Genetische Regulation in Eukaryoten

Definition:

Im strengen Sinne: Regulierung der Transkription eines Genes zu RNAs

Im weiteren Sinne: + Regulierung der Expression und Funktion von Genprodukten (RNAs, Proteine)

Analyse der Genexpression 0.

Es kann bestimmt werden: 1. … die Menge eines Genprodukts in einem specifischen Zelltyp, in behandelten oder kranken Zellen

2. … gleichzeitige Expression von sehr vielen Genen

Real-time PCR cycler

Microarray scanner

Emryogenese Erwachsene

Die Bedeutung der genetischen Regulation

Komplexität und Vielfalt des Phenotyps

1.

1. Molekuläre Diagnostik 2. Gentherapie 3. Individuelles Medizin

2.

DNA oder Protein chips

Die Bedeutung der genetischen Regulation - Anwendungen

Roger D. Kornberg Andrew Z. Fire Craig C. Mello

2006 2006

1965

Francois Jacob Jacques Monod

Nobel Preis

Die Bedeutung der genetischen Regulation - Anerkennung

Chemie – Studieren der eukaryotischen Genexpression

Physiologie oder Medizin - Entdeckung der RNA-Interferenz

Physiologie oder Medizin - Entdeckung des lac operons

3.

4.

Post-Transkriptional

Post-Translational

Regulierung von den Genen bis zu Proteinen

Transkription

mRNA Processierung

mRNA Transport

mRNA Lokalisation

mRNA Stabilität Translation

Proteindegradation

Proteinmodification

5.

1. Genetische Regulierung

2. Epigenetische Regulierung

3. Epigenetische Vererbung

Über diesen Themen reden wir:

1. Regulierung der Transkription

1. Chromatinregulierung

- Methylation

- Acetylation

2. Interaktion zwischen Regulatorelementen

● cis-Elemente: Promotoren, Enhancers und Silencers

● trans-Elemente: RNA-Polymerase, Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren

Regulierung der Transkription

cis-Element: lokalisiert auf dem gleichen DNA Strang als das Gen Trans-Element: lokalisiert im Cytoplasma

Chromatin: DNA - Protein – Komplex im Zellkern

10.

upstream Promotor

Promotor Terminator

Exon Intron Exon Intron Exon polyA-Signal

upstream basic Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1 pA T

Promotoren

Ex1 basic Promotor

25 - 30 Basenpaare

100 - 300 Basenpaare

11.

Promotor-Modul 34.

Basale Promotor-Modul

Response Modul

Zellspezifisches Modul

Entwicklungsregulatoren

Transkriptions- faktoren

TATA box TATAWAAR TFIID (core Promotor)

CAAT box GGCCAATCT NF-1

GC box GGGCGG Sp1

Octamer ATGCAAAT Oct-1

CRE WCGTCA CREB

Hitzenschock-Modul CTNGAATNTTCTAGA hsp27

Hypophysenzelle-Modul ATATTCAT Pit-1

Myoblast-Modul CAACTGAC MyoD

Lymphoid-Zelle-Modul GGGACTTTCC NF-B

Bicoid-Modul TCCTAATCCC Bicoid

Antennapedia-Modul TAATAATAATAATAA Ant

Consensus-sequenzen

N: allerlei Nukleotide W: A oder T

Expressionsmuster: bei der Kombination von Modulen bestimmt

Consensussequenzen = Motive, Elemente, Module

11

Modul

Umstrukturierung (remodeling) des Chromatins 13

Die Initiation der Transkription bei Eukaryoten

- Transkriptionsfaktoren

- Transkriptionskomplex

Transkribierte Region

E1 E2 E3 E4 E5 S2 S1

P T Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1

E6 E7

P: Promotor Ex: Exon I: Intron T: Terninator + polyA-Signal E: Enhancer S: Silencer Is: Insulator

Is Is

10-30.000 Basenpaare

Enhancers and Silencers

Transkriptionsfaktoren binden zu den DNA Regulatorelementen

general Zelltyp-specifisch

15.

Transkriptionsfaktoren

Enhancer

RNA-PolymeraseII

Aktivatoren DNA Promotor Gen

RNA-Synthese

Transkriptionsinitiationskomplex

adaptoren

Allgemeine Transkriptionsfaktoren

16.

