Immunglobulin A in humaner Gallenblasengalle und
sein Einfluß auf die Cholesterinkristallisation
Von der Medizinischen Fakultät der
Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Medizin genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Stefan Südfeld
aus
Werne an der Lippe
Berichter: Universitätsprofessor Dr. med. Dipl.-Biochem. S. Matern
Universitätsprofessor Dr. med. F. Lammert
Tag der mündlichen Prüfung: 11. Mai 2005
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
Inhalt
1 Einleitung.................................................................................................................. 1
2 Material und Methoden............................................................................................. 7
2.1 Gallenblasengalle.............................................................................................. 7
2.2 Immunglobulin A-Gewinnung.......................................................................... 8
2.2.1 Zentrifugation der Gallenblasengalle............................................... 8
2.2.2 ConA-Sepharose-Affinitätschromatographie ................................... 8
2.2.3 IgA-Immunaffinitätschromatographie ............................................. 9
2.3 Methoden zur Messung der Konzentration von Proteinen............................. 11
2.3.1 Radiale Immunodiffusion (RID) .................................................... 11
2.3.2 ELISA............................................................................................. 12
2.3.2.1 Spezifität.................................................................................... 14
2.3.2.2 Reproduzierbarkeit .................................................................... 15
2.3.2.3 ELISA für Immunglobulin G .................................................... 15
2.4 Vergleich von kolostralem und biliärem Immunglobulin A........................... 15
2.4.1 Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation................................... 15
2.4.2 Kristall-ELISA............................................................................... 16
2.4.2.1 Reproduzierbarkeit .................................................................... 18
2.4.2.2 Vergleich der Kristallbindung verschiedener Arten von IgA.... 18
2.4.2.3 Vergleich der Kristallbindung von IgA und IgG...................... 18
2.4.3 Cholesterinkristallisationstest......................................................... 18
2.5 Optische Darstellung der IgA-Kristallbindung............................................... 21
2.5.1 Herstellung der Cholsterinkristalle................................................. 21
2.5.2 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)................................ 22
2.5.3 Fluoreszenzmikroskopie................................................................. 22
2.6 Ergänzende Methoden.................................................................................... 23
2.6.1 Proteinbestimmung......................................................................... 23
2.6.2 Qualitatives Gel.............................................................................. 23
3 Ergebnisse ............................................................................................................... 25
3.1 Gallenblasengallen.......................................................................................... 25
3.1.1 Testung der Gallenblasengallen auf Verunreinigung mit Blut....... 25
3.2 Immunglobulin A-Gewinnung........................................................................ 26
3.2.1 IgA-Immunaffinitätschromatographie ........................................... 26
Inhalt
3.3 Bestimmung der IgA-Konzentration in humaner Gallenblasengalle..............28
3.3.1 RID.................................................................................................29
3.3.2 ELISA.............................................................................................29
3.4 Vergleich von kolostralem und biliärem IgA.................................................30
3.4.1 Saccharose Dichtegradientenzentrifugation...................................31
3.4.2 Kristall-ELISA...............................................................................31
3.4.3 Cholesterinkristallisationstest.........................................................33
3.5 Optische Darstellung der IgA-Kristallbindung...............................................35
3.5.1 TEM................................................................................................35
3.5.2 Fluoreszenzmikroskopie .................................................................36
4 Diskussion...............................................................................................................39
5 Zusammenfassung...................................................................................................43
6 Abkürzungsverzeichnis ...........................................................................................45
7 Literaturverzeichnis.................................................................................................47
1 Einleitung 1
1 Einleitung
Die symptomatische Cholecystolithiasis ist eine häufige Erkrankung. Sie stellt für den
Einzelnen und aufgrund ihrer hohen Inzidenz auch gesundheitsökonomisch ein
bedeutendes Ereignis dar. Derzeit ist jeder 13. Einwohner in Deutschland
asymptomatischer Gallenblasensteinträger1. Es zeigt sich ein deutlicher Anstieg der
Steinprävalenz mit dem Lebensalter1. Da die Lebenserwartung steigt, erhöht sich das
individuelle Risiko, Gallenblasensteinträger zu sein und Komplikationen zu erleiden.
Hierzu zählen eine mechanische Verlegung und eine Entzündung der Gallenwege.
20 - 40% der Patienten entwickeln im Verlauf Komplikationen und müssen medizinisch
behandelt werden. Patienten die im Rahmen einer symptomatischen aber
unkomplizierten Cholecystolithiasis ärztlich vorstellig werden, können sowohl operativ
als auch nicht-chirurgisch behandelt werden. Dabei ist neben dem Versuch der
medikamentösen Steinauflösung auch eine extrakorporale Stosswellenlithotripsie
(ESWL) möglich. Bei beiden nichtoperativen Optionen treten jedoch mit hoher
Wahrscheinlichkeit Rezidivsteine auf. Bei der ESWL beträgt dieses Risiko bis zu 50%
innerhalb von 5 Jahren. Daher werden in Deutschland pro Jahr über 130.000
Cholezystektomien durchgeführt2. Bei der operativen Entfernung der Gallenblase liegt
die Gesamtmortalität bei 0,7%, so dass im Rahmen der Cholezystektomie in
Deutschland etwa 900 Menschen pro Jahr versterben3. Insgesamt verursacht das
Gallensteinleiden über 200.000 stationäre Behandlungen pro Jahr in Deutschland. Dabei
entstehen bei 1,9 Millionen Behandlungstagen Kosten in Höhe von über einer halben
Milliarde Euro4,5.
Ein besseres Verständnis der Gallensteinentstehung ist ein wichtiger Schritt zur
Primärprävention von Gallensteinen und zur Entwicklung neuer Therapieansätze. Bei
der Untersuchung der Gallensteinentstehung müssen die verschiedenen Gallenstein-
typen und ihre Pathogenese unterschieden werden. Die Cholesteringallensteine stellen
mit 80% aller Gallensteine den größten Anteil6 und stehen im Mittelpunkt dieser Arbeit.
Risiokofaktoren für die Cholesteringallensteinbildung wie Adipositas1 sowie starke
Gewichtsabnahme 7 können primär durch Aufklärung oder Prophylaxe
1 Einleitung2
(Gewichtsreduktion, keine forcierte Gewichtsabnahme) behandelt werden. Andere
Veränderungen der Zusammensetzung der Gallenblasengalle sind derzeit einer
Prävention noch nicht zugänglich, da sie auf noch zu erforschenden
pathophysiologischen Mechanismen, insbesondere einer genetische Prädisposition8
beruhen.
Nach dem derzeit gültigen Modell basiert die Pathophysiologie der Gallensteinent-
stehung auf drei Schlüsselfaktoren:
1. Cholesterinübersättigung der Gallenblasengalle
2. Störung der Motilität der Gallenblase
3. Einfluss anderer gelöster Stoffe (insbesondere biliärer Proteine)
Die Gallensteinbildung wird in zwei Phasen unterteilt, die Nukleation und das
Steinwachstum. Für das Steinwachstum ist vor allem eine veränderte Motilität der
Gallenblase mit verlängerter Verweildauer der Galle in der Gallenblase verantwortlich
zu machen. Für die Nukleation ist hingegen die Zusammensetzung der Galle
entscheidend.
Zur Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Cholesterin-
kristallisation werden Modellgallen benutzt. Dies sind wässrige Lösungen, in denen
Cholesterin, Gallensäuren und Phospholipide in unterschiedlichen Konzentrationen
gelöst sind. Die Galle muß als notwendige Voraussetzung für die Entstehung von
Cholesterinkristallen mit Cholesterin übersättigt sein9. Cholesterin selbst ist in wässriger
Lösung nur schlecht löslich. Bei Zugabe von Gallensäuren und Phospholipiden steigt
die Löslichkeit. Für Modellgalle, mit der die Cholesterinnukleation und das
Kristallwachstum simuliert werden können, ermittelten Carey et al.10,11 für verschiedene
Konzentrationen von Cholesterin, Gallensäuren und Phospholipiden experimentell
einen Cholesterinsättigungsindex9,12 (CSI). Nukleation tritt nur bei einem
Sättigungsindex > 1 auf. Humane Gallenblasengalle ist mit Cholesterin übersättigt13.
Die eigentlich zu erwartende Nukleation wird jedoch nur bei maximal 50% der
Patienten beobachtet14. Es müssen daher in humaner Gallenblasengalle aber nicht in
Modellgalle vorkommende Stoffe einen zusätzlichen Einfluss auf die Nukleation haben.
1 Einleitung 3
Busch et al. 15 beschrieben erstmals, dass ein aus Gallenblasengalle mittels
Concanavalin A- und Helix pomatia-Lectin-Affinitätschromatographie gewonnenes
Proteingemisch in einem in vitro Wachstumsversuch nukleationshemmend wirkt. Auf
der Suche nach weiteren an der Nukleation und dem Gallensteinwachstum beteiligten
Proteinen wurden vier an Cholesterinkristalle absorbierte Glykoproteine isoliert, welche
inhibitorische Effekte auf die Nukleation haben16. Sie konnten als die leichten und
schweren Unterketten, die sekretorische Komponente und die Joining-chain des
Immunglobulins A identifiziert werden17.
Immunglobulin A ist das wichtigste Immunglobulin zum Schutz von Schleimhäuten. Es
kann in monomerer und dimerer Form vorliegen. Größere Konglomerate sind im Serum
nachgewiesen worden18. Die monomere Form besteht aus zwei schweren und zwei
leichten Ketten. Die aus einer variablen und aus drei konstanten Domänen bestehende
schwere Kette (α-chain) ist über eine Disulfidbrücke mit der leichten Kette verbunden.
Diese besteht wie bei allen Immunglobulinen aus jeweils einer variablen und einer
konstanten Domäne19.
Monomeres Immunglobulin A kommt in zwei Subklassen vor20,21. Von IgA1
unterscheidet sich IgA2 durch eine Deletion von 13 Aminosäuren in der Hinge-Region
(Gelenkregion, in der die schweren Ketten über Disulfidbrücken verbunden sind) der
schweren Kette. Aufgrund dessen wird es nicht durch die an dieser Stelle ansetzenden
Proteasen22 der auf den Schleimhäuten angesiedelten Keime gespalten. Der Anteil von
IgA2 am gesamten kolostralen Immunglobulin A ist mit 30 %23 bis 61 %24 höher als bei
humoralem Immunglobulin A (20 %)23,24.
Dimeres Immunglobulin A besteht aus zwei Immunglobulin A-Molekülen. Diese sind
miteinander kovalent über eine J-Chain (Joining Chain) verbunden. Diese Verbindung
von zwei Monomeren zu einem Dimer wird durch die um 19 Aminosäuren gegenüber
der schweren Kette des Immunglobulin G (γ-chain) verlängerte schwere Kette des
Immunglobulins A ermöglicht25. Für den transepithelialen Transport wird das Dimer an
eine sekretorische Komponente gebunden26. Im Serum liegt ungefähr 8 % des
1 Einleitung4
Immunglobulins A in dimerer Form vor, wovon 5 % an die sekretorische Komponente
gekoppelt sind27.
Das Verhältnis von Immunglobulin G zu monomerem Immunglobulin A ist im Serum
und in Galle annähernd identisch27. Polymeres Immunglobulin A mit und ohne
sekretorische Komponente ist jedoch in Galle im Vergleich zum Blut vermehrt
vorhanden. Der relative Anteil des polymeren Immunglobulins A in Lebergalle liegt
nach unterschiedlichen Quellen zwischen 44 - 70 %27 und 72 - 95 % 28. Dabei liegt das
polymere Immunglobulin A zu etwa gleichen Anteilen mit und ohne sekretorische
Komponente vor.
