Illustration 1: High density OGT custom DNA microarray, http://www.combichem.co.uk/research/DNAmicroarraytechnologiesPNA.htm
FALLSTUDIE MIKROSYSTEMTECHNIK DNA MICROARRAY
LST TZ 2008, Gruppe TZ-A-2011 Lukas Camenzind, Marco Pegurri, Baris SaricaJuni 2011
InhaltsverzeichnisEinleitung.............................................................................................................................................2Funktion................................................................................................................................................3Arten.....................................................................................................................................................5Herstellung...........................................................................................................................................5
Presynthesized.................................................................................................................................6In situ Synthese................................................................................................................................7
Einsatzgebiete.......................................................................................................................................8Beispiele in der Leukämie und Brustkrebsforschung....................................................................10
Ausblick..............................................................................................................................................11Literaturverzeichnis............................................................................................................................12Abbildungsverzeichnis.......................................................................................................................13
1
EinleitungEin gesamtes Genom zu entschlüsseln, stellt schon seit geraumer Zeit kein grosses Problem mehr
dar. 2001 wurde durch das Human Genom Project das menschliche Genom vollständig
entschlüsselt. Doch allein mit der Kenntnis einer Basenpaarabfolge lässt sich noch keine Aussage
über Gene und deren Proteine machen. Die Genexpression ist wichtig für das Verständnis
physiologischer und pathologischer Prozesse und es lassen sich Rückschlüsse über
Umwelteinflüsse machen. Dank der Microarray Technologie ist es möglich die Genexpression
schnell und einfach zu untersuchen. Innerhalb kürzester Zeit liefert ein Chip die Resultate von
einigen tausend bis zehntausend Reaktionen unter Verwendung sehr geringen Probenmaterials. Die
ersten Mikroarrays wurden durch photolithographische Verfahren hergestellt, was sonst zur
Fertigung integrierter Schaltkreise („Computerchips“) genutzt wird, deshalb findet man häufig auch
den Begriff „DNA-Chip“.
DNA-Microarray’s werden aber nicht nur in der Genetik eingesetzt, sondern finden in vielen
verschiedenen Forschungsgebieten, wie med. Diagnostik, Pharmazie oder Mikrobiologie ihren
Einsatz. In der Medizin wird diese Technik vor allem in der Tumordiagnostik eingesetzt. Dank
dieser Methode lassen sich Tumore frühzeitig identifizieren und deren Entwicklung besser
prognostizieren.
In dieser Seminararbeit soll das Thema der DNA-Microarray Technologie näher besprochen
werden. Das Schwergewicht der Arbeit liegt im Aufbau und Funktion von Microarrays sowie deren
Herstellung und Einsatzgebiete. Abschliessend wird ein Blick in die Zukunft geworfen, um die
Richtung der Entwicklung dieser Technologie aufzuzeigen.
2
FunktionMittels DNA-Micorarray wird entweder die Menge an mRNA (messenger RNA) eines Genoms
oder die rRNA (ribosmale RNA) eines Organismus detektiert. Die mRNA ist eine Kopie eines
bestimmten Gens, welches anschliessend durch die Ribosomen in ein Protein umgeschrieben wird,
somit zeigt die Menge an mRNA die Aktivität eines Gens in einer Zelle dar. Je nach Art,
Konditionierung oder Krankheit einer Zelle kann die Genexpression ändern. Eine Tumorzelle hat
z.B. eine ganz andere Physiologie als eine normale Zelle, was sich mit einem DNA-Chip ganz
einfach und schnell aufzeigen lässt.
Es gibt Grundsätzlich zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays (dazu in nächsten Abschnitt
mehr), solche mit cDNA resp. PCR Produkten die auf ein Trägermaterial gedruckt werden „Spotted
Microarray“ und solche mit künstlich hergestellten Oligonucleotiden –„Oligonucleotide
Microarrays“. Diese DNA-Fragmente werden wie in einem Raster auf Spots von ca. 10-100µm
Durchmesser auf das Trägermaterial aufgebracht und immobilisiert. Aus einer Gendatenbank
werden die entsprechenden Gensequenzen, welche für eine spezifische Anwendung interessieren,
ausgesucht. Somit lassen sich für jede Charakterisierung von Zellen oder Tumoren diejenigen Gene
anschauen, die von Interesse sind.