Gen 2

P2 T Ex2 Ex3 Ex4 I3 I2

Zellen-spezifische Genexpression

Gen 1

P1 T Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1

Ex1 I1

Gen 2

P2 T Ex2 Ex3 Ex4 I3 I2

Gen 1

P1 T Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1

Ex1 I1

Hautzellen-spezifisches Enhancer

S

Neuron-spezifisches Enhancer

TF

Zellen-spezifische Genexpression: Histon-Muster! 1. Transkriptionsfactor wird exprimiert in der Zelle 2. Erreichbarkeit der Regulatorregion des Genes

17.

Hautzellen-spezifisches Enhancer

Neuron-spezifisches Enhancer

Transkriptionsfaktoren

Strukturmotive der Transkriptionsfaktoren

Helix-loop-helix DNAbindende und

aktivierende Domäne Aktivator Domän

DNS-bindende Domän

Transzkription aktivator

Promoter Gen

DNS-bindende Domän

Bindungsstelle

Aktivation

RNA Polimerase

Stimulation der Zusammenstellung des Komplexes

Stimulation der Komplexaktivität

20.

Helix-loop-helix Der Zellkern und die Transkription

Zytoplasma

Kernhülle Kernpore

Zellkern

Nucleolus

Heterochromatin

Kernpore

Aktivirung der Transkription bestimmter Gene

21.

Posttranskriptionale

Regulierung

mRNA-Prozessierung

1. Spleiβen

2. Capping

3. Polyadenylation

4. RNA-Editing

23.

Exon Intron Exon Intron Exon

Terminator

polyA-Signal

upstream basic Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1 pA T

Der Struktur der Gene

Transkribierte Region

Ex1 Ex2 Ex3 I2 I1

Ex1 Ex3

Codierende Region

Regulatorregion Transkribierte Region

Promotor

UTR: nicht-translatierte Region (untranslated region)

Introns: durchschnittlich 20-mal länger als Exons

Ex1

DNA

Prä-mRNA

mRNA

Ex2 Ex3

Ex2

ATG Stop

ATG Stop

pA

pA

pA AAAAAA Cap

5’-UTR - leader 3’-UTR- trailer

Enhancers

Schematische Darstellung des Spleiβens

Eukaryoten: Exons (kodierende Basensequenzen) und Introns (nichtkodierende Basensequenzen)

Der Vorgang des Spleiβens - Consensussequenzen an der Grenzen zwischen Introns und Exons - Spleiβosom: Komplex schneidet RNA, setzt Introns frei, verknüpft Exons (β-Thalassemie: β-Globin mRNA wird nicht richtig gespleiβt) - Selbst-Spleiβen: Ribozym (RNA mit katalytischer Aktivität)

(U1) (U2)

Die Funktionen der Intronen:

1. Alternatives spleiβen: mehr als ein Protein

2. Enthält Regulatorregionen

3. Genetischer Abfall

Spleiβen 27

5’-Ende: Cap-Gruppe (Schutz gegen Exonucleasen, Bindung der mRNA an das Ribosom)

3’-Ende: Poly(A)-Schwanz (Export aus dem Zellkern, Schutz

gegen Exonucleasen, Stabilität)

Prozessierung der mRNA

28.

RNA Editing 29

Alternative Promotornutzung und alternatives Spleiβen

DNA

RNA

Protein

DNA

Nicht-translatierte Region

Translatierte Region

Protein

Alternatives

Spleiβen Alternative

Promotornutzung

Alternative polyA Nutzung

mRNAs verlassen den Zellkern durch die Kenrpore

Zip-Code: Signale auf den mRNAs: bestimmen die Lokalisation in der Zelle

Motorproteine binden an das Zip-Code

31.

