Herpesviren II
Bettina KempkesHelmholtz Zentrum München (HMGU)
23.5. 2011
Herpesviren: Strukturmerkmale
4. Hüllmembranmit Gykoproteinkomplexen (12-14 Proteine)
1. lineares GenomDNA Doppelstrang
und Coreproteine
3.Tegument (HSV: 23 virale/49 zelluläre Proteine)
2. Kapsid(HSV: 8 virale Kapsid
und Kapsid-assoziierte Pr.)
Herpesviridae:
Gemeinsamkeiten
Biologische Merkmale1. virale Enzyme : DNA Metabolismus (Thymidinekinase; Thymidylatesynthase;
Ribonukleotidkinase)DNA Synthese (DNA Polymerase, HelikaseProzessierung von Proteinen)
2. Subzelluläre KompartimentierungKern: Virale DNA Replikation und Kapsid AssemblierungZytoplasma/ER: Morphogenese des Virion
3. Virusproduktion führt zum Tod der Zelle
4. Lebenslange Latenz Zirkuläres Genom Reaktivierung im natürlichen Wirt("Das Virus verbleibt (persistiert) im Wirt. Es gibt jedoch Phasen oder infizierte Zellpopulation,in denen das Virus nicht mehr nachgewiesen werden kann.")
8 humanpathogene Herpesviren
Herpes-Simplex Virus (HSV) 1+2 (HHV 1/2)
Varizella-Zoster Virus (VZV) (HHV 3)
Humanes Herpesvirus 6 A/B (HHV 6)
Epstein-Barr Virus (EBV) (HHV 4)
Cytomegalovirus (CMV) (HHV 5)
Humanes Herpesvirus 7 (HHV 7)
Kaposi Sarkom assoziiertes Herpesvirus (HHV 8)
Tierpathogene Herpesviren(Auswahl)
• Bovines Herpesvirus Typ1** (α) infektiöse Rhinotracheitis/genitaleManifestationen mit breiter Symptomatik
• Bovines Herpesvirus Typ2 (α) ulzerative Entzündung der Euter, Übertragung u.a. durch Fliegen
• Bovines Herpesvirus Typ3 (γ) bösartiges Katarrhalfieber• Equine Herpesvirus Typ 1 (α) Aborte• Porcine Herpesvirus *Typ1 (α) Pseudorabiesvirus*/ Aujeszkysche Krankheit
Übertragung auf Hunde/Katzen und Rinder möglich• Feline Herpesvirus (α) Katzenschnupfen• Kanine Herpesvirus (α) Welpensterben• Porcine Zytomegalovirus (β) Schäden des ZNS, hohe Mortalität• Murine Zytomegalovirus (β) Wichtiges CMV Modell• Galline Herpesvirus **(Typ1) (α) infektiöse Laryngotracheitis mit hoher Morbidität und
Mortalitätund hohen wirtschaftlichen Verlusten(Hühner/Enten/Schwäne)
• Galline Herpesvirus (Typ2) (α) Mareksche Krankheit mit hoher Morbidität und Mortalitätund hohen wirtschaftlichen VerlustenInfektion und Transformation von T-LymphozytenVirusintegration
* DIVA Impfstoffe(differentiating between infection and vaccination)** attenuierten Lebendimpfstoff
DNA Replikation im Zellkern(Latenz oder Lytische Replikation)
DE
RE
E
TGN
TGNLATENZ oder LYTISCHE REPLIKATION ?Das virale Genom zirkularisiert.
LATENZ: virus- und gewebespezifische eingeschränkte Genexpression
LYTISCHE REPLIKATION:Kaskade der viralen Genexpression immediate early: Transaktivatoren(delayed) early: Enzyme für virale DNA Synthese
Lytische Replikationlate: Strukturproteine (Kapsid-, Tegument und Hüllproteine)
Prozessierung und Verpackung der linearen viralen Genome in Kapside.
HerpesvirenAntivirale Therapie
• Chemotherapie• (Zytokinbehandlung)• Adoptive Immuntherapie
Latente oder lytische DNA Replikation
TR
oriPTR
oriLyt
TR
oriLyt
oriP
TR
oriP
TR
oriP
TR
oriP
TRTR
TR
oriLyt
Latente Replikation(zell. DNA Polymerase)
Lytische Replikationvirale DNA Polymeraseund virale Kofaktoren
Azyklische Nukleosidanaloga(Azyklische Zucker)
Analogon virale Thymidinkinase** zelluläre KinaseAcycloguanosin Guanosin +Famiciclovir (Pro-Drug)* Guanosin +Ganciclovir Guanosin virale zelluläre KinaseBirivudin Uracil +Cidovir Monophosphat Cytosin +
* verbesserte Bioverfügbarkeit
Molekulare Virologie 3. Auflage Modrow et al. Principles of Virology 3. Auflage Flint et al.
