Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit Einfluss auf Entwicklung und Erhalt des Knorpel-/Knochen-Systems
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-
Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Andreas Tagariello
aus Wuppertal
Erlangen, 2005
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen
Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung:
21.12.2005 Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. D.P. Häder Erstberichterstatter:
Prof. Dr. A. Winterpacht Zweitberichterstatter:
PD Dr. R. Slany
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung…………………………………………………….……. 1 1.1 Knorpel- und Knochenentwicklung……..……………………………… 1 1.1.1 Enchondrale Ossifikation am Beispiel von Röhrenknochen……..….. 2 1.1.2 Desmale Ossifikation am Beispiel der Schädeldachknochen………. 7 1.2 Erkrankungen des Knorpel-/Knochen-Gewebes………………..……. 10 1.2.1 Chondrodysplasien………………………………………………………. 10 1.2.2 Kraniosynostosen………………………………………………….…….. 11 1.2.3 Osteoarthrose und rheumatoide Arthritis……………………….……... 13 1.3 Zielsetzung……………….………………………………………………….
17
2. Material und Methoden………………………………………….. 18 2.2 Isolierung von DNA…………………………………………..……………. 18 2.2.1 Isolierung von genomischer DNA aus Blut…………………….……… 18 2.2.2 Alkalische Lyse zur Mini-Präparation von Plasmid-DNA……………. 18 2.2.3 Midi- und Maxi-Plasmid-DNA-Präparation mit Hilfe einer
Affinitätssäule………………………………………………..……………
19 2.3 Isolierung von RNA………………………………………………..………. 20 2.3.1 Isolierung von RNA aus eukaryontischen Zellkulturen………………. 20 2.3.2 Isolierung von RNA aus menschlichem und murinem Gewebe….…. 20 2.3.3 DNase I-Behandlung von RNA……………………………..………….. 20 2.4 RNA- und DNA-Standardmethoden…………………….……………….. 21 2.4.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen…………..……... 21 2.4.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA und RNA……………………... 21 2.4.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen………..……….. 21 2.4.4 Fällung von DNA und RNA……………………………………………... 21 2.5 Klonierung…………………………………………………………………… 22 2.5.1 Klonieren von PCR-Produkten………………………………..………... 22 2.5.2 Subklonierung von DNA-Fragmenten………………………….……… 22 2.5.3 Transformation und Selektion positiver Klone…………….………….. 23 2.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)…………………………….………… 23 2.7 RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion)….…... 24 2.8 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)……………………….…… 24 2.9 Quantitative „Real-Time“-PCR…………………………………………… 24 2.10 „Random primed oligo labelling“……………………………………….. 25 2.11 Ligation von T7-Promotoren an PCR-Produkten…………………..… 26 2.12 DIG-RNA-Labelling durch in vitro-Transkription…………….……….. 26
- II -
Inhaltsverzeichnis
2.13 DNA-RNA-Hybridisierung (Northern-Hybridisierung)……………….. 27 2.14 DNA-RNA-Hybridisierung (Dot-Blot-Hybridisierung)………………… 27 2.15 DNA-DNA-Hybridisierung…………………………………………………. 27 2.16 DNA-Sequenzierung……………………………………………..………… 28 2.17 RNA-in situ-Hybridisierung von Gewebeschnitten………….……….. 28 2.18 Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH)…………………………….. 29 2.18.1 Nicktranslation für direkt markierte Sonden………………….……….. 29 2.18.2 Herstellung und Vorbehandlung der Chromosomenpräparate……... 30 2.18.3 Denaturierung und Hybridisierung………………………………..……. 31 2.18.4 Posthybridisierungswaschung………………………………………..… 31 2.19 Zellbiologische Methoden………………………………………………... 31 2.19.1 Kultur von adhärent wachsenden Zellen……………………………… 31 2.19.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen……………………………….…... 32 2.19.3 Transfektion von adhärenten Zellen…………………………………... 32 2.20 Computerauswertungen…………………………………………………. 32 2.20.1 Computerauswertung einer cDNA-Bibliothek………………….……... 32 2.20.2 Computerauswertung von DNA- und Protein-Sequenzen……..……. 33 2.21 Reagenzien und Materialien……………………………………………... 34 2.21.1 Puffer und Lösungen…………………………………………………….. 34 2.21.2 Eukaryontische Zellen…………………………………………………… 36 2.21.3 Chemikalien, Enzyme, Molekulargewichtsstandards,
Zellkulturmedien…………………………………………………………..
36 2.21.4 Geräte……………………………………..………………………………. 38 2.21.5 Kits……………………………………….…………..……………………. 39 2.21.6 Synthetische Oligonukleotide……………………………………………
39
3. Ergebnisse………………………………………………………… 45 3.1 Erstellung eines Expressionsprofils fetaler Wachstumsfugen-
chondrozyten mittels EST-Sequenzierung und funktioneller Charakterisierung ausgewählter Kandidatengene ….……………….
45 3.1.1 Bioinformatische Auswertung von ESTs unter Zuhilfenahme des
Datenbankanalysetools „ESTsweep“….……………………………….45
3.1.2 Systematische Einteilung der ausgewerteten ESTs……………….… 47 3.1.3 Bioinformatische Auswertung von ESTs der „Klasse 1“……………... 49 3.1.3.1 Funktionelle Einteilung der ESTs………………….……….………… 49 3.1.3.2 Expressionsstärke der Gene…………………………………………. 50 3.1.3.3 Expressionsstärke bekannter Matrix auf- und abbauender
Proteine………………………………………………………………….
51
- III -
Inhaltsverzeichnis
3.1.4 Charakterisierung von ESTs der „Klasse 2“ und „Klasse 3“……..….. 54 3.2 Charakterisierung des Klons 68F08…………………………………….. 55 3.3 Charakterisierung des Klons 19C12…………………………………….. 58 3.4 Charakterisierung des Klons 86H12 (ECM3)…………………………... 61 3.4.1 Sequenzierung der humanen ECM3-cDNA…………………………... 62 3.4.2 Analyse der Expression des humanen ECM3-Gens……….………... 63 3.4.3 ECM3 in anderen Spezies…………………………………..………….. 66 3.4.4 ECM3 Expression in Knorpel von Patienten mit Osteoarthrose oder
rheumatoider Arthritis……………………………………………….……
68 3.4.4.1 Etablierung der „Real-Time“-PCR………………………….…….….. 69 3.4.4.2 Expressionsanalyse von ECM3 an Knorpelbiopsaten von
Osteoarthrose-Patienten………………………………………….…...
71 3.4.4.3 Expressionsanalyse von ECM3 an Knorpelbiopsaten von
Patienten mit rheumatoider Arthritis………………………..…….…..
72 3.4.5 ECM3 als positionelles Kandidatengen für die Frontometaphysäre
Dysplasie……………………………….………………………….………
73 3.5 Suche nach Kandidatengenen für Kraniosynostosen…….…..…….. 75 3.5.1 Patientenbeschreibung…………………………………………..……… 75 3.5.2 Zytogenetische Untersuchung………………………………..………… 77 3.5.3 Bruchpunktbestimmung…………………………………………………. 78 3.5.4 Eingrenzung des Bruchpunktes………………………………………... 78 3.5.5 SOX6 als Kandidat für Kraniosynostosen……………………..………. 80 3.5.6 ARM1 als Kandidat für Kraniosynostosen….…………………………. 84 3.5.7 Bruchpunktcharakterisierung auf Chromosom 9q33.1…………..…...
88
4. Diskussion………………………………………………………… 91 4.1 Analyse von EST-Klonen aus einer humanen Chondrozyten-
cDNA-Bibliothek…………………………………………………………….
93 4.1.1 Systematische Einteilung der ausgewerteten ESTs…………….…… 93 4.1.2 Detaillierte Analyse und Charakterisierung von ECM3 (86H12).…... 102 4.1.2.1 Expression und mögliche Funktion des humanen ECM3…….…… 106 4.1.2.2 ECM3 in anderen Spezies……………………………….…………… 107 4.1.2.3 ECM3-Expression in Knorpelbiopsaten von Patienten mit
Osteoarthrose oder rheumatoider Arthritis………………….…..…..
109 4.1.2.4 ECM3 als positioneller Kandidat für Frontometaphysäre
Dysplasie.........................................................................................
112 4.2 Kandidatengene für die Kraniosynostose……………………………... 113 4.2.1 Bruchpunktregion 11p15.2………………………………….……..……. 115
- IV -
Inhaltsverzeichnis
4.2.2 Die Bruchpunktregion 9q33.1………………………….……………..…
119
5. Zusammenfassung ………….….…………………………..…...
123
6. Summary………………………..….………..………………..…...
125
7. Literaturverzeichnis………………………………………………
127
8. Anhang………………………………………………………….….
149
8.1 mRNA-Sequenz von Klon 68F08………………………………………… 149 8.2 mRNA-Sequenz von Klon 19C12………………………………………... 150 8.3 mRNA-Sequenz von Klon 86H12 (ECM3)…………………………….… 150 8.4 Sequenz der bruchpunktüberlappenden PCR zur Validierung des
Bruchpunktes beim untersuchten Kraniosynostose- Patienten…...
151 8.5 Danksagung……………………………………………………..………...... 152 8.6 Lebenslauf…………………………………………………………………… 153 8.7 Veröffentlichungen…………………………………………………........... 154
- V -
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
Verzeichnis der Abbildungen Abb. 1.1: Schematische Darstellung der enchondralen Ossifikation.
3
Abb. 1.2: Alkalische Phosphatase/Safranin O Färbung und schematische Darstellung der Wachstumsfuge.
5
Abb. 1.3: Schädelformationen.
8
Abb. 1.4: Histologische und schematische Darstellung der Schädelnähte.
10
Abb. 3.1: Exemplarisches „ESTsweep“-Ergebnis eines ESTs.
46
Abb. 3.2: Übersicht der prozentualen Klassenverteilung der analysierten ESTs.
47
Abb. 3.3: Funktionelle Einteilung der „bekannten“ Gene („Klasse 1“).
49
Abb. 3.4: Funktionelle Einteilung und prozentuale Verteilung der ESTs, die der Klasse der „bekannten Gene“ zugewiesen wurden.
50
Abb. 3.5: Häufigkeit der ESTs, die Gene unterschiedlicher extrazellulärer Matrix-Proteine repräsentieren.
52
Abb. 3.6: Verteilung der ESTs auf Gene matrixabbauender Proteine.
53
Abb. 3.7: Auswahlkriterien zur Bestimmung der Kandidatengene für weitere experimentelle Analysen.
54
Abb. 3.8: Autoradiogramm eines “Human Multiple Tissue Northern-Blots” (Clontech), der mit einer radioaktiv markierten 68F08-Sonde hybridisiert wurde.
55
Abb. 3.9: Graphische Auswertung der Dot-Blot-Analysen zur Bestimmung der Expressionsstärke des murinen Gens 68F08.
56
Abb. 3.10: Putative Proteinstruktur des Gens 68F08.
56
Abb. 3.11: Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des humanen und murinen 68F08-Proteins.
55
Abb. 3.12: Struktur des humanen 19C12-Gens.
59
Abb. 3.13: Das Autoradiogramm eines “Human Multiple Tissue Northern-Blots” zur Expressionskontrolle von 19C12.
60
Abb. 3.14: Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des humanen und murinen 19C12-Gensproduktes.
61
Abb. 3.15: Strategie zur Komplettierung von ECM3 (rot dargestellt).
62
- VI -
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
Abb. 3.16: Genomische-Struktur des humanen ECM3-Gens.
63
Abb. 3.17: Autoradiogramm der Hybridisierung eines “Human Multiple Tissue“ Northern (MTN)-Blot, mit einer radioaktiv markierten ECM3-Sonde.
64
Abb. 3.18: Das Autoradiogramm eines humanen „Multiple Tissue Expression Array“, der mit der radioaktiv markierten ECM3-Sonde hybridisiert wurde.
65
Abb. 3.19: Percent identity plot (PIP). Interspezies-Vergleich mittels PipMaker zur Identifizierung von orthologen Genen zu ECM3.
67
Abb. 3.20: Amplifikationsgraphen, Standardkurven und Effizienzgeraden für ECM3 und B2M.
70
Abb. 3.21: Relative ECM3-Expression in Knorpelgewebe von Patienten mit Osteoarthrose im Vergleich zu Plazenta-Gewebe.
72
Abb. 3.22: Relative ECM3-Expression in Knorpelgewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis bezogen auf Plazenta-Gewebe.
73
Abb. 3.23: FISH-Analysen mit den BAC-Klonen RP11-846A22 + RP11-177H12 (linke Seite) und RP11-846A22 + CTD-2565C16 (rechte Seite) an Metaphasen von Fibroblasten der Patientin.
74
Abb. 3.24: Kopfaufnahme des an Kraniosynostose erkrankten Patienten.
76
Abb. 3.25: Schädel-Röntgenaufnahmen des untersuchten Kraniosynostose-Patienten.
76
Abb. 3.26: Karyogramm des am Crouzon-Syndrom erkrankten Patienten.
77
Abb. 3.27: Southern-Blot zur Eingrenzung des Bruchpunktes.
79
Abb. 3.28: Bruchpunktüberspannende PCR an Patienten- (unten) und Kontroll-DNA (oben).
80
Abb. 3.29: Bruchpunktregion im Chromosomenbereich 11p15.2 (Darstellung aus USCS-Datenbank).
81
Abb. 3.30: RNA-in situ-Hybridisierung an transversalen Schnitten durch den Schädel einer neugeborenen Maus.
83
Abb. 3.31: Mutiples Alignment der putativen Proteinsequenz von ARM1 und den homologen Proteinen der verschiedenen Spezies.
84
Abb. 3.32: Das Autoradiogramm einer Northern-Analyse mit verschiedenen murinen Geweben zur Expressionskontrolle von Arm1.
85
- VII -
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
Abb. 3.33: RNA-in situ-Hybridisierung an transversalen Kopfschnitten einer neuge-borenen Maus.
87
Abb. 3.34: RNA-in situ-Hybridisierung an Paraffinschnitten von arthrotischem Gelenkknorpel beim Menschen.
88
Abb. 3.35: Ausschnitt der Bruchpunkt umgebenden chromosomalen Region 9q33.1 (USCS).
89
Abb. 3.36: Interspezies-Vergleich mittels Percent identity plot (PipMaker).
90
Abb. 4.1: Verteilung der 1693 Gene (EST-Cluster), die der „Klasse 1“ und der „Klasse 2“ zugeordnet wurden, in Abhängigkeit ihrer Häufigkeit in den EST-Datenbanken (NCBI, blaue Balken).
101
Abb. 4.2: Graphische Darstellung des Ergebnisses der „SignalP 3.0“-Auswertung zur Bestimmung von Signalpeptiden in der Proteinsequenz von ECM3.
103
Abb. 4.3: Multiples Alignment der „Leucin-reichen Repeats“ (LRRs) von ECM3.
104
Abb. 4.4: Graphische Darstellung des Ergebnis der NetNGlyc 1.0 Server (Expasy) Auswertung zur Bestimmung von Bindungsstellen für N-gebundene Oligosaccharide in der Proteinsequenz von ECM3.
105
Abb. 4.5: Alignment der putativen Aminosäuresequenzen von ECM3 zwischen Mensch und Hund.
108
Abb. 4.6: Percent identity plot (PIP). Interspeziesvergleich des ECM3-Gens zwischen Mensch und Rind mittels PipMaker.
108
Abb. 4.7: Evolutionäre Verbindung zwischen einzelnen Spezies der Klasse der Mammalias.
109
Abb. 4.8: Schematische Darstellung der genomischen Organisation und der Proteinstruktur von SOX6 (Spleißvariante 1).
116
Verzeichnis der Tabellen Tab. 1.1: Zeitpunkt der Verknöcherung der Schädelnähte und
Fontanellen beim Menschen.
8
Tab. 1.2: Übersicht der Häufigsten syndromalen Kraniosynostosen.
12
Tab. 3.1: Exemplarische Darstellung der Auswertung einiger ESTs.
48
- VIII -
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
Tab. 3.2: Funktionelle Einteilungen der schwach-, mittel- und hoch-exprimierten Gene der „Klasse 1“.
50
Tab. 3.3: Liste der zehn am stärksten exprimierten Gene der Klasse „ bekannte Gene“.
51
Tab. 3.4: ESTs des UniGene-Clusters Hs.442169.
61
Tab. 3.5: Patientenkollektive, die zur Überprüfung einer Beteiligung von ECM3 an der Pathogenese von Osteoarthrose und rheumatoider Arthritis herangezogen wurden.
68
Tab. 3.6: Zusammenfassung der Ergebnisse der Mutationsanalyse.
81
Tab. 4.1: Humane Knorpel-cDNA-Bibliotheken bei „UniGene“.
92
Tab. 4.2: Prozentuale Anteile der Kollagene in cDNA-Bibliotheken unterschiedlicher Knorpelstadien.
96
- IX -
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius µ Mikro (10-6) 3’-UTR 3’-untranslatierte Region 5’-UTR 5’-untranslatierte Region A Adenin A.bidest Aqua bidestillata Abb. Abbildung AS Aminosäure bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise C Cytosin c Zenti (10-2) cDNA komplementäre DNA Ci Curie cpm ‘counts per minute’ C-terminal carboxy-terminal Cys Cystein ddNTP 2’,3’-Didesoxynucleosid-5’-triphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP 2’-Desoxynucleosid-5’-triphosphat DTT Dithiothreitol ECM extrazelluläre Matrix E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EST ‘expressed sequence tag’ G Guanin g Erdbeschleunigung g Gramm h Stunde H2O Wasser His Histidin IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactopyranosid k Kilo (103) kb Kilobasenpaare kDa Kilodalton l Liter M molar m Meter m Milli (10-3) mb Megabasenpaare min Minute mRNA ‘messenger’ Ribonukleinsäure MOPS 3-(N-morpholin)propansulfonsäure n Nano (10-9) N-terminal amino-terminal OD optische Dichte
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Abkürzungsverzeichnis
ORF ‘open reading frame’ p Piko (10-12) PBS ‘phosphate buffered saline’-Puffer PCR ‘polymerase chain reaction’ pH negativer dekadischer Logarithmus der H+-Ionen-Konzentration RACE ‘rapid amplification of cDNA ends’ RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease rpm ‘rounds per minute’ RT Reverse Transkriptase RT-PCR ‘reverse transcriptase polymerase chain reaction’ s Sekunde SDS Natriumdodecylsulfat SSC ‘standard saline citrate’-Puffer SSW Schwangerschaftswoche T Thymin Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer U ‘units’ (Enzymeinheiten) UV ultraviolett V Volt vgl. vergleiche Vol. Volumen
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Einleitung
1. Einleitung Defekte bei Bildung, Wachstum und Homöostase des Skeletts sind verantwortlich für
eine Reihe menschlicher Erkrankungen, deren molekulare Ursachen aufgrund des
schwer verfügbaren menschlichen Knorpelmaterials nur unzureichend aufgeklärt
sind. Aus diesem Grund ist die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die
an der Knorpel- und Knochenentwicklung beteiligt sind, sowohl von
entwicklungsbiologischer, als auch von medizinischer Seite von großer Bedeutung.
Wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese humaner Erkrankungen,
sowie zur Aufklärung molekularer Vorgänge bei Entwicklungsprozessen liefert die
Identifizierung und Charakterisierung differentiell exprimierter Gene. Zur
Identifizierung solcher Gene werden Hochdurchsatzmethoden wie EST-
Sequenzierung (Adams et al., 1991), SAGE (Serial analysis of gene expression,
Velculescu et al., 1999) oder cDNA-Mikroarraytechnologie (Schena et al., 1995)
angewendet. Während es mit SAGE und cDNA-Mikroarraytechnologie nur
eingeschränkt möglich ist, unbekannte Gene zu charakterisieren, liegt der große
Vorteil der EST-Sequenzierung darin, Sequenzinformationen über unbekannte
Transkripte zu erhalten und so mögliche neue Gene identifizieren zu können.
Eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung von Genen der Knorpel- und
Knochenentwicklung ist durch die gezielte Untersuchung von Patienten mit
genetisch-bedingten Knorpel-/Knochendeffekten und die Aufklärung der zugrunde
liegenden molekularen Ursachen möglich. Die Aufklärung der den
Genveränderungen übergeordneten Signalkaskaden und komplexer Gennetzwerke,
unter Verwendung beider Ansätze, wird nicht nur dazu führen, die genetische
Diagnostik für Erkrankungen zu verbessern, sondern wird helfen, Strategien zur
Prävention und Therapie von Knorpel- und Knochenerkrankungen zu entwickeln.
1.1 Knochen und Knorpelentwicklung Das Skelettsystem entwickelt sich aus Mesenchymzellen und lässt sich in drei
Anteile unterschiedlichen embryonalen Ursprungs aufteilen (Karsenty, 1998). Das
kraniofaziale Skelett entwickelt sich u.a. aus Neuralleistenzellen und ist somit
neuroektodermaler Herkunft (Helms und Schneider, 2003). Vom Mesoderm hingegen
leitet sich sowohl das Achsenskelett (gebildet aus den Sklerotomzellen der Somiten)
als auch das Extremitätenskelett (gebildet aus den Zellen des
- 1 -
Einleitung
Lateralplattenmesoderms) ab. Bei der Entwicklung des Skeletts und dem Aufbau
seiner unterschiedlichen Funktionsstrukturen lassen sich mehrere
Entwicklungsphasen unterscheiden. In der Phase der Musterbildung kommt es zur
Kondensation mesenchymaler Zellen und es entsteht ein Modell des Stützapparates.
In der sich anschließenden Phase der Morphogenese, welche die Prozesse der
Organogenese und Histogenese umfasst, kommt es zur Gestalt- und
Formentwicklung der einzelnen Skelettelemente. Dabei differenzieren sich die
mesenchymalen Vorläuferzellen zu Chondrozyten bzw. Osteoblasten und
Osteoklasten und es kommt zur Einwanderung von Blutgefäßen in die resultierenden
Knorpel- bzw. Knochengewebe. Den Abschluss bildet die Phase der Homöostase, in
der die Knochensubstanz durch kontinuierlichen Auf- und Abbau erneuert, ihre Form
und Größe im Wesentlichen aber nicht mehr verändert wird.
Die Knochenbildung kann durch zwei verschiedene Mechanismen vonstatten gehen:
Bei der intramembranösen (desmalen) Ossifikation, die auf die Entstehung der
flachen Schädelknochen, der lateralen Clavicula und der Mandibula begrenzt ist,
differenzieren die mesenchymalen Vorläuferzellen direkt zu knochenproduzierenden
Osteoblasten. Im Gegensatz dazu verläuft im axialen Skelett, sowie in den
Extremitäten die Osteogenese über Knorpelanlagen, die ein Modell des späteren
Skeletts ausbilden und sekundär durch Knochen und Knochenmark ersetzt werden.
Dieser Prozess wird als enchondrale Ossifikation bezeichnet. Nach der
Musterbildung – die räumlich-zeitliche Anordnung embryonaler Zelltypen, die zu
einem Modell des Skelettsystems mit definierter Form, Lage und Zahl der
Einzelelemente führt (Coates,1994; DeLise et al., 2000; Pizette und Niswander,
2001; Mariani und Martin, 2003) – schließen sich die Morphogenese- und
Wachstumsphase an.
1.1.1 Enchondrale Ossifikation am Beispiel von Röhrenknochen Bei der enchondralen Ossifikation kommt es zunächst zu einer Kondensation
undifferenzierter mesenchymaler Vorläuferzellen. Ausgelöst wird diese durch den
Transkriptionsfaktor SOX9 (Kypriotou et al., 2003), wobei die Randzellen das
Perichondrium bilden, das die Knorpelelemente umschließt (Kronenberg, 2003). Die
Vorläuferzellen differenzieren zu Chondrozyten (Abb. 1.1), proliferieren und beginnen
eine extrazelluläre Matrix (ECM) aus Proteinen wie z.B. Kollagene Typ II, IX und XI,
den Proteoglykanen Aggrekan, Decorin und Biglykan, sowie den nicht-kollagenösen
- 2 -
Einleitung
Proteinen MGP (matrix GLA protein) und COMP (cartilage oligomeric matrix protein)
(Mundlos, 1994; de Crombrugghe et al., 2000) auszubilden.
D
G
M
W
u
d
b
c
i
d
s
e
E
O
Abb. 1.1: Schematische Darstellung der enchondralen Ossifikation. (A, B) Mesenchymale Zellen kondensieren und differenzieren zu Chondrozyten. Die Chondrozyten proliferieren und bilden die extrazelluläre Matrix. (C) Chondrozyten im Zentrum des Schafts werden hypertroph und mineralisieren die extrazelluläre Matrix bis sie durch Apoptose absterben. (D, E, F) In die frei werdenden Lakunen wandern Blutgefäße ein, die von Osteoblasten und Chondro-/Osteoklasten begleitet werden. Chondro- / Osteoklasten resorbieren den Knorpel, Osteoblasten ersetzen ihn durch die primäre Spongiosa. Es bildet sich ein primäres Ossifikationszentrum. (G, H) An den Epiphysen entstehen sekundäre Ossifikationszentren. Das Längenwachstum der Röhrenknochen wird durch die dazwischenliegende Wachstumsfuge reguliert. Verändert nach: Gilbert, Developmental Biology, 6th Edition, Sinauer Associates, 2000, Seite 456.
ie extrazelluläre Matrix besitzt primär mechanische Funktionen und bildet ein
rundgerüst zur Anheftung der Zellen. Darüber hinaus ist dieses Netzwerk aus
akromolekülen gerade während der Entwicklung wichtig für den komplexen
achstums- und Differenzierungsprozess (Adams und Watt, 1993; Hay, 1993; Lin
nd Bissell, 1993). Im weiteren Verlauf der Entwicklung gehen die Chondrozyten in
en hypertrophen Zustand über (Abb. 1.1), beenden die Proliferation und
eeinflussen die Mineralisierung der Knorpelmatrix, die Angiogenese und die
hemotaktische Anziehung von Osteoklasten und Osteoblasten, bis sie letztendlich
n die Apoptose übergehen (Gerber et al., 1999, Gerber und Ferrara, 2000). Durch
iese Prozesse bildet sich in der Diaphyse (Knochenschaft) – unterstützt durch eine
ich kontinuierlich verdickende Knochenmanschette (perichondrale Ossifikation) –
in primäres Ossifikationszentrum (Abb. 1.1), und später in der
mbryonalentwicklung in den Epiphysen je ein weiteres sekundäres
ssifikationszentrum. Zwischen den beiden Ossifikationszentren werden die Stadien
- 3 -
Einleitung
der Chondrozytendifferenzierung in einem immer schmaler werdenden Streifen
(Wachstumsfuge) konzentriert, die im Weiteren das Längenwachstum der
Röhrenknochen reguliert.
Der Aufbau der Wachstumsfuge kann in klar definierte Zonen eingeteilt werden
(Abb.1.2), die durch Chondrozyten in verschiedene Differenzierungsstadien in distal-
proximaler Richtung definiert werden (Abb. 1.2). Distal liegt die Ruhezone. Die
Chondrozyten dieser Zone dienen als Reservoir für die nachfolgende Proliferations-
und Differenzierungszone (Abad et al., 2002). In der Proliferationszone teilen sich die
Chondrozyten, ordnen sich säulenförmig an und beginnen mit der Expression und
Sekretion von Bestandteilen der extrazellulären Matrix (Ballock und O'Keefe, 2003).
Im weiteren Verlauf der Differenzierung nimmt die Teilungsfähigkeit der
Chondrozyten ab, diese hypertrophieren (hypertrophe Zone) und beginnen Kollagen
Typ X, alkalische Phosphatase, Annexin II, V, und VI und die Matrix
Metalloproteinase-13 zu sezernieren (Anderson, 1995; Kirsch et al., 1997;
Johansson et al., 1997; Kirsch et al., 2000; Pfander et al., 2001). Weiter proximal
wird die Interzellulärmatrix durch aktiven Kalziumtransport aus den Zellen
mineralisiert (Wu et al., 1997). Diese Mineralisation findet nicht diffus statt, sondern
beginnt an membranumhüllten Matrixvesikeln, die sich in den longitudinalen Septen
befinden. Die Membranen platzen daraufhin auf und es kommt zu weiteren
Anlagerungen von Mineralsalzen bis die gesamten Septen mineralisiert sind. Diese
Septen bilden die Grundlage der ersten Spongiosabälkchen. Nun beginnt das
Einwandern von Gefäßen. Durch die Kapillarwand dieser Gefäße gelangen
Makrophagen, die noch nicht mineralisierte longitudinale Septen abbauen.
Gleichzeitig werden zwei Drittel der schon mineralisierten Septen durch
Chondroklasten abgebaut. An den Rest der longitudinalen Septen lagern sich
Osteoblasten an, die sich aus dem perivaskulären Bindegewebe differenzieren.
Dieser Prozess führt zum kontinuierlichen Längenwachstum des Knochens. Im Laufe
der Pubertät nimmt die Proliferationsrate der Chondrozyten immer weiter ab (Weise
et al., 2001) und die Wachstumsfuge wird schmaler, bis die Epiphyse und die
Metaphyse verschmelzen und das Längenwachstum abgeschlossen ist.
Der zentrale Regulationsmechanismus der Chondrozytendifferenzierung basiert
wesentlich auf der Indian-hedgehog-(Ihh)/parathyroid-related-Protein-(PTHrP)-
Feedback Schleife (Shum und Nuckolls, 2002; Ballock und O’Keefe 2003;
Kronenberg, 2003). Das von den Zellen der periartikulären Zone der Röhrenknochen
und des Perichondriums sezernierte PTHrP wird über dessen Rezeptor (PTHrP1)
- 4 -
Einleitung
von Chondrozyten der prähypertrophen- und der proliferierenden-Zone erkannt
(Lanske et al., 1996). Dies wirkt der hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten
entgegen (Vortkamp et al., 1996).
Knochen
terminale hypertr. Chondrozyten
hypertrophe Chondrozyten
prähypertrophe Chondrozyten
Ruhezone
proliferierende Chondrozyten
Abb. 1.2: Alkalische Phosphatase/Safranin O Färbung und schematische Darstellung der Wachstumsfuge. Linke Abbildung modifiziert nach Shum und Nuckolls, 2002; rechte Abbildung modifiziert nach Zabel und Winterpacht, 2002.
Reicht die PTHrP-Konzentration aufgrund zunehmender Distanz zu der
periartikulären Region nicht mehr aus, differenzieren die prähypertrophen Zellen zu
hypertrophen Chondrozyten und exprimieren IHH. IHH wirkt über seine Rezeptoren
(patched und gli), die überwiegend im Perichondrium exprimiert werden, wieder
expressionsaktivierend auf PTHrP (Vortkamp et al., 1996). Ein Repressor der
Wirkung von IHH ist TGF-ß, welches in der periartikulären Zone der Röhrenknochen
und des Perichondriums exprimiert wird und die Synthese von PTHrP steigert (Serra
et al., 1999; Alvarez et al., 2001). TGF-ß kann jedoch auch direkt die Hypertrophie
der Chondrozyten verhindern (Ballock et al., 1993), indem es die Expression von
Kollagen Typ X und der alkalischen Phosphatase inhibiert (Ballock et al., 1993;
Bohme et al., 1995; Ferguson et al., 2000; Pateder et al., 2001).
Es gibt darüber hinaus eine Reihe weiterer Signalmoleküle, die die Chondrozyten-
differenzierung entweder direkt oder indirekt über die IHH/PTHrP-Feedbackschleife
modulieren. Ein Beispiel stellen die FGFs (fibroblast growth factors) mit ihren vier
FGF-Rezeptoren (FGFR1-4) dar. Eine über FGF3 und der JAK-STAT1-
Signaltransduktionskaskade getriggerte Inhibition von IHH beschleunigt die
Proliferation der Chondrozyten und dadurch die Hypertrophie der Chondrozyten
- 5 -
Einleitung
(Sahni et al., 1999). Antagonistisch zu den FGFs wirken die BMPs (bone
morphogenetic proteins), die die Chondrozyten-Proliferation direkt aktivieren und
somit der terminalen Differenzierung entgegenwirken, was zusätzlich durch eine
BMP-induzierte Expressionssteigerung von IHH unterstützt wird (Minina et al., 2001;
Minina et al., 2002). Noggin und Chordin fördern durch die Blockierung von BMP
wiederum die terminale Differenzierung der Chondrozyten (Pathi et al., 1999; Zhang
et al., 2002).
In den verschiedenen Phasen der Skelettentwicklung (mesenchymale Kondensation)
spielen Mitglieder der SOX (Sry-related HMG Box)-Familie ein wichtige Rolle. Die
SOX-Proteine gehören zu einer Klasse von Transkriptionsfaktoren, der eine HMG
(high-mobility-group)-Domäne gemeinsam ist. Bis heute wurden ca. 30 SOX-
Proteine identifiziert (Wegner, 1999). Es hat sich gezeigt, dass neben SOX9, das die
Differenzierung der kondensierten mesenchymalen Zellen zu Chondrozyten einleitet
(Ng et al., 1997), die Proliferation der Chondrozyten steigert und Elemente der
PTHrP-IHH-Signaltransduktion moduliert (Bell et al., 1997; Lefebvre et al., 1998;
Smits et al., 2001), auch L-SOX5 und SOX6 essentielle Funktionen bei der
Chondrozytendifferenzierung innehaben (Smits et al., 2001). L-SOX5 und SOX6
werden gemeinsam mit SOX9 während der Differenzierung der kondensierten
mesenchymalen Zellen zu Chondrozyten co-exprimiert und aktivieren gemeinsam die
Expression von Kollagen Typ II (Lefebvre et al., 1998, Smits et al., 2001). Sox6 oder
L-Sox5 defiziente Mäuse (L-Sox5-/- oder Sox6-/-) zeigen nur minimale Knorpeldefekte,
wohingegen L-Sox5-/--Sox6-/--Doppel-knockout-Mäuse im Embryonalstadium 16,5
(E16,5) mit schweren Knorpel/-Knochendeffekten sterben (Smits et al., 2001).
Anhand von 3NA-Mäusen (Mäuse mit drei Null-Allelen, L-Sox5-/-, Sox6+/- oder L-
Sox5+/-, Sox6-/-) konnte die Funktion von L-Sox5 und Sox6 an der
Chondrozytendifferenzierung in der Wachstumsfuge teilweise geklärt werden (Smits
et al., 2004). Ohne die Modellierung durch L-Sox5 und Sox6 gehen die
Chondrozyten der prähypertrophen Zone direkt in die Phase der terminalen
Hypertrophie über. Da weder L-Sox5 noch Sox6 in den hypertrophen oder terminalen
Chondrozyten exprimiert werden, wird davon ausgegangen, dass die Fähigkeit von
L-Sox5 und Sox6, die Chondrozyten vom prähypertrophen Zustand in den
hypertrophen Zustand zu „führen“, durch eine matrixvermittelte Steigerung der
Expression von Fgfr3 und eine Verminderung der Expression des
Transkriptionsfaktors Runx2 ausgelöst wird (Inada et al., 1999; Takeda et al., 2001;
Ueta et al., 2001; Komori, 2003; Otto et al., 2003). Trotz aller Bemühungen sind bis
- 6 -
Einleitung
heute aber dennoch die molekularen Prozesse, die während der enchondralen
Ossifikation ablaufen, nur zum Teil verstanden.
1.1.2 Desmale Ossifikation am Beispiel der Schädeldachknochen Der Schädel entwickelt sich aus Mesenchym, welches das sich entwickelnde Gehirn
umschließt, und setzt sich aus dem Viszerokranium (Gesichtsschädel) und dem
Neurokranium, das eine schützende Kapsel um das Gehirn bildet, (Rohen und
Lütjen-Drecoll, 2004) zusammen. Das Neurokranium wird weiter in das enchondral
verknöchernde Chondrokranium (aus dem die Schädelbasis entsteht) und den
desmal verknöchernden Schädeldachknochen unterteilt. Die flachen
Schädeldachknochen entwickeln sich direkt aus dem mesenchymalen Bindegewebe,
das die Anlagen des Gehirnes umgibt (desmale Ossifikation). Aus sich verdichtenden
Mesenchymzellen differenzieren Osteoblasten, die sich vom primären
Ossifikationszentrum strahlenförmig in die Peripherie ausbreiten. Ausgehend von vier
solchen Ossifikationszentren vergrößern sich die entstehenden Schädeldachknochen
durch appositionelles Wachstum, wobei sich durch die Osteoblasten an der äußeren
Oberfläche neue Knochenschichten bilden (Schumacher und Christ, 1993). Über die
desmale Ossifikation bilden sich insgesamt vier Schädeldachknochen, die an der
Gestaltung des Schädeldaches beteiligt sind: die paarig angeordneten Os frontale
(vorne) und die beiden Os parietale (seitlich). Der unpaare Os occipitale, der
ebenfalls an der Schädeldachbildung beteiligt ist, entsteht über enchondrale
Ossifikation. Während der Embryonalentwicklung wachsen die Schädeldachknochen
immer näher zusammen, bis sie schließlich nur noch durch dünne
Bindegewebsnähte (Schädelnähte) voneinander getrennt sind. Je nachdem welche
Schädelknochen die Schädelnähte flankieren, spricht man von der Stirnnaht,
Koronar-, Sagital- oder Lambdanaht (Abb. 1.3). Treffen mehr als zwei Schädelplatten
aufeinander, so erweitern sich die Schädelnähte zu Fontanellen. Die Schädelnähte
erfüllen als flexible Verbindungen zwischen den einzelnen Schädelknochen wichtige
Aufgaben: während des Geburtsvorgangs erlauben die Nähte eine Kompression des
Schädels mit teilweisem Überlappen der einzelnen Komponenten des
Schädeldaches im Geburtskanal. Diese Kompression und die übereinander
geschobenen Knochen gehen in den ersten Lebenswochen wieder in ihre
Ausgangsposition zurück.
- 7 -
Einleitung
Koronarnaht Stirnnaht
Sagitalnaht Lambdanaht
Anterior-fontanelle
Posterior-fontanelle
Im weiteren Verlauf des Wachstums passt sich das Schädeldach dem stetig
zunehmenden Platzbedarf des wachsenden Gehirns an. In den Schädelnähten wird,
auf das Wachstum des Gehirn abgestimmt, neuer Knochen durch appositionelles
Wachstum gebildet: der Schädel wächst. Verlieren die Schädelnähte ihre
Wachstumsaktivität, verknöchern sie. Die Knochen fusionieren und der Schädel hört
auf zu wachsen. Der Zeitpunkt der Verknöcherung der einzelnen Schädelnähte beim
Menschen ist in Tabelle 1.1 dargestellt.
Schädelnaht/Fontanelle Zeitpunkt der Verknöcherung
Stirnnaht 9 Monate bis 2 Jahre
Koronarnaht 40 Jahre
Sagittalnaht 40 Jahre
Lambdanaht 40 Jahre
Anteriorfontanelle 15-18 Monate
Posteriorfontanelle 3-6 Monate
Anterolateralfontanelle 3 Monate
Posterolateralfontanelle 2 Jahre
Tab. 1.1: Zeitpunkt der Verknöcherung der Schädelnähte und Fontanellen beim Menschen. Modifiziert nach Aviv et al., 2002.
Abb. 1.3: Schädelformationen. Modifiziert nach Cohen und MacLean, 2000.
Die Schädelnähte unterscheiden sich jedoch nicht nur in dem Zeitpunkt ihrer
Verknöcherung, sondern auch in ihrer Morphologie. Während die Mittelnähte
(Sagital- und Stirnnaht) von angrenzenden Knochen flankiert werden, überlappen die
Knochen der Transversalnähte (Koronar- und Lambdanaht) (Abb. 1.4). Diese
unterschiedliche Morphologie liegt wahrscheinlich im unterschiedlichen embryonalen
- 8 -
Einleitung
Ursprung der Nähte und Knochen begründet. Während die Gesichtsknochen in allen
Vertebraten einschließlich des Menschen eindeutig aus der Neuralleiste abgeleitet
werden können (Noden, 1983; Couly und Le Douarin, 1985; Noden 1986; Couly und
Le Douarin, 1987; Couly et al., 1992), werden die embryonalen Ursprünge der
Knochen und Nähte des Schädeldaches in der Literatur unterschiedlich diskutiert
(Noden 1986, Couly et al., 1992; Couly et al., 1993). Vor wenigen Jahren konnte
Jiang et al. (2002) über transgene Mäuse mit einem permanenten Neuralleisten-
Marker (Wnt1-Cre/R26R) zeigen, dass sich die Schädelknochen und -nähte aus
unterschiedlichem embryonalen Ursprung ableiten (Jiang et al., 2002; Cohen, 2005).
So stammen die Koronarnaht und Stirnnaht von Zellen der Neuralleiste ab und sind
somit ektodermalen Ursprungs, während die Sagital- und Lambdanaht aus dem
paraxialen Mesoderm ableiten. Auch die Knochen, die das Schädeldach bilden,
gehen von unterschiedlichen embryonalem Geweben aus: so entwickelt sich die Os
frontale aus Zellen der Neuralleiste, wohingegen die Os parietale und der Os
occipitalis paraxial mesodermalen Ursprungs sind (Jiang et al., 2002). Allen Nähten
ist jedoch gemeinsam, dass sie von zwei Gewebeschichten umgeben sind: dem
Periost (Knochenhaut) und der Dura mater, die der äußeren Hirnhaut entspricht
(Abb. 1.4). Inwieweit diese Schichten die Bildung der Nähte und deren
Aufrechterhaltung unterstützen, ist zurzeit noch nicht komplett verstanden. So
scheint die Dura mater zwar nicht für die Bildung der Schädelnähte selber
verantwortlich zu sein (Oppermann et al., 1993). Roth et al. (1996) konnten jedoch
nachweisen, dass das Einführen einer Silikonbarriere zwischen Schädelnaht und
Dura mater bei neugeborenen Ratten zu einer verzögerten Schließung der
Schädelnähte führt, und die Dura mater somit am Erhalt der Schädelnähte beteiligt
ist. Weitere Experimente zeigten, dass die Dura mater im mesenchymalen Gewebe
die Osteogenese induziert (Yu et al., 1997; Greenwald et al., 2000).
- 9 -
Einleitung
a b
mO mO
uOS PeuOS
Pe
Dm
A B uOS PePe uOS
mOmODm
Abb. 1.4: Histologische und schematische Darstellung der Schädelnähte. A und a zeigen die Koronarnaht einer 6 Tage alten Ratte. B und b stellen die Stirnnaht einer 6 Tagen alten Ratte dar. Die violetten Punkte kennzeichnen die Schädelnähte; Dm, Dura mater; mO, mineralisierter Knochen; Pe, Periost; uOS, unmineralisierte Knochenmatrix (osteoid) und Osteoblasten. Modifiziert nach Greenwald et al., 2000.
1.2 Erkrankungen des Knorpel-/Knochen-Gewebes
1.2.1 Chondrodysplasien Bei der Krankheitsgruppe der Osteochondrodysplasien handelt es sich um genetisch
bedingte, generalisierte Entwicklungsstörungen des Knorpel-Knochen-Gewebes. Ihre
Gesamthäufigkeit liegt bei etwa 4:10000-10:10000 (Zabel und Winterpacht, 2000),
wobei die Gruppe hunderte z.T. sehr seltene Krankheiten umfasst, zu denen unter
anderem die Frontometaphysäre Dysplasie (FMD, MIM305620) gehört. Die FMD ist
eine seltene Erkrankung des knöchernen Schädels und der Röhrenknochen.
Charakteristische Merkmale zeigen das Gesicht (mit prominenten Supraorbitalleisten,
Hypertelorismus, antimongoloiden Lidachsen, breiter Nasenwurzel und Mikrognathie
(kleiner Oberkiefer) mit Zahnanomalien) und das Skelett (Fusion von
Mittelhandknochen, vermehrte Knochendichte entlang der Metaphysen,
ausgeweitete Metaphysen, Skoliose). Als zusätzliche Symptome werden
eingeschränkte Gelenkbeweglichkeit, Fingerkontrakturen und teilweise auch
Hörverlust gefunden. Seltener haben die Patienten Atemprobleme
(Luftröhrenstenosen unterhalb der Glottis, rezidivierende Infekte) und urologische
- 10 -
Einleitung
Störungen. Etwa 30 Fälle von FMD sind bisher beschrieben worden. Robertson et al.
(2003) zeigten, dass „gain of function“-Mutationen in Filamin A (FLNA) zur FMD führt.
Die FMD wird zum Spektrum der Fronto-oto-palato-digitalen Osteodysplasien
gezählt, zusammen mit dem Melnick-Needles-Syndrom (MIM 309350) und den Oto-
palato-digitalen Syndromen Typ 1 (MIM 311300) und Typ 2 (MIM 304120). Alle diese
Syndrome werden X-chromosomal-rezessiv vererbt wobei heterozygoten Frauen
sind nur minimal betroffen sind.
Die Heterogenität der Osteochondrodysplasien erklärt sich aus der Vielzahl von
involvierten Genen, Molekülen, Proteininteraktionen, Zellen und Gewebebereichen,
die an der Bildung, dem Wachstum und der Homöostase des Skeletts beteiligt sind,
und deren Störung zu einem jeweils anderen Krankheitsbild führen kann. Das
Spektrum schließt alle Schweregrade ein: von pränatal letalen Formen bis hin zu
sehr leicht betroffenen, fast symptomfreien Patienten.
1.2.2 Kraniosynostosen Kraniosynostosen sind Entwicklungsstörungen, die auf einem frühzeitigen
Verschluss einer oder mehrerer Schädelnähte zurückzuführen sind. Die Prävalenz
beträgt 1:2100- 1:3200 Neugeborenen (Hunter und Rudd, 1976; Lajeunie et al.,
1995). Kraniosynostosen treten sowohl isoliert (nicht-syndromal; ca. 15-20% aller
Kraniosynostosen), als auch mit anderen Fehlbildungen assoziiert auf (syndromal,
80-85% aller Kraniosynostosen). Die Äthiologie der Kraniosynostosen ist sehr
heterogen. Syndromale Formen zeigen in der Regel einen autosomal-dominanten
Erbgang und eine hohe intra- und interfamiliäre Variabilität, wohingegen bei den
nicht-syndromalen Kraniosynostosen sowohl genetische als auch Umweltfaktoren
diskutiert werden (Cohen und MacLean, 2000). Syndromale Formen können anhand
ihrer phänotypischen Merkmale in etwa 100 Syndrome unterteilt werden (Winter und
Baraitser, 1994). Sie unterscheiden sich durch die Art der betroffenen Schädelnaht,
craniofaziale Anomalien, assoziierte Extremitätenanomalien und Fehlbildungen
anderer Organsysteme.
Erkenntnisse über die molekularen Ursachen, sowie die Pathomechanismen der
Kraniosynostosen stammen weitestgehend von Untersuchungen an einigen
Kraniosynostose-Syndromen. Eine Übersicht der häufigsten syndromalen
Kraniosynostosen ist in Tab. 1.2 dargestellt.