Während die meisten humoralen Proteine durch passiven, vom Molekulargewicht
abhängigen Transport in die Galle gelangen, ist dies bei Immunglobulin A nicht der
alleinige Weg29. In der Mukosa der Gallenwege konnten Immunglobulin A und J-Chain
synthetisierende Plasmazellen nachgewiesen werden30. Die dort gebildeten Dimere
werden mit Hilfe der sekretorischen Komponente von den Epithelzellen der Gallenwege
durch einen endozytischen vesikulären Transport in das Lumen sezerniert31. Ähnliches
gilt auch für das kolostrale Immunglobulin A. Hier konnte nachgewiesen werden, dass
ein Großteil des sezernierten Immunglobulin A aus lokaler Produktion (98 % des
dimeren, 68 % des monomeren IgA) und nur ein kleiner Anteil aus dem IgA-Blutpool
stammt32.
Busch et al.15 wiesen nach, dass IgA in vitro die Gallensteinbildung hemmt und den
Aufbau der Gallensteine modifiziert. Da IgA in vivo zu einem großen Teil in der
Submukosa des biliären Epithels gebildet wird, scheint eine Bildung spezifischer IgA-
Antikörper gegen Cholesterin möglich. Diese könnten dann den beschriebenen Effekt
auf die Gallensteinbildung haben. Bei dem kolostralen IgA wäre dann eine spezifische
Bindung aufgrund der Bildung in der Darmukosa nicht zu erwarten. Entsprechend
würde der Effekt auf die Gallensteinbildung fehlen.
1 Einleitung 5
Es wurde daher in dieser Arbeit
1. ein ELISA zur IgA-Bestimmung entwickelt und validiert um hiermit die
Konzentration von Immunglobulin A in humaner Gallenblasengalle und
anderen Proben zu bestimmen.
2. untersucht, ob biliäres Immunglobulin A einen reproduzierbaren Effekt auf
die Bildung von Cholesterinkristallen hat.
3. untersucht ob der Effekt von biliärem Immunglobulin A auf die Cholesterin-
kristallisation im Vergleich zu nicht biliärem Immunglobulin A unterschied-
lich ist.
4. untersucht ob sich eine Bindung von Immunglobulin A an
Cholesterinkristalle darstellen und vor allem im Vergleich zu nicht biliärem
Immunglobulin A quantifizieren lässt. Hierfür wurde ein Kristall-ELISA
entwickelt und validiert. In diesem wurden dann verschiedene gereinigte
IgA-Proben untersucht.
Präventive Maßnahmen zielen schlussendlich darauf ab, die Gallensteinbildung
überhaupt zu verhindern. Durch die weitere Untersuchung der die Bildung
beeinflussenden Faktoren trägt diese Arbeit zum besseren Verständnis der
zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen bei.
2 Material und Methoden6
2 Material und Methoden 7
2 Material und Methoden
2.1 Gallenblasengalle
Humane Gallenblasengalle wurde im Rahmen der konventionellen und
laparoskopischen Chirurgie von symptomatischen Gallensteinträgern gewonnen. Die
Sammlung erfolgte in Zusammenarbeit mit der Chirurgischen Klinik der RWTH
Aachen, der Chirurgischen Abteilung des St. Franziskus Krankenhauses Aachen und
der Chirurgischen Abteilung des Luisenhospitals Aachen.
Um die in der Gallenblasengalle vorkommenden Proteasen33 zu neutralisieren, wurde
ein Proteaseninhibitorencocktail zu den gewonnenen Gallenblasenproben hinzugegeben.
Die Endkonzentration der Proteaseninhibitoren betrug 1 mM PMSF, 1 mM
Iodacetamid, 1 mM Benzamidin, 2 mM EDTA und 5 µM Bacitracin.
Proben, die eine Verunreinigung des biliären Immunglobulins A mit mehr als einem
Prozent humoralem Immunglobulin A enthielten, sollten verworfen werden. Dies ergibt
für die maximal zulässige Hb-Konzentration in Gallenblasengalle folgenden Grenzwert:
HbIgAc
HbcIgAcHbc l
g
Blut
BlutGalle ][089,001,02,213015,0
01,0)(
)()(max)( =•
•=•
•=
Die gewählten Werte von
c(IgABlut) = 2,2 g/l34 (Maximalwert)
c(HbBlut) = 130 g/l35 (Minimalwert)
c(IgAGalle) = 150 mg/l (Minimalwert, nach eigenen Messungen)
minimieren die Wahrscheinlichkeit, eine Gallenblasengallenprobe mit einem
IgABlut/IgAGalle von größer einem Prozent fälschlicherweise nicht zu verwerfen.
Zum Hämoglobinnachweis wurde der Hemocare®-Test (Care Diagnostica, Voerde)
verwendet. Er entspricht dem modifizierten Guajak-Test nach Gregor36. Dabei wurde
die peroxidaseähnliche Wirkung des intakten Hämoglobins auf Guajak unter Zusatz von
alkoholischer Peroxid-Lösung genutzt. Dies führte zu einer Blaufärbung des
Testmediums.
2 Material und Methoden8
Das Testblut (c(Hb) = 145 g/l) wurden auf die oben berechnete tolerierbare
Konzentration verdünnt. Hierzu wurden in zwei Ansätzen 60 µl des Blutes in 100 ml
isotoner Kochsalzlösung verdünnt. Mit dieser Testlösung (c(Hb) ≈ 0,089 g/l) wurde
dann im nächsten Schritt in verschiedenen Konzentrationen der Hemocare®-Test in
Dreifachbestimmung durchgeführt.
2.2 Immunglobulin A-Gewinnung
Humanes sekretorisches Immunglobulin A wurde aus Gallenblasengalle mittels
Affinitätschromatographie gewonnen. Als erstes wurden Mucin und Feststoffe durch
Zentrifugation aus der Gallenblasengalle entfernt. Anschließend erfolgte die Gewinnung
der Proteinfraktion mit Hilfe der Concanavalin A (Con A)-Sepharose Affinitäts-
chromatographie. Aus dieser Proteinfraktion wurde schließlich mittels IgA-
Affinitätschromatographie das humane Immunglobulin A isoliert.
2.2.1 Zentrifugation der Gallenblasengalle
Gallenblasengalleproben wurden mit 100.000 gn bei 4 °C für eine Stunde
ultrazentrifugiert (Ultrazentrifuge Centrikon T-1000, Kontron Instruments GmbH,
Eching). Sedimentierte Feststoffe und die aufschwimmende Lipidfraktion wurden
verworfen.
2.2.2 ConA-Sepharose-Affinitätschromatographie
Eine 2,5 x 20 cm Säule (Econo-Columns®, Bio Rad Laboratories, Richmond, USA)
wurde mit 50 ml Con A-Sepharose (Pharmacia Biosystems GmbH, Freiburg) gepackt.
Con A-Sepharose besteht aus Concanavalin A isoliert aus Canavalia enisformis
(Schwertbohne), das mittels der Cyanobromid-Methode an Sepharose 4B gekoppelt ist.
Concanavalin A bindet Moleküle, die α-D-Mannose, α-D-Glukose oder sterisch
Verwandte mit C3-, C4- oder C5- Hydroxylgruppen enthalten. Alle folgenden Schritte
wurden bei 4 °C durchgeführt.
2 Material und Methoden 9
Die Con A-Säule wurde vor dem ersten Lauf mit 500 ml Startpuffer (20 mM TRIS/
HCl, pH 7,40, 0,2 mM NaCl, 3 mM NaN3) bei einer Flussgeschwindigkeit von
v = 10 cm/h äquilibriert. Nach der Äquilibrierung wurde die zentrifugierte
Gallenblasengalle mit einem Volumen entsprechend dem Con A-Säulenvolumen
aufgetragen und über Nacht mit gleicher Flussgeschwindigkeit zehnmal rezykliert.
Die Säule wurde mit mindestens 500 ml Waschpuffer (20 mM TRIS/ HCl, pH 7,40 ,
0,2 mM NaCl, 3 mM NaN3 + 3 mM STDC37) unter häufigem Aufrühren gewaschen, bis
die Extinktion bei 280 nm auf einen konstanten Wert abgefallen war. Die gebundene
Proteinfraktion wurden über Nacht bei 4 °C mit 250 ml Eluationspuffer (20mM TRIS/
HCl, pH 7,40, 0,2 mM NaCl, 3 mM NaN3 + 0,25 M Methyl-α-D-mannopyranosid) bei
v = 5 cm/h eluiert. Die gewonnene Probe wurde bis zur weiteren Verwendung bei –
20 °C gelagert.
Regeneriert wurde die Säule zuerst mit 500 ml (zehn Säulenvolumina) 100 mM
TRIS/HCl, pH 8,5, 0,5 M NaCl, 1 mM STDC und dann mit der gleichen Menge
100 mM Natriumacetat, pH 4,5, 0,5 M NaCl mit v = 30 cm/h. Anschließend wurde mit
500 ml Äquilibrierungspuffer (20 mM TRIS/ HCl, 0,2 mM NaCl, pH 7,40, 3 mM
NaN3, 1 mM CaCl, 1 MnCl2) bei v = 10 cm/h reäquilibriert.
2.2.3 IgA-Immunaffinitätschromatographie
Verwendet wurde das Immunopure® Immobilization Kit von Pierce (Rockford, USA).
Das darin enthaltene zu 4 % querverknüpfte Agarosegel enthält Aldehydgruppen, die
mit den primären Amingruppen der Antikörperproteine Schiff’sche Basen bilden.
Dadurch ist die mit Antikörpern gekoppelte Säule über einen weiten pH-Bereich stabil
und wiederverwendbar. Alle Schritte der Antikörperkopplung wurden bei
Raumtemperatur, die der späteren Immunglobulin A-Extraktion bei 4 °C vorgenommen.
Eine 2 ml Aminolink Säule wurde mit spezifisch gegen Immunglobulin A-gerichteten
Antikörpern (a-IgA-Ak, α-Ketten spezifisch, Sigma, St. Louis, USA) gekoppelt.
Hierzu wurde die bei 4 °C in Aminolink Storage Solution (Lagerungslösung, 0,05 %
NaN3, entgast) gelagerte Säule mit dreimal 2 ml Aminolink Coupling Buffer (0,1 M
H2PO4, pH 7,0, 0,05 % NaN3, über 0,2 µm filtriert) bei Raumtemperatur äquilibriert.
2 Material und Methoden10
Die a-IgA-Ak (Sigma) wurden gegen den Aminolink Coupling Buffer diafiltriert und
die Aminolink Säule mit 2 ml dieser Antikörperlösung (24 mg Protein, davon 5,4 mg
spez. Antikörper) und 0,2 ml der Aminolink Reductant Solution (32 mg NaCNBH3 in
500 µl H2Obidest.) für 2 Stunden langsam auf einem Schüttler und dann für weitere 4
Stunden inkubiert. Danach wurde die Säule zuerst mit 4 ml Coupling Buffer gewaschen
und mit 4 ml Aminolink Quenching Buffer (1 M TRIS/HCl, pH 7,4, über 0,2 µm
filtriert) äquilibriert. Die verbleibenden unbesetzten Bindungsstellen der Säule wurden
mit 2 ml Aminolink Quenching Buffer und 0,2 ml Aminolink Reductant Solution
blockiert.
Zur Entfernung ungebundener Anteile wurde die Säule mit viermal 5 ml Aminolink
Wash Solution (1 M NaClaq, über 0,2 µm filtriert) und dreimal 5 ml Lagerungslösung
gewaschen. Danach wurde eine Polyethylenfritte aufgetragen und diese mit 2 ml
Lagerungslösung überschichtet. Das luftblasenfreie Gel wurde dann bei 4 °C bis zur
weiteren Verwendung gelagert.
