Evaluierung eines Impfstoffes zur Vorbeugung der ... · Darmflora des Pferdes angesehen (WOOLCOCK...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Evaluierung eines Impfstoffes zur Vorbeugung

der Rhodococcus equi-Pneumonie beim Fohlen

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Susanne Finze

Burg

Hannover 2015

Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Monica Venner PhD, Dipl. ECEIM

Klinik für Pferde

1. Gutachterin: PD Dr. Monica Venner PhD, Dipl. ECEIM

Klinik für Pferde

2. Gutachter: Prof. Dr. Hoedemaker, Klinik für Rinderkrankheiten

und Bestandsbetreuung

Tag der mündlichen Prüfung: 28. April 2015

für Andreas

und meine Eltern

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

1. Einleitung 11

2. Literaturübersicht 13

2.1. Rhodococcus equi 13

2.1.1. Vorkommen und Bedeutung 13

2.1.2. Pathomorphologie der Rhodokokkose 14

2.1.3. Virulenzfaktoren 15

2.1.4. Krankheitsbild beim Fohlen 17

2.1.5. Diagnose der Rhodokokkose 18

2.2. Immunprophylaxe der Rhodokokkose beim Fohlen 19

2.2.1. Die humorale Immunität und Ansatzpunkte zur passiven

Immunisierung 19

2.2.2. Das unspezifische Immunsystem und Ansätze zur

Immunisierung 21

2.2.3. Die zelluläre Immunität und ihre Cytokinmuster 23

2.2.4. Immunprophylaxe der Rhodokokkose beim Fohlen 27

2.2.5. Immunprophylaxe am Beispiel eines anderen intrazellulären

Erregers beim Fohlen 30

3. Material und Methode 32

3.1. Probanden 32

3.1.1. Allgemeine Haltungsbedingungen der Fohlen 32

3.1.2. Bedingungen für die Aufnahme der Fohlen in die Studie 33

3.1.3. Studiendesign 33

3.2. Methoden 33

3.2.1. Untersuchungen der Fohlen 33

3.2.1.1. Allgemeinuntersuchung der Fohlen 33

3.2.1.2. Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes 34

3.2.1.3. Ultrasonografische Untersuchung der Lunge 34

3.2.2. Labordiagnostische Untersuchung des Blutes 35

INHALTSVERZEICHNIS

3.3. Klinische Durchführung der Studie 36

3.3.1. Charakterisierung von Impfstoff und Placebo 36

3.3.2. Die Impfung 37

3.3.3. Behandlung der Fohlen mit Pneumonie 37

3.4. Evaluierung der humoralen und zellulären Immunantwort auf den

Impfstoff 38

3.4.1. Bestimmung des Antikörpertiters im Serum 38

3.4.2. Bestimmung der Cytokinproduktion 40

3.4.2.1. Aufbereitung der PBMC 40

3.4.2.2. Stimulation der Zellen zur Cytokingewinnung 42

3.4.2.3. Bestimmung der Cytokine mittels Multiplexassay 43

3.5 . Statistische Auswertung 46

4. Ergebnisse 48

4.1. Ergebnisse der klinischen Untersuchungen 48

4.1.1. Anzahl, Geschlecht und Alter der Fohlen bei Studienbeginn 48

4.1.2. Anzahl der klinisch erkrankten Fohlen 48

4.1.3. Alter der Fohlen bei Diagnosestellung 49

4.1.4. Erkrankungsrate in Abhängigkeit vom Alter zum Impfzeitpunkt 50

4.1.5. Abszessscore bei Diagnosestellung in Hinblick auf das

Erkrankungsalter 50

4.1.6. Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung bis zur

Genesung 52

4.1.7. Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung bis

zum Therapiebeginn 53

4.1.8. Anzahl der Blutleukozyten zum Zeitpunkt der

Diagnosestellung 54

4.1.9. Diarrhö 55

4.2. Ergebnisse der Antikörperbestimmung 56

4.2.1. Antikörpertiter beider Gruppen vergleichend 56

4.2.2. P-Werte der Antikörpertiter für den Vergleich beider Gruppen 57

INHALTSVERZEICHNIS

4.3. Ergebnisse der Cytokinmessungen im Multiplexassay 57

4.3.1. Interleukin-4 (Medium – Ansatz) 57

4.3.2. Interleukin-4 (R. equi – Ansatz) 58

4.3.3. Interleukin-4 (PMA- Ansatz) 59

4.3.4. Gegenüberstellung der Interleukin-4 Mittelwerte 60

4.3.5. Interferon- (Medium – Ansatz) 62

4.3.6. Interferon- (R. equi – Ansatz) 63

4.3.7. Interferon- (PMA- Ansatz) 64

4.3.8. Gegenüberstellung der Interferon- Mittelwerte 65









5. Diskussion 75

5.1. Probanden 75

5.2. Unerwünschte Wirkungen 77

5.3. Klinische Wirksamkeit 77

5.4. Stimulation des humoralen Immunsystems 82

5.5. Stimulation des zellulären Immunsystems 83

5.6. Schlussfolgerungen 87

6. Zusammenfassung 89

7. Summery 91

8. Literaturverzeichnis 93

9. Anhang 112

Abbildungsverzeichnis 128

Tabellenverzeichnis 130

Danksagung 132

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS


A Abszess

Abb. Abbildung

bzw. beziehungsweise

C Celsius

CD Cluster of Differentiation

CFU Colony-forming unit

cm Centimeter

CpG Cytosin-Phosphat-Guanin

CR Complement receptor

CTL Cytotoxische T-Zelle

d Day

DNA Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

Fa. Firma

GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung

HIP Hyperimmunplasma

HPR Meerrettichperoxidase

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

kb Kilobase

kDA Kilodalton

KGW Körpergewicht

L Lawsonia

NO Stickstoffmonooxid

M. Musculus

Mac-1 Macrophage-1 antigen

ml Milliliter

µl Mikroliter


o.b.B. ohne besonderen Befund

mRNA messenger Ribonukleinsäure

PAMP Pathogen-assoziierte molekulare Muster

PBMC Peripherial blood mononuclear cells

PCR Polymerase-Chain-Reaction

PMA Phorbol Myristase Acetat

Pn Pneumonie

p.o. per os

R. equi Rhodococcus equi

RNA Ribonukleinsäure

Tab. Tabelle

TBS Tracheobronchialsekret

TCR T-Zellrezeptor

Th T-Helferzellle

TLR Toll-like receptor

TNF Tumornekrosefaktor

Vap Virulenz-assoziiertes Protein

EINLEITUNG

11

1 Einleitung

Immunologische Defizite bei Neugeborenen gelten als Grundlage verschiedenster

Erkrankungen. Beim Fohlen wird diese Unreife als Ursache für die teils dramatische

Entwicklung einer Infektion mit Rhodococcus (R.) equi angesehen. R. equi ist ein

grampositiver, ubiquitär vorkommender Bodensaprophyt, der weltweit sporadisch

oder, vor allem in Betrieben mit Pferdeaufzucht, endemisch in Erscheinung tritt. Er

verursacht beim Fohlen eine eitrige, abszedierende Bronchopneumonie, die akut bis

chronisch verlaufen kann. Pferde, welche älter als sechs Monate sind, erkranken in

der Regel nicht. Vor allem in größeren Zuchtbetrieben verursacht die Rhodokokkose

des Fohlens hohe wirtschaftliche Schäden durch Fohlenverluste und langfristige

Therapiemaßnahmen. Oft wird die Erkrankung erst spät erkannt, wenn sich bereits

viele Abszesse in der Lunge des Fohlens gebildet haben. Einen wirksamen Schutz

vor der Rhodokokkose des Fohlens durch immunprophylaktische Maßnahmen gibt

es trotz jahrelanger Bemühungen bislang nicht.

In den letzten Jahrzehnten wurden vielfältige Versuche mit unterschiedlichen

Impfstrategien durchgeführt, um eine geeignete Methode zur Immunisierung von

Fohlen zu ermitteln. Doch bisher konnten weder die Varianten der aktiven Impfung

noch die passive Immunisierung die Rhodokokkose des Fohlens zufriedenstellend

verhindern. Als Ursache dafür wird die Unreife des neonatalen Immunssystems

angenommen, denn die Fohlen infizieren sich oftmals bereits kurz nach der Geburt.

Hinzu kommt die Schwierigkeit, einen intrazellulären Erreger zu bekämpfen.

Virulente Stämme von R. equi haben sowohl die Fähigkeit, in Makrophagen zu

überleben, als auch sich dort zu vermehren. Um einen wirksamen Immunschutz

aufzubauen, muss somit das humorale und das zelluläre Immunsystem aktiviert

werden. Eine Schlüsselrolle dabei spielt Interferon-, ein entzündungsförderndes

Cytokin, dessen Konzentration bei neugeborenen Fohlen als insuffizient eingeschätzt

wird. Neuere Studien zeigen, dass die Immunantwort von Fohlen zwar quantitativ

geringer ausgebildet ist als die von adulten Pferden, qualitativ jedoch der

erwachsener Pferde entspricht (WAGNER et al. 2010). Diese Ergebnisse zeigen,

EINLEITUNG

12

dass Fohlen in der Lage sind, eine proinflammatorische Immunantwort aufzubauen.

In der vorliegenden Studie wurde ein R. equi - Impfstoff auf seine Wirksamkeit und

Unbedenklichkeit getestet. Durch die mehrfache Impfung der Fohlen wenige Tage

nach der Geburt soll frühestmöglich eine schützende Immunantwort aufgebaut

werden. Der attenuierte Lebendimpstoff bietet dabei eine optimale

Antigenpräsentation, ohne eine Erregerverbreitung zu bewirken. In der Studie

wurden neben der klinischen Wirkung eines neu entwickelten, attenuierten

Lebendimpfstoffes ebenfalls die Bildung spezifischer Antikörper als Ausdruck der

humoralen Immunität und die Produktion verschiedener pro- und antiinflammatorisch

wirksamer Cytokine als Ausdruck der zellulären Immunität geprüft.

LITERATURÜBERSICHT

13

2 Literaturübersicht

2.1 Rhodococcus equi

2.1.1 Vorkommen und Bedeutung

Rhodococcus equi (R. equi) wurde erstmalig im Jahr 1923 von MAGNUSSON als

Erreger einer eitrigen Bronchopneumonie beim Fohlen beschrieben und aufgrund

seiner morphologischen Eigenschaften zunächst der Gattung Corynebakterium

zugeordnet.

R. equi ist ein weltweit verbreiteter, ubiquitär vorkommender Bodensaprophyt mit

hoher Tenazität (TAKAI et al.1986; DEBEY u. BAILEY 1987; KNOTTENBELT 1993;

MEYER-HAMME 2004). In Pferdehaltungen, in denen die Rhodokokkose des

Fohlens endemisch auftritt, sorgt diese Erkrankung durch Fohlenverluste,

Management- und Therapiekosten für hohe wirtschaftliche Schäden (MUSCATELLO

et al 2006a). Die Morbidität der Fohlen beträgt zwischen 5 und 60% weltweit. Die

Letalität liegt unbehandelt bei 40 bis 80% (HILLIDGE 1986; MARTENS et al. 1989).

Neben der Bronchopneumonie treten in einigen Gebieten bei etwa 50% der

erkrankten Fohlen zugleich extrapulmonale Symptome auf (PRESCOTT u.

HOFFMAN 1993; AINSWORTH 1999). Pferde, die älter als sechs Monate sind,

erkranken nicht an Rhodokokkose (WILSON 1955; YAGER 1984), können jedoch

Träger sein. Der Erreger wird sogar als ein Bestandteil der physiologischen

Darmflora des Pferdes angesehen (WOOLCOCK u. MUTIMER 1980).

Die Isolierung von R. equi ist auch in verschiedenen anderen Tierarten beschrieben.

Bei Schweinen kann der Erreger eine chronische, cervicale Lymphadenitis

verursachen, aber auch bei gesunden Tieren nachgewiesen werden (KARLSON et

al. 1940; BARTON u. HUGHES 1984).

R. equi gilt als potentiell humanpathogen. Als gefährdet gelten immunsupprimierte

Menschen, die beispielsweise unter einer HIV-Infektion leiden oder mit

Cortikosteroiden längerfristig therapiert werden (HARVEY u. SUNSTROM 1991;

PRESCOTT u. HOFFMAN 1993).

LITERATURÜBERSICHT

14

2.1.2 Epidemiologie, Morphologie und Pathogenese

R. equi ist ein grampositives, säurefestes, pleomorphes, unbewegliches, ca. 1,2 x 1,4

µm großes Stäbchen mit einer Polysaccharidkapsel (WILSON 1955; WOOLCOCK u.

MUTIMER 1978; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Ferner ist R. equi ein obligat

aerober Keim, der äußerst widerstandsfähig gegenüber Säuren, Basen und

Desinfektionsmitteln ist (WILSON 1955; BARTON u. HUGHES 1984; TAKAI et al.

1991; PRESCOTT u. HOFFMAN 1993). Optimale Bedingungen findet das Bakterium

in den Sommermonaten bei Trockenheit und Wärme. In diesem Zeitraum findet man

die höchste Prävalenz an Lungenentzündungen bei Fohlen (WILSON 1955; YAGER

1987). Das Einatmen von R. equi-haltigem Staub wird als Hauptinfektionsweg

angesehen. Des Weiteren stellt die orale Aufnahme von Kot eine wichtige

Infektionsquelle dar (PRESCOTT et al. 1984). Die Besiedlung des Darmtraktes der

Fohlen beginnt bereits in ihrer ersten Lebenswoche. TAKAI et al. (1986) konnten

schon zu diesem Zeitpunkt R. equi im Fohlenkot nachweisen. Diese Route führt

allerdings in den meisten Fällen lediglich zur weiteren Verbreitung des Keims, es sei

denn, das Fohlen nimmt wiederholt eine große Anzahl an Bakterien auf (JOHNSON

et al. 1983a). Das ist möglich, da sich R. equi in frischem Fohlenkot besonders gut

vermehren kann (TAKAI et al. 1986b). Beschrieben sind ebenfalls die intrauterine

Infektion und die Infektion über den Nabel (BARTON u. HUGHES 1980).

An Rhodokokkose erkranken Fohlen bis zu einem Alter von sechs Monaten. Die

Mehrzahl der erkrankten Tiere ist allerdings jünger als vier Monate (ZINK et al. 1986,

MUSCATELLO et al. 2006b). Die Erkrankung kann sporadisch oder endemisch

auftreten (WILSON 1955; PRESCOTT et al. 1984; YAGER 1987; AINSWORTH

1999). Es besteht dabei ein Zusammenhang zwischen einer hohen Tierdichte und

großen Erkrankungszahlen (COHEN et al. 2005). Trotzdem gilt es als gesichert, dass

der Krankheitsverlauf nicht in erster Linie vom Keimdruck, sondern vom

Vorhandensein des Virulenzproteins A (Vap A) abhängig ist (TAKAI et al. 1991).

LITERATURÜBERSICHT

15

Nach der Inhalation wird R. equi von Alveolarmakrophagen phagozytiert. Virulente

Stämme haben die Fähigkeit, sich in Makrophagen zu vermehren und zu einer

pyogranulomatösen Entzündungsreaktion mit Bildung von mehrkernigen

Riesenzellen zu führen (JOHNSON et al. 1983b).

Die Phagozytose des opsonierten R. equi erfolgt in erster Linie über die Bindung am

Makrophagen-Komplement-Rezeptor CR3 (Mac-1; CD11b, CD18) (HONDALUS et al.

1993). Auch eine Beteiligung von Lipoarabinomannan, einem Oberflächenprotein von

R. equi, welches am Mannose-Rezeptor von Makrophagen bindet, wird in Betracht

gezogen (GARTON et al. 2002). Virulente Stämme sind nun in der Lage, das

Phagosom so zu beeinflussen, dass die Ansäuerung und die Phagosom-Lysosom-

Fusion verhindert wird (ZINK et al. 1987; FERNANDEZ-MORA et al. 2005;

TOYOOKA et al. 2005). Daraufhin führt die unkontrollierte Vermehrung von R. equi in

der Zelle zur Nekrose des Makrophagen (LÜHRMANN et al. 2004), gefolgt von einer

pyogranulomatösen Entzündungsreaktion des umliegenden Lungenparenchyms.

In vitro Versuche zeigen, dass Makrophagen von Mäusen, die durch Interferon-

(IFN-) aktiviert wurden, in der Lage sind, reaktive Sauerstoffspezies zu bilden, und

dass sie dadurch R. equi erfolgreich abwehren können (DARRAH et al. 2000).

Außerdem scheinen Bakterien, welche mit R. equi-spezifischen Antikörpern opsoniert

sind, die Phagosom-Lysosom-Fusion eher zu fördern als zu unterbinden (HIETALA u.

ARDANS 1987). Das zeigt, dass Antikörper eine gewisse Rolle bei der Bekämpfung

der Infektion spielen.

2.1.3 Virulenzfaktoren

Virulente Stämme von R. equi haben die Fähigkeit, intrazellulär zu überleben und

sich dort zu vermehren (HONDALUS u. MOSSER 1994). Diese Fähigkeit ist auf

verschiedene Virulenzfaktoren zurückzuführen. Je nach Vorhandensein dieser

Virulenzfaktoren kann es zu endemischen Krankheitsausbrüchen kommen oder aber

trotz R. equi–Isolaten in Betrieben keinerlei oder nur sporadisch Probleme geben

(ROONEY 1966; TAKAI et al.1991). Isolate von klinisch auffälligen Fohlen haben

eine höhere Virulenz als Isolate aus der Umgebung (ROONEY 1966, VENNER et al.

2007).

LITERATURÜBERSICHT

16

Diese virulenten Stämme besitzen eine oder mehrere Kopien eines etwa 80-90 kb

großen Plasmides (TAKAI et al. 1991b; RODRIGUEZ-LAZARO et al. 2006). Auf der

Pathogenitätsinsel dieses Plasmides sind die Gene der Proteinfamilie der Virulenz-

assoziierten Proteine (Vaps) codiert. Dazu gehören sechs vollständige Gene (VapA,

-C, -D, -E, -G, -H) und drei unvollständige Pseudogene (VapF, -I, -X) (LETEK et al.

2008). Bis heute wurde nur die Rolle des VapA als wichtiger Virulenzfaktor beim

Fohlen bewiesen. Dieses etwa 15 – 17 kDa große VapA ist ein Lipoprotein auf der

Oberfläche des Bakteriums, welches immunogen wirkt (GIGUÈRE et al. 1999;

LÜHRMANN et al. 2004). Es wurde gezeigt, dass VapA für eine persistierende

Infektion und das Vermehren in Makrophagen essentiell ist (JAIN et al. 2003).

Neuere Studien an Fohlen zeigen, dass neben VapA auch VapC stark immunogen

wirkt und eine lymphoproliferative Immunantwort auslöst (JACKS et al. 2007).

Die Expression der Vap–Gene wird erhöht, wenn das Bakterium sich in Makrophagen

befindet. Nährstoffe, Temperatur und pH-Wert beeinflussen dies maßgeblich.

Besonders günstig für die Expression von VapA ist eine Temperatur von 37°C, ein

pH-Wert von 5 – 6,5 und verfügbares Eisen. Auch die Konzentration von Magnesium

beeinflusst die Genexpression (TAKAI et al. 1996; MEIJER u. PRESCOTT 2004).

Neben den Plasmid-codierten haben auch chromosomal-codierte Gene eine

Bedeutung für die Virulenz. Beispielsweise besitzt das Genom von R. equi Gene für

Zwei-Komponenten-Regulationssysteme, welche die Expression anderer Gene fein

justieren. Mutationen dieser Regulationssysteme können zu Hypervirulenz führen

(REN u. PRESCOTT 2004; PEI 2007). LETEK et al. (2010) zeigten in Microarray-

Studien, dass zwischen dem Virulenzplasmid und dem chromosomalen Genom von

R. equi eine molekulare Kommunikation („cross-talking“) stattfindet. Dadurch kann

sich der Erreger optimal an seine Umgebung anpassen und seine

Überlebensfähigkeit verbessern.

Das 20 kDa große Oberflächenprotein VapB wird als intermediär virulent bezeichnet.

Es konnte in Lymphknoten erkrankter Schweine und Menschen isoliert werden,

wurde jedoch niemals bei Fohlen oder in ihrer Umgebung gefunden (TAKAI et al.

1996; LÜHRMANN et al. 2004; LETEK et al. 2008).

LITERATURÜBERSICHT

17

Weitere mögliche Virulenzfaktoren sind die „Equi-Faktoren“. Dazu gehören

Kapselpolysaccharide, die die Phagozytose des Wirtes hemmen, ebenso wie

Exoenzyme mit membranolytischen Eigenschaften, wie die Phospholipase C oder die

Cholesteroloxidase (PRESCOTT et al. 1982; HONDALUS 1997).

2.1.4 Krankheitsbild beim Fohlen

Die klassische Ausprägung einer Rhodokokkose beim Fohlen ist die

pyogranulomatöse Bronchopneumonie (ZINK et al. 1986). Nicht immer tritt diese

klinisch zum Vorschein. Oftmals erholen sich subklinisch erkrankte Fohlen ohne

Behandlung spontan, die Infektion ist dann nur bei einer Ultraschalluntersuchung der

Lunge sichtbar (VENNER et al. 2012).

