1INSCREENEX GMBH, BRAUNSCHWEIG2HELMHOLTZ-ZENTRUM FÜR INFEKTIONSFORSCHUNG, BRAUNSCHWEIG
Cell lines are immortal cultures of cells that are used in research as wellas for production of pharmaceuticals. Currently available cell lines arederived from normal and tumorous tissue of humans and diverse animalspecies, however, with considerable loss of specific properties. The deve-lopment of new immortalization protocols has led to a significant impro-vement of the properties of the resulting cell lines. These retain specificproperties and activities that include functional grafting.
Verwendung von Zellenó Zellen sind unerlässliche Werkzeuge inForschung und Produktion. Sie werden
sowohl in der Grundlagenforschung als auchin der angewandten Forschung verwendet. Soerlauben sie die Aufklärung von Signalwegen
oder Differenzierungsprozessen, sie eignensich für die Untersuchung von biochemischenVorgängen und helfen, dynamische Prozesse(quantitativ) zu verfolgen.
In der angewandten Forschung werden siein der gesamten Wertschöpfungskette derWirkstoffentwicklung verwendet. Sie unter-stützen die Target-Identifizierung und sindessenzielle Werkzeuge für die Suche und Opti-mierung von Wirkstoffkandidaten. Weiterhinfungieren Zellen als Produktionsfabriken, umtherapeutische Wirkstoffe wie Zytokine oderAntikörper herzustellen. Darüber hinaus wer-den Zellen als solche bereits als therapeuti-sche Agenzien z. B. bei Knochenmarkstrans-plantationen eingesetzt.
Vorhandene ZellsystemeZellen, die direkt dem Gewebe entnommenund in Kultur gebracht werden, bezeichnetman als primäre Zellen. Derzeit werden pri-märe Zellen insbesondere dann eingesetzt,wenn ein Testsystem mit einer in vivo ähn-lichen Physiologie benötigt wird (Tab. 1). Die-ser Vorteil geht jedoch mit verschiedenenNachteilen einher, zu denen die Limitationder Zellzahl aufgrund der begrenzten Proli-ferationskapazität, die schwierige und kos-tenintensive Kultivierung und eine signifi-kante Varianz des Zellmaterials von ver-schiedenen Spendern gehören. Auf der ande-ren Seite stehen immortalisierte Zellkulturenin Form von Zelllinien: Diese Zellsysteme sindunbegrenzt verfügbar, klonierbar, genetischmanipulierbar und leicht handhabbar. IhrNachteil ist, dass sich ihre Physiologie meistgravierend von der in vivo-Situation unter-scheidet.
Der Verlust der Funktionalität bei Stan-dardzelllinien beruht darauf, dass diese Zel-len entweder aus Tumormaterial gewonnenwurden, durch die Überexpression von vira-len Onkogenen etabliert wurden oder durchspontane Mutagenese (3T3-Protokoll). All die-se Veränderungen der Zellen sind von einererhöhten Mutationsrate begleitet, die lang-fristig eine Instabilität des genetischen Mate-rials, aber auch eine hohe Adaptationsfähig-keit bedingt. Die Instabilität der Zelllinien
Zellsysteme
Funktionale Zelllinien durch neueImmortalisierungsprotokolle
Forschung• Genfunktionsanalysen• Genfunktionsanalysen• Analyse von zellulären Vorgängen (z. B. Signaltransduktion)• ...
Tab. 1: Primäre Zellen und Zelllinien: Einsatz und Eigenschaften.
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wird durch lange Kultivierungszeiten ver-stärkt. Dies ist ein wichtiger Grund dafür, dasssich der zelluläre Phänotyp in Standardzell-linien deutlich von dem in vivo-Phänotypunterscheidet.
Alle in vitro-Zellkultivierungssysteme lei-den darunter, dass die Zellen ihrer natür-lichen Umgebung beraubt sind. Dies betrifftsowohl das Fehlen des funktionalen Zell-Zell-Kontakts wie auch die physiologischen Bedin-gungen der unmittelbaren Umgebung. Neu-erdings versucht man zunehmend erfolgreich,dies durch dreidimensionale Kultivierung,Ko-Kultur mit anderen Zelltypen und das Ein-stellen von Gas- und Nährstoffbedingungennachzustellen.