** Entwicklungvon Resistenzen
Reduktion oder Verlust derThymidinkinase
oder
Verlust derSubstratspezifität fürAzyklischeNukleosidanaloga
Chemotherapie
• Nucleosidanaloga
Beispiel:Acycloguanosin
ACG
Gertrude ElionNobelpreis 1988
Forscarnet
Nicht-nucleosidische HemmstoffePyrophosphatanalog: Foscarnet
Phosphoameisensäure
Molekulare Virologie 3. Auflage Modrow et al.
bindet an die Pyrophosphatbindestelle der viralen DNA Polymerase
Resistenzen: Aminosäureaustausche in der viralen DNA Polymerase
NucleosidanalogonTrifluridin
Trifluormethylthymidin: Substrat der viralen DNA PolymeraseStörungen der helicalen DNA Struktur nach Einbau Direkte Blockade der Polymerisation(Kinase ?)
Fomivirsen:Antisense-Oligonucleotid zur spezifischen Blockade derExpression von "immediate early genes" des CMV
phosphorothioate 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3'
ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 1996, p. 2004–2011 Vol. 40, No. 9Inhibition of Human Cytomegalovirus Immediate-Early GeneExpression by an Antisense OligonucleotideComplementaryto Immediate-Early RNAKEVIN P. et al.
CMV retinitis: intraocular injection in a concentration of 6.6 mg/mL
HSV-1 Latenz
Epithelzelle:
Replikation
Nervenzelle:Latenz (LAT RNA Expression)Reaktivierung
Latenz: Virale Proteine werden nicht exprimiert. Epigenetische Modifikationen des Genoms verhindern die Expression lytischer Geneund entziehen die infizierten Zellen der Immunkontrolle durch Virus-spezifische B- und T-Zellen.
Virale Mimikry und virale Piraterie
• Mimikry (Funktionelle Konvergenz/Analoge)– CD40/LMP1– B-Zellrezeptor/ LMP2A– Notch-Signaltransduktion/EBNA-2
• Piraterie (Homologe) – "primordial genes or domains" ( evolutionär alt z. Bsp
aus Bakteriophagen)– Wirtsgene oder Domänen aus Wirtsgenen (häufig
fehlen Introns/ retrovirale Übertragung?) (Beispiele: virale IRFs aus KSHV
virales Interleukin 10)
Immune Evasion der Herpesviren"Immunsystem-Umgehungsstrategien"
• Angeborenes Immunsystem- Effektorzellen (Makrophagen, Monozyten, Dendriten, Granulozyten, Natürliche Killerzellen)
- Zellautonome SytemeInterferone (α,β) und Zytokine
• Adaptive Immunsystem- Humorale Immunantwort
B-Zellen- Zellvermittelte Immunantwort
AntigenpräsentationT-Zellen(γ-Interferone)
Angriffsmöglichkeiten:
Lymphozyten
B-Zelle T-Helferzelle - MHC I T-Killerzelle – MHC II
Humorale Immunantwort Zellvermittelte (restringierte) Immunantwort
EBV infiziert und immortalisiert primäre B-Zellen in vitroProliferative Latenz (Latenz III)
EBV
EBNA-1
ABC
EBNA-3
LMP-2A/B
C pLMP-2A p
LMP-2B p
EBNA-LP
LMP-1
EBV Nuclear AntigenLatent Membrane Protein
C BF1 (C-promoter binding) S u(H) (Suppressor of hairless)L ag-1 (C.elegans)
RBP-Jk/RBP-J/Jk/RBP(recombination signal binding protein kappa)
CSL/CBF1
EBNA-2
EBNA-3A/B/C EBNA-2
Die B-Zelle: Aktivierung und Differenzierung
Germinal center reaction
Activation of naive B cellsby antigen
Memory B cellPlasma cell
EBV:Latente Transkriptionsprogramme
"Latency in vivo"
Latent reservoir in vivo: memory B cells Lytic reactivation in plasma cells
Type 0
Type IEBNA-1
Type II:EBNA-1LMP-1, LMP2A/B
Type III:EBNA-1EBNA-2,-3A,-3B,-3C,LPLMP-1,LMP2A/B
Type I:Burkitt's lymphoma
Type III:Post-Transplant-LmphomaAIDS ass. B cell LymphomaInfectious Mononucleosis
Type II:Hodgkin's disease
EBV associateddiseasesof B cell origin
Beta-trefoil (BTD)
RHR-C
RHR-N
ßC4
CSL structure: Kovall et al., 2004
The CSL protein CBF1
CBF1
Corepressor
ubiqitously expressed
highly conserved in evolution
tissue differentiation and development
sequence specific DNA binding factor
recruits co-repressor activity
C/GTGGGAA
C/GTGGGAA
Coactivator
CBF1EBNA-2
C/GTGGGAA C/GTGGGAA
Coactivator
CBF1NotchNotch Corepressor
CBF1
?