Die Symptome der klinisch apparenten Rhodokokkose sind wenig spezifisch und

könnten auch durch andere Erreger verursacht werden (PRESCOTT u. HOFFMAN

1993; AINSWORTH 1999). Das zu erwartende Krankheitsbild spiegelt das einer

chronischen Erkrankung der Atemwege wider. Die Fohlen zeigen ein- oder beidseitig

mukösen bis purulenten Nasenausfluss, eine abdominal verstärkte Atmung und

Inappetenz. Des Weiteren können sie Gewicht verlieren und ein struppiges Haarkleid

bekommen. Während der Auskultation von Lunge und Trachea kann ein verschärftes

Atemgeräusch, Rasseln oder Giemen festgestellt werden. Wird die Diagnose erst

spät gestellt, ähneln die Symptome einer akuten Atemwegserkrankung. Die Fohlen

zeigen Tachypnoe, Husten, Fieber und Lethargie. Ein kleiner Teil der Fohlen

entwickelt eine schwere Verlaufsform. Diese ist gekennzeichnet durch plötzliche,

schwere Atemnot und hohes Fieber. Wenn die Diagnose zu spät gestellt wird,

können solche Fohlen auch trotz eingeleiteter Behandlung versterben (MARTENS et

al. 1982; FALCON et al. 1985; GIGUÈRE u PRESCOTT 1997; AINSWORTH 1999).

Extrapulmonale Krankheitsformen können unabhängig oder in Verbindung mit der

Bronchopneumonie einhergehen. Diarrhö kann als Folge einer ulcerativen

Typhlocolitis, aber auch als Reaktion auf eine Antibiotikatherapie auftreten. Die Colitis

ist gekennzeichnet durch eine pyogranulomatöse Lymphadenitis der regionalen

Lymphknoten. Intraabdominale Abszesse und Peritonitis treten nur selten auf

LITERATURÜBERSICHT

18

(JOHNSON et al. 1983a; ZINK et al. 1986; REUSS et al. 2009). Zuweilen können

septische Arthritis, Osteomyelitis oder Polysynovitis auftreten (CHAFFIN et al. 1995;

REUSS et al. 2009). Fohlen, bei denen immun-vermittelte Symptome wie Uveitis,

hämolytische Anämie oder Pemphigus auftreten, haben schlechtere Chancen auf

Genesung als andere (REUSS et al. 2009).

2.1.5 Diagnose der Rhodokokkose

Um die Prognose für die erkrankten Fohlen zu optimieren, ist es essentiell, im frühen

Stadium der Pneumonie die richtige Diagnose zu stellen. Der Verdacht kann nach

eingehender Anamnese und Untersuchung gestellt werden. Oftmals werden

lethargische Fohlen mit Dyspnoe und Fieber vorgestellt. Hinweisend sind die

klinischen Befunde in Kombination mit hämatologischen Ergebnissen, wie einer

ausgeprägten Leukozytose und Hyperfibrinogenämie. Der Verdacht wird verstärkt

durch den Nachweis von multifokalen Verdichtungen im Lungengewebe durch die

ultrasonografische und/oder röntgenologische Untersuchung (FALCON et al. 1985;

HILLIDGE 1986; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; GIGUÈRE et al. 2003). Die

ultrasonografische Untersuchung ermöglicht die Visualisierung der lateralen

Lungenoberfläche und somit den Nachweis pleuranaher Abszesse. Dabei erweist sie

sich als wesentlich sensibler als die Röntgenuntersuchung der Lunge (VENNER

2014). Nicht zuletzt wegen der vergleichsweise einfachen Durchführung eignet sich

die Ultraschalluntersuchung der Lunge gut für Monitoring und Früherkennung auf

endemischen Betrieben, auch wenn Abszesse tief im Lungengewebe nicht erkannt

werden können (RAMIREZ et al. 2004).

Die Verdachtsdiagnose muss durch eine Erregerisolierung bestätigt werden. Diese

gestaltet sich oftmals problematisch, da R. equi potentiell intrazellulär überleben kann

und nur periodisch über die Atemwege oder den Kot ausgeschieden wird. Somit

gelingt der Nachweis nur in etwa 50% der Fälle (MARTENS 1982; HILLIDGE 1986;

GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Geeignetes Material sind Proben von

Tracheobronchialsekret (TBS) und Kot. Als „Goldstandard“ gilt die Kultivierung des

Erregers aus dem TBS (HILLIDGE 1986; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Der

LITERATURÜBERSICHT

19

Nachweis aus dem Kot ist ebenfalls zuverlässig und einfach durchzuführen

(LÄMMER 2010). Um den Nachweis eines virulenten Stammes zu erbringen, ist die

Polymerasekettenreaktion (PCR) eine geeignete Methode. Sie benötigt wesentlich

weniger Zeit als die Kultivierung des Erregers aus dem TBS, jedoch sind Sensitivität

und Spezifität der PCR geringer (SELLON et al. 2001; VENNER et al. 2007).

2.2 Immunprophylaxe der Rhodokokkose beim Fohlen

Dass erwachsene Pferde und auch einige Fohlen nicht an einer R. equi–Infektion

erkranken, junge Fohlen hingegen schwere Krankheitsbilder zeigen können, geht auf

die Virulenz des Pathogens im Zusammenspiel mit der Empfänglichkeit des Wirtes

zurück (HONDALUS u. MOSER 1994). Neugeborene gelten als immunologisch

unreif und haben im Vergleich zu erwachsenen Tieren immunologische Defizite.

Dazu gehören eine weniger wirksame unspezifische Immunantwort, weniger

effiziente Antigen-präsentierende Zellen und die verminderte Fähigkeit, eine

schützende, zelluläre Immunantwort aufzubauen (GREENOUGH 1996; ADKINS et

al. 2004). Da R. equi ubiquitär vorkommt und in Gestüten und anderen

Pferdebetrieben konzentriert verbreitet ist, infizieren sich neugeborene Fohlen häufig

bereits kurz nach der Geburt (PRESCOTT et al. 1984). Daraus entsteht die

Schwierigkeit, eine zuverlässig wirksame und sichere Immunprophylaxe gegen die R.

equi–Pneumonie der Fohlen zu entwickeln. Trotz jahrelanger Forschung und

unterschiedlichsten Herangehensweisen ist noch immer kein Impfstoff kommerziell

verfügbar.

2.2.1 Die humorale Immunität und Ansatzpunkte zur passiven Immunisierung

Immunglobuline bilden einen wichtigen Teil der adaptiven Immunabwehr. Sie haben

die Fähigkeit, gezielt Antigene, wie immunologisch wirksame Oberflächenproteine

von Erregern, zu opsonieren und damit deren Aufnahme durch Phagozyten zu

verbessern. Equine Immunglobuline umfassen IgG, IgA, IgM und IgE, auch IgD

scheint von Pferden gebildet zu werden. Der Anteil an IgG, welcher sieben

Subklassen einschließt, beträgt etwa 80% am Gesamtrepertoire der Antikörper

LITERATURÜBERSICHT

20

(WAGNER et al. 2004). Es wird angenommen, dass IgGb eine Schlüsselrolle in der

Abwehr von bakteriellen Pathogenen spielt. JACKS et al. (2007) konnten bei

erwachsenen, immunkompetenten Pferden nach experimenteller Infektion mit R. equi

einen deutlichen Anstieg an IgGb nachweisen. Die Synthese von IgGb im jungen

Fohlen beginnt im Vergleich zu anderen Subklassen wie IgGa und IgGT spät und

erreicht in den ersten drei bis acht Monaten nicht deren Werte. Maternale Antikörper

haben im Fall von IgGb nur eine Halbwertszeit von 32 Tagen. Somit liegt die

Haupterkrankungsphase der Fohlen an Rhodokokkose deutlich in dieser

immunologischen Lücke (HOLZNAGEL et al. 2003, WAGNER 2006). Es scheinen

jedoch sowohl IgGb als auch IgGa entscheidend zu sein für die Antikörper-abhängige

zelluläre Zytotoxizität und die Aktivierung des Komplementsystems (TAOUJI et al.

2004; LEWIS et al. 2008).

Antikörper gegen das Oberflächenprotein VapA sind bei den meisten Fohlen mit R.

equi-Pneumonie erhöht. Jedoch können sie auch bei klinisch gesunden Fohlen

nachgewiesen werden und sind auf die Vermehrung der Bakterien im Darmtrakt

zurückzuführen (GIGUÈRE et al. 2003). TAOUJI et al. (2002) demonstrierten die

Produktion von mucosalem IgA gegen VapA. Vermutlich bedarf es des

Zusammenwirkens von lokaler und systemischer Abwehr, um den Erreger erfolgreich

zu bekämpfen. Hier bietet sich eine weitere immunologische Lücke auf. IgA wird im

ersten Lebensmonat noch nicht endogen gebildet und fehlt somit auf den

Schleimhäuten des Respirationstraktes der Fohlen (HOLZNAGEL et al. 2003).

Um die Versorgung des neugeborenen Fohlens mit Immunglobulinen und anderen

Immunmodulatoren zu verbessern und somit früh eine gezielte Abwehr zu

ermöglichen, wird seit vielen Jahren mit unterschiedlichen Erfolgen

Hyperimmunplasma (HIP) verabreicht. Es wurden zahlreiche Studien zu dessen

Wirksamkeit durchgeführt, doch der Einsatz bleibt nach wie vor umstritten. Einige

Autoren konnten positive Effekte, wie verringerte Morbidität und Letalität nachweisen

(MARTENS et al. 1989; HIGUCHI et al. 1999). Andere Gruppen konnten keine

schützende Wirkung demonstrieren (HURLEY u. BEGG 1995; GIGUÈRE et al. 2002;

SCHULTE 2006). Es gibt verschiedene Faktoren, die bei dem Gebrauch von HIP in

der Praxis berücksichtigt werden müssen. Unterschiedliche Bedingungen können

LITERATURÜBERSICHT

21

bereits beim Haltungs- und Hygienemanagement sowie dem Infektionsdruck

auftreten. Unklarheiten folgen daraufhin über die richtige Dosierung zum richtigen

Zeitpunkt, bis hin zu der Frage, ob die im HIP enthaltenen anti-R.equi-Antikörper in

genügender Menge und Qualität vorliegen (HOOPER-MCGREVY et al. 2001). Aus

den uneinheitlichen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass sich nicht durch die Gabe

von Antikörpern allein eine Schutzwirkung gegen Rhodokokkose beim Fohlen

erzielen lässt, sondern weitere Faktoren des Immunsystems berücksichtigt werden

müssen.

2.2.2 Das unspezifische Immunsystem und Ansätze zur Immunisierung

Verschiedene Studien der letzten Jahre zeigten, dass auch das unspezifische

Immunsystem eine tragende Rolle bei der Bekämpfung einer R. equi-Infektion spielt.

Dass Makrophagen und neutrophile Granulozyten viele Infektionen primär abwehren,

ist unbestritten (TIZARD 2008). Allerdings ist die Fähigkeit der Fohlenneutrophilen,

durch „oxidativen Burst“ Pathogene zu töten, in den ersten drei Lebensmonaten

schwach ausgeprägt (DEMMERS et al. 2001). Verschiedene Cytokine, IFN- und

TNF-α werden zum Auslösen dieser Mechanismen benötigt. Eine reduzierte IFN--

Bildung der Fohlen könnte das verminderte Abtöten der Keime durch Phagozyten

erklären (BREATHNACH et al. 2006).

DARRAH et al. (2004) stellten an Mäusen fest, dass VapA effektiv die Toll-like-

Rezeptor (TLR)-abhängige Aktivierung von Makrophagen und somit die Produktion

und Freisetzung von Cytokinen auslösen kann. Sie untersuchten dabei die Rolle des

TLR2, welcher auf Makrophagen, Dendritischen Zellen, B- und T-Zellen zu finden ist.

Der TLR2 erkennt Pathogen-assoziierte, molekulare Muster (PAMP), wie

Lipoproteine, auf der Bakterienoberfläche. Nach der Bindung der Abwehrzelle an

PAMPs kommt es zu einer intrazellulären Signalkaskade, welche zur Ausschüttung

verschiedener Entzündungsmediatoren führt. R. equi bewirkt eine sehr effiziente

Ausschüttung von TNF, IL-12 und NO aus Makrophagen. Interleukin-12 induziert die

Bildung von IFN- aus T-Zellen und Natürlichen Killerzellen. IFN- bewirkt die

Aktivierung von Makrophagen und fördert somit das Abtöten intrazellulärer Erreger

(DARRAH et al. 2000). Beim Menschen konnte in Nabelschnurblut eine verminderte

LITERATURÜBERSICHT

22

TLR3-vermittelte IL-12 Produktion in festgestellt werden, nachdem durch das

Stimulanz Polyinosinic-polycytidylic-acid eine virale, intrazelluläre Infektion imitiert

wurde (DE WIT et al. 2003). Ob hingegen der TLR2-Pfad bei neugeborenen Fohlen

insuffizient ist, bedarf weiterer Untersuchungen.

Neutrophile Granulozyten von Fohlen können über den TLR9 stimuliert werden.

Dieser befindet sich im Gegensatz zum TLR2 im Inneren der Zelle, nämlich im

Endosom, und erkennt aufgenommene bakterielle DNA, welche reich an

unmethylierten CpG-Dinukleotiden ist (VOLLMER 2006). TLR9 ist somit besonders

wichtig für Phagozyten, um intrazelluläre Pathogene zu bekämpfen. Dieser

Signalweg ist bei neutrophilen Granulozyten des Fohlens entwickelt und kann bereits

kurz nach der Geburt durch CpGs aktiviert werden. Auch die Aktivierung der

Neutrophilen durch R. equi gelingt bereits kurz nach der Geburt. Die Bildung des

Cytokins IL-12 steigt jedoch erst acht Wochen nach der Geburt deutlich an (LIU et al.

2009).

Die Fähigkeit von CpGs, über den TLR9 Phagozyten zu aktivieren, wurde wiederholt

zur Impfstoffentwicklung herangezogen. Die Wirkung einer rekombinanten

VapA/CpG-Vakzine wurde an neugeborenen Fohlen untersucht (LOHMANN et al.

2013). Die Fohlen der Impfgruppe (n = 8) wurden im Mittel am dritten Lebenstag

intramuskulär geimpft. Die Impfung wurde nach 14 Tagen wiederholt. Vier Wochen

nach der ersten Impfung wurden die Fohlen intrabronchial mit virulentem R. equi

infiziert. Die Fohlen der Impfgruppe zeigten einen signifikanten Anstieg an VapA-

spezifischen IgG. Des Weiteren konnten sie nach der Infektion einen deutlichen

Anstieg von IFN--mRNA in bronchoalveolären Lavagezellen der geimpften Fohlen

feststellen. Post mortem zeigte die Untersuchung der Lungenläsionen jedoch keine

Unterschiede zwischen Impf- und Kontrollgruppe. Die Impfung konnte die Fohlen

trotz Antikörperproduktion und IFN--Expression nicht schützen. Die Autoren

mutmaßen, dass die lokale (pulmonale) Immunität mehr stimuliert werden müsse und

der CpG-Strang nicht genügend stimulatorische Wirkung zeigte. Weitere

Untersuchungen werden benötigt, um genauere Einblicke in den Einfluss einzelner

Immunkomponenten zu bekommen.

LITERATURÜBERSICHT

23

2.2.3 Die zelluläre Immunität und ihre Cytokinmuster

R. equi ist ein fakultativ intrazellulär lebendes Pathogen. Daher geht man davon aus,

dass T-Zell-vermittelte Immunmechanismen die entscheidende Rolle in der

Bekämpfung der Infektion spielen. In diesem Feld wurde viel Forschung an Mäusen

betrieben. T-Lymphozyten sind für die Elimination von virulentem R. equi in Mäusen

unbedingt erforderlich (KANALY et al. 1995). Doch funktionelle T-Lymphozyten allein

genügen dazu nicht, die Differenzierung der CD4+ (Helfer) T-Zellen in Th1 oder Th2

ist wichtig. Denn diese entscheidet über die Sekretion bestimmter Cytokine und den

Charakter der weiteren Immunantwort. Eine Th1-Antwort, welche durch IFN--

Bildung gekennzeichnet ist, bewirkt eine pulmonale Clearance von R. equi, was unter

einer Th2-Antwort mit IL-4 Produktion nicht gelingt (KANALY et al. 1995, 1996).

Diese Schlüsselrolle der Th1-Antwort, welche proinflammatorisch wirkt und sowohl

CD4+ also auch CD8+ (cytotoxische) T-Zellen rekrutiert, wurde auch bei adulten

Pferden dargelegt (HINES et al. 2001). Ein starkes Stimulanz, um naive T-Zellen zu

Th1-Zellen zu differenzieren, stellt IL-12 dar. Es wird von aktivierten Makrophagen,

Neutrophilen und dendritischen Zellen gebildet (KANALY et al. 1995). Die dabei

mobilisierten CD4+ und CD8+ T-Zellen sind eine wichtige Quelle für IFN- (HINES et

al. 2003). Mäuse, in denen IFN- neutralisiert wurde, können R. equi nicht erfolgreich

bekämpfen und entwickeln Lungengranulome (KANALY et al. 1995).

Lymphozyten von neugeborenen Fohlen zeigen in vitro ein hochgradiges Defizit

sowohl bei der Expression der IFN--Gene als auch bei der IFN--Protein-Produktion.

Beide steigen mit zunehmendem Alter an und erreichen mit etwa drei Monaten das

Level von erwachsenen Pferden. Das scheint nicht allein mit einer verminderten Th1-

Antwort oder wenigen Gedächtniszellen zusammenzuhängen, sondern vielmehr eine

unvollständige IFN--Produktion durch T-Zellen unabhängig vom

Differenzierungsstatus widerzuspiegeln (BREATHNACH et al. 2006). Die Autoren

nutzten in dieser Studie mononukleäre Blutzellen (PBMC) und stimulierten diese mit

Phorbol Myristase Acetat (PMA) und Ionomycin. PMA kann verschiedene

Zellpopulationen über die Aktivierung der Protein Kinase C anregen. Dazu gehören

unter anderem T-Zellen und B-Zellen. In T-Zellen läuft normalerweise nach einer

LITERATURÜBERSICHT

24

Antigen-spezifischen T-Zellrezeptor (TCR)-Aktivierung ein intrazellulärer Signalweg

ab, der zur Differenzierung der Zelle und Produktion verschiedener Cytokine führt.

PMA kann T-Zellen unabhängig von ihrem TCR aktivieren und somit die Produktion

von Cytokinen veranlassen. Dabei entsteht eine polyklonale Cytokinantwort aus dem

naiven T-Zellpool, welche zeigt, was diese Zellen potentiell bilden können (WEISS et

al. 1984). Ebenfalls mit PBMC von Fohlen und unter anderem auch mit PMA

arbeitete die Gruppe um WAGNER, als sie die Th-Zellantwort bei Fohlen in den

ersten drei Lebensmonaten analysierten. Sie untersuchten dafür die

Cytokinproduktion von IFN- (Th1), IL-4 (Th2) und IL-10 (mit IFN- TR1=

regulatorische T-Zellen). Dabei wurde ebenfalls eine reduzierte IFN--Produktion bei

Neonaten im Vergleich zu adulten Pferden nach PMA-Stimulation festgestellt. Ähnlich

waren jedoch auch IL-4- und IL-10-Produktion vermindert. Das Th1/Th2-Verhältnis

stellte sich abhängig vom Alter deutlich zu Gunsten der Th1-Antwort dar. Außerdem

zeigten sich IFN-/IL-10-Verhältnisse wie beim erwachsenen Pferd und die

Produktion von IFN- durch Th-Zellen und CD8+ CTL (cytotoxische T-Zellen) in den

ersten fünf Lebenstagen war klar ersichtlich. Das bedeutet, dass T-Zellen von

equinen Neonaten und Fohlen in der Lage sind, Th1-, CTL- und TR1-Antworten zu

bilden, die qualitativ ähnlich denen adulter Pferde sind. Darüber hinaus wurde eine

verminderte Th2-Antwort beim Fohlen nachgewiesen, welche innerhalb der ersten

drei Lebensmonate quantitativ nicht an Werte von erwachsenen Pferden heranreicht

(WAGNER et al. 2010). Dies steht im Widerspruch zu Forschungsergebnissen bei

neonaten Mäusen und Menschen, bei denen davon ausgegangen wird, dass die

zellvermittelte Immunantwort den Th2-Weg durchläuft (ADKINS 2000). Eine Th2-

Antwort auf Pathogene wurde auch für equine Neonate angenommen, da die

Expression von IFN--spezifischer mRNA der Fohlen erst im Alter von vier Wochen

signifikant steigt (BOYD et al. 2003).

Hingegen wurde die Insuffizienz der IFN--Produktion bei Fohlen deutlich in Frage

gestellt (JACKS et al 2007). Neonate Fohlen wurden dazu intrabronchial mit

verschiedenen Dosen virulenter R. equi infiziert. Anschließend wurden Zellen aus

den bronchialen Lymphknoten mit R. equi–Antigen stimuliert. Es zeigte sich, dass

Fohlen, welche mit einer geringen Infektionsdosis (1x106 CFU pro Fohlen) infiziert

LITERATURÜBERSICHT

25

worden waren, eine signifikant höhere Expressionsmenge von IFN- mRNA und ein

höheres IFN-/IL-4 Verhältnis hatten als adulte Pferde. Es muss erwähnt werden,

dass alle Fohlen trotzdem Läsionen in der Lunge zeigten, was darauf schließen lässt,

dass neben der Th1-Antwort ein anderer Immunmechanismus nicht funktionierte.