Entwicklung neuer Zelllinien mitverbesserten EigenschaftenSeit einigen Jahren wird versucht, die vor-teilhaften physiologischen Eigenschaften vonprimären Zellen mit den Vorteilen von Zell -linien, insbesondere deren Verfügbarkeit, Sta-bilität und Homogenität zu kombinieren. Einwichtiger Schritt in diese Richtung war dieImmortalisierung von primären Zellen mittelsder katalytischen Untereinheit der humanenTelomerase (hTert) [1]. Durch Überexpressionvon hTert wird eine Verkürzung der Telo mereverhindert, was ein wesentlicher Grund fürdie limitierte Proliferationskapazität von pri-mären Zellen ist. Die Funktionalität der soetablierten Zelllinien ist den auf herkömmli-chem Wege etablierten Zelllinien deutlichüberlegen. So konnte beispielsweise gezeigtwerden, dass mittels hTert immortalisierteEndothelzellen ebenso wie adulte mesenchy-male Stammzellen weitgehend ihre Eigen-schaften bis hin zur in vivo-Funktionalitäterhalten [2, 3]. Allerdings können mittelshTert nicht alle primären Zelltypen immor-talisiert werden [4].
Wir haben eine Methode entwickelt, die esermöglicht, neue Zelllinien aus verschiede-nen Geweben und Organismen zu etablieren.Hierfür haben wir Gene identifiziert, die inder Lage sind, primäre Zellen zur Proliferationzu bringen, ohne dass weitere Mutationen fürdie Immortalisierung notwendig sind. DieseGene werden mit rekombinanten Viren alsTransfervehikel in die primären Zellen ein-gebracht. Anschließend werden die transdu-zierten Zellen expandiert und selektiert.Nicht-transduzierte Zellen werden entwederdurch Selektion auf ein ko-tranduziertesResistenzgen eliminiert, oder sie werdendurch ihre begrenzte Teilungsrate in Misch-kulturen mit den erfolgreich transduzierten,
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kontinuierlich proliferierenden, Zellen aus-gedünnt. Mit diesem Verfahren können inner-halb von drei Monaten nach Transduktion derPrimärzellen neue Zelllinien gewonnen wer-den. Diese neuen Zelllinien werden auf ihreFunktionalität überprüft. Die bisher erhalte-nen Analysen zeigen vielversprechendeErgebnisse, die beispielhaft in Abbildung 1
dargestellt und in Tabelle 2 zusammengefasstsind.
Wachstumskontrollierte ZelllinienFür zahlreiche Fragestellungen ist eine kon-trollierte Proliferation von Zelllinien wün-schenswert. Diese beinhalten z. B. die Syn-chronisierung des Zellzyklus, das Konstant-
halten der Zellzahl während der Produk-tionsphase in biotechnologischen Prozessen,aber auch die Kontrolle der Teilungsrate nachTransplantation von Zellen bei regenerativenAnwendungen. Tatsächlich können Zelllinienmit anpassbarer Proliferationsrate generiertwerden, indem die Aktivität der jeweiligenImmortalisierungsgene z. B. durch Exzisionoder Temperaturänderung zeitlich begrenztwird [5–7] (Übersicht in [8]). Wir konntenzeigen, dass eine reversible Immortalisierungauch durch Verwendung von extern steuer-baren Transkriptionsmodulen erzielt werdenkann (Abb. 2A). Eine besonders strikte Pro-liferationskontrolle erlauben synthetische,autoregulierte Transkriptionsmodule (Abb.2B–D). Bei maximaler Konzentration desInduktors ist das Expressionsmuster autore-gulierter Module nicht von dem der graduel-len Regulationsmodule zu unterscheiden. Beilimitierenden Konzentrationen werden dieautoregulierten Module jedoch bimodal, dasheißt nur in einer Subpopulation der Zellen,aktiviert, wobei die Expressionshöhe jedochin allen aktivierten Zellen maximal ist [9].Mit dieser Methode haben wir reversibel pro-liferierende Zelllinien hergestellt, derenWachstum nur durch die Zugabe des Induk-
Tab. 2: Übersicht über die Immortalisierung verschiedener Zelltypen
n. d.: nicht bestimmt
Zelltyp Immortalisierungkonstitutiv konditional
˚ Abb. 1: Biochemische und funktionelle Eigenschaften neuer Zelllinien. A, Kumulative Populationsverdoppelung von primären humanen Osteoblastenund einer daraus etablierten humanen Osteoblastenzelllinie (immortalisierte Osteoblasten). B, Analyse von osteoblastenspezifischen Funktionen in derimmortalisierten Osteoblastenzelllinie. Analysiert wurden die Aktivität der Alkalischen Phosphatase (blaue Färbung der Zellen, links) sowie Kalziumein-lagerungen (Alizarin-Rot-Färbung der Zellen, rechts). C, Ausbildung von gefäßähnlichen Strukturen durch konditional immortalisierte humane Endothel-zellen in vitro. D, Ausbildung von Gefäßen durch konditional immortalisierte humane Endothelzellen nach Implantation in die Maus. Die Detektion dermit Luciferase markierten humanen Endothelzellen erfolgte durch eine Antikörperfärbung gegen Luciferase (rechts).
