1101 Nachrichten aus der Chemie| 61 | November 2013 | www.gdch.de/nachrichten S Die Gesamtfläche der Membra- nen im menschlichen Körper be- trägt 100 km 2 – bei einer Dicke von lediglich 5 nm. Seit Anfang des letz- ten Jahrhunderts postulierten For- scher Modelle zum Aufbau biologi- scher Membranen. In den 1970er Jahren setzte sich das Fluid-Mosa- ikmodell von Singer und Nicolson durch. Dieses Modell ging in seiner ursprünglichen Form von einem See von Membranlipiden aus, in dem Proteine schwimmen; die Membranlipide waren dieser Vor- stellung zufolge ein zweidimensio- nales Lösungsmittel. Dieses Modell berücksichtigt allerdings nicht die enorme chemische Komplexität der Membranlipide. So gibt es Hunder- te von verschiedenen Lipiden in ei- ner biologischen Membran. Mit dieser Erkenntnis sowie der Tatsache, dass die Proteine zum Teil dicht gepackt in einer struktu- rierten Anordnung von definierten Lipiden vorliegen, wurde das ur- sprüngliche Strukturmodell in den Jahren immer weiter verändert und verfeinert. Die Fluidität, also die la- terale Mobilität der Membrankom- ponenten in einer definierten Dop- pelschicht, kombiniert mit einer komplexen chemischen Zusam- mensetzung aus Lipiden sowie pe- ripher gebundenen und eingebette- ten Proteinen sind die Vorausset- zung dafür, dass Membranen ihre Aufgaben erfüllen können. Von Membranmodellen zu Modellmembranen S Wie gelingt es, die verschiede- nen Funktionen einer biologischen Membran, die chemisch so kom- plex ist, systematisch zu untersu- chen? Ein Ansatz sind Modellmem- branen aus einzelnen Lipid- und Proteinkomponenten, die es er- lauben, Struktur-Funktionsbezie- hungen aufzustellen. Bereits Ende der 1960er Jahre wurden Modell- membranen beschrieben, die da- rauf basierten, eine Lipiddoppel- schicht über ein kleines Loch in ei- ner Plastikwand zu spannen, die Black Lipid Membranes (BLMs). 1) Diese Membranen trennen zwei wässrige Kompartimente in Form einer Lipiddoppelschicht. So ist es möglich, die Barriereeigenschaften, also den Transport von Ionen und Molekülen über diese Membran zu verfolgen. Der Grundgedanke ist auch in der modernen Entwicklung von Modellmembranen erhalten geblie- ben. Jedoch wünscht man sich Sys- teme auf Basis von Lab-on-a-Chip- Techniken, um moderne Analyse- methoden einzusetzen und bei- spielsweise Screeningsysteme für Wirkstoffe zu entwickeln. Um sol- che Systeme zu realisieren, können biologische Lipidmembranen mit anorganischen Materialien, die Lochstrukturen aufweisen, verbun- den werden. Biologische Membran auf anorganischen Lochstrukturen S Voraussetzung für eine stabile und funktionale Lipidmembran ist eine wässrige Umgebung. Daher muss das anorganische Material für den Aufbau eines Chips nicht nur mechanisch, sondern auch che- misch in wässriger Lösung stabil sein. Gleichzeitig muss es möglich sein, Lochstrukturen in das Materi- al einzubringen. Im Folgenden sol- len Poren auf Basis von Glas, Silici- um und Aluminiumoxid vorgestellt Claudia Steinem Jede Substanz, die das Innere einer Zelle erreichen soll, muss eine Barriere überwinden. Diese ist nur wenige Nanometer dick, aber aus tausenden von verschiedenen Molekülen zusammengesetzt: die Membran. Wie funktioniert das komplexe Zusammenspiel ihrer Komponenten? Funktionelle Lipidmembranen in der Chiptechnik BBiologische MembranenV VV Lab-on-a-Chip-Systeme aus biologischen Lipid- membranen und anorganischen Materialien mit Lochstrukturen helfen bei der Untersuchung von Modellmembranen. VV In Porenarrays mit mikrometergroßen Poren eines funktionalisierten Siliciumsubstrats lassen sich porenüberspannende Membranen individuell abbilden. VV Verschließt man Kavitäten mit einer Lipid- membran, entsteht ein femtolitergroßer Reaktionsraum, etwa zur Untersuchung von Transportvorgängen. VV Porenarrays mit Membranen auf Basis nano- porösen Aluminats eignen sich, um Ionenkanäle zu integrieren und ihre Kanalaktivität zu unter- suchen. S QUERGELESEN