Den Effekt der Infektionsdosis auf die zelluläre und die humorale Immunantwort von

neugeborenen Fohlen untersuchten JACKS und GIGUÈRE (2009). Fünf Fohlen

wurden intrabronchial mit einer geringen Dosis (1 x 106 CFU) und drei Fohlen mit

einer hohen Dosis (1 x 108 CFU) eines virulenten R. equi Stammes infiziert. Die

Fohlen der niedrig dosierten Gruppe zeigten klinisch keine Krankheitssymptome,

hatten jedoch kleine, makroskopisch sichtbare Lungenläsionen. Dagegen zeigten die

Fohlen der hoch dosierten Gruppe schwere Krankheitsanzeichen und schwere,

großflächige Lungenläsionen. Die hoch dosierte Gruppe entwickelte signifikant mehr

IgG(T) als die niedrig dosierte. Darüber hinaus gab es eine Tendenz zu einem

größeren IFN-/IL4 Verhältnis bei der niedrig dosierten Gruppe. Diese Studie zeigt,

dass die Infektionsdosis sowohl die Antikörpersubklassen als auch das Cytokinprofil

der Immunantwort von Fohlen beeinflussen kann. Schon in einer früheren Studie

wurde virulentem R. equi die Fähigkeit zugeschrieben, die Cytokinantwort von

Fohlen modulieren zu können, indem die Expression von IFN- mRNA in CD4+ Zellen

herunterreguliert wird (GIGUÈRE et al. 1999). Die Infektionsdosis ist demnach eine

entscheidende Größe für die Entwicklung sicherer und wirksamer Lebendimpfstoffe.

Bei adulten Pferden ist nachgewiesen, dass cytotoxische T-Zellen (CTL) an der

Bekämpfung von R. equi beteiligt sind (HINES et al. 2003). Diese R. equi-

spezifischen CTL sind nicht darauf beschränkt, den Haupthistokompatibilitäts-

komplex I (MHC) zu erkennen, sondern bemerken CD1 als nicht klassenspezifisches

MHC-Molekül. Dadurch scheinen sie besondere Lipide aus der Zellwand des

Bakteriums zu erkennen. Dieser Weg der Antigenpräsentation ist auch bei dem R.

equi in vielerlei Hinsicht ähnlichen Erreger Mycobacterium tuberculosis beschrieben.

Dessen Lipidantigene sind Lipoarabinomannan oder Mycolsäure (PATTON et al.

2005). Unterschiede in der CD1-Expression sind bei Alverolarmakrophagen (gering)

und Monozyten (höher) und der Verteilung auf mit R. equi infizierten (gering) und

LITERATURÜBERSICHT

26

nicht infizierten (höher) Makrophagen gezeigt worden. Dabei wird vermutet, dass R.

equi die Expression von CD1 auf der Oberfläche von Makrophagen herunterregeln

kann (PARGASS et al. 2009). Die signifikant verminderte Ausbildung von CD1 auf

Fohlenmakrophagen im Vergleich derer adulter Pferde könnte ebenfalls ein negativer

Faktor bei der Beseitigung der R. equi–Infektion durch Fohlen sein (PARGASS et al.

2009).

Abb. 1: Die zelluläre Immunantwort auf R. equi (GIGUÈRE et al. 2011)

Weiterhin wird der Einfluss des Cytokins Interleukin-17, welches stark

inflammatorisch wirkt und die Abwehr von Pathogenen unterstützt sowie eine Rolle in

autoimmunen Prozessen spielt (KORN et al. 2009), auf die Abwehr von R. equi

angenommen. IL-17 wird von Th17-Zellen sezerniert, einer Untergruppe der T-

Helferzellen. IL-23 und IL-6 bewirken die Differenzierung von Th17-Zellen aus naiven

LITERATURÜBERSICHT

27

CD4+-Zellen. IL-17 induziert die Bildung entzündungsfördernder Cytokine,

Chemokine und Prostaglandine aus beispielsweise Makrophagen, Fibroblasten und

Epithelzellen. Die mRNA von IL-17 wird ähnlich der von IL-4 in den ersten

Lebenswochen der Fohlen von R. equi-stimulierten PBMC geringer gebildet als bei

adulten Pferden (LIU et al. 2011). Die Mengen steigen jedoch wesentlich schneller an

als bei IL-4. Interessanterweise konnte keine verminderte Th1-Antwort durch

reduzierte IFN- mRNA Expression bei neonaten Fohlen festgestellt werden (LIU et

al. 2011). Durch seine unterstützende Wirkung bei der Erregerabwehr wird dem IL-17

eine wichtige Bedeutung bei der Bekämpfung von R. equi zugesprochen.

2.2.4 Immunprophylaxe der Rhodokokkose beim Fohlen

In den vergangenen drei Jahrzehnten wurde an unterschiedlichsten Ansätzen

geforscht, um eine wirksame und sichere Vakzine gegen die Rhodokokkose beim

Fohlen zu entwickeln. Mit dem gleichen Hintergrund wie die bereits beschriebene

Gabe von Hyperimmunplasma wurden Stuten aktiv geimpft, um Fohlen durch

Aufnahme von antikörperreichem Kolostrum passiv zu schützen. Schon in frühen

Untersuchungen wurde trotz eines erhöhten Antikörpergehaltes im Kolostrum kein

zufriedenstellender Schutz gegen die R. equi-Pneumonie des Fohlens erkannt

(MARTENS et al. 1991). In einem großen Feldversuch (800 Stuten) wurde die Gabe

einer Vakzine in den letzten Monaten der Trächtigkeit getestet (BECÚ et al. 1997).

Diese Vakzine enthielt lösliche Antigene von R. equi, darunter auch VapA. Nach der

Impfung wurde ein Rückgang der Fohlenmortalität, verursacht durch die R. equi-

Pneumonie, von 3% auf 1,2% beobachtet. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass

die Immunantwort der geimpften Stuten sehr variabel war. Letztlich konnte durch die

Vakzine kein zuverlässiger Schutz erzielt werden. Eine weitere Studie verglich die

IgG-Konzentrationen in tragenden Stuten, welche mit VapA-Antigen verbunden mit

einem wasserbasierten Nanopartikeladjuvans (n = 24) oder einem abgetöteten

Ganzzellimpfstoff (n = 8) vakziniert wurden (CAUCHARD et al. 2004). Die VapA-

Vakzine bewirkte höhere Serum-IgG-Werte als die andere Impf- und die

Kontrollgruppe. Von den 32 in diesem Versuch passiv immunisierten Fohlen

LITERATURÜBERSICHT

28

entwickelte keines eine R. equi-Pneumonie. Daraus ergeben sich Ansätze, um auf

diesem Gebiet in größeren Tiergruppen weitere Untersuchungen durchzuführen.

Im Rahmen der Entwicklung neuer Impfstrategien gegen die Rhodokokkose beim

Fohlen ist die Testung von Vakzinen an Mäusen nicht wegzudenken. Doch

vielversprechende Ergebnisse im Mausmodell bedeuten nicht zwangsläufig

ebensolche Resultate beim Fohlen. Eine VapA exprimierende DNA-Vakzine bewirkt

bei Mäusen eine ausgeprägte Th1-Immunantwort und schützt gegen eine Infektion

mit R. equi (HAGHIGHI u. PRESCOTT 2005). Bei erwachsenen Pferden konnte mit

einer ähnlichen Vakzine sowohl eine starke zelluläre als auch humorale

Immunantwort erzeugt werden (LOPEZ et al. 2003). Im selben Versuch wurden

neonate Fohlen (8. bis 15. Lebenstag, n = 5) mit dieser Vakzine geimpft. Nur bei

wenigen Fohlen konnten nach 45 Tagen R. equi-spezifische IgGa, IgGb und IgM

gemessen werden. Fohlen reagierten somit wesentlich schwächer auf diese Vakzine

als erwachsene Pferde.

Ein anderer Impfversuch an Mäusen erzielte eine gute Schutzwirkung gegen R. equi.

Der verwendete attenuierte Lebendimpfstoff enthielt VapA exprimierende Salmonella

enterica typhimurium. Nach oraler Immunisierung konnten alle Mäuse der

Impfgruppe eine Infektion mit R. equi abwehren und überlebten, dagegen starben

alle Mäuse der Kontrollgruppe (OLIVEIRA et al. 2007). Gemessen wurden die

Clearance, welche bei der Impfgruppe bis zu siebenfach höher war, sowie Antikörper

im Serum der Mäuse, wo sich in der Impfgruppe hohe Werte von IgGa zeigten. Die

nasale Applikation des Impfstoffes an Mäusen zeigte, dass durch den attenuierten

Lebendimpfstoff ein langanhaltender, humoraler und zellulärer Schutz gegen eine

Infektion mit R. equi aufgebaut wird. Außerdem wurde an TLR2-negativen Mäusen

dargestellt, dass dieser für den Aufbau einer protektiven Immunantwort nicht

unbedingt erforderlich ist (CARDOSO et al. 2013). Es bleibt abzuwarten, welche

Ergebnisse Studien an Fohlen in diesem Feld bringen.

LOPEZ et al. (2008) untersuchten die Wirkung eines vollständig attenuierten

Lebendimpfstoffes, der einen Riboflavin-auxothrophen R. equi-Stamm enthält. Die

LITERATURÜBERSICHT

29

Autoren immunisierten zunächst Mäuse intrabronchial. Der Impfstoff erwies sich als

immunogen und induzierte die Bildung von IFN-, war sicher und schützte die Mäuse

bei einer Infektion mit virulentem R. equi. Auch die intrabronchiale Immunisierung

von Fohlen stimulierte eine spezifische Immunantwort und erwies sich als sicher,

schützte allerdings nicht vor einer Erkrankung mit virulentem R. equi. Man geht

davon aus, dass die Vermehrung des Pathogens notwendig ist, um eine starke

zelluläre Immunantwort zu entwickeln. Anderenfalls ist es möglich, dass der Erreger

schnell eliminiert wird, ohne ausreichend immunologisch wirksam zu sein. Dies trifft

auch auf avirulente R. equi-Stämme zu (HINES et al. 2003).

Die orale Verabreichung einer virulenten R. equi-Lebendvakzine schützte Fohlen vor

einer induzierten, intrabronchialen Infektion mit virulentem R. equi (HOOPER-

MCGREVY et al. 2005). Die Fohlen (n = 4) wurden am 2., 7. und 14. Lebenstag oral

mit 100 ml der Vakzine, die 1 x 108 CFU/ml R. equi enthält, geimpft und in der dritten

Lebenswoche intrabronchial infiziert. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe (n = 3)

entwickelten die geimpften Fohlen weder eine klinische Erkrankung noch Läsionen in

der Lunge. Antikörper gegen VapA und VapC konnten bei der geimpften Gruppe

nachgewiesen werden. Entgegen anderen Ergebnissen zeigten sich dabei hohe Titer

an IgGT und ein geringes IgGa/IgGb-Verhältnis im Serum geimpfter Fohlen. Die

Studie zeigt, dass trotz maternaler Antikörper und der Unreife des neonatalen

Immunsystems eine erfolgreiche Impfung sehr junger Fohlen möglich ist. Der Vorteil

einer oralen Impfung liegt in der zusätzlichen Stimulation der mucosalen Immunität.

Nachteilig ist die fäkale Verbreitung des Pathogens und somit die Kontamination der

Umgebung. Daher ist die orale Gabe einer virulenten Lebendvakzine nicht

praxistauglich (HOOPER-MCGREVY et al. 2005). Vielversprechend scheint die Gabe

einer attenuierten Lebendvakzine, die einerseits immunologisch wirksame

Komponenten enthält und die Vermehrung des Erregers zulässt, andererseits durch

Modellierung ihrer virulenten Eigenschaften sicher ist und sich zur Applikation über

Schleimhäute eignet. Die Erprobung solch einer Vakzine ist Inhalt der vorgelegten

Studie.

LITERATURÜBERSICHT

30

2.2.5 Immunprophylaxe am Beispiel eines anderen intrazellulären Erregers

beim Fohlen

Die equine proliferative Enteropathie ist eine Erkrankung, die vom gram-negativen,

obligat intrazellulären Bakterium Lawsonia intracellularis hervorgerufen wird. Anders

als bei der Rhodokokkose können auch erwachsene Pferde erkranken, vorwiegend

gefährdet sind jedoch Fohlen vom zweiten bis achten Lebensmonat. Als besonders

prädestinierend gilt die Phase nach dem Absetzen. L. intracellularis vermehrt sich

hauptsächlich in Enterozyten (LAVOIE et al. 2000).

Ein attenuierter Lebendimpfstoff von L. intracellularis wurde frisch abgesetzten

Fohlen zweimal im Abstand von drei Wochen oral (Gruppe 1) oder intrarektal

(Gruppe 2) appliziert. Die Ausbildung der humoralen Immunantwort und die Dauer

der fäkalen Ausscheidung des Pathogens wurden untersucht. Der Nachweis im Kot

war bei Gruppe 2 nur wenige Tage länger (bis zu 15) als bei Gruppe 1 (bis zu 12)

möglich. Die Ausbildung von spezifischen Antikörpern war in Gruppe 2 bei allen

Fohlen nach der ersten Impfung im Serum messbar, in Gruppe 1 dagegen nur bei

50% (PUSTERLA et al. 2009).

Die zelluläre Immunantwort auf eine Infektion mit L. intracellularis wurde nach

Impfung mit einer avirulenten L. intracellularis-Lebendvakzine und natürlicher

Infektion verglichen (PUSTERLA et al. 2012a). Dabei zeigte sich, dass die IFN--

Genexpression in PBMC bei geimpften (n = 6) und natürlich infizierten Fohlen (n =

16) ähnlich war, jedoch signifikant höher als bei unbehandelten Kontrollfohlen (n = 6).

Schließlich testete die Gruppe die Wirksamkeit einer avirulenten L. intracellularis-

Lebendvakzine nach experimenteller Infektion mit virulentem L. intracellularis an

abgesetzten Fohlen. Die Fohlen wurden 60 und 30 Tage vor der Infektion intrarektal

geimpft. Es stellte sich heraus, dass geimpfte Fohlen (n = 4) signifikant weniger

Bakterien im Kot ausschieden als ungeimpfte, infizierte Fohlen (n = 4). Keines der

geimpften Fohlen zeigte klinische Symptome, ungeimpfte Fohlen erkrankten teils

schwer (PUSTERLA et al. 2012b).

LITERATURÜBERSICHT

31

Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass ein intrarektal applizierter

Lebendimpfstoff bei Fohlen eine schützende humorale und zelluläre Immunantwort

gegen ein intrazelluläres Pathogen herbeiführen kann und außerdem zur

Eindämmung der fäkalen Verbreitung des Erregers führt. Ob ein zur Bekämpfung der

Rhodokokkose eingesetzter, intrarektal applizierter Lebendimpfstoff dies auch bei

neonaten Fohlen bewirkt, ist Gegenstand der vorgelegten Studie.

MATERIAL UND METHODEN

32

3 Material und Methoden

3.1 Probanden

Für die Untersuchungen wurden insgesamt 60 gesunde Warmblutfohlen in die Studie

aufgenommen. Die Fohlen waren zum Studienbeginn zwischen acht und 14 Tage alt.

Sie wurden auf einem deutschen Gestüt mit endemischer Rhodokokkose geboren,

auf welchem die Studie auch durchgeführt wurde. Die Untersuchungen an den

Probanden erstreckten sich von März bis November 2013 über einen Zeitraum von

26 Wochen für das jeweilige Fohlen.

Die Studie ist vom Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit,

Abteilung Gentechnik, genehmigt (Aktenzeichen 6786-01-0213).

3.1.1 Allgemeine Haltungsbedingungen der Fohlen

Die Fohlen wurden in Einzelboxen geboren, welche sich im Abfohlbereich des

Gestüts befanden, der nur über eine Hygieneschleuse zu betreten war. Die

Einzelboxen waren mit Stroh eingestreut und hatten eine Fläche von etwa 12 m2.

Dort wurden sie in den ersten Lebenstagen täglich klinisch untersucht, was bei

unauffälligen Fohlen neben der Erfassung des Allgemeinzustandes die Untersuchung

des Nabels und die Messung der Rektaltemperatur umfasste.

Nach fünf bis zehn Lebenstagen wurden die Fohlen mit Stuten in einen separierten

Stallbereich verbracht, welcher sich etwa 12 km vom Hauptgestüt entfernt befand.

Dort wurden nacheinander zwei Gruppen mit jeweils 30 Stuten und Fohlen in

Laufställen mit Stroheinstreu untergebracht. Sie hatten jederzeit Zugang zu Wasser

und Heu und wurden zweimal täglich mit Mischfutter, bestehend aus Mais- und

Grassilage, Hafer und Mineralstoffen, zugefüttert.

Die Stuten wurden entsprechend der Herstellerangaben gegen Influenza, Tetanus

sowie Equines Herpes Virus 1 und 4 geimpft. Außerdem wurden alle Pferde

regelmäßig entwurmt.


33

3.1.2 Bedingungen für die Aufnahme der Fohlen in die Studie

Aufnahmebedingung für die Studie waren gesunde, gut entwickelte Fohlen im Alter

von sieben bis 14 Tagen. Sie durften bis Studienbeginn keine Antibiotika erhalten

haben. Des Weiteren durften sie keine Plasmatransfusion erhalten haben. Auch

schwerwiegende Fehlstellungen waren ein Ausschlusskriterium.

3.1.3 Studiendesign

Der vorgelegte Versuch ist eine kontrollierte, randomisierte Blindstudie. Sie wurde in

zwei Durchgängen zu jeweils 30 Fohlen durchgeführt. Die Impfung und die

Untersuchungen des ersten Durchgangs begannen im März 2013, die des zweiten

Durchgangs im Mai 2013. Die Durchgänge wurden jeweils in eine Impfgruppe mit 15

Fohlen und eine Kontrollgruppe mit 15 Fohlen eingeteilt. Somit wurden insgesamt 30

Fohlen geimpft und 30 Fohlen mit einen Placebopräparat behandelt.

In den ersten zehn Wochen nach der Impfung wurden die Fohlen im separierten

Stallbereich von einem konstanten Team untersucht und versorgt. Über diesen

Zeitraum galten strickte Isolierungs- und Hygienemaßnahmen. So erfolgte kein

Tierverkehr und nur eingewiesenen Mitarbeitern wurde Zugang gewährt. Spätere

Untersuchungen erfolgten am Hauptgestüt, wohin die Fohlen nach Rhodococcus

equi-negativen Kotproben (PCR auf den Impfstamm: Equillis RhodE Batch 10E12

(Fa. Intervet, Boxmeer, NL)) frühestens acht Wochen nach der letzten Impfung zu

den anderen Stuten und Fohlen wieder integriert wurden.

3.2 Methoden

3.2.1 Untersuchungen der Fohlen

3.2.1.1 Allgemeinuntersuchung der Fohlen

Alle Fohlen wurden während der gesamten Studiendauer in verschiedenen

Abständen regelmäßig klinisch untersucht. In den ersten sechs Tagen ab dem


34

jeweiligen Impftag wurden täglich klinische Untersuchungen durchgeführt, während

der übrigen Zeit wurde dies auf eine einmal wöchentlich vorgenommene

Untersuchung reduziert.

Bei der klinischen Allgemeinuntersuchung der Fohlen wurden Haltung, Verhalten und

Ernährungszustand bewertet und weiterhin das Fress- und Saugverhalten sowie die

Kotkonsistenz überprüft. Darüber hinaus wurden die rektale Körpertemperatur

ermittelt und der Nabelstumpf kontrolliert. Außerdem wurde auf Gelenkfüllungen,

Verletzungen und sonstige Auffälligkeiten wie mögliche Impfreaktionen geachtet.

Die dabei ermittelten Befunde wurden in speziellen Befundbögen notiert und

entsprechend einem Score-System gewertet.

3.2.1.2 Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes

Die spezielle Untersuchung des Respirationstraktes wurde stets im Anschluss an die

klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt. Dabei wurden Größe, Form und

Konsistenz der Manibularlymphknoten durch Palpation beurteilt. Des Weiteren wurde

möglicher Nasenausfluss beurteilt. Es wurde auf spontan auftretenden Husten

geachtet. Anschließend erfolgte die Auskultation von Trachea und Lunge. Dabei

wurde an der Trachea mittig und an der Lunge an beiden Thoraxseiten über

mindestens zwei Atemzüge auskultiert, und eventuelle verschärfte Atemgeräusche

wurden in gering-, mittel- oder hochgradig eingeteilt. Pathologische Nebengeräusche

wie Giemen oder Rasseln wurden ebenfalls notiert.

Die erhobenen Befunde wurden anschließend nach Schweregrad in einem

klinischen Score festgehalten (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998, MEYER-

HAMME 2004; LÄMMER 2010, siehe Anhang: Tab. 29).

3.2.1.3 Ultrasonografische Untersuchung der Lunge

Die ultrasonografische Untersuchung der Lunge wurde alle 14 Tage oder bei

Vorliegen bestimmter krankhafter Befunde zu zusätzlichen Zeitpunkten durchgeführt.

Zu den krankhaften Befunden gehörten mittel- und hochgradig verschärfte

Atemgeräusche sowie Rasseln und Giemen, Husten, deutliche Dyspnoe mit


35

geblähten Nüstern und abdominaler Atmung, purulenter Nasenausfluss, hochgradig

veränderte Mandibularlymphknoten, Fieber über 39,5°C sowie eine

Blutleukozytenzahl von über 13.000 Zellen pro µl Blut.

Durchgeführt wurde die Untersuchung mit einem tragbaren Ultraschallgerät mit

Akkubetrieb und einem 5 MHz Linearschallkopf (Tringa L, Fa. Esaote Pie Medical,

Maastricht, Niederlande) nach der bereits beschriebenen Methode (MEYER-HAMME

2004; LÄMMER 2010).

Schallleitende Veränderungen von mindestens 10 mm Durchmesser, welche

hypoechogen und rundlich waren, wurden als Abszess (A) dokumentiert.

Veränderungen von unter 10 mm wurden als Pneumonien (Pn) betrachtet. Waren

diese Veränderungen eher oval, so wurden Länge und Breite der Zentimeterskala

entnommen, addiert und durch zwei geteilt, um auf die Größe des Befundes zu

schließen. Nun wurden Art, Größe und Lokalisation der Veränderung in den

Befundbogen eingetragen. Schließlich wurde die Summe der einzelnen Abszesse in

Zentimetern berechnet. Dies entspricht dem sogenannten „Abszessscore“, welcher

den Schweregrad der Lungenveränderungen wiedergibt.