- 11 -
Einleitung
Erkrankung betroffene
Schädelnaht MIM Inzidenz Veränderungen des
(Gesichts)-Schädels weitere Merkmale Gene Refe-
renzen Crouzon-Syndrom
S. coronalis (S. sagittalis S. lambdoidae) bilateral
123500 1:61000 Brachyzephalie, Papageiennase, Exophthalmus (flache Orbitae) Hypertelorismus, Buphthalmus, Mittelgesichtshypoplasie, Maxillenhypoplasie
Strabismus, Schallleitungsfehler Optikusatrophie, Mentale Retardierung (bei erhöhtem Hirndruck durch räumliche Behinderung des Hirnwachstums), seltene zusätzliche Merkmale: Anfallsleiden
FGFR2 Erhöhtes Vateralter
[1] [2] [3] [4] [5]
mit Acanthosis nigricans
Choanalatresie, Hydrozephalus Hyperkeratose mit Hyperpigmentierung, Symptome stärker ausgeprägt als beim klassischen M. Crouzon
FGFR3 [6] [7]
Apert-Syndrom
S. coronalis bilateral
101200 1:65000 Turmschädel, Brachyzephalie, Protosis, Exophtalmus (flache Orbitae), Hypertelorismus, Mittelgesichtshypoplasie, Maxillenhypoplasie, Antimongoloide Lidspalte, Choanalatresie, Gaumenspalte
Strabismus, Hörfehler, Bilaterale knochige Syndaktylie der Hände und Füße Mentale Retardierung (abhängig vom Hirndruck)
FGFR2 Erhöhtes Vateralter
[3] [8] [10]
Pfeiffer-Syndrom
S. coronalis bilateral
101600 1:200000 Turmschädel, Brachyzephalie, Selten Kleeblattschädel, Proptosis, Hypertelorismus, flache Orbitae Maxillenhypoplasie, Mittelgesichts-hypoplasie, Antimongoloide Lidspalte Choanalatresie, kleine Nase
Strabismus, breite Daumen und Großzehen, selten geistige Retardierung
FGFR1 FGFR2
[3] [5] [9] [11]
Saethre-Chotzen-Syndrom
S. coronalis (S. lambdoidae S. metopica) bilateral
101400 1:25000-50000
Akrozephalie, Brachyzephalie, Hohe und flache Stirn, schmale und lange Nase (Papageiennase), Gesichtsasymmetrie, Buphthalmus, Hypertelorismus, Maxillenhypoplasie, Gaumenspalte, verzögerter Verschluss der Fontanelle
Milde bis mittlere geistige Retardierung, Brachydaktylie, Häutige Syndaktylie Klinodaktylie Seltene zusätzliche Merkmale: Strabismus, Ptosis, tief liegende und kleine Ohren Hörprobleme, Herzdefekte
TWIST FGFR2 FGFR3
[12] [13]
Jackson-Weiss-Syndrom
Mehrere Schädelnähte
123150 Turmschädel, Mittelgesichts-hypoplasie
In der radiologischen Untersuchung Tarsus-Metatarsus-Koaleszenz Seltene zusätzliche Merkmale: Mentale Retardierung, Häutige Syndaktylie der 2. und 3. Zehe
FGFR2 [14] [15]
Muenke-Syndrom
S. coronalis Uni- und bilateral
602849 0,8-1:10000
Plagiozephalie, Makrozephalie Seltene zusätzliche Merkmale: Strabismus, In der radiologischen Untersuchung fingerhutförmige Fingerknochen, Zapfenförmige Epiphysen, Hand- bzw. Fußwurzelknochenfusionen Brachydaktylie
FGFR3 [13] [16] [17] [18]
Boston Typ Kleeblattschädel MSX2 [19] [20]
Beare-Stevenson Cutis gyrata
Mehrere Schädelnähte
123790 sporadisch Kleeblattschädel, Proptosis, Mittelgesichtshypoplasie, antimongoloide Lidspalte, Hypertelorismus, Choanalatresie Hydrozephalus
Cutis Gyrata, Acanthosis nigricans, Häutige Genitalveränderungen, Missbildungen der Finger und Zehen, Tief liegende vorgedrehte Ohren, Wachstumsverzögerungen, Balkenmangel, Früher Tod (bei Kleeschädel)
FGFR2 Erhöhtes Vateralter
[21] [22] [23]
Tab 1.2: Übersicht der Häufigsten syndromalen Kraniosynostosen. Modifiziert nach Preising et al., 2005. [1] Crouzon, 1912; [2] Oldbridge et al., 1995; [3] Meyers et al., 1997; [4] Glaser et al., 2000; [5] Renier et al., 1991; [6] Meyers et al., 1995; [7] Tavormina et al., 1999; [8] Apert, 1906; [9] Pfeiffer, 1964; [10] Wilkie et al., 1995; [11] Muenke et al., 1994; [12] Saethre, 1931; [13] Znekas et al., 1998; [14] Jackson et al., 1976; [15] Park et al., 1995; [16] Graham et al., 1998; [17] Muenke et al., 1997; [18] Reardon et al., 1997; [19] Li et al., 1993; [20] Jabs et al., 1993; [21] Beare et al., 1969; [22] Stevenson et al., 1978; [23] Przylepa et al., 1996.
- 12 -
Einleitung
Mutationen in FGFR 1-3, die zu einer konstitutiven Aktivierungen der Gene führen,
sind ursächlich für diverse syndromale Kraniosynostosen (dominant negativer Effekt;
Neilson et al., 1995; Robertson et al., 1998; Anderson et al., 1998; Yu et al., 2000;
Oldridge et al., 1999; Hajihosseini et al., 2001). Im Gegensatz zu den FGFRs führen
bei Patienten mit dem Saethre-Chotzen-Syndrom und dem Bosten-Typ Syndrom
Mutationen in TWIST (Johnson et al., 1998; el Ghouzzi et al., 2001) und MSX2 (Li et
al., 1993; Jabs et al., 1993) zum Funktionsverlust der Gene (loss of function).
Interessanterweise wurden für TWIST nicht nur Mutationen in der kodierenden
Sequenz von TWIST, sondern auch Translokationen beschrieben, die sich mehrere
Kilobasen distal von TWIST befinden (Krebs et al., 1997; Rose et al., 1997). Hier
gehen die Autoren von positionellen Effekten aus, welche die Expression von TWIST
beeinflussen und somit zu Kraniosynostosen führen.
1.2.3 Osteoarthrose und rheumatoide Arthritis Nach Abschluss des Längenwachstums sind die auf den Knochen aufliegenden
Gelenkknorpel die einzigen Bestandteile der Röhrenknochen, die nicht verknöchern.
Ein Gelenkknorpel ist eine nur wenige Millimeter dicke, amorph erscheinende
Gewebeschicht, der Blut- und Lymphgefäße sowie Nerven fehlen. Die einzigen
zellulären Elemente im erwachsenen Gelenkknorpel sind Chondrozyten, wobei
extrazelluläre Matrixbestandteile über 95% des Gewebevolumens repräsentieren.
Die häufigste Ursache für das Versagen der funktionellen Gelenkeinheiten (Knorpel,
subchondraler Knochen, Synovia, Synovialis, Gelenkkapsel, Muskulatur) sind
chronische Gelenkerkrankungen wie Osteoarthrose und rheumatoide Arthritis.
Bei der Osteoarthrose, der häufigsten altersbezogenen Skeletterkrankung, kommt es
zu einer chronisch fortschreitenden Zerstörung des Gelenkknorpels und damit zu
einem Funktionsverlust des Gelenksystems. Charakteristische Merkmale der
Osteoarthrose sind der kontinuierliche Knorpelverlust, die strukturellen
Veränderungen des subchondralen Knochens und die Formation von osteophytären
Randanbauten. Nach einer initialen Knorpelerweichung (Chondromalazie) entstehen
Einrisse im Knorpel, die immer tiefer werden. Der kontinuierliche Knorpelabrieb führt
zur so genannten „Knochenglatze“. Klinisch wird das Endstadium der Erkrankung
dominiert von Schmerzen, massiver Einschränkung der Funktionalität und der
zwingenden Erfordernis eines künstlichen Gelenkersatzes.
Die Progression der Erkrankung lässt sich nach Fassbender (1975) histologisch in
- 13 -
Einleitung
vier Stadien unterteilen: im Stadium I bilden sich in der oberen Knorpelschicht kleine
Fissuren, verbunden mit oberflächlichem Proteoglykan-Verlust. Stadium II ist
gekennzeichnet durch tiefergehende Fissuren, proliferierenden Chondrozyten, die so
genannte Brutnester ausbilden und allmählichem Knorpelverlust. Im Stadium III
reichen die Fissuren und Defekte bis in den kalzifizierenden Knochen hinein.
Vollständiger Knorpelverlust mit Knorpelglatze kennzeichnet das Stadium IV.
Die komplexe Pathogenese der Osteoarthrose umfasst verschiedene Risikofaktoren
wie Übergewicht, Östrogenmangel, Unterversorgung mit Antioxidantien,
Gelenküberbeanspruchung oder -verletzung, sowie Geschlecht und Alter des
Patienten (Felson et al., 2000), die zusammen mit einer genetischen Prädisposition
die Erkrankung hervorrufen (Brandi et al., 2001; Spector und MacGregor, 2004). Die
fortschreitende Zerstörung des Knorpels beruht auf einem Ungleichgewicht anaboler
und kataboler Prozesse in der extrazellulären Knorpelmatrix (Lohmander, 2000;
Fernandes et al., 2002; Martel-Pelletier, 2004). Im gesunden Knorpel wird der Abbau
der Knorpelmatrix durch proteolytische Enzyme, vorrangig Metalloproteinasen
(MMPs und ADAMTS; Shlopov et al., 1997; Tortorella et al., 1999, 2001, 2002),
durch Synthese von anabolen extrazellulären Matrixbestandteilen kompensiert.
Diese komplexe Balance wird durch ein streng kontrolliertes Netzwerk aus Zytokinen
und Wachstumsfaktoren reguliert. Unter den katabolen, proinflammatorischen
Zytokinen, die von Synoviozyten, mononukleären Zellen und Chondrozyten
sezerniert werden, bilden Interleukin-1ß und TNF-α, unterstützt durch IL-6, LIF, IL-17,
IL-8 und IL-18, die Schlüsselmediatoren (Martel-Pelletier et al., 1999). In
synergistischer Wirkung steigern sie die Synthese proteolytischer Enzyme und
hemmen die Synthese von Enzyminhibitoren wie TIMP (tissue inhibitor of
matrixmetalloproteinases), SERPINs (serine proteinase inhibitors) oder α2-
Makroglobulin.
Ihre Wirkung wird im gesunden Gelenk durch kompetitive Hemmung inhibiert.
Rezeptorantagonisten wie IL-1Ra konkurrieren mit der Bindung der Zytokine an ihren
Rezeptor und inhibieren die katabole Funktion der löslichen Zytokine und
antiinflammatorischen Zytokine wie IL-4, IL-10 oder IL-13 und reduzieren damit die
Expression, Synthese oder Aktivität der proinflammatorischen Zytokine (Martel-
Pelletier, 2004). Ferner stimulieren die anabolen Mediatoren IGF-1, TGF-1, 2, und 3,
FGF-2, 4 und 8, und BMPs die extrazelluläre Matrix-Synthese (Sandell und Aigner,
2001), sowie möglicherweise eine Reihe weiterer Genprodukte, die eine Funktion bei
Knorpelaufbau bzw. Knorpelentwicklung spielen bisher jedoch unbekannt sind.
- 14 -
Einleitung
Durch Überexpression bzw. vermehrter Aktivität der proinflammatorischen Zytokine
und durch verringerte Expression bzw. Wirkung der physiologischen Inhibitoren,
werden katabole Vorgänge gefördert und das Gleichgewicht zugunsten der
Knorpeldegradation verschoben. Durch gesteigerte Synthese von ECM-
Komponenten und Erhöhung der mitotischen Teilungen kompensieren Chondrozyten
diesen Degradationsprozess. Die Syntheseaktivität der Chondrozyten reicht
allerdings häufig nicht aus, um die Degradation des Knorpels anzugleichen (Sandell
und Aigner, 2001). Dennoch sind gerade Gene, die an der Knorpelregeneration
beteiligt sind, von großer medizinischer Bedeutung.
Osteoarthrotischer Knorpel weist phäntotypische Veränderungen der Chondrozyten
auf (Pullig et al., 2001; Sandell und Aigner, 2001). Adulte Chondrozyten, die im
gesunden Gelenk einen „stabilen“ Phänotyp zeigen, dedifferenzieren im
osteoarthrotischen Knorpel, beenden die Expression von Aggrekan und Kollagen
Typ II und beginnen - ähnlich wie hypertrophe Chondrozyten - Kollagen Typ I, III, V
und X zu sezernieren (Girkontaite et al., 1996; Oganesian et al., 1997; Lefkoe et al.,
1997). Diese eher knorpeluntypischen Matrixkomponenten können nicht in eine
funktionsfähige Knorpelarchitektur integriert werden und sind zusammen mit der
oben beschriebenen Knorpelmatrixdegradation für die Ausbildung der Osteoarthrose
verantwortlich. Trotz erster Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen
Osteoarthrose und dem Vitamin D-Rezeptor (VDR; Keen et al., 1997), Kollagen
Typ IX (COL9A1; Mustafa et al., 2000), Typ I (COL1A1: Loughin et al., 2000) und
Typ II (COL2A1; Uitterlinden et al., 2000) sowie TGF-ß1 (Keen et al., 2001) sind die
Pathomechanismen der Osteoarthrose weitgehend unverstanden.
Eine weitere Gelenkerkrankung, deren Pathomechanismus sich von der
Osteoarthrose unterscheidet, ist die rheumatoide Arthritis (Bresnihan, 1999). Die
rheumatoide Arthritis ist eine häufige, chronisch verlaufende, entzündliche
Autoimmunerkrankung, die - ähnlich der Osteoarthrose - in der Regel mit Knorpel-
und Gelenkzerstörung einhergeht (Lee und Weinblatt, 2001). Kennzeichnend für die
rheumatoide Arthritis sind Entzündungsvorgänge in den Gelenken, ein gestörtes
Immunsystem und eine Hyperplasie der Synovia (Gay, 1998). Die Prävalenz der
rheumatoiden Arthritis beträgt weltweit etwa 1%, wobei Frauen dreimal häufiger
betroffen sind (Lipinsky, 1994). In finnischen und britischen Studien konnte gezeigt
werden, dass bei eineiigen Zwillingen eine Konkordanz von ca. 12-15% für die
rheumatoide Arthritis vorliegt, bei zweieiigen Zwillingen liegt diese bei ca. 4% (Aho et
al., 1986; Silman et al., 1993). Auch ein Studie von MacGregor et al. (2000) konnte
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Einleitung
zeigen, dass genetische Faktoren bei einer Prädisposition zur rheumatoiden Arthritis
eine bedeutende Rolle spielen.
Bei der rheumatoiden Arthritis handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung. Am
Anfang der Immunantwort steht die Präsentation eines Antigens auf den HLA-
Molekülen von antigenpräsentierenden Zellen an die T-Lymphozyten. Dabei werden
CD4+ Lymphozyten (T-Helfer Zellen) durch HLA-Moleküle der Klasse II (z.B. HLA-
DR, -DQ) aktiviert (Lang, 1991). Assoziationen zwischen rheumatoider Arthritis und
den humanen Lymphozyten-Antigenen HLA-DR1, HLA-DR4 und HLA-DR14 (Nepom
et al., 1989; Newton et al., 2004), sowie auffälligen T-Zell-Infiltraten, lassen eine
Schlüsselfunktion von T-Lymphozyten an der Pathogenese der rheumatoiden
Arthritis vermuten. Dabei werden extrazelluläre Matrixproteine wie Kollagen Typ II, IX
und XI, Aggrekan, „cartilage link protein“ oder Hitzeschockproteine als mögliche Zell-
Autoantigene diskutiert (Verheijden et al., 1997; Li et al., 2000). Nach Aktivierung der
T-Lymphozyten kommt es zur Stimulierung von Plasmazellen, Mastzellen,
Makrophagen und Synovialzellen und zur Produktion proinflammatorischer Zytokine,
wie z.B. Interleukin-1 (IL-1), Tumor-Nekrose-Faktor-α, sowie von matrixabbauenden
Enzymen (z.B. Kollagenasen). Diese tragen zur Zerstörung der Matrix, sowie der
Resorption von Knorpel und Knochen bei (Breedveld, 1998).
Trotz intensiver Bemühungen sind auch bei der rheumatoiden Arthritis die
Pathomechanismen nicht verstanden. Assoziationsstudien geben zwar erste
Hinweise auf die mögliche Beteiligung verschiedener genetischer Faktoren, aufgrund
der Komplexität beider Erkrankungen konnten jedoch noch keine eindeutigen
molekularen Auslöser der Osteoarthrose und der rheumatoiden Arthritis aufgezeigt
werden.
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Einleitung
1.3 Zielsetzung Defekte bei Bildung, Wachstum und Homöostase des Skeletts sind verantwortlich für
eine Reihe menschlicher Erkrankungen, zu denen neben zahlreichen
Skelettdysplasien und Kraniosynostosen auch Osteoarthrose und rheumatoider
Arthritis gehören. Da die diesen Erkrankungen zugrunde liegenden molekularen
Prozesse nur in Ansätzen aufgeklärt sind, war es Ziel der Arbeit, neue Gene, die in
die komplexen Prozesse der Knorpel-/Knochenbildung, -differenzierung und
-homöostase beim Menschen involviert sind, zu identifizieren und molekular zu
charakterisieren. Hierbei wurden zwei unterschiedliche Strategeien verfolgt.
Zum einen sollte mittels EST-Sequenzierung (in Kooperation mit Kollegen in Mainz)
ein Expressionsprofil von humanem fetalen Wachstumsfugen-Knorpel erstellt
werden. Durch bioinformatische Auswertung der Daten sollten Gene identifiziert und
weitergehend charakterisiert werden.
Parallel zu dieser breit angelegten, grundlegenden Strategie sollten zum anderen in
einem Patienten-basierten Ansatz Kandidatengene durch Untersuchung eines
klinisch interessanten Falls identifiziert und weiter evaluiert werden. Hierzu sollten die
Bruchpunkte und betroffenen Gene bei einem der extrem seltenen Fällen von
Kraniosynostose mit balancierter Translokation kartiert werden, um so nicht nur neue
Gene für die Krankheitsgruppe zu identifizieren, sondern auch neue Komponenten
der Schädelknochenentwicklung zu detektieren.
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Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.2 Isolierung von DNA
2.2.1 Isolierung von genomischer DNA aus Blut Die Isolierung von genomischer DNA aus Blut erfolgte mit Hilfe von QiagenGenomic-
tip 20/G Säulen (Qiagen, Hilden) entsprechend der Angaben des Herstellers. 1 ml
Vollblut wurden mit 1 ml eiskaltem C1-Puffer und 3 ml eiskaltem A.bidest vermischt
und 10 min auf Eis inkubiert. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 1300 x g (4°C)
wurde das Präzipitat in 0,25 ml eiskaltem C1-Puffer und 0,75 ml eiskaltem A.bidest
resuspendiert und erneut bei 1300 x g für 15 min (4°C) zentrifugiert. Nach
Resuspension des Präzipitats in 1 ml G2-Puffer wurden 25 µl Proteinase-K-Lösung
(20 mg/ml) zugesetzt und bei 50°C für 1 h inkubiert. Die nun klare Lösung wurde
dann auf eine mit 1 ml QBT-Puffer äquilibrierte Qiagen Genomic-tip 20/G Säule
aufgetragen und mit 3 x 1 ml QC-Puffer gewaschen. Die Elution der genomischen
DNA von der Säule erfolgte mit 2 x 1 ml QF-Puffer. Nach Isopropanolfällung und
Waschen der DNA in 70% Ethanol konnten zwischen 10 und 20 µg genomischer
DNA gewonnen werden.
2.2.2 Alkalische Lyse zur Mini-Präparation von Plasmid-DNA Diese Isolierungsmethode basiert auf der Präparationsmethode von Birnboim und
Doly (1979) und dient zur schnellen Präparation von Plasmid-DNA, wobei die
Qualität der DNA für Restriktionsanalysen und Sequenzierungen ausreichte.
Dazu wurden 2 ml LB-Medium mit Antibiotika versetzt, mit der E.coli-Kolonie
angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zellernte erfolgte durch
Zentrifugation (10 min, 4000 x g). Dann wurden die Zellen in 100 µl Lösung I
resuspendiert und durch Zugabe von 200 µl Lösung II lysiert. Zur Fällung bakterieller
Proteine und chromosomaler DNA wurden 300 µl Lösung III dazugegeben und der
Ansatz 10-15 min auf Eis inkubiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (5
min, 14000 x g) wurde der plasmidhaltige Überstand abgenommen und zur Fällung
der DNA mit 350 µl 100% Isopropanol versetzt, abzentrifugiert (5 min, 14000 x g) und
der Überstand verworfen. Das DNA- Präzipitat wurde dann mit 100 µl RNase-
haltigem-TE-Puffer (100 µg/ml) für 10-15 min bei 37°C inkubiert, zur Fällung mit
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Material und Methoden
120 µl Lösung IV versetzt, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert (5
min, 14000 x g). Der Überstand wurde verworfen, das Präzipitat getrocknet und in 50
µl A.bidest gelöst. Für die Langzeitlagerung der Bakterien wurden Teile der
Übernachtkultur mit einem gleichen Volumen 2 x FM (Freezing Medium) versetzt und
die Glycerin-Kultur bei -80°C gelagert.
2.2.3 Midi- und Maxi-Plasmid-DNA-Präparation mit Hilfe einer Affinitätssäule
Die Isolierung größerer Mengen an qualitativ hochreiner Plasmid-DNA wurde mit
Hilfe des „QIAGEN Plasmid Midi Kits“ bzw. des „QIAGEN Plasmid Maxi Kits“ nach
Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden) durchgeführt. Die isolierte DNA wurde
direkt zur Restriktion, Sequenzierung und Transfektion eingesetzt.
Aus 25 ml (Midi-Präparation) bzw. 100 ml (Maxi-Präparation) einer Übernachtkultur
wurden durch Zentrifugation (4°C, 15 min, 6000 x g) die Bakterien präzipitiert und
durch Zugabe von 4 ml (Midi-Präparation bzw. 10 ml (Maxi-Präparation) Puffer-1
lysiert. Nach Zugabe von 4 ml (Midi-Präparation) bzw. 10 ml (Maxi-Präparation)
Puffer-2 und 4-6 maligem Invertieren wurde der Ansatz für 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert und nach Zugabe von 4 ml (Midi-Präparation) bzw. 10 ml
(Maxi-Präparation) Puffer-3 und erneutem 4-6 maligem Invertieren 15-20 min auf Eis
inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (4°C, 30 min, 20000 x g) wurde der
Überstand durch einen Faltenfilter auf den vorher mit 4 ml (Midi-Präparation) bzw. 10
ml (Maxi-Präparation) Puffer-QBT äquilibrierten QIAGEN-tip 100 bzw. QIAGEN-tip
500 gegeben und die Säule anschließend mit 2 x 10 ml (Midi-Präparation) bzw. 2 x
30 ml (Maxi-Präparation) Puffer-QC gewaschen. Die Plasmid-DNA wurde mit 5 ml
(Midi-Präparation) bzw. 15 ml (Maxi-Präparation) Puffer-QBT eluiert und nach
Zugabe von 3,5 ml (Midi-Präparation) bzw. 10,5 ml (Maxi-Präparation) 100%
Isopropanol bei 14000 x g für 30 min bei 4°C gefällt. Nach einem Waschschritt mit 2
ml (Midi-Präparation) bzw. 5 ml (Maxi-Präparation) 70% Ethanol wurde die Plasmid-
DNA erneut abzentrifugiert (4°C, 30 min, 15000 x g) und nach dem Trocknen des
Präzipitats in 100 µl (Midi-Präparation) bzw. 300 µl (Maxi-Präparation) A.bidest
gelöst.
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Material und Methoden
2.3 Isolierung von RNA
2.3.1 Isolierung von RNA aus eukaryontischen Zellkulturen Diese Isolierungsmethode basiert auf der Präparationsmethode von Chomzynski
(1987). Die 2 x 106 Zellen wurden einmal mit 1 x PBS gewaschen und anschließend
mit TRIzol (GibcoBRL, Karlsruhe) direkt auf der Zellkulturplatte lysiert (1 ml TRIzol
pro 10 cm2). Die Homogenisation der Zellen erfolgte dann durch mehrmaliges auf-
und abziehen mit einer 26 gauge Nadel. Zur Entfernung extrazellulärer
Matrixbestandteile, nicht lysierter Zellen etc. wurde die Suspension bei 12000 x g für
15 min (4°C) zentrifugiert. Der Überstand wurde für 5 min bei Raumtemperatur
inkubiert, mit 1/5 Volumen Chloroform versetzt und durch mehrmaliges Invertieren
vermischt. Die Phasentrennung erfolgte dann bei 12000 x g für 15 min (4°C). Die
wässrige Phase wurde mit 1/2 Volumen Isopropanol versetzt und die RNA in einem
Zentrifugationsschritt (12000 x g, 10 min, 4°C) gefällt. Nach einem Waschschritt mit 1
ml 75% Ethanol und erneutem Zentrifugieren (7500 x g, 5 min, 4°C) wurde die RNA
getrocknet und in 50 µl A.bidest gelöst.
2.3.2 Isolierung von RNA aus menschlichem und murinem Gewebe Zur Gewinnung von Gesamt-RNA aus Gewebe wurde je nach zu erwartender
Ausbeute 50-100 mg tiefgefrorenes Gewebe in flüssigem Stickstoff fein zermörsert,
in 1 ml TRIzol (GibcoBRL, Karlsruhe) aufgenommen und in einem
Glashomogenisator 2 min homogenisiert. Nach 5 minütiger Inkubation bei
Raumtemperatur wurde die Probe mit 0,2 ml Chloroform versetzt und entsprechend
2.3.1 weiterverarbeitet.
2.3.3 DNase I-Behandlung von RNA Um Kontaminationen der isolierten RNA mit DNA auszuschließen, erfolgte eine
Inkubation der RNA mit DNase I in einem Reaktionspuffer bestehend aus 1 x TE-
Puffer, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 Units RNase-Inhibitor (Invitrogen, Karlsruhe)
und 10 Units DNase I (Roche, Mannheim) für 2 h bei 25°C. Anschließend wurde die
RNA erneut mit TRIzol und Chloroform extrahiert und mit Isopropanol gefällt. Die
gereinigte RNA wurde nochmals mit 75% Ethanol gewaschen, bei Raumtemperatur
getrocknet und in 50 µl A.bidest. gelöst.
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Material und Methoden
2.4 RNA- und DNA-Standardmethoden
2.4.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen Die Verwendung von Restriktionsenzymen zur Spaltung von DNA erfolgte nach
Angaben des Herstellers und unter Verwendung der mitgelieferten Restriktionspuffer.
Die verwendete Enzymmenge wurde je nach Aktivität des entsprechenden Enzyms,
sowie der Qualität und Menge der zu restringierenden DNA variiert.
2.4.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA und RNA Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte auf horizontalen
0,8-2-%igen Agarosegelen. Als Puffersystem diente dabei 1 x TBE. Zur
Größenbestimmung wurden entsprechende Molekulargewichtsstandards (100 bp
„Leiter“, 1 kb „Leiter“ (Gibco BRL, Eggenstein)) und λ-DNA (Hind III restringierte;
Roche, Mannheim) benutzt. Die Auftrennung von RNA erfolgte auf horizontalen
1,2%igen Agarosegelen (1% Formaldehyd, 1 x MOPS). Als Laufpuffer wurde 1 x
MOPS verwendet. Vor der Elektrophorese wurde die RNA nach Zusatz von
Formaldehyd (Endkonzentration 2,2 M), Formamid (Endkonz. 50%) und MOPS-
Puffer (Endkonz. 0,5 x) für 15 min bei 55°C zur Denaturierung inkubiert und nach
Zugabe von RNA-Ladepuffer und Ethidiumbromid (Endkonz. 10 µg/ml) im Gel
aufgetrennt. Als Molekulargewichtsstandard wurde die „RNA-Leiter“ der Firma
Invitrogen (Karlsruhe) verwendet. Die Dokumentation erfolgte unter UV-Licht mit dem
BioDocAnalyze (Biometra, Göttingen).
2.4.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Nach elektrophoretischer Trennung von DNA-Fragmenten in Agarosegelen wurden
die Ethidiumbromid-gefärbten Banden auf einem Transilluminator aus dem Gel
ausgeschnitten. Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit
Hilfe des JETquick Gel Extraction Spin Kit (Genomed, Bad Oeynhausen).
2.4.4 Fällung von DNA und RNA Plasmid-DNA und Sequenzierreaktionen wurden nach Zusatz von 1/10 Volumen 3 M
Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100% Ethanol für 15 min bei -70°C gefällt.
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Material und Methoden
Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 16000 x g wurde das Präzipitat mit 70% Ethanol
gewaschen, für 10 min erneut zentrifugiert und luftgetrocknet.
PCR-Produkte, die für die Sequenzierung benötigt wurden, wurden zur Entfernung
von Oligonukleotiden durch Zugabe von 1 Volumen 4 M Ammoniumacetat und 2
Volumen 100% Isopropanol bei Raumtemperatur gefällt. Nach 30 minütiger
Zentrifugation (16000 x g) wurde das Präzipitat mit 70% Ethanol gewaschen, 10 min
zentrifugiert und luftgetrocknet. Die DNA-Präzipitate wurden standardmäßig in
A.bidest gelöst.
Zur quantitativen RNA-Fällung wurde die RNA mit 2 µl Glykogen (10 mg/ml),
1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100% Ethanol versetzt
und 10 min in Trockeneis gefällt (alternativ kann die Fällung auch für 30 min bei
-80°C durchgeführt werden). Nach 20 minütiger Zentrifugation bei 16000 x g und 4°C
wurde das Präzipitat mit 70% Ethanol gewaschen, für 10 min bei 16000 x g und 4°C
zentrifugiert und luftgetrocknet.
2.5 Klonierung
2.5.1 Klonieren von PCR-Produkten Zur Klonierung von PCR-Produkten wurde der „TOPO TA Cloning Kit“ (Invitrogen)
oder bei PCR-Produkten >4 kb der „TOPO XL PCR Cloning Kit“ (Invitrogen)
verwendet. Die Klonierungen erfolgten nach Angaben des Herstellers.
2.5.2 Subklonierung von DNA-Fragmenten Zur Subklonierung von DNA-Fragmenten wurde der Plasmid-Vektor pEGFP-N1
(Clontech, Heidelberg) mit dem entsprechenden Restriktionsenzym verdaut (siehe
Kapitel 2.4.1) und die überhängenden Enden mit alkalischer Phosphatase aus
Kälberdarm (Roche, Mannheim) entsprechend der Angaben des Herstellers
dephosphoryliert. Die für die Subklonierung vorgesehenen DNA-Fragmente wurden
mit Linker-Primern per PCR amplifiziert, mit einem entsprechenden
Restriktionsenzym geschnitten (siehe Kapitel 2.4.1) und in den Vektor kloniert (siehe
Kapitel 2.5.1). Die Aufreinigung der DNA-Fragmente und der Vektor-DNA erfolgte
über ein Agarosegel (siehe Kapitel 2.4.2). Zur Durchführung der Ligation wurde
geschnittene Vektor-DNA mit den zu klonierenden DNA-Fragmenten so gemischt,
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Material und Methoden
dass eine dreifach höhere Konzentration der Integrate gegenüber der Vektor-DNA
vorlag. Dieses Gemisch wurde in Ligationspuffer mit 5 U T4-DNA-Ligase (Gibco BRL,
Karlsruhe) bei Raumtemperatur für 2 h oder Übernacht bei 4°C inkubiert.
2.5.3 Transformation und Selektion positiver Klone Die Transformation von Bakterien des Stammes E.coli DH5α erfolgte nach der
Methode von Hanahan (1983). Zur Herstellung der kompetenten Zellen wurden 100
ml LB-Medium mit einer Übernachtkultur von DH5α angeimpft (OD550=0,05) und
unter Schütteln bei 37°C inkubiert, bis die Bakteriensuspension eine optische Dichte
von OD550=0,5 erreicht hatte. Die Zellen wurden präzipitiert (4°C, 8 min, 1200 x g),
vorsichtig in 30 ml TfbI-Puffer resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach
anschließender Zentrifugation (4°C, 8 min, 800 x g) wurden die Bakterien in 4 ml
TbfII-Puffer vorsichtig resuspendiert und in 100 µl aliquotiert. Die in flüssigem
Stickstoff schockgefrorenen Zellen wurden bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.
Zur Transformation wurden 100 µl der kompetenten Bakterienzellen mit der Hälfte
des Ligationsansatzes vermischt und für 10 min auf Eis inkubiert. Die Aufnahme der
Vektor-DNA in die Bakterienzellen erfolgte durch einen 1 minütigen Hitzeschock bei
42°C. Nach einer 5 minütigen Inkubation auf Eis wurde 800 µl LB-Medium zugesetzt
und die Zellen bei 37°C für 40 min geschüttelt. Jeweils 100 µl bzw. 500 µl wurden auf
antibiotikahaltigen LB-Platten (50 µg/ml Ampicillin bzw. 25 µg/ml Kanamycin)
ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet. Zur Überprüfung der Integrate wurde
eine Kolonie-PCR mit vektor- bzw. integratspezifischen Primern durchgeführt und
positive Klone sequenziert.
2.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR (Saiki et al., 1988) wurde in 50 µl Ansätzen mit jeweils 10 pmol der beiden
Primer, 200 µM dNTPs, PCR-Puffer, sowie 0,5-1 U Taq-Polymerase (GibcoBRL,
Karlsruhe) durchgeführt. Die Amplifikationsbedingungen wurden entsprechend der
verwendeten Primerpaare, sowie deren DNA-Matrizen variiert und ausgehend von
einem Standardprogramm (erster Denaturierungsschritt: 3 min 94°C; 30 Zyklen á 1
min 94°C, 1 min 58°C, 1 min 72°C; Extensionsschritt 10 min 72°C) entsprechend
verändert. Als Template wurden 10-20 ng Plasmid-DNA, 1 µl cDNA oder 1-2 µl
Bakterien-Glycerinkultur pro PCR-Reaktion eingesetzt.
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Material und Methoden
Bei sehr GC-reichen Matrizen wurde die AmpliTaq Gold entsprechend der Angaben
des Herstellers verwendet und dem PCR-Ansatz 10% 5 M Betain zugesetzt. Als
weitere Zusätze wurden bei Auftreten von unspezifischen PCR-Produkten Glycerol
(5-10% Endkonzentration), DMSO (5% Endkonzentration) oder Ammoniumsulfat (60
mM Endkonzentration) verwendet.
Die Amplifikation von DNA-Fragmenten > 4 kb erfolgte mit dem „Long Expand High
Fidelity PCR System“ (Roche, Mannheim) nach Angaben des Herstellers. Die
Amplifikation erfolgte in einem Mastercyclergradient (Eppendorf, Hamburg), einem
PCR Express (Thermo Hybaid, UK) oder einem PTC-225™ (MJ Research, USA). Zur
Überprüfung der PCR-Reaktion wurde in der Regel 1/10 des Reaktionsansatzes in
einem Agarosegel aufgetrennt (siehe Kapitel 2.4.2).
2.7 RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion) Für die Erststrangsynthese der isolierten RNA (reverse Transkription) wurde die
„SuperScript™ II RNase H- Reverse Transkriptase“ (Invitrogen, Karlsruhe) nach
Angaben des Herstellers verwendet. Pro Reaktion wurden 1-4 µg RNA eingesetzt.
Die Zweitstrangsynthese erfolgte unter Verwendung von genspezifischen Primern
(siehe Kapitel 2.6).
2.8 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) Die RACE wurde nach einem veränderten Original-Protokoll von Frohmann et al.
(1993) und mit Hilfe des „GeneRacer™-Kit“ (Invitrogen, Karlsruhe) nach
Herstellerangaben durchgeführt. Pro Reaktion wurde zwischen 1-5 µg Gesamt-RNA
eingesetzt. Für die reverse Transkription wurden entweder genspezifische Primer (2
pmol) oder Random Primer (100 ng) verwendet. Als reverse Transkriptase wurde die
„SuperScript™ II RNase H- Reverse Transkriptase“ (Invitrogen, Karlsruhe) benutzt.
2.9 Quantitative „Real-Time“- PCR Durch die „Real-Time“-PCR ist ein spezifischer und quantitativer Nachweis von
Zielsequenzen möglich. Die Amplifizierung und der Nachweis des PCR-Produktes
erfolgt simultan unter Ausnutzung der 5’-3’-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA-
Polymerase (Holland et al., 1991). Der quantitative Nachweis des PCR-Produktes
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Material und Methoden
erfolgt über eine markierte Sonde. Die Sonde ist ein zur Zielsequenz
komplementäres Oligonukleotid und zwischen den beiden Primern lokalisiert. Das 5‘-
Ende der Sonde ist mit einem fluoreszierender Reporter-Farbstoff (Fluorescein-
Derivat) und das 3‘-Ende mit einem Quencher Farbstoff (Rhodamin-Derivat) (Livak et
al., 1995) markiert. Die Enden der Sonde sind durch Phosphatreste blockiert, so
dass die Sonde nicht als Primer für die Polymerase fungieren kann. Wird die intakte
Sonde bei einer spezifischen Wellenlänge (488 nm) angeregt, wird die Fluoreszenz
durch die räumliche Nähe des Reporter-Farbstoffs zum Quencher durch einen
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von diesem unterdrückt. Nachdem
die Sonde mit den Primern an den Matrizenstrang hybridisiert ist, wird sie in der
Elongationsphase von der Taq-Polymerase verdrängt. Dabei entsteht eine Y-förmige
Sekundärstruktur, die die Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase aktiviert, so
dass die Sonde geschnitten wird. Dadurch wird die räumliche Nähe zwischen
Reporter und Quencher und somit der FRET aufgehoben. Die Emission des
Reporters, die direkt gemessen werden kann, steigt entsprechend der
Akkumulierung des PCR-Produkts an, da für jedes einzelne synthetisierte Molekül
ein spezifisches Signal erzeugt wird. Über die ersten zehn Zyklen der „Real-Time“-
PCR, in denen noch keine nennenswerten Produktmengen zu detektieren sind,
wurde eine Basislinie ermittelt und deren Zehnfaches als Schwellenwert (Threshold)
definiert. Da die Anzahl der Zyklen, die bis zum Überschreiten des Schwellenwertes
benötigt werden (Ct-Werte), direkt proportional zur Anzahl der Anfangskopien in der
Probe sind, kann durch einen Vergleich mit ubiquitär exprimierten Haushaltsgenen
die semiquantitative Konzentration der zu untersuchenden Zielsequenz ermittelt
werden. Die „Real-Time“-PCR wurde mit Hilfe des QuantiTect Probe RT-PCR Kit
(Qiagen, Hilden) durchgeführt. Die Reaktion wurde in 15 µl Volumen mit je 0,4 µM
der beiden Primer, 0,1-0,2 µM Probe, 7,5 µl 2x QuantiTect Probe RT-PCR Master
Mix, 0,15 µl QuantiTect RT-Mix und 1-20 ng RNA durchgeführt. Die cDNA-Synthese
und Amplifikation der Produkte erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Als
Cycler wurde das ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System von Applied
Biosystem verwendet.
2.10 „Random primed oligo labelling“ Für die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten nach Feinberg und Vogelstein
(1983) wurden 20-50 ng denaturierte DNA und 30 µCi [α-32P] dCTP zu den „Ready-
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Material und Methoden
To-Go™ DNA Labelling Beads“ (Amersham, Freiburg) vermischt und für 15-30 min
bei 37°C inkubiert. Zur Abtrennung nicht eingebauter Nukleotide wurden die
markierten DNA-Fragmente über SSPE-äquilibrierte Sephadex G50-Säulen
entsprechend der Angaben des Herstellers aufgereinigt.
2.11 Ligation von T7-Promotoren an PCR-Produkten Zur Ligation eines T7-Promotors an PCR Produkte wurde das Lig`n Scribe Kit
(Ambion) entsprechend der Angaben des Herstellers benutzt. Die Produkte dienten
zum DIG-RNA-Labelling durch in vitro-Trankription.
2.12 DIG-RNA-Labelling durch in vitro-Transkription Die Markierung von RNA-Sonden mit Digoxigenin (DIG) für die RNA-in situ-
Hybridisierung an Gewebeschnitten (siehe Kapitel 2.16) erfolgte mittels in vitro-
Transkription in einem 20 µl Ansatz mit 1 µg aufgereinigter, linearisierter Plasmid-
DNA oder 200 ng aufgereinigtem, mit einem T7-Promotor versehenen PCR-Produkt
(siehe Kapitel 2.11), 2 µl 10 x DIG-RNA-Labeling Mix, 40 U RNA-Polymerase und 40
U RNaseOUTTM in 1 x Transkriptionspuffer für 2 h bei 37°C. Als RNA-Polymerase
wurde die T7- oder T3-Polymerase eingesetzt. Die Plasmid-DNA wurde mit 2 U
Dnase I für 15 min bei 37°C verdaut und anschließend eine Chloroform-Phenol-
Extraktion (siehe Kapitel 2.3.1) durchgeführt. Transkription und Verdau wurden auf
einem Agarosegel getestet.
Um die Effizienz der DIG-Markierung zu überprüfen, wurde eine Verdünnungsreihe
der markierten Sonden (1:102, 1:103, 1:104, 1:105, 1:106) auf eine positiv geladene
Nylonmembran (PALL Corporation, Pensacola) aufgetropft und über Nacht
luftgetrocknet. Die Membran wurde 5 min in Puffer I (100 mM Tris-HCl, 150 mM
NaCl, pH 7,5) gewaschen und für 15 min wurden unspezifische Bindungsstellen mit
Puffer II (1% w/v Blocking Reagenz in Puffer I) abgesättigt. Der Nachweis der
eingebauten DIG-Moleküle erfolgte mit AP-konjugierten Anti-DIG-Fab-Fragmenten
(Verdünnung 1:5000 in Puffer II) für 45 min bei Raumtemperatur. Anschließend
wurde die Membran 2 x 10 min in Puffer I gewaschen und 5 min in Puffer III (100 mM
Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5) äquilibriert. Die Substratreaktion
erfolgte im Dunkeln mit NBT/BCIP bei 37°C in Puffer III und wurde durch kurzes
Waschen in 1 x PBS gestoppt.
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Material und Methoden
2.13 DNA-RNA-Hybridisierung (Northern-Hybridisierung) Für die Northern-Blot-Hybridisierung wurden ca. 20 µg Gesamt-RNA auf einem
1,2-%igem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Im Anschluss wurde das Gel
20 min in DEPC-behandeltem A.bidest und 10 min in 20 x SSC inkubiert. Die RNA
wurde dann über Nacht mit 20 x SSC als Transferpuffer auf eine vorher mit 2 x SSC
präequilibrierte positiv geladene Nylonmembran (Roche, Mannheim) transferiert. Die
Fixierung der RNA auf der Membran erfolgte durch 30 minütiges Backen bei 120°C.
Des Weiteren wurden kommerziell erhältliche humane „Multiple Tissue“ Northern
Blots, sowie „Multiple Tissue Expression Arrays“ (Clontech, Heidelberg) verwendet.
Die Prähybridisierung dieser Filter erfolgte für 30 min bei 68°C. Die Hybridisierung
mit der denaturierten radioaktiv markierten Sonde (siehe Kapitel 2.10) in einer
Konzentration von 1-2 x 106 cpm/ml Expresshyb-Hybridisierungspuffer (Clontech,
Heidelberg) wurde bei 68°C über Nacht durchgeführt. Im Anschluss wurden die Filter
bei Raumtemperatur für 40 min in 2 x SSC/ 0,05% SDS und anschließend für 40 min
in 0,1 x SSC/ 0,1% SDS bei 50°C unter mehrmaligem Wechseln der Waschpuffer
gewaschen. Zur Autoradiographie wurden die noch feuchten Filter in Folie
eingewickelt mit einem Röntgenfilm (Hyperfilm MP; Amersham, Freiburg) bedeckt
und in einer mit Verstärkerfolie (Rego, Augsburg) ausgekleideten Filmkassette bei –
80°C exponiert.
2.14 DNA-RNA-Hybridisierung (Dot-Blot-Hybridisierung) MTE-Arrays (Clontech, Heidelberg) wurden nach Angaben des Herstellers
hybridisiert. Als Sonden wurden radioaktiv markierte PCR-Produkte eingesetzt (siehe
Kapitel 2.10). Bei selbst hergestellten Dot-Blots wurden 4 µg RNA mit einer
entsprechenden Menge an 10 x Denaturierungslösung versetzt und für 10 min bei
65°C denaturiert. Anschließend wurde die RNA auf eine Nylon-Membran (Roche,
Karlsruhe) gespottet und zur Fixierung für 30 min bei 120 °C gebacken. Die
Hybridisierung erfolgte anschließend analog zu den MTE-Arrays (Clontech,
Heidelberg).
2.15 DNA-DNA-Hybridisierung DNA-Fragmente aus Agarosegelen wurden mittels der von Southern (1975)
beschriebenen Methode auf eine Nylonmembran (Hybond-N+) transferiert, wobei ein
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Material und Methoden
unidirektionaler Aufbau gewählt wurde. Das Agarosegel wurde hierzu vorher für 30
min in Denaturierungspuffer denaturiert. Anschließend erfolgte der Transfer für 4 h
mit 10 x SSC als Transferpuffer. Die Nylonmembran wurde daraufhin zur Fixierung
der DNA im Ofen für 30 min bei 80°C gebacken. Die Hybridisierung erfolgte dann wie
unter 2.13 beschrieben. Als Hybridisierungstemperatur wurde 65°C gewählt.
2.16 DNA-Sequenzierung Zur DNA-Sequenzierung wurde die auf Sanger et al. (1977) beruhende
Kettenabbruchmethode verwendet, die von Lee et al. (1992) für die Markierung von
DNA mit fluoreszierenden Didesoxynukleotiden modifiziert wurde.
Die Reaktion wurde in 10 µl Ansätzen mit jeweils 5 pmol Primer, 0,5 µl Big Dye
Version 3.1, (Applied Biosystems, Weiterstadt) und 2 µl 5 x Sequenzierpuffer
(Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt. Als Template dienten 500 ng bis 1
µg Plasmid-DNA bzw. 50 bis 300 ng isopropanolgefällte PCR-Produkte. Die DNA
wurde in einer linearen PCR-Reaktion sequenziert (1. Denaturierungsschritt: 96°C 1
min; 25 Zyklen: 96°C 20 s, 50°C 5 s, 60°C 4 min). Die anschließende Aufreinigung
der Sequenzierungsansätze erfolgte durch Ethanolfällung bzw. mit Hilfe des „Mini
Prep 75“ Roboters (Tecan, Crailsheim). Die Analyse der DNA-Sequenzierung wurde
mithilfe des Sequenziergerätes ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer bzw. 3730 DNA
Analyzer (Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt.
2.17 RNA-in situ-Hybridisierung von Gewebeschnitten Die Untersuchung der Genexpression mittels RNA-in situ-Hybridisierung erfolgte an
Embryonen des Mausstammes BALB/c- der Stadien E18.5 und Neugeborenen (P0-
P1). Dazu wurden 8-14 µm dicke Gefrierschnitte mit Hilfe eines Kryostaten
angefertigt. Nach Trocknen der Schnitte auf den Objektträgern für 10 min bei
Raumtemperatur und anschließend für 15 min bei 50°C, einer Fixierung für 15 min
bei -20°C in Aceton und erneutem Trocknen wurden die Präparate bis zur weiteren
Verwendung luftdicht bei -80°C gelagert.
