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Granulozytenimmunologie und -transfusion
Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin
der Justus Liebig-Universität Gießen
Prof. Dr. med. Ulrich Sachs
JUSTUS - LIEBIG -
UNIVERSITÄT
GIESSEN
FACHBEREICH
MEDIZIN
1.500-1.000/µl mild
1.000-500/µl moderat
<500/µl schwer
CAVE:
•max. 10% des Pools
•nur 2% des Lebenszyklus
Knochenmarkspeicher
Reifungszeit ca. 5-7 d
(ca. 9 x 109/kg KG)
1.63 x 109/kg KG/d Zirkulation
Verweilzeit 8-20 h
(ca. 0.3 x 109/kg KG)
Randspeicher
(ca. 0.4 x 109/kg KG)
Gewebespeicher
Granulozytopenie und Granulozytenpool
Bildungsverminderung
1) Arzneimittel (Alkylanzien; Antimetaboliten)
2) hämatologische Erkrankungen (idiopathisch/zyklisch; Kostmann)
3) Myelofibrose, Knochenmarkkarzinose
4) Alkoholismus/B12- und Folsäuremangel
5) Infektionen (Tbc, AIDS, Virushepatitis, Malaria, EBV, Typhus)
Gesteigerter Abbau
1) antineutrophile Anitkörper
2) Hypersplenismus
3) Autoimmunerkrankungen (M.Felty, RA, SLE)
4) Arzneimittel als Haptene (Methyldopa, Phenylbutazon)
5) M. Wegener
Peripheres Pooling
Ursachen der Neutropenie
2
Neutropenie bei Neugeborenen und Säuglingen
• Plazentainsuffizienz, mütterliche Hypertonie
• Bakterielle Infektion
• Alloimmunneutropenie
• Autoimmunneutropenie
• kongenitale/zyklische Neutropenie (severe chronic neutropenia)
• Kostmann-Syndrom
• ivIG-assoziierte Neutropenie
• Leukämie
Differentialdiagnose bei Neugeborenen/Säuglingen
Granulozytenserologie
Verheugt et al., Br J Haematol 1977
Granulozytenimmunfluoreszenztest (GIFT)
3
Granulozytenimmunfluoreszenztest (GIFT)
Granulozytenagglutinationstest (GAT)
Granulozytenagglutinationstest
GAT = 0
(Inkubation mit AB-Plasma)GAT = 80
(Inkubation mit Anti-HNA-3a)
4
Lymphozyt
Photomultiplier
Lymphozytenimmunfluoreszenztest (LIFT)
Lymphozytenimmunfluoreszenztest
AB-Plasma
Anti-HLA-A2
GIFT GAT LIFT
0 1 2 3 4Reaktionsstärken 0-4:
HLA
Anti-HNA-1b
Auto-Ak
negativ
Serologische Reaktionsmuster (Beispiele)
5
Luminex®-Technologie
nicht verfügbar für HNA-3
Anwendungsbeobachtung:
- HNA-1a und HNA-1b-
Diskriminierung bei vielen
Proben kritisch
- HNA-2-Erkennung
zuverlässig
- Autoantikörper: keine
Erfahrungswerte
Alloimmunreaktionen
Fetus Mutter
Pathomechanismus
6
Von 1016 untersuchten Proben
postpartaler Frauen enthielten …
• 4 (0,4%) Seren HNA-Antikörper
• 248 (24%) Seren HLA-Antikörper
• 49 Seren (4.8%) nicht-zytotoxische HLA-Antikörper
Clay et al., Transfusion 1984
Alloantikörper: Vorkommen
Fallbeispiel
männlicher Säugling, 10 Tage
klinisch: Omphalitis
Milz, Leber, Lymphknotenstatus unauffällig
Thrombozyten 313.000/µl
Erythrozyten 4.5 Mio/µl
Hb 15.1 g/dl
Leukozyten 5000/µl
Differenzierung:
Stabkernige 0*
Segmentkernige 2
Eosinophile 6*
Basophile 0
Lymphozyten 71*
Monozyten 21*
Zielantigene anti-granulozytärer Alloantikörper
HNA alte
Nomenklatur
Gen Protein Antigen-
Häufigkeit
1a NA1
FCGR3BCD16b
(FcgRIIIb)
58
1b NA2 88
1c SH 5
1d 88 (?)