3.2.2 Labordiagnostische Untersuchung des Blutes

Während der Studie wurden den Fohlen zu verschiedenen Zeitpunkten

unterschiedliche Blutproben entnommen.

Wöchentlich im Anschluss an die klinische Allgemeinuntersuchung erfolgte die

Abnahme von 1-2 ml Blut aus der Vena jugularis externa mittels einer 1,2 mm x 40

mm Kanüle (BD MicrolanceTM, Fa. Becton Dickinson, Drogheda, Irland). Das Blut

wurde in einem EDTA-Kalium beschichtetem Probenröhrchen aufgefangen (EDTA K,

4ml, Fa. Sarstedt AG, Nümbrecht). Nach dem elektrischen Widerstandsprinzip wurde

anschließend die Leukozytenzahl pro µl Blut im Blutanalysegerät „SYSMEX KX-21N“

(Fa. Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg) bestimmt.

Des Weiteren wurde in Woche 0, 2, 4, 6, 10, 16, 26 jeweils 9 ml Blut aus einer Vena

jugularis externa zur Serumgewinnung in ein Serumröhrchen (Röhre, 10 ml, Fa.

Sarstedt AG, Nümbrecht) gefüllt. Anschließend wurden die Serumröhrchen aufrecht

stehend etwa 4-8 Stunden bei 4°C gelagert. Daraufhin wurden die Serumröhrchen


36

zehn Minuten bei Raumtemperatur und 1000xg zentrifugiert. Dann wurden zweimal

1,5 ml Serum in ein Eppendorf-Röhrchen pipettiert und bei -20°C bis zur weiteren

Analyse gelagert.

Außerdem wurde den Fohlen vor der Impfung sowie an Tag 1, 14, 28, 56, 84 und 112

nach der Impfung jeweils 20 ml Blut aus der Vena jugularis externa abgenommen,

welches in fünf Lithium-Heparin-Probenröhrchen (Li-Heparin, 4 ml, Fa. Sarstedt AG,

Nümbrecht) abgefüllt wurde. Die weitere Bearbeitung wird unter 3.4.2.1 beschrieben.

3.3 Klinische Durchführung der Studie

3.3.1 Charakterisierung von Impfstoff und Placebo

Die Fohlen der Impfgruppe erhielten die attenuierte Lebendvakzine Equillis RhodE

Batch 10E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL). Diese enthält den Rhodococcus equi-Stamm

RG2837 mit 8 x 1010 CFU/Impfampulle. Dieser Stamm ist eine markerfreie

Deletionsmutante, welche sich vom für Fohlen pathogenen und VapA-Plasmid

enthaltenden Stamm R. equi RE1 ableitet. Aus dem Genom des Impfstammes

RG2837 wurden gezielt große Teile der kodierenden Regionen von vier

chromosomalen Genen entfernt. Neue Gene wurden nicht hinzugefügt. Der

Impfstamm enthält unverändert das VapA-Plasmid, um Immunschutz im Fohlen

aufbauen zu können. Deletiert wurden die Cholesterinkatabolismusgene ipdAB und

die sequenzhomologen Gene ipdAB2 mittels gentechnischer Verfahren unter

Verwendung des Suizid-Vektors pSelAct (VAN DER GEIZE et al. 2008, 2011).

Die Fohlen der Placebogruppe wurden mit Equillis RhodE Batch 01E12 (Fa. MSD,

Boxmeer, NL) geimpft. Dabei handelt es sich um eine lyophilisierte Placebovaccine,

welche frei von Rhodococcus equi ist.

Im Anschluss an die klinische Studie wurden Impfdosen der Vakzine sowie des

Placebopräparates mittels PCR vom Hersteller (Fa. MSD) untersucht, um zu

überprüfen, ob Inhalt und Kennzeichnung der Impfdosen korrekt waren.


37

3.3.2 Die Impfung

Die Impfung der Fohlen und die Verabreichung des Placebo-Präparates wurden an

Tag 0, 1, 14 und 15 der Studie durchgeführt. Dabei wurde den Fohlen jeweils 3 ml

Impfstoff bzw. Placebo rektal verabreicht. Dies wurde mittels einer 5 ml Spritze und

einem Intrarektalapplikator (Fa. Mai/Genesis, Spring Valley, WI, USA) durchgeführt.

Zum Zeitpunkt der Impfung wurde jedes Fohlen klinisch untersucht und eine spezielle

Untersuchung des Respirationstraktes durchgeführt. Nur gesunde Fohlen durften die

Impfung erhalten. Vier Stunden nach der Impfung wurde bei allen Fohlen erneut die

Rektaltemperatur gemessen und der Allgemeinzustand überprüft. Die Impfung wurde

von der Autorin unter der Aufsicht von Dr. T. Jacobs (Firma MSD, Boxmeer, NL)

durchgeführt.

An Tag 3 und Tag 17 wurde der Laufstall komplett gemistet. Täglich wurde die

Betonfläche vor dem Stall mit 1% Halamidlösung desinfiziert (Halamid® Chloramine

T, Fa. Axentive, Bouc Bel Air, Frankreich). Diese Maßnahmen wurden vorgenommen,

um der Verbreitung des Impfstammes in die Umwelt vorzubeugen.

3.3.3 Behandlung der Fohlen mit Pneumonie

Fohlen, die während der Studie an einer abszedierenden Bronchopneumonie mit

einem Abszessscore über 8 cm erkrankten, ebenso wie Fohlen, die mindestens drei

Tage Fieber über 39,5°C in Verbindung mit einem mittel- oder hochgradig

verschärften Atemgeräusch sowie Rasseln, Giemen, Husten, deutlicher Dyspnoe mit

geblähten Nüstern und abdominaler Atmung, purulentem Nasenausfluss oder

hochgradig veränderten Mandibularlymphknoten zeigten, wurden antibakteriell

therapiert.

Diese Therapie umfasste die Gabe von Azithromycin (10 mg/kg KGW, p.o., einmal

täglich) in Kombination mit Rifampicin (10 mg/kg KGW, p.o., einmal täglich) über

sechs Wochen. Die Behandlung wurde nach sechs Wochen beendet, wenn die

sonografische Untersuchung der Fohlenlunge keine Abszesse oder Pneumonien


38

mehr zeigte und die Fohlen klinisch frei von mittel- oder hochgradigen Symptomen

einer Pneumonie waren.

3.4 Evaluierung der humoralen und zellulären Immunantwort auf

den Impfstoff

3.4.1 Bestimmung des Antikörpertiters im Serum

Der Antikörpertiter (IgG) der Fohlen gegen R. equi-Zellextrakt wurde mittels ELISA in

den Serumproben der Fohlen bestimmt. Die Untersuchungen wurden von der Firma

MSD (Boxmeer, NL) durchgeführt. Dazu wurden zunächst die Löcher einer 96-Loch-

Mikrotiterplatte mit Flachboden mit je 150 µl der Antigenlösung befüllt und abgedeckt

bei 37°C für 16–24 Stunden inkubiert. Die Antigenlösung enthält Zellwandextrakt des

virulenten R. equi-Stammes 85F, welches in PBS gelöst ist. Anschließend wurde die

Mikrotiterplatte dreimal mit Waschpuffer (PBS + 0,05% Polysorbat 20 als Emulgator)

gewaschen, wobei der flüssige Inhalt nach jedem Schritt aspiriert wurde. Daraufhin

wurde in alle Löcher 100 µl ELISA-Puffer (EIA-Puffer + 0,05% Polysorbat 80)

pipettiert.

Nun wurde in den Reihen A bis G der Mikrotiterplatte mit dem zu testenden

Fohlenserum jeweils eine 1:2-Verdünnungsreihe in zehn Schritten hergestellt. Dazu

wurden zunächst 100 µl Testserum in Spalte eins hinzugefügt und gemischt, und

dann jeweils 100 µl zum nächsten Loch überführt. Schließlich wurden in Spalte zehn

100 µl verworfen. In der Reihe H der Mikrotiterplatte wurde wie beschrieben eine 1:2

Verdünnungsreihe in zehn Schritten mit einem Standardserum (positives, gemischtes

Pferdeserum) hergestellt. Aus dem letzten Loch der Standardserumreihe (H10)

wurden nun 100 µl nach A11 pipettiert, woraus eine 1:2-Verdünnungsreihe in acht

Schritten vertikal in Spalte 11 erstellt wurde. In Spalte 12 blieb nur der ELISA – Puffer

als Negativkontrolle in den Löchern der Mikrotiterplatte. Die

Mikrotiterplattenanordnung zur Antikörpertiter-Bestimmung wird in Tabelle 1

dargestellt.


39

Tab. 1: Mikrotiterplattenanordnung des ELISAs zur Antikörpertiter-Bestimmung aus

dem Fohlenserum. Pro Mikrotiterplatte können sieben Proben gemessen werden.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 Std ELISA

1:20 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:210 Puffer

B F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 Std ELISA

1:20 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:211 Puffer

C F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 Std ELISA

1:20 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:212 Puffer

D F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 Std ELISA

1:20 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:213 Puffer

E F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 F5 Std ELISA

1:20 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:214 Puffer

F F6 F6 F6 F6 F6 F6 F6 F6 F6 F6 Std ELISA

1:20 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:215 Puffer

G F7 F7 F7 F7 F7 F7 F7 F7 F7 F7 Std ELISA

1:20 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:216 Puffer

H Std Std Std Std Std Std Std Std Std Std Std ELISA

1:20 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:28 1:29 1:217 Puffer

F = Fohlen (gilt als Einzelprobe); Std = Standardserum (positives, gemischtes

Pferdeserum)

Die Mikrotiterplatte wurde anschließend abgedeckt und sofort 60 Minuten bei 37°C

inkubiert. Daraufhin wurde die Mikrotiterplatte dreimal mit Waschpuffer (PBS + 0,05%

Polysorbat 20 als Emulgator) gewaschen, wobei der flüssige Inhalt nach jedem

Schritt aspiriert wurde. Dann wurden alle Löcher der Platte mit 100 µl HRP-rec

Protein G Konjugat (Invitrogen™, Camarillo, CA, USA), welches 22000fach in ELISA-

Puffer verdünnt wurde, versetzt und für 30 Minuten bei 37°C abgedeckt inkubiert.

Nun wurde die Mikrotiterplatte wiederholt dreimal mit Waschpuffer (PBS + 0,05%

Polysorbat 20 als Emulgator) gewaschen, wobei der flüssige Inhalt nach jedem

Schritt aspiriert wurde.

Die Löcher der Mikrotiterplatte wurden dann mit jeweils 100 µl der Substratlösung

befüllt und lichtdicht abgedeckt bei Raumtemperatur für zehn Minuten inkubiert. Die

Substratlösung enthält 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine, welches als Substrat der


40

Meerrettichperoxidase (HPR) mit Peroxiden zu einem blauen Farbstoff reagiert.

Seine Intensität ist proportional zu der Menge an reaktionsfähiger HPR, was

wiederum die Menge an reaktionsfähigen Zielproteinen (Antikörpern) anzeigt. Diese

Reaktion kann durch die Zugabe von Schwefelsäure gestoppt werden. Es kommt zu

einem Farbumschlag von Blau zu Gelb, welcher schließlich eine exakte

Intensitätsmessung ermöglicht. Auf der Mikrotiterplatte wurde nach zehn Minuten in

jedes Loch 50 µl 4N Schwefelsäure (pH 4,4 bei 25°C) hinzu pipettiert. Daraufhin

wurden die Antikörpertiter der Mikrotiterplatten in einem Tecan Spectra ELISA reader

(Fa. Tecan, Männedorf, CH) photometrisch bei 450 nm gemessen. Anschließend

wurden die Messergebnisse mit dem Rechenprogramm Caspex (Fa. Caspex

Corporation, Greenlane, NZ) ausgewertet.

3.4.2 Bestimmung der Cytokinproduktion

Die folgenden Untersuchungen wurden von der Autorin zunächst im Labor der

PRIMACYT Cell Culture Technology GmbH von Dr. D. Runge in Schwerin

durchgeführt. Die Cytokinbestimmung erfolgte daraufhin im Labor des Animal Health

Diagnostic Center, Department of Population Medicine and Diagnostic Sciences im

College of Veterinary Medicine der Cornell University und der Aufsicht von Prof. Dr.

B. Wagner.

3.4.2.1 Aufbereitung der PBMC

Um die zelluläre Immunität zu untersuchen, wurden zunächst mononukleäre Zellen

des peripheren Blutes (PBMC, peripherial blood munonuclear cells) isoliert. Dafür

wurden heparinisierte Blutproben von jedem Fohlen zu sieben Zeitpunkten

entnommen. Die Probenröhrchen wurden daraufhin aufrechtstehend in ein Labor mit

sterilem Abzug gebracht und nach ein bis zwei Stunden weiter bearbeitet.

Nachfolgend wird die Aufbereitung des Blutes stellvertretend an einer Probe

beschrieben.


41

Das Plasma von 20 ml heparinisiertem Blut wurde abpipettiert und vorsichtig in ein

steriles 14 ml Röhrchen auf 4 ml kaltem Ficoll-Paque Plus (Fa. GE Healthcare,

München) aufgeschichtet. Ohne beide Phasen zu vermischen wurde das Röhrchen

nun bei 900xg und 10°C für 20 Minuten ungebremst zentrifugiert. In ein vorbereitetes

50 ml Röhrchen mit 30 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, Fisher

BioReagents®, Pittsburgh, PA, USA) wurde nun die wolkige Zwischenphase aus dem

14 ml Ficollröhrchen bei Raumtemperatur pipettiert. Dieses wurde anschließend bei

500xg und 20°C 15 Minuten zentrifugiert. Daraufhin wurde am Boden des Röhrchens

ein Zellpellet sichtbar, der Überstand wurde verworfen. Nun wurde das Pellet

resuspendiert, in dem es mit 1 ml PBS vorsichtig auf und ab pipettiert wurde. Zu den

suspendierten Zellen wurden nun weitere 9 ml PBS gegeben und das Röhrchen bei

100xg und 20°C zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut verworfen.

Die Nächste Waschung erfolgte mit Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Fa.

gibco® life technologies, Carlsbad, CA, USA), wobei 500 ml DMEM mit 56 ml

10%igem Fetalen Bovinen Serum (FBS, Fa. gibco® life technologies, Carlsbad, CA,

USA), 12,5 ml Tissue Culture Cocktail (enthält Pen-Strep, MEM Non-Essential Amino

Acids Solution, Sodium Pyruvate, DMEM, alle Fa. life technologies, Carlsbad, CA,

USA und 2-Mercaptoethanol, Fa. Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und 560 µl

Gentamicin versetzt sind. Das Pellet wurde nun mit 1 ml DMEM gelöst. Aus der

entstandenen Suspension wurde eine 1:10 Verdünnung erstellt, welche zur

Zellzählung herangezogen wurde. Zur restlichen Suspension wurden 9 ml DMEM

hinzugefügt und erneut bei 100xg und 10°C zehn Minuten zentrifugiert. Nach dem

Verwerfen des Überstandes wurde das Pellet in 900 µl DMEM resuspendiert und in

ein Cryoröhrchen pipettiert. Dieses wurde für 30 Minuten bei 4°C gekühlt. Daraufhin

wurden 100 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzupipettiert und das Röhrchen über

Nacht auf -20°C gekühlt, um dann bis zur Weiterverarbeitung bei -80°C zu lagern.

Mit der 1:10 Verdünnung wurde die Zellzählung durchgeführt. Dabei wurde unter

Verwendung der Neubauer-Zählkammer lichtmikroskopisch gezählt. Die erhaltenen

PBMC-Zahlen lagen zwischen 2 - 5 x 107 Zellen/ml PBMC-Isolat, welches bis zur

weiteren Bearbeitung tiefgefroren wurde.


42

3.4.2.2 Stimulation der Zellen zur Cytokingewinnung

Im nächsten Schritt wurde, zur Beurteilung der Stimulation des zellulären

Immunsystems durch die Impfung, die Reaktion von PBMCs auf Rhodococcus equi-

Antigen getestet. Je nach Stimulierung verschiedener Zelltypen wird die Produktion

bestimmter Cytokinmuster erwartet.

Zunächst wurden die eingefrorenen PBMCs aufgetaut. Dies geschah durch

langsames Schwenken der Cryoröhrchen im 37°C warmen Wasserbad und

unmittelbares Überführen der PBMC-Suspension in 5 ml 10°C warmes DMEM,

sobald sich die gefrorene Probe vom Röhrchenrand löste. Dadurch sollte das

Absterben der empfindlichen PBMCs beim Auftauen verhindert werden. Nun wurden

die Proben bei 100xg und 10°C für zehn Minuten zentrifugiert, anschließend der

Überstand verworfen und das Zellpellet in 1 ml DMEM resuspendiert. Die Proben

wurden dann so mit DMEM verdünnt, dass eine Konzentration von 8 x 106 PBMC/ml

erzeugt wurde.

Im Versuch wurde jede Probe neben R. equi- Antigen mit DMEM als Negativkontrolle

und Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) als Positivkontrolle angesetzt. Dafür wurde

das PMA zunächst mit DMEM 1:200 verdünnt. Daraufhin wurden 1 µl dieser Lösung

und 0,4 µl Ionomycin zu 1000 µl DMEM hinzugefügt. Als R.equi-Antigen wurde der

virulente Strang ATCC 33701 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Julia B. F.

Flaminio, Cornell University, NY) verwendet. Die Bakterienkonzentration betrug 1

CFU/Zelle PBMC. Sie wurde in Vorversuchen ermittelt, um einer

Bakterienüberwucherung durch den lebenden Strang nach Inkubation

entgegenzuwirken. Das Bakterienisolat wurde nach Anzüchtung der Ursprungsprobe

auf Schafblutagar in Aliquots von 2 x 1010 CFU/ml in 1 ml PBS bei 4°C gelagert.

Der Ansatz dieses Versuchs erfolgte nun in 96-Loch-Mikrotiterplatten mit

Flachboden. Dafür wurden je Einzelprobe (sieben je Fohlen, 420 insgesamt) drei mal

100 µl PBMC-Suspension mit einer Konzentration von 8 x 105 PBMC/100 µl in je ein

Loch pipettiert und mit 100 µl DMEM, 100 µl R. equi-Suspension oder 100 µl PMA


43

versetzt. Die gefüllte Mikrotiterplatte wurde mit Frischhaltefolie umhüllt und für 48

Stunden bei 37°C inkubiert.

Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Überstände abgenommen und in eine 96-

Loch-Mikrotiterplatte mit Rundboden pipettiert. Diese wurde mit ELISA-Folie

versiegelt und anschließend bei -20°C bis zur Cytokinmessung gelagert.

3.4.2.3 Bestimmung der Cytokine mittels Multiplexassay

Die quantitative und qualitative Bestimmung der nach Antigenkontakt gebildeten

Cytokine der PBMCs wurde mittels Multiplexassay durchgeführt. Dabei handelt es

sich um ein System, das auf der Messung von fluoreszierenden Beads basiert,

welches die gleichzeitige Messung mehrerer Cytokine aus einer einzelnen Probe

ermöglicht (WAGNER et al. 2009). Dazu wurde ein Luminex Analyser (BioPlex 200,

Fa. Luminexcorp., Austin, TX, USA) verwendet. Der Vorteil eines

Multiplexcytokinassays gegenüber einem ELISA besteht zum einen in der erhöhten

Sensitivität und außerdem in einem größeren dynamischen Quantifizierungsbereich

(KELLER u. DOUGLASS 2003; MORGAN et al. 2004). Bei der Luminextechnologie

werden Probenproteine an Beads mit bestimmtem Fluoreszenzfarbton gekoppelt und

weiterhin mit einem Fluoreszenzmarker markiert. Somit können die Probenproteine

(hier Cytokine) in einer Messung durch die Beads klassifiziert und durch den

Fluoreszensmarker quantifiziert werden.

Gemessen wurden die Cytokine IL-4, IL-10, IL-17 und IFN-. Dadurch kann nicht nur

eine Aussage darüber gemacht werden, ob das zelluläre Immunsystem aktiviert wird,

sondern auch ob diese Aktivierung von entzündungshemmender (IL-4, IL-10) oder

entzündungsfördernder (IL-17, IFN-) Natur ist.

Zu Beginn der Durchführung mussten zunächst Standardmesslösungen hergestellt

werden. Dafür wurden Antigenstandardlösungen von IL-4, IL-10, IL-17 und IFN-,

welche im Wagner Lab (Wagner, B., Department of Population Medicine and

Diagnostic Sciences, Animal Health Diagnostic Center, College of Vet. Med., Cornell

University, NY) hergestellt wurden, mit dem Blockierungspuffer PBN (PBS mit 1%


44

bovinem Serumalbumin und 0,05% Natriumazid) versetzt und eine 1:3-

Verdünnungsreihe in acht Stufen hergestellt. Eine zweite 1:3-Verdünnungsreihe in

sechs Stufen wurde aus PMA und PBN hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die

Beadlösung angefertigt, welche aus PBN versetzt mit anti-IL-4, anti-IL-10, anti-IL-17

und anti-IFN-, jeweils bead-gekoppelt (hergestellt im Wagner Lab, beschrieben bei

WAGNER et al. 2009), besteht. Die Beads sind lichtempfindlich, daher muss die

Lösung stets abgedeckt verwahrt werden.

Gearbeitet wurde nun mit 96-Loch-Mikrotiterplatten mit Filterboden (Fa.

ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), die vor Benutzung mindestens zwei

Minuten mit Phosphate buffered saline Triton (PBST, Waschpuffer) im ELx50 bottom

filter strip washer (Fa. Biotek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) hydratisiert

wurden. Nachdem PBST aus den Platten aspiriert wurde, wurden jeweils 50 µl

Standardverdünnung, PMA-Verdünnung und Proben in die jeweiligen Löcher der

Platten gefüllt. Die Mikrotiterplattenanordnung zur Cytokinmessung wird in Tabelle 2

dargestellt.

Anschließend wurde in jedes Loch 50 µl Beadlösung hinzugefügt und lichtdicht

abgedeckt für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rüttler (Brinkman OrbiMix

3010) inkubiert. Dann wurden die Platten mit PBST gewaschen und jeweils 50 µl

Detektorantikörperlösung pro Loch hinzugefügt. Diese Lösung besteht aus

biotinylierten anti-IL-4-, anti-IL10-, anti-IL17- und anti-IFN- Antikörpern (hergestellt

im Wagner Lab), welche in PBN gelöst wurden. Die Platten wurden nun erneut bei

Raumtemperatur 30 Minuten abgedeckt auf dem Shaker inkubiert und anschließend

gewaschen. Danach wurde pro Loch 50 µl einer Streptavidin-gebundenen,

fluoreszierenden Phycoerythrinlösung (Fa. Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)

hinzugefügt, welche 1:10 mit PBN verdünnt wurde. Nachdem die Mikrotiterplatte

abgedeckt 30 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Rüttler inkubiert wurde, wurde

sie gewaschen, jedes Loch mit 100 µl PBN versetzt und erneut abgedeckt 15

Minuten auf dem Rüttler inkubiert.

Anschließend wurde die Platte mittels BioPlex Software auf dem Luminex 200 (Fa.

Luminexcorp, Austin, TX, USA) gelesen.


45

Tab. 2: Mikrotiterplattenanordnung des Multiplexassays zur Cytokinmessung

(Luminextechnologie). Der Aufbau ermöglicht die Messung der Probensätze von drei

Fohlen pro Mikrotiterplatte.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A St.Lsg PBN

F1 Med

F1 R.eq

F1 PMA

F2 Med

F2 R.eq

F2 PMA

F3 Med

F3 R.eq

F3 PMA

1:30

pre pre pre pre pre pre pre pre pre

B St.Lsg PBN

F1 Med

F1 R.eq

F1 PMA

F2 Med

F2 R.eq

F2 PMA

F3 Med

F3 R.eq

F3 PMA

1:31

d1 d1 d1 d1 d1 d1 d1 d1 d1

C St.Lsg PMA1

F1 Med

F1 R.eq

F1 PMA

F2 Med

F2 R.eq

F2 PMA

F3 Med

F3 R.eq

F3 PMA

1:32

1:30

d14 d14 d14 d14 d14 d14 d14 d14 d14

D St.Lsg PMA2

F1 Med

F1 R.eq

F1 PMA

F2 Med

F2 R.eq

F2 PMA

F3 Med

F3 R.eq

F3 PMA

1:33

1:31

d28 d28 d28 d28 d28 d28 d28 d28 d28

E St.Lsg PMA3

F1 Med

F1 R.eq

F1 PMA

F2 Med

F2 R.eq

F2 PMA

F3 Med

F3 R.eq

F3 PMA

1:34

1:32

d56 d56 d56 d56 d56 d56 d56 d56 d56

F St.Lsg PMA4

F1 Med

F1 R.eq

F1 PMA

F2 Med

F2 R.eq

F2 PMA

F3 Med

F3 R.eq

F3 PMA

1:35

1:33

d84 d84 d84 d84 d84 d84 d84 d84 d84

G St.Lsg PMA5

F1 Med

F1 R.eq

F1 PMA

F2 Med

F2 R.eq

F2 PMA

F3 Med

F3 R.eq

F3 PMA

1:36

1:34

d112 d112 d112 d112 d112 d112 d112 d112 d112

H St.Lsg PMA6

1:37

1:35

St.Lsg = Antigenstandardlösung; PBN = Blocking Buffer; PMA = Phorbol Myristase

Acetat; Med = Medium (DMEM); R.eq = R. equi–Suspension; pre = Probe vor der 1.

Impfung; d = Studientag; F = Fohlen


46

3.5 Statistische Auswertung In der statistischen Auswertung wurden die folgenden Fragestellungen bearbeitet:

1. Vergleich von Anzahl, Geschlecht und Alter der Fohlen bei Studienbeginn

2. Vergleich von Erkrankungsrate, Erkrankungsalter, Abszess-Score,

Erkrankungsdauer und Leukozytenwerte im Blut zum Zeitpunkt der

Diagnosestellung in den beiden Fohlengruppen

3. Zusammenhang von Diarrhö zum Impfzeitpunkt und Erkrankung der geimpften

Fohlen an Rhodokokkose

4. Vergleich der Antikörpertiter unter den beiden Fohlengruppen und unter

gesunden und erkrankten Fohlen der einzelnen Gruppen

5. Vergleich der Bildung von IL-4, IFN-, IL-10 und IL-17 zwischen den beiden

Gruppen nach Stimulation durch Medium, R. equi-Antigen und PMA

6. Vergleich der Bildung von IL-4, IFN-, IL-10 und IL-17 zwischen den

Stimulationsmedien (Medium, R. equi-Antigen und PMA) untereinander

Für die deskriptive Darstellung der Daten für alle Variablen der gemachten

Stichproben wurden die Anzahl der Tiere, der arithmetische Mittelwert und die

Standardabweichung bzw. der Median sowie die Minima, Maxima, obere und untere

Quartile ermittelt.

Die statistische Auswertung der Cytokinwerte erfolgte am College of Veterinary

Medicine, Cornell University, NY, USA durch Prof. Dr. Bettina Wagner, sowie an der

Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig durch PD Dr. Ingrid Vervuert,

wo ebenfalls die Ergebnisse der Antikörperdaten statistisch ausgewertet wurden.

Die Überprüfung der Normalverteilung der Cytokin- und Antikörperparameter erfolgte

unter Verwendung des Shapiro-Wilks-Tests.

Zum Vergleich der Cytokinwerte unter den beiden Gruppen wurde die zweifaktorielle

Varianzanalyse (ANOVA) mit den Faktoren „Gruppe“ und „Zeit“ angewendet.

Anschließend wurde als Post-Hoc-Mehrfachvergleich ein Bonferroni-Test für

paarweise Vergleiche zwischen Gruppenmittelwerten durchgeführt.


47

Die Auswertung der Antikörperdaten bezüglich des Vergleichs der Impfgruppe gegen

die Kontrollgruppe wurde als nicht parametrisches Verfahren für den Vergleich zweier

Gruppen durch einen Mann-Whitney U-Test durchgeführt.

Für den Vergleich der unterschiedlichen Inkubationen der einzelnen Cytokine wurden

die Daten mit einer linearen Regression überprüft. Dabei gibt der

Korrelationskoeffizient (r-Wert) die Beziehung zwischen zwei Parametern an, wobei

ein hoher positiver oder negativer r-Wert (maximal 1 oder -1) einen engen

Zusammenhang beschreibt und ein niedriger r-Wert (minimal 0) keinen

Zusammenhang zwischen den Parametern wiedergibt.

Als Irrtumswahrscheinlichkeit α wurde ein Wert von 0,05 für p festgelegt (siehe Tab.

3).

Tab. 3: Signifikanz errechneter p-Werte

p-Wert Signifikanz

> 0,05 nicht signifikant

< 0,05 schwach signifikant

< 0,01 signifikant

< 0,001 hoch signifikant

ERGEBNISSE

48

4 Ergebnisse

4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchungen

4.1.1 Anzahl, Geschlecht und Alter der Fohlen zu Studienbeginn

In die Studie wurden insgesamt 60 Fohlen aufgenommen. Keines der Fohlen musste

aus gesundheitlichen oder anderen Gründen im Verlauf aus der Studie

ausgeschlossen werden. Die 33 Stutfohlen und 27 Hengstfohlen waren zu

Studienbeginn zwischen acht und 14 Tage alt. Das mittlere Alter bei Studienbeginn

lag bei 12,0 ± 1,8 Tagen.

Die Impfgruppe umfasste 30 Fohlen, davon waren 53 % Stutfohlen und 47 %

Hengstfohlen. Das mittlere Alter der Tiere bei Studienbeginn betrug 11,8 ± 1,8 Tage.

Die Kontrollgruppe umfasste ebenfalls 30 Fohlen, davon waren 57 % Stutfohlen und

43 % Hengstfohlen. Das mittlere Alter der Tiere bei Studienbeginn betrug 12,2 ± 1,7

Tage.

4.1.2 Anzahl der klinisch erkrankten Fohlen

Als klinisch erkrankt galten die Fohlen nach der Diagnosestellung „Pneumonie“,

wobei dafür in erster Linie das Auftreten von Abszessen in der Lunge diagnostiziert

wurde. Daneben gaben die Ergebnisse der klinischen Untersuchungen einschließlich

Rektaltemperatur und Blutleukozytenzahl Hinweise auf eine Lungenentzündung und

wurden ebenfalls erfasst.

In der Impfgruppe entwickelten 23 Fohlen Lungenabszesse im

Untersuchungszeitraum von 182 Tagen ab der ersten Impfung. Das sind 76,7 % der

geimpften Fohlen. 14 Fohlen (46,7 %) der Impfgruppe erkrankten behandlungswürdig

mit einem Abszessscore von mindestens 8 cm (VENNER et al. 2013).

In der Kontrollgruppe entwickelten 27 Fohlen (90,0 %) Abszesse während der

Untersuchungen (siehe Abb. 2). Behandlungswürdige Fohlen, d. h. mit einem

Abszessscore von mindestens 8 cm, waren hier 17 (56,7 %).

ERGEBNISSE

49

7

3

23

27

0

5

10

15

20

25

30

Impfgrupppe Kontrollgruppe

An

zah

l d

er

Fo

hle

n

nicht erkrankt

erkrankt

Abb. 2: Anzahl der an einer Pneumonie erkrankten und nicht erkrankten Fohlen im

Studienzeitraum

4.1.3 Alter der Fohlen bei Diagnosestellung

Die Diagnose „Pneumonie“ wurde in der Impfgruppe im Mittel an Tag 98,3 ± 32,2

nach der ersten Impfung (Tag 43 - 162) gestellt. Somit waren die Fohlen im Mittel 110

± 32,2 Tage alt.

Bei den Fohlen der Kontrollgruppe wurde die Diagnose im Mittel an Tag 89,3 ± 39,3

nach Studienbeginn (Tag 8-144) gestellt. Sie waren im Mittel 101,5 ± 39,3 Tage alt

(siehe Tab. 4).

Tab. 4: Alter der Fohlen bei der Diagnosestellung „Pneumonie“; Das Alter setzt sich

aus dem Studientag + 12 Tagen zusammen.

Anzahl der

erkrankten

Fohlen

Fohlenalter

Minimum –

Maximum in Tagen

Fohlenalter

MW ± SD

in Tagen

Impfgruppe (n = 30) 23 55 - 174 110,0 ± 32,2

Kontrollgruppe (n =

30) 27 20 - 156 101,5 ± 39,3

MW= Mittelwert, SD= Standardabweichung

ERGEBNISSE

50

4.1.4 Erkrankungsrate in Abhängigkeit vom Alter zum Impfzeitpunkt

Laut Herstellerangaben (Fa. MSD, Boxmeer, NL) soll die Impfung der Fohlen gegen

Rhodokokkose in der ersten Lebenswoche durchgeführt werden Aus methodischen

Gründen aber waren die Fohlen zum Impfzeitpunkt in der Impfgruppe zwischen acht

und 14 Tage alt. Die Auswertung bezieht sich auf die Fohlen der Impfgruppe (n = 30).

Es erkrankten sowohl 100 % der an Lebenstag 8 geimpften Fohlen, als auch 100 %

der an Lebenstag 14 geimpften Fohlen an einer Lungenentzündung. Die

Erkrankungsraten für die weiteren Lebenstage sind der Tabelle zu entnehmen. Es

besteht kein offensichtlicher Unterschied zwischen den Erkrankungsraten in

Abhängigkeit vom Alter der Fohlen zum Zeitpunkt der ersten Impfung (siehe Tab. 5).

Tab. 5: Erkrankungsrate in Abhängigkeit vom Alter der Fohlen zum Zeitpunkt der

ersten Impfung

Alter zur

1. Impfung

Fohlen

Anzahl nicht erkrankt erkrankt

therapiewürdig

erkrankt

Lebenstag 8 2 0 2 2

Lebenstag 9 2 2 0 0

Lebenstag 10 4 1 3 3





4.1.5 Abszessscore bei Diagnosestellung im Hinblick auf das Erkrankungs-

alter

In der folgenden Gegenüberstellung wird betrachtet, ob die Impfung einen Einfluss

darauf hat, wie schwer ein Fohlen abhängig vom Alter erkrankt. Als Maß für den

Schweregrad der Erkrankung wird hier der Abszessscore bei der Diagnosestellung

„Pneumonie“ herangezogen (siehe Abb. 3).

ERGEBNISSE

51

Abb. 3: Abszessscore bei der Diagnosestellung „Pneumonie“ im Zusammenhang mit

dem Erkrankungszeitpunkt der Fohlen aus der Impf- und Kontrollgruppe

ERGEBNISSE

52

4.1.6 Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung bis zur Genesung

Ein Teil der erkrankten Fohlen entwickelte nur milde Krankheitssymptome. Bei diesen

Fohlen wurde höchstens ein Abszessscore von 8 cm gemessen. Die Abheilung, d. h.

die vollständige Rückbildung der Lungenabszesse trat bei all diesen Fohlen spontan

auf. Es wurde keinerlei antimikrobielle Therapie angewendet. Die Erkrankungsdauer

wurde hier ausgewertet und ist definiert als der Zeitraum in Tagen vom Tag der

Diagnosestellung bis zu dem Tag, ab dem dauerhaft über den restlichen

Untersuchungszeitraum keine Lungenabszesse ultrasonografisch dargestellt werden.

In der Impfgruppe erkrankten neun Fohlen mild. Das sind 39,1 % der 23 erkrankten

Fohlen dieser Gruppe. Der Median für die Erkrankungsdauer lag bei den mild

erkrankten Fohlen der Impfgruppe bei 24 Tagen (min.: 15 und max.: 108 Tage).

Von den 27 erkrankten Fohlen der Kontrollgruppe erkrankten zehn (37,0 %) Fohlen

mild. Die Erkrankungsdauer der mild erkrankten Fohlen lag in der Kontrollgruppe bei

24,5 Tagen (min.: 6 und max.: 125 Tage; siehe Abb. 4).

ERGEBNISSE

53

Abb. 4: Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung „Pneumonie“ bis zur

Genesung der Fohlen, die milde Befunde aufwiesen; dargestellt sind Minima,

Maxima, Mediane, obere und untere Quartile

4.1.7 Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung bis zum Therapiebeginn

Fohlen, die im Untersuchungszeitraum schwere Krankheitssymptome und einen

Lungenabszesssore von mindestens 8 cm entwickelten, galten als schwer erkrankt.

Solche Fohlen wurden mit Antibiotika behandelt.

In der Impfgruppe erkrankten 14 Fohlen schwer. Das sind 60,9 % der 23 erkrankten

Fohlen dieser Gruppe. Die Erkrankungsdauer von der Diagnosestellung bis zum

Therapiebeginn lag bei sieben Tagen (min.: 0 und max.: 120 Tage).

In der Kontrollgruppe zeigten 17 der 27 erkrankten Fohlen (63,0 %) ein

behandlungswürdiges Krankheitsbild. Die Erkrankungsdauer von der

Diagnosestellung bis zum Therapiebeginn lag bei der Kontrollgruppe im Median bei

24 Tagen (min.: 0 und max.: 72 Tage, siehe Abb. 5).

ERGEBNISSE

54

Abb. 5: Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung „Pneumonie“ bis zum

Therapiebeginn der Fohlen; dargestellt sind Minima, Maxima, Mediane, obere und

untere Quartile

4.1.8 Anzahl der Blutleukozyten zum Zeitpunkt der Diagnose

Die Anzahl an Blutleukozyten betrug bei den Fohlen der Impfgruppe zum Zeitpunkt

der Diagnose „Pneumonie“ 17.382 ± 8.242 Leukozyten/µl (min.: 4.700 und max.:

48.900 Zellen/µl).

Der Mittelwert der Blutleukozyten lag bei den Fohlen der Kontrollgruppe bei 15.903 ±

4.623 Zellen/µl (min.: 7.700 und max.: 27.600 Zellen/µl.

Laut dieser Werte besteht kein offensichtlicher Unterschied zwischen der Anzahl der

Leukozyten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung in beiden Gruppen.

ERGEBNISSE

55

4.1.9 Diarrhö

Sowohl der Impfstoff als auch das Placebopräparat wurde den Fohlen rektal

appliziert. Einige Fohlen litten im Impfzeitraum gering- bis mittelgradig an Diarrhö.

In der Impfgruppe zeigten sieben der 30 Fohlen an mindestens einem der vier

Impftage Diarrhö. Von diesen geimpften Fohlen erkrankten fünf (71%) Fohlen im

Untersuchungszeitraum an Rhodokokkose und zwei Fohlen blieben gesund.

Dagegen erkrankten von den 23 Fohlen ohne Durchfall im Impfzeitraum 18 (78%)

Fohlen an Rhodokokkose und fünf Fohlen blieben gesund (siehe Abb. 6).

Abb. 6: Diarrhö im Impfzeitraum und deren Einfluss auf den Impferfolg

ERGEBNISSE

56

4.2 Ergebnisse der Antikörperbestimmung

Den Fohlen aus der Impf- und Kontrollgruppe wurden zu sieben Zeitpunkten im

Studienverlauf Blut zur Serumgewinnung entnommen. Aus diesem Serum wurde

mittels ELISA der Antikörpertiter gegen R. equi-Zellextrakt als Antigen bestimmt.

4.2.1 Antikörpertiter beider Gruppen vergleichend

Die Antikörpertiter der Fohlen der Impfgruppe und der Kontrollgruppe sind in Abb. 7

dargestellt. (Einzelwerte sind in Tab. 19 im Anhang angegeben)

Abb. 7: Verlauf der R. equi–Antikörpertiter der Fohlen der Impf- und Kontrollgruppe.

d0: erster Impftag; dargestellt sind die Mediane sowie die oberen und unteren

Quartile

ERGEBNISSE

57

4.2.2 P-Werte der Antikörpertiter für den Vergleich beider Gruppen

Die nicht parametrisch verteilten Antikörpertiter der Fohlen von Impf- und

Kontrollgruppe wurden unter Verwendung des U-Tests von Mann-Whitney verglichen.

An den Messzeitpunkten Studientag 42, 112 und 182 unterschieden sich die

Antikörpertiter beider Gruppen signifikant (p<0,05) (siehe Tab. 6).

Tab. 6: P-Werte der Antikörpertiter für den Vergleich beider Gruppen

Parameter: Antikörpertiter beider Gruppen

Studientag p-Wert

d 0 0,812225

d 14 0,353169

d 28 0,113000

d 42 0,018293

d 70 0,662585

d 112 0,033188

d 182 0,027221

d = Studientag

4.3 Ergebnisse der Cytokinmessungen im Multiplexassay

Im Multiplexassay wurden die durch die PBMCs produzierten Cytokine gemessen,

nachdem diese mit den Stimulanzien R. equi–Antigen, DMEM–Medium als

Negativkontrolle und PMA als Positivkontrolle inkubiert wurden. Die dafür benötigten

PBMCs wurden den Fohlen der Impf- und Kontrollgruppe zu sieben Zeitpunkten

entnommen.

4.3.1 Interleukin-4 (Medium–Ansatz)

Die gemessenen Mittelwerte an IL-4 schwankten im Medium-Ansatz bei der

Impfgruppe zwischen 2,8 pg/ml am Tag vor der Impfung und 4,6 pg/ml an Tag 14

während der sieben Messzeitpunkte. In der Kontrollgruppe konnten in diesem Ansatz

ERGEBNISSE

58

IL-4 Mittelwerte zwischen 2,4 pg/ml an Tag 28 und 4,2 pg/ml am Tag vor der Impfung

ermittelt werden (siehe Abb. 8).

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der IL-4 Mittelwerte im Medium–Ansatz ergab

keinen Effekt für die Variable „Zeit“ (F(6,348) = 0,80; p = 0,57), die Variable „Gruppe“

(F(1,348) = 0,11; p = 0,74) oder die Interaktion zwischen „Zeit“ und „Gruppe“

(F(6,348) = 1,22; p = 0,29). Ein anschließend durchgeführter Bonferroni-Test ergab

keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppenmittelwerten (p > 0,05).

Abb. 8: IL-4 Konzentration im Medium-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n = 30)

und der Kontrollgruppe (n = 30) zu den gegebenen Messzeitpunkten; (Mittelwert und

Konfidenzintervall sind mit einem Konfidenzniveau von 95% nach der Students-T-

Verteilung angegeben)

Pre = Probe wurde vor der 1. Impfung genommen, d1 = Tag nach der 1. Impfung

4.3.2 Interleukin-4 (R. equi–Ansatz)

Im R. equi–Ansatz wurden bei den Fohlen der Impfgruppe Mittelwerte zwischen 2,6

pg/ml IL-4 am Tag vor der Impfung und 7,7 pg/ml IL-4 an Tag 14 zu den einzelnen

Messzeitpunkten ermittelt. Die IL-4 Mittelwerte der Kontrollgruppe lagen zwischen

ERGEBNISSE

59

2,3 pg/ml am Tag vor der Impfung und 4,8 pg/ml an Tag 56 (siehe Abb. 9).