Für die RNA-in situ-Hybridisierung mit Digoxigenin markierten RNA-Sonden (siehe
Kapitel 2.12) wurden die Schnitte für 1 h bei Raumtemperatur aufgetaut, das
Gewebe für 30 min in 4% PFA/1 x PBS bei Raumtemperatur fixiert und für 2 x 5 min
in PTW gewaschen. Anschließend erfolgte für 2 h eine Prähybridisierung mit 100 µl 5
- 28 -
Material und Methoden
x SSC/1 x Formamid pro Objektträger bei 60-64°C in einer feuchten Kammer. Nach
Denaturierung für 10 min bei 80°C wurden die RNA-Sonden zur Hybridisierung in
einer Konzentration von 200 ng/ml Hybridisierungslösung (5 x SSC/1 x Formamid)
eingesetzt. Pro Gewebeschnitt wurden 50 µl der entsprechend konzentrierten Sonde
luftblasenfrei auf die Schnitte pipettiert und je nach Stringenz bei 60-64°C über Nacht
in einer feuchten Kammer inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Objektträger 3 x
20 min in 2 x SSC bei 60°C, 3 x 20 min in 0,1 x SSC bei 60°C und 1 x 5 min in 1 x
PBT bei Raumtemperatur gewaschen. Nach 30 minütiger Inkubation in
Blockierungslösung wurden pro Gewebeschnitt 50 µl 1:100 in Blockierungslösung
verdünnte „AP-konjugierte Anti-Digoxigenin Fab-Fragmente“ zugegeben und für 1 h
bei 37°C inkubiert. Die Substratreaktion erfolgte nach dem Waschen der Schnitte für
2 x 5 min in PBT und 2 x 5 min in NBT-Puffer nach Angaben des Herstellers mit einer
NBT/BCIP-haltigen Substratlösung für 0,5-2 h bei 37°C oder bei 4°C über Nacht. Die
Reaktion wurde durch 5 minütige Inkubation in 1 x PBS abgestoppt, die Objektträger
mit wenigen Tropfen Crystal/MountTM bedeckt, für 10 min bei 70°C getrocknet und
nachfolgend mit ClarionTM Mounting Medium eingedeckelt. Die histologische
Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Vergleichsschnitten erfolgte nach Angaben des
Herstellers (Sigma, Taufkirchen). Die Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Leica MZ16
Mikroskops (Leica, Solms). Die Ergebnisse wurden mit einer DC300 Kamera (Leica,
Solms) und der IM-Software Version 1.20 (Leica, Solms) dokumentiert.
2.18 Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH)
2.18.1 Nicktranslation für direkt markierte Sonden Um die benötigten Sonden zu markieren, wurde die Technik der Nicktranslation
angewendet. Dabei wurden fluoreszenzmarkierte Nukleotide nachträglich in den
DNA-Strang eingebaut. 1 µg Plasmid wurde mit Ampuva auf 12 µl aufgefüllt. Nach
Zugabe von 4 µl des 5 x-Fluorophor-Mix und 4 µl des Nicktranslations-Mix wurde gut
gemischt und die Proben für 2 h bei 15°C inkubiert. Nach den 2 h wurden 20 µl
Stoppmix und 60 µl TE zugegeben. Die markierten Sonden wurden nun über
Sephadexsäulen aufgereinigt, um nicht eingebaute Nukleotide, Enzyme und
Puffersubstanz zu entfernen. Zur Herstellung der Säulen wurden 1 ml-
Einwegspritzen mit einem Stopfen aus Glaswolle versehen, mit Sephadex aufgefüllt
und in ein Zentrifugierröhrchen gegeben. Durch abwechselnde Zentrifugation
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Material und Methoden
(3000 x g, 3 min) und Auffüllung wurde eine Sephadex-Säule bis zur 1 ml-Marke
aufgebaut. Anschließend wurde auf jede Säule 100 µl TE-Puffer gegeben und
nochmals zentrifugiert. Die Flüssigkeit wurde verworfen und in das
Zentrifugierröhrchen, ein deckelloses Eppendorfgefäß, gegeben. Die Säulen wurden
bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt. Das Gemisch wurde auf die Säule
pipettiert und zweimal zentrifugiert (3000 x g, 3 min). Das Säuleneluat wurde mit 2 µl
Hering-Testis-DNA (Invitrogen, Karlsruhe), 2 µl Cot1-DNA (Invitrogen, Karlsruhe) und
500 µl 100% Ethanol gemischt und über Nacht oder länger bei -20°C gefällt. Die
gefällte DNA wurde zentrifugiert (13000 x g, 4°C, 30 min.) und der Überstand
verworfen. Zum Waschen des Präzipitats werden 500 µl 70% Ethanol zugegeben
und nochmals zentrifugiert (13000 x g, 4°C, 5 min). Der Überstand wurde
abgenommen und das Präzipitat mit Hilfe einer Speed-Vac für 4-6 min getrocknet.
Anschließend konnte die Sonde in 30 µl Dextransulfat gelöst werden und bei -20°C
gelagert werden.
2.18.2 Herstellung und Vorbehandlung der Chromosomenpräparate Objektträger, die in einer Lösung aus Essigsäure/Methanol gelagert wurden, wurden
sorgfältig mit A.bidest gespült und darin aufbewahrt. Ein Objektträger wurde
herausgenommen und mit einer Gummilippe kurz zweimal von überschüssigem
Wasser befreit. Die gut gemischte Lymphozytensuspension wurde aufgetropft und
der Objektträger geschwenkt. Die Präparate wurden unter einem Lichtmikroskop auf
genügend Metaphasen untersucht, ansonsten wurde nochmals Zellsuspension
aufgetropft. Die Objektträger wurden getrocknet und in einer Küvette mit 70%
Ethanol bei -20°C über zwei Nächte aufbewahrt. Auf die trockenen Objektträger
wurden zunächst 100 µl RNase-Lösung (0,05 µg/µl) gegeben und mit einem
Deckglas abgedeckt. In einer Metallbox wurden sie für exakt 3 min in bei 37°C
inkubiert. Nach Waschschritten mit 2 x SSC (3 x 5 min) und 1 x PBS (5 min) wurden
die Objektträger mit 0,005 % Pepsinlösung bei 37°C (Pepsin wurden erst kurz vor
Gebrauch zugegeben) behandelt. Anschließend wurden sie in einer Küvette mit
MgCl2-versetztem PBS (5 ml 1 M MgCl2, 95 ml 1 x PBS) für 5 min geschüttelt, um
den Pepsinverdau zu stoppen. Nach der Fixierung für 10 min in einer 1 %
Formaldehydlösung (5 ml 1 M MgCl2, 95 ml 1 x PBS, 2,7 ml Formaldehyd) wurden
kurz für 5 min in PBS gespült. Durch eine Ethanolreihe (70%, 90%, 100% für je
5 min) werden die Präparate entwässert.
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Material und Methoden
2.18.3 Denaturierung und Hybridisierung Für die DNA-Probe wurden 0,5 µl des Nicktranslationsansatzes mit 9,5 µl
Dextransulfat vermischt und zusätzlich 1 µl der entsprechenden Subtelomersonde
des anderen Chromosomenarms (zur eindeutigen Identifizierung des jeweiligen
Chromosoms) hinzugegeben. Je nach Größe des zu hybridisierenden Bereichs,
wurden etwa 1-3 µl des Hybridisierungsgemisches auf den trockenen Objektträger
gegeben und mit einem Deckglas möglichst blasenfrei abgedeckt. Der Objektträger
wurde mit Fixogum versiegelt und zur Denaturierung für 5 min auf eine Metallbox bei
75°C inkubiert. Die Hybridisierung erfolgte für zwei Tage bei 37°C in einer feuchten
Kammer.
2.18.4 Posthybridisierungswaschung Nach der Hybridisierung wurde das Fixogum entfernt und die Deckgläser vorsichtig
vom Objektträger geschoben. Die Präparate wurden für 2 min in 0,4 x SSC (75°C)
und anschließend kurz in 4 x SSC/0,2% Tween bei Raumtemperatur gewaschen. Auf
jeden Objektträger wurde 50 µl Dapi (1 µl Stammlösung auf 1 ml 4 x SSC) gegeben
und mit einem Deckglas abgedeckt. Nach einer vierminütigen Färbung im Dunkeln
wurde der Objektträger kurz mit A.bidest gespült. Wenn der Objektträger vollkommen
trocken ist, wurde er mit 20 µl Antifade luftblasenfrei eingedeckt. Die Objektträger
konnten nun unter dem Fluoreszenzmikroskop mit geeignetem Filter betrachtet
werden und wurden bei -20°C gelagert.
2.19 Zellbiologische Methoden
2.19.1 Kultur von adhärent wachsenden Zellen Adhärente Zelllinien wurden bei 37°C (95% relative Luftfeuchtigkeit) und einer 5%
CO2-Konzentration in 6-Well Platten (Greiner, Solingen) oder 100 mm Kulturschalen
(Greiner, Solingen) in Dulbecco´s modified Eagle Medium (DMEM, Mac Pherson und
Stoker, 1962), das mit 10% hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (GibcoBRL,
Karlsruhe) und Antibiotika (Penicillin-Streptomycin 100µg/ml, GibcoBRL, Karlsruhe)
komplettiert worden war, kultiviert. Verwendet wurden folgende adhärente Zelllinien:
COS7- (Gluzman, 1981), HEK293- (Graham et al., 1977), HCS-Zellen (Merluzzi et
al., 1987).
- 31 -
Material und Methoden
2.19.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen Als Einfriermedium wurde eine Mischung aus DMEM-Medium (Gibco BRL ,
Eggenstein) und 10% DMSO verwendet. Jeweils etwa 107 Zellen wurden in 2 ml des
Einfriermediums aufgenommen und dauerhaft in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Das Auftauen der Zellen erfolgte zügig durch Inkubation im Wasserbad bei 37°C und
sofortigem Überführen der Zellsuspension in vorgewärmtes Vollmedium.
2.19.3 Transfektion von adhärenten Zellen Für die transiente Transfektion von adhärenten Zellen wurde „Lipofectamin 2000“
Reagenz (Invitrogen, Karlsruhe) nach Angaben des Herstellers verwendet. Zur
Durchführung wurde die zur Transfektion vorgesehene Plasmid-DNA und
„Lipofectamin 2000“ jeweils mit serum- und antibiotikafreiem DMEM-Medium (Gibco,
Eggenstein) vermischt, 51min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden
die Plasmid-DNA und das „Lipofectamin 2000“ miteinander vermischt und für 30 min
bei Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die am Vortag
ausplattierten Zellen einmalig mit 2-5 ml DMEM-Medium gewaschen. Nach
vorsichtigem Aufbringen der Lipofectamin 2000-DNA Mischung auf die Zellen wurden
diese für 4-6 h im Brutschrank in DMEM-Medium kultiviert, mit vorgewärmtem
DMEM-Medium 1 x gewaschen und bis zur Weiterverarbeitung 14-24 h in DMEM-
Medium kultiviert.
2.20 Computerauswertungen
2.20.1 Computerauswertung einer cDNA-Bibliothek Ausgehend von humanem Knorpelgewebe (20. Schwangerschaftswoche bis 2.
Lebensjahr) wurde von B. Lee et al. eine humane Chondrozyten-cDNA-Bibliothek
hergestellt (Ahn et al., 1995). 5000 ESTs dieser Bibliothek wurden von der Firma
GENterprise (Mainz) generiert und sequenziert. Die Auswertung der ESTs erfolgte
nach Aufteilung der Sequenzen auf die Kooperationspartner: Arbeitsgruppe Prof.
Winterpacht, Arbeitsgruppe Prof. Zabel (Kinderklinik, Mainz) und der Firma
GENterprise (Mainz), mittels „ESTsweep“. „ESTsweep“ ein Programm zur
automatisierten Auswertung von ESTs (Hotz-Wagenblatt et al., 2003), wurde in einer
Kooperation zwischen der Arbeitsgruppe Prof. Winterpacht (Institut für
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Material und Methoden
Humangenetik, Erlangen), der AG Prof. Zabel (Kinderklinik, Mainz), der Firma
GENterprise (Mainz) und der „Bioinformatic Service group“ des DKFZ entwickelt.
„ESTsweep“ ist ein Analysetool von HUSAR (Heidelberg Unix Sequence Analysis
Resources) und eine Weiterentwicklung des GCG Programmpaketes der Genetics
Computer Group (Devereux et al., 1984), welches von der „Bioinformatic Service
group“ des Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) entwickelt (Senger et al.,
1995) wurde. In HUSAR sind über 260 verschiedene DNA- und Protein-Analysetools
zusammengefasst, die auf ca. 200 aktuelle Datenbanken zurückgreifen.
Vor der Analyse der ESTs mittels „ESTsweep“ erfolgte eine automatisierte
Maskierung der Sequenzabschnitte mit geringer Komplexität, sowie der
Vektorbestandteile über die HUSAR-Anwendung „Phredplus“.
2.20.2 Computerauswertung von DNA- und Protein-Sequenzen Für Homologievergleiche mit Nukleotid- bzw. Proteindatenbanken wurden die
Programme „BLASTN“ bzw. „BLAST2“, „BLASTX“ und „BLASTP“ (Altschul et al.,
1990; 1997) vom NCBI-Server (National Center for Biotechnology Information,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), „UCSC Genome Browser“
(http://www.genome.ucsc.edu, Kent et al., 2002), „Ensembl Genome Browser“
(http://www.ensembl.org/Mus_musculus, Hubbard et al., 2002) und „Mouse Genome
Informatics“ (http://www.informatics.jax.org, Blake et al., 1997) verwendet.
Alignments zwischen großen genomischen Bereichen wurden mittels des
Programms „PipMaker“(http://pipmaker.bx.psu.edu/pipmaker, Schwartz et al., 2000)
durchgeführt. Als Exon- und Genvorhersage-Programme wurden „GRAIL II“-
Analysen (http://grail.lsd.ornl.gov/grailexp, Uberbacher und Mural, 1991; Xu et al.,
1994) und „GENSCAN“-Analysen (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html, Burge und
Karlin, 1997; 1998) verwendet. Des Weiteren wurden für Homologievergleiche und
die Analyse funktioneller Proteindomänen das Programm SMART (http://smart.embl-
heidelberg.de, Schultz et al., 1998; Letunic et al., 2002) genutzt. Eine Vorhersage
von Signalpeptiden wurde mit Hilfe der Programme PSORT
(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html, Nakai und Kanehisa, 1991) und SignalP
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP, Nielsen et al., 1997) getroffen.
Mit der unter „Genomatix“ zur Verfügung stehenden Programmen
„PromotorInspector“ (Scherf et al., 2000) und „MatInspector“ (Quandt et al., 1995)
wurden Promotoranalysen durchgeführt (http://www.genomatix.de). Die Auswertung
- 33 -
Material und Methoden
der erhaltenden DNA-Sequenzdaten erfolgte mit Hilfe der Programme Chromas 2
(Technelysium Pty Ltd, Australien) und DNAStar (DNASTAR, Inc, USA).
2.21 Reagenzien und Materialien
2.21.1 Puffer und Lösungen Agar-Platten 15 g Agar-Agar
ad 1 l LB-Medium
Blockierungspuffer (für RNA-Dot-Blot)
1% (w/v) “Blocking Reagenz” (Roche, Mannheim) in Maleinsäurepuffer
Blockierungspuffer (= Puffer II) (für RNA-in situ-Hybridisierung)
1% (w/v) „Blocking Reagenz“ (Roche, Mannheim) in Puffer I
Detektionspuffer (für RNA-Dot-Blot)
100 mM Tris/HCl 100 mM NaCl ; pH 9,5
DNA/RNA-Ladepuffer (6 x) 0,25% Bromphenolblau 0,25% Xylencyanol FF 30% Glycerin
FM-Medium (2 x) 65% Glycerin 100 mM MgSO425 mM Tris/HCl, pH 7,5
LB-Medium 10 g Trypton 5 g Hefeextrakt 10 g NaCl ad 1 l A.bidest.; pH 7,5
Lösung I 50 mM Glucose 10 mM Tris 1 mM EDTA (pH 8,0)
Lösung II 0,2 N NaOH 1% SDS
Lösung III 4 M Kaliumacetat 11,5% Essigsäure
Lösung IV 88% Isopropanol 0,2 M Kaliumacetat
Maleinsäurepuffer (für RNA-Dot-Blot)
100 mM Maleinsäure 150 mM NaCl; pH 7,5
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Material und Methoden
Maleinsäure-Waschpuffer (für RNA-Dot-Blot)
100 mM Maleinsäure 150 mM NaCl 0,3% Tween20; pH 7,5
MOPS-Puffer (10 x) 0,2 M 3-(N-morpholin)propansulfonsäure 0,05 M NaOAc 0,01 M EDTA; pH 7,0
NBT-Puffer (= Puffer III) (für RNA-in situ-Hybridisierung)
100 mM Tris/HCl 100 mM NaCl 50 mM MgCl2, pH 9,5
PBS (10 x) 1,37 M NaCl 65 mM Na2HPO4 • 2 H2O 27 mM KCl 11,5 mM KH2PO4
PBT-Puffer 0,2% (w/v) BSA 0,1% (v/v) Tween20 in 1 x PBS
PFA-Lösung 4% (w/v) PFA in 1 x PBS
PTW-Puffer 0,1% (v/v) Tween20 in 1 x PBS
Puffer I (für RNA-in situ-Hybridisierung)
100 mM Tris/HCl 150 mM NaCl, pH 7,5
QBT 750 mM NaCl 50 mM MOPS (pH 7,0) 15% Isopropanol 0,15% Triton X-100
QC 1,0 M NaCl 50 mM MOPS (pH 7,0) 15% Isopropanol
QF 1,25 M NaCl 50 mM Tris/HCl (pH 8,5) 15% Isopropanol
SSC (20 x) 3 M NaCl 0,3 M Na3-Citrat; pH 7,0
Substratlösung (für RNA-in situ-Hybridisierung)
45 µl NBT, 35 µl BCIP in 10 ml Puffer III
TBE (1 x) 90 mM Tris 90 mM Borsäure 1,25 mM EDTA; pH 8,3
- 35 -
Material und Methoden
Tbf I 30 mM Kaliumacetat 50 mM MnCl2
100 mM KCl 10 mM CaCl2
15% Glycerin (pH 5,8)
TE-Puffer
10 mM Tris 1 mM EDTA
Tfb II
10 mM NaMOPS, pH 7,0 75 mM CaCl2
10 mM KCl 15% Glycerin
Waschpuffer I (für RNA-Dot-Blot)
2 x SSC 0,1% SDS
Waschpuffer II (für RNA-Dot-Blot)
0,1 x SSC 0,1% SDS
2.21.2 Eukaryontische Zellen Zelllinie Erstbeschreiber Herkunft COS-7 Gluzman, 1981 Affennierenzellen HEK293 Graham et al., 1977 Humane embryonale Nierenzellen SW-1353 (HCS) Merluzzi et al., 1987 Humane Chondrosarkomzellen
2.21.3 Chemikalien, Enzyme, Molekulargewichtsstandards, Zellkulturmedien
100mM dNTP Set Invitrogen, Karlsruhe Albumin bovine fraction V Sigma-Aldrich, Taufkirchen Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Roche, Mannheim Assay-by-designTM
Assay-on demandTMApplied Biosystems, Warrington (U.K.) Applied Biosystems, Foster City (USA)
BigDyeTM Terminator v3.1 Applied Biosystems, Foster City (USA) Blocking Reagent Roche, Mannheim ClarionTM Mounting Media Biomeda, Foster City Crystal/MountTM Biomeda, Foster City Digoxigenin-11-dUTP Roche, Mannheim DIG-RNA Labelling Mix Roche, Mannheim ExpressHyb Hybridization Solution BD Biosciences, Palo Alto (USA) HyperfilmTM ECLTM Amersham Pharmacia, Buckinghamshire HyperfilmTM MP Amersham Bioscience, Buckinghamshire Isotop [α-32P]-dCTP MP Biomedicals Europe, Asse-Relegem
(Belgien) Lipofectamin 2000 Invitrogen, Karlsruhe Objektträger Histo Bond Marienfeld, Lauda-Köngishofen
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Material und Methoden
PapPen Immunostaining Pen Kisker, Steinfurt positiv geladenen Nylon-Membran Biodyne® B 0,45
PALL Corporation, Pensacola
ProbeQuantTM G-50 Micro Columns Amersham Bioscience, Piscataway Ready-To-GoTM DNA Labelling Beads Amersham Bioscience, Buckinghamshire Salmon Testes DNA Sigma-Aldrich, Taufkirchen Tecan-Aufreinigungsplatten: MontageTM PCR96MontageTM SEQ96
Millipore, Billerica (USA) Millipore, Billerica (USA)
Tissue-Tec® Sakura, Zoeterwoude (NL) Chemikalien
Aceton Roth, Karlsruhe Agar-Agar Roth, Karlsruhe Ammoniumacetat Roth, Karlsruhe Ampicillin Natriumsalz Roth, Karlsruhe BCIP Roche, Mannheim Betaine Sigma-Aldrich, Taufkirchen Chloroform Merck, Darmstadt Diethylpyrocarbonat Sigma-Aldrich, Taufkirchen Dimethylsulfoxid Merck, Darmstadt DTT Invitrogen, Karlsruhe Eosin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Ethanol Roth, Karlsruhe Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe Formaldehyd Merck, Darmstadt Formamid Sigma-Aldrich, Taufkirchen Glycerin Roth, Karlsruhe Hämatoxylin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Hefeextrakt Roth, Karlsruhe IPTG ICN Biomedicals, Ohio Isopropanol Roth, Karlsruhe Kanamycin-Sulfate Roth, Karlsruhe KCl Sigma-Aldrich, Taufkirchen KH2PO4 Sigma-Aldrich, Taufkirchen MgCl2 Merck, Darmstadt MgSO4 Merck, Darmstadt MOPS Roth, Karlsruhe mussel glycogen Invitrogen, Karlsruhe Na2HPO4 • 2 H2O Merck, Darmstadt NaCl Sigma-Aldrich, Taufkirchen Natriumacetat Trihydrat Roth, Karlsruhe Natriumcitrat Sigma-Aldrich, Taufkirchen Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck, Darmstadt NBT Roche, Mannheim Paraformaldehyd Merck, Darmstadt Phenol Roth, Karlsruhe Seakem LE Agarose Biozym, Hessisch Oldendorf TrizmaBase Roth, Karlsruhe
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Material und Methoden
TRIzol Gibco BRL, Karlsruhe Trypton Roth, Karlsruhe Tween 20 Roth, Karlsruhe X-Gal Roth, Karlsruhe
Enzyme
AmpliTaqGold Applied Biosystem, Weiterstadt DNase I, RNase frei Roche, Mannheim Long Expand High Fidelity Roche, Mannheim Restriktionsendonukleasen und Puffer New England Biolabs, Frankfurt / Main RNase Erase ICN Biomedicals, Ohio RNase H Invitrogen, Karlsruhe RNaseOUTTM Ribonuclease Inhibitor Invitrogen, Karlsruhe Superscript IITM Reverse Transcriptase Invitrogen, Karlsruhe T4 DNA Ligase Clontech, Heidelberg T7-RNA-Polymerase Roche, Mannheim Taq-DNA Polymerase Gibco BRL, Karlsruhe
Molekulargewichtsstandards
0,24-9,5 kb RNA-Leiter Invitrogen, Karlsruhe 1 kb DNA-Leiter Invitrogen, Karlsruhe 100 bp DNA-Leiter Invitrogen, Karlsruhe Lambda DNA Hind III Digest NEB, Frankfurt am Main SMART Ladder SF Eurogentec, Heidelberg
Zellkulturmedien
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
Gibco BRL, Karlsruhe
FCS (hitzeinaktiviert) Gibco BRL, Karlsruhe Penicillin / Streptomycin Gibco BRL, Karlsruhe Trypanblau Gibco BRL, Karlsruhe Trypsin / EDTA Gibco BRL, Karlsruhe
2.21.4 Geräte Autoklav HiclaveTM HV-85 (HMC, Engelsberg) Bakterienschüttler Innova 4000 (New Brunswick Scientific, Nürtingen) Brutschränke Heraeus, Hanau DNA-Sequenziergeräte
ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Weiterstadt) 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Weiterstadt) 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Weiterstadt)
Dot-Blot-Apparatur PEQLAB, Erlangen
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Material und Methoden
Eis-Maschine Ziegra, Isernhagen Geldokumentation BioDocAnalyze (Biometra, Göttingen) Gelelektrophorese-Kammern PEQLAB, Erlangen Hybridisierungsofen Memmert, Schwabach Kryostat HM 560 (Microm, Walldorf) Mikroskop MZ16 (Leica, Solms); Kamera DC300 (Leica,
Solms) Neubauer-Zählkammer Brand, Wertheim Photometer Biometra, Göttingen Pipettierroboter MiniPrep 75 (Tecan, Crailsheim) Sterile Werkbank LaminAir (Heraeus, Hanau) TaqMan ABI Prism 7900HT SDS (Applied Biosystems,
Weiterstadt) Thermocycler
PCRExpress (Thermo Hybaid, Franklin, USA) Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg) PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Waltham) PTC-220 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Waltham)
Thermomixer Thermomixer compact (Eppendorf, Hamburg) Wasserbäder SW-20C (Julabo, Seelbach)
GFL, Burgwedel Zentrifugen Centrifuge 5415 D (Eppendorf, Hamburg)
Centrifuge 5415 R (Eppendorf, Hamburg) Centrifuge 5810 D (Eppendorf, Hamburg) Varifuge 20 RS (Heraeus, Hanau)
2.21.5 Kits GeneRacerTM Kit Invitrogen, Karlsruhe JETquick Gel Extraction Spin Kit Genomed, Bad Oeynhausen Lig’n ScribeTM No-cloning Promoter Addition Kit
Ambion, Huntingdon
Multiplex PCR Kit Qiagen, Hilden QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden QIAGEN Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden QuantiTectTM RT-PCR Kit Qiagen, Hilden TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing Invitrogen, Karlsruhe TOPO XL PCR Cloning® Kit Invitrogen, Karlsruhe
2.21.6 Synthetische Oligonukleotide Allgemeine Primer T3 5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’ T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ M13 fw 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’
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Material und Methoden
M13 rev 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ GAPDH fw 5’-GTGGAGTCCACTGGCGTCTTC-3’ GAPDH rev 5’-CTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3’ GeneRacerTM RNA Oligo 5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGACATGGA
CTGAAGGAGTAGAAA-3’ GeneRacerTM Oligo dT Primer 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATG
ACAGTG(T)18-3’ GeneRacerTM 5’ Primer 5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’ GeneRacerTM 5’ Nested Primer 5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’ GeneRacerTM 3’ Primer 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’ GeneRacerTM 3’ Nested Primer 5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’
68F08 68F08-human-FwC 5’-CTCCTGGATCTTAGTCTCGTTTG-3’ 68F08-human-RevC 5’-CAAACGAGACTAAGATCCAGGAG-3’ 68F08-human-FwD 5’-GAGCTCCTGAAGATGTGGACATC-3’ 68F08-human-RevD 5’-GATGTCCACATCTTCAGGAGCTC-3’ 68F08-human-FwE 5’-GCTCCAGGCTCCCACGGGCACC-3’ 68F08-human-RevE 5’-GGTGCCCGTGGGAGCCTGGAGC-3’ 68F08-human-FwF 5’-GCACAGAGCTGGCACTGGTGCTG-3’ 68F08-human-RevF 5’-CAGCACCAGTGCCAGCTCTGTGC-3’ 68F08-human-FwG 5’-GACGGTCGTCCACCTCGGGTCC-3’ 68F08-human-RevG 5’-GGACCCGAGGTGGACGACCGTC-3’ 68F08-human-FwH 5’-GTGCCTGTCCTGCTGCCTTTCC-3’ 68F08-human-RevH 5’-GGAAAGGCAGCAGGACAGGCAC-3’ 68F08-human-FwI 5’-GCAGTGTGGACAGGCTGACACG-3’ 68F08-human-RevI 5’-CGTGTCAGCCTGTCCACACTGC-3’ 68F08-human-FwJ 5’-CTCACCAGCATATGGCGGTGGG-3’ 68F08-human-RevJ 5’-CCCACCGCCATATGCTGGTGAG-3’
68F08-mouse-FwA 5’-GAATCGGATACGCAGATGCGTG-3’ 68F08-mouse-RevB 5’-CATCATGCACATCCAAGTCGAAG-3’ 68F08-mouse-FwB 5’-CTTCGACTTGGATGTGCATGATG-3’ 68F08-mouse-RevC 5’-CTTCTTAGATAAGCCAGTAGTAG-3’ 68F08-mouse-FwC 5’-CTACTACTGGCTTATCTAAGAAG-3’ 68F08-mouse-FwD 5’-GATGCCTCACCAAGAGACCTGAC-3’ 68F08-mouse-RevD 5’-GTCAGGTCTCTTGGTGAGGCATC-3’ 68F08-mouse-FwE 5’-GCCAGGATGTCAGTGGCCACAC-3’ 68F08-mouse-RevE 5’-GTGTGGCCACTGACATCCTGGC-3’ 68F08-mouse-FwF 5’-CTCTCACCAGGACAGGCTCACG-3’ 68F08-mouse-RevF 5’-CGTGAGCCTGTCCTGGTGAGAG-3’ 68F08-mouse-FwG 5’-GCAGGGCACATCCAAGACTGAC-3’ 68F08-mouse-RevG 5’-GTCAGTCTTGGATGTGCCCTGC-3’ 68F08-mouse-FwH 5’-CAGTCCTCTGCACCTACCATTC-3’ 68F08-mouse-RevH 5’-GAATGGTAGGTGCAGAGGACTG-3’ 68F08-mouse-FwI 5’-GAGTCATGGCTTGCCAGGGCTC-3’ 68F08-mouse-RevI 5’-GAGCCCTGGCAAGCCATGACTC-3’ 68F08-mouse-FwJ 5’-GATCCTGGACGGCCAGGACCTG-3’
- 40 -
Material und Methoden
68F08-mouse-RevJ 5’-CAGGTCCTGGCCGTCCAGGATC-3’ 68F08-mouse-FwK 5’-CAGGACAGCAGTTTGTTGTGAC-3’ 68F08-mouse-RevK 5’-GTCACAACAAACTGCTGTCCTG-3’ 68F08-mouse-FwL 5’-CTTGCACCTGCTGAGCTCTGAG-3’ 68F08-mouse-RevL 5’-CTCAGAGCTCAGCAGGTGCAAG-3’ 68F08-mouse-RevM 5’-CCATCTTCTCACCTTCTGCAG-3’ 19C12 19c12-human-AFw 5’-CAGTTTCCTGATGCTTCTGCTGCC-3’
19c12-human-BFw 5’-ATGGGCCAAGACAGAGAGGATCG-3’
19c12-human-CFw 5’-ACTGGTGTGCAACTATGAGCCTCCG-3’
19c12-human-DFw 5’-TCCGGCTTTCTTGGTAACAGAGGTC-3’
19c12-human-ARev 5’-AGGCAAATCCTGAGCATCTTCCG-3’
19c12-human-BRev 5’-CAGGGAGCCTGAGACCTCTGTTACC-3’
19c12-human-CRev 5’-TTCCACAGCAGGCAGAGCCTTG-3’
19c12-human-DRev 5’-ACCAGAGGAGGCAGGAGCAGTAGTC-3’
19c12-human-ERev 5’-GTAGTGCTCACGCTCGTGGTGC-3’ 19c12-mouse-fw2 5’-GGCACGAGGAGCATGAGTATTAC-3’ 19c12-mouse-rev2 5’-GTAATACTCATGCTCCTCGTGCC-3’ 19c12-mouse-fw3 5’-GGCACGAGGAGCATGAGTATTAC-3’ 19c12-mouse-rev3 5’-GTAATACTCATGCTCCTCGTGCC-3’ 19c12-mouse-fw4 5’-CTGACAGAGTCAGGAGAGTCCGTAC-3’ 19c12-mouse-rev4 5’-GTACGGACTCTCCTGACTCTGTCAG-3’ 19c12-mouse-fw5 5’-CTGCTGCTGTTGGCTGGCATGGTC-3’ 19c12-mouse-rev5 5’-GACCATGCCAGCCAACAGCAGCAG-3’ 19c12-mouse-fw6 5’-GCCAGGCTAGTACAGCATGGCTAC-3’ 19c12-mouse-rev6 5’-GTAGCCATGCTGTACTAGCCTGGC-3’
86H12 (ECM3) 86H12_Fw5 5’-CGGCGGCAGGACCTCCAAGAC-3’ 86H12_Fw6 5’-GAACTCGCTGACCAGAGTCCCG-3’ 86H12_Fw7 5’-GCACATGAAGCCAGGCCTAGAG-3’ 86H12_FwA 5’-CAGCCAAGAGGAGTGTGCTGCTC-3’ 86H12_FwB 5’-CAGCCAAGAGGAGTGTGCTG-3’ 86H12_FwC 5’-CAGCTCCTGCAAGAGCACATTC-3’ 86H12_FwD 5’-CAGCATGGTACCACCATCGCC-3’ 86H12_FwE 5’-CGCCTCCAGTGGGCCTGGAGG-3’ 86H12_FwF 5’-GCACAAGGAGATGGTGGCCTC-3’ 86H12_FwG 5’-CACGGCTCACTCAGCCTGCTC-3’ 86H12_FwH 5’-GTGGGCAGCAGGAGTACCACTC-3’ 86H12_FwJ 5’-CAGTGACCTTGGAGCAGGAGC-3’ 86H12_FwK 5’-GCAGCAGTCACCGAGGAGGACC-3’ 86H12_Rev4 5’-GTCTTGGAGGTGCTGCCGCCG-3’ 86H12_Rev5 5’-CAAGCCCTGCAGGAGGTTGTCG-3’
- 41 -
Material und Methoden
86H12_Rev6 5’-CGTCAGCCTGCAGCCTGTTGTG-3’ 86H12_Rev7 5’-GCTGGAGGACCACGCTGTGATAG-3’ 86H12_RevA 5’-CACCCCTGCTTTCGTGTTCTCC-3’ 86H12_RevB 5’-CTTCCTTGTCTCATTTGCAAG-3’ 86H12_RevC 5’-GAATGTGCTCTTGCAGGAGCTG-3’ 86H12_RevD 5’-GGCGATGGTGGTACCATGCTG-3’ 86H12_RevE 5’-CCTCCAGGCCCACTGGAGGCG-3’ 86H12_RevF 5’-GAGGCCACCATCTCCTTGTGC-3’ 86H12_RevI 5’-GGGAAGCGCTTTCCAGCCAGTG-3’ 86H12_RevJ 5’-GCTCCTGCTCCAAGGTCACTG-3’ 86H12_RevK 5’-GGTCCTCCTCGGTGACTGCTGC-3’ Race-Pr1 5’-AGATTCTTGAAGGCATGGGGG-3’ Race-Pr2c 5’-CTGTCCTCTGGCCCTGGTCCTC-3’ Race-Pr3b 5’-CTGGGGCTGAGCCCACTCAGC-3’ Race-Pr4b 5’-GCCCCTCCTGAGCAGCTCCCC-3’ Race-Pr5d 5’-GGCCTGAGAGGCCCACCACAG-3’
Bruchpunktbestimmung CHR9_MSP01 5’-CGCTGGAGAAGAGCTAATGTC-3’ Chr11_MSP1Fw 5’-CTCTTAGACTGCACTGTACTC-3’ Chr11_MSP1Rev 5’-GTTCTAGAAAGCATAACTGAG-3’ Chr11_MSP2Fw 5’-CATCTAACCTCATTTGACCAG-3’ Chr11_MSP2Rev 5’-GCTTTGCTATTAGATCCATAG-3’ CHR9_MSP02 5’-GCAGGAGTCAACAGATAGGTC-3’ CHR9_MSP03 5’-CTAATCTCCTAGTACTTGAAC-3’ CHR9_MSP04 5’-CTCGTGATATCTTCAGCAATG-3’ CHR9_MSP05 5’-GATTGAATGTGTTTGCATGTC-3’ CHR9_MSP06 5’-TATCGGACTGACCCACTCACAG-3’ CHR9_MSP07 5’-GCTGTCATTGCAACTCCATGC-3’ CHR9_MSP08 5’-GTCTTTTACTAATATCGTCAC-3’ CHR9_MSP09 5’-GTGATGGCACCAGACGTACCAC-3’ CHR9_MSP10 5’-CTATGATGACCCTACATTGTG-3’ CHR9_MSP11 5’-GTGCTTAGATGGCTTATAACG-3’ CHR9_MSP12 5’-GATAATTGACCTGGAAGAAGAG-3’ CHR9_MSP13 5’-TGCCTTAGGCACTGTCCACTC-3’ CHR9_MSP14 5’-CTTTGAGTTGGGAGGTATGCAC-3’ CHR9_MSP15 5’-TACTCCAGATTAAGATCACTC-3’ CHR9_MSP16 5’-CACCTTGATGGGTCCTAAGTC-3’ CHR9_MSP17 5’-GGTACACTTGTGCTCCCATTG-3’ Sonde1_Fw 5’-TTTACTGAGGAATGGACAGTA-3’ Sonde1_Rev 5’-CAGCCTTCTTTTAAATGTCAC-3’ Sonde2_Fw 5’-GAGAATAGGTAGCTATCCATG-3’ Sonde2_Rev 5’-CAGTGCTCCATCAGGCATCAAG-3’ Sonde3_Fw 5’-CTCAGGAAACTTACAATCATG-3’ Sonde3_Rev 5’-CAACTAGCTGCATCTTATATC-3’
- 42 -
Material und Methoden
Konservierter Bereich auf Chromosom 9q33.1 MausChr4+1Fw 5’-CAGGGGAAGCGGCATTGGGTG-3’ MausChr4+2Fw 5’-GCCTAACTTATAGAGTTATTG-3’ MausChr4+3Fw 5’-CACATGTCCAAAGAGAGTTTG-3’ MausChr4+4Fw 5’-GTTGTGTGCATGATAATATTG-3’ MausChr4+1Rev 5’-CACCCAATGCCGCTTCCCCTG-3’ MausChr4+2Rev 5’-CAATAACTCTATAAGTTAGGC-3’ MausChr4+3Rev 5’-CAAACTCTCTTTGGACATGTG-3’ MausChr4-1Fw 5’-GTCCGTCAGTCTGAGCAATCTG-3’ MausChr4-1Rev 5’-CAGATTGCTCAGACTGACGGAC-3’ MausChr4-2Fw 5’-GTGCTACTAGATGATGTTTTG-3’ MausChr4-2Rev 5’-CAAAACATCATCTAGTAGCAC-3’ MausChr4-3Fw 5’-GTCCTCAACTGTGTGCTATCC-3’ MausChr4-3Rev 5’-GGATAGCACACAGTTGAGGAC-3’ MausChr4-4Rev 5’-CTTCGGTAATCTTCTCTACCTAC-3’
SOX6 SOX6-E10_Fw 5’-CAAGGCTGTCTGAGAAATCTAAC-3’ SOX6-E10_Rev 5’-GATAGTGAAGCAGGCTATGTTG-3’ SOX6-E11_Fw 5’-GTGGCATTGTCTCTGAGGTG-3’ SOX6-E11_Rev 5’-CTGTTTAGTTACGACTGATACTTG-3’ SOX6-E12_Fw 5’-CTTCCTTGTTCAGAGAATGCAGC-3’ SOX6-E12_Rev 5’-GGTATCAACCTGCAGCCATAG-3’ SOX6-E13_Fw 5’-CAGAGTCCACATTGGTCAGAAATG-3’ SOX6-E13_Rev 5’-GTGTGTCTGAGCTAGATATAGGATC-3’ SOX6-E14_Fw 5’-CTTCCTGCCCTGACATTACAG-3’ SOX6-E14_Rev 5’-GAAGCAAGGGGATAACTAGGATC-3’ SOX6-E15_Fw 5’-CGCACAGATGAGTGAAGTGATG-3’ SOX6-E15_Rev 5’-CTATAGGATGGCTACTGGCAGTAT-3’ SOX6-E16_Fw 5’-GTGTGAATTCCAATGCTGTACATAG-3’ SOX6-E16_Rev 5’-GCATTTGTGGCTCCACAATTAC-3’ SOX6-E2_Fw 5’-CCTGAACTAGCCAAATGCAAGG-3’ SOX6-E2_Rev 5’-GGGAAATAGATGACCTTAGAGTT-3’ SOX6-E3_Fw 5’-TAAGCATCATATACTGTCCTCAG-3’ SOX6-E3_Rev 5’-GTGGGATTTCAAGGGTCAGA-3’ SOX6-E4_Fw 5’-CCTGGGGTTCAAGCTACAGC-3’ SOX6-E4_Rev 5’-GCTGATCTTCTGTACTGTAACAG-3’ SOX6-E5_Fw 5’-CAATGGCCTCCAGTCATTGTCC-3’ SOX6-E5_Rev 5’-GGAATGTGCCAGGCTCAGAG-3’ SOX6-E6_Fw 5’-GTAATACCAGGAGAAATACCTGAG-3’ SOX6-E6_Rev 5’-CTCTGCAGATGTACCCCTGT-3’ SOX6-E7_Fw 5’-GTGGCTGTGTGGGTACCAGC-3’ SOX6-E7_Rev 5’-CACAGGAGCATGCCAGGGAAC-3’
- 43 -
Material und Methoden
SOX6-E8_Fw 5’-GCTCAGGCAATCCAAGGACC-3’ SOX6-E8_Rev 5’-CCAGCTGTATGCTAAATAATGGCC-3’ SOX6-E9_Fw 5’-CTGTTTCATGAGTTCTGACAGTAT-3’ SOX6-E9_Rev 5’-GATTGTTCAGTCATACTCTAGGC-3’ Sox6-ISH_Fw 5’-CTCTAGATATACTATCCAGTC-3’ Sox6-ISH_RevL 5’-CATGAACGCATTCATTGGTCG-3’
ARM1 ARM_Rev1 5’-CTACACAAAACTCTCCTCCAT-3’ ARM_Fw1 5’-GTGACAAGCAGAGAGTGGACAC-3’ ARM_Rev2 5’-GTGTCCACTCTCTGCTTGTCAC-3’ ARM_Fw2 5’-TTCCGGTGCTTGTACCCCCAGGC-3’ ARM_Rev3 5’-GCCTGGGGGTACAAGCACCGGAA-3’ ARM_Fw3 5’-CTGAAGTCAATGAAGGCCTGCGTG-3’ FwD_ARM 5’-CTGCGCCCCGCCACCACTGGC-3’ FwE_ARM 5’-CGCTCGCACTACCAGCCTGTC-3’ RevA_ARM 5’-CAAATGTATTTCTTCGCCCAC-3’ REvB_ARM 5’-GTCAGAGGGGGTGTGAGAACA-3’ FwC_ARM 5’-CATGATGGCACTGCCTGGAGG-3’ Rev4_ARM 5’-CACGCAGGCCTTCATTGACTTCAG-3’ FwA_ARM 5’-CAGGGTCCCCTCAGTGCCAAGC-3’ FwB_ARM 5’-GTACAATTCTTTCTCCTATGTC-3’
MSX2 MSX2_Fw1Maus 5’-GCTTCTCCGACTAAAGGCGGT-3’ MSX2_Rev1Maus 5’-GTTCAGAGAGCTGGAGAACTC-3’ MSX2_Fw2Maus 5’-CATATGAGCCCCACCACCTGC-3’ MSX2_Rev2Maus 5’-CTTCCTTAGGATACATGGTAG-3’
- 44 -
Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1 Erstellung eines Expressionsprofils fetaler Wachstumsfugen-chondrozyten mittels EST-Sequenzierung und funktioneller Charakterisierung ausgewählter Kandidatengene
Ausgangspunkt für das vorliegende EST-Projekt war eine cDNA-Bibliothek aus
humaner Wachstumsfuge und Knorpelgewebe von Feten der 20.
Schwangerschaftswoche bis zu Kindern aus dem 2. Lebensjahr, die von Dr. B. Lee
(Houston, Texas) mit Hilfe des ZAP“-cDNA Synthese Kits“ (Stratagene, Heidelberg)
hergestellt wurde (Ahn et al., 1995). Die Bibliothek wurde mittels eines modifizierten
oligo-dT-Primers generiert und konnte so gerichtet in einen „Uni-ZAP“-Vektor kloniert
werden. Zur Evaluierung der cDNA-Bibliothek wurden in einer ersten Analyse 384
Klone durch Amplifikation mit vektorspezifischen T3- und T7-Primern auf ihre
Integratgröße untersucht. Die untersuchten Klone hatten eine durchschnittliche
Integratgröße von 550 bp und umfassten zahlreiche knorpelspezifische Gene wie
z.B. Kollagen Typ II oder Kollagen Typ X (Stelzer, 2000). Ferner konnten Ahn et al.
(1995) das für die erbliche multiple Exostose verantwortliche Gen (EXT1) aus dieser
cDNA-Bibliothek isolieren. Ausgehend von dieser Voruntersuchung wurden ca. 5000
Klone mit einer Integratgröße von mind. 350 bp von der Firma GENterprise (Mainz)
sequenziert. Die unbearbeiteten Sequenzdaten wurden anschließend auf die drei
Kooperationspartner (AG Prof. Winterpacht (Institut für Humangenetik, Erlangen), AG
Prof. Zabel (Kinderklinik, Mainz), Firma GENterprise (Mainz)) verteilt und
bioinformatisch untersucht. Die Gesamtauswertung der Daten, sowie detaillierte
Analysen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführt (Tagariello et al.,
im Druck).
3.1.1 Bioinformatische Auswertung von ESTs unter Zuhilfenahme des Datenbankanalysetools „ESTsweep“
Die Rohdaten der Sequenzen wurden in Blöcken von ca. 80 über ein FTP-
Transferprotokoll (Ws-FTP für Windows) auf den HUSAR-Server
(genius.embnet.dkfz-heidelberg.de) übertragen. Über die HUSAR-Anwendung
„Phredplus“ wurden die Sequenzen voranalysiert und Vektorsequenzen, sowie
repetitive Elemente automatisch maskiert. Die bioinformatische Auswertung der
ESTs erfolgte anschließend über die HUSAR-Anwendung „ESTsweep“ (siehe Kapitel
- 45 -
Ergebnisse
2.19.1). Die Analysen wurden an insgesamt drei Datenbanken durchgeführt. Hierbei
handelte es sich um:
„human_assembled“ : genomische Mensch Datenbank (NCBI)
„Refseq_dna“ : mRNA Datenbank (NCBI)
„Nrnuc“ : Datenbank, welche alle nicht redundanten GENBANK- und EMBL-Sequenzen, aber keine ESTs oder Sequenzen aus der „htgs“ (high throughput genomic sequences) enthält (NCBI)
Pro Analysenansatz wurden 80 Sequenzen gleichzeitig untersucht. Die Ergebnisse
der Analysen werden in Form einer Tabelle zusammengefasst, in der alle relevanten
Daten, Sequenzen, Alignments und Grafiken der verschiedenen Analysen über
Mausklick abrufbar sind (Abb. 3.1).
Ingesamt wurden im gesamten EST-Projekt von den drei Kooperationspartnern 4748
ESTs ausgewertet. Die erhaltenen Daten wurden im Folgenden nochmals
bioinformatisch aktualisiert und systematisch funktionell eingeordnet. Dabei wurden
Abb. 3.1: Exemplarisches „ESTsweep“-Ergebnis eines ESTs. Aufgelistet sind die einzelnen Datenbanken (Refseq_dna, human_assembled, Nrnuc) in denen die Homologiesuche durchgeführt wurde, sowie die jeweiligen Resultate.
- 46 -
Ergebnisse
sowohl die „ESTsweep“-Daten als auch weitere bioinformatische Resultate
berücksichtigt. Die bioinformatischen Resultate beruhen auf einer umfassenden
Analyse der korrespondierenden chromosomalen Regionen und der Identifizierung
von EST-Clustern mit Hilfe der UniGene-Datenbank. Hier werden überlappende
ESTs automatisch zu einer Gruppe zusammengefasst.