Das Probenmaterial wird aus einer Gewebeprobe gesammelt. Die RNA wird aus der jeweiligen
Probe extrahiert, dazu gibt es verschiedene Kits. Die Extraktion ist aber dennoch sehr schwierig, da
die RNA sehr instabil ist. Um die RNA aus den Zellen zu isolieren, müssen die Zellen zerstört
werden. Dazu kommt das gekühlte Gewebe zusammen mit einer Metallkugel in ein Gefäß, das sehr
schnell geschüttelt wird. Dabei pulverisiert die Metallkugel das gefrorene Gewebe. Anschließend
werden RNAse-deaktivierende Chemikalien zugegeben. Nun kann die RNA bei Raumtemperatur
aus dem Gemisch isoliert werden. Als nächstes wird die RNA mittels Reverser Transrkitption in
cDNA umgewandelt. Dies ist nötig, da auf dem CHIP ebenfalls cDNA ist. Während dieses
Prozesses werden Fluoreszenzmoleküle in die DNA eingebaut. Die DNA CHIPs sowie die cDNA
wird erhitzt, damit die doppelsträngigen Moleküle denaturieren und sich später wieder aneinander
anlagern können. Anschliessend wird die DNA Lösung über Nacht auf dem CHIP inkubiert. Durch
Hybridisierung lagern sich die Proben, der DNA spezifischen Moleküle, auf dem Microarray an.
Überschüssige DNA wird vor der Messung weggewaschen1, 2, 3.
3
Zum Schluss wird der DNA-Chip in einem Laser-Scanner
untersucht. Bei einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert
der Farbstoff. Je besser, d.h. je mehr cDNA auf einen Spot
gebunden haben, desto stärker wird das Signal. Ein
Computerprogramm wertet das entstandene Bild aus, womit
nun Rückschlüsse über die Genexpression einer Probe
gemacht werden kann. Will man die Genexpression in zwei
verschiedenen Geweben miteinander vergleichen, kann man
für jedes Gewebe einen anderen Fluoreszenzfarbstoff
benutzen (zum Beispiel einen, der grün fluoresziert, und
einen, der rot fluoresziert). Die cDNA von beiden Geweben
wird dann gleichzeitig auf den Chip zum Hybridisieren
gegeben. Anschließend werden im Scanner die beiden
Farbstoffe mit den entsprechenden Wellenlängen angeregt. Je nach dem, in welchem Gewebe ein
Gen exprimiert wurde, gibt es anschließend dunkle Spots (in keinem Gewebe vorkommende
Sequenz), rote bzw. grüne (jeweils nur in einem der beiden Gewebe vorkommende Sequenz) und
gelbe Spots (wenn die Sequenz in beiden Geweben exprimiert wurde: rot + grün = gelb).
4
Illustration 4: Visualisierung der Genexpression mit verschiedenen Farben, http://www.microarray.ntnu.no/html/micrarray_scanning_services.html
Illustration 2: Prinzip eines Microarray-Experiments, http://www.ra.cs.uni-tuebingen.de/lehre/ws06/sem_inferenz/Microarrays_CDreischer.pdf
Illustration 3:DNA Microarray- Chip, http://www.agilent.com/
ArtenEs gibt hauptsächlich zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays, einerseits solche, bei denen
cDNA, Oligonukleotide oder Fragmente von PCR-Produkten die der mRNA entsprechen auf das
Trägermaterial gedruckt werden ("Spotted Microarrays") und solche, die auf synthetisch
hergestellten Oligonukleotiden beruhen ("Oligonukleotide Microarrays"). Diese dienen als Sonden,
die an definierte Positionen eines Rasters z. B. auf Glasträger aufgebracht werden. Unabhängig von
der Art der verwendeten Arrays wird RNA zunächst aus dem zu untersuchenden Objekt extrahiert
und diese nach eventuellen Aufreinigungs- und/oder Vermehrungsschritten in cDNA oder cRNA
umgeschrieben und beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Eine bedeutende Ausnahme
stellen sogenannte Phylochips dar. Hier wird DNA extrahiert, amplifiziert, und auf dem Array mit
organismenspezifischen Sonden hybridisiert. Bei der Hybridisierung binden markierte
einzelsträngige DNA/cDNA/cRNA Stücke an ihren komplementären Gegenpart auf dem Array.
Nach Abwaschen der nicht gebundenen DNA/cDNA/cRNA Stücke wird das Fluoreszenzsignal
jeder Position des DNA-Microarrays mittels eines Lasers ausgelesen. Diese reine Intensität wird
üblicherweise noch normalisiert um Abbaueffekten, verschieden guten Extraktionen und anderen
Effekten Rechnung zu tragen4.