2 NB1CD177
CD177
(NB1)
97
3a 5bSLC44A2 CTL-2
97
3b 3
4a MartITGAM
CD11b
(Mac-1)
99
4b -
5a OndITGAL
CD11a
(LFA-1)
86
5b -
7
24-105: Domäne 1
107-189: Domäne 2
N39
N75
N163
N170
Arg36Ser
Asn65Ser
Asp82Asn
Val106Ile
Aminosäurenaustausch
Oligosaccharid
HNA-1aHNA-1b
HNA-1 auf FcgRIIIb (CD16b)
Ala78Asp
HNA-1c
GIFT GAT LIFT
HLA
HNA-1b??
Das Problem mit der HLA-Immunisierung
S
P
MAIGA
S
8
MAIGA
pos. Kont.
Patient 1
Patient 2
neg. Kont.
pos. Kont.
Patient 1
Patient 2
neg. Kont.
HNA-1b HNA-1a
Patient 1: Anti-HNA-1b; Patient 2: negativ
Genotypisierungsverfahren
HNA-2: multiple Polymorphismen (Kissel et al., 2002)
FCGRB*1
FCGRB*2
FCGRB*3
CTL2*461G
CTL2*461A
ITGAM*230G
ITGAM*230A
ITGAL*2466G
ITGAL*2466C
HNA-1a
HNA-1b, -1d
HNA-1c
HNA-3a
HNA-3b
HNA-4a
HNA-4b
HNA-5a
HNA-5b
Bux et al., 1994
Bux et al., 1997
Greinacher et al., 2010
Sachs et al., 2004
Sachs et al., 2005
• Omphalitis, Staphylodermie
• andere Infektionen (Otitis, Atemwege, Urogenitaltrakt)
• keine Sepsis, keine Todesfälle
• primäre Therapie: Antibiose
• G-CSF wirksam, aber in der Regel nicht erforderlich
• Neutropenie-Dauer: 11 Wochen (3-28 Wochen)
• auch bei Erstgeborenen beschrieben
Lalezari et al., Semin Hematol 1974
Bux et al., Transfus Med 1992
Alloimmunneutropenie: Klinik
9
Autoimmunreaktionen
Fallbeispiel
21 Monate altes Mädchen
klinisch: Stomatitis, zervikale Lymphknotenschwellung
Milz, Leber unauffällig
Thrombozyten 330.000/µl
Erythrozyten 4.8 Mio/µl
Hb 11.8 g/dl
Leukozyten 5300/µl
Differenzierung:
Stabkernige 0*
Segmentkernige 6*
Eosinophile 2
Basophile 0
Lymphozyten 77*
Monozyten 15*
Knochenmark:
linksverschobene Granulopoese
Epidemiologie
• Kinder unter 2 Jahre
• Infektionen meist zwischen dem 1. und 15. Lebensmonat
• Häufigkeit angeblich 1:100.000 (Lyall et al., J Clin Pathol 1992)
• Mädchen (54%) häufiger betroffen als Jungen (46%)
Klinik
• milde bis moderate, wiederkehrende Infektionen der Haut, des
Oropharnynx, selten Pneumonien;
• aber: 10% schwere Infektionen
• intrauterines Auftreten berichtet (Calhoun et al., Pediatrics 2001)
• Knochenmarkbefunde uneinheitlich
Autoimmunneutropenie: Klinik
10
132 Kinder mit Autoimmunneutropenie*
Normalbefund 31%
Normozellulär mit reduzierter Anzahl reifer Neutrophiler 13%
mit Reifungsstopp bei Bandformen 4%
mit Reifungsstopp auf Metamyelozytenniveau 1%
Hyperzellulär mit reduzierter Anzahl reifer Neutrophiler 18%
mit reifen Neutrophilen 26%
mit Reifungsstopp auf Metamyelozytenniveau 1%
mit Reifungsstopp auf Myelozytenniveau 1%
Hypozellulär mit reduzierter Anzahl reifer Neutrophiler 2%
mit reifen Neutrophilen 1%
*Bux et al., Blood 1998
Knochenmarkbefunde bei der Autoimmunneutropenie
Prognose
• Spontanremissionen in 80-95% der Kinder
• Remissionsbeginn nach 7-24 oder 1-38 Monaten
(Ø Krankheitsdauer 12 Monate)
Therapie
Zuwarten, aber …
• kein IgG!
