INGO APPELHAGEN, PRISCA VIEHÖVER,

BERND WEISSHAAR

UNIVERSITÄT BIELEFELD, CEBITEC UND FAKULTÄT FÜR BIOLOGIE

Organisms with defect genes are important tools in biological research.They allow the analysis of gene functions, given that they display charac-teristics (phenotypes) that differ from that of „normal“ (wild type) orga-nisms. Defects in plant genes or knockout plants are often generated byusing T-DNA insertional mutagenesis. Large collections of T-DNA mutants– like the GABI-Kat collection for the model plant Arabidopsis thaliana –serve basic plant research since more than ten years.

DOI: 10.1007/s12268-013-0367-0© Springer-Verlag 2013

Reverse Genetikó In der biologischen Forschung dienenrevers-genetische Ansätze der Funktionsauf-klärung von Genen. Bei reverser Genetik wer-den die phänotypischen Auswirkungen desAusfalls ausgewählter Gene untersucht. Diesstellt den umgekehrten Weg dar, der bei klas-sischer Vorwärtsgenetik erfolgt: Ausgehendvon einer Mutante und deren Phänotypenwerden die verursachenden Gene identifi-ziert. Als Voraussetzung für reverse Genetikdienen Knock-out-Mutanten, die für Bakte-rien und viele tierische Organismen gezieltmithilfe von homologer Rekombination imausgewählten Gen generiert werden können.Da in höheren Pflanzen homologe Rekombi-nation als Werkzeug für die gezielte Mutage-nese in der Regel nicht zur Verfügung steht,bedarf es in diesem Feld anderer Methoden.

Agrobakterien als genetischesWerkzeugDas als Pflanzenpathogen erkannte Boden-bakterium Agrobacterium tumefaciens, wel-ches dikotyledone Pflanzen befallen kann, istdas Hilfsmittel der Wahl für die Insertions-mutagenese. A. tumefaciens ist natürlicher-weise für die Bildung von Wurzelhals-Gallen,die tumorartigen Wucherungen gleichen, ver-antwortlich [1]. Der Mechanismus der Gal-lenbildung wurde bereits in den frühen

1980er-Jahren durch die Entdeckung derTransfer-DNA (T-DNA) aufgeklärt [2]. Die T-DNA wird von A. tumefaciens in das Pflan-zengenom übertragen. Sie programmiert dortden Pflanzenstoffwechsel so um, dass diePflanzenzellen ungebremst spezielle Nähr-stoffe produzieren, die nur von den Agrobak-terien aufgenommen und genutzt werdenkönnen.

Die T-DNA befindet sich in Agrobakterienauf dem Ti-Plasmid (Ti für Tumor-induzie-rend). Sie enthält natürlicherweise die Gene,die für die Tumorinduktion und die Umpro-grammierung des Pflanzenstoffwechsels nötigsind. Die Fähigkeit von Agrobakterien, T-DNAin das Pflanzengenom zu integrieren, ist

jedoch völlig unabhängig vom Vorhandenseindieser Gene. Für die Übertragbarkeit derT-DNA sind hauptsächlich zwei Sequenzennotwendig, die als left border (LB) und rightborder (RB) bezeichnet werden und an denEnden der T-DNA liegen. Es ist möglich, dieSequenzabschnitte, die zwischen LB- undRB-Sequenz liegen und für die Tumorinduk-tion und Umprogrammierung des Stoffwech-sels notwendig sind, durch maßgeschneider-te andere Sequenzen zu ersetzen [2]. Auf die-se Weise können Agrobakterien durch modi-fizierte T-DNAs auf ihren Ti-Plasmidengenutzt werden, um gezielt transgene Pflan-zen zu produzieren bzw. um Pflanzen zutransformieren.

T-DNA-InsertionslinienDie Transformation kann genutzt werden, umGene in das Pflanzengenom einzubringen,die dort normalerweise nicht vorhanden sind.Auf diese Weise entstehen Pflanzen mit neu-en Eigenschaften, die durch die Sequenzab-schnitte bedingt sind, die zwischen LB- undRB-Sequenz in die T-DNA eingesetzt wordensind. T-DNA-Insertionen weisen aber eine wei-tere Eigenschaft auf, die ausgenutzt werdenkann, um Knock-out-Mutanten zu generieren.Die Insertion von T-DNAs im Pflanzengenomerfolgt weitgehend ungerichtet an zufälligenStellen. Wenn ein T-DNA-Insertionsort imLeseraster eines Gens liegt, werden die ent-sprechenden Genfunktionen in der Regel aus-

Arabidopsis thaliana

Insertionslinien als Werkzeuge fürfunktionelle Genomforschung

˘ Abb. 1: Aufbewah-rung von Arabidopsisthaliana-Samen derGABI-Kat-Kollektion.Diese umfasst über90.000 verschiedeneT-DNA-Insertionsli-nien, die eine Quellefür Knock-out-Mutan-ten in A. thalianasind. Die Lagerungder Samen erfolgtunter kontrolliertenBedingungen sortiertin Papiertüten.