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Nachrichten aus der Chemie| 61 | November 2013 | www.gdch.de/nachrichten
S Die Gesamtfläche der Membra-nen im menschlichen Körper be-trägt 100 km2 – bei einer Dicke von lediglich 5 nm. Seit Anfang des letz-ten Jahrhunderts postulierten For-scher Modelle zum Aufbau biologi-scher Membranen. In den 1970er Jahren setzte sich das Fluid-Mosa-ikmodell von Singer und Nicolson durch. Dieses Modell ging in seiner ursprünglichen Form von einem See von Membranlipiden aus, in dem Proteine schwimmen; die Membranlipide waren dieser Vor-stellung zufolge ein zweidimensio-nales Lösungsmittel. Dieses Modell berücksichtigt allerdings nicht die enorme chemische Komplexität der Membranlipide. So gibt es Hunder-te von verschiedenen Lipiden in ei-ner biologischen Membran.
Mit dieser Erkenntnis sowie der Tatsache, dass die Proteine zum Teil dicht gepackt in einer struktu-rierten Anordnung von definierten Lipiden vorliegen, wurde das ur-sprüngliche Strukturmodell in den Jahren immer weiter verändert und verfeinert. Die Fluidität, also die la-terale Mobilität der Membrankom-ponenten in einer definierten Dop-pelschicht, kombiniert mit einer komplexen chemischen Zusam-mensetzung aus Lipiden sowie pe-ripher gebundenen und eingebette-ten Proteinen sind die Vorausset-zung dafür, dass Membranen ihre Aufgaben erfüllen können.
Von Membranmodellen zu Modellmembranen
S Wie gelingt es, die verschiede-nen Funktionen einer biologischen Membran, die chemisch so kom-plex ist, systematisch zu untersu-chen?
Ein Ansatz sind Modellmem-branen aus einzelnen Lipid- und Proteinkomponenten, die es er-lauben, Struktur-Funktionsbezie-hungen aufzustellen. Bereits Ende der 1960er Jahre wurden Modell-membranen beschrieben, die da-rauf basierten, eine Lipiddoppel-schicht über ein kleines Loch in ei-ner Plastikwand zu spannen, die Black Lipid Membranes (BLMs).1) Diese Membranen trennen zwei wässrige Kompartimente in Form einer Lipiddoppelschicht. So ist es möglich, die Barriereeigenschaften, also den Transport von Ionen und Molekülen über diese Membran zu verfolgen.
Der Grundgedanke ist auch in der modernen Entwicklung von Modellmembranen erhalten geblie-ben. Jedoch wünscht man sich Sys-teme auf Basis von Lab-on-a-Chip-Techniken, um moderne Analyse-methoden einzusetzen und bei-spielsweise Screeningsysteme für Wirkstoffe zu entwickeln. Um sol-che Systeme zu realisieren, können biologische Lipidmembranen mit anorganischen Materialien, die
Lochstrukturen aufweisen, verbun-den werden.
Biologische Membran auf anorganischen Lochstrukturen
S Voraussetzung für eine stabile und funktionale Lipidmembran ist eine wässrige Umgebung. Daher muss das anorganische Material für den Aufbau eines Chips nicht nur mechanisch, sondern auch che-misch in wässriger Lösung stabil sein. Gleichzeitig muss es möglich sein, Lochstrukturen in das Materi-al einzubringen. Im Folgenden sol-len Poren auf Basis von Glas, Silici-um und Aluminiumoxid vorgestellt
Claudia Steinem
Jede Substanz, die das Innere einer Zelle erreichen soll, muss eine Barriere überwinden. Diese ist nur
wenige Nanometer dick, aber aus tausenden von verschiedenen Molekülen zusammengesetzt:
die Membran. Wie funktioniert das komplexe Zusammenspiel ihrer Komponenten?