Codierende Region

Zip-code-Sequenz

Zip-Code-Struktur

ASH1 mRNA

Transport der mRNA

Posttranslationale Regulierung

Proteindegradation

Lebensdauer: -lang: zB. Steroid-Receptor; -kurz: zB. Proteine der Augenlinse

- Aminosäuren an den N-Enden korreliert mit: 1. Rate der ubiquitin-Bindung 2. Stabilität

- Arg, Lys, Phe, Leu, Trp 1/2 Existenzdauer: ≤ 3 min

- Cys, Ala, Ser, Thr, Gly, Val, Pro, Met 1/2 Existenzdauer: ≥ 20 hrs

Ubiquitin (ein Peptid aus 76 Aminosäuren) binden an Proteinen und markeirt sie zur Degradation bei proteolytischen Enzymen der Proteasomen

33.

proteasome

Ursachen der Degradation: - aberranter Structur - Optimale Existenzdauer - nicht mehr gebraucht - Hunger nach Aminosäuren

Proteindegradation 34

1. Proteolytisches Schneiden

- Verschiedene Peptide aus eineem Prekursorpeptid (zB. Neuropeptide)

- Entfernen von Inhibitorpeptiden (zB. Verdauundsenzyme)

2. Glycosylation: Transport (Kontrolle über Lokalisation der Proteine) 3. Phosphorylation: Aktivation - Inaktivation 4. Methylation – acethylation: Histon-Regulierung

Proteinmodifikationen Precursorpeptide

Peptidevarianten

I

35.

Glycosylation: Anknüpfen einer Glycosyl Gruppe

P kinase

phosphatase inactive active

Carb

ohyd

rate group

prote

in

mannose

glucose

N-acetil- gluckosamine

protein protein

Typen der Genexpression

Genexpression und Signalwege

Die Eigenschaften der Genexpression

a.Wann?

b.Wieviel?

c.Wo?

38.

Die Eigenschaften der Genexpression

a.Wann?

b. Wieviel?

c. Wo?

d. Wie?

e. In welcher Kombination?

Ontogenese, Induktion

Wieviel RNA, Prpteine?

In welcher Zelltyp?

Welche alternatives Form?

39

Welche Proteine interagieren miteinander?

1. Konstitutiv (kontinuirlich)

- Haushaltsgene

2. Induziert bei

2a. Nahrung: Glükose in Leberzellen

2b. Stress: Hitzenschock-Proteine, Osmotic (Salz) - Schock

2c. Zellkommunikation:

(Mediatoren: Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter)

2d. Ontogenetisch reguliert

3. Zelltypspezifisch

Die Typen der Genexpression

Genexpression – induciert bei Zellkommunikation

Signalmolekül beeinfluβt einen Transkriptionsfactor indirekt

Eintreten, oder nicht eintreten? Wenn in der Zelle . . . .

41

Aktivation durch Steroid-hormone

GRE: glucocorticoid response element

GRE DNA

Cytoplasma

Zellkern

Glucocorticoid Receptor

Inhibitor (hsp90) Steroid

Signaltransduction

42.

Aktivation durch Interferon-γ

RE: response element IFN: Interferon JAK: Janus activated kinase STAT-1: transcription factor

RE DNA

Cytoplasma

Zellkern

IFN-γ Receptor

JAK Kinase

IFN-γ

P P

Signaltransduction

43.

Rezeptor

Signalmolekül

Targetproteine

Veränderter Zellzustand

Sekundärer Botenstoff G Protein

1.

2.

3.

Regulatorproteine

Neu gebildete Regulatorproteine

4. 5.

6. 6.

7.

7.

8. 9.

5. inaktiv

inaktiv inaktiv

inaktiv aktiv

aktív

aktiv

aktiv

Schnelle und langsame Signalwege

Langsame Veränderung Schnelle Veränderung

DNA RE

Zellkern

Veränderter Zellzustand

Zellkern Zytoplasma

Veränderung in Zellfunktion

1.

2.

3. 4.

5.

6. 7.

8.

9.

10.

11.

12.

13. 14.

15.

16.

17.

Kommunikation mit anderen Zellen

18.

usw.

Informationsbewegung und Rückmeldung

7.

RNA- Interferenz

Slicer mRNA

siRNAs (21-23 Basenpaare)

siRNS: small interfering RNS

RISC: RNAi-induced silencing complex

RISC*: aktivált RISC

Slicer: a vágásért felelős

RNáz: ribonukleáz

1.RNAi -- schneiden (Dicing)

RISC

RISC* (aktiviert) Helikase

ds RNA Dicer

Degradiertes mRNA

RNAse

RNA abhängige

RNA-Polymerase viele siRNAs

siRNS: small interfering RNS

RISC: RNAi-induced silencing complex

RISC*: aktivált RISC

Slicer: a vágásért felelős

RNáz: ribonukleáz

48 RNAi- Amplifikation dsRNA

Dicer

siRNAs

mRNA repliziertes dsRNA

49.