Es wurden gebundene Con A-Fraktionen zur Gewinnung von humanem
Immunglobulin A mittels Immunaffinitätschromatographie verwendet.
Die Proben mit einem Immunglobulin A-Gehalt von 2 – 3 mg wurden mit dreimal
10 ml Startpuffer (20 mM TRIS/ HCl, pH 7,40, 0,2 mM NaCl, 3 mM NaN3) diafiltriert
(Amiconzelle mit Filter YM10, Molekulargewichtsgrenze 10 kD, Millipore, Bedford,
USA) und auf 1 ml eingeengt. Sie wurden dann auf die mit 30 ml Startpuffer
äquilibrierte Immunaffinitätschromatographiesäule aufgetragen und über Nacht
zehnmal rezykliert. Die Säule wurde mit 15 ml Startpuffer (siehe 2.2.2) gewaschen,
wobei die ersten 10 ml als ungebundene Fraktion aufgefangen und bei -70 °C
aufbewahrt wurden.
Danach wurde die Säule erneut mit fünfmal 5 ml Startpuffer gewaschen und dann
eluiert. Hierzu wurden in eine Amiconzelle 0,5 ml Neutralisationspuffer (1 M TRIS,
pH 9,5) vorgelegt und die gebundene Proteinfraktion mit 10 ml Elutionspuffer (0,1 M
Glycin, pH 2,5) direkt in die Amiconzelle eluiert. Die Säule wurde mit fünfmal 5 ml
Startpuffer und mit zweimal 5 ml Lagerungslösung gewaschen, mit 2 Lagerungslösung
versetzt und bei 4 °C bis zur Wiederverwendung gelagert.
2 Material und Methoden 11
Zur qualitativen Beurteilung der Fraktionen des Proteineluats der Affinitätssäule
wurden 3 ml (Gesamtproteingehalt 1,96 mg, siehe 2.6.1) einer gebundenen Con A-
Fraktion eines humanen Gallenblasengallenpools gegen Probenpuffer
(25 mM NH4HCO3) diafiltriert. Die resultierende Lösung (1 ml) wurde auf die mit
30 ml Probenpuffer äquilibrierte Säule aufgetragen. Daraufhin wurde die Säule nach
obigem Schema inkubiert und gewaschen. Die Elution erfolgte in 2 ml-Schritten mit
Elutionspuffer, wobei die einzelnen Fraktionen in Küvetten aufgefangen und direkt mit
50 µl TRIS-HCl (pH 9,5) neutralisiert wurden. Anschließend wurde die Säule mit 5 ml
Elutionspuffer versetzt, nach obigem Schema gewaschen und gelagert.
Die Extinktionen der einzelnen Fraktionen wurden photometrisch (280nm, Ultrameter,
LKB, Bromma, Schweden) gegen Probenpuffer gemessen.
Zur Bestimmung der Bindungskapazität der Immunaffinitätschromatographiesäule
wurden verschiedene Läufe mit vorher festgesetzten, unterschiedlichem Immunglobulin
A-Gehalt der Proben durchgeführt. Hierbei wurde kolostrales Immunglobulin A
verwendet. Danach wurde in der ungebundenen Fraktion und in der gebundenen
Fraktion jeweils die Konzentration des Immunglobulins A mittels ELISA (siehe 2.3.2)
bestimmt.
2.3 Methoden zur Messung der Konzentration von Proteinen
2.3.1 Radiale Immunodiffusion (RID)
Um die IgA Konzentration in Gallenblasengalle zu beurteilen, wurden erworbene, mit
Anti-Immunglobulin A-Antikörpern beschichtete Gelplatten (Human-IgA-NanoridTM-
Plate, The Binding Site, Birmingham, GB) benutzt. Die vorhandenen Wells wurden zur
Doppelbestimmung wie folgt bestückt:
• Calibrator (Konzentration: 5,8 mg IgA /l)
• unverdünnt
• 50% in PBS (Na2HPO4, 0,24 g/l KH2PO4, pH 7,4, 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl,
1,44 g/l + 0,001 % Thiomersal)
2 Material und Methoden12
• 10% in PBS
• Kontrolle (Sigma)
• Probe (Galle)
• 2%
• 1%
• 0,5%
Daraufhin wurden die Platten 96 Stunden lang waagrecht bei Zimmertemperatur
gelagert und der Durchmesser der Präzipitationskreise ausgemessen.
2.3.2 ELISA
Der „enzyme-linked immunosorbent assay“ (ELISA) wurde erstmals von Engvall et al38
als Methode zur rationalen und einfach zu handhabenden Proteinkonzentrations-
bestimmung39 beschrieben. Hierbei wird ein spezifischer Antikörper an einer Mikro-
titerplatte immobilisiert. Die zu messende Substanz bindet an diesen und kann mittels
eines zweiten spezifischen Antikörpers nachgewiesen werden. Diese Technik wird
wegen des Einsatzes zweier Antikörper als „double-site immunoassay“ bezeichnet.
HRP-Antikörper
biliäres IgA
a-IgA
Abb. 1: Anordnung der verschiedenen Antikörper im ELISA
In dieser Arbeit wurden Mikrotiterplatten mit Antikörpern gegen humanes
Immunglobulin A (a-IgA) bestückt (Abb.1). Die Menge des nach Zugabe der
Testproben gebundenen Immunglobulins A wurde nach Bindung eines dritten
2 Material und Methoden 13
Antikörpers, der mit HRP (HRP-Antikörper, Peroxidase aus Meerrettich) konjugiert
war, durch Bestimmung der enzymatischen Aktivität gemessen.
Es wurden Flachboden-Mikrotiterplatten MaxiSorp® (Nunc Immuno Plate, Nunc,
Rochester, USA) über Nacht mit 100 µl a-IgA (α-Ketten spezifisch, Kaninchen-IgG,
Sigma) 1:4000 (0,5 ng/ml) in PBS-Puffer (Na2HPO4, 0,24 g/l KH2PO4, pH 7,4, 8 g/l
NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l + 0,001 % Thiomersal) bei 4oC beschichtet. Am nächsten
Tag wurden die Platten dreimal mit PBS-Tween-Puffer (PBS-Puffer mit
0,05 % Tween-20, Serva, Merck, Freiburg) gewaschen. Die freien Bindungsstellen der
Mikrotiterplatten wurden mit 200 µl 1 % bovinem Serumalbumin (BSA, reinst,
Behring, Marburg) in PBS-Tween-Puffer für eine Stunde bei 37 °C blockiert.
Nach erneutem dreimaligen Waschen der Platten mit PBS-Tween-Puffer wurden die
Proben aufgetragen. Hierfür wurden 100 µl 0,1 % BSA in PBS-Tween-Puffer vorgelegt
und die auf etwa 500 µg/l in 0,1 % BSA in PBS-Tween-Puffer vorverdünnten Proben
(Volumen 100 µl) in die erste Zeile der Mikrotiterplatten gefüllt. Als Standard wurde
humanes Immunglobulin A von Sigma mit einer nephelometrisch bestimmten
Konzentration von 2,1 g/l benutzt. Hierauf erfolgte eine Verdünnung mit einer Zwölf-
Kanal-Pipette (Independent 36012, Integra Biosciences, Fernwald). Daraus ergaben sich
für den Standard (IgA, Sigma) Konzentrationen von 210,0/ 105,0/ 52,5/ 26,3/ 13,1/ 6,6/
3,3 µg/l. Die letzte Zeile der Mikrotiterplatten wurde zur Bestimmung des Leerwertes
benutzt. Dieser wurde durch den Austausch der Probe gegen PBS-Tween-Puffer
bestimmt. Alle Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen und ebenso wie der
Standard behandelt. Daraufhin wurden die Platten für zwei Stunden im
Trockeninkubator bei 37 °C mit 80 UpM inkubiert und dann erneut dreimal mit PBS-
Tween-Puffer gewaschen um nicht gebundenes IgA zu entfernen.
Zum Nachweis der Immunglobulin-A-Bindung wurden jetzt 100 µl Kaninchen a-IgA-
Antikörper (HRP konjugiert, α-Ketten spezifisch, Dako, Glostrup, DK) in 0,1 %
BSA/PBS-Tween-Puffer hinzugefügt. Diese wurden nach der zweistufigen
Glutaraldehyd-Methode40 hergestellt. Nach dreimaligen Waschen mit PBS-Tween-
Puffer und zweimaligen Waschen mit PBS-Puffer wurden 100 µl der Färbelösung
(0,1 g/l 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin, 0,0036 % H2O2, 0,1 M Natrium-Acetat, pH 5,5) je
2 Material und Methoden14
Probe hinzugefügt. Dabei wird Tetramethylbenzidin (C16H20N2) als Protonendonator
(D-H2), unter Anwesenheit der Peroxidase und Wasserstoffperoxid als Reaktionspartner
dehydriert. Die nach dem Schema:
DO2HH-DOH 2222 +→+
von farblos nach gelb ablaufende Reaktion wurde unter visueller Überprüfung nach
5 Minuten mit 2 molarer Schwefelsäure gestoppt. Die Lösung hatte durch den dadurch
erfolgten Farbumschlag von gelb nach blau ein Extinktionsmaximum bei 450 nm41,42.
Anschließend erfolgte die Ablesung mit einem Mikrotiterplattenlesegerät (TR 400, SLT
Labinstruments) bei 450 nm Messwellenlänge und 550 nm Referenzwellenlänge. Die
Errechnung der Standardkurve und die Ermittlung der Probenkonzentrationen erfolgten
mittels der gewichteten linearen Regression nach logit-log-Transformation (auf einem
Personalcomputer mit dem Programm EasyFit® von SLT Labinstruments) nach der
folgenden Formel43:
BC
ionKonzentrat )(1DA
DExtinktion+
−+=
Die Parameter A und D geben die Extinktionswerte der Asymptote an, gegen welche
die Kurve rechts und links läuft. Sie wurden mittels Vier-Parameter-Interpolation
errechnet. Die Parameter B und C wurden nach einer Achsentransformation durch
lineare Regression ermittelt. Dabei wurden zur Berechnung der Probenkonzentrationen
nur die Probenwerte berücksichtigt, die auf dem linearen Anteil der optisch
kontrollierten Standardkurve43 lagen.
2.3.2.1 Spezifität
Die Spezifität des Tests gegenüber dem häufigsten anderen Immunglobulin in der
Gallenblasengalle, Immunglobulin G, wurde durch Messung einer humanen
Immunglobulin G-Probe (Sigma) mit einer mittleren Konzentration der obigen
Verdünnungsreihe (25 µg/l) auf fünf verschiedenen Assayplatten bestimmt.
2 Material und Methoden 15
2.3.2.2 Reproduzierbarkeit
Als Maß für die Reproduzierbarkeit des durchgeführten Assays wurden der intraassay-
und der interassay-Variationskoeffizient bestimmt. Der intraassay-Variationskoeffizient
wurde aus 12 Einzelwerten von drei Verdünnungsreihen auf einer Mikrotiterplatten, der
interassay-Variationskoeffizient aus den 20 Einzelwerten von fünf Verdünnungsreihen
zweier an verschiedenen Tagen verarbeiteten Mikrotiterplatten bestimmt.