3.1.2 Systematische Einteilung der ausgewerteten ESTs Auf Basis der oben angeführten Untersuchungen wurden die ESTs in vier Klassen
eingeteilt (Tab. 3.1). „Klasse 1“ umfasst ESTs, welche eine signifikante
Sequenzidentität zu bekannten Genen aufwiesen. Hierbei wurden
Sequenzidentitäten mit einem P-Wert (statistisches Signifikanzniveau) kleiner als
10-10 als signifikant angesehen (Claudio et al., 1998). „Klasse 2“ beinhaltet ESTs mit
signifikanter Sequenzidentität zu mRNAs, ESTs oder hypothetischen Proteinen
unbekannter Funktion. ESTs der „Klasse 3“ zeigen ausschließlich zu humaner
genomischer DNA Sequenzidentitäten. In „Klasse 4“ sind die ESTs
zusammengefasst, die keine Sequenzidentität zu menschlichen Sequenzen
aufweisen und somit als Kontaminationen betrachtet wurden. Dazu gehören unter
anderem Vektorsequenzen, E.coli Sequenzen oder Sequenzen, die durch die
HUSAR-Anwendung „Phredplus“ (siehe Kapitel 2.19.1) komplett maskiert wurden.
Das Verhältnis der einzelnen Klassen zueinander ist in Abb. 3.2 dargestellt. Dabei
machen ESTs der „Klasse 1“ 76,8% (3647 ESTs), „Klasse 2“ 11,2% (529 ESTs),
„Klasse 3“ 6,1% (291 ESTs) und „Klasse 4“ 5,9% (279 ESTs) aller ESTs aus.
76,8%11,2%
Abb. 3.2: Übersicht der prozentualen Klassenverteilung der analysierten ESTs.
6,1%
5,9%
Klasse 1Klasse 2Klasse 3Klasse 4
- 47 -
Ergebnisse
Uni
Gen
e-C
lust
erf
Hs.4
0818
2 16
801
0102
5
0071
1
989
6224
0443
4
3284
4
3658
1
9842
7
0853
0
4911
9
2308
9
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Hs.4
Hs.1
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2272
6782
6970
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3817
3528
0748
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NT_
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97
NT_
0262
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NT_
0092
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NT_
0166
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0248
12
NT_
0048
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NT_
0072
99
NT_
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Tab
3.1:
Exe
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r. vo
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nom
isch
en K
lone
ne , Uni
gene
Acc
essi
on-N
r.f .
- 48 -
Ergebnisse
Proteinexpression (gene/protein expression, 27,7%
der Gruppe Zellsignalübertragung und
ignaling/communication), sowie Gene, die in der Gruppe
us (metabolism) zusammengefasst sind, machen 21,6% (275 Gene) bzw.
ellstruktur und Zellbewegung (cell structure/motility, 8,3% bzw.
bwehr (cell/organism defense, 7,4% bzw. 94 Gene) und
ion, 7,1% bzw. 91 Gene). 9,7% (123 Gene) der Gene waren
eniger Informationen funktionell keiner
die Anzahl an ESTs zu den einzelnen
lgendermaßen (Abb. 3.4): der Anteil der
ruppe „gene/protein expression“ steigt auf 42,8%, dies entspricht 1522 ESTs. Im
ittelfeld befinden sich die Gruppen „unclassified“ mit 13,7% (487 ESTs),
etabolism“ mit 13,1% (467 ESTs), „cell signaling/communication“ mit 10,9% (387
STs), und „cell structure/motility“ mit 10,5% (373 ESTs). Den Abschluss bilden die
3.1.3 Bioinformatische Auswertung von ESTs der „Klasse 1“
3.1.3.1 Funktionelle Einteilung der ESTs Die 3647 ESTs, die der „Klasse 1“ zugeordnet wurden, verteilen sich auf 1274
verschiedene Gene. Diese Gene lassen sich entsprechend Ihrer Funktion in sieben
Gruppen einordnen (Einteilung übernommen von Zhang et al. 2003). Eine Übersicht
der funktionellen Gruppen und die Einteilung der ESTs zeigt Abb. 3.3. Die meisten
Gene sind der Gruppe Gen- und
bzw. 352 Gene) zuzuordnen. Gene, die in
Zellkommunikation (cell s
Metabolism
18,2% (232 Gene) aller Gene aus. Die Gruppen, in denen die wenigsten Gene
vertreten sind, sind Z
106 Gene), Immuna
Zellteilung (cell divis
zwar bekannt, konnten jedoch aufgrund zu w
Gruppe zugeordnet werden.
Berücksichtigt man die bei der Auswertung
Genen, so verändert sich die Verteilung fo
G
M
„m
E
9,7%21,6%
7,4%
7,1%
27,7%
18,2%8,3%
unclassifieldgene/protein expressioncell signaling/communicationmetabolismcell structure/motilitycell/organism defensecell division
Abb. 3.3: Funktionelle Einteilung der „bekannten“ Gene („Klasse 1“).
- 49 -
Ergebnisse
Gruppen „cell/organism defense“ mit 6,5% (230 ESTs) und „cell division“ mit 2,4%
(87 ESTs).
einem weiteren Schritt wurden die Gene entsprechend der Häufigkeit der
korrespondierenden ESTs in drei Redundanz en ete teilun von
Bortoluzzi et al. 0 n g a 2 p : a E r io >
aller ESTs e e ) x s “ e 3
opi un c io < 2 r o ) i r te g
ind von den insgesamt 1274 Genen 187 Gene (14,7%) stark exprimiert, 296 Gene
3,2%) zeigen eine mittlere Expressionsstärke und 791 Gene (62,1%) werden
chwach exprimiert. Eine Kombination dieser Ergebnisse mit der oben dargestellten
einem weiteren Schritt wurden die Gene entsprechend der Häufigkeit der
korrespondierenden ESTs in drei Redundanz en ete teilun von
Bortoluzzi et al. 0 n g a 2 p : a E r io >
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ind von den insgesamt 1274 Genen 187 Gene (14,7%) stark exprimiert, 296 Gene
3,2%) zeigen eine mittlere Expressionsstärke und 791 Gene (62,1%) werden
chwach exprimiert. Eine Kombination dieser Ergebnisse mit der oben dargestellten
3.1.3.2 Expressionsstärke der Gene
3.1.3.2 Expressionsstärke der Gene InIn
13,7%
42,8%
unclassifieldgene/protein expressioncell signaling/communicationmetabolismcell structure/motility
2,4%
cell/organism defensecell division
10,9%
13,1%
10,5%
6,5%
gruppgrupp eingeing ilt (Einilt (Ein g g
, 20, 20 0 u0 u d Zd Zhanhan et et l., l., 003003 adaada tiert)tiert) „st „st rkerke xpxp essess n“ (n“ ( 0,1%0,1%
od od r mr m hr ahr als 4ls 4 Ko Koppienien , „m, „mittlerittlere Ee E prespres ionion (<0(<0,1-0,,1-0,0 %0 %2424 od od r 2-r 2-
KK en)en) d sd s hwahwache che ExprExpressess n (n ( 0,00,0 4%4% odeode 1 K 1 K piepie . Na. Nach dch d eseese Ein Ein ilunilun
ss
(2(2
ss
funktionellen Klassifikation ist in Tabelle 3.2 dargestellt.
cell
division cell
signaling cell
structurecell
defense gene
expressionmeta-bolism
unclassi-fied
∑
funktionellen Klassifikation ist in Tabelle 3.2 dargestellt.
cell
division cell
signaling cell
structurecell
defense gene
expressionmeta-bolism
unclassi-fied
∑
Stark 6 3,2 16 8,6 18 9,6 22 11,8 101 53,0 18 9,6 6 3,2 187 14,7Mittel 19 6,4 60 20,3 30 10,1 21 7,1 79 21,7 56 18,9 30 10,1 296 23,1
Schwach 66 8,3 199 25,2 58 7,3 51 6,4 172 16,8 158 20 123 11 791 62,1∑ 91 8,3 275 21,6 87 8,3 94 7,4 352 23,4 201 18,2 290 9,7 1217 100
Tab 3.2: Funktionelle Einteilungen der schwach-, mittel- und hoch-exprimierten Gene der „Klasse 1“. Die gelben Spalten geben die Anzahl der Gene an, die den verschiedenen Expressionsstärken und funktionellen Gruppen zugeordnet wurden. Die grünen Spalten geben die prozentuale Verteilung der Gene an.
Abb. 3.4: Funktionelle Einteilung und prozentuale Verteilung der ESTs, die der Klasse der „bekannten Gene“ zugewiesen wurden. Dabei werden hier im Gegensatz zur Abb. 3.3 nicht nur die unterschiedlichen Gene berücksichtigt, sondern auch die Anzahl der ESTs, die einem Gen zugeordnet werden konnten.
- 50 -
Ergebnisse
Betrachtet man die zehn am stärksten exprimierten Gene (Tab 3.3) zeigt sich
rwartungsgemäß, dass COL2A1 (α1-Kette von Kollagen Typ II) mit 103 ESTs
STs der „Klasse 1“) am stärksten exprimiert eben
rd och eine Rei n der grund -
pre n b ra
ha versch (R
ho in 5) od
ina 3) stark expr e die am
de munantwort (tu ationally-con
mor rejection antigen (gp96) 1 (TRA1)) beteiligt sind.
e
(entspricht 3% aller E wurde. N
COL2A1 we en n he von Genen, die a sätzlichen Protein
und Genex ssio eteiligt s ryotic tind, wie EEF1A1 (euka nsla tiontion elonga
factor 1 alp 1), ieden oteinee Gene ribosomaler Pr PL7A, RPL3, RPL9)
HSPA5 (Chaperon heat s ck 70kDa prote er MMP3 (Matrix
Metalloprote se imiert, sowie drei Gen Metabolismus (FTL,
Ferritin) und r Im mor protein, transl trolled 1 (TPT1) und
tu
Acession-
Nr. Anzahl
an ESTs Name Klasse NM_033150 103 collagen, type II, alpha 1 cell structure/motility NM_006457 89 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 gene/protein expressionNM_002032 49 ferritin, heavy polypeptide 1 metabolism NM_003295 48 tumor protein, translationally-controlled 1 cell/organism defense NM_005347 45 Heat shock 70kDa protein 5 gene/protein expressionNM_000971 40 ribosomal protein L7A gene/protein expressionNM_003299 38 tumor rejection antigen (gp96) 1 cell/organism defense NM_002422 34 matrix metalloproteinase 3 gene/protein expressionNM_000967 32 ribosomal protein L3 gene/protein expressionNM_000661 28 ribosomal protein L9 gene/protein expression
3.1.3.3 Expressionsstärke bekannter Matrix auf- und abbauender Proteine 90% der Wachstumsfuge wird durch die extrazelluläre Matrix gebildet (Neame et al.
1999), die damit den Hauptbestandteil des Knorpels darstellt. Die extrazelluläre
Matrix besteht aus einer Vielzahl von Molekülen, durch deren Variation sie den
unterschiedlichen Ansprüchen des Bindegewebes gerecht wird. Primär besitzt die
extrazelluläre Matrix mechanische Funktionen und bildet ein Grun
Tab. 3.3: Liste der zehn am stärksten exprimierten Gene der Klasse „ bekannte Gene“.
dgerüst zur
nheftung der Zellen. Gleichzeitig besitzt die extrazelluläre Matrix die Fähigkeit,
rozesse wie zelluläre Proliferation und Differenzierung aktiv zu steuern (Adams und
att, 1993; Hay, 1993; Lin und Bissell, 1993). Die Proteine, die am Aufbau der
atrix beteiligt sind, wurden für die in silico-Analyse in drei Gruppen (Kollagene,
roteoglykane, weitere ECM-Proteine) eingeteilt (Einteilung siehe Zhang et al.,
003). 18 Gene bzw. 182 ESTs konnten den Kollagenen zugeordnet, 11 Gene (38
STs) den Proteoglykanen und 16 Gene (76 ESTs) den restlichen ECM-Proteinen
erden. Die Verteilung der einzelnen Gene auf die drei Gruppen, sowie die
äufigkeiten der korrespondierenden ESTs sind in Abb. 3.5 dargestellt.
A
P
W
M
P
2
E
w
H
- 51 -
Ergebnisse
A
B
C
0
20
40
Anz
60
80
100
120
ahl d
er E
STs
COL1A1
COL1A2
COL2A1
COL3A1
COL4A1
COL4A2
COL5A1
COL6A1
COL6A2
COL9A1
COL9A2
COL9A3
COL11A1
COl11A2
COL12A1
COL14A1
COL16A1
COL27A1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
- 52 -
9
Anz
ahl d
er E
STs
BGN
FMOD
CSPG
4
AGC1
DCN
SDC4
SDC2
PRG
4
GPC
3
GPC
1
PREL
P
0
5
10
15
20
25
Anz
ahl d
er E
STs
SPARCFN1
COMPMGP
LMNACRTL1
CHM-I
SDCBPTNC
MATN3
EFEMP1
PLOD2
LAMC2
LAMC1
HAPLN3
CHI3L1
Abb. 3.5: Häufigkeit der ESTs, die Gene unterschiedlicher extrazellulärer Matrix-Proteine repräsentieren. A: Kollagene. B: Proteoglykane und C: weitere ECM Proteine SPARC: secreted protein: acidic: rich cysteine; FN1: fibronectin 1; COMP: cartilage oligomeric matrix protein; MGP: Matrix Gla protein ; LMNA: lamin A/C ; CRTL1: cartilage linking protein 1; CHM-I: chondromodulin-1; SDCBP: syndecan binding protein; TNC: tenascin C; MATN3: matrilin 3; EFEMP1: EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1; PLOD2: procollagen lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2; LAMC2: laminin gamma 2; LAMC1: laminin gamma 1; HAPLN3: hyaluronan and proteoglycan link protein 3; CHI3L1: chitinase 3-like 1; BGN: biglycan; FMOD: fibromodulin; CSPG4: chondroitin sulfate proteoglycan 4; AGC1: aggrecan 1; DCN: decorin; SDC4: syndecan 4; SDC2: syndecan 2; PRG4: proteoglycan 4; GPC3: glypican 3; GPC1: glypican 1; PRELP: proline arginine-rich end leucine-rich repeat protein.
Ergebnisse
Abb. 3.6: Verteilung der ESTs auf Gene matrixabbauender Proteine. MMP3: matrix metalloproteinase 3; MMP1: matrix metalloproteinase 1; MMP13: matrix metalloproteinase 13; MMP9: matrix metalloproteinase 9; MMP2: matrix metalloproteinase 2; MMP11: matrix metalloproteinase 11; ADAMTS1: disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif.
Bei den in Abb. 3.5 dargestellten Genen handelt es sich um matrixaufbauende
(anabole) Proteine. Bei der Betrachtung der Matrix sollten jedoch nicht nur die
Proteine des Matrixaufbaus, sondern auch matrixabbauende Enzyme (katabol)
berücksichtigt werden (Aigner et al. 2004), da beide Prozesse in Wechselwirkung
miteinander stehen und erst das Wechselspiel des anabolen- und katabolen-Weges
die Integrität der Matrix gewährleisten. Zu der Gruppe der matrixabbauenden
Proteine gehören zum einen die Matrixmetalloproteinasen (MMPs), die einzigen
Proteinasen, die bei neutralem pH-Wert die trippelhelikale Struktur von Kollagen
aufbrechen können und zum Anderen die Familie der ADAMTS (a disintegrin and
metalloproteinase with thrombospondin motifs)-Proteine, deren Mitglieder sowohl bei
der Kollagen-Biosynthese (als Prokollagen-Propeptidase), als auch bei der
Degradation von Aggrekan beteiligt sind (ADAMTS-1, ADAMTS-4, ADAMTS-5,
ADAMTS-9, ADAMTS-15) (Kevorkian et al., 2004). Abb. 3.6 zeigt die Verteilung der
ESTs auf die einzelnen Gene, die der Gruppe der matrixabbauenden Proteine
zugewiesen wurden. Während MMP3 und MMP13 auch in anderen Knorpel-cDNA-
Bibliotheken als die zwei am stärksten exprimierten anabolen Proteine beschrieben
wurden (Zhang et al. 2003; Pogue et al. 2004) wird MMP1 in den Publikationen nicht
erwähnt (siehe Kapitel 4.4.1).
0
5
10
15
20
25
30
35
Anz
ahl d
er E
STs
MMP3MMP1
MMP13MMP9
MMP2
MMP11
ADAMTS1
- 53 -
Ergebnisse
3.1.4 Charakterisierung von ESTs der „Klasse 2“ und „Klasse 3“
Kandidatengen
Anzahl der ESTs in den Datenbanken
Gewebeverteilung der ESTs in den Datenbanken
Chromosomale Lokalisation
Putative Domänen mit potentieller Funktion bei der Knorpelentwicklung
Homologien zu Proteinfamilien
Putativer offener Leserahmen
Über den EST hinausgehende ormation über eine Sequenzinf
potentielle RNA Vorhergesagtes Signalpeptid
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand der EST-Daten die Gene zu
identifizieren, die potentiell an der Knorpelentwicklung beteiligt sind und funktionell
bzw. positionell Kandidatengene für Skeletterkrankungen darstellen. Als potentielle
Kandidaten wurden hierfür alle ESTs angesehen, die der „Klasse 2“ und „Klasse 3“
(siehe Kapitel 3.1.2) zugeordnet wurden. In einem ersten Schritt wurde das Ziel
verfolgt, entsprechende Kandidaten aus der Liste aller möglichen ESTs auszuwählen
(Auswahlkriterien siehe Abb. 3.7). Diese ESTs wurden anschließend experimentell
weiter charakterisiert. Daten zu einigen interessanten Kandidaten sind im Folgenden
(3.2-3.4) dargestellt.
Da menschliches Knorpelmaterial für weitergehende funktionelle Untersuchungen
(insbesondere Expressionsanalysen) nur schwer verfügbar ist, wurde parallel
versucht, die orthologen Mausgene zu einigen putativen Kandidatengenen zu
identifizieren.
Abb. 3.7: Auswahlkriterien zur Bestimmung der Kandidatengene für weitere experimentelle Analysen.
- 54 -
Ergebnisse
3.2 Charakterisierung des Klons 68F08 Die Auswertung des EST-Klons 68F08 ergab eine chromosomale Lokalisation in der
Chromosomenregion 9q33.1 (NCBI, Blast the Human Genome). Ein
Sequenzvergleich (mittels BlastN) des EST mit der Datenbank „Nrnuc“ zeigte eine
100%ige Sequenzidentität zu dem KIAA1870 Protein (Accession Nr.: AB058773,
5332 bp), über das wiederum ein korrespondierendes UniGene-Cluster (Hs.334604)
identifiziert werden konnte. Über das UniGene-Cluster konnte nahezu die komplette
mRNA bestimmt und über RT-PCR verifiziert werden (Daten nicht gezeigt). Das
5`-Ende des Transkriptes konnte über 5`-RACE bis zum ersten potentiellen STOP-
Codon komplettiert werden (Daten nicht gezeigt). Northern-Blot Analysen an
humaner mRNA (Abb. 3.8) zeigten eine ubiquitäre Expression mit einem
Haupttranskript von ca. 9 kB, das damit der über RT-PCR verifizierten Sequenz
entsprach. Die Hybridisierungssonde stammte aus dem 5`-UTR des Transkriptes und
wurde mittels RT-PCR generiert (Fw-Primer: 68F08-human-FwJ, Rev-Primer: 68F08-
human-RevJ).
Um weiterführende Experimente durchführen zu können, wurde über
Sequenzvergleiche der 68F08-cDNA-Sequenz mit der „est_mouse“ Datenbank
(Programm „BlastN“) das orthologe, murine 68F08-Gen identifiziert und über RT-
PCR verifiziert (Daten nicht gezeigt). Dot-Blot Analysen mit verschiedenen adulten
Maus-mRNAs und mRNAs von Mäusen unterschiedlicher Embryonalentwicklungs-
Abb. 3.8: Autoradiogramm eines “Human Multiple Tissue Northern-Blots” (Clontech), der mit einer radioaktiv markierten 68F08-Sonde hybridisiert wurde. Die Analyse zeigte ein Haupttranskript von ca. 9 kb und mehrere kleinere diffuse Transkripte, die vermutlich auf alternative Spleiß- oder Abbauprodukte zurückzuführen waren. Für eine relative Abschätzung der Hybridisierungssignale wurde der Northern-Blot anschließend mit einer GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)-Sonde hybridisiert.
- 55 -
Ergebnisse
stadien konnten die ubiquitäre Expression von 68F08 bestätigen. Auch hier wurde
eine radioaktiv markierte RT-PCR-Sonde aus dem 5`-UTR des Transkripts gewählt
(Fw-Primer: 68F08-mouse-FwL, Rev-Primer: 68F08-mouse-RevL). Die Dot-Blot-
Signale wurden mittels der Auswertungssoftware BioDocAnalyze Software (Biometra,
Göttingen) luminometrisch ausgewertet. Nach der Normalisierung der Werte über
GAPDH wurden die Signalstärken jeweils im Verhältnis zur Expression von 68F08 im
Mausentwicklungsstadium 13,5 dpc dargestellt (Abb. 3.9).
Das Gen besteht aus insgesamt 61 Exons mit einer abgeleiteten Proteinsequenz von
1858 Aminosäuren. Ein Homologievergleich der putativen Aminosäuresequenz
mittels „SMART“ zeigte, dass das putative Protein ein N-terminales Signalpeptid,
eine „thrombospondin N-terminal-like“-Domäne, einen großen trippelhelikalen (Gly-X-
Y) Bereich, sowie eine COLF1 (C-terminal) Domäne besitzt (Abb. 3.10).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
rela
tive
Expr
essi
onss
tärk
e
Leber
Niere
Gehirn
Uterus
Testis
Tag 10
,5
Tag 11
,5
Tag 13
,5
Tag 14
,5
Tag 15
,5
Abb. 3.9: Graphische Auswertung der Dot-Blot-Analysen zur Bestimmung der Expressionsstärke des murinen Gens 68F08. Je 5 µg Gesamt-RNA der Mausentwicklungsstadien Tag 10,5 dpc, 11,5 dpc, 13,5 dpc 14,5 dpc, 15,5 dpc und der Gewebe Leber, Niere, Gehirn, Uterus und Testis von adulten Tieren wurden auf eine Membran gespottet und mit einer radioaktiv markierten, murinen 68f08-Sonde hybridisiert.
Abb. 3.10: Putative Proteinstruktur des Gens 68F08. Die insgesamt 1858 Aminosäuren beinhalten vier potentielle funktionelle Strukturen: Ein Signalpeptid (SP), eine thrombospondin N-terminal-like-Domäne (TSPN), eine Region, in der jede dritte Aminosäure ein Glycin ist (Gly-X-Y Region) und eine kollagen C-terminal-Domäne (COLF1).
N- -CSP TSPN Gly-X-Y Region COLF1
1 43
45 220
614 1620
1657 1858
- 56 -
Ergebnisse
Abb. 3.11: Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des humanen und murinen 68F08-Proteins. Grün unterlegt ist die „thrombospondin N-terminal-like“-Domäne, rot dargestellt ist der trippelhelikale Bereich und türkis die COLF1-Domäne.
Die „thrombospondin N-terminal–like“-Domäne, eine Domäne, welche bei
Thrombospondin für die Bindung von Heparin und für die Zell-Zell- und Zell-
extrazelluläre Matrix-Adhäsion verantwortlich ist, der trippelhelikalen (Gly-X-Y)
Bereich mit insgesamt 335 Gly-X-Y Repeats und nicht zuletzt die COLF1 (C-terminal)
Domäne, welche bei fibrillären Kollagenen zu finden ist (Funktion ist aber noch nicht
ganz geklärt), weisen darauf hin, dass Klon 68F08 ein neues fibrilläres Kollagen
kodiert. Ein Sequenzvergleich zwischen der Aminosäuresequenz des Menschen und
der Maus zeigt eine Identität von über 84,4% (Abb. 3.11). 1 100 Human (1) MPLGAGGRTDRPASHVGTQGFLFSWILVSFACHLASTQGAPEDVDILQRLGLSWTKAG---SPAPPGVIPFQSGFIFTQRARLQAPTGTVIPAALGTELA mouse (1) ---------------MAWFGHWVGIVPLGGWLRESDTQMREHDVDVLQRLGLSWTKAGGGRSPTPPGVIPFPSGFIFTQRAKLQAPTANVLPTTLGRELA Consensus (1) MA G I L A TQ DVDILQRLGLSWTKAG SP PPGVIPF SGFIFTQRAKLQAPTA VIP LG ELA 101 200 Human (98) LVLSLCSHRVNHAFLFAVRSQKRKLQLGLQFLPGKTVVHLGSRRSVAFDLDMHDGRWHHLALELRGRTVTLVTACGQRRVPVLLPFHRDPALDPGGSFLF mouse (86) LVLSLCSHRVNHAFLFAIRSRKHKLQLGLQFLPGRTIIHLGPRQSVAFDLDVHDGRWHHLALELRGRTVTMVTACGQHRVPVPLPSRRDSMLDPQGSFLL Consensus (101) LVLSLCSHRVNHAFLFAIRS K KLQLGLQFLPGKTIIHLG R SVAFDLDMHDGRWHHLALELRGRTVTLVTACGQ RVPV LP RD LDP GSFLAAA 201 300 Human (198) GKMNPHAVQFEGALCQFSIYPVTQVAHNYCTHLRKQCGQADTYQSPLGPLFSQDSGRPFTFQSDLALLGLENLTTATPALGSLPAGRGPRGTVAPATPTK mouse (186) GKVNPRAVQFEGALCQFSIHPVAQVAHNYCAHLRERCRQVDTYSPQVGTLFPWDSGPAFALHPEPALLGLGNLTRTPATLGARPVSRALAVTLAPAMPTK Consensus (201) GKMNP AVQFEGALCQFSIHPVAQVAHNYC HLR C Q DTYLG LF DSG F D ALLGL NLT LGA PRA TLAPA PTK 301 400 Human (298) PQRTSPTNPHQHMAVGGPAQTPLLPAKLSASNALDPMLPASVGGSTRTPRPAAAQPSQKITATKIPKSLPTKPSAPSTSIVPIKSPHPTQKTAPSSFTKS mouse (286) PLRTVHPDVSEHSSS----QTPLSPAKQSARKTPSPSSSASLANSTRVYRPAAAQPRQ-ITTTSPTKRSPTKPSVSPLSVTPMKSPHATQKTGVPSFTKP Consensus (301) P RT H A QTPL PAK SA P ASLA STR RPAAAQP Q IT T K PTKPS SI PIKSPH TQKTA SFTK 401 500 Human (398) ALPTQKQVPPTSRPVPARVSRPAEKPIQRNPGMPRPPPPSTRPLPPTTSSSKKP-IPTLARTEAKITSHASKPASARTSTHKPPPFTALSSSPAPTPGST mouse (381) VPPTQKPAPFTSYLAPSKASSPTVRPVQKTFMTPRPPVPSPQPLRPTTGLSKKFTNPTVAKSKSKTTSWASKPVLARSSVPKTLQQTVLSQS-----PVS Consensus (401) PTQK P TS PAK S P KPIQK PRPPPS PL PTT SKK PTLAKS AK TS ASKP ARSS K T LS S S 501 600 Human (497) RSTRPPATMVPPTSGTSTPRTAPAVPTPGSAPTGSKKPIGSEASKKAGPKSSPRKPVPLRPGKAARDVPLSDLTTRPSPRQPQPSQQTTPALVLAPAQFL mouse (476) YLGSQTLAPALPPLGVGNPRTMPPTRDSALTPAGSKKFTGRETSKKTRQKSSPRKPEPLSPGKSARDASPRDLTTKP-------SRPSTPALVLAPAYLL Consensus (501) P G PRT P A P GSKK G E SKK KSSPRKP PL PGKAARD DLTTKP S STPALVLAPA L 601 700 Human (597) SSSPRPTSSGYSIFHLAGSTPFPLLMGPPGPKGDCGLPGPPGLPGLPGIPGARGPRGPPGPYGNPGLPGPPGAKGQKEDPGLSPGKAHDGAKGDMGLPGL mouse (569) SSSPQPTSSSFPFFHLLGPTPFPMLMGPPGSKGDCGLPGVVMMLDPTGTDGG-----PPGPYGNPGPPGPPGAKGQKGDPGLSPGQAHDGAKGNMGLPGL Consensus (601) SSSP PTSS F FHL G TPFPLLMGPPG KGDCGLPG L G GA PPGPYGNPG PGPPGAKGQK DPGLSPG AHDGAKG MGLPGL 701 800 Human (697) SGNPGPPGRKGHKGYPGPAGHPGEQGQPGPEGSPGAKGYPGRQGLPGPVGDPGPKGSRGYIGLPGLFGLPGSDGERGLPGVPGKRGKMGMPGFPGVFGER mouse (664) SGNPGPLGRKGHKGHPGAAGHPGEQGQPGPEGSPGAKGYPGRQGFPGPVGDPGPKGSRGYIGLPGLFGLPGSDGERGLPGVPGKRGWEGQMGFPGDFGER Consensus (701) SGNPGP GRKGHKGHPG AGHPGEQGQPGPEGSPGAKGYPGRQG PGPVGDPGPKGSRGYIGLPGLFGLPGSDGERGLPGVPGKRG G GFPG FGER 801 900 Human (797) GPPGLDGNPGELGLPGPPGVPGLIGDLGVLGPIGYPGPKGMKGLMGSVGEPGLKGDKGEQGVPGVSGDPGFQGDKGSQGLPGFPGARGKPGPLGKVGDKG mouse (764) GPPGLDGNPGEIGLPGPPGVLGLIGDTGALGPVGYPGPKGMKGLMGGVGEPGLKGDKGEQGVPGVSGDPGFQGDKGSHGLPGLPGGRGKPGPLGKAGDKG Consensus (801) GPPGLDGNPGEIGLPGPPGV GLIGD G LGPIGYPGPKGMKGLMG VGEPGLKGDKGEQGVPGVSGDPGFQGDKGS GLPG PGARGKPGPLGK GDKG 901 1000 Human (897) SIGFPGPPGPEGFPGDIGPPGDNGPEGMKGKPGARGLPGPRGQLGPEGDEGPMGPPGAPGLEGQPGRKGFPGRPGLDGVKGEPGDPGRPGPVGEQGFMGF mouse (864) SLGFPGPPGPEGFPGDIGPPGDNGPEGMKGKPGARGLPGPPGQLGPEGDEGPMGPPGVPGLEGQPGRKGFPGRPGLDGSKGEPGDPGRPGPVGEQGLMGF Consensus (901) SIGFPGPPGPEGFPGDIGPPGDNGPEGMKGKPGARGLPGP GQLGPEGDEGPMGPPG PGLEGQPGRKGFPGRPGLDG KGEPGDPGRPGPVGEQG MGF 1001 1100 Human (997) IGLVGEPGIVGEKGDRGMMGPPGVPGPKGSMGHPGMPGGMGTPGEPGPQGPPGSRGPPGMRGAKGRRGPRGPDGPAGEQGSRGLKGPPGPQGRPGRPGQ- mouse (964) IGLVGEPGIVGEKGDRGVMGPPGAPGPKGSMGHPGTPGGIGNPGEPGPWGPPGSRGLPGMRGAKGHRGPRGPDGPAGEQGSKGLKGRVGPRGRPGQPGQQ Consensus (1001) IGLVGEPGIVGEKGDRGMMGPPG PGPKGSMGHPG PGGIG PGEPGP GPPGSRG PGMRGAKG RGPRGPDGPAGEQGSKGLKG GP GRPG PGQ 1101 1200 Human (1096) --QGVAGERGHLGSRGFPGIPGPSGPPGTKGLPGEPGPQGPQGPIGPPGEMGPKGPPGAVGEPGLPGEAGMKGDLGPLGTPGEQGLIGQRGEPGLEGDSG mouse (1064) FVVTHASKDAHCTSRVQLGIPGPSGPPGAKGLPGEPGSQGPQGPVGPPGEMGPKG------------------DLGPLGPPGEQGLIGQRGEPGLEGDHG Consensus (1101) A AH SR GIPGPSGPPG KGLPGEPG QGPQGPIGPPGEMGPKG DLGPLG PGEQGLIGQRGEPGLEGD G 1201 1300 Human (1194) PMGPDGLKGDRGDPGPDGEHGEKGQEGLMGEDGPPGPPGVTGVRGPEGKSGKQGEKGRTGAKGAKGYQGQLGEMGVPGDPGPPGTPGPKGSRGSLGPTGA mouse (1146) PVGPDGLKGDRGDPGPDGEHGEKGQEGLKGEDGSPGPPGITGVPGREGKPGKQGEKGQRGAKGAKGHQGYLGEMGIPGEPGPPGTPGPKGSRGTLGPTGA Consensus (1201) PMGPDGLKGDRGDPGPDGEHGEKGQEGL GEDG PGPPGITGV G EGK GKQGEKG GAKGAKGHQG LGEMGIPGDPGPPGTPGPKGSRGSLGPTGA 1301 1400 Human (1294) PGRMGAQGEPGLAGYDGHKGIVGPLGPPGPKGEKGEQGEDGKAEGPPGPPGDRGPVGDRGDRGEPGDPGYPGQEGVQGLRGKPGQQGQPGHPGPRGWPGP mouse (1246) PGRMGAQGEPGLAGYNGHKGITGPLGPPGPKGEKGDQGEDGKTEGPPGPPGDRGPVGDRGDRGEPGDPGYPGQEGVQGLRGEPGQQGQPGHPGPRGRPGP Consensus (1301) PGRMGAQGEPGLAGY GHKGI GPLGPPGPKGEKGDQGEDGK EGPPGPPGDRGPVGDRGDRGEPGDPGYPGQEGVQGLRG PGQQGQPGHPGPRG PGP 1401 1500 Human (1394) KGSKGAEGPKGKQGKAGAPGRRGVQGLQGLPGPRGVVGRQGLEGIAGPDGLPGRDGQAGQQGEQGDDGDPGPMGPAGKRGNPGVAGLPGAQGPPGFKGES mouse (1346) KGSKGEEGPKGKPGKAGPSGRRGTQGLQGLPGPRGVVGRQGPEGTAGSDGIPGRDGRPGYQGDQGNDGDPGPVGPAGRRGNPGVAGLPGAQGPPGFKGES Consensus (1401) KGSKG EGPKGK GKAG GRRG QGLQGLPGPRGVVGRQG EG AG DGIPGRDG G QGDQG DGDPGPMGPAGKRGNPGVAGLPGAQGPPGFKGES 1501 1600 Human (1494) GLPGQLGPPGKRGTEGRTGLPGNQGEPGSKGQPGDSGEMGFPGMAGLFGPKGPPGDIGFKGIQGPRGPPGLMGKEGIVGPLGILGPSGLPGPKGDKGSRG mouse (1446) GLPGQLGPPGKRGTEGGTGLPGNQGEPGSKGQPGDSGEMGFPGVAGLFGPKGPPGDIGFKGIQGPRGPPGLMGKEGIIGPPGMLGPSGLPGPKGDRGSRG Consensus (1501) GLPGQLGPPGKRGTEG TGLPGNQGEPGSKGQPGDSGEMGFPGMAGLFGPKGPPGDIGFKGIQGPRGPPGLMGKEGIIGP GILGPSGLPGPKGDKGSRG 1601 1700 Human (1594) DWGLQGPRGPPGPRGRPGPPGPPGGPIQLQQDDLGAAFQTWMDTSGALR---PESYSYPDRLVLDQGGEIFKTLHYLSNLIQSIKTPLGTKENPARVCRD mouse (1546) DLGLQGPRGPPGPRGRPGPPGPPWHPIQFQQDDLGAAFQTWMDAQGAVRSEVLQGYSYPDQLALDQGGEIFKTLHYLSNLIQSIKTPLGTKENPARVCRD Consensus (1601) D GLQGPRGPPGPRGRPGPPGPP PIQ QQDDLGAAFQTWMD GALR YSYPD L LDQGGEIFKTLHYLSNLIQSIKTPLGTKENPARVCRD 1701 1800 Human (1691) LMDCEQKMVDGTYWVDPNLGCSSDTIEVSCNFTHGGQTCLKPITASKVEFAISRVQMNFLHLLSSEVTQHITIHCLNMTVWQEGTGQTPAKQAVRFRAWN mouse (1646) LMDCEQRMADGTYWVDPNLGCSSDTIEVSCNFTQGGQTCLKPITASKAEFAVSRVQMNFLHLLSSEGTQHITIHCLNMTVWQEGPGRSSARQAVRFRAWN Consensus (1701) LMDCEQKM DGTYWVDPNLGCSSDTIEVSCNFT GGQTCLKPITASK EFAISRVQMNFLHLLSSE TQHITIHCLNMTVWQEG G S AKQAVRFRAWN 1801 1858 Human (1791) GQIFEAGGQFRPEVSMDGCKVQDGRWHQTLFTFRTQDPQQLPIISVDNLPPASSGKQYRLEVGPACFL mouse (1746) GQVFEAGGQFRPEVSMDGCKVHDGRWHQTLFTFRTQDPQQLPIVSVDNLPPVSSGKQYRLEVGPACFL Consensus (1801) GQIFEAGGQFRPEVSMDGCKV DGRWHQTLFTFRTQDPQQLPIISVDNLPP SSGKQYRLEVGPACFL
- 57 -
Ergebnisse
Das Gen stellt grundsätzlich aufgrund seiner Ähnlichkeit zu Kollagen XI (hier wurden
Mutationen bei verschiedenen Skelettdysplasien identifiziert (Li et al., 1995) ein
interessantes Kandidatengen für Skelettdysplasien dar. Bisher konnte jedoch keine
spezielle Erkrankung in der Chromosomenregion 9q33.1 kartiert werden. Zeitgleich
wurde das Gen von einer amerikanischen Arbeitsgruppe beschrieben und als
COL27A1 bezeichnet (Pace et al., 2003). Aus diesem Grund wurde auf eine weitere
Analyse verzichtet.
3.3 Charakterisierung des Klons 19C12 Der Sequenzvergleich des EST 19C12 mit Hilfe der UniGene-Datenbank, sowie
weiterer Datenbanken führte zur Identifizierung des UniGene-Clusters Hs.25391. Der
Cluster beinhaltet Informationen zu einem putativen neuen menschlichen Gen
unbekannter Funktion in der Chromosomenregion 6p21.31. Anhand der
Expressionsdaten der ESTs aus dem genannten Cluster war ersichtlich, dass das
putative Gen in sehr vielen verschiedenen menschlichen Geweben, unter anderem
aber auch in Tumoren des Knorpels (Chondrosarkom) exprimiert wird, und daher für
weitere Analysen interessant erscheint.
Ausgehend von der unvollständigen mRNA-Sequenz mit der Accession-Nr.
AY358422 konnte über ein EST-Clustering Programm (http://genius.embnet.dkfz-
heidelberg.de/menu/cgi-bin/estcluster/estcluster.start) der komplette offene
Leserahmen der mRNA bestimmt werden. Das Gen besteht aus 7 Exons und
umfasst einen genomischen Bereich von 10 kB (Abb. 3.12). Die einzelnen Exons
konnten über RT-PCR verifiziert werden. Zudem wurde eine Spleißvariante der Exon
5 fehlt gefunden.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz umfasst 463 Aminosäuren. Ein Vergleich der
Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens mit der Datenbank „SMART“ zeigte,
dass das putative Protein eine SCP (SCP / Tpx-1 / Ag5 / PR-1 / Sc7 family of
extracellular)-Domäne besitzt. Mit dem Programm SignalP V2.0 konnte mit einer
Wahrscheinlichkeit von 95% ein Signalpeptid vorhergesagt werden, so dass das
putative Gen entweder ein Transmembranprotein oder ein extrazelluläres Protein ist.
- 58 -
Ergebnisse
Abb. 3.12 : Struktur des humanen 19C12-Gens. Die Exons sind hellblau dargestellt. Der offene hmen ist durch das erste Methionin (Start-Codon) und durch das Stop-Codon begrenzt und
umfasst 463 Aminosäuren. Das Signalpeptid ist blau und die SCP-Domäne rot unterlegt. Lesera
Mit Hilfe von RT-PCR-Analysen an RNA aus humanem Knorpel- und Patella-Gewebe
konnte in Vorversuchen gezeigt werden, dass 19C12 in humanem Knorpel-Gewebe
exprimiert wird (Daten nicht gezeigt). Zur weitergehenden Untersuchung der
Expression und der Ermittlung der Transkriptgröße des humanen 19C12-Gens
wurden Northern-Blot-Analysen mit kommerziell erhältlichen „Multiple Tissue
Northern Blots/Arrays“ (Clontech, Heidelberg) durchgeführt. Als Sonden wurden zwei
verschiedene RT-PCR-Fragmente aus dem 3`-UTR und dem 5`-UTR der 19C12-
mRNA verwendet. Mit beiden Sonden konnte ein identisches Expressionsmuster
nachgewiesen werden (Abb. 3.13). Über die Northern-Blot-Analysen konnten die
in silico-Daten und die RT-PCR Experimente bestätigt werden und ein
Haupttranskript mit einer Größe von ca. 2,2 kb, sowie eine Spleißvariante von ca. 1,6
kb (was dem Verlust von Exon 5 entsprechen würde) nachgewiesen werden
(Abb.3.13). Zudem bestätigt das Experiment die ubiquitäre Expression des Gens und
eine besonders starke Expression der 1,6 kb Spleißvariante im Gehirn.
5` 3`
Exon 1 499 bp
Exon 2 221 bp
Exon 3 110 bp
Exon 4 89 bp
Exon 5 678 bp
Exon 6 140 bp
Exon 7 446 bp
Intron 1 4213 bp
Intron 2 2084 bp
Intron 3 325 bp
Intron 4 960 bp
Intron 5 210 bp
Intron 6 423 bp
Startcodon Stopcodon
- 59 -
Ergebnisse
A bb. 3.13: Das Autoradiogramm eines “Human Multiple Tissue Northern-Blots” zur Expressionskontrolle von 19C12. Die Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten 19C12-Sonde
s dem 5’-UTR des Gens, zeigt eine starke Expression eines 2,2 kB Transkripts im Herzen und eine sehr starke Expression eines 1,6 kB großen Transkripts im Gehirn sowie schwächer in weiteren
eweben. Für eine relative Abschätzung der Hybridisierungssignale wurden die Northern-Blots anschließend mit einer ß-Actin-Sonde hybridisiert.
au
G
Über Sequenzvergleiche der 19C12-cDNA-Sequenz mit der „est_mouse“-Datenbank
(Programm „BlastN“) wurde die 19c12-cDNA des orthologen murinen Gens
identifiziert und über RT-PCR verifiziert. Die Homologie auf Aminosäureebene
zwischen Mensch und Maus liegt bei 73% und ist in Abb. 3.14 dargestellt. RNA-in-
situ-Hybridisierungen an Mausembryonen zeigten ein starkes Signal im Gehirn
(Daten nicht gezeigt). Es konnte jedoch kein signifikantes Signal in Knochen- oder
Knorpelelementen detektiert werden. Aufgrund der experimentellen Daten, die keine
spezifische Beteiligung von 19C12 an der Knorpel-, Knochenentwicklung nahe
legten, wurde der Klon nicht weiter charakterisiert.
- 60 -
Ergebnisse
Abb. 3.14: Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des humanen und murinen 19C12-Gensproduktes. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen weisen eine Sequenzähnlichkeit von 73% auf. Identische Aminosäuren sind gelb schattiert, unterschiedliche Aminosäuren gleicher abgeleiteter Funktionalität grün. Das Signalpeptid ist mit einer grauen Box und die SCP-Domäne mit einer türkisen Box hinterlegt.
human (1) SCSFLMLLLP--LLLLLVATTGPVGALTDEEKRLMVELHNLYRAQVSPPASDMLHMR mouse (1) MHGSCSPWVMLPPPLLLLLLLIATGPTTALTEDEKQTMVDLHNQYRAQVSPPASDMLQMR human (59) WDEELAAFAKAYARQCVWGHNKERGRRGENLFAITDEGMDVPLAMEEWHHEREHYNLSAA mouse (61) WDDELAAFAKAYAQKCVWGHNKERGRRGENLFAITDEGMDVPLAVGNWHEEHEYYNFSTA human (119) TCSPGQMCGHYTQVVWAKTERIGCGSHFCEKLQGVEETNIELLVCNYEPPGNVKGKRPYQ mouse (121) TCDPNQMCGHYTQVVWSKTERIGCGSHFCETLQGVEEANIHLLVCNYEPPGNVKGRKPYQ human (179) EGTPCSQCPSGYHCKNSLCEPIGSPEDAQDLPYLVTEAPSFRATEASDSRKMGTPSSLAT mouse (181) EGTPCSQCPLGYSCENSLCEPMRNPEKAQDSPPRVTEVPSTRATEAPSSRETGTPSLATS human (239) GIPAFLVTEVSGSLATKALPAVETQAPTSLATKDPPSMATEAPPCVTTEVPSILAAHSLP mouse (241) ETLHFSVIKVSDSLATESSPAVETKAPSSLATEGPSSMATEAQAFVT-EVPLVSARHMQP human (299) SLDEEPVTFPKSTHVPIPKSADKVTDKTKVPSRSPENSLDPKMSLTGARELLPHAQEEAE mouse (300) SVDEGPVNFLTSTHIPVPKSMDEEASKSSATSVSPKKSLYPKMSLTESGESVPQIQEEAE human (359) AEAELPPSSEVLASVFPAQDKPGELQATLDHTGHTSSKSLPNFPNTSATANATGGRALAL mouse (360) AEAESPLSSEALVPVLPAQERGG-QKASLEHSGHPASPSLPTFP--SASGNATGGRTLAL human (419) QSSLPGAEGPDKPSVVSGLNSGPGHVWGPLLGLLLLPPLVLAGIF mouse (417) QSSWTGAENPEK---ADWDLKNSAHVWGPFLGLLLPSLLLLAGMV
3.4 Charakterisierung des Klons 86H12 (ECM3) Ausgehend vom EST-Klon 86H12 („Klasse 2“, 445 bp) wurden über BlastN-Analysen
unter Verwendung der „est-human“-Datenbank vier ESTs identifiziert, die 252 bp
eines möglichen Transkripts abdecken. Alle vier ESTs stammten aus
unterschiedlichen Knorpelgeweben (Tab. 3.4) und führten zu einem UniGene-Cluster
(Hs.442169), das ansonsten keine weiteren ESTs enthielt.
EST-Accession-Nr. Gewebe Library-Name Sequenz-
Informationen Länge des
Klons
BQ181183 Osteoarthritic Cartilage NCI_CGAP_Car1 617 bp 1114 bp
BQ447619 Osteoarthritic Cartilage NCI_CGAP_Ct1 645 bp 1029 bp
BQ448435 Osteoarthritic Cartilage NCI_CGAP_Ct1 408 bp 1036 bp
BQ772123 Chondrosarcoma Grade II NCI_CGAP_Ch2 697 bp 1081 bp
Tab. 3.4: ESTs des UniGene-Clusters Hs.442169. Alle ESTs wurden vom 3’-Ende gelesen, so dass lle Klone überlappen. Die Spalte „Sequenzinformationen“ gibt die Anzahl der Basen wieder, die in en Datenbanken abgelegt wurden. Die Spalte „Länge des Klons“ weist die absolute Länge des
jeweiligen EST-Klons aus.
ad
- 61 -
Ergebnisse
- 62 -
Das UniGene-Cluster wird in der Datenbank als „Similar to Extracellular matrix
protein 2 precursor“ bezeichnet, und zeigt Homologien zu dem Gen ECM2. 86H12
wurde daraufhin von uns mit ECM3 (Extracellular matrix protein 3) benannt.