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geschaltet. Dadurch ist es möglich, große Kol-lektionen von Pflanzenlinien zu erstellen, dieKnock-out-Mutanten für den größten Teil derGene einer Pflanze abdecken (Abb. 1, [3–5]).

Da die T-DNA-Insertionspositionen in ver-schiedenen Linien zufällig im Genom verteiltsind, ist es notwendig, diese Insertionsposi-tionen für jede einzelne Linie zu bestimmen,

um die Gesamtkollektion im Sinne der rever-sen Genetik nutzen zu können.

Die Arabidopsis thaliana-Insertions -linienpopulation GABI-KatIn Pflanzen, deren Genom sequenziert ist,kann eine Insertionspositionsvorhersage überflanking sequence tags (FSTs) erfolgen [6]. Daserste sequenzierte Pflanzengenom ist das derModellpflanze Arabidopsis thaliana (Acker-schmalwand) [7]. Die Sequenz liegt seit demJahr 2000 vor, und das Genom beinhaltet nachaktueller Genvorhersage 27.206 Protein-codie-rende Gene auf der Zellkern-DNA. FSTs lassensich durch eine PCR-basierte Methode, aus-gehend von genomischer DNA (gDNA), gene-rieren (Abb. 2A). Bei diesem Verfahren wirdgDNA zunächst mit einem Restriktionsenzymverdaut; an schließend werden synthetischhergestellte Adapter an die Enden der DNA-Fragmente ligiert. Da die Adaptersequenzsowie die Sequenz inserierter T-DNA bekanntist, können mittels PCR DNA-Fragmenteamplifiziert werden, die einen Teil T-DNA-Sequenz und einen angrenzenden Teil gDNA-Sequenz enthalten, der direkt benachbart zurT-DNA im Genom der transformierten Pflan-ze liegt. Durch Sequenzierung der PCR-Frag-mente und Abgleich mit der bekanntenGenomsequenz können anhand dieser DatenInsertionspositionsvorhersagen gemacht wer-den.

Die GABI-Kat-Kollektion (www.gabi-kat.de)ist – wie die SALK-Kollektion aus den USA[9] – eine FST-basierte T-DNA-Insertionsli-nienpopulation in A. thaliana [8]. Sie bein-haltet 89.746 unabhängige Linien, für dieFSTs generiert wurden. Für insgesamt 19.438der 27.206 Protein-codierenden Gene inA. thaliana finden sich potenzielle Inser-tionslinien in der GABI-Kat-Kollektion. Infor-mationen zu den vorhandenen Linien werdenin einer Datenbank gespeichert, deren Nut-zerinterface SimpleSearch im Internet ver-fügbar ist (Abb. 2B).

Anwendung von GABI-Kat-Linien amBeispiel des FlavonoidmetabolismusKnock-out-Linien können für funktionelleAnalysen kompletter Stoffwechselwege ein-gesetzt werden. Wenn Gene ausgeschaltetwerden, die für Enzyme codieren, welche amBeginn eines Stoffwechselweges liegen, kanndies Auswirkungen auf alle später normaler-weise im Stoffwechselweg auftretenden Meta-bolite haben.

Ein in Pflanzen inzwischen gut untersuch-ter Stoffwechselweg ist die Flavonoid-Bio-

˚ Abb. 2: Aufbau der flanking sequence tag(FST)-basierten Insertionslinienkollektion GABI-Kat.A, schematische Darstellung der PCR-basierten Methode zur Generierung von FST. B, Die FST-Sequenzen werden in eine Datenbank importiert, die für externe Nutzer über die Internetseitewww.gabi-kat.de abgerufen werden können. Passende GABI-Kat-Linien werden mit Einzelheitenzur Insertionspositionsvorhersage und weiteren experimentellen Daten für das gewünschte Genangezeigt.

A B

˚ Abb. 3: Arabidopsis thaliana-Mutanten mit veränderter Pigmentierung der Samenschale. A,Übersicht des Flavonoidstoffwechsels bis zu den kondensierten Tanninen, die der Samenschale(Testa) eine charakteristische Braunfärbung verleihen. Rot markiert sind die Mutanten von Enzy-men und Transportproteinen, deren Funktionsverlust zu einem transparent testa(tt)-Phänotypführt. B, braune Samen von A. thaliana-Wildtyppflanzen (WT) sowie von gelb bis hellbraunentt-Knock-out-Mutanten der in A gezeigten Schritte sowie von regulatorischen Genen.