A
C
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tors Doxycyclin gesteuert wird [4, 10]. InAnwesenheit von Doxycyclin proliferierendiese Zelllinien unbegrenzt. Kultiviert mandie Zellen dagegen in Abwesenheit von Doxy-cyclin, so stellen sie die Proliferation ein –können aber reaktiviert werden, sobald wie-der Doxycyclin gefüttert wird (Abb. 2C, D).In der arretierten Phase können die Zellen jenach Zelltyp bis zu über 50 Tage gehaltenwerden. Am Beispiel von humanen End-othelzellen konnten wir zeigen, dass auch die-se Zellen ihre zelltypspezifischen Eigen-schaften und Funktionen behalten und sogarim Tiermodell gefäßähnliche Strukturen aus-bilden (Abb. 1C, D). Mit diesen neu entwi-ckelten Immortalisierungstechnologien kön-nen somit Zellsysteme etabliert werden, diedie in vivo-Physiologie sehr viel besser wider-spiegeln und somit sowohl in der Grundla-gen- als auch in der angewandten Forschungden Aufbau aussagekräftiger zellbasierterin vitro-Tests ermöglichen. Langfristig bietensie die Möglichkeit, neue Therapiekonzeptezu erarbeiten. ó
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Korrespondenzadresse:Dr. Hansjörg HauserHelmholtz-Zentrum für Infektionsforschung – HZIAbt. Genregulation und DifferenzierungInhoffenstraße 7D-38124 BraunschweigTel.: 0531-6181-5000Fax: [email protected]
AUTORENTobias May1996–2001 Biochemiestudium, Universität Halle-Wittenberg. 2005 Promotion in derGruppe von Dr. D. Wirth am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung. 2005–2011Postdoc in der Abteilung Genregulation und Differenzierung am Helmholtz-Zentrum fürInfektionsforschung. Seit 2011 Mitgeschäftsführer InSCREENeX GmbH, Braunschweig.
Hansjörg Hauser1968–1973 Studium der Lebensmitteltechnologie und Ernährungswissenschaft an derUniversität Hohenheim. 1977 Promotion an der Universität Konstanz in der Gruppe vonProf. Dr. R. Knippers. 1978–1980 Postdoc mit Prof. Dr. G. Schütz am MPI für Molekula-re Genetik, Berlin, und am DKFZ, Heidelberg. 1981–1985 wissenschaftlicher Angestell-ter an der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF), Braunschweig. 1986–1994 Leiter der AG Genetik von Eukaryonten. Seit 1994 Leiter der Abteilung Genregula-tion und Differenzierung, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig.
Dagmar Wirth1982–1987 Chemiestudium an der TU Braunschweig. 1991 Promotion in der Gruppevon Prof. Dr. J. Bode. 1991–1996 Postdoc in der AG Hauser der GBF in Braunschweig.1996–1998 freiberuflich tätig in der biomedizinischen Forschung. 1999–2003 wissen-schaftliche Mitarbeiterin der Medizinischen Hochschule Hannover. Seit 2004 wissen-schaftliche Mitarbeiterin am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung; dort seit2007 Leiterin der AG Modellsysteme für Infektion und Immunität.
˚ Abb. 2: Wachstumskontrolle in immortalisierten Zellen. A, Schema der kontrollierten Expan-sion von Zellen im aktivierten (+) und inaktivierten Status (–). B, Darstellung einer autoreguliertenImmortalisierungskassette; nach Aktivierung (mit Doxycyclin) werden der Transaktivator rtTAsowie das Immortalisierungsgen vom induzierbaren PTET-Promotor exprimiert. C, Zellwachstumvon konditional immortalisierten embryonalen Fibroblasten in An- bzw. Abwesenheit von Doxy -cyclin. Die Färbung erfolgte durch Kristallviolett. D, Das An- bzw. Abschalten der Proliferationsge-ne kann zu beliebigen Zeitpunkten (wiederholt) erfolgen und führt zum Wachstum bzw. Stillstandder Kultur. Dox: Doxycyclin. Weitere Erklärungen im Text.