3.4.1 Sequenzierung der humanen ECM3-cDNA
BQ181183 (1-617)
BQ447619 (1-645)
BQ448435 (1-408)
AATAAA
05002500 2000 1500 1000
ECM3
86f08 (1-445)
BQ772123 (1-617)
IMAGE:5850224 (1-1114)
Race-Pr1 (1080-1581)
Race-Pr5d (2174-2429)
Race-Pr4b (1980-2390)
Race-Pr3b (1672-2022)
Race-Pr2c (1540-1795)
ATG
SignalpeptidBQ181183 (1-617)
BQ447619 (1-645)
BQ448435 (1-408)
AATAAA
05002500 2000 1500 1000
ECM3
86f08 (1-445)
BQ772123 (1-617)
IMAGE:5850224 (1-1114)
Race-Pr1 (1080-1581)
Race-Pr5d (2174-2429)
Race-Pr4b (1980-2390)
Race-Pr3b (1672-2022)
Race-Pr2c (1540-1795)
ATG
Signalpeptid
05002500 2000 1500 1000
ECM3
86f08 (1-445)
BQ772123 (1-617)
IMAGE:5850224 (1-1114)
Race-Pr1 (1080-1581)
Race-Pr5d (2174-2429)
Race-Pr4b (1980-2390)
Race-Pr3b (1672-2022)
Race-Pr2c (1540-1795)
ATG
Signalpeptid
bb. 3.15: Strategie zur Komplettierung von ECM3 (rot dargestellt). Durch verschiedene ACE-Experimente (lila) konnte der offene Leserahmen (1749 bp) komplettiert werden. unkelgrün sind zwölf „leucine-rich repeats, typical (most populated) subfamily“ Domänen argestellt. Das Polyadenlyierungssignal ist durch die Erkennungssequenz AATAAA
ARDdgekennzeichnet.
Die Sequenzierung des RZPD-Klons IMAGE:5850224 (entspricht dem EST-Klon mit
der Accession-Nr. BQ181183) führte zu einer Verlängerung des 5’-Bereichs der EST-
Sequenz auf 1114 bp. Hiervon ausgehend konnten über sukzessive RACE (Rapid
Amplification of cDNA Ends)-Experimente das 5’-Ende des ECM3-Gens identifiziert
werden. Insgesamt wurde so eine mRNA von 2429 bp ermittelt. Eine Übersicht über
die Klonierungs-Strategie und die daraus erhaltenen Sequenzinformationen zeigt die
Abb. 3.15. Die erhaltene Sequenz wurde anschließend über RT-PCR an humaner
Plazenta- und Knorpel-RNA und nachfolgender Sequenzierung verifiziert. Das Gen
umfasst 12 Exons mit einer Transkriptlänge von 2448 bp (Abb. 3.15).
Ergebnisse
Abb. 3.16: Genomische-Struktur des humanen ECM3-Gens. Die Exons sind violett dargestellt. Der offene Leserahmen ist durch das erste Methionin (Start) und durch das Stop-Codon begrenzt und umfasst 562 Aminosäuren. Die zwölf „Leucine-rich repeats, typical (most populated) subfamily”-Domänen sind blau unterlegt.
Genomisch erstreckt sich das Gen über 10,7 kb. Durch „BlastN“
Homologievergleiche der cDNA-Sequenz des humanen ECM3-Gens mit der
„htgs“-Datenbank konnte gezeigt werden, dass ECM3 auf dem genomischen
Contig NT_025965.12 in der Chromosomenregion Xq28 lokalisiert ist. Die abgeleitete
Aminosäuresequenz umfasst 589 Aminosäuren. Ein Vergleich der
Aminosäuresequenz des putativen offenen Leserahmens mit der Proteindatenbank
„SMART“ zeigte, dass das putative Protein zwölf „Leucine-reiche Repeats (LRR),
typical subfamily-Domänen“ enthält. SignalP V2.0 sagt mit einer Wahrscheinlichkeit
von 100% ein Signalpeptid vorher.
Exon 1
5 3
Exon 2 Exon 3 Exon 5 Exon 6 Exon 7Exon 4
Intron 1 Intron 2 Intron 3 Intron 4 Intron 5 Intron 6
Exon 8 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 12
Intron 7 Intron 8Intron 9 Intron 10 Intron 11
109 bp 103 bp 196 bp 426 bp 288 bp 116 bp125 bp
1239 bp 1051 bp 223 bp 1193 bp 355 bp 161 bp
133 bp 26 bp 140 bp 327 bp 459 bp
401 bp 256 bp 654 bp 2325 bp 534 bp
Start Stop
3.4.2 Analyse der Expression des humanen ECM3-Gens Aus den im UniGene-Cluster Hs.442169 aufgeführten ESTs war ersichtlich, dass das
humane ECM3-Gen ein sehr schwach transkribiertes Gen ist, das vor allem in
krankhaft verändertem Knorpelgewebe (Chondrosarkom, Osteoarthrose-Knorpel)
exprimiert wird (Tab. 3.4).
Mit Hilfe von RT-PCR-Analysen an RNA aus verschiedenen juvenilen humanen
Knorpelgeweben konnte in Vorversuchen nachgewiesen werden, dass ECM3 in
Knorpelgewebe exprimiert wird (Daten nicht gezeigt). Zur weitergehenden
Untersuchungen der Expression und der Ermittlung der Transkriptgröße des
humanen ECM3-Gens wurden Northern-Blot-Analysen von humaner RNA aus
verschiedenen Geweben durchgeführt. Hierzu wurden selbst hergestellte Northern-
Blots, sowie kommerziell erhältliche „Multiple Tissue“ Northern-Blots verwendet. Als
Sonden wurden zwei verschiedene RT-PCR-Fragmente eingesetzt. Die erste Sonde
umfasste Teile von Exon 11 und Exon 12 (Sondenlänge:335 bp; Primer: 86H12_Fw7
und 86H12_Rev7) und die zweite Sonde Teile von Exon 4 und Exon 5
(Sondenlänge: 489 bp; Primer 86H12_FwA und 86H12_RevK). Beide Sonden
- 63 -
Ergebnisse
Abb. 3.17: Autoradiogramm der Hybridisierung eines “Human Multiple Tissue“ Northern (MTN)-Blot, mit einer radioaktiv markierten ECM3-Sonde. Der Blot zeigte zwei Haupttranskripte bei 2,4 und 2,2 kb. Die stärkste Expression konnte in Plazenta nachgewiesen werden. Für eine relative Abschätzung der Hybridisierungssignale wurde der Northern-Blot anschließend mit einer GAPDH-Sonde hybridisiert.
GAPDH
kb Herz Gehirn
Plazen
ta
LungeLeb
erSke
lettm
uskel
NierePan
kreas
0,24 -
1,35 -
2,4 -
4,4 -
7,5 -9,5 -
Herz Gehirn
Plazen
ta
LungeLeb
erNier
ePan
kreas
0,24 -
1,35 -
2,4 -
4,4 -
7,5 -9,5 -
GAPDH
kb Herz Gehirn
Plazen
ta
LungeLeb
erSke
lettm
uskel
NierePan
kreas
0,24 -
1,35 -
2,4 -
4,4 -
7,5 -9,5 -
Herz Gehirn
Plazen
ta
LungeLeb
erNier
ePan
kreas
0,24 -
1,35 -
2,4 -
4,4 -
7,5 -9,5 -
Herz Gehirn
Plazen
ta
LungeLeb
erSke
lettm
uskel
NierePan
kreas
0,24 -
1,35 -
2,4 -
4,4 -
7,5 -9,5 -
Herz Gehirn
Plazen
ta
LungeLeb
erNier
ePan
kreas
0,24 -
1,35 -
2,4 -
4,4 -
7,5 -9,5 -
zeigten ein identisches Expressionsmuster. Nachgewiesen werden konnte eine
starke Expression in der Plazenta und eine schwache ubiquitäre Expression in Herz,
Gehirn, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas (Abb. 3.17). Insgesamt
konnten zwei Haupttranskriptgrößen festgestellt werden. Ein 2,4 kb großes
Transkript, das in etwa der Größe der in Kap. 3.4.1 ermittelten mRNA entspricht,
sowie ein kürzeres Transkript von 2,2 kb, bei dem es sich vermutlich um eine sehr
seltene Spleißvariante handelt.
Darüber hinaus wurde die Expression von ECM3 in verschiedenen menschlichen
Geweben mittels Dot-Blot-Analysen untersucht. Verwendet wurde ein „Multiple
Tissue Expression Array“ (Clontech, Heidelberg). Die radioaktive Hybridisierung fand
mit den gleichen Sonden statt, die auch bei den Northern-Blot-Analysen verwendet
wurden. Auch hier zeigte sich mit beiden Sonden ein identisches Expressionsprofil.
Diese Daten bestätigen die Ergebnisse der Northern-Blot-Analysen. Auch hier ist
eine starke Expression in Plazenta und eine schwache ubiquitäre Expression in
diversen anderen Geweben feststellbar (Abb. 3.18).
- 64 -
Ergebnisse
Abb. 3.18: Das Autoradiogramm eines humanen „Multiple Tissue Expression Array“, der mit der radioaktiv markierten ECM3-Sonde hybridisiert wurde. Nach einer sechswöchigen Exposition zeigt der Blot eine ubiquitäre Expression von ECM3 in humanen Geweben. Die stärkste Expression von ECM3 konnte in RNA aus Plazenta nachgewiesen werden.
- 65 -
Ergebnisse
3.4.3 ECM3 in anderen Spezies Um weitere experimentelle Untersuchungen insbesondere RNA-
in situ-Hybridisierungen durchführen zu können, wurde über bioinformatische und
experimentelle Methoden versucht, das zu ECM3 orthologe Gen in der Maus zu
identifizieren. Suchen in den murinen EST-Datenbanken bei NCBI, USCS, TIGR,
Ensembl und MGI ergaben allerdings keine Ergebnisse. Vergleicht man die Anzahl
der EST-Einträge der verschiedenen Organismen, so kann dies mit den verwendeten
Datenbanken zusammenhängen. ECM3 ist mit seinem sehr spezifischen und
schwachen Expressionsmuster lediglich viermal in den humanen EST-Datenbanken
vertreten. Die menschliche EST-Datenbank ist mit 5.654.825 ESTs die
umfangreichste Datenbank (Stand 31.08.05, dbEST (NCBI)). Alternativ könnte das
Fehlen muriner ESTs darauf hinweisen, dass ECM3 evolutionär nicht konserviert ist.
Um der Frage nachzugehen, ob die genomische Organisation um ECM3
(einschließlich flankierender Gene) auch in der Maus erhalten ist, wurden Syntenie-
Bereiche zwischen Mensch und Maus miteinander verglichen (Abb. 3.19).
Interessanterweise sind zwar die Exons der ECM3 flankierenden Gene (Biglykan und
Trex) zwischen Mensch und Maus konserviert, jedoch nicht die Exons von ECM3.
Auch experimentelle Analysen wie RT-PCR, Northern- und Dot-Blot-Analysen an
verschiedenen murinen Geweben (Daten nicht gezeigt) ergaben keinen Hinweis auf
die Expression bzw. Existenz eines funktionellen orthologen Gens zu ECM3 in der
Maus. In anderen Modellorganismen wie Schimpanse oder Hund konnte über
Syntenievergleiche gezeigt werden, dass die Exon-Intron Struktur zwischen Mensch
und Hund, sowie Mensch und Schimpanse konserviert ist (Abb. 3.20).
- 66 -
Ergebnisse
Abb. 3.19: Percent identity plot (PIP). Interspezies-Vergleich mittels PipMaker zur Identifizierung von orthologen Genen zu ECM3. Die schwarzen waagerechten Balken geben jeweils die prozentuale Identität des genomischen Bereichs zwischen Mensch-Schimpanse (erste Spalte), Mensch-Hund (zweite Spalte) Mensch-Maus (dritte Spalte) und Mensch-Ratte (vierte Spalte) an (Bereiche zwischen 50 und 100%). Gelb unterlegt sind die genomischen Bereiche der zu ECM3 flankierenden Gene (TREX und BGN). Die humanen Exons der flankierenden Gene sind in blau dargestellt. Rot markiert ist der genomische Bereich und grün dargestellt sind die Exons von ECM3 im Menschen.
- 67 -
Ergebnisse
3.4.4 ECM3 Expression in Knorpel von Patienten mit Osteoarthrose oder rheumatoider Arthritis
Osteoarthrose und rheumatoide Arthritis stellen die beiden häufigsten chronischen
Gelenkerkrankungen dar (Felson et al., 2000). Zurzeit sind trotz intensiver Forschung
weder die zugrunde liegenden Pathomechanismen hinreichend bekannt, noch
existieren ausreichende diagnostische Tests oder zufrieden stellende
Therapiekonzepte. Da aus den zur Verfügung stehenden EST-Daten
geschlussfolgert werden konnte, dass ECM3 in Osterarthroseknorpel exprimiert wird
(siehe Kapitel 3.4.1), wurde in der vorliegenden Arbeit durch
Genexpressionsanalysen mittels „Real-Time“-PCR der Frage nach einer potentiellen
Beteiligung von ECM3 an der Pathogenese von Osteoarthrose und rheumatoider
Arthritis, sowie nach einer möglichen Verwendung als diagnostischer Marker bei
Osteoarthrose und rheumatoider Arthritis nachgegangen.
Für diese Untersuchungen wurden von der AG PD Dr. Pullig (Rheumatologie,
Erlangen) RNA aus Knorpelbiopsien zweier Patientenkollektive zur Verfügung
gestellt (Tab. 3.5).
Patient Erkrankungsstadium Patient Erkrankungsstadium
656 0 - I 439 II - III 428 I 656 III 649 I 428 III 671 I 619 III 434 II - III 436 III 674 II - III 677 III 438 II - III 675 III
Patient Erkrankungsstadium Patient Erkrankungsstadium 508 0 – I (Osteophyt) 488 I - II 471 I - II 493 II 523 I - II 471 III 411 I - II 523 III 435 I - II
A
B
Tab. 3.5: Patientenkollektive, die zur Überprüfung einer Beteiligung von ECM3 an der Pathogenese von Osteoarthrose oder rheumatoider Arthritis herangezogen wurden. Unter A sind die untersuchten Patienten, die an Osteoarthrose, und unter B diejenigen, die an rheumatoider Arthritis erkrankt sind, aufgelistet. Die Klassifizierung der Patienten erfolgte nach Fassbender (1975; siehe Kapitel 1.2.3).
- 68 -
Ergebnisse
3.4.4.1 Etablierung der „Real-Time“-PCR Die Sonde für die quantitative Bestimmung von ECM3 mittels „Real-Time“-PCR
wurde bei der Firma Applied Biosystems (Assay-by-design) bestellt und umschließt
den Übergang von Exon 10 zu Exon 11. Primer und Sonde für β2-Mikroglobulin
(B2M) als endogene Referenz stellte die AG PD Dr. Pullig (Rheumatologie,
Erlangen) zur Verfügung.
Um Primer und Sonde auf Anwendbarkeit zu testen, wurden für ECM3 und B2M
Standardkurven erstellt und daraus die Effizienzen der PCR-Reaktionen bestimmt,
die unter optimalen Bedingungen bei exponentiellem PCR-Verlauf 100% betragen
sollten (Raeymaekers, 2000). Dazu wurde aus Knorpel-RNA eine Verdünnungsreihe
von 7,5 ng/µl bis 0,46875 ng/µl hergestellt und die Effizienz der ECM3-PCR bei den
verschiedenen RNA-Konzentrationen bestimmt. Die PCR-Rohdaten wurden mit der
ABI PRISM 7900 HAT SDS V2.1.1-Software (Applied Biosystems, Foster City)
bearbeitet und bei linearer Auftragung in einem sigmoidalen Amplifikationsgraphen
dargestellt (exemplarisch ist jeweils ein Graph für jede RNA-Verdünnung in Abb.
3.20, A (ECM3), B (B2M) gezeigt). Basislinie und Schwelle konnten für beide Gene
gleich gesetzt werden. Trägt man die CT-Mittelwerte gegenüber dem Logarithmus der
jeweiligen RNA-Menge auf und ermittelt die Regressionsgerade, so erhält man die
Standardkurve, aus der über die Steigung die Effizienz der PCR-Reaktion für jedes
Gen berechnet werden kann (QIAGEN, 2004).
Die Standardkurve für ECM3 ist in Abb. 3.20 (C) abgebildet. Die Steigung der
Regressionsgeraden von -2,9 entspricht einer PCR-Effizienz von 121%. Das mit R2
angegebene Bestimmtheitsmaß liegt bei 0,972. B2M besitzt in seiner Standardkurve
eine Steigung von -3,35, was umgerechnet eine Effizienz von 99% ergibt, mit einem
Bestimmtheitsmaß von 0,994 (Abb. 3.20, D).
Zur relativen Quantifizierung der Genexpression existieren zwei verschiedene
Berechnungsmethoden: die Standardkurven- und die vergleichende ∆∆CT-Methode.
Welche der beiden Methoden gewählt wird, hängt von den Amplifikationseffizienzen
ab. Bei vergleichbaren Effizienzen zwischen Zielgen und Referenzgen kann die
∆∆CT-Methode angewendet werden, bei unterschiedlichen Effizienzen muss mittels
Standardkurvenmethode berechnet werden (Qiagen, 2004). Ein Vergleich der
Effizienzen von Zielgen und Referenz ermöglicht das Darstellen einer
Effizienzgerade (Abb. 3.20, E), für die dann CT-Werte gegen den Logarithmus der
jeweiligen Verdünnungsfaktoren aufgetragen werden. Ist die Steigung der ermittelten
Regressionsgeraden kleiner als 0,1 gelten die Amplifikationseffizienzen als
- 69 -
Ergebnisse
vergleichbar und die ∆∆CT-Methode kann angewendet werden. Im vorliegenden Fall
war die Steigung der Regressionsgeraden zum Vergleich der Effizienzen zwischen
ECM3 und B2M (Abb. 3.20, E) mit einem Wert von 0,45 größer als 0,1, so dass die
Standardkurvenmethode angewandt wurde.
Abb. 3.20: Amplifikationsgraphen, Standardkurven und Effizienzgeraden für ECM3 und B2M.
In den Amplifikationsdiagrammen (A und B) sind die Rohdaten der SDS-Software exemplarisch mit m Amplifikationsgraphen pro RNA-Verdünnung sowie Schwelle und Basislinie (rot)
dargestellt. Die Diagramme C und D zeigen die daraus ermittelten Standardkurven mit weichung, Gleichung der Regressionsgeraden und Bestimmtheitsmaß. Die Effizienz-
de (E) ermöglicht über die Geradensteigung eine Bestimmung der Kalkulationsmethode.
je eine
Standardabgera
- 70 -
Ergebnisse
3.4.4.2 Expressionsanalyse von ECM3 an Knorpelbiopsaten von Osteoarthrose-Patienten
Für die Ermittlung der relativen Expressionslevel von ECM3 in Knorpelbiopsaten von
Patienten mit Osteoarthrose konnte als Kalibrator keine Knorpel-RNA von gesunden
Kontrollen benutzt werden, da bei zwei benutzten gesunden Kontrollen nach 45
PCR-Zyklen keine detektierbare Amplifikation von ECM3 zu verzeichnen war.
Vergleichsexperimente mit GAPDH, B2M und SPOC-1 zeigten jedoch, dass beide
RNA-Präparationen qualitativ und quantitativ in Ordnung waren. Hieraus kann man
schlussfolgern, dass ECM3 offensichtlich nicht in gesundem adulten Gelenk-Knorpel
exprimiert wird. Aus diesem Grund wurde Plazenta-RNA, dem Gewebe mit der
höchsten ECM3-Expression in Northern-Blot und RNA-Dot-Blot-Analysen (siehe
Kapitel 3.4.3), als Kalibrator gewählt. Die Untersuchung der 14 Gewebeproben ergab
eine sehr heterogene Expression (Abb. 3.21). Die Expressionslevel schwankten von
einer 0,5fachen (P656, Stadium III) bis zu einer 21,6fachen Expressionsstärke
(P428, Stadium III) gegenüber Plazenta-Gewebe. Auffällige Expressionsmuster
n eine als signifikant anzusehende Expressionssteigerung gegenüber der
lazentakontrolle (>4fach höhere Expressionsstärke). Bezogen auf gesunden
adulten Knorpel sind die Expressionsunterschiede um ein vielfaches höher, da für die
beiden gesunden Kontrollen nach 45 PCR-Zyklen kein Reaktionsprodukt
nachweisbar war und daher von einer sehr schwachen ECM3-Transkription im
gesunden Knorpel ausgegangen werden muss. Die Daten deuten auf eine potentielle
Assoziation von ECM3 mit osteoarthrotischen degenerativen Prozessen im Knorpel
hin.
zwischen den verschiedenen Erkrankungsstadien oder dem Verlauf der Krankheit
konnten nicht festgestellt werden. Auch die Patienten P656 und P428, denen
Knorpelbiopsien aus zwei Regionen unterschiedlichen Schweregrads der Erkrankung
entnommen wurden, lassen keine Tendenz zur Expressionsveränderung in
Abhängigkeit vom Stadium der Erkrankung erkennen. Patient P656 zeigt jedoch
allgemein eine sehr niedrige Expression in beiden Biopsien, wohingegen Patient 428
in beiden Biopsien eine sehr starke Expression aufweist.
Hervorzuheben ist allerdings die insgesamt deutlich stärkere Expression von ECM3
in Gewebeproben einzelner Osteoarthrose-Patienten. 11 von insgesamt 14 Patienten
zeige
P
- 71 -
Ergebnisse
- 72 -
3.4.4.3 Expressionsanalyse von ECM3 an Knorpelbiopsaten von Patienten mit rheumatoider Arthritis
Die Expression von ECM3 in Knorpelgewebe von Patienten mit rheumatoider
Arthritis wurde aus o.g. Gründen ebenfalls auf Pla
Abb. 3.21: Relative ECM3-Expression in Knorpelgewebe von Patienten mit Osteoarthrose im Vergleich zu Plazenta-Gewebe. Die Patientennummern und das Erkrankungsstadium sind unter der Abszisse angegeben. Die Erkrankungsstadien sind zusätzlich durch verschiedene Farben gekennzeichnet: Stadium 0-I in hellgrün, Stadium I in dunkelgrün, Stadium II-III in hellblau, Stadium III in dunkelblau und Plazenta (Pl.) als Kalibrator in violett. Für die beiden gesunden Kontrollen (Jg. 1973, Jg.1967) und für Patient 619 III war nach 45 PCR-Zyklen kein Fluoreszenzanstieg messbar. Für jeden Patienten und für Plazenta ist die Standardabweichung dargestellt.
zenta-RNA bezogen. Es ließ sich
auch hier eine auffallende Variabilität der Expression erkennen (Abb. 3.22): die
Expressionslevel von ECM3 bei Patienten mit rheumatoider Arthritis schwankten von
ur 0,26facher Expressionsstärke (Patient 493 II) bis hin zur über 17fachen
xpressionsstärke (Patient 411 I-II). Es zeigt sich auch hier kein eindeutiger
Zusammenhang der ECM3-Expression mit dem Schweregrad oder dem Verlauf der
rkrankung. Ähnlich zu Osteoarthrose-Patienten ergibt sich für Patienten mit
rheumatoider Arthritis eine insgesamt deutlich erhöhte Expression von ECM3 in
nstiege uf die gesunden Kontrollen kann auch hier von noch höheren
n
E
E
Knorpelresektaten gegenüber Plazenta: 7 von 9 Patientenproben zeigten signifikante
. Bezogen aA
Expressionsunterschieden ausgegangen werden.
Ergebnisse
- 73 -
3.4.5 ECM3 als positionelles Kandidatengen für die Frontometaphysäre Dysplasie
Ausgangspunkt der Untersuchung war
Abb. 3.22: Relative ECM3-Expression in Knorpelgewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis bezogen auf Plazenta-Gewebe. Die Patientennummern und das Erkrankungsstadium sind unter der Abszisse angegeben. Die Erkrankungsstadien sind zusätzlich durch verschiedene Farben gekennzeichnet: Stadium 0-I in hellgrün, Stadium I-II in dunkelgrün, Stadium II in hellblau, Stadium III in dunkelblau und Plazenta als Kalibrator in violett. Für die beiden gesunden Kontrollen (Jg. 1973, Jg.1967) war nach 45 PCR-Zyklen kein Amplifikationsprodukt für ECM3 detektierbar. Für jeden Patienten und für die Plazenta ist die Standardabweichung dargestellt.
eine Patientin mit einer vorzeitig
enen anterioren Fontanelle, kraniofzialen Anomalien und X-Beinen, die
Die motorische und mentale Entwicklung
rnspintomographie, die zu einem früheren
aufgenommen wurde, wurde bei der Patientin eine bilaterale
uläre Noduläre Heterotopie (PVNH, siehe Kapitel 4.1.2.4) diagnostiziert.
leichzeitig wies sie jedoch die typischen Merkmale einer Frontometaphysären
ysplasie (FMD, siehe Kapitel 1.2.1) auf. Radiologische Anomalien konnten die
iagnose der FMD unterlegen. Während für die PVHN Mutationen im Protein Filamin
(FLNA), die zu einem Funktionsverlust führen, verantwortlich gemacht werden
Krankheitsursache für
MD unbekannt. Nachdem bei der Patientin durch ein externes Labor
issensmutationen und schmale Deletionen/Insertionen in der codierenden Region
on FLNA zunächst ausgeschlossen wurden (Zenker, Institut für Humangenetik,
ers. Mitteilung), lag die Vermutung nahe, dass bei der Patientin ein so genanntes
ontiguous gene syndrom“ vorliegen könnte. Es handelt sich hierbei um einen durch
eine Deletion verursachten Verlust mehrerer benachbarter Gene, von denen eines
verschloss
schon mehrmals operativ korrigiert wurden.
war normal. Aufgrund einer kranialen Ke
Zeitpunkt
Periventrik
G
D
D
A
konnten (Fox et al., 1998), war beim Beginn der Arbeit die
F
M
v
p
„c
Ergebnisse
der betroffenen Gene FLNA sein müsste. FLNA liegt in der Chromosomenregion
q28 und damit in direkter Nachbarschaft zu ECM3 (siehe Abb. 3.23). Damit
rschien ECM3 als nahe liegendes positionelles Kandidatengen für den Phänotyp bei
er Patientin. Um größere Veränderungen innerhalb der betroffenen chromosomalen
egion wie Deletionen oder Inversionen nachzuweisen, wurden im Rahmen dieser
rbeit BAC-Klone (bacterial artificial chromosomes) eingesetzt und FISH-Analysen
urchgeführt. Als BAC-Sonde dienten RP11-846A22, RP11-177H12 und CTD-
565C16, die den Bereich zwischen FLNA und ECM3 umspannen. Die FISH-
Abb. 3.23: FISH-Analysen mit den BAC-Klonen RP11-846A22 + RP11-177H12 (linke Seite) und RP11-846A22 + CTD-2565C16 (rechte Seite) an Metaphasen von Fibroblasten der Patientin. Unten dargestellt ist der chromosomale Bereich um ECM3 und FLNA und die
osomale Bereich umfasst 1 mb.
X
e
d
R
A
d
2
Analysen an Metaphasechromosomen der Patientin zeigten jedoch keine
Auffälligkeiten (Abb. 3.23).
Auch SNP-Analysen (SNP= singel nucleotide Polymorphism)
FLNA ECM3
eingesetzten Sonden. Der dargestellte chrom
Parallel hierzu wurden SNP (single nucleotide polymorphism)-Analysen an der DNA
der Patientin und deren Eltern durchgeführt, um heterozygote Deletionen
nachzuweisen. Diese ergaben keinen Hinweis auf deletierte Bereiche um ECM3 und
- 74 -
Ergebnisse
FLNA (Daten nicht gezeigt). Zeitgleich konnte eine englische Arbeitsgruppe
(Robertson et al., 2003) zeigen, dass „gain of function“ Mutationen im FLNA-Gen zu
FMD führen. Aufgrund dieses Befundes wurde die Mutationssuche durch Dr. Zenker
bei der Patientin wiederholt. Es zeigte sich dann, dass eine heterozygote
de novo-Mutation c.7315C>A (NM_001456) in Exon 45 des FLNA für den komplexen
Phänotyp der Patientin verantwortlich gemacht werden konnte (siehe Kapitel 4.1.2.4,
enker et al., 2004).
.5 Suche nach Kandidatengenen für Kraniosynostosen
ei der Krankheitsgruppe der kraniofazialen Dysostosen handelt es sich um seltene
rkrankungen, die vor allem Knochenentwicklungsstörung der Schädelplatten
ufweisen. Ein wesentliches Kennzeichen dieser Krankheitsbilder ist die
raniosynostose: es handelt sich hierbei um eine frühzeitige Verknöcherung
ssifikation) der Schädelnähte, sowie daraus resultierende Schädeldeformitäten.
isher sind nur wenige Gene beschrieben worden, deren Veränderung zu
yndromalen Kraniosynostosen führen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine rein
atienten-basierte Strategie gewählt, um mögliche neue Kandidatengene der
chädelnahtentwicklung zu identifizieren.
.5.1 Patientenbeschreibung
nd gesunder, nicht verwandter, deutscher
r Familienanamnese (Mutter: 31 Jahre; Vater: 38 Jahre). Der
ser Schwangerschaft in der 39.
schaftswoche mit einer Länge von 51 cm (50. Perzentile), einem Gewicht
Z
3 B
E
a
K
(O
B
s
P
S
3 Der männliche Indexpatient ist das Ki
Eltern mit unauffällige
Junge wurde nach komplikationslo
Schwanger
von 2670 Gramm (3.-10. Perzentile) und einem Kopfumfang von 33 cm (3.-10.
Perzentile) geboren. Das Neugeborene präsentierte sich mit einem flachen
Mittelgesicht, abgeflachter Supraorbitalpartie, einer hohen Stirn, tief sitzenden,
posterior rotierten Ohren, einer weiten vorderen Fontanelle und einer muskulären
Hypotonie (Abb. 3.24). Es fanden sich keine Anomalien der Hände und Füße.
- 75 -
Ergebnisse
n Sagittalnaht konnte mittels Schädelröntgenaufnahmen
Ebenso ergaben Ultraschallaufnahmen des Gehirns, des Herzens und der Nieren,
Routine-Laborwerte, die Bestimmung der Schilddrüsenhormone, sowie
ophthalmologische und audiologische Untersuchungen unauffällige Befunde. Der
Verdacht auf einen bilateralen, vorzeitigen Verschluss der Lambdanaht und einen
Verschluss der posteriore
bestätigt werden (Abb. 3.25). Aufgrund der kraniofazialen Morphologie in Verbindung
mit der radiologisch nachgewiesenen Kraniosynostose wurde die klinische Diagnose
eines Crouzon-Syndroms gestellt.
Abb. 3.24: Kopfaufnahme des an Kraniosynostose erkrankten Patienten.
Abb. 3.25: Schädel-Röntgenaufnahmen des untersuchten Kraniosynostose-Patienten. Dargestellt ist die fusionierte Lambda- und die zum Teil betroffene Sagittalnaht.
- 76 -
Ergebnisse
Bei dem Patienten wurde in einem Alter von 5,5 Monaten die Lambdanaht und der
osteriore Teil der Sagittalnaht operativ geöffnet. Mit einem Alter von 5 ½ Jahren
eigte das Kind keine körperlichen Auffälligkeiten mehr. Die Körpermaße
inschließlich Kopfwachstum lagen im Normbereich (um 25. Perzentile). Aufgrund
iner milden Sprachentwicklungsverzögerung erhielt der Junge eine logopädische
ehandlung. Ansonsten war sein Entwicklungsstand altersgerecht, und er besuchte
inen Regelkindergarten.
den Kandidatengenen FGFR2 und FGFR3, die häufig (ca. 50%; Passos-Bueno et
l., 1999) in Crouzon-Patienten eine Mutationen aufweisen, konnte keine Mutation
efunden werden (Greven, 2002).
.5.2 Zytogenetische Untersuchung
ei der routinemäßig durchgeführten zytogenetischen Untersuchung wurde bei dem
ntersuchten Patienten eine reziproke Translokation 46,X,t(9;11) (q33;p15)
entifiziert (Abb. 3.26). Die Eltern wiesen die Translokation nicht auf, so dass hier
on einer de novo-Mutation ausgegangen werden kann (Daten nicht gezeigt).
p
z
e
e
B
e
In
a
g
3 B
u
id
v
Abb. 3.26: Karyogramm des am Crouzon-Syndrom erkrankten Patienten. Die Graphik zeigt eine reziproke Translokation 46,X,t(9;11) (q33;p15).
- 77 -
Ergebnisse
3.5.3 Bruchpunktbestimmung Um die Bruchpunkte auf den Chromosomen 9 und 11 genauer bestimmen zu
können, wurden BAC-Klone (bacterial artificial chromosomes) eingesetzt und FISH-
Analysen durchgeführt. Die Bruchpunktbestimmung wurde vollständig am Max-
Planck-Institut für Molekulare Genetik, Berlin, von Frau PD Dr. Vera Kalscheuer
durchgeführt. Der Arbeitsgruppe war es möglich, bruchpunktüberspannende
BAC-Klone zu identifizieren. Es handelt sich hierbei um die Klone RP11-417O17 für
den Bruchpunkt auf Chromosom 11 und den Klon RP11-451E16 für den Bruchpunkt
.5.4 Eingrenzung des Bruchpunktes
Rahmen dieser Arbeit sollten die Bruchpunkte kloniert und die betroffenen Gene
entifiziert werden. Zur weiteren Eingrenzung des Bruchpunktes wurden Southern-
lot-Analysen durchgeführt. Dazu wurden sowohl die Patienten-DNA als auch
ontroll-DNAs mittels verschiedener Restriktionsenzyme verdaut, elektrophoretisch
ufgetrennt und auf Nylonmembranen geblottet. Die zur Hybridisierung verwendeten
dioaktiv markierten DNA-Sonden wurden mittels PCRs generiert und deckten weite
ereiche des Klons RP11-417O17 auf Chromosom 11 ab (Abb. 3.27). Beim
estriktionsverdau mit dem Restriktionsenzym MspI und unter Verwendung der
onde 2“ (Abb. 3.27), konnte bei dem Patienten neben der zu erwartenden Bande
on 13,3 kb noch ein weiteres Fragment von ca. 4 kb nachgewiesen werden. Durch
ie reziproke Translokation zwischen Chromosom 11 und 9 musste folglich eine
eue MspI-Schnittstelle eingeführt worden sein und zwar 4 kb von der MspI-
chnittstelle 1 nkt musste also
kb um ingesetzte Sonde liegen.
auf Chromosom 9.
3 Im
id
B
K
a
ra
B
R
„S
v
d
n
S auf Chromosom 1 entfernt (Abb. 3.27). Der Bruchpu
4 die e
- 78 -
Ergebnisse
BSonde 2 (24360 - 24762)Sonde 1 (7175 - 7592) Sonde 3 (38551 - 38973)
(5825) M(23713) M
(37050) M M (46636)M (53205)
13337 bp
} Kpn
I
} Msp
I
} Sfu
I
} Sac
I
C C C CP P P P
4,3 -6,6 -
9,4 -
23,3 -kb
9q32 (RP11- 451E16)194680 bp
M 1M 2
M 3 M 4M 5
M 6M 7
M 8M 9
M 10M 11
M 12M 13
M 14M 15
M 16M 17
11p15 (RP11-417O17)58573 bp
Sonde 2 (24360 - 24762)Sonde 1 (7175 - 7592)(5825) M (23713) M
4000 bpder(11)
56
56 M 14M 15
M 16M 17
cen tel
cen tel
telcen
A
ment (blau n 4 kb (rot
eingekreist), nachgewiesen werden. B) Graphische Übersicht der Strategie zur Eingrenzung des Bruchpunktes. Oben sind die ersten 58 kb des Klons RP11-417O17 graphisch dargestellt. Die Sonden für die einzelnen radioaktiven Hybridisierungen sind rot markiert, die Schnittstellen für das Restriktionsenzym MspI (M) grün. In der Mitte ist der Klon RP11-451E16 mit seinen MspI-Schnittstellen zu sehen. Das hypothetisch abberante Fragment (4000 bp) ist unten dargestellt. Die
nen Pfeile stellen Primer dar, über die versucht wurde, eine bruchpunktüberspannende PCR eren.
Abb. 3.27: Southern-Blot zur Eingrenzung des Bruchpunktes. A zeigt ein Autoradiogramm eines Southern mit Patienten (P)- und Kontroll (C)-DNA, die mit KpnI, MspI, SfuI und SacI verdaut wurde. Als Hybridisierungssonde wurde „Sonde2“ verwendet. Neben den erwarteten Fragmenten konnte beim Verdau der Patienten-DNA mit MspI zusätzlich zum normalen Frageingekreist, 13 kb) ein neues abberantes Restriktionsfragment, mit einer Größe vo
brauzu etabli
- 79 -
Ergebnisse
Zur weiteren Eingrenzung des Bruchpunktes wurde nun eine
ruchpunktüberlappende PCR etabliert. Dabei wurde der „Forward-Primer“ auf
Chromosom 11 (Chr11_Fw2, 5´vor der MspI-Schnittstelle bei 23713 bp, Abb. 3.27)
spI-Schnittstelle des Klons
b. Über eine anschließende Sequenzierung
es PCR-Produktes konnte der Bruchpunkt auf die Base genau bestimmt werden.
Die bruchpunktumspannende Sequenz ist im Anhang dargestellt. Zur Bestätigung
des Bruchpunktes wurde das bruchpunktüberspannende Fragment auf dem
derivativen Chromosom 9 kloniert und sequenziert (Daten nicht gezeigt).
b
und die „Reward-Primer“ 3` hinter jede vorhandene M
RP11-451E16 (Chr9_MSP 1-17) auf Chromosom 9 gelegt. Die daraus resultierenden
PCR-Produkte wurden elektrophoretisch aufgetrennt und sind in Abb. 3.28 zu sehen.
Bei der Patienten-DNA ergab sich bei der Primerkombination Chr11_Fw2 und
Chr9_MspI-14 eine Bande von ca. 4 k
d
Abb. 3.28: BruchpunktüberspanVon links nach rechts sind jeweils die
3 SOX6 als für Kra n D uchpunkt in d mosomenreg liegt zwischen nd Exon
7 (Abb. 3.29) des
das für einen Transkriptionsfaktor kodiert, der eine Rolle bei der enchondralen
et al., 2004).
nende PCR an Patienten- (unten) und Kontroll-DNA (oben). PCR-Ansätze mit den Primer-Kombinationen Chr11_Fw2
und Chr9_MspI-1-17 aufgetragen. Bei der Patienten-DNA konnte ein Produkt bei der Kombination Chr11_Fw2 und Chr9-MspI_14 von ca. 4 kb und bei der Kombination Chr11_Fw2 und Chr9_MspI-15 von ca. 12 kb nachgewiesen werden. Zur Größenabschätzung sind jeweils links und
.rechts Längenstandards aufgetragen
.5.5 Kandidat niosynostose
er Br er Chro ion 11p15.2 Exon 6 u
SOX6-Gens (SRY (sex determining region Y)-box 6) einem Gen,
Ossifikation spielt (Smits
- 80 -
Ergebnisse
- 81 -
Da SOX6 einen Einfluss auf die Schädelnahtentwicklung haben könnte wurden die
DNAs von weiteren 104 Patienten syndromalen und nicht syndromalen
Kraniosynostosen, die von Dr. Wolfram Kress (Molekulare Humangenetik, Würzburg)
zur Verfügung gestellt wurden, auf mögliche genetische Veränderungen in SOX6
untersucht. Bei allen Patienten waren Mutationen in den Genen FGFR2 und FGFR3
ausgeschlossen. Dazu wurden die Exons 2-16 (diese entsprechen dem offenen
Leserahmen von SOX6) über PCR amplifiziert und sequenziert. Die Ergebnisse sind
in Tab. 3.6 zusammengefasst.
Patienten-DNA Exon/In
Abb. 3.29: Bruchpunktregion im Chromosomenbereich 11p15.2 (Darstellung aus USCS-Datenbank). Der Bruchpunkt ist markiert mit „Your Sequence from Blat Search“. Insgesamt sind 500 kb dargestellt.
tron Nukleotidaustausch Aminosäureaustausch
F08 Intron 15 IVF15+6 A>G -
G09 Intron 15 IVF15+6 A>G -
P15 Exon 2 c.263G>A p.D68N
Bei einer Allelhäufigkeit von 50% konnte der Austausch 894C>T detektiert werden.
sgesamt konnten drei unterschiedliche Nukleotidaustausche detektiert werden. Der
ustausch von c.263G>A (NM_033326) stellt eine Missensmutation dar, die in einem
Jahre alten Patienten (P15) mit einer komplexen Koronar- und
Sagitalnahtsynostose gefunden wurde (heterozygot) und zu einer Substitution von
Aspartat zu Asparagin an der Position 68 (p.D68N) führte. Bei 103 Patienten mit
Kraniosynostose und 100 Kontrollpersonen konnte die Mutation kein zweites Mal
detektiert werden. Jedoch wurde der Austausch auch in der nicht betroffenen Mutter
Tab 3.6: Zusammenfassung der Egebnisse der Mutationsanalyse. Alle Ergebnisse beziehen sich auf die Acessio Nr.: NM_033326.
In
A
7
Ergebnisse
des Patienten gefunden. Der Austausch von 894C>T (NM_033326) in Exon 7 konnte
it einer Häufigkeit von 50 % detektiert werden, wobei es sich hier um einen
olymorphismus handelt, da die Häufigkeit auch in den 96 „Normalkontrollen“ bei
0% lag und damit nicht weiter verfolgt wurde. Die Veränderung von IVF15+6 A>G
M_033326) konnte in zwei Patienten nachgewiesen werden (heterozygot). Der
ustausch befindet sich jedoch im Intronbereich von SOX6 (Zhang, 1998) und wurde
udem in nicht betroffenen Kontrollen mit einer Häufigkeit von 1:50 gefunden. Daher
urde auch dieser Austausch nicht weiter verfolgt. Bei den 104 untersuchten
atienten konnte demnach keine genetische Veränderung detektiert werden, die
ffensichtlich auf eine Beteiligung von SOX6 an der frühzeitigen Verknöcherung des
chädels schließen lässt.
m eine mögliche Beteiligung von Sox6 an der Schädelnahtentwicklung zu
berprüfen, wurden Expressionsstudien mittels RNA-in situ-Hybridisierung am
eugeborenen Mäuseschädel (P0) durchgeführt. Als Sonde wurde ein PCR-Produkt
us dem 3`-UTR von Sox6 verwendet (Fw-Primer:Sox6-ISH_Fw; Rev-Primer: Sox6-
H_RevL). Die RNA-in situ-Hybridisierung ergab jedoch keinen Hinweis auf eine
xpression in der Stirnnaht oder der Koronarnaht (Abb. 3.30).
m
P
5
(N
A
z
w
P
o
S
U
ü
n
a
IS
E
- 82 -
Ergebnisse
A C E
B D F Pe
Pe
Dm K K K Dm K K Pe K
Dm G I K H J L
Dm Pe
K
K
K
nsversalen Schnitten durch den Schädel einer neugeborenen Maus. RNA-in situ-Hybridisierung mit einer Sox6 Antisense-Sonde (A, B, G und H), HE Färbungen (C,D, I und J) und RNA-in situ-Hybridisierung mit der Sense-Sonde (E, F, K und L). Die umrahmten Regionen bei A, C, E, G, I und K sind jeweils in den darunterliegenden Bildern vergrößert dargestellt. B, D und F zeigen die Stirnnaht und H, J und L die Koronarnaht. K, Knochen; Pe, Periost; Dm, Dura mater.
K
Pe Dm Pe
K
K
Abb. 3.30: RNA-in situ-Hybridisierung an tra
Dm
- 83 -
Ergebnisse
3.5.6 ARM1 als Kandidat für Kraniosynostosen Bei der Analyse der Region um den Bruchpunkt auf Chromosom 11p15.2 konnte
über Interspeziesvergleiche ein neues Gen identifiziert werden, welches bis zum
Kugelfisch hochkonserviert ist (Abb. 3.31). 1 75 Mensch (1) MMALPGGRHLDSVTLPGQRLHLMQVDSVQRWMEDLKLMTECECMCVLQAKPISLEEDAQ-GDLILAGGPGPG--- Hund (1) MMALPGGRHLDSIPLPGQRLHLMQVDSVQRWMEDLKLMTECECMCVLQAKPISLEEDAQ-SDLILAGGPGPG--- Maus (1) MMALPGGRHLDSVPLQEQRLHFMQVDSVQRWMEDLKLMTECECMCVLQAKPISLEEDTQ-GDLILAGGPGPG--- Huhn (1) -------------------MHLIQVDSVQRWMEDLKLMTDCECMCILQSKPISAEKDEQ-NELILSSQYSTS--- Zebrafisch (1) --------------------------------------------------------------------------- Kugelfisch (1) MMALPGGRHLDSIPLPGQRMLSLQVDSVQRWMEDLRHMTEVECMCVLQAKPIGGDEDGQQGELIVASGVGAGEHV 76 150 Mensch (72) --DPLQLLLKRGWVISTELRRIGQKLAQDRWARVHSMSVRLTCHARSMVSEYSAVSRNSLKEMGEIEKLLMEKCS Hund (72) --DPLQLLLKRGWVISTELRRIGQKLAQDRWARVHSMSVRLTCHARSMVSEYSAVSRSSSQEMGQLEKLLMEKCS Maus (72) --DPLQLLLKRGWVISTELRRIGQKLAQDRWARVHSMSVRLTCHARSMVSEYSTISRTASQEMGQAEKLLMEKCS Huhn (53) --DNLQLLLKRAWIISTELTRIAQKLEKNRWQRVHSMTVRVNCHVRSMINEYNAFTRSSSEEMNQLEKLLIDKCS Zebrafisch (1) --------------------------------------------------------------------------- Kugelfisch (76) ARNNLQTLLRRALVVSTELGKMFQRLEKGRWQRVHSTAVRANCHVRSLVHEYSAA-RSTPPEMQKYEKSLLEKCT 151 225 Mensch (145) ELSAVTERCLQVENEHVLKSMKACVSETLSMLGQHFGQLLELALTREVQALVRKIDASDNIYTTESTTGNLFSLT Hund (145) ELSAITERCLQVENEHVLKSMKACVSETLSTLGQHFGQLLELALTREVQALVRKINASDNIYTTESTTGNLFSLT Maus (145) ELSAVTERCLQVENEHVLKSMKACVSETLSLLGEHFGQLLELALTREVQALVRKIDTSDNIYITESTTGNLFGLT Huhn (126) EFTAFTERCIQIEDEQMLRSMKSCINETLTTVAQYFGQLIELVLTHEAQNLLRQIESSDSVYITESAINSLFSLT Zebrafisch (1) -----------------------------------------------------QIQQHKHDRVKHNSINMTVNNS Kugelfisch (150) ELTSISERCLHTQDKVFLTSMREAIHEILTDVSDSFSTMIDMALANEIRILIKQIESSDNVHAISSAISNLLSLT
226 300
Mensch (220) QEGAPLCRIIAKEGGVVALFKVCRQDSFRCLYPQALRTLASICCVEEGVHQLEKVDGVLCLADILTDNSHSEATR Hund (220) QEGAPLCRIIAKEGGVVALFKVCRQDSFRCLYPQALRTLASICCVEEGVHQLEKVDGVLCLADILTDDSHPEATR Maus (220) QEGAPLCRIIAKEGGVVALFKVCRQDSFRCLYPQALRTLASICCVEEGVHQLEKVDGILCLADILTDESHSEATR Huhn (201) QEGTHLCRIIAKEGGVVALFKICRQDYFRCLYPQTLRTLASICCVEEGMHQLEKVDGILCLADILTDNTHSEATH Zebrafisch (23) IYSSERCCVCVQEGAVVALLKICRQDCFSSLYAPALRTVASICCVEEGISQLEKVDGLLCLADILTDGACAEATR Kugelfisch (225) QDGPQLCSIIAKEGAVVALFKICRQDRFRELYAHALRTVASICCVEEGIDQLDKVDGILCLADILTDDSSVEAAR
301 375
Mensch (295) AEAAAVVAQVTSPHLPVTQHLSSFLESMEEIVTALVKLCQEASSGEVFLLASAALANITFFDTMACEMLLQLNAI Hund (295) AEAAAVVAQVTSPHLPFTQHLGSFLESMEEIVTALIKLCQEASSGEVFLLASAALANITFFDTMACEMLLQLNAI Maus (295) AEAAAVVAQVTSPHLSFTQHLTSFLENMEEIVTALIKLCQEASSGEVFLLASAALANITFFDKMACEMLLQLNAI Huhn (276) AEAAAVIAQITSPHLTFTQHLSSFLENMEEIVTALVKLCQEASSGEVFLLASAALANITFFDTMACEMLLQLNAM Zebrafisch (98) AEAAAVMAQITSPHHSSTQHLSSFLESMQDIVTALIHLCESASCGEVFLLASAALANITFFDSMACEILLQLNAV Ku
gelfisch (300) AEAAAVVAQITSPHHTSTQHLASFLESMHDIVTALIKLCESASCGEVFLLASAALANITFFDSMACEILLQLSAV 376 450
Mensch (370) RVLLEACSDKQRVDTPYTRDQIVTILANMSVLEQCASDIIQENGVQLIMGMLSEKPRSGTPAEVAACERVQQKAA Hund (370) RVLLEACSDKQRVDTPYTRDQIVTILANMSVLEQCASDIIQENGVQLIMGMLSEKPRSGTPAEVAACERVQQKAA Maus (370) RVLLEACGDKQRVDTPYTRDQIVTILANMSVLEQCGSDIIQENGVQLIMGMLSEKPRSGTPAEVAACERVQQKAA Huhn (351) KILLAACSDKHIVDTPYSRDQIVTILANMSVLEQCASDIIQENGVQLLMEMLFERSSSGNSAEVAACERVQQKSA Zebrafisch (173) HILLQACRDRQRVDTPYSKDQVVTILANLSVLEQCTADVLEEKGIEQLLVLLNEKPSSSSPSESAACERVQQKAA Ku
gelfisch (375) PILLQACRDRQRVDTPYSKDQVVTILANLSVLEQSAAEVLQERGIERLLLLLGEKPSSSSPSEGAACERVQQKAA 451 525
Mensch (445) VTLARLSRDPDVAREAVRLSCMSRLIELCRSPSERNSSDAVLVACLAALRRLAGVCPEGLQDSDFQQLVQPRLVD Hund (445) VTLARLSRDPEVAREAVRLSCMSRLIELCRSPSERNSSDAVLVACLAALRRLAGVCPEGLQDSDFQQLVQPRLVD Maus (445) VTLARLCRDPDVAQEAVRLSCMSRLIELCRSPSERNSSDAVLVACLAALRRLAGVCPEGLQDSDFQQLVQPRLVD Huhn (426) VTLARLSRDPEVADAAVKLSCIPRLIKLCRSPTERNNSDSVLVACLAALRRLAVMSPEGLEDSDFQQLVKPRLVD Zebrafisch (248) VTLARLSRDPLLAQTAIQCKAVPRLIELCRSPAERNNSDSVLVACLAALRRLAAECPDSIGPSDHQQLIKPRLVD Kugelfisch (450) VTLARLSRDNEVAQTAIQLKAVPRLIELCRSPTERNNSDSVLVACLAALRRLAAGCPDSIAAADQQQLIKPRLVD
526 538 Mensch (520) SFLLCSNMEESFV Hund (520) SFLLCSNMEESFV Maus (520) SFLLCSNMEESFV Huhn (501) SFLLCTNMEESFV Zebrafisch (323) SFLLCSNMEESFV Ku
gelfisch (525) SFLLCSNMEESFV
Abb. 3.31: Mutiples Alignment der putativen Proteinsequenz von ARM1 und den homologen Proteinen der verschiedenen Spezies. Die putativen Armadillo/beta-catenin-like repeats sind rot
dargestellt.