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der IL-4 Mittelwerte im R. equi–Ansatz ergab


(F(1,348) = 0,62; p = 0,44) oder die Interaktion zwischen „Zeit“ und „Gruppe“



Abb. 9: IL-4 Konzentration im R. equi-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n = 30)





4.3.3 Interleukin- 4 (PMA–Ansatz)

Die IL-4 Mittelwerte im PMA–Ansatz der Impfgruppe lagen an den jeweiligen

Messzeitpunkten zwischen 813,2 pg/ml am Tag vor der Impfung und 9454,0 pg/ml an

Tag 1. In der Kontrollgruppe wurden Mittelwerte zwischen 531,2 pg/ml IL-4 am Tag

vor der Impfung und 7783,0 pg/ml IL-4 an Tag 1 gemessen (siehe Abb. 10).

ERGEBNISSE

60

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der IL-4 Mittelwerte im PMA–Ansatz ergab einen

Effekt für die Variable „Zeit“ (F(6,348) = 7,44; p < 0,001). Kein Effekt wurde für die

Variable „Gruppe“ (F(1,348) = 0,11; p = 0,74) oder eine Interaktion zwischen „Zeit“

und „Gruppe“ (F(6,348) = 1,22; p = 0,29) gefunden. Ein anschließend durchgeführter

Bonferroni-Test ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den

Gruppenmittelwerten (p > 0,05).

Abb. 10: IL-4 Konzentration im PMA-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n = 30)





4.3.4 Gegenüberstellung der IL-4 Mittelwerte

Bei der Betrachtung der Mittelwerte des im Multiplexassay gemessenen IL-4 in den

verschiedenen Ansätzen ist zu erkennen, dass die PBMC sowohl der Impf- als auch

der Kontrollgruppe nach der Stimulation mit R. equi–Antigen IL-4 im selben Maße

bilden wie in der Negativkontrolle mit DMEM-Medium. Die gebildeten Mengen an IL-4

ERGEBNISSE

61

nach Stimulation der PBMC mit PMA sind dagegen um die Potenz 103 höher als nach

der Stimulation mit R. equi–Antigen. Auch dies kann sowohl in der Impfgruppe als

auch in der Kontrollgruppe festgestellt werden (siehe Tab. 7).

Tab. 7: IL-4 Mittelwerte der Impf- und Kontrollgruppe vergleichend in den

verschiedenen Ansätzen

IL-4

(pg/ml)

Impfgruppe (n = 30) Kontrollgruppe (n = 30)

Medium R. equi PMA Medium R. equi PMA

pre 2,8 2,6 813,2 4,2 2,3 531,2

Tag 1 3,0 3,6 9454,0 2,6 2,8 7783,0

Tag 14 4,6 7,7 3595,0 2,9 2,6 2162,0

Tag 28 3,1 3,2 2481,0 2,4 2,8 4030,0

Tag 56 3,0 3,5 2011,0 3,1 4,8 2098,0

Tag 84 3,4 3,5 4672,0 3,4 3,1 5497,0

Tag 112 3,4 3,3 6722,0 2,6 2,9 6001,0

Die unterschiedlichen Inkubationsansätze für IL-4 wurden mit einer linearen

Regression bezüglich ihres Zusammenhangs überprüft. Dabei stellte sich heraus,

dass zwischen den Ansätzen mit DMEM-Medium und R. equi–Antigen ein enger

Zusammenhang besteht, wohingegen kein Zusammenhang zwischen den Ansätzen

mit PMA und R. equi–Antigen bzw. DMEM-Medium dargestellt werden kann (siehe

Tab. 8).

Tab. 8: Zusammenhang zwischen den Inkubationsansätzen für IL-4

Vergleich

(IL-4) Regression Korrelationskoeffizient (r) p-Wert

R. equi gegen

Medium

y = 0,58851 +

0,77538 * x

y = med, x = equi

r = 0,79 p < 0,05

R. equi gegen

PMA

y = 4665,5 – 176,4 * x

y = PMA, x = equi r = -0,08 n.s.

Medium gegen

PMA

y = 4615,4 – 158,8 * x

y = PMA, x = med r = -0,07 n.s.

ERGEBNISSE

62

4.3.5 Interferon- (Medium–Ansatz)

Die Mittelwerte an IFN- beider Fohlengruppen über den Studienzeitraum sind in

Abb. 11 angegeben.

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der IFN- Mittelwerte im Medium–Ansatz ergab

einen Effekt für die Variable „Zeit“ (F(6,348) = 15,77; p < 0,001). Kein Effekt wurde für

die Variable „Gruppe“ (F(1,348) = 0,70; p = 0,41) oder eine Interaktion zwischen

„Zeit“ und „Gruppe“ (F(6,348) = 0,80; p = 0,57) gefunden. Ein anschließend

durchgeführter Bonferroni-Test ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den


Abb. 11: IFN- Konzentration im Medium-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n =

30) und der Kontrollgruppe (n = 30) zu den gegebenen Messzeitpunkten; (Mittelwert

und Konfidenzintervall sind mit einem Konfidenzniveau von 95% nach der Students-

T-Verteilung angegeben)


ERGEBNISSE

63

4.3.6 Interferon- (R. equi–Ansatz)


Abb. 12 angegeben.

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der IFN- Mittelwerte im R. equi–Ansatz ergab






Abb. 12: IFN- Konzentration im R. equi-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n =





ERGEBNISSE

64

4.3.7 Interferon- (PMA–Ansatz)


Abb. 13 angegeben.

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der IFN- Mittelwerte im PMA–Ansatz ergab einen






Abb. 13: IFN- Konzentration im PMA-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n = 30)





ERGEBNISSE

65

4.3.8 Gegenüberstellung der IFN- Mittelwerte

Die Mittelwerte des im Multiplexassay gemessenen IFN- liegen sowohl bei der Impf-

als auch der Kontrollgruppe nach der Stimulation der PBMC mit R. equi–Antigen

ebenso wie nach der Stimulation mit DMEM-Medium im Bereich zwischen 8,8 pg/ml

und 12,6 pg/ml. Nach der Stimulation der PBMC mit PMA liegen die IFN- Mittelwerte

zwischen 28,1 pg/ml und 334,7 pg/ml.

Diese sind somit in beiden Gruppen um die Potenz 101 höher als die Mittelwerte

nach Stimulation mit R. equi-Antigen (siehe Tab. 9).

Tab. 9: IFN- Mittelwerte der Impf- und Kontrollgruppe vergleichend in den


IFN-

(pg/ml)



Pre 9,3 9,6 29,7 8,8 8,8 28,1

Tag 1 11,5 11,4 334,7 10,3 10,2 257,7

Tag 14 12,5 11,8 283,7 11,0 10,6 165,9

Tag 28 11,2 11,7 326,4 10,9 10,7 271,5

Tag 56 11,9 12,0 291,1 11,8 11,7 235,6

Tag 84 12,6 12,1 312,6 12,2 11,1 260,4

Tag 112 12,4 11,7 186,7 11,7 11,1 165,5

Die unterschiedlichen Inkubationsansätze für IFN- wurden mit einer linearen

Regression bezüglich ihres Zusammenhangs überprüft. Es konnte ein enger

Zusammenhang zwischen den Ansätzen mit DMEM-Medium und R. equi–Antigen

gezeigt werden. Dagegen wurde ein weiter Zusammenhang zwischen den Ansätzen

mit PMA und R. equi–Antigen bzw. DMEM-Medium festgestellt (siehe Tab. 10).

ERGEBNISSE

66

Tab. 10: Zusammenhang zwischen den Inkubationsansätzen für IFN-

Vergleich

(IFN-) Regression Korrelationskoeffizient (r) p-Wert

R. equi gegen

Medium y = 3,2156 + 0,73479 * x

y = med, x = equi r = 0,73 p < 0,05

R. equi gegen

PMA y = 27,998 + 17,830 * x

y = PMA, x = equi r = 0,23 n.s.

Medium gegen

PMA y = 44,345 + 15,674 * x

y = PMA, x = med r = 0,21 n.s.

4.3.9 Interleukin-10 (Medium–Ansatz)

Die Mittelwerte an IL-10 beider Fohlengruppen über den Studienzeitraum sind in Abb.

14 angegeben.







ERGEBNISSE

67

Abb. 14: IL-10 Konzentration im Medium-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n =





4.3.10 Interleukin-10 (R. equi – Ansatz)


15 angegeben.

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der IL-10 Mittelwerte im R.equi–Ansatz ergab






ERGEBNISSE

68

Abb. 15: IL-10 Konzentration im R. equi-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n =





4.3.11 Interleukin-10 (PMA–Ansatz)


16 angegeben.







ERGEBNISSE

69







Bei der Gegenüberstellung der IL-10 Mittelwerte ist zu erkennen, dass sich die

Mengen an gebildeten IL-10 im Ansatz mit DMEM-Medium und im Ansatz mit R.

equi–Antigen nur geringgradig unterscheiden. An einigen Probetagen produzierten

die PBMC der Fohlen beider Gruppe nach Stimulation mit R. equi–Antigen im Mittel

2-3 x 100 mehr IL-10 als nach Stimulation mit DMEM-Medium. In der Kontrollgruppe

wurden am Tag vor der Impfung sogar geringere Werte IL-10 im R. equi-Ansatz als

im Medium - Ansatz gemessen. Die ermittelten Mengen an IL-10 lagen sowohl in der

Impf- als auch der Kontrollgruppe nach Stimulation der PBMC mit PMA um die

Potenz 101 bis 102 höher als nach Stimulation mit R. equi–Antigen (siehe Tab. 11).

ERGEBNISSE

70



IL-10

(pg/ml)



Pre 5,0 7,3 32,4 5,2 1,7 27,7

Tag 1 12,1 37,7 581,2 17,9 35,9 570,7

Tag 14 9,2 18,7 843,7 6,5 13,2 394,4

Tag 28 11,3 32,5 879,5 17,3 32,4 722,4

Tag 56 11,2 21,7 859,6 10,1 32,1 941,0

Tag 84 7,8 20,7 1057,0 8,7 11,8 911,7

Tag 112 7,9 19,7 835,3 9,8 10,2 569,4


Regression bezüglich ihres Zusammenhangs überprüft. Es zeigte sich, dass

zwischen allen Ansätzen ein (mittel-) weiter Zusammenhang besteht (siehe Tab. 12).


Vergleich


R. equi gegen

Medium

y = 3,1876 + 0,01793 * x

y = med, x = equi r = 0,26 n.s

R. equi gegen

PMA

y = 976,68 + 54,133 * x

y = PMA, x = equi r = 0,49 p < 0,05

Medium gegen

PMA

y = 444,52 + 319,36 * x

y = PMA, x = med r = 0,20 n.s.

4.3.13 Interleukin-17 (Medium-Ansatz)


17 angegeben.



ERGEBNISSE

71

(F(1,348) = 0,58; p = 0,45) oder eine Interaktion zwischen „Zeit“ und „Gruppe“



Abb. 17: IL-17 Konzentration im Medium-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n =





4.3.14 Interleukin-17 (R. equi-Ansatz)


18 angegeben.

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der IL-17 Mittelwerte im R. equi–Ansatz ergab


(F(1,348) = 0,78; p = 0,38) oder eine Interaktion zwischen „Zeit“ und „Gruppe“



ERGEBNISSE

72

Abb. 18: IL-17 Konzentration im R. equi-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe (n =





4.3.15 Interleukin-17 (PMA-Ansatz)


19 angegeben.







ERGEBNISSE

73







Beim Vergleich der IL-17 Mittelwerte der einzelnen Ansätze zeigt sich, dass die

PBMC der Fohlen beider Gruppen nach Stimulation mit R. equi-Antigen an drei

(Impfgruppe) beziehungsweise zwei (Kontrollgruppe) Probetagen um die Potenz 101

mehr IL-17 produziert haben als nach Stimulation mit DMEM-Medium. Darüber

hinaus sind sowohl in der Impf- als auch der Kontrollgruppe die Mengen an IL-17

nach Stimulation mit PMA um bis zu 103 höher als nach Stimulation mit R. equi-

Antigen (siehe Tab. 13).

ERGEBNISSE

74



IL-17

(pg/ml)



pre 3,0 3,5 67,2 7,3 3,8 48,5

Tag 1 3,3 9,9 1147,0 3,2 34,9 933,3

Tag 14 3,4 14,0 1001,0 3,5 5,3 727,4

Tag 28 2,9 11,9 1748,0 2,9 6,7 1661,0

Tag 56 3,8 20,6 2108,0 3,2 60,5 2241,0

Tag 84 3,2 5,0 2089,0 3,5 4,8 1920,0

Tag 112 4,1 9,9 2940,0 3,5 10,4 2544,0


Regression bezüglich ihres Zusammenhangs überprüft. Dabei stellte sich heraus,

dass zwischen den Ansätzen mit DMEM-Medium und PMA kein Zusammenhang

besteht. Ein weiter Zusammenhang kann zwischen den Ansätzen mit R. equi–

Antigen und PMA bzw. DMEM-Medium dargestellt werden (siehe Tab. 14).


Vergleich


R. equi gegen

Medium

y = 5,1592 + 0,22840 * x

y = med, x = equi r = 0,53 p < 0,05

R. equi gegen

PMA

y = 383,03 + 13,066 * x

y = PMA, x = equi r = 0,51 p < 0,05

Medium gegen

PMA

y = 578,68 + 8,0456 * x

y = PMA, x = med r = 0,14 n.s.

DISKUSSION

75

5 Diskussion

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Schutzwirkung der attenuierten

Lebendvakzine Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL) an Fohlen

gegen die Pneumonie durch Rhodococcus equi (R. equi) sowie ihre Verträglichkeit

zu untersuchen. Parallel dazu wurden Fohlen einer Kontrollgruppe mit der R. equi–

freien Placebovakzine Equillis RhodE Batch 01E12 (Fa. MSD) geimpft. Da virulente

Stämme von R. equi die Fähigkeit haben, sich in Makrophagen zu vermehren und zu

einer pyogranulomatösen Entzündungsreaktion zu führen (JOHNSON et al. 1983b),

muss ein Impfstoff sowohl das humorale als auch das zelluläre Immunsystem

anregen, um vor der Erkrankung schützen zu können. Aus diesem Grund richteten

sich hier die Untersuchungen neben der Erfassung der klinischen Wirksamkeit

weiterhin auf den Nachweis schützender Antikörper und die Bestimmung der

qualitativen und quantitativen Cytokinantwort der Fohlen. So wurden hier, neben den

Erkrankungsraten von geimpften und nicht geimpften Fohlen, die Kinetik der R. equi-

Antikörpertiter ermittelt, und zusätzlich der Einfluss des Impfstoffes auf den Verlauf

des Cytokinmusters der Fohlen untersucht, um Informationen über den Status der

humoralen und zellulären Immunantwort unter den Fohlengruppen zu vergleichen.

5.1 Probanden

Der Impfstoff wurde in dieser Studie an 30 Warmblutfohlen getestet, welche viermal

(Studientag 0, 1, 14 und 15) rektal geimpft wurden. Zu Studienbeginn (Studientag 0)

waren die Fohlen der Impfgruppe im Mittel 11,8 ± 1,8 Tage alt. Als Vergleich bildeten

30 weitere Warmblutfohlen eine Kontrollgruppe, in der eine Placebovakzine geimpft

wurde. Die Fohlen der Kontrollgruppe waren an Studientag 0 im Mittel 12,2 ± 1,7

Tage alt. Eine frühe Impfung der Fohlen ist notwendig, weil die Fohlen bereits in den

ersten Lebenswochen den Erreger durch Staub und Kot in ihrer Umgebung

aufnehmen (TAKAI et al. 1986; COHEN et al. 2013). Laut Herstellerangaben hätte

die erste Impfung in der ersten Lebenswoche der Fohlen erfolgen sollen, was aus

methodischen Gründen in dieser Studie nicht möglich war. In einer anderen Studie

DISKUSSION

76

wurden Fohlen erstmalig zwischen dem achten und 15. Lebenstag mit einer DNA-

Vakzine geimpft. Die Ergebnisse zeigten jedoch nicht die erhoffte Steigerung der

Cytokinproduktion bzw. des Antikörpertiters (LOPEZ et al. 2003). Bereits am 2., 7.

und 14. Lebenstag wurden Fohlen dabei mit einer Lebendvakzine geimpft, welche

die Fohlen vor einer klinischen Erkrankung und Lungenläsionen schütze (HOOPER-

MCGREVY et al. 2005). Die Fohlen der vorliegenden Studie waren zum Zeitpunkt der

Impfung möglicherweise bereits zu alt, so dass der Impferfolg eventuell deshalb

ausgeblieben ist.

Alle Fohlen wurden im März oder Mai 2013 auf einem Gestüt mit endemischer

Rhodokokkose geboren und wuchsen unter gleichen Bedingungen heran. Der

Infektionsdruck war demnach für alle Fohlen vergleichbar. Um in die Studie

aufgenommen zu werden, mussten die Fohlen klinisch gesund erscheinen und

durften nicht antibiotisch vorbehandelt sein, um mit einem vergleichbaren

Immunstatus an dem Impfversuch teilzunehmen. Die ersten zehn Wochen der Studie

verbrachten die Fohlen mit ihren Müttern isoliert auf einem räumlich getrennten

Bereich des Gestüts. Anschließend erfolgten die weiteren Untersuchungen am

Hauptgestüt. Dort kann ein wesentlich höherer Infektionsdruck aufgrund der höheren

Tierzahlen angenommen werden, denn es besteht ein Zusammenhang zwischen

einer hohen Tierdichte und großen Erkrankungszahlen (COHEN et al. 2005).

Die 60 Fohlen wurden im Zeitraum von März bis November 2013 jeweils 26 Wochen

untersucht. Der lange Untersuchungszeitraum ist günstig, um einerseits auch späte

Infektionen zu erfassen, die bis zu einem Alter von sechs Monaten beschrieben

wurden (ZINK et al. 1986) und andererseits den Verlauf von Antikörperbildung und

Cytokinproduktion über einen langen Zeitraum zu ermitteln. Die Gruppengröße

unterscheidet sich von anderen Studien, in denen nur vier Fohlen (HOOPER-

MCGREVY et al. 2005), fünf Fohlen (LOPEZ et al. 2003) oder fünf und drei Fohlen

(JACKS u. GIGUÈRE 2009) geimpft bzw. infiziert wurden und ist als deutlich

aussagekräftiger zu werten.

DISKUSSION

77

5.2 Unerwünschte Wirkungen

Weder bei den Fohlen der Impfgruppe noch bei den Fohlen der Kontrollgruppe

konnten im Studienzeitraum unerwünschte Wirkungen der Impfung festgestellt

werden. In den ersten sechs Tagen ab dem jeweiligen Impftag wurden täglich

klinische Untersuchungen durchgeführt, während der übrigen Zeit wurde dies auf

eine einmal wöchentlich vorgenommene Untersuchung reduziert. Dabei wurde auf

Anzeichen einer Erkrankung durch die Impfung geachtet. Es konnte bei keinem der

Fohlen Fieber, Lethargie oder Husten unmittelbar auf die Impfung folgend festgestellt

werden, wie es im Anfangsstadium der Rhodokokkose zu erwarten wäre (FALCON et

al. 1985). Auch Diarrhö konnte bei den geimpften Fohlen weder als Folge einer R.

equi-Infektion mit symptomatischer Typhlocolitis noch als Reizung der

Darmschleimhaut durch die rektale Impfung beobachtet werden (ZINK et al. 1986).

Da geringgradige Diarrhö vereinzelt sowohl bei geimpften als auch bei nicht

geimpften Fohlen in den ersten Lebenswochen auftrat, ist dies vielmehr auf eine

Umstellung der Darmflora durch die beginnende Aufnahme von Mischfutter und Heu

sowie der veränderten Aufstallung zurückzuführen (KUHL et al. 2011).

Die orale Impfung von zwei bis vier Wochen alten Fohlen mit der strukturell

ähnlichen, attenuierten Lebendvakzine RE1∆ipdAB (8,7 x 107 CFU/Impfdosis) erwies

sich ebenfalls als sicher und gilt als Basis für die Entwicklung der hier geprüften

Vakzine (VAN DER GEIZE et al. 2011).

5.3 Klinische Wirksamkeit

Zwischen den Erkrankungsraten der Impf- und Kontrollgruppe gab es keine

Unterschiede. In der Impfgruppe erkrankten 23 von 30 Fohlen an einer

Lungenentzündung. In der Kontrollgruppe waren es 27 von 30 Fohlen. Die Morbidität

liegt demnach in beiden Gruppen über dem weltweiten Durchschnitt von 5 bis 60%

(HILLIDGE 1986; MARTENS et al. 1989). Auch Fohlen, die mit einem Abszessscore

(Summe der Durchmesser der sonografisch beobachteten Lungenabszesse) von

mindestens 8 cm eine schwere, therapiewürdige Pneumonie entwickelten, waren in

DISKUSSION

78

beiden Gruppen ähnlich verteilt. In der Impfgruppe waren dies 14 von 30 Fohlen und

in der Kontrollgruppe 17 von 30 Fohlen. Die hohe Erkrankungsrate stellt somit ein

enttäuschendes Ergebnis des Impfschutzes dar.

Bei den 23 Fohlen der Impfgruppe wurde die Diagnose „Pneumonie“ im Mittel an

Studientag 98,3 ± 32,2 gestellt, das entspricht einem mittleren Lebensalter von 110

Tagen. In der Kontrollgruppe wurde die Diagnose bei den 27 Fohlen im Mittel an

Studientag 89,3 ± 39,3 gestellt, dies entspricht einem mittleren Lebensalter von 101,5

Tagen. Das Erkrankungsalter deckt sich somit mit den Angaben aus der Literatur,

wonach Fohlen im Alter von ein bis sechs Monaten vermehrt erkranken (ZINK et al.

1986). Bei einem Fohlen der Kontrollgruppe konnten bereits am 21. Lebenstag

(Studientag 8) Lungenabszesse diagnostiziert werden. Dies bestätigt, dass sich

Fohlen bereits kurz nach der Geburt mit R. equi infizieren können (PRESCOTT et al.