Funktionelle Lipidmembranen in der Chiptechnik
BBiologische MembranenV
VV Lab-on-a-Chip-Systeme aus biologischen Lipid-
membranen und anorganischen Materialien mit
Lochstrukturen helfen bei der Untersuchung von
Modellmembranen.
VV In Porenarrays mit mikrometergroßen Poren
eines funktionalisierten Siliciumsubstrats
lassen sich porenüberspannende Membranen
individuell abbilden.
VV Verschließt man Kavitäten mit einer Lipid -
membran, entsteht ein femtolitergroßer
Reaktionsraum, etwa zur Untersuchung von
Transportvorgängen.
VV Porenarrays mit Membranen auf Basis nano -
porösen Aluminats eignen sich, um Ionenkanäle
zu integrieren und ihre Kanalaktivität zu unter-
suchen.
S QUERGELESEN
werden. Alle Materialien sind hy-drophil und damit mit Wasser gut benetzbar.
Das Unternehmen Nanion, München, bietet Glaschips mit et-wa 5 µm großen Löchern an. Auf diesen Glaschips entstehen Lipid-membranen durch das Aufplatzen einzelner Riesenvesikel mit Durch-messern von mehreren 10 µm. Die-se Lipidmembranen bilden eine
hochohmige Barriere und eignen sich somit für die Analyse von Ionenkanälen sehr gut.2)
Dieses planare Chipverfahren ist eine Erweiterung der ursprüngli-chen Patch-clamp-Technik für die Bert Sakmann und Erwin Neher 1991 den Nobelpreis für Physiolo-gie oder Medizin erhielten. Bei der Patch-clamp-Technik wird ein klei-ner Membranbereich (patch) aus
einer Zellmembran an eine Glaspi-pette gebracht, die gleichzeitig als Messelektrode fungiert. Während der Messung wird über den Mem-branpatch eine konstante Span-nung angelegt (clamp) und der Strom über einzelne Ionenkanäle in dem Zellmembranpatch gemessen. Die Nanion-Glaschips bieten je-doch zusätzlich die Option zur Au-tomatisierung und Parallelisierung.
Strukturierungsverfahren für Si-licium erweitern das Angebot von Chips zur Bildung von planaren Li-pidmembranen noch deutlich. So gibt es einzelne Aperturen mit Durchmessern von 50 nm bis zu mehreren Mikrometern sowie Ar-rays, die einzeln elektrisch kontak-tiert werden und so der Untersu-chung von Ionenkanälen dienen.3)
Arrays von mikrometergroßen Poren
S Um nicht nur elektrische Mes-sungen, sondern auch mikroskopi-sche Untersuchungen an einzelnen porenüberspannenden Lipidmem-branen durchzuführen, entstanden Porenarrays mit mikrometergroßen Poren. So lässt sich jede porenüber-spannende Membran abbilden. Um Membranen auf diesen mikrome-tergroßen Poren aufzuspannen, ist es nötig, die Oberflächen des Silici-umsubstrats zu funktionalisieren.
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a) b) c)
Abb. 2. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von porenüberspannenden Membranen auf einem Siliciumsubstrat. Während der Fluorophor Perylen (a) anzeigt,
über welchen Poren sich eine Membran befindet (blau: Membran, schwarz: membranfrei), zeigt der Fluorophor BodiPy-PC (b) an, wo sich mit bestimmten
Lipiden angereicherte Membrandomänen (flüssig-geordnete Phase (lo): dunkel; flüssig-ungeordnete Phase (ld): hell) innerhalb einer porenüberspannenden
Membran befinden. c) Die Fläche der flüssig-geordneten Phase wird durch den Porendurchmesser des porösen Siliciumsubstrats bestimmt.6)
3 µm
1 µm
5 µm
3 µm
a)
b)
c)
d)
Abb. 1. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Lochstrukturen in Siliciumnitrid.
a) Aufsicht und b) Seitenansicht eines Siliciumsubstrats des Herstellers Fluxxion, Eindhoven.
In der Seitenansicht ist die aufgedampfte Goldschicht gut zu erkennen.
c) Aufsicht und d) Seitenansicht eines Siliciumsubstrats mit geschlossenen Kavitäten, die am
Forschungszentrum Caesar, Bonn, gefertigt wurden.