- 84 -
Ergebnisse
Dieses Gen liegt 700 kb distal benachbart zu SOX6 und könnte über einen
Positionseffekt durch die Translokation in seiner Aktivität beeinflusst sein. Beim
Menschen und der Maus konnten jeweils eine cDNA mit 13 Exons mit insgesamt
1853 bp nachgewiesen werden. Die 12 Exons, die den offenen Leserahmen
umfassen (532 Aminosäuren), konnten über RT-PCR verifiziert werden.
Datenbankanalysen führten zum UniGene-Cluster Hs.374080, in dem 39 ESTs
repräsentiert sind.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens mit der
Proteindatenbank „Pfam“ zeigte fünf mögliche Armadillo/beta-catenin-like Repeats.
Die Armadillo/beta-catenin-like Repeats dienen der Protein-Protein-Interaktion (Peifer
et al. 1994).
Zur Überprüfung der Expressionsstärke und des Expressionsmusters von Arm1
urde ein Northern-Blot mit verschiedenen murinen Geweben mittels einer w
Abb. 3.32: Das Autoradiogramm einer Northern-Analyse mit verschiedenen murinen Geweben zur Expressionskontrolle von Arm1. Von links nach rechts sind die folgenden RNAs aufgetragen: Hoden (1), Herz (2), Milz (3), Lunge (4), Niere (5), Leber (6), Neugeborenenschädel (7), Neugeborenenextremitäten (8), adulter Schädel (9), Neugeborenenkopf (10), Mausembryo 14.5 dpc (11), Mausembryo 15.5 dpc (12). Für eine relative Abschätzung der Hybridisierungssignale wurden die Northern-Blots anschließend mit einer Gapdh-Sonde hybridisiert.
Gapdh -
- 85 -
Ergebnisse
radioaktiven Arm1-Sonde hybridisiert. Die Sonde wurde über RT-PCR aus muriner
chädel-cDNA erzeugt. Zur Generierung des PCR-Produktes wurden die Primer
rm_Fw1 und Arm_RevA verwendet. Über die Northern-Blot-Analysen konnten die in
ilico-Daten und die RT-PCR Experimente bestätigt werden. Es konnte ein
aupttranskript mit einer Größe von ca. 1,8 kb in der RNA aus
eugeborenenschädel (Abb. , Spur 7) nachgewiesen werden. Aufgrund der in
ilico-Daten und der experimentellen Ergebnisse kann eine Beteiligung von ARM1 an
er Schädeldachentwicklung vermutet werden. Um die Expressionsdaten zu
erifizieren u en Expressionsstudien mittels RNA-in situ-Hybridisierung an
eugeborenen Mäuseschädeln (P0) durchgeführt. Als PCR-Primer wurden Arm_Fw1
nd Arm_RevA verwendet. Durch RNA-in situ-Hybridisierung konnte jedoch keine
xpression in der Stirnnaht und der Koronarnaht nachgewiesen werden (Abb. 3.33).
ls Negativkontrolle wurde eine Arm1-Sense-Probe verwendet, die mit den Primern
er Antisense-Prob generiert wurde. Als Positivkontrollen wurden Antisense-
onden von Msx2 Kollagen Typ I verwendet, zwei Gene, von denen eine
xpression in Schädelnähte ekannt ist. RNA-in-situ-Hybridisierungen mit einer
RM1-Sonde an Paraffinschnitten von humanem arthrotischen Gelenkknorpel zeigen
owohl eine schwache Färbung in den Osteoblasten des angrenzenden
nochengewebes auch in den Chondrozyten des Gelenkknorpels
bb. 3.34, C). In bb. 3.34 F-G ist ein arthrotischer Gelenkknorpel zu sehen, bei
em der Urspru knorpel durch Faserknorpel, w er h aus Knochengewebe
ebildet hat, ersetzt wurde. Auch hier zeigt die RNA-in situ-Hybridisierung mit ARM1
ine positive Färbung der Chondrozyten. Obwohl RNA-in-situ-Hybridisierungen mit
rm1 an den Nähten der neugeborenen Mäuse kein Signal ergaben, sprechen
owohl der Northern-Blot als auch der Nachweis von ARM1 in Osteoblasten von
rthrotischem me chlichen Knorpel für eine mögliche Beteiligung von ARM1 an der
esmalen Ossifikation und damit potentiell auch an der Schädelnahtentwicklung.
S
A
s
H
3.32
, w rd
e
und
n b
(Abb. 3.34, B), als
A
ngs elch sic
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A
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- 86 -
Ergebnisse
A B
C D
E
Dm
Pe K
K
Dm
Pe K
K
Dm
Pe
K
K
Dm
Pe K
K
K
K Abb. 3.33: RNA-in situ-Hybridisierung an transversalen Kopfschnitten einer neuge-borenen Maus. Zu sehen ist jeweils die Koronalnaht. In A wurde mittels der Arm1-Anitsense-Sonde, in B mittels der Arm1-Sense-
nde und in D iert. E zeigt eine
HE Färbung der Koronalnaht. K, Knochen; Pe,
Dm Sonde, in C mittels einer Msx2-Somittels der Cola1-Sonde hybridis
Pe Periost; Dm, Dura mater.
- 87 -
Ergebnisse
- 88 -
risierung auf Chromosom 9q33.1 Datenbanksuchen ergaben keinerlei Hinweise auf die direkte Beteiligung eines Gens
in der Region um den Bruchpunkt auf Chr. 9q33.1. Mehr als 1 mb um den
Bruchpunkt liegen keine bekannten Gene, ESTs oder hypothetische Gene (Abb.
3.35).
3.5.7 Bruchpunktcharakte
Abb. 3.34: RNA-in situ-Hybridisierung an Paraffinschnitten von arthrotischem Gelenkknorpel beim Menschen. Die erste und dritte Zeile wurde jeweils mit einer ARM1-Antisense-Sonde, die zweite Zeile mit einer 28S-RNA-Sonde hybridisiert. A-E zeigt den arthrotischen Gelenkknorpel eines Patienten, bei dem der Ursprungsknorpel noch vorhanden ist. In den Bildern F und G ist der Gelenkknorpel eines Patienten gezeigt bei dem der Ursprungsknorpel zerstört ist und durch Faserknorpel ersetzt wurde. Die umrahmten Regionen bei A, D und F sind jeweils in den folgenden Bildern vergrößert dargestellt. Die roten Pfeile zeigen positiv angefärbte Osteoblasten.
Ergebnisse
- 89 -
Zur Überprüfung von konservierten Bereichen zwischen einzelnen Spezies, die einen
Hinweis darauf geben könnten, ob sich in der „Bruchpunktregion“ noch weitere, in
den Datenbanken nicht repräsentierte Gene oder regulatorische Elemente befinden,
wurde der Syntenie-Bereich der Region zwischen Mensch, Maus und Huhn auf
Sequenzidentität mittels einem „Percent identity plot“ (PIP) überprüft. Ein Ausschnitt
des Ergebnisses ist in Abb. 3.36 dargestellt und zeigt, dass es um den Bruchpunkt
immer wieder Bereiche zwischen 350 und 600 bp gibt, die zwischen den Spezies
hochkonserviert sind. Der Konservierungsgrad übersteigt teilweise sogar 90%. Um
zu untersuchen, ob diese hochkonservierten Bereiche den Exons einer der
transkribierten Sequenzen entsprechen, wurden für die einzelnen Sequenzen Primer
generiert und über RT-PCR versucht, potentielle Transkripte nachzuweisen. Es
wurden RNAs von Mausembryonen der Stadien E14,5, E16,5 und E18,5, sowie RNA
aus dem Schädel einer neugeborenen Maus verwendet. Transkripte konnten jedoch
in keinem der Versuchsansätze nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Zur
Verifizierung des Ergebnisses wurde ein „Human Multiple Tissue Expression Array“
lontech), auf dem 55 RNAs unterschiedliche Gewebe aufgetragen sind, mit zwei
m Bruchpunkt flankierenden homologen Bereichen
iert. Auch hier konnte kein Transkript detektiert werden (Daten nicht gezeigt),
o dass davon ausgegangen werden kann, dass die Bereiche keine Gene
repräsentieren. Um einen Hinweis auf mögliche regulatorische Funktionen der
homologen Sequenzen zu erhalten, wurden die Sequenzen bioinformatisch auf
Abb. 3.35: Ausschnitt der Bruchpunkt umgebenden chromosomalen Region 9q33.1 (USCS). Der Bruchpunkt ist markiert mit „Your Sequence from Blat Search“. Insgesamt sind 5 Mb dargestellt.
(C
humanen Sonden aus den de
hybridis
s
Ergebnisse
- 90 -
-100 %
-50 %
-100 %
-50 %
-100 %
-50 %
-100 %
-50 %
-100 %
-50 %
-100 %
-50 %
-100 %
-50 %
Abb. 3.36: Interspezies-Vergleich mittels Percent identity plot (PipMaker). Dargestellt ist der genomische Synteniebereich zwischen Mensch (9q33.1), Maus (4qC1) und Huhn (Chr17) ca. 200 kb um den kartierten Bruchpunkt (rote Linie). Die schwarzen waagerechten Balken geben jeweils die prozentuale Identität zwischen Mensch-Maus (erste Spalte) und Mensch-Huhn (zweite Spalte)
an. Die konservierten Bereiche zwischen den einzelnen Spezies sind blau markiert.
anskriptionsfaktoren untersucht
). Es konnten jedoch keine Bindungsstellen identifiziert
potentielle Bindungsstellen für Tr
(http://www.genomatix.de
werden (Daten nicht gezeigt).
Diskussion
4. Diskussion
Defekte in Bildung, Wachstum und Homöostase des Skeletts sind verantwortlich für
eine sehr heterogene Gruppe von hereditären Erkrankungen, zu denen neben den
seltenen monogenen Krankheitsbildern auch komplexe Erkrankungen wie
Osteoarthrose und rheumatoide Arthritis gehören. Die Gruppe der seltenen genetisch
bedingten Erkrankungen umfasst über 250 verschiedene Formen von
Skelettdysplasien, sowie verschiedene Dysostosen und die große Gruppe der
kraniofazialen Dysostosen. Obwohl sie als Einzelerkrankungen selten sind, betreffen
diese Krankheitsbilder einen beträchtlichen Bevölkerungsanteil. So zeigen
Fehlbildungen der Extremitäten eine Inzidenz von 1 auf 1000 Neugeborenen
(Manouvrier-Hanu et al., 1999). Sowohl bei einem Großteil der komplexen
Skeletterkrankungen als auch bei den monogenen hereditären Krankheitsbildern sind
die molekularen Ursachen, sowie die Pathomechanismen nur unzureichend
erstanden. Ursache dafür ist zum größten Teil die begrenzte Verfügbarkeit
hu und K ls Ko us l an
möglic idat n Pro hstums
und der Skeletthomöostase betei
Ziel der Arbeit war es daher, grundsätz eletten lung zu
identifiz owie kelette
Dies sollte durch zwei Strategien verfolgt werden: erstens durch eine systematische
Identif euer G er Wach fuge und zw s durch
ine Patienten-orientierte Studien.
esentlichen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese humaner Erkrankungen,
v
manen Knorpel- nochenmaterials. A nsequenz hiera ist die Anzah
hen Kand engenen, die an den gestörte
ligt sind, sehr begrenzt.
zessen des Skelettwac
lich neue Gene der Sk twick
ieren, s neue Kandidatengene für S rkrankungen zu untersuchen.
izierung n ene aus humaner fetal stums eiten
e
W
sowie zur Aufklärung molekularer Vorgänge bei Entwicklungsprozessen, liefert die
Identifizierung und Charakterisierung differenziell exprimierter Gene. Hierzu werden
Hochdurchsatzmethoden wie EST-Sequenzierung (Adams et al., 1991), SAGE
(Serial analysis of gene expression, Velculescu et al. 1999,) oder
Mikroarraytechnologie (Schena et al., 1995) angewendet.
Bei der EST-Sequenzierung werden willkürlich ausgewählte Klone aus einer cDNA-
Bibliothek des Zielgewebes von den Enden her ansequenziert. Die Sequenzen
charakterisieren jeweils ein bestimmtes Transkript (EST= expressed sequence tag)
und werden in Datenbanken abgelegt. Überlappende ESTs werden hierbei einer
Transkriptionseinheit zugeordnet (UniGene-Cluster) und zu einer Sequenz
verbunden. Durch Vergleiche mit vorhandenen EST-Datenbanken kann die relative
- 91 -
Diskussion
Expressionsstärke und -verteilung (Anzahl ESTs eines bestimmten Gens) ermittelt
werden. Außerdem ist es möglich durch Datenbankrecherchen neue Gene zu
identifizieren (Schuler et al., 1996). Mittlerweile sind in der öffentlichen
dbESTDatenbank (NCBI) über 27 Millionen ESTs von 910 Spezies enthalten (Stand
Juli 2005). Die UniGene-Datenbank enthält so genannte Cluster, in denen
Informationen zu einem bestimmten Transkript zusammengefasst sind. Dazu
gehören unter anderem Sequenzinformationen, Expressionsprofile, genomische
Lokalisationen, Proteindaten und Homologien zu anderen Spezies. Die UniGene-
Datenbank greift für den Menschen auf knapp 5 Millionen ESTs aus über 8700
cDNA-Bibliotheken zurück (Stand Juli 2005), die sich auf 53256 UniGene-Cluster
s
Knorpelgewebe stammen (Tab. 4.1). Im Vergleich zu anderen Geweben sind
ranskripte aus Knorpel, insbesondere Wachstumsfugenknorpel, stark
verteilen. Dabei erhalten lediglich vier cDNA-Bibliotheken ESTs, die au
T
unterrepräsentiert.
Bibliotheksnr. Bibliotheksname Veröffentlicht Anzahl der Sequenzen
Lib. 10412 NCI_CGAP_Car1 (Osteoarthritic Cartilage) 1996 3983
Lib. 10848 NCI_CGAP_Ct1 (Osteoarthritic Cartilage) 1996 3379
Lib. 8940 HNC (Human Normal Cartilage) 2001 5219
Lib. 8936 HOA (Human Osteoarthritic Cartilage) 2001 5017
Verfolgt man die aktuelle Literatur, so ist auch hier die Zahl der Veröffentlichungen,
die sich mit der Erfassung von Expressionsprofilen von Knorpelgewebe beschäftigen,
sehr gering. Okihana und Yamada (
Tab. 4.1: Humane Knorpel-cDNA-Bibliotheken bei „UniGene“.
1999) beschrieben die Charakterisierung einer
DNA-Bibliothek aus dem Knorpel 4 Wochen alter BALB/c-Mäuse. Dazu wurde aus
et
c
60 Mäusen eine cDNA-Bibliothek hergestellt und 1400 ESTs ausgewertet. Kumar
l. (2001) veröffentlichten zwei cDNA-Bibliotheken, bei denen jeweils 5000 ESTs ausa
humanem normalen adulten Knorpel und humanem adulten osteoathrotischen
Knorpel analysiert wurden. Vergleichende Expressionsanalysen mittels Microarrays
von differenzierten (Fibroblasten) und undifferenzierten humanen Chondrozyten aus
Abortenmaterial der 20.-24. Schwangerschaftswoche wurden von Stokes et al.
(2002) beschrieben. Krakov et al. (2003) publizierten eine cDNA-Bibliothek aus
- 92 -
Diskussion
Chondrozyten aus Gelenkknorpel und Wachstumsfuge, entnommen von zwei Feten
der 18.-20. Schwangerschaftswoche, analysierten aber lediglich 420 ESTs. Parallel
dazu wurden 13155 ESTs einer cDNA-Bibliothek aus Knorpel der Wachstumsfuge
und Gelenkknorpel von 20 Aborten der 8.-12. Schwangerschaftswoche analysiert
(Zhang et al. 2003). 2004 stellten Pogue et al. eine erweiterte Analyse ihrer cDNA-
Bibliothek aus dem Jahre 2003 vor (Krakow et al., 2003), in der 6266 ESTs
ausgewertet wurden (Pogue et al., 2004). Bislang lagen aber keine entsprechenden
Analysen von Wachstumsfugenknorpel späterer Stadien vor (z.B. Neugeborene).
Gerade in den späteren Stadien steht das Wachstum des Knochens im Vordergrund.
4.1 Analyse von EST-Klonen aus einer humanen Chondrozyten-cDNA-Bibliothek
Die Daten von Zhang et al. und Pogue et al. (Zhang et al. 2003; Pogue et al., 2004)
zeigten, dass Vergleiche von Expressionsprofilen unterschiedlicher Stadien der
Knorpelentwicklung Aufschlüsse über die molekularen Prozesse während der
Knorpel-/Knochenentwicklung geben können.
Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit war eine cDNA-Bibliothek aus humaner
Wachstumsfuge von Feten der 20. Schwangerschaftswoche bis zu Kindern aus dem
2. Lebensjahr, die von Dr. B. Lee (Houston, Texas) hergestellt wurde. Im Rahmen
eines DHGP-Projekts wurden 4748 Klone mit einer Integratgröße von mind. 350 bp
von der Firma GENterprise (Mainz) sequenziert. Die unbearbeiteten Sequenzdaten
wurden anschließend auf die drei Kooperationspartner (AG Prof. Winterpacht (Institut
für Humangenetik, Erlangen), AG Prof. Zabel (Kinderklinik, Mainz), Firma
GENterprise (Mainz)) aufgeteilt und mittels „ESTsweep“ bioinformatisch analysiert
(siehe Kapitel 3.1.1). In der vorliegenden Arbeit wurden die Sequenzen aller EST-
Klone bioinformatisch ausgewertet und einige ausgewählte Kandidatengene
experimentell weiter charakterisiert.
4.1.1 Systematische Einteilung der ausgewerteten ESTs Insgesamt wurden 4748 ESTs sequenziert und ausgewertet. 4176 (88%) der ESTs
konnten bekannten Genen oder uncharakterisierten ESTs zugeordnet werden. Dabei
entspricht der Anteil der ESTs, die signifikante Sequenzidentitäten zu bekannten
Genen („Klasse 1“) aufwiesen, 76,8% bzw. 3647 ESTs. Die 3647 ESTs verteilen sich
entsprechend der UniGene-Datenbank auf 1274 unterschiedliche Transkripte. Der
- 93 -
Diskussion
Anteil der ESTs, die Sequenzidentitäten zu uncharakterisierten Genen,
hypothetischen Proteinen oder einzelnen ESTs aufwiesen („Klasse 2“), lag bei 529
ESTs (11,2%) oder 444 unterschiedlichen Transkripten. Die restlichen 570 ESTs
(12%) entsprachen Kontaminationen („Klasse 3“ genomische DNA ohne repetitive
Elemente (6%); „Klasse 4“ repetitive Elemente, leere Vektoren, E.coli Sequenzen,
mitochondriale Sequenzen, sowie nicht auswertbaren Sequenzen (6%)). Diese
entsprachen dem in Publikationen beschriebenen Anteil an Verunreinigungen
(Kumar et al., 2001; Yu et al., 2003; Jung et al., 2004). Eine Auswertung der EST-
Daten bezg. ihrer Häufigkeit ergab, dass 14,7% aller Gene „stark exprimiert“ (>0,1%
aller ESTs bzw. >4 Kopien), 23,1% „mittelstark exprimiert“ (<0,1-0,024% bzw.
zwischen 2-3 Kopien) und 62,1% „schwach exprimiert“ (<0,024%, bzw. 1 Kopie) sind.
Hierbei ist zu beachten, dass der Anteil an stark exprimierten Genen sinkt je mehr
ESTs ermittelt werden (Bortoluzzi et al., 2000). Erst wenn das nahezu komplette
Transkriptom einer Zelle oder eines Gewebes erfasst wäre, könnten Aussagen über
A-Bibliothek sind, sowie die Aussagekraft
es gewählten experimentellen Ansatzes bestätigen. Zu diesen ESTs gehören vor
llen Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM). Der Begriff extrazelluläre Matrix
t als die Gesamtheit aller Makromoleküle definiert, die in den Geweben den Raum
wischen den Zellen ausfüllen. Im Knorpel macht die ECM 95% des
ewebevolumens aus, wohingegen die Chondrozyten als einziges zelluläres
lement nur 5% des Gewebes bilden (Ballock und O´Keefe, 2003). Die ECM besteht
us einem hochorganisierten Netzwerk von Kollagenen, Glykosaminoglykanen,
die absolute Häufigkeit einzelner Gene gemacht machen. Geht man davon aus, dass
der Mensch 30000-40000 Genen hat (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001;
Hogenesch et al., 2001), müssten theoretisch 650000 ESTs analysiert werden, um
das Transkriptom vollständig zu erfassen (Velculescu et al., 1999), was bisher jedoch
für kein Gewebe und keinem Zelltyp durchgeführt wurde. Dennoch erlaubt auch die
Gewinnung geringer EST-Mengen einen guten, jedoch unvollständigen Überblick
über das Expressionsprofil eines Gewebes.
Betrachtet man die funktionelle Einteilung der bekannten Gene, so kann festgestellt
werden, dass die Verteilung der Gene auf die einzelnen funktionellen Gruppen
vergleichbar mit EST-Datenbanken aus Herz, Niere oder Leber (Adams et al., 1995)
ist. Den meisten ESTs, die in der Bibliothek gefunden wurden, entsprechen ubiquitär
exprimierte Gene, die wichtig für zelluläre Prozesse wie Stoffwechsel oder Gen- und
Proteinexpression sind. Es gibt jedoch auch eine Reihe von ESTs, die typisch für
Knorpelgewebe und die Qualität der cDN
d
a
is
z
G
E
a
- 94 -
Diskussion
Proteoglykane n Das Grundgerüst des
Knorpels besteht hauptsächlich aus den fibrillären Kollagenen Typ II, IX und XI (Eyre
et al., 2002) und dient den Zellen und anderen Komponenten der ECM als
Verankerung. Darin eingelagert ist die so genannte Grundsubstanz, die aus
Glykosaminogl nd P h die Bindung von
Wasser eine gelartige Konsistenz aufwe urch die hoh gative Ladungsdichte
der Glykosaminoglyk osmotischer Quelldruck, der durch die
Kollagenfibrille fangen wird. Bei der Einwirkung von Druck sorgt die
Grundsubstanz für eine elastische Abfe g und die K ene für Zugfestigkeit.
Neben dieser en F on kom r ECM auch dynamische Rolle als
Vermittler von nen (Aumaill d Gayraud, 1 ). Dabei interagiert die
Matrix direkt n O flächen- ptoren der len und initiiert so
Signalkaskaden, die deren Differenzierung beeinflussen (Timpl, 1989; Paulsson
1992).
Erwartungsgem ten in rliegend atensatz 182 Ts identifiziert werden,
die 18 unterschiedlichen Kollagen-Genen entsprechen. Insgesamt stellt COL2A1 das
am stärksten exprimierte Gen mit insges 03 ESTs (2,5% aller ESTs der „Klasse
1“ und „Klasse Dies gelt die ache wieder, dass Kollagen Typ II (ein
Homotrimer, dessen Ketten durch das kodiert werden) ca. 10% der
Trockenmasse elge e ausm (van der Res d Garrone, 1991) und
mit 80-95% d ste et al., 1986).
utationen im COL2A1-Gen konnten als Ursache eines ganzen Spektrums von
steochondrodysplasien unterschiedlichen Schweregrades identifiziert werden
et al., 1994; Hall, 2002). Ein Vergleich der am stärksten exprimierten
n Daten aus Gelenkknorpel und
n und nichtkollagene Proteinen. sehr stabile
ykanen u roteoglykanen aufgebaut ist und durc
ist. D e ne
ane entsteht ein hoher
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Informatio zu ey un 998
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COL2A1
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as häufig vorhandene Knorpelkollagen ist (Mayne
M
O
(Spranger
Kollagentranskripte mit entsprechende
Wachstumsfuge von Aborten der 8.-12. Schwangerschaftswoche (SSW) (Zhang et
al., 2003) und von Aborten der 12.-20. SSW (Pogue et al., 2004) wiesen einige
interessante Unterschiede auf (Tab. 4.2).
- 95 -
Diskussion
- 96 -
Kollagen % Kollagen8.-12. SSW
% Kollagen 18.-20. SSW
% Kollagen 20. SSW- 2. Lebensjahr
COL2A1 24 33,3 56,59
COL1A2 21 0,38 1,1
COL1A1 12 0,38 4,4
COL9A1 10 29,4 8,24
COL3A1 7,5 0,26 1,65
COL11A1 6,4 10,1 1,1
COL11A2 4,7 5,5 4,95
COL9A3 3,6 8,96 6,59
COL9A2 2,9 5,63 4,4
COL12A1 1,38 0,38 1,1
COL27A1 kA 1,15 1,1
COL6A1 kA 1,02 1,1
COL6A2 kA 0,77 2,75
COL14A1 kA 0,64 0,55
COL16A1 kA 0,64 2,2
COL5A2 kA 0,38 nD
COL4A2 kA 0,26 1,1
COL4A1 kA 0,13 0,55
COL5A3 kA 0,13 nD
COL6A3 kA 0,13 nD
COL10A1 kA 0,13 nD
COL18A1 kA 0,13 nD
COL5A1 kA kA 0,55
Obwohl COL2A1 in allen drei Bibliotheken das am stärksten exprimierte Gen ist,
zeigt sich ein kontinuierlicher Anstieg der COL2A1-Expression von der 8.-12. SSW
(24% aller Kollagene) über die 18.-20. SSW (33,3% aller Kollagene) bis zu den hier
vorliegenden Daten (56,59 % aller Kollagene). COL2A1 wird in den Chondrozyten
Tab. 4.2: Prozentuale Anteile der Kollagene in cDNA-Bibliotheken unterschiedlicher Knorpelstadien. Die prozentuale Verteilung bezieht sich jeweils auf alle gefundenen Kollagen-ESTs der jeweiligen cDNA-Bibliotheken. Die Daten aus Knorpel von Embryonen der 8.-12. Schwangerschaftswoche (SSW) stammen von Zhang et al. (2003), die Daten aus Knorpel von Embryonen der 18.-20. Schwangerschaftswoche (SSW) von Pogue et al. (2004). Die Daten der letzten Spalte wurden in vorliegender Arbeit generiert.
unterschiedlich stark exprimiert, je nachdem in welchem Differenzierungsstadium
sich die Chondrozyten befinden. Chondrozyten in der proliferativen und der unteren
hypertrophen Zone zeigen die stärkste Expression an COL2A1, während
Chondrozyten der Ruhezone und der restlichen hypertrophen Zone eine schwache
Expression von COL2A1 aufweisen. COL2A1 scheint somit ein Marker für die
Teilungsaktivität der Chondrozyten zu sein (Mundlos, 1994). Da das
Diskussion
Längenwachstum im Laufe der Embryonalentwicklung und der ersten Lebensjahre
immer stärker zunimmt, steigt damit auch die Teilungsrate der Chondrozyten der
Wachstumsfuge und somit auch die Expression von COL2A, was durch vorliegende
Daten bestätigt wird.
COL1A1 und COL1A2 sind mit 12% und 21% aller detektierten Kollagene in der
Bibliothek von Zhang et al. (2003) sehr stark exprimiert, wohingegen in der Bibliothek
von Pogue et al. (2004) die beiden Gene mit jeweils 0,38% eher schwach exprimiert
werden. In den vorliegenden Daten ist dann jedoch wieder ein Anstieg zu
verzeichnen. Dieses Expressionsprofil ist mit publizierten Daten im Einklang und
decken sich mit dem Knorpel-
spiegelt die Expression von COL1A1 und COL1A2 in der frühen Skelettentwicklung
wieder (Mundlos et al., 1990). Beide Gene werden in embryonalen Mesenchymzellen
und frühen Prächondrozyten stark exprimiert. Die Expression sinkt jedoch während
der späteren Stadien der enchondralen Ossifikation wieder und ist dann
hauptsächlich in Osteoblasten zu finden (Lui et al., 1995; Sanchez et al., 2001). Der
erneute Anstieg von COL1A1 und COL1A2 in späteren Entwicklungsstadien ist damit
zu erklären, dass sich in der weiteren Entwicklung der Röhrenknochen die
Wachstumsfuge verkürzt, dabei jedoch breiter wird, so dass sich die Fläche zwischen
Wachstumsfuge und entstehendem Knochen ausdehnt. Als Konsequenz daraus
erhöht sich der Anteil an einwandernden Osteoblasten in die hypertrophe Zone der
Wachstumsfuge, was zu einer Expressionssteigerung an COL1A1 und COL1A2
führt.
Obwohl die α1-Kette von Kollagen Typ IX (COL9A1) mit 29,4 % aller Kollagene in der
EST-Datenbank der 18.-20. SSW dem zweithäufigsten Transkript entspricht (Pogue
et al., 2003), konnten sowohl in der 8.-12. SSW (Zhang et al., 2004) als auch in den
Daten dieser Arbeit nur eine relativ schwache Expression (10% und 8,24% aller
Kollagene) festgestellt werden. Diese Daten
Expressionsprofil der sich entwickelnden Maus (Perala et al., 1997). Col9A1, Col9A2
und Col9A3 wiesen hier während der Embryonaltage 14,5-16,5 einen
Expressionsanstieg auf, nahmen jedoch danach in ihrer Expression wieder ab.
Während COL16A1 in dem Datensatz dieser Arbeit 2,2% aller Kollagene ausmacht,
konnte es in früheren Stadien nur sehr schwach exprimiert gefunden werden
(8.-12. SSW keine Angaben, 18.-20. SSW 0,64% aller Kollagene). Während der
Embryonalentwicklung der Maus ist Col16a1 in vielen Geweben vertreten und wird
dort mit fibrillären Kollagenen koexprimiert. Hauptsächlich wird Kollagen Typ XVI in
differenzierten Chondrozyten (Lai und Chu, 1996; Kassner et al., 2003) exprimiert
- 97 -
Diskussion
und ist dort Bestandteil der schmalen „heterotypic D-banded“ Fibrillen (Kassner et al.,
2004; 2004). Basierend auf in vitro-Studien konnte gezeigt werden, dass COL16A1
erst in einem späteren Verlauf der Chondrogenese eine Rolle spielt (Sekiya et al.,
2002), was vorliegende Daten stützt.
Zusätzlich konnte im Rahmen dieser Arbeit neues fibrilläres Kollagen mit Ähnlichkeit
zu Kollagen Typ XI gefunden werden. Das Gen wurde inzwischen von Pace et al.
(2003) publiziert und als COL27A1 bezeichnet. COL27A1 zeigt eine starke
Expression in Knorpel, Auge und Ohr und konnte auch in früheren
iert. Dementsprechend
x-Proteine identifiziert werden (siehe Abb. 3.5). In dieser Gruppe
Entwicklungsstadien nachgewiesen werden (Pogue et al., 2004).
Weiterhin wurden 11 verschiedene Proteoglykane (38 ESTs) identifiziert (siehe Abb.
3.5). Interessanterweise konnten Biglykan (BGN) und Chondroitinsulfat
Proteoglykan 4 (CSPG4), die in der ausgewerteten Datenbank mit jeweils 9 und 6
ESTs sehr stark exprimiert sind, in den cDNA-Bibliotheken der 8.-12. SSW (Zhang et
al., 2003) und der 18.-20. SSW (Pogue et al., 2004) entweder gar nicht oder sehr
schwach nachgewiesen werden. Für beide Gene wurde bereits eine Beteiligung an
der Knochenentwicklung gezeigt. BGN ist ein wichtiger Bestandteil der
mineralisierten Matrix und wird sehr stark in Knochen exprim
konnte bei einem Verlust der Funktion in der Maus ein reduziertes
Knochenwachstum nachgewiesen werden (Young et al., 2002; Waddington et al.,
2003). CSPG4 ist in unreifen Knorpelanlagen der sich entwickelnden Extremitäten
stark exprimiert. Nachdem CSPG4 in reifen Chondrozyten herunterreguliert wird, wird
es während der primären Ossifikation in den hypertrophen Chondrozyten und
Osteoblasten wieder stark exprimiert (Fukushi et al., 2003). Die hohe Expression von
BGN, CSPG4 und anderen Proteoglykanen spiegelt das fortgeschrittene Stadium der
Skelettentwicklung wieder und demonstriert die Spezifität des Ausgangsmaterials der
in dieser Arbeit ausgewerteten cDNA-Bibliothek.
Neben den Kollagenen und den Proteoglykanen konnten eine Reihe anderer
extrazellulärer Matri
sind SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich) und FN1 (Fibronektin 1) mit
jeweils 22 ESTs am stärksten vertreten. SPARC, auch als Osteonectin oder BM-40
bezeichnet (Termine et al., 1981; Sage et al., 1994; Dziadek et al., 1986) gehört zur
Familie der BM-40. SPARC zeigt eine weit verbreitete Expression während der
embryonalen Entwicklung, sowie in adulten Stadien. Es ist insbesondere in
Osteoblasten und Chondrozyten der hypertrophen Zone exprimiert (Maurer, 2002;
Mundlos et al., 1992). Während die Störung der SPARC-Expression in Nematoden
- 98 -
Diskussion
und Amphibien zu schweren, zum Teil letalen Entwicklungsstörungen führt
(Fitzgerald und Schwarzbauer, 1998), ist der Phänotyp von murinen Nullmutanten
verhältnismäßig schwach. Die Entwicklung der Mäuse erscheint bis zu einem Alter
von sechs Monaten normal. Danach entwickeln sie schwere Augenschäden (Gilmour
et al., 1998; Norose et al., 1998) und weisen zudem eine verringerte Knochenmasse,
sowie eine verschlechterte Fähigkeit zur Knochenneubildung (Delany et al., 2000)
auf. Erkrankungen, die auf Mutationen in SPARC zurückzuführen sind, wurden
bisher nicht beschrieben.
FN1, ein früher Marker der Knorpelentwicklung (Peters et al., 2002), hat sowohl eine
hohe Affinität zu Heparin, als auch zu Kollagenen, Fibrin und verschiedenen
Proteoglykanen (Ruoslathi et al., 1988; Yamada et al., 1991). Bemerkenswert ist die
stark erhöhte Konzentration in osteoarthritischen Geweben. Man vermutet, dass
Fragmente von FN1 die Zytokin- und Matrixmetalloproteinasenexpression induzieren,
die charakteristisch für die Osteoarthrose sind (Homandberg, 2001). Beide Gene
(SPARC und FN1) konnten sowohl in den Knorpel-cDNA-Bibliotheken der 8.-12.
SSW (Zhang et al., 2003) als auch in der 18.-20. SSW (Pogue et al., 2004) in einem
vergleichbar hohen Expressionslevel nachgewiesen werden.
Interessanterweise sind SPARC und FN1 in Knorpel-cDNA-Bibliotheken der 8.-12.
SSW (Zhang et al., 2003) und der 18.-20. SSW (Pogue et al., 2004) ähnlich stark
exprimiert wie Hyaluron und Proteoglykan link protein 1 (HAPLN1 oder CRTL1). Im
Gegensatz dazu konnten im Datensatz der vorliegenden Arbeit nur zwei ESTs
gefunden werden, die eine Sequenzidentität zu HAPLN1 aufwiesen. HAPLN1 ist
wichtig für die Organisation von hypertrophen Chondrozyten (Watanabe und
Yamada, 1999) und wird von SOX9 reguliert (Kou und Ikegawa, 2004). Die
Regulation durch SOX9 weist darauf hin, dass HAPLN1 schon in frühen Stadien der
enchondralen Ossifikation, eventuell in der Ruhe- und Proliferationszone der
Wachstumsfuge, exprimiert wird. Diese ist möglicherweise in unserer Datenbank
unterrepräsentiert.
Bei Betrachtung der Matrix müssen nicht nur die Proteine des Matrixaufbaus,
sondern auch matrixabbauende Enzyme (katabol) berücksichtigt werden (Aigner et
al,. 2004), da beide Prozesse in Wechselwirkung miteinander stehen und erst das
Wechselspiel der anabolen und katabolen Prozesse die Integrität der Matrix
erlauben. So zeigen Matrixmetalloproteinasen (MMPs) defiziente Mäuse schwere
Knorpel- und Knochenfehlbildungen (Vu et al., 1998; Holmbeck et al., 1999; Zhou et
al., 2002). Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit sieben verschiedene
- 99 -
Diskussion
matrixabbauende Enzyme identifiziert werden (64 ESTs). Von diesen sieben sind die
Matrixmetalloproteinase-3 (MMP3, 34 ESTs), eine Proteoglykanase, MMP1 (22
ESTs) und MMP13 (4 ESTs), die beide zu den Kollagenasen gehören, die am
stärksten exprimierten matrixabbauenden Enzyme. Sowohl MMP3 als auch MMP13
wurden in den cDNA-Bibliotheken aus Knorpel der 18.-20. SSW (Pogue et al., 2004)
als die am stärksten exprimierten MMPs beschrieben. Alle drei MMPs sind am
Knorpel/Knochen Auf- und Umbau involviert und spielen eine wichtige Rolle in der
Skelettentwicklung (Bord et al., 1998; Wu et al., 2002; Vincenti und Brinckerhoff,
2002). Die MMP3- und MMP13-Expression ist auf die hypertrophen Chondrozyten
und die den Knorpelgelenken angrenzenden Osteoblasten beschränkt (Bord et al.,
1998; Sasano et al., 2002; Stickens et al., 2004), während MMP1 am stärksten in
Osteoblasten exprimiert ist. MMP1 konnte jedoch auch in proliferativen und
hypertrophen Chondrozyten, Osteocyten und Osteoklasten nachgewiesen werden
(Bord et al., 1997; Haeusler et al., 2005). Die Verteilung dieser drei MMPs gibt das
spätere Stadium der Skelettentwicklung mit einem erhöhten Anteil an
knochenbildenden Zellen wieder. Mit MMP3, MMP13, Annexin II (ANXA2, 3 ESTs)
und Annexin V (ANXA5, 8 ESTs) wurde eine Reihe von Genen gefunden, die als
Marker für hypertrophe Chondrozyten angesehen werden können (Kirsch et al.,
000; Turnay et al., 2001; Sasano et al., 2002; Stickens et al., 2004). Eine Reihe von
usätzlichen Markern für prähypertrophe und hypertrophe Chondrozyten wie
OL10A1, alkalische Phosphatase, MMP9 und IHH konnte jedoch noch nicht
efunden werden. Dies kann damit zusammenhängen, dass die Gene gegenüber
nderen gefundenen Markern einfach zu schwach exprimiert sind. Unterstützt wird
iese These durch Daten aus Knorpel der 18.-20. SSW (Pogue et al., 2004), bei
enen z.B. COL10A1, obwohl 6000 ESTs ausgewertet wurden, nur einmal gefunden
urde. Leider sind weder bei der Arbeit von Zhang et al. (2003) noch in der
eröffentlichung von Pogue et al. (2004) Expressionsprofile der übrigen Marker
ypertropher Chondrozyten erwähnt, so dass davon ausgegangen werden kann,
ass diese Gene auch in den beiden Datensätzen nicht vorhanden sind. Es ist
doch nicht auszuschließen, dass durch die Präparation der Biopsien der in dieser
rbeit ausgewertete cDNA-Bibliothek, bei der versucht wurde, die Kontamination
reduzieren, die hypertrophen Chondrozyten
unterrepräsentiert sind und so schwach exprimierte Marker nicht detektiert werden
konnten.
Die Identifikation von Genen, die ein gewebe- oder entwicklungsspezifisches
2
z
C
g
a
d
d
w
V
h
d
je
A
durch Knochenmarkzellen zu
- 100 -
Diskussion
Expressionsprofile aufweisen, ist eine wichtige Analysemethode zur Identifizierung
on Kandidatengenen, die an Entwickungsprozessen beteiligt sind. Eine Möglichkeit,
v
solche Gene zu finden, ist der Vergleich von Expressionsprofilen verschiedener
cDNA-Bibliotheken (Audic und Claverie, 1997). In der vorliegenden Arbeit wurden
daher alle Transkripte der „Klasse1“ und „Klasse2“ entsprechend analysiert. Dazu
wurde die Anzahl der gefundenen ESTs pro Transkript durch die Anzahl der
korrespondierenden ESTs in der NCBI-EST-Datenbank dividiert. Basierend auf
diesen Rechnungen wurden die Transkripte in vier verschiedene Gruppen eingeteilt.
Die Werte reichten von >0,05 für Transkripte, die eine hohes relatives
Expressionslevel für embryonales Knorpel-/Knochengewebe aufweisen, bis <0,005
für ubiquitär exprimierte Transkripte (Abb. 4.1). 27 Gene konnten der Gruppe 1
(relatives Expressionslevel >0,05) zugeordnet werden. Diese Gruppe enthält 9 Gene
(33,33%), für die eine grundlegende Rolle im Prozess des Knorpelwachstums und
der Homöostase bereits nachgewiesen ist (COL2A1, MMP3, COL9A1, MMP1,
COL9A2, COL9A3, MMP13, CHM1, MAT3). Interessanterweise gehören der Gruppe
1 (relatives Expressionslevel: >0,05) 12 uncharakterisierte Transkripte an. Diese
stellen potentielle Kandidatengene für die Knorpel- und Knochenentwicklung dar.
Eine Auswahl dieser Transkripte wurde im Verlauf der Arbeit untersucht.
>0,050,05-0,001
0,001-0,005<0,005
33,3%
13,0%
4,0% 4,0%1,5%9,7%
20,5%
68,1%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
% d
er E
ST-C
lust
er
relatives Expressions
level
bb. 4.1: Verteilung der 1693 Gene (EST-Cluster), die der „Klasse 1“ und der „Klasse 2“ ugeordnet wurden, in Abhängigkeit ihrer Häufigkeit in den EST-Datenbanken (NCBI, blaue
Balken). Das relative Expressionslevel wurde durch die Division der Anzahl der ESTs in der eigenen Bibliothek durch die Anzahl der ESTs in der EST-Datenbank (NCBI) berechnet. Die roten Balken zeigen den prozentualen Anteil der Transkrikpte, bei denen eine Funktion in der Knorpel-/Knochenentwicklung durch Publikationen nachgewiesen ist.
Az
- 101 -
Diskussion
4.1.2 Detaillierte Analyse und Charakterisierung von ECM3 (86H12) Die cDNA mit der Bezeichnung 86H12 weist ein relatives Expressionslevel von 0,25
auf und zeigt eine signifikante Sequenzidentität zu vier, im UniGene-Cluster
Hs.442169 zusammengefassten, ESTs. Alle vier ESTs entstammen Knorpel- bzw.
Chondosarkom-cDNA-Bibliotheken (siehe Tab. 3.4). Das Transkript (UniGene-
Cluster Hs.442169) ist als „similar to extracellular matrix protein 2 precursor“
bezeichnet und zeigt Ähnlichkeit zu den Genen ECM2 und BGN, einem
Proteoglykan, das in der Knorpel-/Knochenentwicklung wichtige Funktionen innehat
(Bock et al., 2001; Wiberg et al., 2002; Young et al., 2002). 86H12 wurde aufgrund
seiner Ähnlichkeit zu ECM2 als ECM3 (Extracellular matrix protein 3) bezeichnet.
u ECM2 und BGN, und da die einzigen ESTs, die
ECM3 aufweisen, aus Knorpel- bzw. Chondosarkom-cDNA
ECM3 ein sehr interessanter Kandidat und wurde auf
-/Knochenentwicklung untersucht.
ECM3 auf Chromosom Xq28. Über RT-PCR und RACE-Experimente
ionsstelle lässt sich mit Hilfe der Kozak-Konsensus-
Aufgrund der Sequenzidentität z
eine Sequenzidentität zu
Bibliotheken stammen, ist
mögliche Beteiligung an der Knorpel
Lokalisiert ist
konnte der komplette offene Leserahmen von ECM3 bestimmt und verifiziert werden.