DICER

Ago + andere RISC-Proteine

Ago + andere Proteine

aktiviertes RISC aktiviertes RITS

DNA

Degradiertes RNA Hemmung der Transkription

Mthylierung der Histone und der DNA

RNA-Interferenz

Parallele Wege

Andrew Z Fire; Craig C Mello

Kontroll Gefärbt

antisense-RNA dsRNA

RNAi: Abschaltung von Genen durch dsRNAs

Caenorhabditis elegans

mex-3 Gen GFP Gen (als Transgen in E. coli)

Futter: GFP- exprimierende E.coli

Wild Typ RNSi-Deffekt

1998

2006

. RNA-Interferenz

Andrew Z Fire; Craig C Mello

Technologien für selektive Hemmung der Genexprimierung:

Früher:

- In vitro – antisense DNA-Oligonukleotide + antisense RNAs:

- In vivo – Knock-out Technologie - - - - - - - - - - - -

Heute:

- Knock-down Technologie mithilfe von RNAi (in vitro + in vivo)

Natürliche Funktion:

- Antivirales Mechanismus

- Regulierung der Genexprimierung

51. RNA-Interferenz

52.

(1) Gentherapie

(2) Antimikrobiales Mittel

Medizinische Bedeutung

Epigenetik

1. Zelltyp Bestimmung

2. X-Chromosom Inaktivierung

3. Maternaler Effekt

4. Genetische Prägung (imprinting)

Epigenetische Merkmale - Vererbung ohne Gene

Epigenetische Vererbung: Informationsübertragung von einer Zelle od. von einem multizellulären Organismus zu den Nachkommen, ohne Veränderung der Nukleotidsequenz der Gene.

Epigenetik: Wissenschaftsfeld,dass sich mit epigenetischer Vererbung befasst

Chromatin: Komplex von DNA und Proteinen,der im Nukleus gebildet wird

Epigenetische Regulierung: (1) Innerhalb eines Individuums, zwischen Zellen

- Zelltypbestimmung (modifiziert: Histon – Methylierung, Acetylierung, Phoshorylierung)

(modifiziert: DNA – Methylierung) - Chromosom Inaktivierung (modifiziert: DNA - Methylierung)

Epigenetische Vererbung: (2) Von den Eltern zu den Nachkommen

- Genetisches Imprinting (modifiziert: DNA - Methylierung) - Maternaler Effekt (maternal mRNAs and proteins are transmitted to offspring)

Transmission von epigenetischen Informationen:

Epigenetik

Epigenetische Regulierung: Transmission von epigenetischen Informationen:

1. Veränderung in Transkription

2. epigenetische Veränderung in Ontogenese

3. Zelltypbestimmung

4. Epigenetisches Program hängt vom Umwelt ab

Chemischer Hintergrund: (modifiziert: Histon – Methylierung, Acetylierung, Phoshorylierung (modifiziert: DNA – Methylierung Chromosom Inaktivierung (modifiziert: DNA - Methylierung)

Innerhalb eines Individuums, zwischen Zellen

- direkt Effekt: Genetisches Imprinting (modifiziert: DNA - Methylierung)

- indirekt Effekt: Maternaler Effekt (mütterliche mRNA und Proteine werden den

Nachkommen übergetragt)

Epigenetische Vererbung:

!

Von den Eltern zu den Nachkommen, zwischen Individen

.

Hautzelle

Zelltypbestimmung Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum

Zelltypbestimmung: Ein Zelltyp produziert die gleiche Zell, aber nicht(oder selten) anderer, obwohl ihr DNA Inhalt identisch ist.

Der Histonkod Die Histonkod-Hypothese besagt,dass die chemische Modifikation von Histonen eine Serie von vorprogrammierten Änderungen während der Zelldifferenzierung und Embryogenese ist.

Zelltypbestimmung Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum

Differenzierung: Programmierte Veränderung der Histonmuster

Eizelle

Differenzierte Hautzelle

Zelltypbestimmung

Differenzierte Leberzelle

Der Histonkod Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum

Embryogenese

zygote

Hypothetisches Experiment: Insertion des gleichen Zellkerns in unterschiedliche Zytoplasmen

Zelltypbestimmung Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum

zygote

Embryogenese

Zelltypbestimmung

zygote

Hypothetisches Experiment: Insertion des gleichen Nukleus

in ein jeweils anderes Zytoplasma

Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum

DNA Methylierung Die Methylierung der DNA verhindert Genexpression,aber ihre Rolle in der Gewebedifferenzierung ist unklar. Verschiedene Zelltypen haben verschiedene Metilationsmuster

Zelltypbestimmung

Metilom Code?