A B

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synthese (Abb. 3A, [10]). Flavonoide sindsekundäre Pflanzenstoffe, die in vielenPflanzen für die Farbe von Blüten, Früch-ten und Samen verantwortlich sind. Unter-gruppen der Flavonoide sind unter ande-rem Flavonole, Anthocyane und Proan-thocyanidine (kondensierte Tannine). Fla-vonole absorbieren Licht im UV-Spektrumund können Pflanzen dazu dienen, ihreZellen vor Schäden durch UV-Strahlungzu bewahren. Anthocyane rufen in Blütenund Früchten eine rote, violette bis blau-schwarze Färbung hervor, die bestäuben-de Insekten anzieht. Oxidierte Proantho-cyanidine weisen eine braune Färbung aufund akkumulieren in der Samenschale vie-ler Pflanzen. Sie dienen dort unter ande-rem dazu, den Samen vor Herbivoren undPathogenen zu schützen.

Gene, die im Flavonoidmetabolismusvon A. thaliana eine Rolle spielen, wurdenschon früh über eine hellere Samenfarbein entsprechenden Mutanten erkannt.Wenn entscheidende Gene für den Flavo-noidmetabolismus ausgeschaltet sind, kön-nen keine Proanthocyanidine mehr gebil-det werden und die Samenschale wirdtransparent, was zu einem gelben bis hell-braunen Erscheinungsbild der Samenführt (transparent testa/ tt-Phänotyp) [11].In Abbildung 3B ist dies anhand von GABI-Kat-Linien veranschaulicht. VerschiedeneT-DNA-Insertionslinien von tt-Genen, dienicht nur einen Samenschalen-Phänotypaufweisen, sondern auch in der Anthocy-an- und Flavonol-Biosynthese Ver än de -rungen zeigen, konnten zur Aufklärungdes Flavonoid-Stoffwechselweges beitra-gen [12].

Der Musterfall „Flavonoidmetabolismus“veranschaulicht die prominente Rolle vonT-DNA-Insertionslinien-Populationen inder funktionellen Genomforschung, dieein nicht zu ersetzendes Hilfsmittel in denmolekularen Pflanzenwissenschaften sind.

DanksagungDas Projekt GABI-Kat wird über den Pro-jektträger Jülich (PtJ) vom BMBF gefördert(Pkz 0313855), wofür wir uns auch imNamen unserer vielen Tausend nationa-len und internationalen Nutzer bedankenmöchten. Weiterhin bedanken wir uns beiallen ehemaligen Mitarbeitern des Pro-jekts sowie bei Eliane Quittschau, HeleneSchellenberg und Andrea Voigt für dietechnische Unterstützung. ó

Literatur[1] Van Larebeke N, Engler G, Holsters M et al. (1974)Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential forcrown gall-inducing ability. Nature 252:169–170[2] Hernalsteens J, Van Vliet F, De Beuckeleer M et al.(1980) The Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid as ahost vector system for introducing foreign DNA in plantcells. Nature 287:654–656[3] Azpiroz-Leehan R, Feldmann KA (1997) T-DNA inser-tion mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth.Trends Genet 13:152–156[4] Rios G, Lossow A, Hertel B et al. (2002) Rapid identifi-cation of Arabidopsis insertion mutants by non-radioacti-ve detection of T-DNA tagged genes. Plant J 32:243–253[5] Sessions A, Burke E, Presting G et al. (2002) A high-throughput Arabidopsis reverse genetics system.Plant Cell 14:2985–2994[6] Strizhov N, Li Y, Rosso MG et al. (2003) High-through-put generation of sequence indexes from T-DNA mutage-nized Arabidopsis thaliana lines. Biotechniques 35:1164–1168[7] Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of thegenome sequence of the flowering plant Arabidopsis thali-ana. Nature 408:796–815[8] Kleinboelting N, Huep G, Kloetgen A et al. (2012)GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsisthaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Res 40:D1211–1215[9] Alonso JM, Stepanova AN, Leisse TJ et al. (2003)Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis tha-liana. Science 301:653–657[10] Harborne JB, Williams CA (2000) Advances in flavo-noid research since 1992. Phytochemistry 55:481–504[11] Koornneef M (1990) Mutations affecting the testacolour in Arabidopsis. Arabidopsis Info Serv 27:1–4[12] Appelhagen I, Jahns O, Bartelniewoehner L et al.(2011) Leucoanthocyanidin dioxygenase in Arabidopsisthaliana: characterization of mutant alleles and regula-tion by MYB-BHLH-TTG1 transcription factor complexes.Gene 484:61–68

Korrespondenzadresse:Prof. Dr. Bernd WeisshaarUniversität BielefeldFakultät für BiologieLehrstuhl für GenomforschungD-33594 BielefeldTel.: 0521-106-8720Fax: 0521-106-6423genomforschung@uni-bielefeld.dewww.gabi-kat.de

AUTOREN

Das GABI-Kat-Team des Lehrstuhls für Ge-nomforschung wird von Bernd Weisshaar(links) geleitet. Wissenschaftliche Mitarbeitersind Ingo Appelhagen, Gunnar Huep, NilsKleinbölting und Prisca Viehöver (von links).Das Projekt GABI-Kat wurde 1999 von BerndWeisshaar am Max-Planck-Institut für Züch-tungsforschung initiiert und wird seit 2007an der Universität Bielefeld weitergeführt.