• kein Anti-CD20!
• ggf. Langzeitprophylaxe (Cotrimoxazol)
• ggf. G-CSF (Akuttherapie)
Verlauf
TRALI
11
Transfusions-assoziierte akute Lungeninsuffizienz
1. Akute Lungeninsuffizienz:
- akuter Beginn
- Hypoxämie (FiO2 ≤ 300 mmHg oder
SpO2 < 90% bei Raumluft)
- bilaterale Infiltrate im Röntgen-Thoraxbild
- kein Hinweis auf linksatriale Hypertension
2. kein vorbekanntes ALI
3. während der Transfusion oder binnen 6 Stunden
4. kein zeitlicher Zusammenhang mit einem anderen
Risikofaktor für eine ALI
Kleinman et al, Transfusion 2004 / Wallis & Sachs, Rossi‘s Principles, 2009 / Sachs, Transfus Apher Sci 2007
4h post GFP
Antibody specificity Number of cases Fatalities Blood component
HLA class I 4 0 4 FFP
HLA class I + II 3 1 3 FFP
HLA class II 17 3 17 FFP
HNA-1a 1 0 1 FFP
HNA-2a 1 0 1 FFP
HNA-3a 10 6 7 FFP, 2 RBC, 1 PC
Total 36 10
1Reil et al., Vox Sang 2008; 2Williamson L et al., SHOT 2006
92% of all TRALIs were caused by plasma transfusion
risk per component as calculated from SHOT data2:
plasma, 1:95,000 vs. RBC, 1:1,500,000
Antikörper bei TRALI1
Pathophysiologie
Wallis JP & Sachs UJ, In: Rossi‘s Principles of Transfusion Medicine (2009); Bux J & Sachs UJ, Br J Haematol 2007
*Sachs et al, Blood 2011; **Hofstra et al, Semin Thromb Hemost 2008; Vlaar et al, Blood 2010; Jensen et al, Vox Sang 2010
1
2
HNA/HLA Klasse I
1
2
HLA class II*
6-8 µm 2-15 µm
Arteriole VenulePulmonalkapillare
8 Alv / ~25 Kap
t = 26 sec (Ery < 4 sec)
2
1
Bioaktive Substanzen
12
strength of transfusion-
related mediators
individual
predisposition
mild TRALI
healthy individuals patients at risk
activated primed resting
neutrophils / endothelial cells
A Bsevere TRALI
Bux J & Sachs UJ, Br J Haematol 2007
Das Schwellenmodell der TRALI
Clinical evidence: recipient-related factors
Sachs UJ, Curr Opin Hematol 2011
Risk factor OR Author, year Number of patients with TRALI/ number
of enrolled patients
History of heavy alcoholism 2.7 Gajic, 2007 74/901
(8.2 %)Sepsis 2.6
Liver disease 2.1
End-stage liver disease 31.7 Benson, 2010 22/225
(9.7 %)
Emergency coronary artery
bypass grafting
17.6 Vlaar, 2010 109/2,024
(5.4 %)
Hematologic malignancy 13.1
Massive transfusion 4.5
Mechanical ventilation 3
Sepsis 2.5
Patient age n/a Vlaar, 2011 16/668
(2.4 %)Time on cardiopulmonary bypass n/a
Chronic alcohol abuse 5.9 Toy, 2012 Case-control-study
89 TRALI, 164 control casesFluid balance before transfusion