Epigenetische Regulierung: innerhalb 1 Individuum

Der Genotyp der Mutter manifestiert sich in den Nachkommen

Function: die Cytoplasma der Eizelle reguliert die ersten Schritte der Embriogenese

Maternaler Effekt

Pferde- od. Esel-Maultier?

Zygote

Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen

Genetische Prägung (Imprinting)

Methylierung der DNA

Der Effekt eines geprägten Gens hängt vom Elternteil ab, von dem es stammt

Funktion: ?Eltern-Kind-Konflikt Hypothese?

Beispiel: IGF2 (insulin-like growth factor): männlich

Vorkommen: Säugetiere m. Plazenta, blühende Pflanzen

Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen

apai kr. anyai kr.

In den somatischen Zellen sind bestimmte Gene der väterlichen Chromosomen metiliert (imprintert), andere Gene der mütterlichen Chromosomen sind also

imprintiert

In den Spermien wird alle Imprintierung

gelöscht und nach väterlichen Muster

wiederhergestellt

In den Eizellen wird alle Imprintierung

gelöscht und nach mütterlichen Muster

wiederhergestellt

Epigenetische Verärbung: Von den Eltern zu den Nachkommen

Genetisches Imprinting

väterliches Chomosom

mütterliches Chomosom

Genetisches Imprinting

Metilierung

15. Chromosom

SNRPN UBE3A SNRPN UBE3A

SNRPN UBE3A

SNRPN UBE3A

SNRPN UBE3A

SNRPN UBE3A

SNRPN UBE3A

Syndrom von Prader-Willi und von Angelman

Prader-Willi Syndrom Angelman Syndrom

Normal

Deletion

UPD

Imprinting

hiba

(~80%)

(~20%)

(~2%)

Epigenetische Vererbung: Von den Eltern zu den Nachkommen

Wild Typ Angelman-Syndrom

Prader-Willi-Syndrom

Lethal

Deletion

Deletion

Eltern- Konflikt David Haig

Je besser die Mutter das Embryo versorgt, desto weniger werden die anderen

Nachkommen versorgt, und desto mehr verliert sie an Fittnes.

Die gute Versorgung des Embryos liegt am Interesse des Vaters (der väterlichen

Gene), und er kümmert sich um die anderen Nachkommen und die zukünftige

Reproduktion der Mutter nicht.

Väterlich imprintirte Gene fördern das Wachstum des Embryos, mütterlich

imprintierte Gene hemmen das Wachstum des Embryos.

Epigenetische Umschaltung

•Väterlich imprintierte Gene dominieren

während der Embryogenese im Gehirn.

(Mütterliche Kopien der Gene werden

exprimeirt)

•Später, im Erwachsenenalter, dominieren

die väterlichen Gene

•Es gibt sehr viele imprintierte Gene (ca. 1300)

•Imprintierung ist dynamisch, es wird während

des Lebens des Individuums verändert

•Imprintierung spielt eine wichtige Rolle

während der Entwicklung und in der

Regulierung des Verhaltens

Dominanz

GRB10

Kodiert für ein intrazelluläres Adaptorprotein

Interagiert mit Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, beeinflusst Signalübertragung

Ein imprintiertes Gen (mütterliche und väterliche Kopien des Gens werden unterschiedlich expremiert)

Väterliche Kopie: wird im Gehirn expremiert,

lindert die Dominanz, Knock-out: dominates Verhalten, kein Ausweichen in Röhr-Test

Mütterliche Kopie: wird im Körper expremiert (ausser Gehirn)

Funktion: reguliert Metabolismus und Wachstum

Weitere imprintierte Gene, die Verhalten beeinflussen: Mest, Peg3 (Pfegeverhalten der Weibchen)

Die Umwelt beeinflusst das epigenetische

Program

Unser Gehirn ist besonders empfindlich für epigenetische Signale

Die Entschlüsselung der Nukleotidsequenz der

DNA ist erst der Anfang…

Postgenomische Ära