Herpesviralprotein
CBF1
?
??
?
C/GTGGGAA
Corepressor
CBF1EBNA-3A/C
The Notchpathway: CSL/CBF1 signalling
in cells infected with γ-herpesviruses
Notch/CBF1 signalling
Herpesviral CBF1 signalling
C/GTGGGAA
CBF1vIRF/RTA/LANA
MAM-L1
EBV:
KSHV:
Das virale Protein LMP2A aus EBV und der B-Zellrezeptor Komplexrekrutieren die Kinasen Lyn und Syk über ITAM Motive
Ligand-vermittelte AktivierungAbberante Konstitutive Aktivierung
Thorley-Lawson 2001
Kanonischer und alternativer NFkB Signalweg werden in Tumoren häufig dereguliert
Jost und Ruland 2007
p65 p50RelB p52
LMP1
NH2AS187AS 24
AS1
AS 193 Plasmamembran
Zytoplasma
Kern
verändert aus Cornelia Hömig (Dissertation)
ATF2 Elk-1
FOS Jun
AP-1 aktivierte Gene
Kanonischer NFkB Signalweg Alternativer NFkB Signalweg
Das virale Protein LMP1 des EBV und der Ligand-aktivierte CD40 Rezeptoraktivieren ähnliche Signalwege und in der Folge kommt es
auch zur Aktivierung der Transkription ähnlicher Zielgene im Kern
verschiedene Adaptorenaus der TRAF Familie
Ligand-vermittelte Aktivierung Abberante Konstitutive Aktivierung
MAP- Kinase Signalweg
CD40
Adoptive Immuntherapie:Zellbasierte Krebstherapie am Beispiel EBV assoziierter Erkrankungen
(Post-Transplantlymphome, Morbus Hodgkin)
Expansion EBV infizierter B-Zellen in vitro
Ko-Kultur mit T-Zellen
Expansion EBV spezifischer T-Zellen
B-Zelle+ EBVex vivo:
Peripheres Blut
Vor der Transplantation: Patient oder Knochenmarksspender (EBV pos.)
Nach der Transplantation:
T-Zelle
***
* *
Das latente KSHV GenomLatente Gene: LANA1, v-Cyclin, v-FLIP, Kaposin, miRNAs (vIRF3)
virale Piraterie lytischer und latenter Gene
Zelluläre Heterogenität des Kaposi Sarkoms (Spindelzellen und zelluläres Infiltrat)
Hämatoxylin und Eosin
Reaktive Entzündung oder neoplastische Veränderung
Lytischer oder abortiv lytischerLebenszyklus
LatenterLebenszyklus
LANA
Parakrine Stimulationder latent infizierten NachbarzelleAngiogeneseEntzündungsmediatoren
Inhibition von p53 abh. ApoptoseZellzyklusregulation
Die SpindelzellevGPCR K1 K15
KSHV Proteine
vCyclin
vCyclinLANA
vIL-6
Cyclin abhängige Kinasen (CDKs) werden von Cyclinen aktiviert und von spezifischen Inhibitoren (CKIs) kontrolliert.
Das Retinoblastoma Protein (Rb) inhibiert die Aktivierung von E2F-regulierten Genen im hypo-phosporyliertem Zustand.Die Rb Phosphorylierung führt zur Auflösung des Rb/E2-F Komplexes.Der Transkriptionsfaktor E2-F aktiviert die Transkription.
E2-F
Rb
Gene desS-Phasen-
eintritt
E2-F
cyclincdk
P P
Rb
AUS AN.
v-cyclin wird in latent mit KSHV infizierten Zellen exprimiert.