HerstellungBei den Herstellungsarten wird unterschieden, ob auf dem Substrat bereits komplette DNA
Sequenzen angebracht werden sollen (presynthesized DNA- Sequences), oder ob die
Nukleotidsequenzen später direkt auf dem Wafer synthetisiert werden (in situ Synthese).
Es kommt eine grosse Auswahl an Herstellungsverfahren zum Einsatz, so kann das Substrat z.B.
mit feinen Spitzen, im Ink-Jet verfahren, per Photolitographie über vorgefertigte Masken oder
elektrochemisch bedruckt werden.
Als Substrat werden u.a. Speziell beschichtete Kunststoffe, Gläser oder Silizium verwendet5.
Das verwendete Substrat wird zuerst aufgereinigt, dann beschichtet. Als Reinigungsmethode für
Siliziumsubstrate kann die Substratoberfläche mit alkalischen Glasreinigern behandelt werden, um
Schmutzpartikel und hydrophobe Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Über eine
Hydroxylierung entsteht auf der Substratoberfläche eine Oxidschicht, welche die
Siliziumoberfläche negativ lädt6.
Bei der darauf folgenden Beschichtung (z.B. über Layer-by-Layer Technik) werden Polyelektrolyt-
Multischichten auf der Substratoberfläche abgeschieden6, 7.
5
Presynthesized
Hierbei dienen im vorraus synthetisierte Oligonukleotide, cDNA oder Fragmente von PCR-
Produkten als Sonden. Nach der Synthetisierung werden sie auf der Array- Oberfläche angelagert.
Die Sonden werden mittels mechanischem Microspotting oder Inkjetting auf dem Träger
angebracht. In der Regel werden diese Arrays für spezifische Aufgaben vorgefertigt.
Derzeit sind viele verschiedene Produkte auf dem Markt erhältlich, die Plattform “CodeLink” des
Herstellers GE Healthcare z.B. setzt silanisierte Glasslides ein. Das Funktionsprinzip des
“CodeLink” Produkts basiert auf der kovalenten immobilisierung von Amino- modifizierter DNA.
Das Produkt der Firma Applied Biosystems, “Genome Survey Microarray”, basiert auf
Glassubstraten mit Nylonbeschichtung. 60- basige Oligonukletide dienen als Probes wobei
schlussendlich über Chemilumineszenz Ausgewertet wird8.
6
Illustration 5: Spottingprozess mittels "ink-stamping", http://www.arrayit.com/Products/Microarray_Printing/Microarray_Pins_ChipMaker_Tech/microarray_pins_chipmaker_tech.html
In situ Synthese
Bei der in situ Synthese werden die angestrebten Nukleotidsequenzen direkt auf der Trägematrix
synthetisiert. Je länger die Sequenz wird, desto aufwändiger ist die Herstellung.
Der Vorteil der in situ Synthese liegt vorallem darin, dass man auf teure, vorgefertigte Arrays
(Design, Herstellung, Qualitätskontrolle) verzichten kann. Jedes Array kann spezifisch,
kostensparend synthetisiert werden9
Eine von Ryan D. Egeland et al. vorgeschlagene Methode, Arrays in situ zu synthetisieren besteht
darin, dass man Korrosionsbeständige 40μm breite, Elektroden als Druckwerkzeuge verwendet. So
lassen sich mit einem Werkzeug beliebig viele Arrays herstellen. Als Herstellungsverfahren für die
Elektroden kommt Dünnfilm- Litographie zum Einsatz.
Hierbei setzt die Oxidation einer
Elektrolytlösung, nach anlegen einer
Spannung an den Mikroelektroden,
Säure an den Anoden frei. Die
gleichzeitige Reduktion an der Kathode
reduziert die Säure. Die Ionen und
Radikale, die durch diese Redox-
Reaktionen an der
Elektrodenoberfläche erzeugt werden,
wandern weg von den Elektroden, hin
zum Substrat (durch eine Kombination
von Diffusions-, Konvektions- und
Migrationseffekten). Während dieser
Laufzeit können die
Elektrodenprodukte weiter reagieren.
Sobald die primären oder sekundären
Produkte das Substrat erreicht haben,
können sie entweder die
Schutzgruppen entfernen
(deblockieren), die Kopplung der
nächsten Nukleotide erleichtern oder
die bereits synthetisierten Oligonukleotide zerstören10.