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Zum einen kann die Siliciumober-fläche silanisiert werden,4) so dass sich Riesenvesikel, die größer als der Porendurchmesser sind, auf der Oberfläche zu planaren Membra-nen ausbreiten. Zum anderen wird eine Goldbeschichtung eingesetzt (Abbildung 1b). Diese ist durch Thiolchemie modifizierbar und dient als Grundlage für porenüber-spannende Membranen.5)
Wir etablierten ein Verfahren, das unilamellare Riesenvesikel auf funktionalisierten Goldoberflächen zu planaren porenüberspannenden Membranen spreitet. Dabei kontrol-liert in phasenseparierten Lipid-membranen das darunterliegende Porennetz die Größe von mit Lipid-komponenten angereicherten Mem-brandomänen (Abbildung 2).6)
Attraktiv ist es, Kavitäten mit ei-ner Lipidmembran zu verschlie-
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a)
b)
Abb. 3. a) Nanoporen-Kavität: Jede pyramidal geformte Kavität mit
einer lateralen Dimension von 5 × 5 �m2 ist bedeckt von einer 50 nm
großen, dünnen transparenten Siliciumnitridschicht, die zentral ein
kleines Loch enthält.
b) Translokation von Farbstoffmolekülen durch das Protein �-Hämoly-
sin. Beobachtet man eine farbstoffgefüllte Pore, so tritt der Farbstoff
mit der Zeit aus, wie die Fluoreszenz aufnahmen (unten) zeigen.7)
ßen, um so einen femtolitergroßen Reaktionsraum zu schaffen (Abbil-dungen 1c und 1d). Auch hier lie-fert die Siliciumtechnik mit hoher Präzision verschiedene Porengeo-metrien.
Die Arbeitsgruppe um Tampé fertigte Kavitäten, die mit einer dünnen und damit optisch transpa-renten Siliciumnitridschicht be-deckt sind, die zentral eine Nano-pore mit Durchmessern von 15 bis 120 nm enthält (Abbildung 3a).7) So lässt sich die darunterliegende Kavität fluoreszenzmikroskopisch auslesen, während die Nanopore durch Spreiten von unilamellaren Vesikeln mit einer Membran über-spannt wird. Dieser Porenarray diente dazu, den Transport von fluoreszierenden Molekülen durch �-Hämolysin-Poren zu analysieren (Abbildung 3b).7)
Große Porendurchmesser von mehreren Mikrometern lassen sich entweder durch das Überstreichen von in Lösungsmittel gelöstem Li-pid mit einer Membran überspan-nen – wie es in den 1970er Jahren für Black Lipid Membranes be-schrieben wurde – oder durch Spreiten von Riesenvesikeln mit Durchmessern von mehreren 10 �m. In beiden Fällen entstehen Lipidmembranen, in denen sich Transportprozesse durch Auslesen von Fluoreszenzfarbstoffen analy-sieren lassen, wie am Beispiel des Antiports von H+ und K+ durch das Ionophor Nigericin gezeigt (Abbildung 4).8) Jedoch ist nur beim Spreiten von Riesenvesikeln die Membran lösungsmittelfrei und erlaubt die funktionale Re-konstitution von Transmembran-proteinen.
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Abb. 4. a) Mikrometergroße Kavitäten, die von einer Lipidmembran
(rot) überspannt sind und einen pH-sensitiven Farbstoff (grün)
einschließen. b) Bei Integration von Nigericin in die Membran und
einem vorhandenen K+-Gradienten werden Protonen aus der
Kavität gepumpt und der pH-Wert sinkt, was mit dem pH-sensitiven
Farbstoff Pyranin zeitaufgelöst verfolgt werden kann.8)
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Arrays von nanometergroßen Poren
S Unsere Arbeitsgruppe etablierte hochgeordnete Porenarrays in Alu-minium als Substrate für porenüber-spannende Membranen (Abbildung 5a). Hochgeordnete Porenarrays sind im Labor ohne Reinraumtech-nik einfach durch Anodisierung von reinen Aluminiumfolien herzustel-len. In einem Selbstorganisations-prozess bilden sich hexagonal ange-ordnete zylinderförmige Kavitäten mit enger Verteilung der Poren-durchmesser. Die Anodisierungspa-rameter bestimmen dabei die Gitter-konstante – einstellbar zwischen 10 und 420 nm – sowie die Dicke des porösen Materials.9)
Eine Besonderheit des anodi-schen porösen Aluminats ist, dass die Porengrößen kleiner sein kön-nen als die Streulichtgrenze des sichtbaren Lichts, sodass das porö-se Material optisch transparent ist. So lassen sich nicht nur Membra-nen auf der Oberfläche des porösen Aluminats analysieren, sondern
auch Prozesse, die in den Kavitäten unterhalb der Membran ablau-fen.10) Die durch das Ätzverfahren hergestellten Poren sind nach unten hin geschlossen, lassen sich aber durch chemisches Auflösen des Aluminiumoxids leicht öffnen.