1984; COHEN et al. 2013). Ein Gestüt mit endemischer Rhodokokkose bietet dafür

ein erhöhtes Risiko.

Als Grund dafür, dass Fohlen in diesem Alter erkranken, wurde früher die

immunologische Lücke angenommen, die durch den Abbau maternaler Antikörper

und die späte Bildung eigener, schützender Immunglobuline entsteht. Beispielsweise

haben maternale Antikörper im Fall von IgGb, welchem eine besondere Bedeutung

bei der Abwehr von R. equi zugesprochen wird, nur eine Halbwertszeit von 32 Tagen

und IgGb wird in den ersten drei bis acht Monaten nicht in genügendem Maße vom

Fohlen gebildet (HOLZNAGEL et al. 2003; WAGNER 2006). Doch schon ab der

vierten Lebenswoche ist die Eigensynthese von Immunglobulinen bei Fohlen deutlich

zu erkennen (PAUL 2005). Eine klassische Lücke in der Immunantwort des Fohlens

besteht demnach nicht. Viel bedeutender für die reduzierte Immunantwort ist die sehr

geringe Interferon- Produktion durch die neugeborenen Fohlen. Das Interferon-

wird für die Aktivierung von Makrophagen benötigt. Sowohl die Expression der IFN--

Gene als auch die IFN--Protein Produktion steigt mit zunehmendem Alter an und

erreicht mit etwa drei Monaten das Niveau von erwachsenen Pferden

(BREATHNACH et al. 2006). Es ist davon auszugehen, dass alle Fohlen der

vorliegenden Studie bereits in den ersten Lebenstagen und -wochen mit R. equi in

Kontakt gekommen sind und sich somit beim Auseinandersetzen mit dem Erreger in

DISKUSSION

79

dieser immunologisch kritischen Phase befanden. Die Diagnose „Pneumonie“ wurde

im Mittel erst nach der Rückkehr aufs Hauptgestüt gestellt, wo die Fohlen im

klassischen Erkrankungsalter einem wesentlich höherer Keimdruck ausgesetzt

waren.

Die Impfung Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL) hat keinen

Einfluss darauf, wie schwer ein Fohlen abhängig vom Alter erkrankt. Fohlen, die

jünger als drei Monate alt sind, erkranken in der Regel schwerer an Rhodokokkose

als ältere Fohlen. Eine Häufung von Todesfällen kann im Lebensalter von zwei

Monaten beobachtet werden (BEECH u. SWEENEY 1991). Die Ergebnisse der

vorliegenden Studie zeigen, dass sich der Schweregrad der Krankheit abhängig vom

Erkrankungsalter zwischen den Fohlen der Impf- und Kontrollgruppe nicht

unterscheidet. Als Maß für den Schweregrad der Erkrankung wurde hier der

Abszessscore bei der Diagnose „Pneumonie“ herangezogen, da hochgradig

erkrankte Fohlen spät im akut erscheinenden Krankheitsstadium diagnostiziert

werden. Beide Gruppen zeigten einen geringgradig erhöhten Abszessscore bei der

Diagnose „Pneumonie“, wenn diese im dritten bis vierten Lebensmonat gestellt

wurde. Dies ist möglicherweise auf den erhöhten Keimdruck nach der Umstallung auf

das Hauptgestüt zurückzuführen. Denn auch die Infektionsdosis von R. equi

beeinflusst die zelluläre und die humorale Immunantwort von Fohlen. Eine hohe

Infektionsdosis führt zu schweren Krankheitsanzeichen und großflächigen

Lungenläsionen, wohingegen Fohlen eine niedrige Infektionsdosis des Erregers ohne

klinische Veränderungen und mit nur geringen Lungenläsionen abwehren können

(JACKS u. GIGUÈRE 2009).

Trotz der immunologischen Defizite der Fohlen ist es in anderen Studien, allerdings

mit kleineren Tiergruppen, bereits gelungen, erfolgreich sehr junge Fohlen gegen R.

equi zu impfen. Eine virulente R. equi–Lebendvakzine wurde Fohlen oral am 2., 7.

und 14. Lebenstag verabreicht. Daraufhin konnte nach intrabronchialer Infektion

weder eine klinische Erkrankung noch post mortem Läsionen in der Lunge der

Fohlen festgestellt werden (HOOPER-MCGREVY et al. 2005). Der Vorteil einer

oralen Impfung liegt in der zusätzlichen Stimulation der mucosalen Immunität, jedoch

DISKUSSION

80

konnte der virulente Lebendimpfstoff wegen der Gefahr der Verbreitung von

virulenten R. equi nicht an einer größeren Tiergruppe getestet werden. Die

Produktion von mucosalem IgA gegen das Virulenzprotein VapA demonstrierten

bereits TAOUJI et al. (2002). Jedoch wird IgA im ersten Lebensmonat der Fohlen

noch nicht im Maße erwachsener Pferde endogen gebildet (HOLZNAGEL et al.

2003). Daher scheint eine Lebendvakzine notwendig zu sein, um eine ausreichend

starke Immunantwort zu bilden.

Bei dem in dieser Studie verwendeten Impfstoff Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa.

MSD, Boxmeer, NL) handelt es sich einerseits um einen VapA-enthaltenden

Lebendimpfstoff, der jedoch zur Gewährung der Sicherheit attenuiert ist, und

andererseits wird er auch mucosal, über die Rektalschleimhaut, verabreicht. Aus

diesen Parallelitäten zum Impfversuch von HOOPER-MCGREVY et al. (2005) ergibt

sich die Frage, ob der Impfzeitpunkt entscheidend zum Aufbau einer schützenden

Immunantwort beiträgt. Die Fohlen in der Studie von HOOPER-MCGREVY et al.

(2005) erhielten bereits am zweiten Lebenstag ihre erste Impfung. Laut

Herstellerangaben des Versuchsimpfstoffes (Fa. MSD, Boxmeer, NL) soll die Impfung

der Fohlen auch hier in der ersten Lebenswoche durchgeführt werden. Aus

methodischen Gründen beträgt das Alter der Fohlen zum Impfzeitpunkt in der

Impfgruppe zwischen acht und 14 Tagen. Die Ergebnisse zeigen, dass kein

offensichtlicher Unterschied zwischen den Erkrankungsraten in Abhängigkeit vom

Alter der geimpften Fohlen zum Zeitpunkt der ersten Impfung besteht. Es bleibt offen,

ob eine Impfung vor dem achten Lebenstag eine bessere Wirkung erzielen würde.

Doch warum sollte eine noch frühere Impfung wirksamer sein, obwohl Fohlen bis

mindestens zum dritten Lebensmonat als immunologisch unreif gelten

(BREATHNACH et al. 2006). Der Aufbau eines humoralen und zellulären

Immunschutzes in den ersten Lebenswochen ist trotz des Vorhandenseins

maternaler Antikörper möglich (HOOPER-MCGREVY et al. 2005). Darüber hinaus

sind Fohlen schon in den ersten fünf Lebenstagen in der Lage, IFN- durch Th-Zellen

und CD8+ cytotoxische T-Zellen zu produzieren (WAGNER et al. 2010). Demnach

bleibt die Antwort darauf, ob eine Impfung mit der verwendeten Vakzine kurz nach

der Geburt wirksamer wäre, weiteren Versuchen vorbehalten.

DISKUSSION

81

Gleichwohl gab es in der vorgelegten Studie keinen Unterschied in der

Erkrankungsdauer von geimpften (Median 24 Tage) und nicht geimpften (Median

24,5 Tage) Fohlen. Das bedeutet, dass durch die Impfung die Zeit, in welcher das

Immunsystem des Fohlens die Erkrankung erfolgreich bekämpft, nicht durch die

Beteiligung des immunologischen Gedächtnisses verkürzt wird. Der immunologische

Schutz von adulten Pferden ist auf die schnelle Typ1-Reaktion von Gedächtniszellen

zurückzuführen (HINES et al. 2001; HINES et al. 2003). Die scheinbar verkürzte

Erkrankungsdauer bis eine Therapie notwendig wird (Median geimpfte Fohlen:

sieben Tage), lässt sich auch auf eine Diagnosestellung im fortgeschrittenen

Krankheitsstadium zurückführen. Denn auch wenn die Fohlen wöchentlich klinisch

und die Lungen der Fohlen mindestens im 14 tägigen Abstand ultrasonografisch

untersucht wurden, so können doch bei unauffälligen klinischen Symptomen bis zu

13 Tage vergangen sein, bis ein Abszess an der Lungenoberfläche erkannt wird.

In dieser Studie wurde weiterhin erfasst, ob einige Fohlen bei der rektalen Applikation

des Impfstoffes benachteiligt waren, weil sie im Impfzeitraum gering- bis mittelgradig

an Diarrhö litten. Diese könnte mechanisch einen Einfluss auf die Wirksamkeit der

Impfung haben, da gemutmaßt werden kann, dass die Verweildauer des Impfstoffs

im Enddarm des Fohlens für eine biologische Wirkung nicht ausreichen könnte. Die

Dauer der initialen Antigenpräsentation ist maßgeblich für die Stärke der folgenden T-

Zell-Antwort, wenngleich die Funktionalität der Effektorzellen nicht beeinträchtigt wird

(PRLIC et al. 2006). Dazu wurden die Fohlen der Impfgruppe betrachtet. Letztlich

konnte herausgestellt werden, dass es zwischen Fohlen, welche zu einem

Impfzeitpunkt an Diarrhö litten und Fohlen, die keine Diarrhö zeigten, keine

Unterschiede in der Erkrankungsrate gab und der Einfluss der Diarrhö somit als nicht

relevant betrachtet werden kann.

Die rektale Impfung von frisch abgesetzten Fohlen mit einer avirulenten

Lebendvakzine gegen das intrazelluläre Pathogen L. intracellularis bewirkte die

Bildung spezifischer Antikörper bei allen vier geimpften Fohlen. Dagegen führte die

orale Impfung der gleichen Vakzine nur bei zwei von vier Fohlen zur

Antikörperbildung (PUSTERLA et al. 2009). Dies zeigt, dass die rektale Applikation

einer Impfung bei Fohlen eine humorale Immunantwort bei einem intrazellulär

DISKUSSION

82

lebenden Pathogen aufbauen kann. Nach einer Impfung von abgesetzten Fohlen mit

einer vergleichbaren attenuierten Lebendvakzine gegen L. intracellularis und

anschließender Infektion blieben alle vier geimpften Fohlen klinisch gesund,

wohingegen drei von vier ungeimpften Fohlen schwer klinisch erkrankten

(PUSTERLA et al. 2012b). Daraus lässt sich ableiten, dass aus der rektalen Impfung

gegen ein intrazelluläre lebendes Pathogen beim Fohlen ein wirksamer Immunschutz

hervorgehen kann, auch wenn es sich hier nicht um die selbe Altersgruppe von

Fohlen handelte.

5.4 Stimulation des humoralen Immunsystems

Die Stimulation des humoralen Immunsystems von Fohlen durch den Impfstoff

Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL) wurde in dieser Studie durch

die Messung der Antikörpertiter gegen R. equi-Zellwandextrakt erfasst. Dazu wurde

bei jedem Fohlen an sieben Zeitpunkten im Studienverlauf der R. equi-spezifische

IgG-Titer mittels ELISA im Serum der Impf- und Kontrollfohlen ermittelt.

Der Verlauf der Antikörpertiter spiegelt den Verlauf eines neugeborenen und

heranwachsenden Fohlens wieder. Zum Studientag 0, das heißt vor der ersten

Impfung sind die IgG-Werte im Wesentlichen auf maternale Antikörper

zurückzuführen. Gemäß ihrer Halbwertszeit von 17 bis 32 Tagen je nach Subklasse

erfolgt daraufhin ein Rückgang des gemessenen Antikörpertiters in den nächsten

zwei bis vier Wochen (PAUL 2005; DAWSON et al. 2009). Daraufhin wird der Anstieg

der IgG-Titer durch die zunehmende Eigensynthese der Fohlen ermöglicht, die sich

wie bei PAUL (2005) in der sechsten Lebenswoche bzw. Studientag 28 deutlich

darstellt. Die IgG-Titer zwischen den Fohlen der Impf- und Kontrollgruppe

unterscheiden sich an Studientag 42, 112 und 182 signifikant (p < 0,05). Der

deutliche Titeranstieg am 70. Studientag, der in beiden Fohlengruppen auftritt und

sich nicht signifikant unterscheidet (p > 0,05) ist eher auf den vermehrten Keimdruck

in der Umgebung der Fohlen nach der Umstallung auf das Hauptgestüt

zurückzuführen, als allein als Reaktion auf die Impfung. Die IgG-Titer der Impfgruppe

steigen zwar etwas eher an als die der Kontrollgruppe und sind an Studientag 42

DISKUSSION

83

signifikant höher, doch an den Studientagen 112 und 182 sind wiederum die IgG-Titer

der Kontrollgruppe signifikant höher als die der Impfgruppe. Daraus lässt sich

schließen, dass die Bildung spezifischer IgGs nicht offensichtlich durch die Impfung

beeinflusst wird, da sich der ermittelte Höchstwert nicht signifikant unterscheidet und

die Kontrollgruppenergebnisse zum Ende der Studie signifikant höher liegen.

Außerdem wird durch die Antikörper kein zufriedenstellender Schutz vor der

Rhodokokkose gewährleistet, da in beiden Gruppen trotz steigender Antikörpertiter

mit einem gemessenen Höchstwert am Studientag 70, die Diagnose „Pneumonie“ im

Mittel erst am Studientag 98 (Lebenstag 110,0 ± 32,2 bei Impffohlen) bzw. Studientag

89,5 (Lebenstag 101,5 ± 39,3 bei Kontrollfohlen) gestellt wurde.

Doch um diese Aussagen konkretisieren zu können, müssten in weiteren

Untersuchungen IgG-Subklassen bestimmt werden. Große Bedeutung in der Abwehr

von R. equi wird beispielsweise IgGb zugeschrieben, wohingegen die Bildung von

IgG(T) mit unzureichendem Schutz vor dem Pathogen in Verbindung steht

(WAGNER et al. 2006; JACKS et al 2007; LEWIS et al. 2008).

5.5 Stimulation des zellulären Immunsystems

Die Bildung bestimmter Cytokine durch das zelluläre Immunsystem des Fohlens

spiegelt dessen immunsupprimierende (IL-4, IL-10) oder entzündungsfördernde (IFN-

, IL-12, IL-23) Eigenschaften wieder (GIGUÈRE et al. 2011). Die erfolgreiche

Abwehr der Rhodokokkose bedarf aufgrund der intrazellulären Überlebensfähigkeit

des Erregers in Makrophagen einer Th1-Antwort, die durch die Bildung von IFN-

gekennzeichnet ist (KANALY et al. 1996). In der vorgelegten Studie wurde die

Bildung der Cytokine IL-4, IFN-, IL-10 und IL-17 als Reaktion auf die Impfung mit

dem Impfstoff Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL) bei den Fohlen

der Impfgruppe mit der Bildung dieser Cytokine bei den nicht geimpften Fohlen der

Kontrollgruppe verglichen. Dazu wurden Blutleukozyten von Fohlen mit R. equi-

Antigen, DMEM-Medium als Negativkontrolle und PMA als Positivkontrolle stimuliert,

und die dabei gebildeten Cytokine im Multiplexassay gemessen. Der Vorteil des

Multiplexassays ist das gleichzeitige Messen verschiedener löslicher Agentien (hier

Cytokine), um die Immunantwort des Fohlens umfassend zu ermitteln, wobei

DISKUSSION

84

Sensivität und Spezifität höher sind als beim ELISA (WAGNER et al. 2009). So

konnten durch das Bestimmen von vier Cytokinen aus einer Probe

Gegenüberstellungen genauer, das heißt mit einem geringeren Risiko biologischer

Differenzen und methodischer Fehler aufgezeigt werden.

Die Ergebnisse zeigen bei allen vier Cytokinen in keinem der Ansätze signifikante

Unterschiede zwischen den Fohlen der Impfgruppe und der Kontrollgruppe. Ein

Gruppeneffekt oder eine Interkation zwischen Gruppe und Zeit konnten nicht gezeigt

werden. Ebenso sind keine Unterschiede zwischen dem R. equi-Ansatz und der

Negativkontrolle bei den einzelnen Cytokinen innerhalb der Gruppen ersichtlich.

Dagegen zeigt die Positivkontrolle im PMA-Ansatz durchgehend 101 bis 103mal

höhere Werte an gebildeten Cytokinen als im R. equi-Ansatz. Dies gilt sowohl in der

Impf- als auch der Kontrollgruppe bei allen untersuchten Cytokinen und wurde mit

einer linearen Regression überprüft. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Impfung

weder die Bildung entzündungsfördernder (IFN-, IL-17) noch immunsupprimierender

(IL-4, IL-10) Cytokine fördert und demnach auch auf der Ebene des zellulären

Immunsystems keinerlei Wirkung durch die Stimulation des immunologischen

Gedächtnisses zeigt.

Als mögliche Ursache dafür ist die Zusammensetzung des Impfstoffes denkbar.

Eventuell ist durch die Deletion der vier chromosomalen Stoffwechselgene die

Antigenität des Impfstoffes beeinträchtigt worden. Es ist noch nicht abschließend

geklärt, warum Steroidkatabolismusgene für die Pathogenität des Erregers wichtig

sind. Immunregulatorische Eigenschaften, insbesondere während der Infektion,

werden vermutet. Die Deletion der Gene ipdAB bewirkt eine verminderte Bildung des

Steroidstoffwechselproduktes Methylhexahydroindanon-Proprionat, welches mit der

Pathogenität von R. equi korreliert. In vitro stellten sich ipdAB-deletierte R. equi in

Makrophagen attenuiert dar (VAN DE GEIZE et al. 2011). Die Bedeutung der

strukturanalogen Gene ipdA2B2, die nicht in den Steroidkatabolismus integriert sind,

ist noch unklar. Sie scheinen jedoch keinen Einfluss auf die Pathogenität von R. equi

zu haben (VAN DE GEIZE et al. 2011). In einer Studie zeigte sich ein R. equi-Stamm

mit der selben Gendeletion nach intratrachealer Infektion an drei Fohlen im Alter von

drei bis fünf Wochen als sicher. Vier Fohlen im Alter von zwei bis vier Wochen

DISKUSSION

85

wurden daraufhin mit diesem Stamm oral geimpft und zeigten nach experimenteller

Infektion signifikant niedrigere R. equi-Wildtypkonzentrationen als ungeimpfte Fohlen

(VAN DE GEIZE et al. 2011). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zusammensetzung

des Impfstoffes den Einsatz als attenuierten Lebendimpfstoff ermöglicht. Ob die

antigene Wirkung des VapA-enthaltenden R. equi-Stammes durch die Deletion der

Gene beeinträchtigt wurde, ist durch Ergebnisse bisheriger Studien nicht eindeutig

feststellbar.

Des Weiteren könnte die Konzentration von R. equi mit 8 x 1010 CFU/Impfampulle

nicht günstig sein. Die Infektionsdosis von R. equi hat nachweislich einen Effekt auf

die Immunantwort der Fohlen und somit auf den Schutz vor der Erkrankung. Nach

intrabronchialer Infektion mit 1 x 106 CFU virulentem R. equi entwickelten Fohlen nur

eine milde Erkrankung und immunologisch eine Th1-Antwort, wohingegen eine

Infektion mit 1 x 108 CFU R. equi zu einer schweren Erkrankung führte (JACKS u.

GIGUÈRE 2009). Weiterhin könnte die Verabreichungsform einen Einfluss auf die

Wirksamkeit des Impfstoffes haben. Die Impfung über das Rektum ist einfach

durchzuführen und durch die Lymphonodi solitarii und aggregati in der

Dickdarmwand ist diese Körperregion gut immunologisch versorgt, um auf

Pathogene reagieren zu können. Das wurde bereits an Impfversuchen gegen L.

intracellularis an abgesetzten Fohlen bestätigt (PUSTERLA et al. 2009, 2012b).

Andere Impf- und Infektionsversuche an Fohlen, die Teilerfolge zeigten, nutzen den

die intrabronchiale Applikation (JACKS u. GIGUÈRE 2009) oder die orale Applikation

(HOOPER-MCGREVY et al. 2005; VAN DE GEIZE et al. 2011). Diese haben den

Vorteil, dass der natürliche Infektionsweg genutzt wird und es dort zur Stimulation der

mucosalen Abwehr kommt. Doch die Durchführbarkeit in der Praxis ist sowohl bei der

intrabronchialen als auch der oralen Impfung mit 100 ml Impfvolumen (HOOPER-

MCGREVY et al. 2005) nicht bzw. ungenügend gewährleistet. Aus ähnlichen

Vorversuchen heraus wurde die rektale Applikation in der gegebenen Konzentration

in dieser Studie gewählt (Angaben T. JACOBS, MSD, Boxmeer, NL), welche

beispielsweise bei der Impfung von abgesetzten Fohlen gegen L. intracellularis

bereits zu guten Ergebnissen führte (PUSTERLA et al. 2009).