2.3.2.3 ELISA für Immunglobulin G
Zum relativen Vergleich mit dem Kristall-ELISA, der auch mit Immunglobulin G
durchgeführt wurde, wurde der oben angeführte ELISA auch mit a-IgG (Sigma) als
primärem Antikörper beschichtet und mit a-IgG (konjugiert mit HRP, Dako) als
tertiärem Antikörper durchgeführt. Als sekundärer (zu bestimmender) Antikörper wurde
hier immer eingewogenes Immunglobulin G (Sigma) verwendet.
2.4 Vergleich von kolostralem und biliärem Immunglobulin A
Um Unterschiede in den Eigenschaften des Immunglobulin A aus Kolostrum und
Gallenblasengalle darzustellen, wurden sie in verschiedenen Assays eingesetzt. Mit der
Saccharose-Gradientenzentrifugation wurden Unterschiede in der Immunglobulin A-
Zusammensetzung dargestellt. Der Einsatz der Proben in einem mit Cholesterin-
kristallen beschichteten ELISA zeigte quantitativ das Bindungsverhalten gegenüber
diesen Kristallen. Die Durchführung eines Cholesterinkristallisationstests zeigte den
unterschiedlichen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Cholesterinkristallisation.
2.4.1 Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation
Zur Bestimmung des relativen Verhältnisses von mono- und dimerem Immunglobulin A
in Gallenblasengalle wurde mittels der Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation die
Verteilung der Konzentration von kolostralem und biliärem Immunglobulin A in einem
2 Material und Methoden16
Dichtegradienten ermittelt 44. Als Proben wurden ein Gallenblasengallenpool und
Immunglobulin A-Standard eingesetzt.
Es wurden 40 ml 10 % (m/v) Saccharose Lösung in PBS (10,1 mM Na2HPO4,
1,76 mM KH2PO4, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl + 0,001 % Thiomersal) in
einem Ultrazentrifugationsröhrchen bei –20 °C eingefroren und langsam aufgetaut. Die
Proben mit einem Immunglobulin A-Gehalt von 222,5 µg wurden vorsichtig
aufgetragen. Die darauffolgende Zentrifugation erfolgte bei 30.000 UpM für 15 Stunden
(Ultrazentrifuge Centrikon T1000 mit Vertikalrotor VC 53) bei 4 °C. Aus den Röhrchen
wurden mit einem FPLC-Fraktionssammler (Pharmacia, Uppsala, Schweden) jeweils 43
Fraktionen mit einem Volumen von je 940 µl mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min
gewonnen44. Die Immunglobulin A Konzentration in den Fraktionen wurde mittels
ELISA (siehe 2.3.2) bestimmt.
2.4.2 Kristall-ELISA
Der Aufbau des Kristall-ELISA entsprach grundsätzlich dem oben beschriebenen
allgemeinen ELISA-Aufbau (siehe 2.3.2), nur wurden anstelle des ersten Antikörpers
Cholesterinkristalle an der Assayplatte immobilisiert (Abb.2). Diese Technik wird auch
als „single-side immunoassay“ bezeichnet.
HRP-Antikörper
biliäres IgA
ChMHK
Abb. 2: Aufbau des Kristall-ELISA
Zur Bestimmung der spezifischen Cholesterinbindungsfähigkeit des Immunglobulins A
wurden die verwendeten Mikrotiterplatten mit feinen Cholesterinmonohydratkristallen
2 Material und Methoden 17
(ChMHK) beschichtet. Diese wurden dann, um die unspezifische Bindung des Immun-
globulin A zu minimieren, blockiert. Die Kristalle wurden durch die Auskristallisation
einer cholesterinhaltigen Lösung hergestellt. Um Monohydratkristalle zu erhalten,
wurde als Lösungsmittel wässriges Ethanol mit einem Wasseranteil von 5 % gewählt45.
Ebenso wie bei dem normalen ELISA wurde die Menge des nach Zugabe der
Testproben gebundenen Immunglobulins A mittels eines dritten Antikörpers, der mit
HRP (HRP-Antikörper) konjugiert war, durch enzymatische Färbung gemessen.
Um Monohydratkristalle zu erhalten, wurden Mikrotiterplatten (Dynatech Immulon 1B,
Dynex Technologies, Chantilly, USA) über Nacht mit 50 µl Cholesterin (Kodak,
Rochester, USA) in 95% Ethanol (v/v) in unterschiedlicher Konzentration bei
Raumtemperatur und 100 UpM im Trockeninkubator unter Verdunstung des
Lösungsmittels beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten dreimal mit PBS
(siehe 2.4.1) gewaschen. Die freien Bindungsstellen der Mikrotiterplatten wurden mit
200 µl 1 % bovinem Serumalbumin (reinst, BSA, Behring) in PBS-Puffer für eine
Stunde im Trockeninkubator bei 37oC mit 80 UpM geblockt. Nach erneutem
dreimaligen Waschen der Platten mit PBS-Puffer wurden die Proben aufgetragen.
Hierfür wurden 100 µl 0,1% BSA in PBS-Puffer vorgelegt und die auf 400 mg/l in
0,1 % BSA in PBS-Puffer vorverdünnten Proben in die erste Zeile der Mikrotiterplatten
gefüllt. Als Standard wurde humanes Immunglobulin A von Sigma mit einer
nephelometrisch bestimmten Konzentration von 2,1 g/l verwendet. Hierauf erfolgte eine
Verdünnung mit einer Zwölf-Kanal-Pipette. Daraus ergaben sich für den Standard (IgA,
Sigma) Konzentrationen von 210,0/ 105,0/ 52,5/ 26,3/ 13,1/ 6,6/ 3,3 [mg/l]. Die letzte
Zeile der Mikrotiterplatten wurde zur Bestimmung des Leerwertes benutzt. Hierfür
wurde die Probe gegen BSA/PBS-Puffer ausgetauscht. Alle Proben wurden in
Doppelbestimmung gemessen und ebenso wie der Standard behandelt. Daraufhin
wurden die Platten für zwei Stunden im Trockeninkubator bei 37oC mit 80 UpM
inkubiert und dreimal mit PBS-Puffer gewaschen. Zum Nachweis der Immunglobulin-
A-Bindung wurden jetzt 100 µl Kaninchen a-IgA-Antikörper, HRP konjugiert (Dako) in
0,1 % BSA/PBS-Puffer je Probe hinzugefügt. Nach dreimaligen Waschen mit PBS-
Puffer und zweimaligen Waschen mit PBS-Puffer wurden 100 µl der Färbelösung
gemäß Standard-ELISA hinzugefügt und die Färbung nach visueller Überprüfung
2 Material und Methoden18
gestoppt und abgelesen. Die Farbreaktion, die Ablesung der Platten und die Berechnung
der Probenkonzentrationen erfolgten wie bei dem Standard-ELISA (2.3.2).
2.4.2.1 Reproduzierbarkeit
Als Maß für die Reproduzierbarkeit und damit Güte des durchgeführten Assays wurde
der intraday-, der interday-Variationskoeffizient und das Quantil25/75 bestimmt. Der
intraday-Variationskoeffizient und das Quantil25/75 wurden aus 48 Einzelwerten zweier
Verdünnungsreihen, die parallel bestückt wurden, bestimmt. Dabei wurde die
Konzentrationen der Cholesterin/Ethanol-Lösung variiert. Der interday-
Variationskoeffizient wurde aus den 36 Einzelwerten zweier an verschiedenen Tagen
verarbeiteter Mikrotiterplatten bestimmt.
2.4.2.2 Vergleich der Kristallbindung verschiedener Arten von Immunglobulin A
Mittels Con A- und Immun-Affinitätssäule aus Gallenblasengalle verschiedener
symptomatischer Gallensteinträger gewonnenes sekretorisches Immunglobulin A
(vorverdünnt auf 410 mg/l) wurde vergleichend mit dem gekauften Standard
(kolostrales IgA, Sigma) im Kristall-ELISA und normalen ELISA gemessen.
2.4.2.3 Vergleich der Kristallbindung von Immunglobulin A und Immunglobulin G
Ebenso wurde die Kristallbindung von Immunglobulin G und Immunglobulin A im
Kristall-ELISA verglichen. Hierfür wurde Immunglobulin G (Sigma) auf 2 mg/l (10 mg
in 5 ml PBS) vorverdünnt und gegen den Immunglobulin A-Standard gemessen.
2.4.3 Cholesterinkristallisationstest
Im Cholesterinkristallisationstest kann der Einfluss, den Substanzen auf die
Kristallisation in einer mit Cholesterin übersättigten Modellgalle haben, bestimmt
werden. Diese Modellgalle ist in ihrer Zusammensetzung der Gallenblasengalle
nachempfunden. Sie besteht aus einer wässrigen Lösung der wichtigsten Bestandteile
der Gallenblasengalle: Gallensäure, Cholesterin und Phospholipid. Die Herstellung
erfolgt aus Stammlösungen dieser Substanzen.
Einer übersättigten Cholesterin/Methanol-Lösung wurde Chloroform bis zur
vollständigen Lösung des Cholesterins zugesetzt. Danach wurde die Stammlösung zur
2 Material und Methoden 19
Entfernung von festen Bestandteilen zentrifugiert (15 min, 22 °C, 1000 gn, Minifuge
GL, Heraeus, Hanau) und mit N2 überschichtet bei -70°C gelagert. Die
Cholesterinkonzentration der Stammlösung wurde enzymatisch mit dem Monotest®
Cholesterin HP (Boehringer, Mannheim) nach Allain et al.46 bestimmt. Dieser beruht
auf dem Nachweis des bei der Oxidation des Cholesterins durch die Cholesterinoxidase
entstehenden Wasserstoffperoxids mittels Peroxidase unter Anwesenheit einer
geeigneten Färbesubstanz. Die Extinktion der Lösung mit dem unter Anwesenheit von
Phenol und 4-Aminophenazon gebildeten roten Chinonimin47 wurde bei 500 nm
photometrisch bestimmt und die Konzentration berechnet.
Taurocholsäure (Sigma) wurde in Methanol gelöst und nach der Zentrifugation (15 min,
15 °C, 1000 gn) mit N2 überschichtet bei –70 °C gelagert. Die Konzentration der
Taurocholsäure wurde mit dem Sterognost-3α® Pho-Kit (Nycomed AS, Oslo,
Norwegen) nach Fausa und Skalhegg48 bestimmt. Dabei katalysiert die 3α-
Hydroxysteroiddehydrogenase die Umsetzung von 3α-Hydroxygallensäuren unter
NAD-Bildung. Die Menge des gebildeten NAD kann dann mittels des optischen Tests
nach Warburg49 nachgewiesen und die Konzentration der Taurocholsäure berechnet
werden.
Gelöstes Lecithin in Chloroform-Methanol 2:1 (v/v) (Lipid Products, South Nutfield,
GB) wurde als Phospholipid-Stammlösung verwendet. Die Lecithinkonzentration wurde
nach der von Gurantz et al. 50 modifizierten Methode nach Takayama 51 gemessen.
Verwendet wurde hierfür der Phospholipid-Test von Texas International Laboratories,
Houston, USA). Dabei wird durch die Phospholipase D aus Phospholipiden Cholin
freigesetzt, welches dann mit der Cholinoxidase oxidiert wird. Die Konzentration des
entstehenden Wasserstoffperoxid wird dann wie oben angegeben gemessen und die
Ausgangskonzentration des Lecithins berechnet.
Die für die Modellgalle benutzten Mengen der Stammlösungen waren abhängig von der
vorgegebenen
• Gesamtlipidkonzentration (hier 10 g/dl),
• dem molaren Gallesäuren-/ Phospholipid-Verhältnis und dem
• Cholesterinsättigungsindex (hier 1,3).