7
Illustration 6: Chemischer Reaktionszyklus der in Situ Synthese nach Egeland et al, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1183109/figure/fig3/
EinsatzgebieteDie DNA Microarray sind ein wichtiges Werkzeug in der Forschung. Sie gehören heute zu den
wichtigsten Instrumenten in der biomedizinischen Forschung. Sie sind unerlässlich zur effizienten
Analyse von biologischen Prozessen. Was zu Anfangszeiten vor allem in der Genanalyse genutzt,
findet heute mehr und mehr Nutzen in verschiedensten Bereichen. Inzwischen profitieren auch die
molekulare Medizin, die Pharmaforschung sowie die Lebensmittel- oder Umweltanalytik von dieser
Technologie. Sie bieten die Möglichkeit im Bereich der Pharmaforschung um mögliche Wirkstoffe
aus einer Menge von Substanzen herauszupicken. Genetisch veränderte Lebensmittel können des
Weiteren in der Lebensmittelindustrie eruiert werden. Weiter ist es auch möglich, verschiedenste
Keime in Lebensmittel nachzuweisen. Im Bereich Umweltschutz können Microarrays in der
Analyse von Bakterien in Klärschlamm eingesetzt werden11. Die molekulare Medizin befasst sich
vor allem mit der Genexpressionsanalyse, sie bezeichnet eine Untersuchung der Umsetzung der
genetischen Information (Genexpression) mit molekularbiologischen und biochemischen
Methoden12. Einen grossen Nutzen findet die Genexpression in der Onkologie (Krebsforschung). Im
folgenden Abschnitt wird nun die Anwendung von DNA Microarray in der Tumordiagnostik
besprochen.
Mit Hilfe der Technik ist es heute möglich, mit einer hohen Sensitivität und Spezifität genomweit
quantitative Genexpressionsanalysen durchzuführen13. Genexpressionsanalysen mit der Microarray-
Technologie stellen einen Ansatz dar, mit welchem die Diagnostik von Tumoren schneller, sicherer
und exakter zu gestalten um gleichzeitig den Aufwand zu reduzieren. Diese Analyse ermöglicht eine
Analyse von mehreren zehntausend Gene in kürzester Zeit und verschafft damit einen Grossteil des
Genbestands, während man mit anderen Technologien wie PCR oder FISH nur eine oder wenige
ausgewählte Gensonden einsetzen konnte. Sämtliche Microarray basierte Genexpressionsanalysen
lassen sich auf das Prinzip der Hybridisierung, welche in dieser Arbeit unter dem Kapitel
„Funktion“ beschrieben ist, zurückführen14.
„Die Krebsforschung hat mit Hilfe der Microarray-Technologie enorme Fortschritte gemacht.
Mittlerweile können für viele Tumore molekulare Untergruppen von Patienten aufgrund von
Unterschieden in komplexen genomischen, epigenetischen oder transkriptionellen Mustern
bestimmt werden, bis hin zur Definition gänzlich neuer Tumorentitäten.“15
Im Folgenden werden die Anwendungen von Microarrays anhand von Beispielen in der Leukämie
wie auch der Brustkrebsforschung erläutert.
8
Illustration 8: Vergleich normale Zellen mit Tumor Zellen mittels Microarray
Illustration 7: Röntgenaufnahme bei einer Brustkrebspatientin
9
Illustration 10: DualChip Human breast cancer
Beispiele in der Leukämie und Brustkrebsforschung
Erste grosse Meilensteine in der Tumorforschung, mittels der Microarray Technologie, wurde im
Bereich der Diagnostik von Leukämie erzielt. Hierbei gelang es einer Gruppe von Wissenschaftlern
mit Hilfe von der Genexpressionsanalyse eine Klassifikation von ALL nach zytogenetischen,
immunologischen und molekularen Subtypen vorzunehmen. Weiter konnte anhand der Analyse eine
Aussage über den Erfolg der Therapie wie auch Rezidivrisikos gemacht werden. Der Einsatz von
Microarray erlaubt eine bessere Klassifikation und weiter auch detaillierte Aussagen bezüglich
Therapieansprechens, Rezidivhäufigkeit und therapie-assoziierter Sekundärneoplsien. In der
Brustkrebsforschung wurde durch die Entwicklung eines „Dual Chip human breast cancer„ die
Möglichkeit gegeben, hochparallele Analysen differentieller Genexpression in Krebszellen zu
ermöglichen. Durch das Screening vieler verschiedener Tumore geben diese Aufschluss über die
Klassifizierung unterschiedlichster Krebsformen und Stadien. Da jeder Tumor sich in Bezug auf
deren Ursprung unterscheidet, ist es wichtig möglichst viele verschiedene Tumore auf molekularer
Ebene zu untersuchen16. Der „Dual Chip human breast cancer“ enthält über 210 relevante
Brustkrebsgene. Fehlfunktionen dieser Gene werden direkt mit der Entstehung von Brustkrebs in
Verbindung gebracht. Ziel ist nebst der erfolgreichen Klassifizierung und Charakterisierung eine
exakte Prognose und therapeutische Massnahmen für den Patienten zu definieren16.