Boshoff und Weiss, 2002
p15p16p18p19
CKIs der INK Genfamilie
Coscoy 2007
KSHV Proteine
Interferon Regulatory Factor (IRF)
A) Induktion der Immunantwort B) Interferon Wirkung(Expression antiviraler Proteine)
Plasmamembran
Kern
KSHV Blockade der
Anti-apoptotische Proteinedes KSHV:
vBCL-2 blockiert BAX/BAC vermittelten Cytochrom C AusstromvFLIP aktiviert NF-kB SignaltransduktionvIAP blockiert die Aktivierung der Effektor-Kaspasen
P. Krammer et al., 2007
Immune Evasion CMVAntigenprozessierung und Antigenpräsentation im Komplex mit MHC Klasse I Proteinen
a) US6 blockiert TAP-vermittelten Transport von Peptiden ins ER (Early und Late)b) US3: MHC Klasse I Moleküle werden im ER zurückgehalten (Immediate Early)c) US11: US2: Rücktransport von MHC Klasse I und Degradation im Zytoplasma
(Early)
Transporters Associatedwith Antigen Processing(TAP)
hCMV
Reddehase (2002)
Proteasom
ER
MHC Klasse I Peptid-beladen
T-Killerzelle
Virus-infizierteZielzelle
T-Zellrezeptor CD8
MHC Klasse I
Zelllyse
MCMV: Antigenprozessierung und Antigenpräsentation durch MHC Klasse I Moleküle
a) m04 (E/L) eskortiert nicht funktionelle/modifizierte MHC Klasse I Molekülean die Plasmamembran
b) m06 (E): lysosomale Degradation von MHC Klasse I und Antigen c) m152 (E): Retention von Antigen beladenen MHC Klasse I Molekülen im ER
mCMV
T-Killerzelle
Virus-infizierteZielzelle
T-Zellrezeptor CD8
MHC Klasse I
Zelllyse
NatürlicheKillerzelle
Virus-infizierteZielzelle
KillerInhibitorischerRezeptor (KIR)
MHC Klasse I
Blockade der ZelllyseReddehase (2002)
ER
GOLGI
Proteasom
Herpesvirus Saimiri (HVS)
• γ2-Herpesvirus, apathogen im natürlichen Wirt, Übertragung durchSpeichel, lebenslange Persistenz
• HVS kann aus dem peripheren Blut infizierter Tiere durch Kokulturgewonnen werden
• Akute T-Zelllymphome in anderen Affenspezies (Tamarin, Krallenaffen)
• Langzeitproliferation humaner T Zellen
Saimiri sciureus
Herpesvirus Saimiri (HVS)
Saimiri sciureus
Transformations-assoziierte Membranproteine des HVS regulierenNF-kB, MAPK, STAT, Lck Signalwege
Murine γ-Herpesvirus 68 (MHV68)ein Tiermodell für γ-Herpesviren (EBV und KSHV)
• natürlicher Wirt: Waldmaus und Rötelmaus
• Übertragung: Experimentell durchTröpfcheninfektion (intranasal) in Labormausstämmen
• Infektiöse Mononukleose und Splenomegalie• Lebenslange Latenz in B-Zellen
• Anerkanntes Modell für Etablierung von Latenzaber als Tumormodell umstritten
Zeit nach Infektion
Zeit nach Infektion
Zeit nach Infektion
Viru
s-Ti
ter
CD
8+T-
Zelle
nSp
leno
meg
alie
,A
ntik
örpe
r
Lytisches Virus
Latentes Virus
CD8+
Vβ4+CD8+
Splenomegalie
PolyklonaleAntikörper
VirusspezifischeAntikörper
A
B
C
Zeitverlauf der MHV 68 Infektion und der Virus-spezifischen Immunantwort
Herpesviren Vorlesung
• Principles in Virology Hrsg. Flint, Enquist, Racaniello, Skalka (2009)• Medizinische Virologie Hrsg. Doer, Gerlich (2010)• Molekulare Virologie Hrsg. Modrow, Falke,Truyen,Schätzl 3. Auflage (2010)• Fields Virology Hrsg. Knipe, Howley Band 2 (2007)
• Zahlreiche Folien aus: Virologie Vorlesung LMU (Medizinische Fakultät)
Bettina KempkesHämotologikumHelmholtz Zentrum MünchenMarchioninistr. 2581377 München (Großhadern)