2 Material und Methoden20
Die maximal lösliche Cholesterinkonzentration in Molprozent wurde von Carey für
gegebene Werte für die Gesamtlipidkonzentration und dem molaren
Gallesäuren/Phospholipid-Verhältnis tabellarisch zusammengestellt10.
Die endgültige Cholesterinkonzentration errechnet sich aus dem Produkt der maximal
löslichen Cholesterinkonzentration und dem vorgegebenen Cholesterinsättigungsindex.
Die Herstellung der Modellgalle erfolgte nach der von Busch et al. beschriebenen
Methode52.
Dabei wurden die errechneten Mengen der Lecithin- und Cholesterin-Stammlösung in
einem Reagenzglas vor der Zugabe der Phospholipid-Stammlösung bei 50 °C eingeengt.
Das fehlende Volumen wurde durch Methanol ergänzt und die Lösung gut
homogenisiert. Die organischen Lösungsmittel wurden dann verdampft und die Proben
zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels lyophilisiert. Die Proben wurden dann
unter N2 bei –70 °C bis zur Verwendung gelagert.
Zum Schutz vor Oxidation der Substanzen wurden alle obigen Schritte bei maximal
50 °C und unter N2 durchgeführt53.
Zur Herstellung der endgültigen Modellgalle wurden die Proben mit TBS-Puffer
(25 mM TRIS/ HCl, pH 7,45, 150 mM NaCl, 3 mM NaN3) resuspendiert. Dabei wurde
das Volumen der Lipide (0,75 µl/ml bei einer Gesamtlipidkonzentration von 1 g/l) von
der zu verwendenden Pufferlösung abgezogen. Die Suspension wurde bei 50 °C gut
resolublisiert und bei 37 °C durch einen vorgewärmten Filter (0,22 µm, Millipore
Corp.) filtriert. Die zu testende Proteinprobe wurde in Reagenzgläser, gelöst in 40 µl
TBS-Puffer, gefüllt. Als Leerwert wurde nur 40 µl TBS-Puffer verwendet. Alle Proben
wurden auf 37 °C erwärmt.
Alle folgenden Schritte wurden unter N2-Überschichtung und bei 37 °C durchgeführt.
Zu den Proben wurde jeweils 460 µl der Modellgalle gegeben und durchmengt. Dieser
Zeitpunkt markierte den Beginn des Cholesterinkristallisationstests.
Daraufhin wurde über einen Zeitraum von einer Woche zehnmal 20 µl aus den
einzelnen Proben entnommen und unter Zugabe von 80 µl 10 mM Taurodeoxycholsäure
in TBS-Puffer photometrisch vermessen. Die Zugabe des Taurodeoxycholsäure-Puffer
eliminierte die vesikelbedingte Trübung der Modellgalle durch Auflösung der Vesikel.
2 Material und Methoden 21
Auf diese Weise konnte die kristallbedingte Trübung spezifisch erfasst werden52. Die
Extinktion wurde bei 840 nm mit einem Winkel von 13-24° gegen 10 µM
Taurodeoxycholsäure in TBS-Puffer nephelometrisch gemessen (BN 100
Nephelometer, Behring, Marburg) und graphisch sowie statistisch ausgewertet.
Als Proben wurde kolostrales Immunglobulin A (Sigma) und gewonnenes biliäres
Immunglobulin A (2.2) in fünf verschiedenen Konzentrationen jeweils in Doppel-
bestimmung getestet. Der Leerwert wurde in Dreifachbestimmung gemessen. Die
statistische Auswertung erfolgte mittels Varianzanalyse.
Da der benutzte Test thermodynamisch instabil war und es zu einer überschießenden
heterogenen Auskristallisation bei der Zugabe der Proteinproben kommen konnte17,
wurden Proben, die nach 26 h eine höhere Extinktion als 0,03 (normal bis 0,015) hatten,
bei der Auswertung nicht berücksichtigt.
2.5 Optische Darstellung der IgA-Kristallbindung
Um die Bindung des Immunglobulin A an die Cholesterinkristalle optisch darzustellen,
wurden in vitro hergestellte Cholesterinkristalle und Fragmente humaner Gallensteine
verwendet. Die Cholesterinkristalle wurden mit IgA inkubiert und es wurde versucht die
Immunglobulin A Bindung mittels verschiedener a-IgA Antikörper und Techniken
nachzuweisen.
2.5.1 Herstellung der Cholsterinkristalle
Cholesterinmonohydratkristalle wurden durch Erhitzen von 12,5 g/l Cholesterin in 95 %
Ethanol auf 60 °C und anschließendes Abkühlen auf Raumtemperatur hergestellt. Um
möglichst kleine, nicht zerbrochene Kristalle zu erhalten, wurde die Lösung während
des Abkühlens mit 30 UpM gerührt. Im nächsten Schritt wurden die Kristalle durch
2 Material und Methoden22
Abzentrifugieren mit 2400gn über fünf Minuten und anschließendes Dekantieren
gewonnen.
2.5.2 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
Zur Darstellung von einzelnen Antikörperbindungen wurde versucht, die Bindung
goldkonjugierter a-IgA-Antikörper an Immunglobulin A auf vorbehandelten
Cholesterinkristallen mittels Transmissionselektronenmikroskop darzustellen.
Hierfür wurden 10 µl der in destilliertem Wasser resuspensierten Cholesterinkristalle
(siehe 2.5.1) auf die Oberfläche der TEM-Grids (SPI, West Chester, USA) gegeben und
die überstehende Lösung nach 30 Minuten mit Filterpapier entfernt. Die Grids wurden
im Exsikkator mit Phosphorpentoxid gelagert. Vor der Transmissionselektronen-
mikroskopie (TEM400T, Philips, NL-Eindhoven) wurden sie mittels Durchlicht-
mikroskopie auf Kristalle untersucht.
2.5.3 Fluoreszenzmikroskopie
Die Resuspension der gewonnen Kristalle (siehe 2.5.1) erfolgte mit 1 % BSA/PBS und
anschließender Inkubation bei 37 °C für eine Stunde im Trockeninkubator bei
100 UpM, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Nach dreifachem
Zentrifugieren, Dekantieren und Resolubilisieren mit 0,1 % BSA/PBS wurde 1 ml
kolostrales IgA (Sigma) in einer Konzentration von 200 µg/l in 0,1 % BSA/PBS
hinzugefügt. Die Suspension wurde für zwei Stunden bei 37 °C und 100 UpM inkubiert.
Nach der darauffolgenden viermaligen Reinigung wurde 1 ml der
Fluoreszenzantikörperlösung, bestehend aus 100 µl anti-human-IgA FITC konjugiert
(Sigma) in 0,1 % BSA/PBS, hinzugegeben und für eine Stunde bei 37 °C und 100 UpM
inkubiert. Daraufhin wurde die Suspension erneut gereinigt und in 1 ml 0,1 % BSA/PBS
resolubilisiert.
25 µl dieser Suspension wurden auf ein Objektträger gegeben und in der
Durchlichtmikroskopie (Leica DM RB) und in der Fluoreszenzauflichtmikroskopie
(Leica DM RB mit I3 Filter) fotografiert (Minolta 9000).
Die Bilder wurden zur weiteren Bearbeitung mittels Dia- (Polaroid, Cambridge, USA)
und Flachbettscanner (Paragon 12000 SP, Mustek, Taiwan) eingelesen und an einem
2 Material und Methoden 23
Personal Computer mit Corel PhotopaintTM (Version 7.0, Corel Corporation, Dublin,
Irland) bearbeitet und optisch ausgewertet.
2.6 Ergänzende Methoden
2.6.1 Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung wurde mit dem Protein Assay DC (Bio-Rad Laboratories,
Richmond, USA) nach Bradford54 durchgeführt. Nach dieser Methode wird die
Änderung der Extinktion von Coomassie Brilliant Blue nach der Bindung an Protein bei
595 nm gemessen. Dabei steigt die gemessene Extinktion über eine großen Bereich
linear zur gemessenen Proteinkonzentration55. Die Konzentrationen wurden gegen
Rinderserumalbumin (Sigma) als Standard errechnet.
2.6.2 Qualitatives Gel
Zur Auftrennung der gewonnenen Proteinfraktionen wurde eine Elektrophorese im
diskontinuierlichen TRIS-Glycin-HCl-Puffersystem nach Lämmli56 im homogenen Gel
in Vertikaltechnik durchgeführt.
Die Laufstrecke des Trenngels betrug 6 cm, die des Sammelgels 1 cm, die Dicke des
Gesamtgels betrug 1 mm. Die Totalacrylamidkonzentration betrug im Trenngel 15 %
und im Sammelgel 5 % (m/v), jeweils mit einem Vernetzungsgrad von 2,67 %. Beide
Gele enthielten 0,375 M TRIS/HCl-Puffer (pH 8,80), 0,1 % (m/v) SDS und 2 mM
EDTA. Als Elektrophoresepuffer wurde 25 mM TRIS, 192 mM Glycin, 0,1 % (m/v)
SDS, 3 mM NaN3, pH 8,40 verwendet.
Das Trenngel polymerisierte, überschichtet mit 0,5 % (m/v) SDS, bei Raumtemperatur
über Nacht aus. Danach wurde das Sammelgel aufgetragen, das nach dem Einsetzen des
Kammes für die Probentaschen innerhalb von 30 Minuten auspolymerisierte.
Die Proben mit einer Proteinfraktion von maximal 5 µg wurden in 20 µl SDS-
Probenpuffer (50 mM TRIS/HCl, 2 % (m/v) SDS, 10 % (v/v) Glycin, 10 % (v/v)
2-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 3mM NaN3, 0,004 % (m/v) Bromphenolblau,
pH 6,80) verdünnt und für 5 min auf 95 °C erhitzt. Dabei diente das Mercaptoethanol
als Reduktionsmittel und das Bromphenolblau als Marker für die Lauffront während der
Elektrophorese.
2 Material und Methoden24
Die Proben wurden in die Geltaschen pipettiert und die Elektrophorese durchgeführt.
Hierfür wurden Strom und Spannung jeweils begrenzt, und zwar während der ersten
10 min (Sammelgel) auf Imax = 10 mA und Umax = 80 V und dann auf Imax = 25 mA und
Umax = 200 V für die verbleibende Zeit.
Die Proteine wurden 30 min mit 10 % (v/v) Essigsäure, 40 % (v/v) Ethanol fixiert und
dann nach der Methode nach Heukeshoven57,58 mit Silber gefärbt. Hierzu wurde das
Gel für zwei Stunden mit 30 % (v/v) Ethanol, 0,5 M Natriumacetat, 8 mM
Natriumthiosulfat, 0,13 % (v/v) Glutaraldehyd für die nachfolgende Silberanlagerung
vorbereitet.
Für die Molekulargewichtsbestimmung wurde das Gel mit sechs Standardproteinen
(LMW-Standard) geeicht (Tab.1).