(increment per L)
1.15
Peak airway pressure >30 cm H20
before transfusion
3.6
Shock before transfusion 4.2
Current smoker 3.4
Liver surgery 6.7
Clinical evidence: transfusion-related factors
Sachs UJ, Transfus Clin Biol 2012
Risk factor OR Author, year
Any high plasma volume components 2.78 Gajic, 2007
Number of units from female donors 1.51
Amount of female plasma (L) 5.09
Amount of female plasma (L) with at least one pregnancy 9.48
Number of HLA class II positive units 3.08
Number of GIFT positive units 4.85
Mean lysoPC 1.61
Number of HLA class I positive units -
Antibody-positive units 14.2 Vlaar, 2011
HLA class II positive units -
HLA class I positive units -
GIFT positive units -
RBC storage time -
PLT storage time -
Lyso PC -
Female plasma 4.5 Toy, 2012
Quantity of cognate anti-HLA class II antibodies 3.2
Volume of GIFT positive blood products 1.71
HLA class I antibodies -
Amount of lysoPC -
RBC storage time -
13
Mechanical ventilation strategies and TRALI
*Vlaar et al, Crit Care Res Pract 2012
10 cm H2O, 110/min (LVT) vs. 18 cm H2O, 50/min; PEEP 2 cm H2O (HVT)*
TRALI-Diagnostik/Labordiagnostik
klinischer Verdacht
(Leitlinien)keine
Diagnostik-
+
Screening
GIFT (IgG, IgM, IgA)
GAT
LIFT
HLA-Klasse I ELISA
HLA-Klasse II ELISA
Spender
frei- +
Differenzierung
MAIGA
HNA-Genotypisierung
HLA-Ak-Differenzierung
HLA-Genotypisierung
Spender gesperrt
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2003 2004 2005 2006
all TRALI cases
TRALI deaths
highly likely/probable TRALI
plasma from male donors
only* (Oct 2003)
Male only-Plasma* (Großbritannien)
*ca. 15% S/D-Plasma
14
Transfusion-related acute lung injury
Funk et al, Vox Sang 2012
Vox Sang, 2009
Recommendations of the ISBT Working Party on Granulocyte Immunobiology for
leucocyte antibody screening in the investigation and prevention of antibody-
mediated transfusion-related acute lung injury.
Bierling P, Bux J, Curtis B, Flesch B, Fung L, Lucas G, Macek M, Muniz-Diaz E,
Porcelijn L, Reil A, Sachs U, Schuller R, Tsuno N, Uhrynowska M, Urbaniak S,
Valentin N, Wikman A, Zupanska B.
screen for HLA class I and HLA class II
screen for granulocyte antibodies (HLA is not a substitute)
screen for HNA-3a
not many laboratories will be able to screen
cost accounting: 28.81 €/donor1
1Sachs UJ et al, Transfus Med 2008
Antikörpersuche als Präventions-Strategie?