Illustration 9: DualChip human breast cancer
10
AusblickDie DNA Microarray Chip Technologie ermöglicht eine vielfältige und schnelle Analyse von Daten
in kürzester Zeit. Eine Vision für deren Einsatz liegt sicherlich darin, Patienten mit dieser
Technologie individuelle personifizierte Behandlungen zu ermöglichen. Jedem Patienten das
passende Medikament und die richtige Dosierung11.
Folgende Aussagen zeigen den technologischen Fortschritt sowie die Zukunft dieser Technologie in
der Krebsforschung:
„Aufgrund der Heterogenität und Komplexität von Krebs hat sich die DNA-Microarray Technologie
in den letzten Jahren zu einem wichtigen Werkzeug der Diagnostik entwickelt“17
„The dream, says M.D Anderson’s Mendelsohn, is that Mrs. Smith gets a breast biopsy, we’ll be
able to say: Here are for genes that are abnormal in her tumor, pull open a drawer, pick out the
antibodies or small molecules designed against the abnormal product of those genes, and give her
a cocktail targeting the genes that caused her cancer”18
Aufgrund der Effektivität dieser Technologie setzten sich mehr und mehr Firmen ein, diese
Technologie auch mehr auszubauen, um den oben erwähnten technologischen Schritt zu erreichen.
Die Genexpressionsanalyse mittels DNA-Microarray wird einen wichtigen Schritt in dieser
Technologie einnehmen.
Firmen wie Roche sind daran DNA-Microarray Chips nach den gängigen GMP (Good
Manufacturing Pratice) Konformen herzustellen, um die eigenen Prozesse in Diagnostik, Forschung
und Entwicklung zu beschleunigen und die gewünschte Qualität zu bekommen19. Solche
technologische Erweiterungen zeigen die Wichtigkeit solcher Technologien und zeigen auch, dass
die Zukunftsaussichten für DNA Microarray vielversprechend sind11.
11
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14. Haferlach, T. et al. Microarray-Genexpressionsanalysen in der Leukämiediagnostik. Med Klin 101, 908-914 (2006).
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18. Lemonick, M.D. & Park, A. New hope for cancer. Time 157, 62-69 (2001).19. Roche NimbleGen stellt Microarray-Produktion auf GMP um und plant Einreichung zur FDA-
Zulassung - Roche Diagnostics GmbH - PresseBox. at <http://www.pressebox.de/pressemeldungen/roche-diagnostics-gmbh/boxid/335460>
12
AbbildungsverzeichnisIllustration 1: High density OGT custom DNA microarray, http://www.combichem.co.uk/research/DNAmicroarraytechnologiesPNA.htm..................................1Illustration 2: Prinzip eines Microarray-Experiments, http://www.ra.cs.uni-tuebingen.de/lehre/ws06/sem_inferenz/Microarrays_CDreischer.pdf.................................................4Illustration 3:DNA Microarray- Chip, http://www.agilent.com/..........................................................4Illustration 4: Visualisierung der Genexpression mit verschiedenen Farben, http://www.microarray.ntnu.no/html/micrarray_scanning_services.html............................................4Illustration 5: Spottingprozess mittels "ink-stamping", http://www.arrayit.com/Products/Microarray_Printing/Microarray_Pins_ChipMaker_Tech/microarray_pins_chipmaker_tech.html..............................................................................................................6Illustration 6: Chemischer Reaktionszyklus der in Situ Synthese nach Egeland et al, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1183109/figure/fig3/.................................................7Illustration 7: Röntgenaufnahme bei einer Brustkrebspatientin...........................................................9Illustration 8: Vergleich normale Zellen mit Tumor Zellen mittels Microarray...................................9Illustration 9: DualChip human breast cancer....................................................................................10Illustration 10: DualChip Human breast cancer.................................................................................10
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