Standardprotein Herkunft Molekulargewicht [kD]
Phosphorylase bAlbumin
OvalbuminCarboanhydraseTrypsininhibitora-Lactalbumin
KaninchenmuskelRinderserum
HühnereiweißRindererythozyten
SojabohneKuhmilch
94,067,043,030,020,114,4
Tab. 1: LMW-Standard für die Eichung der qualitativen Gele
3 Ergebnisse 25
3 Ergebnisse
3.1 Gallenblasengallen
3.1.1 Test der Gallenblasengallen auf Verunreinigung mit Blut
Für die Untersuchung der Eigenschaften von biliärem Immunglobulin A war dessen
Reinheit wichtig. Eine Verunreinigung des biliären Immunglobulin A mit humoralem
Immunglobulin A wurde bis zu 1 % toleriert, da zum einen eine geringere
Verunreinigung der Gallenblasengalle mit Blut bei der Punktion der Gallenblase meist
nicht zu vermeiden war und sie zum anderen auch keinen nennenswerten Einfluss auf
die Interpretation der Ergebnisse hatte. Dies entsprach bei dem angenommenen
Normalwert von 130 g Hb/l Blut einer Verunreinigung der Gallenblasengalle mit
maximal 0,090 g Hb/l. Mit einer Testlösung dieser Hämoglobin-Konzentration wurde
der verwendete Peroxidasetest auf seine Empfindlichkeit getestet:
Verdünnungsfaktor c(Hb) [mg/l]Reaktion
(Probe mit 0,9 %NaCl-Lösung)
Konzentriert 89,0 ++
0,5 44,5 ++
0,2 17,8 ++
0,1 8,9 +
0,05 4,5 (+)
0,025 2,2 -
Tab. 2: Peroxidasetest mit verdünntem Blut (++ deutlich positiv/ + positiv/ (+) schwach positiv/ - negativ)
Der Test fiel bis zu einer Verdünnung der Testlösung auf 10 % positiv aus (Tab.2).
Daher haben wir die von uns benutzten Gallenblasengallenproben in drei Verdünnungs-
stufen (Gallenblasengalle konzentriert; 20 %; 10 %) auf ihre Blutkontamination
getestet, um lediglich Proben mit Verunreinigungen des biliären Immunglobulins A
durch weniger als 1 % humorales Immunglobulin A einzuschließen.
3 Ergebnisse26
Die von uns getesteten 50 Gallenblasengallen (Proben) symptomatischer
Gallensteinträger wurden direkt vor der Durchführung des Tests entsprechend verdünnt.
Die 29 bei der stärksten Verdünnung (10 %) negativ getesteten Proben wurden im
Weiteren zur Gewinnung von Immunglobulin A genutzt.
Das Probenvolumen lag im Mittel bei 17,9 ±9,5 ml. Von den 29 Proben wurden jeweils
2 ml zur Bestimmung der Konzentration von Immunglobulin A zurückgehalten und bis
zur weiteren Verwendung bei -70 °C gelagert. Die Proben wurden dann
ultrazentrifugiert, um das unlösliche Mucin und andere unlösliche Bestandteile
weitgehend zu entfernen. Bei fünf Proben wurde in den verschiedenen Fraktionen
(aufschwimmende Lipidfraktion/ Gallenlösung/ Sediment) mittels ELISA die
Konzentration von Immunglobulin A bestimmt.
Die Verteilung ergab, dass das Immunglobulin A mit einer mittleren Konzentration von
158,8 mg/l in der Mucinfraktion signifikant (p<0,05) erniedrigt gegenüber der
Konzentration in der Gallenblasengalle mit 423,2 mg/l war. Nicht signifikant
unterschieden sich die Konzentrationen des Immunglobulin A in der Gallenlösung
(c = 418,2 mg/l) und im Sediment (c = 659,2 m/l).
3.2 Immunglobulin A-Gewinnung
Um den Reinheitsgrad des Immunglobulin A zu maximieren, wurden zwei
Affinitätschromatographie-Methoden verwendet. Die besonders gut geeignete
Isolierung der Proteinfraktion mit Hilfe von Concanavalin A Lectin59,60,61 wurde
verwendet, um das lösliche Mucin, das nicht an Concanavalin A bindet, und Lipide aus
der Gallenlösung zu entfernen. Um Immunglobulin A aus der gewonnenen
Proteinfraktion zu extrahieren, wurde dann eine Immunaffinitätssäule eingesetzt.
3.2.1 IgA-Immunaffinitätschromatographie
Aus der mittels Con A Affinitätschromatographie gewonnenen Proteinfraktion wurde
anschließend das Immunglobulin A isoliert.
3 Ergebnisse 27
0
0,01
0,02
0,03
0,04
1 3 5 7 9 11 13
Fraktion
Ext
inkt
ion
Abb. 3: Qualitative Abschätzungder Fraktionen des Eluats der a-IgA Immunaffinitätssäule.
Die qualitative Abschätzung der Fraktionen des Eluats der a-IgA Immunaffinitätssäule
erfolgte photometrisch (Abb.3) und mittels Auftrennung durch eindimensionale
Elektrophorese (Abb.4) entsprechend des Molekulargewichtes (MG).
MG[kD]
Abb. 4: Mit den Fraktionen (Fr) 1 bis 11, 12 und 15 und der ungebundenen Fraktion (IA-Unbound) derImmunaffinitätssäule (IA) wurde ein qualitatives Gel erstellt.
Als Standard dienten ein Proteinstandard (Kontrolle) und Immunglobulin A(IgA-Std).
3 Ergebnisse28
In der Auftrennung (Abb.4) zeigte sich, dass die gebundene Fraktion in den ersten
10 ml (Fr 1-11) gut eluiert war. In der Abbildung 4 sind die Anteile des
Immunglobulin A (Fr 1-11) sichtbar: Die schweren Ketten (63 kD), die leichten Ketten
(28 kD), die sekretorische Komponente (74 kD) und die Joining-Chain (16 kD) sowie
eine zusätzliche Bande bei ungefähr 55 kD, die sich im IgA-Standard (IgA-Std) nicht
darstellt. In der ungebundenen Fraktion fehlen diese Banden nahezu vollständig.
Die Bindungskapazität der a-IgA Immunaffinitätssäule wurde durch Läufe mit
unterschiedlichem Immunglobulin A-Gehalt der Proben ermittelt (Tab.3).
Immunglobulin A-Gehalt [mg]EingewogeneIgA-Probe
[mg]gebundene Fraktion ungebundene
Fraktion
Anteil des in derungebundenen Fraktion
vorhandenen IgA5 2436,2 510,0 17,3 %
4 1527,1 429,6 22,0 %
2 1343,9 78,3 5,5 %
1 267,0 20,4 7,1 %
Tab. 3: Vergleich des Gehaltes an Immunglobulin A in der gebundenen und ungebundenen Fraktion derImmunaffinitätssäule bei unterschiedlicher Menge an eingesetztem Protein.Die Konzentrationen wurde mittels ELISA gegen einen Standard ermittelt.
Um die Ausbeute zu maximieren, wurden daher Proben mit einem Gehalt von 2 mg
Immunglobulin A auf die Immunaffinitätssäule aufgetragen.
3.3 Bestimmung der IgA-Konzentration in humaner Gallenblasengalle
Die Lebergalle wird bei nüchternen Patienten in der Gallenblase gesammelt und
konzentriert. Der Gewinnung der Gallenblasengalle, die während der Cholezystektomie
erfolgt, geht immer eine Nahrungskarenz des Patienten voraus. Daher ist die
Konzentration des Immunglobulin A stark abhängig vom Operationszeitpunkt bzw. der
präoperativen Nahrungskarenzzeit.
3 Ergebnisse 29
Die in der Literatur vorhandenen Angaben für die Immunglobulin A-Konzentration in
Galle variieren stark62,24. Der genaue Vorgang der Probengewinnung ist dabei teilweise
nicht zu eruieren. Für die weiteren Untersuchungen war es nötig, die Konzentration von
Immunglobulin A genau und kostengünstig zu messen. In den verwendeten
Gallenblasengallen wurden mittels ELISA (bzw. RID) die IgA-Konzentrationen
bestimmt.
3.3.1 RID
Die zur Bestimmung zuerst eingesetzte radiale Immunodiffusion ließ nur eine
semiquantitative Bestimmung der Immunglobulin A-Konzentrationen zu, da die Größen
der Präzipitationskreise nur näherungsweise bestimmt werden konnten.
Der in Doppelbestimmung gemessene Standard (5 mg IgA/l) wurde mit einer
Immunglobulin A-Konzentration von 5,9 mg/l relativ genau, die zufällig ausgewählte
Gallenblasengalle mit 178 mg/l gegenüber der im ELISA bestimmten Konzentration
von 305 mg/l zu niedrig gemessen.
3.3.2 ELISA
Für den normalen ELISA wurde mit Immunglobulin A-Standard in mehreren
Verdünnungsreihen ein intraassay-Variationskoeffizient von 4,4 errechnet. Der
interassay-Variationskoeffizient betrug 5,1.
Die Spezifität des Immunglobulin A-Assays für die Messung von IgA wurde im
Vergleich mit einem anderen humanen Immunglobulin bestimmt. Im Vergleich mit
Immunglobulin G, dem anderen in Gallenblasengalle in großer Konzentration
vorkommenden Immungloblin, konnte eine mittlere Spezifität von 1:283 (1:106 bis
1:714) für Immunglobulin A ermittelt werden.
Mit diesem Assay wurde in 28 Gallenblasengallen die Immunglobulin A-
Konzentrationen gemessen. Diese lagen zwischen 12,9 mg/l und 1004,2 mg/l mit einem
Mittel von 353,4 ±272,5 mg/l.
3 Ergebnisse30
Abb. 5: Immunglobulin A-Konzentrationen in Gallenblasengalle
Bei der graphischen Auftragung der Werte (Abb.5) gruppieren sich die gemessenen
Konzentrationen um zwei Werte. Die unteren zwei Drittel der ermittelten
Konzentrationen liegen zwischen 130 mg/l und 350 mg/l bei einem Mittel von
218 mg/l. Die hohen Konzentrationen liegen mit einem Mittel von 777 mg/l auf dem
oberen Plateau.
3.4 Vergleich von kolostralem und biliärem IgA
Es wurden verschiedene Untersuchungen durchgeführt, in denen biliäres Immun-
globulin A mit Immunglobulin A aus anderen Quellen (Kolostrum) verglichen wurde.
Mit der Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation wurde der Anteil von mono- und
dimerem Immunglobulin A in biliärem und kolostralem Immunglobulin quantifiziert.
Im Kristall-ELISA wurden die Unterschiede in der Cholesterinbindungsfähigkeit der
unterschiedlichen Immunglobuline ermittelt. Der Kristallisationsversuch diente dem
Vergleich des unterschiedlichen Einflusses auf die Cholesterinkristallisation.
IgA in Gallenblasengalle
0
200
400
600
800
1000
1200 I
gA [
mg/
l]
3 Ergebnisse 31
3.4.1 Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation
In den gewonnenen 43 Fraktionen wurde die Immunglobulin A-Konzentration
gemessen und die relativen Werte aufsummiert dargestellt (Abb.6).
Der Anteil des dimeren am kolostralen Immunglobulin A wird recht konstant mit
95 %62,63 angegeben und war in den ersten 17 Fraktionen enthalten. In diesen
Fraktionen sind 57 % des biliären Immunglobulins A enthalten.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 11 21 31 41
Fraktion
aufs
um
mie
rt c
(Ig
A)
[%]
biliäres IgA kolostrales IgA
Abb. 6: Aufsummierte relative IgA-Konzentration in den einzelnen Fraktionen einerDichtegradzentrifugation
Somit liegen in unserem Gallenblasengallenpool 57 % des Immunglobulin A in dimerer
Form vor.
3.4.2 Kristall-ELISA
Die Kristallbindungsfähigkeit des Immunglobulins A aus verschiedenen Quellen an
Cholesterikristalle wurde mittels ELISA ermittelt. Dabei wurden an Assayplatten
Cholesterinkristalle immobilisiert. Die ermittelten relativen Konzentrationen ergaben im
3 Ergebnisse32
Verhältnis zu der im normalen ELISA ermittelten Konzentration einen Wert für die
Kristallbindungsaktivität des verwendeten Immunglobulins A.