TRALI-Prävention
Nicht-immunogenes TRALI
- generelle Leukozytendepletion
- gewaschene Blutprodukte für Risikopatienten
- frische Blutprodukte für Risikopatienten
Immunogenes TRALI
- partieller/genereller Ausschluss von Frauen (Schwangerschaft)
- Screening auf granulozytenreaktive Antikörper
- alternative Präparate (S/D-Plasma)
15
Granulozytentransfusion
zentrale Aufgabe: unspezifische Abwehr von Bakterien und Pilzen
Ausmaß und Dauer der Neutropenie sind proportional zum Infektionsrisiko
(kritischer Wert ca. 1.000/µl)(Bodey et al., Ann Intern Med 1966)
Infektionen durch Versagen der unspezifischen Abwehr bei:
•Chemotherapie maligner Erkrankungen
•Knochenmarkerkrankungen
•Funktionsdefekte neutrophiler Granulozyten
Schwellendosis für die Granulozytentransfusion ca. 2 x 108/kg KG(Dale et al., Blood 1976)
Hintergrund
Pool-GK aus buffy coats
•kein klinischer Erfolg nachweisbar (Baley et al., Pediatrics 1987)
Adhäsion von Granulozyten an Nylon
•schlechte Ausbeute, toxische Effekte (Djerassi et al., J Med 1970)
Granulozytapherese
•bessere Separation und Ausbeute durch
Sedimentationsbeschleuniger (Lowenthal et al., Transfusion 1975)
•favorisiert wird HAES, maximal 500 ml (Strauss et al., Transfusion 1986)
•mindestens 12 Einzelspender
Leukozyten von Spendern mit CML
•effektiv praktikabel und wirksam (Freireich et al., Ann NY Acad Sci 1964)
•organisatorische und biologische (?) Vorbehalte
Techniken der Granulozytengewinnung
16
Granulozytapheresepräparat bei CML
10 l Prozessvolumen
ohne Stimulation 2.0 x 109 2 kg
10 l Prozessvolumen
nach Corticosteroiden (8 mg Dexa p.o.) 2.0 x 1010 20 kg
6.5 l Prozessvolumen
nach G-CSF (5-10 µg/kg KG) 4.0 x 1010 40 kg
7 l Prozessvolumen
nach G-CSF + Dexamethason 6.7 x 1010 67 kg
Loftus et al., J Clin Apheresis 1983; Bux et al., Vox Sang 2003; Stroncek et al., Transfusion 2001
Ertrag Päd.* Erw.*
STOP
STOP
Spenderstimulation vor Granulozytapherese
Metaanalyse [8 Studien prä-G-CSF] (Vamvakas & Pineda, J Clin Apheresis 1997)
Outcome abhängig von:
• Leukozytenkompatibilität
• Dosis
• Dauer der Neutropenie
Adäquate Dosen kompatibler Leukozyten:
• reduzieren das Infektionsrisiko signifikant
• reduzieren Tod und Tod durch Infektion signifikant
Kenndaten der Granulozytapherese-PräparateKlinische Wirksamkeit von Granulozytentransfusionen
17
Präparatevolumen 296 ± 68 ml
Leukozytengehalt 5,27 x 1010 ± 2,41 x 1010
Granulozytengehalt 4,31 x 1010 ± 2,32 x 1010
Thrombozytengehalt 35,6 x 1010/l ±15,1 x 1010/l
Erythrozytengehalt 1,5 x 1012/l ± 2,7 x 1012/l
Zusammensetzung von n=996 Apheresaten
Studie der DGTI*
*n=415 Spender in 14 Zentren; Sachs et al, unpublished
Biologische Wirkung von G-CSF
Drewniak A et al., Haematologica 2008
Nebenwirkungen (Spender)
Studie der DGTI*
*n=415 Spender in 14 Zentren; Sachs et al, unpublished
18
Der Separationserfolg ist abhängig vom Stimulationserfolg.
Mit der Zahl der Spenden innerhalb eines Spendezyklus
steigen Stimulations- und Separationserfolg an.
Stimulations- und Separationserfolg sind abhängig vom
Geschlecht: Frauen spenden eher bessere Präparate als Männer.
Alter und G-CSF-Typ haben keinen Einfluss auf den
Stimulations- und Separationserfolg.
Nebenwirkungen sind abhängig vom Geschlecht:
Frauen haben mehr Nebenwirkungen als Männer.