Ist die Aluminatoberfläche ana-log zu den Siliciumsubstraten mit Gold beschichtet, so ist sie durch Chemisorption von Thiolen so mo-difizierbar, dass sie Lipidmembra-nen adsorbiert, während die inne-ren Aluminiumoxidoberflächen li-pidfrei bleiben. Die auf diese Weise hergestellten Membranen auf offe-nen Porenarrays in Aluminiumoxid zeichnen sich durch hohe Mem-branwiderstände sowie eine hohe Langzeitstabilität aus. Sie eignen sich deshalb gut, um Ionenkanäle zu integrieren und ihre Kanalakti-vität zu untersuchen.11)
Nachteil dieses Verfahrens ist die Goldbeschichtung, die den Vorteil der Transparenz des porösen Alu-minats zunichte macht. Um Trans-parenz zu nutzen, sind andere Funktionalisierungsstrategien nö-
tig. Diese basieren auf Silanen, die direkt kovalent an die OH-Grup-pen des Aluminiumoxids binden. Eine orthogonale Funktionalisie-rungsstrategie ermöglicht poren-überspannende Lipidmembranen auf Aluminaten, die das wässrige Kompartiment mit Attoliter -volumina vom Außenmedium trennt (Abbildung 5b).12) Solche Aufbauten liefern die Grundlage, um Fragen zum Transport über Membranen fluoreszenzmikrosko-pisch zeitaufgelöst zu analysieren.
Literatur
1) P. Mueller, D. O. Rudin, H. T. Tien,
W. C. Wescott, J. Phys. Chem. 1963, 67,
534.
2) N. Fertig, R. H. Blick, J. C. Behrends,
Biophys. J. 2002, 82, 3056.
3) E. Reimhult, K. Kumar, Trends Biotechnol.
2008, 26, 82.
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2011, 12, 2568.
5) P. V. Ganesan, S. G. Boxer, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 2009, 106, 5627.
6) A. Orth, L. Johannes, W. Römer, C. Steinem,
ChemPhysChem 2012, 13, 108.
7) A. Kleefen, D. Pedone, C. Grunwald,
R. Wei, M. Firnkes, G. Abstreiter, U. Rant,
R. Tampé, Nano Lett. 2010, 10, 5080.
8) D. Frese, S. Steltenkamp, S. Schmitz,
C. Steinem, RSC Adv. 2013, 3, 15752.
9) A.-P. Li, F. Müller, A. Birner, K. Nielsch,
U. Gösele, J. Appl. Phys. 1998, 84, 6023.
10) T. D. Lazzara, C. Carnarius, M. Kokun,
A. Janshoff, C. Steinem, ACS Nano 2011,
5, 6935.
11) O. Gaßmann, M. Kreir, C. Ambrosi,
J. Pranskevich, A. Oshima, C. Röling,
G. Sosinsky, N. Fertig, C. Steinem,
J. Struct. Biol. 2009, 168, 168.
12) T. D. Lazzara, T.-T. Kliesch, A. Janshoff,
C. Steinem, ACS Appl. Mater. Interfaces
2011, 3, 1068.
Abb. 5. a) Poröses Aluminat: links Schema; rechts rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen.
b) Eine Membran (rot) wird selektiv auf die obere Fläche des porösen Aluminats aufgebracht, sodass die
darunterliegenden mit Farbstoff (grün) gefüllten Poren vom Außenmedium getrennt sind.10)
(Konfokalmikroskopische 3D-Aufnahmen am optisch transparenten Aluminat.)
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