ECM3 besteht aus 12 Exons mit insgesamt 2448 bp. Diese 2248 bp umfassen einen
genomischen Bereich von 10,2 kb. Der offene Leserahmen umfasst 9 Exons (Exon
4-12) mit 1767 bp (589 Aminosäuren) und ist durch STOP-Codons begrenzt. Die
potentielle Translationsinitiat
Sequenz vorhersagen (Kozak, 1996), die den optimalen Kontext zur
Translationsinitiation in der Vertebraten-mRNA darstellt (cccaccATGg). In ECM3 liegt
das putative Startcodon im Kontext ccctccATGg (erstes ATG im offenen
Leserahmen). Die hohe Sequenzübereinstimmung zwischen den Basen im Bereich
des putative Startcodons und des Konsensus-Motivs legt nahe, dass das erste
Methionin in der abgeleiteten Aminosäuresequenz das Startcodon für die Translation
darstellt. Ein weiterer Hinweis für den richtigen Translationsstart ist die Identifizierung
einer Signalsequenz. Das Programm „SignalP 3.0“ sagt mit einer Wahrscheinlichkeit
von 100% ein Signalpeptid vorher, was das Protein zu einem potentiellen
sekretorischen Protein mit einer Schnittstelle zwischen Position 21 (G, Glycin) und
Position 22 (G, Glycin) macht (Abb. 4.2).
- 102 -
Diskussion
Abb. 4.2: Graphische Darstellung des Ergebnisses der „SignalP 3.0“-Auswertung zur Bestimmung von Signalpeptiden in der Proteersten 70 Aminosäuren des putativen Proteins. D
Dies konnte wen es Pro n“ bestätigt
werden. „PS edic gt mit 55,6% ein
extrazellulär ode ransm nalyse der
putativen P nz Prog ucin-reiche
Repeats“(LR
LRRs konnt 000 en un men (Viren,
Bakterien, A rien karyo ie Proteine
mit LRRs um mo -Rezeptoren, elladhäsions-
roteine, bakterielle Virulenzfaktoren, Enzyme und extrazelluläre Matrix-
lykoproteine (Enkhbayar et al., 2004). Nahezu alle LRR-enthaltenden Proteine sind
Protein-Protein-Interaktionen, die Signaltransduktion, Zelladhäsion, DNA-
eparatur, Rekombination, Transkription, RNA-Prozessierung, Immunantwort und
insequenz von ECM3. Analysiert wurden die er C-Score (rot) gibt die Wahrscheinlichkeit an,
mit der sich zwischen zwei Aminosäuren eine Schnittstelle für eine Signalpeptidase befindet. Der S-Score gibt lic er eine Aminosä nes Signalpeptids (hoher Score) oder des s (nied chließlich die Kombination inlic s C-Sco
die Wahrschein hkeit an, mit d ure Teil eiAminosäuren Propeptid riger Score) ist. Der Y-Score gibt s
der Wahrsche hkeiten au re und S-Score an.
unter Ver dung d gramms „PSORT II Predictio
ORT II Pr tion“ sa einer Wahrscheinlichkeit von
es Protein r ein T embranprotein vorher. Eine A
roteinseque mit dem ramm „SMART“ ergab 12 „Le
Rs).
en in über 2 Protein d in einer Vielzahl von Organis
rchaebakte und Eu nten) nachgewiesen werden. D
fassen Hor n Tyrosinkinase-Rezeptoren, Z
P
G
in
R
Apoptose involviert (Enkhbayar et al., 2004). Die LRRs sind in ihrer
Konsensussequenz und der Anzahl an Wiederholungen sehr variabel. So variiert die
Anzahl zwischen 2 und 45 Wiederholungen, ihre Länge zwischen 20 und 30
Aminosäuren. Alle LRRs beinhalten ein hochkonserviertes und ein variables
Segment. Der hochkonservierte Abschnitt besteht aus 11-12 Aminosäuren mit der
Konsensussequenz LxxLxLxxNx1-2L, wobei „x“ eine variable Aminosäure darstellt, „L“
Leucin (Leu, L), Isoleucin (Ile, I) oder Valin (Val, V) und „N“ Asparagin (Asn, N),
Threonin (Thr, T), Serin (Ser, S) oder Cystein (Cys, C) (Kajava et al., 1995; 1998).
- 103 -
Diskussion
Sieben unterschiedliche Klassen an LRRs, die sich durch unterschiedliche Längen
und unterschiedliche Konsensussequenzen im variablen Anteil der LRRs
unterscheiden, konnten bis heute identifiziert werden (Kajava et al., 1995;
Matsushima et al., 2000). Die 12 LRRs, die in ECM3 identifiziert wurden, konnten der
Klasse „typical“ zugeordnet werden (Abb. 4.3). Sequenzvergleiche ergaben
Ähnlichkeiten zu zahlreichen LRRs-enthaltenden Proteinen. Die größte Ähnlichkeit
zeigte sich zu ECM2 (extracellular matrix protein 2) (Nishiu et al., 1998). ECM2 zeigt
eine Aminosäureidentität zu ECM3 von 43% und besitzt ebenfalls ein Signalpeptid
und 12 LLRs der Klasse „typical“. ECM2 zeichnet sich jedoch zusätzlich durch eine
„von Willebrand factor (vWF) type C“-Domäne (Nishiu et al., 1998) aus, die in
Protein-Protein-Interaktionen involviert ist (Voorberg et al., 1991). Die Funktion von
ECM2 ist noch weitestgehend unbekannt.
LRR-Element AS-Position Sequenz LRR TYP 01 247-269 -PGLTTLYLAENEIAKIPAHTFLG-- LRR TYP 02 270-295 LPNLEWLDLSKNKLDPRGLHPHAFKN
LRR TYP 03 296-318 LMRLKRLNLVGNSLTTVPALPAS---
LRR TYP 04 319-339 ---LQELKLNDNLLQGLQGSSFRG--
LRR TYP 05 343-366 LLTLEELHLGTNLIEEVAEGALSH--
LRR TYP 06 367-392 IHSLSVLVLSHNWLQEHWLAPRAWIH
LRR TYP 07 393-416 LPKLETLDLSYNRLVHVPRFLPRG--
LRR TYP 08 417-437 ---LRRLTLHHDHIERIPGYAFAH--
LRR TYP 09 440-464 -PGLEFLHLSHNRLQADGIHSVSFLG
LRR TYP 10 467-488 -ASLAELLLDHNQVQAIPRGLLG---
LRR TYP 11 489-512 LKGLQVLGLSHNRIRQVPLNSICD--
LRR TYP 12 519-543 -SNLTSTHLENNLIDRRRIPPTAFSC
Consensus LxxLxxLxLSHNxLxxLPxxxFA
„typical“ LRR LxxLxxLxLxxNxLxxLpxxoFxx
e Aminosäuren
Abb. 4.3: Multiples Alignment der „Leucin-reichen Repeats“ (LRRs) von ECM3. Links sind die Bezeichnungen der einzelnen LRRs dargestellt. In der Mitte sind die Aminosäure-Positionen der LRRs und rechts die Sequenz der Aminossäuren im hypothetischen Protein ECM3 aufgeführt. Grün hinterlegt sind die Aminosäuren, die nach Kajava (2001) in der Klasse „typical“ konserviert sind (letzte Zeile).
ECM3 z igt weitere Ähnlichkeit zu Lumican (30% identisch oder 46%
gleicher Funktion), Biglykan (29% identisch oder 45% Aminosäuren gleicher
Funktion), Keratokan (29% identisch oder 45% Aminosäuren gleicher Funktion) oder
Fibromodulin (32% identisch oder 45% Aminosäuren gleicher Funktion). Diese
Proteine sind Mitglieder der „schmalen Leucin-reichen Proteoglykane“ (SLRPs). Bei
den SLRPs handelt es sich um kleine sekretierte Proteoglykane, die in
Kollagenfibrillogenese, zelluläres Wachstum, Differenzierung und Migration involviert
sind (Tasheva et al., 2004). Der Aufbau der 13 Mitglieder dieser Proteinfamilie ähnelt
- 104 -
Diskussion
dem von ECM3. Die Proteine umfassen 299-480 Aminosäuren. N-terminal befindet
Heparin-/Heparansulfat (HS), Chondroitin-/Dermatansulfat (CS/DS),
sich ein Signalpeptid und C-terminal 5-11 LRRs, die jeweils von einem Cystein-
Cluster umgeben sind (Hocking et al., 1998). Diese fehlen jedoch bei ECM3.
Das Vorhandensein einer potentiellen Glykosaminoglykan (GAG)-Bindungsstelle an
Aminosäureposition 177 (Serin-Glycin; Krusius et al., 1986), ein Charakteristikum von
Proteoglykanen, weißt darauf hin, dass es sich bei ECM3 um ein Proteoglykan
handeln könnte. Die GAGs sind unverzweigte Polysaccharide, die alternierend aus
Uronsäure- und Hexosamin-Anteilen aufgebaut sind und ein Hauptbestandteil der
gelartigen Grundsubstanz der ECM. Man unterscheidet grundsätzlich vier Typen von
GAG:
Keratansulfat (KS) und Hyaluronsäure (HA). Jedes GAG repräsentiert ein Polymer
aus sich wiederholenden Disaccharideinheiten, die bei Heparin, HS und HA aus N-
Acetyl-Glucosaminen und Uronsäure, bei CS/DS aus N-Acetyl-Galaktosaminen und
Uronsäure, und bei KS aus N-Acetyl-Glucosaminen und Galaktose bestehen. Bis auf
Hyaluronsäure sind sie sulfatiert und an Proteine gebunden (Proteoglykane) (Wigh et
al., 1991).
Im C-terminalen Bereich des putativen ECM3-Proteins befindet sich an AS-Position
547 eine potentielle Bindungsstelle für N-gebundene Oligosaccharide (Abb. 4.4), ein
weiteres Charakteristikum für Proteoglykane. Zusammen mit den LRRs und der
Ähnlichkeit zu den SLRPs deutet dies darauf hin, dass es sich bei ECM3 um ein
Proteoglykan handelt.
Abb. 4.4: Graphische Darstellung des Ergebnis der NetNGlyc 1.0 Server (Expasy) Auswertung zur Bestimmung von Bindungsstellen für N-gebundene Oligosaccharide in der Proteinsequenz von ECM3. Es wird eine Bindungsstelle an AS-Position 547 vorhergesagt.
- 105 -
Diskussion
4.1.2.1 Expression und mögliche Funktion des humanen ECM3 Expressionsanalysen mittels eines humanen Northern-Blots mit cDNA-Sonden aus
dem 3`- und dem 5`-Bereich von ECM3 ergaben ein starkes Hybridisierungssignal in
Plazenta und eine schwache Expression in Gehirn, Herz, Leber, Niere, Pankreas und
kelettmuskel, mit einer Transkriptgröße von 2,4 kb. In Lunge konnte ein
kb detektiert werden. Mittels Dot-Blot-
r
ibrillogenese von Kollagenen (Wiberg et al., 2002), die wichtig für Struktur,
achstum und Differenzierung der Knorpelanlagen und besonders für die
achstumsfuge sind.
s konnte gezeigt werden, dass Decorin in vitro an lösliches Kollagen Typ I und II
indet (Hedbom und Heinegard, 1989), die Fibrillenformation verzögert (Vogel et al.,
984) und simultan den Fibrillendurchmesser vermindert (Vogel und Trotter, 1987).
992),
C1q
it von
ende
der
h für
ritani
S
zusätzliches Transkript von 2,2
Hybridisierungen an humanen Geweben konnten die Daten bestätigt und ergänzt
werden. Auch hier zeigte sich eine schwache Expression in diversen Geweben und
eine starke Expression in Plazenta.
Eine mögliche Beteiligung von ECM3 an der Chondrozytenentwicklung ergaben erste
Untersuchungen durch Dr. Fiedler (Universitätsklinikum Ulm, Abt. und Poliklinik für
Orthopädie). In vitro-Untersuchungen an mesenchymalen Progenitoren
Stammzellen, die durch BMP2 und Dexamethason zur chondrogenen
Differenzierung angeregt wurden, zeigten, dass ECM3 nach 21 Tagen um das
3-6fache erhöht ist (mündliche Mitteilung). Die Erhöhung der ECM3-Expression
während der Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen zu Chondrozyten
weist auf eine mögliche Beteiligung von ECM3 an diesem Differenzierungsprozess
hin.
Eine mögliche Funktion in diesem Differenzierungsprozess könnte über die
Ähnlichkeit von ECM3 zu den SLRPs hergeleitet werden. So haben SLRPs
Funktionen bei Aufbau, Aufrechterhaltung und Umbau der ECM und speziell bei de
F
W
W
E
b
1
Des Weiteren interagiert Decorin mit Kollagen Typ VI (Bidanset et al., 1
Fibronectin (Schmidt et al., 1991), Thrombospondin (Winnemoller et al., 1992),
(Krumdieck et al., 1992) und mit Wachstumsfaktoren, z.B. TGF-ß. Die Fähigke
Decorin Wachstumsfaktoren zu binden, spielt möglicherweise eine entscheid
Rolle bei der Kontrolle der Zellproliferation, und hat darüber hinaus Anteil an
Regulation von TGF-ß (Yamaguchi et al., 1990). Interessanterweise wird auc
ECM2 eine Funktion bei der Zellproliferation bei B-Lymphozyten beschrieben (O
et al., 1998), wobei der Mechanismus unbekannt ist.
- 106 -
Diskussion
Die SLRPs Fibromodulin und Lumikan zeigen ebenfalls eine hohe
s auf
and
z zur
ktive
Das
ltung
e neue Komponente für Aufbau,
en werden. Um diese These zu
tersuchen, müssten in einem nächsten Schritt Bindungsanalysen durchgeführt
erden, um Bindungspartner von ECM3 zu identifizieren.
(u.a. Maus, Ratte, Hund). Vergleiche der
urch TREX2 und BGN begrenzten DNA-Bereiche zwischen Mensch und Maus und
ensch und Ratte zeigten, dass ECM3 zwischen den Spezies nicht konserviert ist
iehe Abb. 3.16). Mit Hilfe von „Pipmaker“-Analysen wurden im Bereich der Exons 5-
eine Sequenzidentität >60% zwischen Mensch und Maus vorhergesagt, jedoch
onnten weder Exon-Intron-Grenzen noch ein offener Leserahmen detektiert werden.
uch über RT-PCR- und Dot-Blot-Analysen an verschiedenen Mausgeweben und
ntwicklungsstadien konnte ECM3 bei der Maus nicht nachgewiesen werden.
teressanterweise konnte über „Pipmaker“-Analysen zwischen Mensch und Hund
ine hohe Sequenzähnlichkeit in Bereichen der ECM3-Exons gezeigt werden. Auch
ind die Exon-Intron-Grenzen zwischen den beiden Spezies konserviert. Setzt man
Bindungsaffinitäten zu fibrillären Kollagenen und einen inhibitorischen Einflus
die Fibrillogenese (Hedbom und Heinegard, 1989; Rada et al., 1993; Hedbom
Heinegard, 1993).
Im Gegensatz zu den beschriebenen SLRPs zeigt BGN keine hohe Tenden
Bindung von Kollagen Typ I (Brown und Vogel, 1989), wohingegen eine sele
Bindung an Kollagen Typ VI beobachtet werden konnte (Wiberg et al., 2002).
Zusammenspiel von SLRPs und Kollagenen ist essentiell für die Aufrechterha
der ECM. Möglicherweise konnte mit ECM3 ein
Aufrechterhaltung und Umbau der ECM gefund
un
w
4.1.2.2 ECM3 in anderen Spezies ECM3 wird im humanen Genom von den Genen TREX2 (Three prime repair
exonuclease 2) und BGN flankiert (siehe Abb. 3.16). Beide Gene sind Teile eines
Synteniebereiches verschiedener Spezies
d
M
(s
8
k
A
E
In
e
s
hier die putativen Exons zusammen, erhält man einen offenen Leserahmen von 546
Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von 66% zum humanen ECM3 (Abb. 4.5).
- 107 -
Diskussion
1 70 Mensch (1) --------------------MAAKRSVLLPILALWAGSCSG-------------GAPPTPMGLATLQLLP Ko
Hund (1) MQAFQQKTGSTGVQEKSTSLSLQMRSMMLPVLALWVGCCPGGALAEQGLSPREPAATPTSPGMLTLQPPP nsensus (1) RSMLLPILALW G C G AA PT GL TLQ P 71 140
Mensch (38) -SPPGAPDGQLQPIPGIGHPDKPEAGKLDQLRDQPTPKQGAQGTPTQSPSTGWKALPRPGLALRKESPPV Hund (71) PSWPGPPNGQARPTLSNSGLDRPEEGAHEACTQPPGP---SR-----------KALARPRPAQREASPPA
nsensus (71) S PG P GQ P DKPE G D P P A KAL RP A R SPP 141 210
Ko Mensch (107) TLEQEQGHNKGLVAEWAQPQATAAMRAGAGKPEALKLRPWQAGRDPQAQEGAAVTEEDQGQRTGGREDKG Hund (127) AWDQEWSHYKGPSSKWAQPQA----VA-------------------EAQERAVATREGVLRRPGS----G
nsensus (141) DQE H KG A WAQPQA A AQE A T E R G G 211 280
Ko Mensch (177) RGLKPRRPPKGTSHQPGLRIRRPQKDRSRGQGGGGSTSKTPGHGWKRPGSTHGHRHRHADLGTTQQAMPS Ko
Hund (170) S--RPQK--K---------------DDSQGQGGG-CTEETTDRERKRPRSRQGHGHRFPDLGAAEQAMPP nsensus (211) KP K K D S GQGGG T T KRP S GH HR DLG QAMP 281 350
Mensch (247) LPASCLLAQAVIACGNVKMKHVPALTHPGLTTLYLAENEIAKIPAHTFLGLPNLEWLDLSKNKLDPRGLH Hund (220) LPASCLLARAAIACSNVKMKHIPALTDPGLATLYLAENEIAKIPAHAFRGLPNLQWLDLSKNKLDAQGLH
nsensus (281) LPASCLLA A IAC NVKMKHIPALT PGL TLYLAENEIAKIPAH F GLPNL WLDLSKNKLD GLH 351 420
Ko Mensch (317) PHAFKNLMRLKRLNLVGNSLTTVPALPASLQELKLNDNLLQGLQGSSFRGLSQLLTLEE----------- Hund (290) PDAFKNLTRLKRLNLDGNSLAAVPALPASLQELKLNDNVLQGLQHSSFRGLSRLLTLEVEGNQLHDGNIS
nsensus (351) P AFKNL RLKRLNL GNSL VPALPASLQELKLNDNLLQGLQ SSFRGLS LLTLE 421 490
Ko Mensch (376) ---------------------------------LHLGTNLIEEVAEGALSHIHSLSVLVLSHNWLQEHWL Hund (360) PLAFQPLHSLLYLRLDRNHLRTIPPGLPASLRELHLGTNVIEEVTEGMLNHSHSLSVLVLSNNQLQEDRL Konsensus (421) LHLGTNLIEEV EG L H HSLSVLVLS N LQE L 491 560 Mensch (413) APRAWIHLPKLETLDLSYNRLVHVPRFLPRGLRRLTLHHDHIERIPGYAFAHMKPGLEFLHLSHNRLQAD Hund (430) APRAWTDLPKLEVLDLSHNRLARVPSSLPRGLRRLTLHHNRIERIPAYVFAHMRPGLELLRLSHNSLRTD Konsensus (491) APRAW LPKLE LDLSHNRL VP LPRGLRRLTLHH IERIPAY FAHMKPGLE L LSHN L D
630 561 Mensch (483) GIHSVSFLGLRASLAELLLDHNQVQAIPRGLLGLKGLQVLGLSHNRIRQVPLNSICDMRVAQDSNLTSTH Hund I-----------------------
nsensus I 631 667
äuresequenzen von ECM3 zwischen Mensch und
(500) GIRGASFLGLRSSLAELLLDHNQLRAIPRGLLGLRGLQVLHLSHNE (561) GI SFLGLRASLAELLLDHNQL AIPRGLLGLKGLQVL LSHN Ko
Mensch (553) LENNLIDRRRIPPTAFSCTRAYHSVVLQPQRRGEEGS Hund (547) ------------------------------------- Konsensus (631) Abb. 4.5: Alignment der putativen Aminos
Hund.
Auch im Vergleich zur ersten „genome assembly“-Version vom Rind
(http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/bovine) zeigen sich hohe Übereinstimmungen
zwischen ECM3 und Contigs des Rinds (Scaffold36004 und Scaffold221643 (Abb.
4.6)), so dass man davon ausgehen kann, dass ECM3 auch im Rind konserviert und
somit höchst wahrscheinlich funktionell ist.
Abb. 4.6: Percent identity plot (PIP). Interspeziesvergleich des ECM3-Gens zwischen Mensch und Rind mittels PipMaker. Als Vergleichssequenzen wurden beim Rind die Scaffolds 36004 und 221643 verwendet, die jedoch erst bei Exon 5 beginnen. Sequenzinformationen aus dem Bereich von Exon 1-4 des Rindes standen nicht zur Verfügung (Stand: August 2005). Die schwarzen waagerechten Balken geben jeweils die prozentuale Identität des genomischen Bereichs zwischen Mensch und Rind an. Die menschlichen Exons des humanen ECM3 sind grün markiert.
- 108 -
Diskussion
- 109 -
Zur Interpretation dieser Befunde kann ein Dendrogramm herangezogen werden,
das ausschließlich die Sequenzidentität der DNA verschiedener Spezies zueinander
berücksichtigt (Thomas et al., 2003; Abb. 4.7). Die Abbildung zeigt die
Verwandschaftsverhältnisse der untersuchten Spezies. Die Daten sprechen dafür,
dass vor der Trennung von Maus und Ratte eine Funktion von ECM3 nicht mehr
erforderlich war, so dass das Gen keinem evolutionären Druck ausgesetzt war,
Mutationen aquiriert hat, und so seine Funktion in Maus und Ratte verloren ging.
4.1.2.3 ECM3- Expression in Knorpelbiopsaten von Patienten mit Osteoarthrose oder rheumatoider Arthritis
Da die vorliegenden EST-Daten zu ECM3 in den Datenbanken für eine verstärkte
Expression in Osteoarthrose-Knorpel sprechen, wurde dieser Aspekt in der
vorliegenden Arbeit näher untersucht.
Die fortschreitende Zerstörung des Knorpels während der Osteoarthrose beruht auf
einem Ungleichgewicht anaboler und kataboler Prozesse in der Knorpelmatrix
(Lohmander, 2000; Fernandes et al., 2002; Martel-Pelletier, 2004). Die Ursachen für
das Ungleichgewicht sind zum größten Teil noch unverstanden. Durch
Expressionsanalysen und RNA-in-situ-Hybridisierungen konnte gezeigt werden, dass
Chondrozyten versuchen, den degradierten Knorpel durch fehlgesteuerte
kompensatorische Mechanismen zu reparieren und zu regenerieren. Dazu beginnen
die Chondrozyten schwach zu proliferieren, bilden so genannte Brutnester aus
(Sandell und Aigner, 2001) und dedifferenzieren zu einem fibroblasten-ähnlichen
: Evolutionäre Verbindung zwischen einzelnen Spezies der Klasse der Mammalia. odifiziert nach Thomas et al., 2003.
Abb. 4.7M
Diskussion
Phänotyp. Mit der Dedifferenzierung wird auch die Synthese extrazellulärer
Matrixkomponenten verändert. Dies führt zur Verringerung der Aggrekan- und
ECM-Bestandteilen
tsch-Prehm et al., 1992;
chgewiesen (siehe Abb. 3.21). Im Vergleich zu Plazentagewebe, das
on insgesamt 73 untersuchten adulten Geweben (siehe Abb. 3.19) die stärkste
hen
atienten eine bis zu 21fach höhere Expression an ECM3 in den Knorpelproben.
Kollagen Typ II-Synthese, zur gesteigerten Expression von Kollagen Typ I, III und V
(Sandell und Aigner, 2001; Miosge et al., 2004), sowie zur Bildung von
knochenspezifischen Proteinen. Zu diesen gehören die alkalischen Phosphatasen,
Osteocalcin und Osteopontin (Pullig et al., 2000a; 2000b) und das für hypertrophe
Chondrozyten spezifische Kollagen Typ X (Girkontaite et al., 1996). Während die
dedifferenzierten Chondrozyten unter Kalzifizierung der Matrix in die Apoptose
übergehen, versuchen Chondrozyten, die ihren normalen Phänotyp beibehalten
haben, durch erhöhte Expression von physiologischen Knorpel-
den Matrixverlust auszugleichen. Für die Osteoarthrose wurden hierbei unter
anderem für Tenascin (Salter, 1993), Fibronektin (Brown und Jones, 1990; Lorenzo
et al., 2004), sowie für Kollagen Typ II und VI (Aigner et al., 1992; Hambach et al.,
1998) Transkriptionssteigerungen beschrieben. Andere wichtige Bestandteile der
extrazellulären Matrix, die während des Verlaufes der Osteoarthrose eine
Veränderung in ihrer Expression erfahren, sind Proteoglykane. Aggrekan wird in den
oberen osteoarthrotischen Gelenkknorpelzonen herunterreguliert, in den unteren
Zonen hingegen konnte eine verstärkte Expression beobachtet werden (Aigner et al.,
1997). Auch bei den SLRPs wie Biglykan, Decorin und Fibromodulin konnte eine
verstärkte Bildung und eine erhöhte Expression der korrespondierenden mRNAs in
späten Stadien der Osteoarthrose nachgewiesen werden (Wi
Cs-Szabo et al., 1995; Poole et al., 1996; Cs-Szabo et al., 1997; Bock et al., 2001).
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass homozygote knockout-Mäuse, bei denen
Decorin oder Fibromodulin inaktiviert wurde, eine Prädisposition zur Osteoarthrose
besitzen (Ameye und Young, 2002; Gill et al., 2002).
In der vorliegenden Arbeit wurde mittels quantitativer „Real-Time“-PCR die
Expression von ECM3 im Knorpel von Osteoarthrose-Patienten untersucht. Während
in adulten, gesunden Knorpelresektaten keine Expression von ECM3 detektiert
werden konnte, wurde bei einigen Osteoarthrose-Patienten eine deutliche
Expression na
v
Expression an ECM3 aufwies, zeigten die Knorpelbiopsate von osteoarthrotisc
P
Auffällig war die ausgeprägte Variabilität der Expression innerhalb des
Patientenkollektivs, wobei keine Korrelation zwischen Schweregrad der Erkrankung
- 110 -
Diskussion
und der ECM-Expression festgestellt werden konnte. Das Phänomen der variablen
Expressivität von Genen wird in der Literatur von verschiedenen Arbeitsgruppen
auch bei unterschiedlichen Methoden zur Analyse der Genexpression für die
Osteoarthrose beschrieben (Nguyen et al., 1992; Cs-Szabo et al., 1997;
Chubinskaya et al., 1997; Gehrsitz et al., 2001; Lorenzo et al., 2004). Die Ursachen
ne Referenz der quantitativen PCR wurde β2-Mikroglobulin ausgewählt
renzgene festgestellt wurden
Arbeiten vordringlich, weitere Patienten
für diese Variabilität liegen vor allem darin, dass die Mechanismen, die zur
Osteoarthrose führen, bisher noch unverstanden sind. Diskutiert werden unter
anderem „Modifier-Gene“, Einstufungen der Schweregrade, Prozedur der
Knorpelentnahme, Belastung der Gelenke vor Entnahme des Knorpels etc..
Ähnlich wie bei der Osteoarthrose handelt es sich auch bei der rheumatoiden
Arthritis um einen degenerativen Prozess, dessen Krankheitsverlauf ähnlich der
Osteoarthrose verläuft (siehe Kapitel 1.2.3). Dementsprechend zeigt ECM3 bei
Patienten mit rheumatoider Arthritis eine ähnliche Expressionsverteilung wie bei
Osteoarthrose-Patienten (siehe Abb. 3.22). Auch hier zeigt sich, dass ECM3 in den
Knorpelbiopsien der Patienten stärker exprimiert wird als in Plazenta. Zudem ist
ebenfalls keine offensichtliche Korrelation zwischen dem Schweregrad der
Erkrankung und der Expressionsstärke von ECM3 zu erkennen.
Als endoge
(Schmittgen und Zakrajsek, 2000; Lupberger et al., 2002; Radonic et al., 2004). Im
Gegensatz zu GAPDH, β-Aktin oder HPRT (Sellner und Turbett, 1996; Lupberger et
al., 2002) besteht für β2-Mikroglobulin keine Gefahr der Koamplifikation eines
Pseudogens. Somit konnte bei der RNA-Isolation auf einen DNAse-Verdau verzichtet
werden. Neue Studien zeigten jedoch, dass β2-Mikroglobulin in
Osteoarthroseknorpeln eventuell verstärkt exprimiert werden könnte (Zhang et al.,
2002). Obwohl in der vorliegenden Arbeit keine signifikanten Unterschiede zwischen
β2-Mikroglobulin, 18S-RNA und GAPDH als Refe
(Daten nicht gezeigt), sollte bei weiteren Studien eine mögliche Beteiligung von β2-
Mikroglobulin an der Osteoarthose berücksichtigen werden.
Zusammenfassend zeigen die Analysen eine starke Expressionssteigerung von
ECM3 in Knorpelresektaten einzelner Patienten mit Osteoarthrose oder rheumatoider
Arthritis. Aufgrund der extremen Expressionsunterschiede zwischen einzelnen
Patienten und Kontrollen wäre es für weitere
auf eine Korrelation der Expression von ECM3 mit einem bestimmten
Krankheitsverlauf oder mit der Expression weiterer Gene (Marker) zu untersuchen.
Dies würde Aussagen über eine mögliche Beteiligung von ECM3 an den
- 111 -
Diskussion
Pathomechanismen der Arthrose bzw. den Einsatz als prognostischer Marker
ermöglichen.
4.1.2.4 ECM3 als positioneller Kandidat für Frontometaphysäre Dysplasie Ausgangspunkt der Untersuchung war eine Patientin, die sowohl Symptome einer
Periventrikulären Nodulären Heterotopie (PVNH), als auch typische Merkmale einer
Frontometaphysären Dysplasie (FMD) aufwies (siehe Kapitel 1.2.1 und Kapitel
3.4.5). Während für die PVHN Mutationen im Protein Filamin A (FLNA), die zu einem
Funktionsverlust führen, verantwortlich gemacht werden konnten, war zu Beginn der
ier vorliegenden Arbeit die Krankheitsursache für FMD unbekannt und sollte in einer
en) aufgeklärt werden.
ie PVHN (MIM 300049) ist eine Hirnfehlbildung, die ihre Ursache in einer abnormen
ngen für den FMD-Phänotyp der Patientin.
Deletionen oder Inversionen nachzuweisen, wurden BAC-Klone (bacterial artificial
h
Kooperation mit Dr. Zenker (Institut für Humangenetik, Erlang
D
neuronalen Wanderung hat: eine Gruppe von Neuronen kann nicht in die sich
entwickelnde Hirnrinde einwandern und bleibt in einer Vielzahl von Knötchen an der
Oberfläche der Ventrikel liegen. Diese Knötchen sind im MRI leicht darstellbar. Die
klassische PVNH ist eine bei Männern seltene, X-chromosomal-dominant vererbte
Krankheit. Die Betroffenen sind geistig normal bis grenzwertig geistig retardiert. Sie
haben zerebrale Krampfanfälle unterschiedlicher Schwere und als nicht-
neurologische Symptome Herzfehler und Gerinnungsstörungen. Im Allgemeinen ist
die Krankheit beim männlichen Geschlecht pränatal letal, jedoch wurden in der
letzten zeit einige wenige männliche Fälle mit X-chromosomaler PNVH beschrieben.
Ursache der X-chromosomalen PNVH sind Mutationen in FLNA (Filamin A), die zu
einem Verlust der Proteinfunktion führen (Fox et al., 1998; Sheen et al. 2001; Moro et
al., 2002).
Nachdem bei der Patientin durch Mutationsscreening Missensmutationen und
schmale Deletionen/Insertionen in der codierenden Region von FLNA
ausgeschlossen wurden (Untersuchungen erfolgten in einem externen Labor), lag die
Vermutung nahe, dass die Patientin ein so genanntes „contiguous gene syndrom“
(Verlust mehrerer benachbarter Gene auf einem Chromosomenabschnitt) aufweist,
wobei eines der betroffenen Gene FLNA sein müsste. FLNA liegt auf Xq28 in direkter
Nachbarschaft zu ECM3. Aus diesem Grund erschien ECM3 als gutes positionelles
Kandidate
Um größere Veränderungen innerhalb der betroffenen chromosomalen Region wie
- 112 -
Diskussion
chromosomes) eingesetzt und FISH-Analysen durchgeführt, die jedoch keine
Auffälligkeiten zeigten (siehe Abb. 3.23). Auch SNP (single nucleotide
polymorphism)-Analysen an der Patientin und deren Eltern ergaben keinen Hinweis
auf deletierte Bereiche um ECM3 und FLNA.
Zeitgleich konnte eine englische Arbeitsgruppe (Robertson et al., 2003) zeigen, dass
„gain of function“-Mutationen in FLNA zu FMD führen. Aufgrund dieses Befundes
wurde von Dr. Zenker (Institut für Humangenetik, Erlangen) die Mutationssuche in
FLNA wiederholt, wobei sich eine heterozygote de novo-Mutation c.7315C>A
(NM_001456) in Exon 45 des FLNA zeigte. Diese konnte für beide Phänotypen
(PHNV und FMD) der Patientin verantwortlich gemacht werden. Die Mutation führt zu
zwei abberanten Transkripten: Ein normal langes Transkript mit einer Substitution
von L2439M und ein um 21bp verkürztes Transkript, welches durch die Bildung einer
neuen Spleiß-Donorsite entsteht. Es konnte gezeigt werden, dass das verkürzte
Fragment zu einem Funktionsverlust von FLNA führt und die Ursache für die PNVH
darstellt. Die Substitution L2439M führt indes zu veränderten Bindungseigenschaften
von FLNA mit seinen Interaktionspartnern und ist somit ursächlich für die FMD (Zenker et al. 2004).
4.2 Kandidatengene für die Kraniosynostose Kraniosynostosen zeichnen sich durch den frühzeitigen Verschluss einer oder
mehrerer Schädelnähte aus und treten mit einer Häufigkeit von 1: 2100 bis 1:3200
auf (Cohen, 2000). Sie sind auf Defekte der desmalen Ossifikation während der
Schädelentwicklung zurückzuführen. Die Äthiologie der Kraniosynostosen ist sehr
heterogen. Syndromale Formen zeigen in der Regel einen autosomal dominanten
Erbgang und eine hohe intra- und interfamiliäre Variabilität, wohingegen für die nicht-
syndromalen Kraniosynostosen sowohl genetische als auch Umweltfaktoren
diskutiert werden (Cohen und MacLean, 2000). Syndromale Formen können anhand
ihrer phänotypischen Merkmale in etwa 100 unterschiedliche Syndrome unterteilt
werden (Winter und Baraitser, 1994;, Muenke und Wilkie, 2001). Sie unterscheiden
sich durch die Art der betroffenen Schädelnaht, kraniofaziale Anomalien, assoziierte
Extremitätenanomalien und Fehlbildungen anderer Organsysteme. Wichtige
Informationen über Gene und Genpathways, die an der Entwicklung und dem
Verschluss der Schädelnähte beteiligt sind, stammen von Untersuchungen an
syndromalen Kraniosynostoseformen. Dennoch sind erst einige dieser Syndrome
- 113 -
Diskussion
aufgeklärt und die Biologie der Schädelnähte noch weitgehend unverstanden. In der
vorliegenden Arbeit sollte durch eine Patienten-basierte Analyse das Verständnis für
die Ursachen der Kraniosynostosen vertieft und mögliche weitere genetische
ller
ntersuchten Crouzon-Syndrom-Patienten konnten Mutationen in FGFR2 oder
t werden (Jabs et al., 1994; Wilkie et al.,
995; Passos-Bueno et al., 1999; Kan et al., 2002; de Ravel et al., 2004). Das
Faktoren, die für die Kraniosynostose verantwortlich sein könnten, identifiziert
werden.
Ausgangspunkt der Untersuchung war ein zehn Wochen alter, männlicher Patient mit
Brachyzephalie1, Proptosis2, Hypoplasie3 des Mittelgesichts und einem niedrigen
Ohransatz. Eine Dreidimensionale-Kraniale-Computertomographie zeigte einen
vorzeitigen Verschluss der Lambdanähte, sowie einen partiellen Verschluss der
posterioren Seite der Sagitalnaht mit einer weit geöffneten anterioren Fontanelle
(ausführliche Patientenbeschreibung siehe Kapitel 3.5.1). Aufgrund seines
Aussehens wurde beim Patienten ein Crouzonähnliches-Syndrom diagnostiziert. Das
Crouzon-Syndrom (MIM 123500) ist eine autosomal dominante Kraniosynostose mit
einer Häufigkeit von 1:60000 (Cohen und Kreiborg, 1992) und gehört mit 5% zu den
häufigsten syndromalen Kraniosynostosen (Kabbain und Raghuveer, 2004). Der
Phänotyp umfasst neben einer kranialen Synostose, Proptosis, Strabismus4,
okulären Hypertelorismus5 und eine Progenie6 des Unterkiefers. Bei ca. 50% a
u
FGFR3 als genetische Ursache detektier
1
Crouzon-Syndrom wird damit zu den so genannten „FGFR-zugehörigen
Kraniosynostosen“ (http://www.geneclinics.org/profiles/craniosynostosis /details.html)
gezählt, zu denen das Münke-Syndrom (MIM 602849), das Jackson-Weiss-Syndrom
(MIM 123150), das Apert-Syndrom (101200), das Pfeiffer-Syndrom (MIM 101600)
das Beare-Stevenson-Syndrom (MIM 123790) und das Crouzon-Syndrom mit
Acanthosis nigricans (MIM 123500) gehören. Diesen Syndromen ist gemeinsam,
dass sie durch Mutationen in den Genen FGFR1-3 hervorgerufen werden. Zudem
zeichnen sich diese Syndrome durch einen bilateralen Verschluss der Koronarnähte
aus. Eine Ausnahme bildet das Münke-Syndrom. Hier tritt entweder eine einseitige
Koronarnahtsynostose oder eine Megalenzephalie ohne Kraniosynostose auf. Da bei
1 Brachyzephalie = sog. Kurz-, Rund- oder Breitköpfigkeit mit Abflachung des Hinterkopfes. 2 Proptosis = vorgetriebener Augapfel 3 Hypoplasie = angeborene oder anlagebedingte Unterentwicklung eines Organismus, Organs oder Gewebe 4 Strabismus = Schielen 5 Hypertelorismus = überweiter Abstand zwischen zwei Organen 6 Progenie = in Bezug auf die Schädelbasis zu weit vorne liegende Unterkieferbasis mit Überbiss der Schneidezähne
- 114 -
Diskussion
dem in der vorliegenden Arbeit untersuchten Patienten ein Verschluss der
Lambdanaht diagnostiziert wurde, unterscheidet er sich von dem typischen Crouzon-
Syndrom-Phänotyp. Dies wurde durch das Fehlen von Mutationen in den Genen
FGFR2-3, die in Vorarbeit Greven (2004) ausgeschlossen werden konnten, bestätigt.
Demgegenüber ergab sich in der Standard-Chromosomenanalyse eine balancierte
de novo-Translokation zwischen den Chromosomen 9q33 und 11p15 (t(9;11)
(q33;p15)). Dr. Vera Kalscheuer (Max-Plack-Institut für Molekulare Genetik, Berlin)
konnte über FISH-Analysen zwei bruchpunktüberspannende BAC-Klone
identifizieren.
Basierend auf diesen Vorarbeiten wurden in der vorliegenden Arbeit über Southern-
Blot- und PCR-Experimente die Bruchpunktfragmente identifiziert und sequenziert.
Auf Chromosom 11 liegt der Bruchpunkt im Gen für den Transkriptionsfaktor SOX6
und auf Chromosom 9 in einem genomischen Bereich, in dem hochkonservierte,
nicht-kodierende Sequenzabschnitte (highly conserved non-genic sequences
(CNGs)) vorkommen. Die Charakterisierung von Bruchpunkten in Patienten mit
balanciertem chromosomalen de novo-Rearrangement ist ein gängiges Verfahren
zur Identifizierung von Krankheitsgenen (Vortkamp et al., 1991; Tao et al., 2004).
Wichtiger zu beachtender sind dabei mögliche Positionseffekte, die die Expression
der zum Bruchpunkt benachbarten Gene beeinflussen (Lettice et al., 2000;
Dlugaszewska et al., 2001). Die veränderte Expression vom Bruchpunkt bis zu 1 mb
entfernten Genen könnte dann ursächlich für die Kraniosynostose sein (Pfeifer et al.,
999). Im Folgenden werden daher nicht nur die direkt betroffenen chromosomalen
ereiche, sondern auch mögliche Positionseffekte benachbarter Gene diskutiert.
.2.1 Bruchpunktregion 11p15.2
er Bruchpunkt in der Region 11p15.2 liegt zwischen Exon 6 und 7 des SOX6-Gens
nd sollte daher zu einer kompletten Inaktivierung eines SOX6-Allels führen. SOX6
RY (sex determining region Y)-box 6) ist ein Mitglied der SOX-Gen-Familie. Die ca.
Mitglieder der SOX-Familie gehören zu einer
1
B
4 D
u
(S
30 Subfamilie der DNA-bindenden
Proteine mit einer HMG (high mobility-group)-Domäne (Lefebvre et al., 1998). Diese
Proteine sind in eine Reihe von Entwicklungsprozessen wie
Geschlechtsdetermination, Neurogenese und Skelettentwicklung involviert (Laudet et
al., 1993; Pevny und Lovell-Badge, 1997; Southard-Smith et al., 1998). Es konnte
gezeigt werden, dass SOX6 zusammen mit SOX5 (LSOX5) und SOX9 an einer
- 115 -
Diskussion
Reihe von Entwicklungsprozessen während der Chondrogenese beteiligt ist
(Lefebvre et al., 1998; Smits et al., 2001; Akiyama et al., 2002; Lefebvre, 2002; Ikeda
et al., 2004; siehe Kapitel 1.1.1). Zusätzlich erwies sich, dass SOX9 und LSOX5 an
der Neuralleistenentwicklung (Ceung und Briscoe, 2003; Perez-Alcala et al., 2004)
involviert sind, was eine Beteiligung von SOX6 an diesem Prozess vermuten lässt.
Sowohl Teile der Schädeldachknochen als auch Teile der Schädelnähte nehmen
ihren Ursprung in Zellen der Neuralleiste (Helms et al., 2005), so dass Gene, die an
Entwicklung, Migration und Differenzierung der Neuralleistenzellen beteiligt sind,
ermutlich auch Einfluss auf die Entwicklung der Schädeldachknochen nehmen. Um
Rolle bei der Entwicklung der
ion von Sox6 in der Stirn- und
v
der Frage nachzugehen, ob SOX6 eine
Schädeldachknochen und -nähte spielt, wurden RNA-in situ-Hybridisierungen mit
Sox6-Sonden an transversalen Kopfschnitten von neugeborenen Mäusen
durchgeführt. Es konnte jedoch keine Express
Koronarnaht nachgewiesen werden. Darüber hinaus zeigen Sox5 -/-;Sox6 -/- Doppel-
knockout Mausmutanten trotz vielfältiger Chondrodysplasien keine Fehlentwicklung
der desmalen Ossifikation (Smits et al., 2001) und demnach auch keine
Entwicklungsstörung in der Schädeldachbildung. Dies spricht gegen eine durch einen
Funktionsverlust von SOX6 induzierte Kraniosynostose beim untersuchten Patienten.
Denkbar wäre jedoch, dass durch die Translokation eine kurze, stabile mRNA
entsteht, die zu einem trunkierten Protein translatiert wird. Das trunkierte Protein, das
aus Exon 1-6 bestehen würde, besäße noch seine „coiled-coil“-Region, die wichtig
für die Interaktion mit anderen Proteinen ist (Abb. 4.8). Es wäre daher möglich, dass
es zu einer kompetetiven Bindung von SOX6 mit einem Interaktionspartner kommt
und dieser dominant-negative Effekt zur Ausbildung der Kraniosynostose führt. Da
SOX6 nicht in lymphoblastoiden Zelllinien exprimiert wird und Gewebeproben vom
Patienten nicht zur Verfügung standen, konnte ein mögliches trunkiertes Protein
beim Patienten nicht nachgewiesen werden.
Abb. 4.8: Schematische Darstellung der genomischen Organisation und der Proteinstruktur von SOX6. Die 16 Exons (blau) kodieren für ein 808 Aminosäure langes Protein (grüner Balken). Dargestellt ist die „coiled-coil“-Region (blaue Box), die Bindestelle für CtBP2 (lila Box) und die HMG-Domäne (orange Box) in der Proteinsequenz. Der rote Blitz symbolisiert den Bruchpunkt beim untersuchten Patienten. Durch rote Ballons sind die beim Mutationsscreening gefundenen Missensmutationen und durch grüne Ballons SNPs markiert.
1 3 5 9 11 13 16
N- -C
1
808
184
261
424
429
600
670
4
- 116 -
Diskussion
Um der Frage nachzugehen, ob eine Mutation im SOX6-Gen eine häufige Ursache
für Kraniosynostosen sein könnte, wurden die kodierenden Exons (2-16) des SOX6-
Gens bei 104 Patienten mit unterschiedlichen, zumeist nicht-syndromalen
Kraniosynostosen (ohne FGFR-Mutationen) auf mögliche Mutationen untersucht. Die
einzige gefundene Mutation bei einem Patienten führte zu einem Austausch von
Asparaginsäure zu Asparagin (pD68N). Die betroffene Aminosäure lag im N-
Terminus von SOX6 und kann keiner funktionellen Domäne zugeordnet werden. Die
Aminosäure ist evolutionär bis zum Zebrafisch hoch konserviert (Daten nicht gezeigt)
und konnte in 103 Patienten mit Kraniosynostose und 100 Kontrollpersonen nicht
detektiert werden. Jedoch wurde der Austausch auch in der nicht betroffenen Mutter
des Patienten gefunden. Daher bleibt die Frage zunächst ungeklärt, ob es sich bei
die in verschiedene zelluläre Prozesse involviert sind, zur Armadillo-Repeat
Superfamilie (http://www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR000225). Aufgrund der
diesem Austausch um einen seltenen Polymorphismus handelt oder ob er ursächlich
für die Kraniosynostose ist. Im letzten Fall könnte eine reduzierte Penetranz oder
eine variable Expressivität bei der Mutter vorliegen.
Weitere Kandidatengene in der Region 11p15.2
Denkbar ist, dass der Verlust eines SOX6-Allels nicht für den Phänotyp des
Patienten verantwortlich ist, sondern andere benachbarte Gene durch die
Translokation in ihrer Aktivität verändert werden.