Nebenwirkungen sind unabhängig vom Stimulations- und
Separationserfolg, vom Alter und von der Anzahl der
Spenden innerhalb eines Spendezyklus.
Studienergebnisse*
*n=415 Spender in 14 Zentren; Sachs et al, unpublished
Autor, Zeitschrift JahrInfekt-
tage
Erfolgs-
rate
Neben-
wirkungen
Hester et al, J Clin Apher 1995 12 (2-36)* *** ***
Dignani et al, Leukemia 1997 -** *** ***
Auffermann et al, Bone Marrow Transplant 1999 -** *** ***
Peters et al, Brit J Haematol 1999 8 (1-28) 70% moderat
Price et al, Blood 2000 -** 42% mild
Lee et al, Leukemia 2001 -** 40% schwer
Illerhaus et al, Ann Hematol 2002 -** 66% keine
Cesaro et al, Support Care Cancer 2003 12 (5-28) 40% mild
Grigull et al, Support Care Cancer 2006 >3*** 75% mild
Sachs et al, Transfusion 2006 6 (3-18) 82% mild
Ofran et al, Vox Sang 2007 12 (1-22) 62% schwer
*Responder: 8 Tage; Non-Responder, 17 Tage; **keine Angabe; ***keine genauere Angabe
Kenndaten der Granulozytapherese-PräparateNicht-randomisierte Studien (G-CSF)
Kenndaten der Granulozytapherese-PräparateKlinische Anwendung I
Ein-Gal et al., Transfusion 2007
Wunddebridement
bei Fasciitis necroticans
(vor Transfusion)
Wunddebridement
bei Fasciitis necroticans
(nach Transfusion)
19
Klinische Anwendung II
1 2 3
1
2
3
4
5
AN
C (
x 1
09/l)
4
2
4
6
8
10
12
14
CR
P (
mg/d
l)Sachs et al., Transfusion 2006
Randomisierte Studien
Studie, Jahr Publikation Patienten
(GTX vs.
Kontrolle)
Granulozyten
(mittlere Dosis,
x1010)
Higby 1975 New Engl J Med 17/19 3,7
Alavi 1977 New Engl J Med 12/19 5
Herzig 1977 New Engl J Med 13/14 0,4/1,7
Vogler 1977 Am J Med 17/13 2,7
Scali 1978 Schw Med Wo 13/12 2,9
Winston 1982 Ann Int Med 48/47 0,5
Klastersky 1983 Schweiz and Wschr 16/23 >1
Bow 1984 Can Med Assoc J 13/11 0,87
Seidel 2008 Bone Marrow Transplant 40/39 >3
Randomisierte Studien
Sterblichkeit1 (alle) 0,64 [0,33-1,26]
Sterblichkeit1 (high dose) 0,37 [0,17-0,82]
Metaanalyse aus Cochrane, 2005
Seidel et al, 2008: Daten extrahiert
1Sterblichkeit Tag 20-22
Infektionskontrolle 0,94 [0,71-1,26]
Sterblichkeit2 1,07 [0,57-2,01]
0,5 21
2Sterblichkeit Tag 28 (Seidel et al, Bone Marrow Transplant 2008)
20
Bewertung
Granulozytentransfusionen sind eine gut verträgliche,
angemessene Therapie bei hämatologischen Erkrankungen mit
persistierendem Fieber in therapie-induzierter Neutropenie.
Leukozytenverträglichkeitsuntersuchungen vor Transfusion
können zu einer Reduktion des Transfusionsrisikos beitragen.
Eine frühe Interventionsstrategie (um Tag 6 der Infektion) führt
vermutlich zu einem besseren Ansprechen als eine spätere
Intervention.
Randomisierte Studien mit einem frühen Interventionsdesign sind
dringend erforderlich, um den klinischen Einsatz von
Granulozytenpräparaten zu prüfen (Eudra-CT 2009-010700-28)
Justus Liebig-Universität Gießen
Fachbereich Humanmedizin
Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin