INTERFAKULTÄRES INSTITUT FÜR BIOCHEMIE, UNIVERSITÄT TÜBINGEN
Adenosine-to-inosine RNA editing allows for reprogramming genetic infor-mation on the RNA level. We have re-engineered human ADAR proteinsinto guide-RNA-dependent enzymes in order to obtain a tool for the site-selective manipulation of arbitrary RNAs. In the future such a tool couldbe used to understand the crosstalk of editing and RNA processing or forthe on/off-switching of disease-related point mutations.
ó Aufgrund ihrer einzigartigen molekula-ren Erkennung ragen die Nukleinsäuren ausder Menge der Biomoleküle heraus. Ihrewechselseitige Erkennung via Basenpaarungist wesentlich für die einfache und rationelleProgrammierung von Paarungskomplexen mitvorhersagbarer Spezifität, Bindungsenerge-tik und -dynamik und bildet die Grundlageder genetischen Informationsverarbeitung inder Zelle.
Mithilfe der Basenpaarung können Nuk -leinsäuren direkt und sehr spezifisch in die
Genfunktionen regulativ eingreifen. Be -sonders effizient und mannigfaltig gelingtdies jedoch erst im Zusammenspiel mit kata-lytisch aktiven Proteinkomplexen. Verschie-dene enzymatische Aktivitäten werdenmittels guide-RNAs an zelluläre Nukleinsäu-ren (DNA und RNA) gezielt adressiert, umdiese chemisch zu verändern. Derartige Pro-teine enthalten demnach eine RNA-Kompo-nente, die guide-RNA, die es dem Proteinermöglicht, ein Nukleinsäuresubstrat spezi-fisch zu erkennen (Abb. 1). Beispielsweise
werden ribosomale und spleißosomale RNAsin einem snoRNA(small nucleolar-RNA)-adres-sierten Verfahren posttranskriptionell durch2�-O-Methylierung [1] und Transglykosylie-rung einiger Uridinbasen zu Pseudouridin [2]modifiziert. Mikro-RNAs vermitteln denAbbau und die translationale Stilllegung vonmRNAs durch spezifische Adressierung derArgonaut-Proteine im RNA-induced silencingcomplex (RISC) [3]. In Hefe wurde gezeigt,dass ein verwandter RNA-abhängiger Mecha-nismus zur epigenetischen Stilllegung vonGenen führt (RITS, RNA-induced transcriptio-nal silencing complex,[4]). Und in Bakterienund Archaeen bewirken die CRISPR(cluste-red regularly interspaced short palindromicrepeats)-Transkripte eine Cas-Protein-ver-mittelte Immunität gegenüber fremdenNukleinsäuren [5].
guide-RNA-abhängige Enzyme könnenumadressiert werdenAllen diesen Maschinen ist gemeinsam, dasskatalytisch aktive Proteindomänen, etwaNukleasen, Methyltransferasen oder Trans-glykosylasen, mittels guide-RNAs an Nuklein-säuretargets (RNA oder DNA) spezifischadressiert werden. Des Weiteren konnten alleerfolgreich durch die Gabe künstlicher guide-RNAs zu neuen Nukleinsäuretargets um -adressiert werden. Besonders breite Anwen-dung hat der Knock-down von Genfunktionendurch den RISC-vermittelten Abbau vonmRNA erlangt. Die Transfektion oder Ex -pression künstlicher small interfering-RNA (siRNA), besser bekannt als RNA-Interferenz,ist in den letzten zehn Jahren zu einem Stan-dardwerkzeug der Zellbiologie geworden. DieUmadressierung der Cas9-Nuklease mittelskünstlicher guide-RNAs wird derzeit in einemkompetitiven Wettlauf mehrerer Arbeits-gruppen zu einem Werkzeug entwickelt, wel-ches ein altes Problem der Zellbiologie lösenkönnte, nämlich die effiziente und zielgenaueManipulation komplexer eukaryotischerGenome [5]. Im Vergleich dazu hat die Um -adressierung RNA-modifizierender Ribopro-teine weniger Aufmerksamkeit erlangt. Eine
Gezielte RNA-Manipulation
Gerichtete Editierung – ein Werkzeugzur Reprogrammierung von RNA
˚ Abb. 1: Nukleinsäuren können durch Basenpaarung Genfunktionen beeinflussen. Verschiedenezelluläre Nukleinsäuren, etwa small nuclear-RNA (snRNA), messenger-RNA (mRNA) oder genomi-sche DNA (gDNA) (jeweils in Blau), werden an spezifischen Stellen enzymatisch modifiziert. Daskatalytisch aktive Protein, z. B. eine Methyltransferase, Transglykosylase oder Endonuklease, wirddazu mittels Basenpaarung zwischen Nukleinsäure (blau) und guide-RNA, z. B. small nucleolar-RNA (snoRNA), small interfering-RNA (siRNA) und clustered regularly interspaced short palindro-mic repeats-RNA (CRISPR-RNA) (rot), adressiert.
Ursache wird sein, dass diese Modifikationenrecht beschränkt in die Genregulation ein-greifen: Die Einführung einer 2�-O-Methyl-gruppe kann die RNA-Prozessierung blo-ckieren (etwa das Spleißen) [1], und dieUmwandlung von Uridin in Pseudouridinführt zu einem Durchlesen von Stoppcodons[2]. Für derartige Anwendungen gibt esbereits alternative Verfahren.
Editierungen sind spezielleRNA-ModifikationenChemische RNA-Modifikationen, die den Sinneines Codons in der Translation verändern,bezeichnet man auch als Editierungen. Der-artige Modifikationen erreichen mehr als nurdie Blockade aktiver biochemischer Prozes-se wie Transkription, Spleißen oder Transla-tion. Editierungen tragen maßgeblich zurDiversifizierung der Genprodukte bei, ent-weder indem sie die RNA-Prozessierungmodulieren (Erzeugung alternativer Spleiß-seiten), oder indem sie Punktmutationen imLeserahmen und damit Mutationen auf demProteinlevel erzeugen. Eine typische Editie-rung ist die enzymatische Desaminierung vonAdenosin zu Inosin (A-zu-I-Editierung) [6].Da Inosin biochemisch als Guanosin gelesenwird, handelt es sich formal um die Einfüh-rung einer A-zu-G-Punktmutation auf demRNA-Level, welche es erlauben sollte, bis zu
12 der 20 kanonischen Aminosäuren umzu-programmieren. Dies sind genau jene Ami-nosäuren, die für die Enzymkatalyse (z. B.His, Ser, Arg, Lys, Tyr) oder für die posttranslationale Proteinmodifikation mitZuckern, Phosphaten, Ubiquitin etc. (Asn,Gln, Asp, Glu, Thr, Ser, Tyr, Lys) essenziellsind. Folglich kann eine einzelne Editierungim Leserahmen dramatisch in die Funktio-nalität eines Proteins eingreifen. Tatsächlichfindet man im menschlichen Transkriptoman rund 30 Stellen hochspezifische Editie-rungen, welche den essenziellen Austauscheiner einzelnen Aminosäure bewirken. Dar-über hinaus kann A-zu-I-Editierung in die Pro-zessierung von RNAs eingreifen, etwa durchEditierung von (pri)-miRNAs (primary micro-RNAs), von miRNA-Bindeseiten im 3�-UTRoder durch Editierung von (alternativen)Spleißseiten oder anderer Signale (etwa desPolyadenylierungssignals). Wenn es gelänge,die A-zu-I-Editierung an beliebige Ziel-RNAszu adressieren und einzelne Codons gezielt zueditieren, so hätte man ein nützliches Werk-zeug in der Hand, um in der Zelle Punktmu-tationen an- und auszuschalten, ohne dassman das Genom verändern müsste, rescue-Gene bräuchte oder das Zielgen aus seinernatürlichen transkriptionellen Regulation ent-fernen müsste. Dadurch würde es möglich,den Wirkmechanismus von Punktmutationen
im zellulären Kontext wesentlich einfacherund genauer als bisher zu untersuchen.
Design von guide-RNA-abhängigenDesaminasenDie Enzyme, die die A-zu-I-Editierung kata-lysieren, die ADARs (adenosine deaminasesacting on RNA), sind allerdings keine guide-RNA-abhängigen Proteine. Sie erkennen ihreRNA-Substrate über N-terminale dsRNA(dop-pelsträngige RNA)-bindende Proteindomänen.Damit ist die Möglichkeit verbaut, diese Enzy-me mittels exogener guide-RNAs einfachumzuadressieren. Stattdessen steht man vorder Herausforderung, ein künstliches Ribo-protein – genauer eine guide-RNA-abhängigeDesaminase – neu zu entwerfen (Abb. 2). Tat-sächlich ist es so, dass ADARs ausschließlichdsRNA als Substrat umsetzen. Einzelsträngi-ge RNA wird weder von den Substratbinde-domänen noch von der katalytischen Domäneerkannt und gebunden. Daher lag es nahe,die Substratbindungsdomänen zu entfernenund die katalytisch aktive Desaminasedomä-ne mit einer guide-RNA auszustatten, die eszum einen erlaubt, die Desaminase neu zuadressieren, und die das Substrat der Editie-rung erst unter Bildung des RNA-Duplexesmit der Ziel-RNA erzeugt. Dieser Ansatz stell-te uns jedoch vor die Herausforderung, RNA-Protein-Komplexe oder -Konjugate effizientherzustellen, die spezifisch aus unserer guide-RNA und der Desaminase bestehen.Hierzu diente ein biotechnologisches Tool,das ursprünglich für das Imaging von Pro -teinen entwickelt worden war: das SNAP-Tag[7]. Dabei handelt es sich um eine evolvierteAlkylguanin-DNA-Alkyltransferase, welchespezifisch O-6-Benzylguanin erkennt undunter Freisetzung von Guanin den Benzylrestkovalent sowie genau einmal auf einenbestimmten Cysteinrest der SNAP-Tag-Domä-ne überträgt. Der Trick dabei ist, dass der Aro-mat in para-Position mit beliebigen chemi-schen Gruppen (typischerweise Farbstoffen)ausgestattet werden kann, welche nun hoch-definiert und kovalent mit dem Protein ver-bunden sind. Da die Reaktion sehr schnellund vollständig abläuft, konnten wir eine Viel-zahl verschiedener guide-RNA-Desaminase-Konjugate in situ herstellen und in der Editierung untersuchen, wobei keine Aufrei-nigung oder Charakterisierung der Konju gatenotwendig war [8].
Gezielte Editierung von mRNAWir haben die gerichtete Editierung zunächstin vitro an Reportergenen optimiert. Dazu wur-
˚ Abb. 2: Erzeugung definierter guide-RNA-Desaminase-Konjugate. Durch Fusion der Desamin -asedomäne mit einer SNAP-Tag-Domäne gelingt die Darstellung definierter 1+1-RNA-Proteinkon-jugate sehr einfach. Die Spezifität der Reaktion beruht auf der chemischen Modifikation der guide-RNA mit einem Benzylguanin(BG)-Rest. Unter Freisetzung von Guanin wird die guide-RNAeinmal enzymatisch auf das Fusionsprotein kovalent übertragen. hADAR: human adenosine deaminases acting on RNA.
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BIOspektrum | 02.14 | 20. Jahrgang
de ein funktionell wichtiger Tryptophanrest(UGG) im cfp-Gen (cyan fluoreszierendes Pro-tein) zu einem Stoppcodon (UAG) mutiert,welcher dann mittels A-zu-I-Editierung aufdem RNA-Level repariert wird (Abb. 3). Tat-sächlich konnten wir die effiziente Reparaturdes Stoppcodons erzielen, ohne dass eine deranderen 244 Adenosinbasen der mRNA edi-tiert wurde [8]. Eine effiziente Reparatur desUAG-Stoppcodons benötigte die mittige Einbettung der Zielbase (A) in einen 13 bis17 Basenpaare langen RNA-Duplex. Die Ziel-base konnte durch Fehlpaarung mit Cytosinspeziell aktiviert und durch Fehlpaarung mitGuanosin für die Editierung deaktiviert werden. Somit konnten wir zeigen, dass die guide-RNA mehr als nur eine adressierendeFunktion erfüllt: Die Sekundärstruktur desguide-RNA/mRNA-Duplexes beeinflusst maß-geblich die Aktivierung der Zielbase undermöglicht die Unterdrückung ungewollterNebenreaktionen an benachbarten Adeno-sinbasen [8]. Im schwierigen, Adenosin-hal-tigen Sequenzkontext erlaubt die chemischeModifikation der guide-RNA mit 2�-O-Methyl-gruppen eine Feinabstimmung der Editie-rungsselektivität. Dies ließ sich für den Aus-gleich der Faktor-V-Leiden-Mutation, einerkrankheitsrelevanten Punktmutation, aus-nutzen, deren Reparatur mithilfe unserer guide-RNA-abhängigen Desaminase in vitrogut gelang [9]. Die globale chemische Modi-fikation der guide-RNA sollte deren Potenz,Langlebigkeit und Spezifität insbesonderein vivo deutlich verbessern. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass sich enzymatischfunktionale guide-RNA-Desaminasekonjugatein 293T- Zellen assemblieren lassen undReportergene erfolgreich editieren [9]. Wieerwartet war dabei die chemische Modifika-tion der guide-RNA mit 2�-O-Methylgruppenund Phos phothioaten Voraussetzung für einerobuste Editierung.
AusblickUm der Anwendung in den Lebenswissen-schaften den Weg zu ebnen, muss nun gezeigtwerden, dass unser Werkzeug seine Funktionin lebenden Modellorganismen ausführenkann. Ebenfalls wünschenswert wäre die Ent-wicklung einer genetisch voll codierbarenVariante, die eine Expression anstelle einerTransfektion der guide-RNA in Gewebenermöglicht.
DanksagungWir danken der DFG (STA 1053/3-1), demFonds der Chemischen Industrie und der Uni-versität Tübingen für die großzügige finan-zielle Unterstützung. ó
Literatur[1] Zhao X, Yu Y-T (2008) Targeted pre-mRNA modificationfor gene silencing and regulation. Nat Methods 5:95–100[2] Karijolich J, Yu Y-T (2011) Converting nonsense codonsinto sense codons by targeted pseudouridylation.Nature 474:395–399[3] Meister G, Tuschl T (2004) Mechanisms of gene silencingby double-stranded RNA. Nature 431:343–349[4] Verdel A, Jia S, Gerber S et al. (2004) RNAi-mediated tar-geting of heterochromatin by the RITS complex.Science 303:672–676[5] Wang H, Yang H, Shivalila CS et al. (2013) One-step gene-ration of mice carrying mutations in multiple genes byCRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153:910–918[6] Nishikura K (2010) Functions and regulation of RNA edi-ting by ADAR deaminases. Annu Rev Biochem 79:321–349[7] Keppler A, Gendreizig S, Gronemeyer T et al. (2003) Ageneral method for the covalent labeling of fusion proteinswith small molecules in vivo. Nat Biotechnol 21:86–89[8] Stafforst T, Schneider MF (2012) An RNA-deaminase con-jugate selectively repairs point mutations. Angew Chem Int Ed 51:11166–11169
[9] Vogel P, Schneider MF, Wettengel J et al. (2014) ImprovingDirected RNA Editing In Vitro and in Cell Culture byChemical Modification of the guideRNA. Angew Chem Int Ed 53, doi:10.1002/anie.201402634
Korrespondenzadresse:Dr. Thorsten StafforstInterfakultäres Institut für BiochemieNachwuchsgruppe Chemische BiologieUniversität TübingenAuf der Morgenstelle 15D-72076 TübingenTel.: 07071-29-75376thorsten.stafforst@uni-tuebingen.dewww.ifib.uni-tuebingen.de/ research/ stafforst.html
¯ Abb. 3: Editierungeines UAG-Stoppco-dons in einer Repor-ter-mRNA. Die Editie-rung erfolgt dank derPaarung der mRNA(blau) mit einer guide-RNA (rot) orts-spezifisch. Bei erfolg-reicher Editierungwird anstelle vonAdenosin (rot) Gua-nosin (blau) in derSequenzierspur dercDNA ausgelesen.Die Editierungseffi-zienz und -selektivitätkann durch dieSequenz der guide-RNA ge steuert wer-den.