Zur Ermittlung der optimalen Cholesterinkonzentration in der Lösung zur Beschichtung
der Platten wurden zunächst verschiedene Platten mit jeweils unterschiedlichen
Konzentrationen eingesetzt. Auf diesen Platten wurde dann der intrassay-
Variationskoeffizient und das Q25/ Q75- Quantil bestimmt (Abb.7).
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0 2 4 6 8 10 12
Cholesterin [g/l Ethanol]
Interquantilabstand Q75/ Q25 Variationskoeffizient
Abb. 7: Interquantilabstand und Variationskoeffizient bei unterschiedlichenCholesterinkonzentrationen in der Lösung zur Beschichtung der Platten im Kristall-ELISA
Da der kleinste Variationskoeffizient bei einer Konzentration von 2,5 g Cholesterin/l
Ethanol (95 %) ermittelt wurde, wurden im Folgenden zur Beschichtung Lösungen mit
dieser Cholesterinkonzentration verwendet.
Die gemessenen IgA-Konzentrationen in Gallenblasengallen schwankten bei gleicher
Probe sehr stark (>10x). Dies wurde auf die variablen Wechselwirkungen von in
Gallenblasengalle gelösten Stoffen mit den Cholesterinkristallen zurückgeführt. Daher
wurde gereinigtes biliäres Immunglobulin A, das mittels der Concanavalin A- und
Immunaffinitätschromatographie aus Gallenblasengallen gewonnen worden war (siehe
4.2 und 4.2.1), verwendet.
3 Ergebnisse 33
In fünf aus Gallenblasengallen gewonnenen biliären Immunglobulin A-Proben wurde
im normalen und im Kristall-ELISA die Immunglobulin A-Konzentrationen bestimmt.
Kolostrales Immunglobulin A wurde als Standard und zum Vergleich eingesetzt.
Probe Relative IgA-
Konzentration
Normaler ELISA
Relative IgA-
Konzentration
Kristall-ELISA
Quotient
c(Kristall-ELISA)/
c(normaler ELISA)
Kolostrale Probe 1,00 1,00 1,0
biliäre Probe 1 0,13 1,16 8,7
biliäre Probe 2 0,52 8,52 16,5
biliäre Probe 3 0,24 1,37 5,7
biliäre Probe 4 0,36 0,60 1,7
biliäre Probe 5 0,20 3,73 18,6
Tab. 4: Biliäres IgA im normalen und Kristall-ELISA im Vergleich zu kolostralem IgA
Dabei hatten die biliären Proben im Kristall-ELISA gegenüber dem normalen ELISA
eine signifikant (p<0,05) höhere Konzentration (1,7 - 18,6x).
3.4.3 Cholesterinkristallisationstest
Im Kristallisationstest wurde der Einfluss von kolostralem und biliärem
Immunglobulin A auf die Cholesterinkristallisation getestet.
Die Tabelle 5 zeigt die ermittelten Extinktionen der unterschiedlichen Proben zu den
jeweiligen Zeitpunkten. In Abbildung 8 sind die gemessenen Extinktionen für die
verschiedenen Proben gemittelt über die Zeit aufgetragen.
3 Ergebnisse34
Zeit (h) 0 20,5 26 43,5 49 66,5 96 117 141
c(IAb) 0,5 52 0 12 409 520 910 1038 1071 1013
0,5 11 4 0 96 159 921 1389 1445 936
2,5 0 3 42 134 99 571 746 770 1064
2,5 19 17 12 126 199 625 831 941 922
5 19 23 58 112 101 309 592 362 995
5 33 29 87 629 507 874 883 894 929
10 12 20 71 407 482 772 1143 957 988
10 24 25 63 462 517 755 735 1127 849
20 17 0 27 197 364 523 829 770 832
c(IAcol) 0,5 39 20 32 343 785 1639 1571 1167 1507
0,5 32 7 73 151 269 1590 1813 2034
2,5 41 11 34 608 920 1454 1734 1596 1395
2,5 58 12 28 503 750 1060 1494 819 1336
5 47 33 25 564 614 1035 1600 1550 1092
5 65 16 57 608 736 935 703 912 832
10 38 11 35 306 456 1490 1145 1553 1372
10 52 28 38 301 311 1157 873 1398 1142
20 45 32 108 1121 1605 1824 1533 1869 2111
20 30 22 41 912 1472 1857 2181 2019 1750
Kontrolle K1 87 31 60 352 582 1091 1286 1316 1222
K2 63 20 34 725 1074 1505 1445 1563 1327
Tab. 5: Extinktionen (x10-4) der Proben im Wachstumsversuch mitkolostralem und biliärem Immunglobulin A im Vergleich.
(IAb: gebundener Anteil der mit der ConA-Fraktion der Gallenblasengallen beschicktenImmunaffinätätssäule; IAcol: kolostrales Immunglobulin A gereinigt über Immunaffinitätssäule)
3 Ergebnisse 35
0200400600800
1000120014001600
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132
Zeit [h]
Ext
inkt
ion
[x10
E-4
]
Kontrolle biliäres IgA kolostrales IgA
Abb. 8: Extinktionszunahme der Proben im Wachstumsversuch durch fortschreitendeCholesterinkristallisation
Während das kolostrale Immunglobulin A in den getesteten Konzentrationen keinen
Einfluss auf die Kristallisation ausübte, zeigte das biliäre eine signifikante Inhibition der
Kristallbildung. In der Varianzanalyse unterschieden sich die Extinktionen im
Einzelvergleich der Zeitpunkte ab dem fünften Messzeitpunkt (48 h) signifikant
(p<0,01). Der relative Vergleich der biliären und kolostralen Probe ergab in der
Varianzanalyse unter Einbeziehung des ersten bis dritten Wertes als Grundwert eine
ebenso signifikante Abweichung der beiden Kurven ab dem fünften Messwert.
3.5 Optische Darstellung der IgA-Kristallbindung
3.5.1 TEM
Die Cholesterinkristalle konnten mittels Transmissionelektronenmikroskopie nicht
dargestellt werden. Es kam im Rahmen der Fokussierung des Elektronenstrahls zur
Verflüssigung der Kristalle, welche auch durch Variation der Kristallpräparation nicht
zu beeinflussen war.
3 Ergebnisse36
3.5.2 Fluoreszenzmikroskopie
Die Antikörperbindung an die synthetisierten Cholesterinkristalle wurde mit an
Fluorescein-Isothiocyanat gekoppelten Antikörpern gegen humanes Immunglobulin A
nachgewiesen.
Die Bindungsstellen der Kristalle, die mit Albumin gegen unspezifische Bindung
geblockt wurden, zeigten eine erhöhte Affinität für Immunglobuline.
Im unbearbeiteten Bild zeigten die Kristalle eine gegenüber der Umgebung
(Grundfluoreszenz) deutlich gesteigerte Fluoreszenz (Abb.9).
Abb. 9: Kristall im Phasenkontrastbild/ in der Auflicht-Fluoreszenz/ in der Durchlichtmikroskopie
Die aufgenommenen Fluoreszenzbilder wurden dann über die in der
Durchlichtmikroskopie aufgenommenen Bilder projiziert (Abb.10).
3 Ergebnisse 37
Abb. 10: Extrahierte Fluoreszenzinformationen, auf Kristallbild projiziert
In der Auflicht-Fluoreszenz zeigten die Seiten und Bruchkanten der Kristalle die größte
Aktivität.
3 Ergebnisse38
Bei dem Einsatz des fluoreszierenden Antikörpers ohne vorhergehende Inkubation mit
Immunglobulin A fehlte die Kristallfluoreszenz und der Kristall hob sich als deutliche
Aussparung in der Grundaktivität vom Hintergrund ab.
Die Spezifität des an Fluorescein-Isothiocyanat gekoppelten Antikörpers wurde
gegenüber einem mit Immunglobulin G beschichteten Cholesterinkristall ermittelt. Der
Kristall zeigte sich dabei wenig fluoreszierend und hob sich deutlich als Aussparung
vom fluoreszierenden Hintergrund ab (Abb.11).
Abb. 11: Mit Immunglobulin G inkubierter Kristall, der dann mit einem gegen IgA gerichteten und mitFluorescein-Isothiocyanat gekoppelten Antikörper behandelt wurde
4 Diskussion 39
4 Diskussion
In der Gallenblasengalle liegt Cholesterin in einfachen und gemischten Mizellen gelöst
vor. Bei einer Änderung dieses Gleichgewichtes kommt es zur Bildung cholesterin-
reicher Vesikel, die nach Fusion zur Ausbildung multilamellärer Strukturen und zur
Kristallpräzipitation neigen64. Als Voraussetzung für die Gallensteinbildung muss eine
Übersättigung der Gallenblasengalle mit Cholesterin vorliegen9. Allerdings bilden sich
nur bei etwa der Hälfte der Patienten mit einer Cholesterinübersättigung Gallensteine14.
Auch bei gesunden (gallensteinfreien) Patienten liegt in 50 - 70% eine Übersättigung
der Gallenblasengalle mit Cholesterin vor65. Daher kommen den anderen beiden
pathogenetischen Schlüsselfaktoren der Cholesterincholelithiasis, den die Kinetik der
Kristallisation beeinflussenden Substanzen und der Gallenblasenmotilitätstörung,
besondere Aufmerksamkeit zu. Voraussetzung für eine Cholesterinsteinbildung ist die
oben beschriebene Bildung von Mikrokristallen (Kristallisation). Durch eine Störung
der Gallenblasenmotilität und einer Verlängerung der Verweilzeit wird dann das
Gallensteinwachstum gefördert und die Elimination der gebildeten Kristalle aus der
Gallenblase verringert.
Generell zeigen Patienten mit Gallenblasensteinen einen höheren Proteingehalt der
Gallenblasengalle66. Denaturierung dieser Proteine führt zu einer verzögerten
Kristallisation; dieser Effekt kann durch Zugabe geringer Mengen nicht denaturierter
Gallenblasengalle aufgehoben werden62,67. Die Zugabe eines Proteinextrakts aus
Gallenblasengalle Gesunder bewirkt dagegen eine verzögerte Nukleation68. Es
existieren also in der Proteinfraktion der Galle sowohl nukleationsfördernde als auch
nukleationshemmende Proteine.
Die Proteine, die Einfluss auf die Kinetik der Nukleation und das weitere Wachstum der
Cholesterinkristalle haben, sind in Tab. 6 zusammengefasst. Die mit der
Concanavalin A-Affinitätschromatographie gewonnene Proteinfraktion hat einen
fördernden Einfluss auf die Nukleation. Als möglicher Promotor in dieser Fraktion
wurde Phospholipase C identifiziert69. Als weitere Promotoren wurde ein 42kD
Glykoprotein (α1-saures-Glykoprotein) 70,71,72, sowie ein 130kD Glykoprotein
4 Diskussion40
(Aminopeptidase N)61,73 und Gallenblasenmucin74 identifiziert. Als
nukleationsverzögernd wurden Apolipoprotein A-I75,76 und A-II76 beschrieben. Bei den
untersuchten Immunglobulinen zeigen Immunglobulin G und ebenfalls
Immunglobulin M77 einen nukleationsfördernden Effekt, während für Immunglobulin A
von Busch et al. einen negativer Einfluss auf die Nukleation nachgewiesen wurde17.
Promotoren Inhibitoren
Phospholipase C
α1-saures Glykoprotein
Aminopeptidase N
Immunglobulin G
Immunglobulin M
Gallenblasenmucin
Apolipoprotein A-I und A-II
Immunglobulin A
Tab. 6: Promotoren und Inhibitoren der Cholesterinkristallisation und des Gallensteinwachstums
4.1 Cholesterinkristallisationstest
In dieser Arbeit wurde die Gallenblasengalle symptomatischer Gallenblasensteinträger
für weitere Untersuchungen benutzt. Aus der Gallenblasengalle wurde biliäres
Immunglobulin A gewonnen und mittels verschiedener affinitätschromatographischer
Verfahren gereinigt.