Bei der Betrachtung der Region um den Bruchpunkt auf Chromosom 11p15.2 konnte
über Interspeziesvergleiche ein neues Gen identifiziert werden, welches bis zum
Kugelfisch evolutionär konserviert ist (siehe Abb. 3.31). Das Gen liegt ca. 700 kb
distal von SOX6 und kann aufgrund seiner Lage als potentielles Kandidatengen für
die Kraniosynostose angesehen werden. Die 12 Exons des offenen Leserahmens
umfassen 1596 bp (532 Aminosäure). Datenbanksuchen führten zum UniGene-
Cluster Hs.374080, der 39 ESTs repräsentiert. Die ESTs stammen zum größten Teil
aus Hoden, Brustdrüse, Auge und Blut. Ein Homologievergleich der
Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens mit der Proteindatenbank „Pfam“
zeigte fünf Armadillo/beta-catenin-like Repeats. Armadillo/beta-catenin-like Repeats
sind 40 Aminosäuren lange, tandemähnliche Wiederholungen, die in Protein-Protein-
Interaktionen involviert sind. Zum ersten Mal wurden diese Wiederholungen für
Armadillo, einem Protein aus Drosophila, das in verschiedene Entwicklungsprozesse
involviert ist, beschrieben (Pfeiffer et al., 1993). Mittlerweile gehören 647 Proteine,
- 117 -
Diskussion
Armadillo/beta-catenin-like Repeats wird das auf Chromosom 11p15.2 identifizierte
Gen im Weiteren ARM1 genannt. Erste RNA-in-situ-Hybridisierungen an
Koronarnähten von transversal geschnittenen, neugeborenen Mausköpfen konnten
zwar keine eindeutige Expression nachweisen. RNA-in situ-Hybridisierungen an
Parafinschnitten von arthrotischem Gelenkknorpel beim Menschen zeigen jedoch,
dass ARM1 hier sowohl in Chondrozyten, als auch in Osteoblasten schwach
exprimiert wird (siehe Abb. 3.33). Ein weiterer Hinweis auf eine mögliche Beteiligung
von ARM1 an der desmalen Ossifikation und damit an der Schädelnahtentwicklung
-Richtung von SOX6 lokalisiert ist. Dieses Gen umfasst genomisch 6,5 kb
nd besteht aus 6 Exons. CALCA codiert für 2 Proteine, die durch alternatives
lcitonin, das aus Exon 1-4
t, hmen enthält. Das Präprohormon besteht
illyard et al., 1983). Als Medikament wird Calcitonin zur Inhibition
ergab sich bei einer Northern-Blot-Hybridisierung mit einer Arm1-Sonde an
unterschiedlichen murinen Geweben (siehe Abb. 3.31). Bei dieser ergab sich ein ca.
1,8 kb großes Transkript in der RNA aus dem Schädel einer neugeborenen Maus.
Obwohl RNA-in-situ-Hybridisierungen mit Arm1 an den Nähten der neugeborenen
Mäuse kein Signal ergaben, sprechen sowohl der Northern-Blot als auch der
Nachweis von ARM1 in Osteoblasten von arthrotischem menschlichen Knorpel dafür,
dass ARM1 an der desmalen Ossifikation und damit potentiell auch an der
Schädelnahtentwicklung beteiligt sein könnte. Dies müsste jedoch durch weitere
Expressionsuntersuchungen und Patientenstudien verifiziert werden.
Geht man von einem Bereich von ca. 2 mb um den Bruchpunkt aus, so kommen
noch eine Reihe von Genen durch ihre Nähe zum Bruchpunkt und ihrer Funktion als
Kandidaten für eine Beteiligung an der Schädelnahtentwicklung in Frage. Zu diesen
Genen gehörten u.a. CALCA (calcitonin-related polypeptide, alpha), das ca. 800 kb
in Telomer
u
Spleißen entstehen. Das erste Protein ist das Hormon Ca
esteh wobei Exon 4 den offenen Leserab
aus 141 Aminosäuren, das Hormon aus 32 Aminosäuren (Breimer et al., 1988).
Exprimiert wird das Gen in den parafollikulären Zellen der Schilddrüse. Durch
Hemmung der Calciumfreisetzung aus dem Knochen und durch eine gesteigerte
Calciumausscheidung im Urin senkt Calcitonin als Antagonist des Parathormons den
Blutcalciumspiegel und trägt so zur Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase des
Organismus bei (H
des Knochenverlustes bei Osteoporose eingesetzt (Mehta et al., 2003). Das zweite
Proteinprodukt von CALCA besteht aus Exon 1-3, 5 und 6, wobei Exon 5 das Protein
(CGRP-α, calcitonin gene-related peptide) kodiert. Das Neuropeptid CGRP wird in
den Neuronen des peripheren und zentralen Nervensystems exprimiert und ist ein
- 118 -
Diskussion
starker Vasodilatator7, dessen vermuteter Effekt auf die Knochen in einer Förderung
der Knochenbildung besteht, indem es die Knochenresorption inhibiert (Roos et al.,
1986; Owan und Ibaraki, 1994; Akopian et al., 2000). In vivo konnten Hoff et al.
(2002) zeigen, dass bei CT/CGRP-/--knockout-Mäusen die Osteoblasten und
Osteoklastenzahlen zwar unverändert sind, die Knochenbildung jedoch signifikant
erhöht (2-fach) ist. Dies resultiert in einer deutlich gesteigerten (80% vermehrten)
Knochenmasse in Wirbelsäule und Röhrenknochen. Der Knochenmasseanstieg ist
bereits im Alter von einem Monat nachweisbar und steigt bei drei Monate alten
Tieren weiter an (Hoff et al., 2002). Obwohl bei den Knockout-Mäusen keine
Kraniosynostose beschrieben wurde, könnte eine Expressionssteigerung von CALCA
als Folge der Translokation zu einem vorzeitigen Verschluss der Schädelnähte bei
dem untersuchten Patienten beitragen.
Zwischen CALCA und SOX6 liegt CALCB (calcitonin-related polypeptide, beta MIM
114160), ein weiteres Gen der CALC-Familie. Das Gen kodiert für ein 37
Aminosäuren langes Neuropeptid (CGRP-β) und zeigt eine hohe Homologie zu
CGRP-α. Die Funktion des Neuropeptids ist noch ungeklärt, jedoch lässt sich
aufgrund der hohen Homologie zwischen CGRP-α und CGRP-β vermuten, dass
beide Peptide eine ähnliche Funktion haben. 2,2 mb distal von SOX6 liegt PTH
(Parathormon). PTH ist ein Hormon der Nebenschilddrüse und hat diverse
Funktionen bei der Knochenbildung inne (Murray et al., 2004; Rowe, 2004). PTH wird
bstand von 2,2 mb zum
in der Literatur sowohl als Antagonist zu Calcitonin (Kurbel et al., 2003) als auch im
Zusammenhang mit Kraniosynostosen (Satokata et al., 2000; Oktenli et al., 2002)
diskutiert und ist damit zusammen mit CALCA und CALCB ein interessantes
Kandidatengen für die Schädelnahtentwicklung. Der A
Bruchpunkt ist allerdings sehr groß, so dass ein Positionseffekt unwahrscheinlich
erscheint.
4.2.2 Die Bruchpunktregion 9q33.1 Interessanterweise wurde 1978 ein Patient mit einer interstitialen de novo-Deletion
des Chromosoms 9q32-q34 beschrieben (Turleau et al., 1978). Der Phänotyp des
Patienten ähnelte dem kraniofazialen Phänotyp des in der Arbeit untersuchten
Patienten. Die Deletion könnte die Region des Bruchpunktes umfassen und wäre ein
7 Vasodilatator = blutgefäßerweiterndes Mittel
- 119 -
Diskussion
Hinweis auf eine Beteiligung der chromosomalen Region 9q33.1 an der
Kraniosynostose.
Der Bruchpunkt in der Chromosomenregion 9q33.1 konnte in einem Bereich
lokalisiert werden, in dem sich interessanterweise keine bekannten oder
hypothetischen Gene befinden (siehe Abb. 3.30). Auffällig ist, dass sich hier in einer
Region von 1 mb im Bereich der Bruchpunktregion jedoch Sequenzabschnitte finden,
die zwischen den Spezies Mensch, Maus und Huhn hochkonserviert sind (>70%,
>350bp, siehe Abb.3.31). Mittels Expressionsanalysen und RT-PCR an
verschiedenen Mausgeweben konnte eine Transkription dieser Bereiche weitgehend
ausgeschlossen werden. Das lässt vermuten, dass es sich hier um evolutionär-
konservierte, jedoch nicht kodierende DNA handelt. Neue Untersuchungen zeigen,
dass ungefähr 3-3,5% der genomischen Sequenz zwischen Mensch und Maus
konserviert ist (Waterston et al., 2002; Chiaromonte et al., 2003), wovon nur etwa
1,2% für Proteine kodieren (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001). Die
konservierten Bereiche umfassen vor allem regulatorische Elemente (transkriptionale
Regulatoren und Spleiß-Kontrolle), RNA-Gene, micro-RNAs (miRNAs),
Matrixbindungsstellen, Replikationsorigins, sowie weitere funktionelle Elemente,
deren Funktion bis heute ungeklärt ist (Bejerano et al., 2004). Es werden prinzipiell
verschiedene Arten von Konservierungsgraden unterschieden. Als „ultrakonservierte“
Elemente werden diejenigen Sequenzen bezeichnet, die zwischen Mensch und
Maus über mindestens 200 bp zu 100% identisch sind und auch zwischen Mensch
und Huhn eine 95-99%ige Sequenzübereinstimmung aufweisen (Bejerano et al.,
2004). Diese Elemente liegen meistens überlappend mit Exons, in intronischen
Bereichen oder in der Nähe von Genen. Sie sind an der RNA-Prozessierung, sowie
in die Regulation der Transkription oder der Regulation von Entwicklungsprozessen
(Mattick, 2003) beteiligt.
Die nächste Klasse beinhaltet Sequenzen, die zwischen den einzelnen Vertebraten
über 100 bp zu 100% konserviert sind. Die Funktion dieser Sequenzen ist derzeit
noch vollständig unbekannt. Es wird vermutet, dass diese Sequenzen für die
Ontogenese von Bedeutung sind (Bejerano et al., 2004).
Eine weitere Klasse konservierter Sequenzen zeichnet sich dadurch aus, dass sie in
Clustern angeordnet sind und große genomische Bereiche (~ 1 mb) umfassen. Diese
werden als CNGs (conserved non-coding sequences) bezeichnet. Die
Sequenzidentität liegt bei über 70% (>100 bp) zwischen Mensch und Maus, wobei
sie nicht bei evolutionär entfernteren Tieren, wie z.B. Fischen, konserviert sind.
- 120 -
Diskussion
Sowohl Ausdehnung als auch der Grad an Sequenzidentität zwischen Mensch und
Maus, sowie Mensch und Huhn sprechen dafür, dass es sich bei den konservierten
Bereichen um den Bruchpunkt auf 9q33.1 um CNGs handelt. Eine Reihe von CNGs
konnten in den letzten Jahren identifiziert werden. Es zeigte sich hierbei, dass einige
dieser Elemente Einfluss auf die Expression benachbarter Gene nehmen können
(Dermitzakis et al., 2005). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Translokationen,
die solche CNG-Cluster betreffen, für eine Reihe von Erkrankungen ursächlich sind
(Dermitzakis et al., 2005; Kleinjan et al., 2005). Beispiele hierfür sind Translokationen
in CNGs, die vor dem HOXD-Komplex (Dlugaszewska et al., 2005), dem
RIEG/PITX2-Gen (Flomen et al., 1998) oder dem SOX9-Gen (Velagaleti et al., 2005)
liegen. Andererseits haben Nobrega et al. (2004) knockout-Mäuse hergestellt, bei
denen zwei solcher CNG-Cluster deletiert wurden. Interessanterweise unterscheiden
sich solche Tiere weder im Phänotyp noch in anderen untersuchten Eigenschaften
(Reproduktion, Homöostase, Genexpression der zu den CNG-Clustern benachbarten
Gene etc.) von normalen Tieren. Die Frage nach der Funktion dieser konservierten
Regionen ist somit noch nicht komplett verstanden. Ob es sich bei den CNGs in
9q33.1 um regulatorische Elemente handelt, konnte in der vorliegenden Arbeit nicht
abschließend geklärt werden. Sollte es sich um regulatorische Elemente handeln, so
wären auch hier Positionseffekte durch die Translokation auf benachbarte Gene
möglich, die somit Kandidatengene für die Kraniosynostose darstellen. Proximal wird
ie Region vom Gen DBCR1 (deleted in bladder cancer 1), einem ubiquitär
xprimierten Gen, das in Zelltod und Tumorentwicklung involviert ist, und distal von
LR4 (Toll-like-Rezeptor-4), flankiert.
LR4 gehört zu einer Familie mit 10 Mitgliedern, die sich durch extrazelluläre
eucin-reiche-Repeat“-Domänen und eine cytoplasmatische Toll/IL-1-Rezeptor-
(TIR)-Domäne auszeichnen (Akira, 2003). TLR4 ist ein Rezeptor für bakterielle
Lipopolysaccharide (LPS) und ist an der Induktion der angeborenen Immunantwort
bei Infektions- und Entzündungsprozessen, die durch gram-negative Bakterien
verursacht werden, beteiligt. Der Mechanismus der Aktivierung der Immunantwort
über TLR4 ist gut verstanden (Medzhitov, 2001; Akira, 2003). Interessanterweise
wird TLR4 häufig im Zusammenhang mit der Knochenbildung diskutiert. So konnten
Johnson et al. (2004) zeigen, dass Mäuse des Mausstammes C3H/HeJ, bei denen
es durch eine Aminosäuresubstitution in der TIR-Domäne (Pro712His) zu einem
Verlust der Aktivität von TLR4 kommt, durch größere Knochen und eine erhöhte
Knochendichte charakterisiert sind. Den gleichen Phänotyp weisen C57BI/10ScNCr-
d
e
T
T
„L
- 121 -
Diskussion
Mausmutanten auf, denen das komplette
beiden Fällen führt eine fehlende F
TLR4-Gen fehlt (Johnson et al., 2004). In
unktionalität von TLR4 zu einer Erhöhung des
Osteoklasten (Asai et al., 2003). Dieser Effekt wird durch Zugabe
Teil
Knochenwachstums. Einen möglichen Erklärungsansatz liefert die Arbeit von Asai et
al. (2003). Die Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass in der Osteoblastenzelllinie SaOS-
2 die Expression von Il-1 (Interleukin-1) und RANKL (Receptor activator nuclear
factor-κB (NF-κB) ligand) durch die Induktion mit Escherichia coli-type synthetic lipid
A steigt8. Il-1 und RANKL sind Aktivatoren der Osteoklastendifferenzierung (Katagiri
und Takahashi, 2002; Kwan et al., 2004). Nach der Aktivierung von Il-1 und RANKL
induzieren die SaOS-2-Zellen die Differenzierung von mononuklearen Blutzellen aus
peripherem Blut zu
eines TLR4-Antikörpers, der eine Hemmung von TLR4 bewirkt, inhibiert. Damit
scheint TLR4 bei der Aktivierung durch Escherichia coli-type synthetic lipid A die
Differenzierung von knochenabbauenden Zellen (Osteoklasten) zu fördern. Weitere
aktivierende Liganden von TLR4 sind unter anderem Fibronektin (Okamura et al.,
2001) und HSP60 (Ohashi et al., 2000), die jedoch nicht im Zusammenhang mit der
Osteoklastendifferenzierung diskutiert werden. Im Menschen sind Mutationen in
TLR4 mit einer verminderten Immunantwort auf Endotoxine (Arbour et al., 2000),
Multiple Sklerose (Reindl et al., 2003) und einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber dem
Respiratory-Syncytial-Virus assoziiert (Tal et al., 2004). Diese Verknüpfung beruht
auf Mutationen im extrazellulären Teil von TLR4 (Asp299Gly, Thr399Ile) und scheint
durch eine verminderte Bindungseigenschaft der Liganden hervorgerufen zu werden.
Bei keinem der untersuchten Patienten konnten jedoch Mutationen im zellulären
des Proteins nachgewiesen werden. Die Aktivierung der Osteoklastendifferenzierung
und das erhöhte Knochenwachstum bei Tlr4-defizienten Mäusen machen TLR4 zu
einem interessanten Kandidatengen für Untersuchungen im Zusammenhang mit dem
vorzeitigen Verschluss der Schädelnähte.
8 Lipid A ist eine Hauptkomponente von LPS und ein aktivierender Ligand von TLR4 (Westphal et al., 1981; Tamai et al., 2003).
- 122 -
Zusammenfassung
5. Zusammenfassung Defekte bei Bildung, Wachstum und Homöostase des Skeletts sind verantwortlich für
eine Reihe menschlicher Erkrankungen, zu denen neben zahlreichen
Skelettdysplasien und Kraniosynostosen auch Osteoarthrose und rheumatoide
Arthritis gehören. Da die diesen Erkrankungen zugrunde liegenden molekularen
Prozesse nur in Ansätzen aufgeklärt sind, war es Ziel der Arbeit, neue Gene, die in
die komplexen Prozesse der Knorpel-/Knochenbildung, -differenzierung und
cin-reichen Repeats“, das Ähnlichkeit zu
den Proteinen BGN, ECM1 und ECM2 aufweist. Die Expression von ECM3 ist auf
wenige Gewebe (u.a. Plazenta, sowie normalen und osteoarthrotischen Knorpel)
begrenzt. Quantitative Expressionsanalysen mittels „Real-Time“-PCR ergaben eine
signifikant höhere Expression des ECM3-Gens in Kniegelenkknorpel-Resektaten
einzelner Patienten mit Osteoarthrose oder rheumatoider Arthritis, so dass vermutet
werden kann, dass ECM3 in die Pathogenese der beiden chronischen
-homöostase beim Menschen involviert sind, zu identifizieren und molekular zu
charakterisieren.
Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden zunächst insgesamt 4748 ESTs
aus humanem fetalen Wachstumsfugenknorpel (20.SSW – 2.Lebensjahr), die im
Rahmen eines Kooperationsprojektes mit der Universität Mainz und der Fa.
GENterprise generiert worden waren, bioinformatisch ausgewertet und zur Erstellung
eines Expressionsprofils verwendet (Tagariello et al., 2005a). Die 4748 ESTs
repräsentieren 1688 unterschiedliche Transkripte, die sich auf 1247 bekannte und
414 unbekannte, putative Gene verteilen. Die Spezifität der cDNA-Bibliothek, sowie
der gewonnenen Daten, zeigte sich dadurch, dass für ca. 10% aller bekannten Gene
in dem ausgewerteten Datensatz bereits eine Funktion in der Knorpel-
/Knochenentwicklung und -homöostase nachgewiesen war. Im Vergleich mit
entsprechenden Datensätzen anderer Entwicklungsstadien konnten
entwicklungsspezifische Unterschiede im Expressionsprofil identifiziert werden.
Die Berechnung der relativen Frequenz der ausgewerteten Transkripte, im Vergleich
zu der Verteilung der Transkripte in anderen cDNA-Bibliotheken, ergab einen Satz
von 81 Genen, die entweder völlig uncharakterisiert sind oder für die bisher keine
Funktion bei der Skelettentwicklung beschrieben wurde. Diese Gene stellen mögliche
Kandidatengene für Skeletterkrankungen dar.
Eines der identifizierten Gene (ECM3: extracellular matrix 3) kodiert für ein putatives
Protein mit einem Signalpeptid und 12 „Leu
- 123 -
Zusammenfassung
Gelenkerkrankungen involviert ist. Darüber hinaus stellte ECM3 zu Beginn der
it auch ein exzellentes positionelles Kandidatengen für die
när hoch konservierten, nicht-kodierenden
vorliegenden Arbe
Frontometaphysäre Dysplasie (FMD) dar. Durch Untersuchung eines seltenen
Patienten mit bilateraler Periventrikulärer Nodulärer Heterotopie und einer FMD, die
in Zusammenarbeit mit Dr. Zenker (Institut für Humangenetik, Erlangen) durchgeführt
wurde, konnte ECM3 im Rahmen der vorliegenden Arbeit als ursächliches Gen
ausgeschlossen und stattdessen eine Mutation im Filamin A (FLNA)-Gen
nachgewiesen werden (Zenker et al., 2004).
Neben der breit angelegten, grundlegenden Strategie zur Genidentifizierung wurde in
der vorliegenden Arbeit auch versucht, über einen Patienten-basierten Ansatz
Kandidatengene für die Knorpel-/Knochenentwicklung zu identifizieren. Hierzu
wurden die Bruchpunkte bei einem Patienten mit Kraniosynostose und einer
balancierten Chromosomentranslokation (t(9;11) (q33;p15)) kloniert und sequenziert
(Tagariello et al., 2005b). Bei den Kraniosynostosen handelt es sich um die
frühzeitige Verknöcherung einer oder mehrerer Schädelnähte, deren Ursachen
bisher nur in Ansätzen bekannt sind. Der Bruchpunkt auf Chromosom 11p15
unterbricht das SOX6-Gen, das in Skelettentwicklung und -wachstum involviert ist.
Obwohl in der vorliegenden Arbeit eine Missens-Mutation im SOX6-Gen bei einem
weiteren Patienten mit Kraniosynostose identifiziert werden konnte, ließ sich ein
direkter Nachweis der SOX6-Veränderung als Ursache für das Krankheitsbild nicht
erbringen. Der Bruchpunkt auf Chromosom 9q33 ist in einer Region ohne bekannte
oder vorhergesagte Gene lokalisiert. Hier unterbricht die Translokation
interessanterweise eine Reihe von evolutio
und nicht-transkribierten Elementen (CNGs = highly conserved non-genic
sequences), was zu möglichen Positionseffekten auf flankierende Gene führen
könnte. Zwei interessante Kandidatengene, die den Bruchpunkt flankieren, stellen
hierbei die Gene TLR4 (für das eine Funktion bei der Knochenentwicklung bereits
nachgewiesen wurde) und das in der vorliegenden Arbeit neu identifizierte und in der
Schädeldecke exprimierte Gen ARM1 dar.
- 124 -
Zusammenfassung
6. Summary Defects in formation, growth and homeostasis of the skeleton are responsible for
various human monogenic and multigenic heritable disorders as skeletal dysplasias,
craniosynostosis and ostheoarthritis. Thus, the present dissertation aims at the
identification of novel genes and pathways involved in the complex processes of
cartilage/bone formation, growth, differentiation and homeostasis, which may serve
as candidate genes for the above mentioned disorders.
In the first part of my work, I analysed 4748 clones from a human growth plate
cartilage cDNA library generated from 20 weeks prenatal- to 2 years postnatal
specimens (Tagariello et al., 2005a). In silico analysis of these sequences revealed
1688 individual transcription units, corresponding to known (1274) and to novel, yet
uncharacterised genes (414). The EST profile representing with a total of
approximately 10% proteins already shown to be involved in cartilage/bone
development or homeostasis, reflect the tissue specifity of the library. The EST profile
also reflects the developmental stage of the tissue with significant differences in the
expression of matrix known compounds compared to corresponding EST profiles
from 8-12 and 12-20 week human fetal cartilage. Calculation of the relative frequency
of transcripts in our cDNA library, as compared to their abundance in other EST
databases, revealed a set of approximately 200 genes, including 81 novel, yet
uncharacterised genes, showing increased expression. These genes represent
candidates for the large number of osteochondrodysplasias for which the causative
gene defects have not yet been identified.
In the present thesis, I described the further characterization of a putative candidate
gene (ECM3: extracellular matrix protein 3). The predicted protein has a length of
583 amino acids with 12 leucine-rich repeats, a signal peptide and a high homology
to ECM2 and BGN. The expression of ECM3 is restricted to a few tissues including
placenta as well as normal and osteoarthritic cartilage. Investigation of the high
expression level of ECM3 in several specimens of cartilage from osteoarthritis and
eumtatoid arthritis patients in different stages of disease progression by real-time
CR, indicated a function of ECM3 in the pathogenesis of these two forms of chronic
rthropathies. Furthermore ECM3 turned out to be an excellent positional candidate
ene for a patient with an interesting combination of frontometaphyseal dysplasia
nd periventricular nodular heterotopia. However, in collaboration with Dr. Zenker
(Department of Human Genetics, Erlangen) ECM3 was excluded to be involved in
rh
P
a
g
a
- 125 -
Zusammenfassung
this disease. Instead, an unusual mutation in the
to be the basic cause of the clinic
Filamin A (FLNA) gene was shown
al phenotype (Zenker et al., 2004).
desm
b
i
s irth the patient
set revealed fusion of the
l
f
chro
T
know
t
miss
c n
aspa
terminal part of SOX6 and has s
S
rema
w
c
b high conserved non-genic
chro Two interesting target
development) and ARM1 a novel gene, identified in the context of my present study.
In the second part of my work I focused on novel genes involved in the process of
al ossification. I analysed a patient with a craniosynostosis and a de novo
alanced translocation. Craniosynostosis is a congenital developmental disorder
lving premature fusion of cranial sutures resulting in annvo abnormal shape of the
kull. Little is known about the various forms of craniosynostosis. At b
presented with Crouzon-like brachycephaly, proptosis, midfacial hypoplasia and low
ears. Three-dimensional cranial computer tomography
ambdoid sutures and distal part of the sagittal suture with a gaping anterior
ontanelle. Mutations in the genes for FGFR1-3 were excluded. Standard
mosome analysis revealed a de novo balanced translocation t(9;11)(q33;p15).
he identified breakpoint on chromosome 11p15 disrupts the SOX6 gene, a gene
n to be involved in skeletal growth and differentiation processes. Screening of
he SOX6 gene in 104 patients with various forms of craniosynostosis revealed a
ense mutation in one particular patient with an apparently isolated complex
raniosynostosis involving the coronal and sagital suture. Interestingly, a
evolutionary conserved aspartate residue at position 68 was exchanged against
ragine as a result of the mutation. The affected amino acid is located in the N-
o far not been assigned to any functional domain.
ince the mutation was also found in the patient´s apparently non-affected mother, it
ins open, whether the mutation represents a rare polymorphism or is associated
ith a craniosynostosis form with reduced penetrance. The breakpoint on
mosome 9 could be located in a region without any knownhro or predicted genes,
ut interestingly, disrupts patches of evolutionary
sequences (CNGs) and may thus led to a dysregulation of flanking genes on
mosome 9 or 11 involved in skull vault development.
genes of this dysregulation are TLR4 (previously shown to be involved in bone
- 126 -
Anhang
7. Literaturverzeichnis Aba
chondrogenesis.“
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8. Anhang
8.1 mRNA-Sequenz von Klon 68F08 atgggagcgggatcggcgcggggggcccgaggcacagcggcggcggcggcggcgcgcgggggggggtttctcttctcctggatcttagtctcgtttgcctgtcacctggcctccacccaaggagctcctgaagatgtggacatcctccagcggctgggcctcagctggacgaaggccgggagccctgcacccccgggagtcattcctttccagtcgggcttcatctttacgcagcgggcccggctccaggctcccacgggcaccgtcattcctgccgccttgggcacagagctggcactggtgctgagcctctgctcccaccgggtgaaccatgccttcctcttcgctgtccgcagccagaaacgcaagctgcagctgggcctgcagttcctccccggcaagacggtcgtccacctcgggtcccggcgctcagtggccttcgacctcgacatgcacgacgggcgctggcaccacctggccctcgagctccgaggccgcacagtcactctggtgactgcctgcgggcagcgccgggtgcctgtcctgctgcctttccacagggaccctgcactcgaccctgggggctccttcctctttgggaagatgaacccgcatgcagtccagtttgaaggtgctctctgccagttcagtatctaccctgtgacgcaggtcgctcacaattactgtacccacctgaggaagcagtgtggacaggctgacacgtaccagtccccactgggacctctcttctcccaagactctggcagaccttttaccttccagtccgacctcgccctgctaggcctggagaacttgaccactgccacaccagccctggggtcactgccagcaggcaggggacccagggggactgtggcacccgccacgcccaccaagccccaaaggactagccccacaaaccctcaccagcatatggcggtgggaggcccagcccaaaccccgctgctacctgccaagctgtcagccagtaacgcacttgatcccatgctcccagcctctgttggcggctctaccagaacgcctcgccctgcggccgctcaaccatcacagaagatcacagccaccaaaatccccaaaagcctccctaccaagccttcggccccttctacttcaattgtgcccatcaaaagcccccatcctacccagaaaacagctccatcttcatttacaaagtcagcc ctacccactcagaagcaagtgccacctacttcccgtccagttcctgccagagtctcccgtcccgcagagaagcccatccagaggaacccgggaatgcccaggcccccaccgcccagcacccggcccctacctcctaccaccagctcctctaaaaaacccattcccacactagctcggactgaggccaagataaccagccatgccagtaagccggcctctgcccgcaccagcacccacaaacctcccccatttactgctttatcctcatctcctgcccctactcctggttctaccaggagtactcggccaccagccacgatggtacctccaacttcgggcaccagcactcccagaacagcacctgccgtccccactcctggctcagctcccactggaagcaagaagcccattggatcggaagcctcaaagaaagccggacccaagagcagcccccggaagcctgtccccctcagacctgggaaggcagccagggatgtccccttgagcgatctgacaaccaggcctagccccagacagccccagcccagtcagcagaccaccccggccctggtattggccccggcgcaattcctgtcctccagcccccggcccacgagcagtggctattcgatcttccacctggcaggatctacgcctttccctctgctgatggggcctccgggacccaagggagactgtggcttgccgggtccccctgggctacctgggctacctggaatccctggtgcacgtgggcctcggggtcctcctgggccttatggaaatccaggtctccccggccctcctggagccaaaggacagaaaggggacccagggctctcaccaggaaaggcccacgatggggcaaagggtgacatgggcttgcctgggctctccgggaatccaggacctccgggacgaaagggacacaagggctatcctggaccggcagggcaccccggagaacaggggcagccaggacctgagggcagcccaggggccaaaggttaccctggcaggcaggggttacctggaccggtaggagatcccggccccaaaggcagcaggggctacattgggctcccagggctcttcggcctgccagggtctgatggagaacgaggcctgcctggcgttcctggcaagaggggcaagatgggtatgccggggtttcctggagtctttggggaaagaggccct cctggactggatggaaatcctggagaactgggcctgccaggcccccctggagtccccggcctcattggtgacttaggagtgttgggtccgattggctacccgggacccaagggcatgaagggactgatgggcagcgtgggggagcccggactgaaaggtgataagggtgaacaaggggttccaggtgtgtcaggagatcccggattccaaggagacaaggggagccaggggttgccagggttccccggtgcacgggggaagccagggcctctgggcaaagtcggagacaaaggatccattgggtttcccgggccccctggacccgagggattcccaggagacatcggcccccctggcgacaatggcccagaaggcatgaagggtaagcctggagcccgaggcctgccgggaccccgtgggcagctggggcccgagggagatgagggacccatggggccgccaggggcccctggcttggagggtcagcctggcaggaaggggtttcctgggaggcccggcctggatggcgtgaagggggaaccaggggatcctggtcggccggggcctgtgggagagcagggatttatgggattcattggtctggtcggggagccaggaatcgtgggagaaaagggtgatcgtggcatgatgggacccccaggcgtgcctggacccaaggggtcgatgggtcatcctggaatgccaggtggtatggggacccctggagagcctggaccccagggtcctccaggatctcgaggcccaccaggcatgaggggagcaaagggacgtcggggcccccgaggaccggacggaccagctggggagcaagggtccaggggcctgaagggccctccaggaccccagggcagaccgggccggcctggacagcagggtgtggctggtgagcgaggccacttgggctcgagaggctttcctggcatcccgggtccctcaggccccccaggcaccaagggcctcccaggagaaccgggccctcagggaccccaggggccaattgggcctccaggagagatgggacccaaggggccgcctggtgcagtgggagaaccgggccttcctggggaagccgggatgaagggtgaccttggacccctgggcactcctggggagcagggcctcattgggcaacggggagagccaggccttgagggtgacagtggccccatgggacctgat gggctgaagggggacaggggagacccagggcctgatggagaacatggcgagaaaggccaggaagggctgatgggtgaggacgggccccccggcccccctggcgtcactggtgtccggggtcctgaaggaaaatcagggaagcaaggcgagaagggccgcactggagccaagggtgccaagggctatcaaggacagctgggtgagatgggcgtccctggagaccctggaccccctggcactccaggccctaaagggtcccggggcagcctgggaccaacgggtgctccgggacgcatgggggcccaaggagaaccgggactggctggttatgatggacacaaaggcattgtgggaccccttggacctcctggaccaaaaggcgaaaagggggagcagggcgaggacggcaaggctgaggggccccctgggccacctggagatcggggccct
- 149 -
Anhang
gtgggtgatcgaggagaccgcggggaaccgggagaccctgggtaccctggacaggagggtgtgcaaggcctccgtggaaagccaggccagcagggccaacccgggcatccgggaccccgggggtggccgggacccaaaggatcgaaaggcgcagagggaccaaagggaaagcaaggcaaggcaggggccccaggccggaggggggtccagggcctgcaggggctgccagggccccggggcgtggtggggagacagggcctcgagggcatcgctggaccagatgggcttcctggcagggacgggcaagcaggacagcagggggagcagggagacgatggggaccctggccccatgggccctgctgggaagagaggaaatccaggtgtggccggcttacctggagcacagggacccccaggattcaagggtgagagtgggttacccggacagctgggtccccctggcaagcgaggaacagagggcagaacggggctccctggaaaccagggggagcctgggtccaaaggccagccgggcgactctggcgagatgggcttcccaggaatggcaggtctcttcggacccaagggcccgcctggagacattggcttcaaaggcatccagggccctcgggggccacctggcttgatgggaaaggaaggcatcgtcgggcccctcggaatcctgggaccttcgggactcccgggtccgaagggtgacaaaggcagccgtggggactggggattgcaa ggtccgaggggtcctcccggccccagagggcggcccggccccccgggtcctccagggggtcctatccaattgcaacaagatgatcttggggcagctttccagacgtggatggacaccagtggagcactcaggccagagagttacagctatccagaccggctggtgctggaccagggaggagagatctttaaaaccttacactacctcagcaacctcatccagagcattaagacgcccctgggcaccaaagagaaccccgcccgggtctgcagggacctcatggactgtgagcagaagatggtggatggtacctactgggtggatccaaaccttggctgctcctctgacaccatcgaggtctcctgcaacttcactcatggtggacagacgtgtctcaagcccatcacggcctccaaggtcgagtttgccatcagccgggtccagatgaatttcctgcacctgctaagctccgaggtgacccagcacatcaccatccactgccttaacatgaccgtgtggcaggagggcactgggcagaccccagccaagcaggccgtacgcttccgggcctggaatggacagatttttgaagctgggggtcagttccggcccgaggtgtccatggatggctgcaaggtccaagatggccgctggcatcagacactcttcaccttccggacccaagacccccaacagctgcccatcatcagtgtggacaacctccctcctgcctcatcagggaagcagtaccgcctggaagttggacctgcgtgcttcctctga
8.2 mRNA-Sequenz von Klon 19C12 cctgggtgcaaccagtcacagctctgcagaggttactgtgattttgcccctgaaggatctgtccacaacttaggaactcacacagcttttggcctgagcccccgttaccaagagaaaggaggtttttgccaaggactccaaggggagtgcacttgatgctggtcgggacccaaagcacccagccctccctgagacattgtgtgagtcgggctgggcctcaaacacggcccccactgccccaccccagccagggtggtgcttgtgtgggaaggactttaaatccagctgccagacccctggacgggagaaggagagacggctggccaccatgcacggctcctgcagtttcctgatgcttctgctgccgctactgctactgctggtggccaccacaggccccgttggagccctcacagatgaggagaaacgtttgatggtggagctgcacaacctctaccgggcccaggtatccccgacggcctcagacatgctgcacatgagatgggacgaggagctggccgccttcgccaaggcctacgcacggcagtgcgtgtggggccacaacaaggagcgcgggcgccgcggcgagaatctgttcgccatcacagacgagggcatggacgtgccgctggccatggaggagtggcaccacgagcgtgagcactacaacctcagcgccgccacctgcagcccaggccagatgtgcggccactacacgcaggtggtatgggccaagacagagaggatcggctgtggttcccacttctgtgagaagctccagggtgttgaggagaccaacatcgaattactggtgtgcaactatgagcctccggggaacgtgaaggggaaacggccctaccaggaggggactccgtgctcccaatgtccctctggctaccactgcaagaactccctctgtgaacccatcggaagcccggaagatgctcaggatttgccttacctggtaactgaggccccatccttccgggcgactgaagcatcagactctaggaaaatgggtgcagagggccctgacaagcctagcgtcgtgtcagggctgaactcgggccctggtcatgtgtggggccctctcctgggactactgctcctgcctcctctggtgttggctggaatcttctgaaggggataccactcaaagggtgaagaggtcagctgtcctcctgtcatcttccccaccctgtccccagcccctaaacaagatacttcttggttaaggccctccggaagggaaaggctacggggcatgtgcctcatcacaccatccatcctggaggcacaaggcctggctggctgcgagctcaggaggccgcctgaggactgcacaccgggcccacacctctcctgcccctccctcctgagtcctgggggtgggaggatttgagggagctcactgcctacctggcctggggctgtctgcccacacagcatgtgcgctctccctgagtgcctgtgtagctggggatggggattcctaggggcagatgaaggacaagccccactggagtggggttctttgagtgggggaggcagggacgagggaaggaaagtaactcctgactctccaataaaaacctgtccaacctgt
8.3 mRNA-Sequenz von Klon 86H12 (ECM3) agtgagcaaagaatccactgtccagtcctcgttgatgacagccttgagggacaaacagcattgctttggcatcctccaggctaccaatctgagtcccagcttgtagagggacgcacaaggagatggtggcctcatccctgactccagaggcatttgctgactccctagatggtccctgtttctggtctgtacgtggcagggtccaaattcagccatggatgcagggcccagcagcctgcggtggccgacccgctctgtggtgggcctctcaggcctgccacgtgtgagacagaagccccattcatggaggccactgggccagagccagcggagaatcaatgcgggcctcacagcaaaagggcaggaccgtccggtctgaggaaagggcaatctgtctttctcttcagctctccttccctccatggcagccaagaggagtgtgctgctccccatcctggcactgtgggcggggagctgctcaggaggggccccaccaacccccatgggcttggctaccctgcagctgctgcccagcccaccaggggcccccgacggtcagctgcagcccatccctggcatcggccacccagacaagcctgaggctgggaagctggaccagttgcgggatcagcccaccccgaagcagggagctcaaggaacccccacccagtccccctccactggctggaaagcgcttcccaggccagggctggccctgaggaaggagtcacccccagtgaccttggagca
- 150 -
Anhang
- 151 -
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8.4 Sequenz der bruchpunktüberlappenden PCR zur Validierung des Bruchpunktes beim untersuchten Kraniosynostose- Patienten
GAAACAAAGGAAAGGTTAAAAATTAACTGGGTGTGATGGCATGCATCTGTAGTCCTAGCTACTTGGGAGGCTGAGGTAGGGGG ATCTCTTGAGCACAGGAGTTTTAGGCTGCATTGAGCTATGATCACTGCACTCCATCCTGGGCTATGGAGAAAGAAGGCAGCGG TTTGAAACCTGTGTTAGCTTTTCAGAGTTGGGAAATTAACATAAATGTGCCAAACCTCAGTTTTCTCATGTGGGAACTGCTGA GTCATAAATGAAAGAAGTGAGATATAAAGGAGGTGGCATATATAGGCA
Anhang
8.5 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Winterpacht für die Bereitstellung des Themas
der vorliegenden Doktorarbeit, sowie für die kompetente Betreuung, engagierte
Unterstützung und fortwährende Diskussionsbereitschaft, die wesentlich zum
Gelingen der Arbeit beigetragen haben.
Herrn PD Dr. Slany danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Herrn Dr. Zenker (Humangenetik, Erlangen), sowie der AG PD Dr. Pullig
(Orthopädische Rheumatologie, Erlangen) danke ich für die produktive
Zusammenarbeit.
Einen ganz besonderen Dank für ihre Unterstützung und ihre unermüdlichen
Ratschläge während der Korrektur meiner Arbeit möchte ich meiner Freundin
Cornelia Overhoff aussprechen.
Ferner danke ich meinen Kolleginnen Anja Schweizer, Annegret Bördlein und Tina
Molter für die intensive Durchsicht der Arbeit.
Zu guter Letzt möchte ich allen Kollegen und Freunden der Institute für
Humangenetik in Hamburg und Erlangen danken. Mein Dank gilt dabei besonders:
Anja Schweizer, Annegret Bördlein, Annette Greven, Denny Schanze, Gerrit
Mohrmann, Sabine Endele, Sabine Guth, Sabine Richter, Stephanie Schlickum und
Tina Molter. Ohne euch hätte die Arbeit nur halb soviel Spaß gemacht.
- 152 -
Anhang
8.6 Lebenslauf Name:
Andreas Tagariello
Akademischer Titel:
Diplom-Biochemiker
Geburtstag:
26. September 1974
Geburtsort:
Wuppertal, Nordrhein-Westfalen
Familienstand:
ledig
Schulischer Werdegang 1981-1985
Grundschule in Wuppertal-Ronsdorf
1985-1994
Städt. Gesamtschule Wuppertal-Ronsdorf Abschluss: Abitur
1994-1996 Rheinische Akademie e.V. Köln Abschluss: Staatlich geprüfter Biologisch-technischer Assistent
Studium 10/1996-03/2001 Biochemie-Studium an der Ruhr-Universität Bochum
Abschluss: Diplom-Biochemiker Diplomsarbeitsthema: „Identifizierung von DPC4-Zielgenen im Pankreaskarzinom“ angefertigt am Institut für physiologische Chemie, Abteilung Medizinisches Proteom-Center unter der Leitung von Prof. H.E. Meyer
03/2001-03/2002 Promotionsstudium am Institut für Humangenetik an der Universität Hamburg zum Dr.rer.nat. unter der Leitung von Prof. A. Winterpacht, Dissertationsthema „Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit Einfluss auf Entwicklung und Erhalt des Knorpel-/Knochen-Systems“
Seit 03/2002 Fortsetzung des Promotionsstudiums am Institut für Humangenetik an der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg unter Leitung von Prof. A. Winterpacht
- 153 -
Anhang
8.7 Veröffentlichungen Teile der vorliegenden Arbeit werden in folgenden Zeitschriften veröffentlicht bzw.
sind bei verschiedenen Tagungen vorgestellt worden (Ausnahme mit „*“ gekenn-
zeichnet):
Publikationen Zenker M, Rauch A, Winterpacht A, Tagariello A, Kraus C, Rupprecht T, Sticht H,
Reis A (2003) „A dual phenotype of periventricular nodular heterotopia and
frontometaphyseal dysplasia in one patient caused by a single FLNA mutation
leading to two functionally different aberrant transcripts.” Am J Hum Genet., 74(4),
731-737.
*Zenker M, Mayerle J, Lerch MM, Tagariello A, Zerres K, Durie PR, Beier M,
Hülskamp G, Guzman C, Rehder H, Beemer F, Hamel B, Vanlieferinghen P,
Gershoni-Baruch R, Vieira MW, Dumic M, Auslander R, Lopes VL, Steinlicht S, Rauh
M, Shalev SA, Thiel C, Winterpacht A, Kwon YT, Varshavsky A, and Reis A (2005)
„Deficiency of UBR1, a ubiquitin ligase of the N-end rule pathway, causes pancreatic
dysfunction, malformations and mental retardation (Johanson-Blizzard syndrome).“
Nat Genet, in Druck.
Tagariello A, Schlaubitz S, Hankeln T, Mohrmann G, Stelzer C, Schweizer A,
Hermanns P, Lee B, Schmidt ER, Winterpacht A, Zabel B (2005a) „Expression profiling
of human fetal growth plate cartilage by EST sequencing.“ Matrix Biol, in Druck.
Tagariello A, Heller R, Greven A, Kalscheuer VM, Molter T, Rauch A, Kress W,
Winterpacht A (2005b) „Balanced translocation in a patient with craniosynostosis disrupts
the SOX6 gene and an evolutionary conserved non-transcribed region.“ J Med Genet,
eingereicht.
- 154 -
Anhang
Publizierte Kongressbeiträge
Zabel B, Schlaubitz S, Stelzer C, Luft F, Schmidt ER, Hankeln T, Hermanns P, Lee
B, Jakob F, Noeth U, Mohrmann G, Tagariello A, Winterpacht A (2002) „Molecular
identification of genes and pathways involved in skeletogenesis by EST sequence
analyses and microarray expression profiling of human mesenchymal stem cell
differentiation.” Poster: GfH Jahrestagung, Leipzig 29.09-02.10.2002. Med Genetik,
3, 304.
Tagariello A, Mohrmann G, Schlaubitz S, Luft F, Schmidt ER, Hankeln T, Lee B,
Winterpacht A (2003) „Molecular identification of genes and pathways involved in
skeletogenesis by EST sequencing analysis and expression profiling.” Vortrag: Joint
Annual Meeting of the German and Swiss Connective Tissue Society, Ulm 27.03-
29.03.2003.
Tagariello A, Stauffer K, Lee B, Zabel B, Hankeln T, Schmidt ER, Winterpacht A
(2003) „Novel genes expressed in human fetal growth plate cartilage –
characterization of candidate genes for skeletal disorders.” Poster: GfH
Jahrestagung, Marburg 01.10.-04.10.2003. Med Genetik, 3, 343.
Zenker M, Rauch A, Winterpacht A, Tagariello A, Kraus C, Rupprecht T, Sticht H,
Reis A (2004) „A dual phenotype of periventricular nodular heterotopia and
frontometaphyseal dysplasia (PVNH+FMD) in one patient caused by a single FLNA
mutation leading to two functionally different aberrant transcripts.“ Poster: ESHG
Jahrestagung, München 12.06.-15.06.2004. Eur J Hum Gen, 12 [supp.], 255.
Stauffer K, Hankeln T, Zabel B, Schmidt ER, Schweizer A, Winterpacht A,
Tagariello A (2004) „Characterization of ECM3, a novel human-specific gene
expressed in normal and osteoarthritic cartilage samples.” Poster: ESHG
Jahrestagung, München 12.06.-15.06.2004. Eur J Hum Gen, 12 [supp.], 330.
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Tagariello A, Heller R, Greven A, Kalscheuer V, Molter T, Kress W, Winterpacht A
(2005) „Balanced (9;11) translocation in a patient with non-syndromic
craniosynostosis disrupts the SOX6 gene (11p15) and a conserved non-transcribed
region (9q33).” Poster: Jahrestagung der Amerikanischen Gesellschaft für
Humangenetik, Toronto 27.10.-31.10.2005.
Tagariello A, Heller R, Greven A, Kalscheuer V, Molter T, Kress W, Winterpacht A
(2005) „Balanced (9;11) translocation in a patient with non-syndromic
craniosynostosis disrupts the SOX6 gene (11p15) and a conserved non-transcribed
region (9q33).” Poster: GfH Jahrestagung, Halle 09.03.-12.03.2005. Med Genetik, 1,
124.
Tagariello A, Heller R, Greven A, Kalscheuer V, Molter T, Kress W, Winterpacht A
(2005) „Balanced (9;11) translocation in a patient with non-syndromic
craniosynostosis disrupts the SOX6 gene (11p15) and a conserved non-transcribed
region (9q33).” Poster: French and German Connective Tissue Societies, Köln
10.03.-12.03.2005.
Tagariello A, Stauffer K, Schweizer A, Winterpacht A (2005) „Characterization of
ECM3, a novel human-specific gene expressed in normal and osteoarthritic cartilage
samples.“ Poster: French and German Connective Tissue Societies, Köln 10.03.-
12.03.2005.
Zenker M, Mayerle J, Tagariello A, Zerres K, Durie PR, Hülskamp G, Guzman C,
Rehder H, Beemer FA, Hamel B, Vanlieferinghen P, Gershoni-Baruch R, Vieira MW,
Kwon YT, Varshavsky A, Lerch MM, Reis A (2005) „Mutations in UBR1, encoding the
ubiquitin ligase E3 of the N-end rule pathway, cause Johanson-Blizzard syndrome.“
Poster: Jahrestagung der Amerikanischen Gesellschaft für Humangenetik, Salt Lake
City 26.10.-29.10.2005.