In unserem Cholesterinkristallisationstest wirkte biliäres Immunglobulin A als Inhibitor
der Kristallisation. Dabei änderte sich die Morphologie der Kristalle, die unter
Anwesenheit von Immunglobulin A gewachsen waren16. Kolostrales Immunglobulin A
zeigte hingegen keinen Einfluss auf die Wachstumsgeschwindigkeit. Der Unterschied
zwischen biliärem und kolostralem Immunglobulin A war signifikant. Der kompaktere
Aufbau der Kristalle und die Verlangsamung der Kristallisation bei Steinwachstum
unter Anwesenheit von biliärem Immunglobulin A ließen eine Bindung des biliären
Immunglobulin A an Cholesterin vermuten. Eine solche Bindung könnte sowohl den
4 Diskussion 41
modifizierten Kristallaufbau als auch die Änderung der Wachstumsgeschwindigkeit
erklären. Die durchgeführten Untersuchungen zur visuellen Darstellung der IgA-
Cholesterinkristallbindung bestätigen diese Hypothese. Auf Cholesterinkristallen, die
mit biliärem Immunglobulin A inkubiert worden waren ließ sich mittels Fluoreszenz-
untersuchung IgA nachweisen.
Die Bildung spezifischer Antikörper gegen Cholesterin wurden bereits im Tierversuch
bei einer Reihe von Substanzen nachgewiesen. So bilden Kaninchen in
Modelluntersuchungen zum Anti-Phospholipid-Syndrom Antikörper gegen saure
Phospholipide (Cardiolipin, Phosphatidylinositol), die dann in verschiedenen Assays
nachgewiesen wurden78-82. Darauf aufbauend konnte mit Hilfe einer Impfung mit
cholesterinreichen Liposomen die Produktion von Antikörpern gegen Cholesterin, VDL
und LDL in Mäusen und Kaninchen nachgewiesen werden83-85. Die antigenen
Strukturen des Cholesterin war dabei die polare C3-Hydroxylgruppe84,85. Dabei zeigten
immunisierte Kaninchen bei der Verabreichung einer cholesterinreichen Diät einen
signifikant geringeren Anstieg des Serumcholesterinspiegel als nicht immunisierte
Kaninchen85.
Das biliäre IgA wird im Gegensatz zum biliären IgG, dass durch passiven vom
Molekulargewicht abhängigem Transport in die Galle gelangt, zum großen Teil lokal in
der Submukosa produziert. Das IgA wird dann mit Hilfe der sekretorischen
Komponente durch einen endocytischen vesikulären Transport in das Lumen der
Gallenwege sezerniert. Möglicherweise bildet auch der Mensch spezifische biliäre
Antikörper gegen Cholesterin. Biliäres Cholesterin in gelöster und kristalliner Form
könnte nach Inkorporation oder Aufnahme in die Mukosa zu einer Aktivierung
immunkompetenter und Antikörper-synthetisierender Zellen führen. Durch diese
spezifische Interaktion des biliären Immunglobulins A mit Cholesterinkristallen könnte
die von Busch et al.17 beschriebene Modifikation des Kristallaufbaus und der
inhibitorische Effekt auf die Gallensteinbildung erklärt werden.
4 Diskussion42
4.2 Kristall-ELISA
Zur Bestimmung der IgA-Konzentration in verschiedenen Galleproben wurde zunächst
ein ELISA validiert. Unter der Annahme, dass bei einer spezifischen Bindung das
biliäre IgA an Cholesterinkristalle binden und diese Bindung die Reinigungsschritte
überdauern würde, wurde zur Quantifizierung der Cholesterinbindungsfähigkeit
zusätzlich ein Kristall-ELISA entwickelt. Hierzu wurden Cholesterinmono-
hydratkristalle als primäres Antigen an einer apolaren Oberfläche immobilisiert. Als
sekundärer Antikörper wurde IgA aus verschiedenen Quellen und als tertiärer ein
enzymgekoppelter Antikörper verwendet. Aufgrund zahlreicher verschiedener in
Gallenblasengalle vorkommender (Glyko-) Proteine, die zu einer Instabilität des
Kristall-ELISAs führten, wurde Immunglobulin A zunächst aus den verschiedenen
Galleproben mittels Zentrifugation und zweier Chromatographieverfahren gereinigt.
Die gleiche Untersuchung wurde mit gereinigtem kolostralen Immunglobulin A
durchgeführt. Gegenüber dem IgA-Pool aus Kolostrum zeigte biliäres IgA im Kristall-
ELISA eine im Mittel 10fach erhöhte Affinität zu Cholesterin. Diese hohe Affinität
spricht für eine spezifische Bindung des biliären Immunglobulins A an Cholesterin-
kristalle. Die optische Darstellung der Antikörper-Kristallbindung mittels
fluoreszierenden Antikörpern zeigte dabei eine homogene Verteilung der Fluoreszenz-
aktivität auf dem Kristall.
Bei einer spezifischen Bindung wäre eine interindividuell unterschiedliche
Beeinflussung des Kristallwachstums durch das Immunglobulin A je nach Prägung des
variablen Anteiles möglich. Weitere Untersuchungen unter dem Einsatz von
Immunglobulin A-Proben mit unterschiedlicher Cholesterinbindungsfähigkeit im
Wachstumsassay könnten im Vergleich zeigen, ob hier ein direkter Zusammenhang
zwischen Cholesterinbindungsfähigkeit und hemmendem Einfluss auf die
Cholesterinkristallisation besteht.
5 Zusammenfassung 43
5 Zusammenfassung
Biliäres Immunglobulin A moduliert die Cholesterinkristallisation. In dieser Arbeit
wurde Immunglobulin A aus humaner Gallenblasengalle gewonnen und sein Einfluss
auf die Cholesterinkristallisation und die Kristallbindung in vitro quantifiziert. Hierfür
wurde ein neuer Assay zur Kristallbindung entwickelt und evaluiert.
1. Es wurde humanes biliäres Immunglobulin A gewonnen und mittels verschiedener
affinitätschromatographischer Verfahren gereinigt.
2. Es wurde eine vergleichender Cholesterinkristallisationstest mit kolostralem und
biliärem Immunglobulin A durchgeführt. Hierbei zeigte biliäres Immunglobulin A
eine signifikante Hemmung der Kristallisation, während kolostrales
Immunglobulin A keinen Einfluss auf die Kristallisation hatte.
3. Ausgehend von einer Methode zur Bestimmung der Immunglobulin A-
Konzentration in Gallenblasengalle wurde ein Cholesterinkristall-ELISA entwickelt
und evaluiert. Damit steht ein Instrument zur quantitativen Bestimmung der
relativen Kristallbindungsfähigkeit biliärer Inhibitorproteine zur Verfügung. Biliäres
Immunglobulin A zeigte im Vergleich zu kolostralem Immunglobulin A eine
deutlich höhere Bindung an Cholesterinkristalle bei hoher interindividueller
Variabilität.
4. Die Bindung von Immunglobulin A an Cholesterinmonohydratkristalle wurde
mittels Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Sie erwies sich als gleichmäßig.
Desweiteren konnte eine spezifische Bindung des Immunglobulin A an
Cholesterinkristalle nachgewiesen werden, so dass eine Beeinflussung der
Cholesterinkristallisation durch diese spezifische Bindung anzunehmen ist.
Weitergehende Untersuchungen individueller IgA-Pools in Bezug auf Ihre
Kristallbindung und ihren Einfluß auf die Cholesterinkristallisation könnten den Einfluß
von IgA auf die Kristallisation weiter spezifizieren und damit das Verständnis über die
Pathogenese der Gallensteinbildung erweitern.
5 Zusammenfassung44
5 Zusammenfassung 45
Abkürzungsverzeichnis
a-IgA Antikörper gegen humanes Immunglobulin A
a-IgG Antikörper gegen humanes Immunglobulin G
Ak Antikörper
BSA bovines Serumalbumin
c(...) Konzentration
Con A Concanavalin A Lectin
CSI Cholesterinsättigungsindex
E Extinktion
EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäure
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
Hb Hämoglobin
HRP Horseradish Peroxidase
IgA Immunglobulin A
IgG Immunglobulin G
J-Chain Joining Chain
kD Kilodalton
LDL Low-density Lipoproteine
m/v Masse/Volumen
NAD Nicotinamidadenindinucleotid
PBS Phosphat Buffered Saline
PMSF Phenylmethansulfonylfluorid
RID Radiale Immunodiffusion
RWTH Rheinisch-Westfälische Hochschule Aachen
SDS Natriumdodecylsulfat
STDC Taurodeoxycholsäure
TBS TRIS Buffered Saline
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
TM Trademark
TRIS Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan
5 Zusammenfassung46
UpM Umdrehungen pro Minute
VLDL Very Low-density Lipoproteine
v/v Volumen/Volumen
6 Literaturverzeichnis 47
6 Literaturverzeichnis
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Die vorliegende Arbeit wurde von 1995 bis 2000 im biochemischen Labor der
Medizinischen Klinik III der RWTH Aachen angefertigt. Ich danke
Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Dipl.-Biochem. S. Matern, Direktor der Medizinischen
Klinik III der RWTH Aachen, sehr herzlich, daß er mir die Durchführung der Arbeit in
seiner Forschungsgruppe ermöglichte und durch optimale Rahmenbedingungen
unterstützte.
Herrn Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Norbert Busch für die kompetente und motivierende
Betreuung.
Herrn PD Dr. med. Frank Lammert für die ausführlichen und fruchtbaren Diskussionen,
für die er jederzeit zur Verfügung stand.
Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Schumpelick, Direktor der Chirurgischen Klinik der RWTH
Aachen und Herrn Prof. Dr. med. G. Müller Chefarzt der Chirurgischen Abteilung des
Luisenhospitals Aachen für die Sammlung der Gallenproben im Rahmen der
Cholecystektomien.
Darüber hinaus danke ich Frau Ingrid Franz für die sehr gute technische Assistenz,
Herrn Dr. rer. nat. H. G. Hollweg, Pathologie der RWTH Aachen und Herrn Dr. H.
Klahr, Gemeinschaftslabor für Elektronenmikroskopie der RWTH Aachen für Beratung
bei und Durchführung der transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen
und Herrn Dipl.-Math. Thorsten Reineke, Institut für Medizinische Informatik für die
Beratung bei der statistischen Auswertung.
Curriculum vitae
Name: Stefan Südfeld
Geburtsdatum: 14.12.1970 in Werne an der Lippe
Familienstand: verheiratet seit 13.8.1999, eine Tochter
Schulbildung:
1977-1981: Grundschule Nordenstadt, Friedrich-Schiller-Grundschule Wiesbaden
1981-1990: Helene-Lange-Gymnasium und Tagesheimgymnasium Kerpen
Zivildienst: 08/90 - 10/91 Rettungsdienst der Berufsfeuerwehr Detmold
Studium:
1992-1999 Studium der Humanmedizin an der RWTH Aachen
08 / 1994 Ärztliche Vorprüfung
04 / 1996 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04 / 1998 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
1998-1999 Praktisches Jahres in der Chirurgischen, Medizinischen und
Neurologischen Klinik des Knappschaftskrankenhauses Bardenberg
10 / 1999 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Beruf:
seit 12 / 1999 Tätigkeit als Arzt im Praktikum/ Arzt in der Medizinischen
Klinik III des Universitätsklinikums der RWTH Aachen