DISKUSSION

86

Überdies lassen sich aus den Ergebnissen andere Folgerungen ableiten. Die

gemessenen Cytokinmengen nach der Stimulation der Fohlen-PBMC mit PMA

zeigen, dass das zelluläre Immunsystem der Fohlen durchaus in der Lage ist,

Cytokine nach Antigenkontakt zu bilden. Es sind bei allen vier Cytokinen die

niedrigsten Werte in der Probe vor der ersten Impfung (Fohlen jünger als 12 Tage)

gemessen worden. Daraufhin steigen die Mengen an gemessenen IL-10 (bis 1057,0

pg/ml an Tag 84) und IL-17 (bis 2940,0 pg/ml an Tag 112) im Studienverlauf

kontinuierlich an. Dieser Zeiteffekt spiegelt die verminderte Fähigkeit des neonaten

Immunsystems wieder, Cytokine in ausreichendem Maße zu bilden, wobei etwa im

Alter von drei Monaten Cytokinmengen wie von adulten Pferden produziert werden

können (WAGNER et al. 2010). Anders verhalten sich die ermittelten Mengen an

IFN- und IL-4. In beiden Fohlengruppen bleiben die gemessenen Mengen an IFN-

im Studienverlauf im Mittel zwischen 165,5 pg/ml und 334,7 pg/ml nach PMA-

Stimulation. Die Mittelwerte von IL-4 bewegen sich dagegen zwischen 2011,0 pg/ml

und 9454,0 pg/ml in der Impf- und Kontrollgruppe. Das deutet daraufhin, dass die

Fohlen tendenziell stärker mit einer IL-4 vermittelten Th2-Antwort auf ein Pathogen

reagieren können als mit einer durch IFN--Produktion gekennzeichneten Th1-

Antwort. Eine insuffiziente IFN--Bildung durch neugeborene Fohlen wurde von

verschiedenen Autoren beschrieben (BOYD et al. 2003; BREATHNACH et al. 2006).

Das heißt jedoch nicht zwangsläufig, dass es nicht möglich ist, mit einem wirksamen

Impfstoff durch gezielte Aktivierung von antigenpräsentierenden Zellen, daraus

folgender IL-12 Produktion und Th1-Stimulation in erster Linie die Bildung von IFN-

und somit eine effektive Abwehr von R. equi zu bewirken. Ein IFN-/IL-4 Verhältnis zu

Gunsten der proinflammatorischen Th1-Antwort ist nach experimenteller Infektion

von Fohlen mit R. equi beschrieben (JACKS et al. 2007). Der in dieser Studie

verwendete Impfstoff stimulierte das Immunsystem der Fohlen hingegen weder in

Richtung einer Th1- noch einer Th2-Antwort. Trotz des Vorhandenseins von VapA

scheint die antigene Wirkung der Vakzine verloren gegangen zu sein.

DISKUSSION

87

5.6 Schlussfolgerungen

Die Impfung von neugeborenen Fohlen mit der in dieser Studie verwendeten,

attenuierten Lebendvakzine Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL)

kann aufgrund der ermittelten Ergebnisse zum Schutz von Fohlen vor der R. equi-

Pneumonie nicht empfohlen werden.

Die vorgelegte Arbeit wurde auf einem Gestüt mit endemischer Rhodokokkose,

welche in erster Linie als pyogranulomatöse Bronchopneumonie in Erscheinung tritt,

durchgeführt. Von den 30 geimpften Fohlen in dieser Studie erkrankten 23 Fohlen an

einer Lungenentzündung mit Abszessbildung. In der Kontrollgruppe erkrankten 27

der 30 Fohlen. Daraus lässt sich schließen, dass durch die Impfung der Fohlen kein

zufriedenstellender Impfschutz aufgebaut wird. Während der Untersuchungen

zeigten sich weiterhin keinerlei Unterschiede im Erkrankungsalter, der

Erkrankungsdauer und des Schweregrades der Erkrankung zwischen den geimpften

und den nicht geimpften Fohlen. Klinisch wurde keinerlei Wirkung der Vakzine

nachgewiesen.

Als eine Ursache für den fehlenden Impfschutz kommt der späte Impfzeitpunkt in

Frage. Die Fohlen waren zum Zeitpunkt der ersten Impfung zwischen acht und 14

Tage alt. Möglicherweise fallen die Ergebnisse anders aus, wenn nach

Impfstoffherstellerangaben in der ersten Lebenswoche geimpft worden wird.

Da die Entwicklung des Immunsystems neugeborener Fohlen als unzureichend gilt,

die Beteiligung des humoralen und zellulären Immunsystems aber als essentiell für

die erfolgreiche Bekämpfung des intrazellularen Erregers R. equi angesehen wird,

wurden weiterhin Antikörpertiter und Cytokinantwort nach der Impfung erfasst. Die

Resultate der Antikörpertiterbestimmungen zeigen, dass diese nicht durch die

Impfung beeinflusst worden sind. Stattdessen sind sie vielmehr als Reaktion auf die

natürliche Infektion zu werten, da sie sich zwischen den beiden Gruppen nicht

unterschieden. Dass die Antikörpertiter gesunder Fohlen denen erkrankter Fohlen

entsprechen, weist darauf hin, dass Immunglobuline nicht die entscheidende Rolle

bei der Abwehr von R. equi spielen. Jedoch müssten für genauere Aussagen über

DISKUSSION

88

den Einfluss von IgG auf die Bekämpfung der Erkrankung dessen Subklassen

bestimmt werden (JACKS et al. 2007; LEWIS et al. 2008). Mangels Wirksamkeit

dieses Impfstoffes werden weiterführende Studien erst nach Modifizierung der

Vakzine ratsam.

Die Auswertung der Cytokinbestimmungen stellt deutlich heraus, dass die zelluläre

Immunantwort durch die Impfung ebenfalls nicht beeinflusst wird. Ursachen dafür,

wie eine möglicherweise zu hohe Bakterienkonzentration, müssten in weiteren

Grundlagenversuchen ermittelt werden (JACKS u. GIGÈRE 2009). Dass durch die

Cytokinantwort jedoch keinerlei Reaktion auf die Stimulation der Leukozyten

dargestellt wird, ist auf das nicht ausgebildete immunologische Gedächtnis

zurückzuführen. Die antigene Wirkung der Vakzine sollte grundlegend überdacht

werden. Eventuell sind bei der Deletion nicht nur Stoffwechselgene von R. equi

beeinträchtigt worden, oder diese haben eine größere Bedeutung als man bisher

ermitteln konnte. Auch das Virulenzplasmid des Erregers ist nicht nur für dessen

Pathogenität sondern auch für den Aufbau einer schützenden Immunantwort

erforderlich (HINES et al. 2003). Die Ergebnisse nach PMA-Stimulation der Fohlen-

Leukozyten bestätigen, dass die Zellen trotz methodischer Schwierigkeiten das

Einfrieren und Auftauen überstanden haben und schon bei jungen Fohlen in der Lage

sind, eine Cytokinantwort zu bilden (WAGNER et al. 2010). Das Hervorrufen einer

schützenden Immunantwort durch eine geeignete, attenuierte Lebendvakzine wird in

den nächsten Jahren in weiterführenden Versuchen ein wichtiger Bestandteil der R.

equi-Forschung sein. Dem Pferdehalter und Tierarzt bleibt also weiterhin mit

Hygiene, Früherkennung und geeigneten Therapiemaßnahmen die Rhodokokkose

von Fohlen zu bekämpfen.

ZUSAMMENFASSUNG

89

6 Zusammenfassung

Finze, Susanne:

Evaluierung eines Impfstoffes zur Vorbeugung der Rhodococcus equi-

Pneumonie beim Fohlen

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Schutzwirkung der attenuierten

Lebendvakzine Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL) an Fohlen

gegen die Pneumonie durch Rhodococcus equi (R. equi) sowie ihre Verträglichkeit

zu untersuchen.

Die Studie wurde auf einem deutschen Warmblutgestüt mit endemischer

Rhodokokkose durchgeführt. In der Impfgruppe wurden 30 Fohlen mit der Vakzine

geimpft und in der Kontrollgruppe wurden 30 weitere Fohlen mit einem

Placebopräparat behandelt. Zum Zeitpunkt der ersten Impfung waren die Fohlen in

beiden Gruppen im Mittel 12 Tage alt. Die Impfung der Fohlen erfolgte an den

Studientagen 0, 1, 14 und 15 und der Impfstoff wurde rektal verabreicht. Die Fohlen

wurden im Studienzeitraum von 26 Wochen regelmäßig klinisch und

ultrasonografisch auf mögliche Krankheitsanzeichen und unerwünschte Wirkungen

untersucht. Darüber hinaus wurde ihnen an sieben Untersuchungszeitpunkten im

Studienverlauf Blut zur Antikörpertiterbestimmung mittels ELISA entnommen.

Außerdem wurden den Fohlen an sieben weiteren Zeitpunkten Blutproben zur

Gewinnung von Blutleukozyten entnommen, welche mit R. equi-Antigen und PMA

stimuliert wurden und anschließend zur Cytokinbestimmung mittels Multiplexassay

untersucht wurden.

Die Diagnose „Pneumonie“ wurde bei 23 der 30 geimpften Fohlen gestellt. In der

Kontrollgruppe erkrankten 27 von 30 Fohlen. Die Fohlen der Impfgruppe erkrankten

im Mittel an Studientag 98,3 ± 32,2, die Kontrollfohlen erkrankten im Mittel an

Studientag 89,3 ± 39,3. Die milde Erkrankungsform dauerte in beiden Gruppen vom

Zeitpunkt der Diagnosestellung bis zur vollständigen spontanen Genesung 24,5 Tage

im Median. Auch der Schweregrad der Erkrankung unterschied sich bei geimpften

und nicht geimpften Fohlen nicht.

Die unzureichenden Unterschiede in der klinischen Wirksamkeit der Vakzine spiegeln

ZUSAMMENFASSUNG

90

sich auch im Vergleich der Antikörpertiterverläufe unter beiden Fohlengruppen

wieder. Gemessen wurden IgG-Titer gegen R. equi-Zellwandextrakt, die im

Studienverlauf für Fohlen charakteristische Kurven bildeten, in denen maternale

Antikörper, immunologische Lücke und vermehrte IgG-Eigenproduktion in

Kombination mit steigendem Infektionsdruck klar ersichtlich waren. Jedoch

unterschieden sich die Antikörpertiter zwischen geimpften und Kontrollfohlen nicht.

Darüber hinaus waren auch zwischen den erkrankten und nicht erkrankten Fohlen

keine offensichtlichen Unterschiede hinsichtlich der Antikörpertiter zu erkennen.

Zur Bestimmung der zellulären Immunantwort der Fohlen auf den Impfstoff wurden

Blutleukozyten mit R. equi-Antigen stimuliert und die gebildeten Cytokine im

Multiplexassay gemessen. Die Konzentrationen an IL-4, IFN-, IL-10 und IL-17

unterschieden sich nicht zwischen den geimpften und den Kontrollfohlen. Überdies

waren innerhalb der Gruppen keine Unterschiede der gebildeten Cytokinmengen

nach R. equi-Stimulation und Negativkontrolle ersichtlich. Die Positivkontrolle mittels

PMA-Stimulation zeigte jedoch, dass die Produktion von Cytokinen durch ein

aktiviertes, zelluläres Immunsystem schon beim jungen Fohlen möglich ist. Die

Blutleukozyten der Fohlen bildeten nach PMA-Stimulation deutlich mehr IL-4 als IFN-

unabhängig von der Impfung. Im Verlauf der vier Monate war eine deutliche

Erhöhung der an IL-10 und IL-17 darstellbar.

Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass der getestete Impfstoff weder das

humorale noch das zelluläre Immunsystem der Fohlen stimuliert. Dies erklärt, dass

dieser Impfstoff auch keine schützende Wirkung aufweist. Trotz vielversprechender

Vorversuche mit der attenuierten Lebendvakzine muss neben Dosierung und

Applikationsart auch die antigene Wirkung des Impfstoffes überprüft werden. Darüber

hinaus zeigt die Studie, dass Blutleukozyten von Fohlen schon früh in der Lage sind

Cytokine zu bilden. Es bedarf weiterer Untersuchungen die Fohlen-Blutleukozyten

durch gezielte Antigenstimulation dazu zu bringen, Cytokine für eine schützende

Immunantwort zu produzieren.

SUMMARY

91

7 Summary

Finze, Susanne:

Examination of the efficacy of a Rhodococcus equi-vaccine to prevent the

pneumonia by Rhodococcus equi in foals

The aim of this study was to investigate the efficacy of an attenuated live vaccine

Equillis RhodE Batch 10E12 (Fa. MSD, Boxmeer, NL) in foals in preventing the

pneumonia caused by Rhodococcus equi (R. equi) and ist innocuity.

This study was held on a stud with warmblood horses in Germany, in which R. equi is

endemic. It was designed as a prospective double blind study with a control group. A

group of 30 foals was administered a rectal vaccine and the control group consisted

of 30 foals and was administered a placebo. The rectal vaccination of the foals

occurred on day 0, 1, 14 and 15 of the study. During the study which lasted 26

weeks, all foals were frequently examined clinically and the lungs were evaluated by

sonography in order to detect signs of pneumonia or side effects of the vaccine. In

addition blood samples were taken at seven time points during the study to get serum

and to detect antibody titers with ELISA. Further seven blood samples were collected

to get PBMCs from the foals, which were incubated with R. equi antigen and PMA to

measure cytokines with Multiplex technology.

The pneumonia was diagnosed in 23 of the 30 vaccinated foals. In the control group

27 of 30 foals developed pneumonia. In vaccinated foals pneumonia was diagnosed

on day 98 ± 32 of the study and the control foals on day 89 ± 39. The disease lasted

in both groups 24 days from diagnosis till complete recovery without treatment. There

was also no difference in the severity of the disease between vaccinated and control

foals.

IgG titers against R. equi cell wall extract were measured during the study. In those

characteristic curves the presence of maternal antibodies, immunological gap and

indigenous production of IgG combined with rising infection were clearly apparent in

all foals. However there was no difference in antibody titers between the two groups.

In addition healthy and sick foals did not differ in antibody titers either.

http://dict.leo.org/ende/index_de.html#/search=indigenous&searchLoc=0&resultOrder=basic&multiwordShowSingle=on

SUMMARY

92

To identify the cellular immune response of the foals after vaccination, PBMC were

stimulated with R. equi antigen and the generated cytokines were measured with

multiplex technology. The results demonstrated no significant differences in IL-4, IFN-

, IL-10 and IL-17 values between vaccinated and control foals. Furthermore there

were no differences between the amount of cytokines after R. equi stimulation and

negative control within the groups. Though the positive control operated with PMA

stimulation showed a clear cytokine response by an activated, cellular immune

system even in very young foals. The PBMCs of the foals developed after PMA

stimulation considerably more IL4 than IFN-, independently of the vaccination.

Especially the amounts of IL-10 and IL-17 clearly increased during the study.

These results demonstrate that the vaccine tested here does neither activate the

humoral nor the cellular immune system of the foals and therefore it induces no

clinical effects. Despite promising preliminary trials with that attenuated live vaccine,

the dosing and way of application such as the antigen effect of the vaccine have to

be fundamentally verified. More over this study shows that PBMCs of young foals are

able to generate cytokines. More research needs to be done to generate a protective

immune response in young foals by specific stimulation. According to the present

results the humoral immune system seems to play a minor role in controlling R. equi.

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93

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ANHANG

112

9 Anhang

Tab. 15: Daten der Impfgruppe: Geschlecht und Alter

Fohlennummer Gr. Geschlecht Geburtstag Alter Tag 0

(Tage)

F2 IG Mare 11.03.2013 14

F4 IG Stallion 12.03.2013 13

F5 IG Stallion 12.03.2013 13

F6 IG Stallion 11.03.2013 14

F9 IG Mare 13.03.2013 12

F11 IG Mare 15.03.2013 10

F15 IG Mare 12.03.2013 13

F16 IG Stallion 12.03.2013 13

F17 IG Stallion 15.03.2013 10

F18 IG Mare 12.03.2013 13

F21 IG Stallion 12.03.2013 13

F24 IG Stallion 14.03.2013 11

F25 IG Mare 15.03.2013 10

F27 IG Mare 13.03.2013 12

F30 IG Mare 11.03.2013 14

F32 IG Stallion 14.05.2013 13

F35 IG Mare 18.05.2013 9

F36 IG Stallion 16.05.2013 11

F37 IG Stallion 18.05.2013 9

F38 IG Stallion 15.05.2013 12

F41 IG Mare 17.05.2013 10

F44 IG Stallion 14.05.2013 13

F46 IG Mare 15.05.2013 12

F48 IG Mare 15.05.2013 12

F51 IG Mare 15.05.2013 12

F52 IG Stallion 19.05.2013 8

F55 IG Mare 13.05.2013 14

F56 IG Mare 19.05.2013 8

F57 IG Stallion 16.05.2013 11

F60 IG Mare 13.05.2013 14

Gr.= Gruppe; IG = Impfgruppe

ANHANG

113

Tab. 16: Daten der Kontrollgruppe: Geschlecht und Alter

Fohlennummer Gr. Geschlecht Geburtstag Alter Tag 0

(Tage)

F1 KG Mare 12.03.2013 13

F3 KG Stallion 14.03.2013 11

F7 KG Stallion 12.03.2013 13

F8 KG Stallion 11.03.2013 14

F10 KG Mare 11.03.2013 14

F12 KG Mare 11.03.2013 14

F13 KG Mare 13.03.2013 12

F14 KG Stallion 11.03.2013 14

F19 KG Stallion 12.03.2013 13

F20 KG Mare 15.03.2013 10

F22 KG Mare 14.03.2013 11

F23 KG Mare 11.03.2013 14

F26 KG Mare 14.03.2013 11

F28 KG Mare 12.03.2013 13

F29 KG Stallion 11.03.2013 14

F31 KG Stallion 16.05.2013 11

F33 KG Mare 13.05.2013 14

F34 KG Stallion 14.05.2013 13

F39 KG Stallion 16.05.2013 11

F40 KG Mare 14.05.2013 13

F42 KG Mare 14.05.2013 13

F43 KG Stallion 18.05.2013 9

F45 KG Mare 17.05.2013 10

F47 KG Mare 13.05.2013 14

F49 KG Mare 16.05.2013 11

F50 KG Mare 15.05.2013 12

F53 KG Stallion 13.05.2013 14

F54 KG Stallion 15.05.2013 12

F58 KG Stallion 19.05.2013 8

F59 KG Mare 18.05.2013 9

Gr. = Gruppe; KG = Kontrollgruppe

ANHANG

114

Tab. 17: Klinische und sonografische Befunde der Fohlen der Impfgruppe

F.-

Nr. Gr.

Anzahl

Blutleukozyten

TD (Zellen/µl)

Lfd.

Std.tag

TD

Abszess-

Score TD

(cm)

Lfd.

Std.tag

TTB

Lfd.

Std.tag

TG

Diarrhö

T0, T1,

T14, T15

F2 IG 4700 162 4,50 182 0

F4 IG 16600 98 1,50 141 1

F5 IG 15600 92 6,00 102 0

F6 IG 17400 73 3,50 86 0

F9 IG 18400 80 6,00 82 0

F11 IG 0

F15 IG 1

F16 IG 15100 85 1,00 106 0

F17 IG 13400 77 17,50 78 0

F18 IG 27900 100 1,00 119 0

F21 IG 0

F24 IG 16200 92 39,00 92 0

F25 IG 13800 147 11,00 148 0

F27 IG 12900 86 1,00 101 0

F30 IG 19000 105 6,00 113 0

F32 IG 26700 101 2,00 182 0

F35 IG 0

F36 IG 12600 74 3,50 182 1

F37 IG 0

F38 IG 0

F41 IG 19600 49 2,00 169 0

F44 IG 14400 100 6,00 145 0

F46 IG 12500 43 1,50 143 1

F48 IG 15400 155 2,00 179 0

F51 IG 11300 148 2,00 172 1

F52 IG 13200 101 5,00 106 0

F55 IG 20900 109 3,00 115 0

F56 IG 48900 134 1,00 136 0

F57 IG 1

F60 IG 13300 49 3,50 112 1

F.-Nr. = Fohlennummer; Gr. = Gruppe; IG = Impfgruppe; Lfd. Std.-Tag = laufender

Studientag; TD = Tag der Diagnosestellung; TTB = Tag des Therapiebeginns; TG = Tag

der Genesung; T0, T1, T14, T15 = Tage, an denen geimpft wurde; Diarrhö: 0 = keine

Diarrhö, 1 = Diarrhö mind. 1 Tag

ANHANG

115

Tab. 18: Klinische und sonografische Befunde der Fohlen der Kontrollgruppe

F.-

Nr. Gr.

Anzahl

Blutleukozyten

TD (Zellen/µl)

Lfd.

Std.tag

TD

Abszess-

Score TD

(cm)

Lfd.

Std.tag

TTB

Lfd.

Std.tag

TG

F1 KG 16900 66 1,00 113

F3 KG 15400 87 2,00 92

F7 KG 15000 49 1,00 106

F8 KG 7700 14 2,50 86

F10 KG

F12 KG 16300 79 2,00 99

F13 KG 17400 128 23,50 129

F14 KG 17200 108 4,50 115

F19 KG 10200 28 18,00 28

F20 KG 14600 67 4,00 91

F22 KG 15000 129 2,50 158

F23 KG 14400 92 8,00 92

F26 KG 23800 85 1,00 122

F28 KG 10300 8 1,00 133

F29 KG 15900 113 3,50 119

F31 KG 11500 56 2,00 119

F33 KG 10800 14 2,50 72

F34 KG 11100 78 1,00 168

F39 KG 25600 92 9,50 93

F40 KG 21200 121 3,00 145

F42 KG 17900 120 6,50 176

F43 KG 15800 128 1,00 176

F45 KG 17900 105 7,00 155

F47 KG

F49 KG

F50 KG 27600 119 7,00 155

F53 KG 11100 141 2,50 144

F54 KG 19300 119 1,00 136

F58 KG 15000 120 1,00 136

F59 KG 14500 144 19,50 144

F.-Nr. = Fohlennummer; Gr. = Gruppe; KG = Kontrollgruppe; Lfd. Std.-Tag = laufender

Studientag; TD = Tag der Diagnosestellung; TTB = Tag des Therapiebeginns; TG = Tag

der Genesung

ANHANG

116

Tab. 19: Antikörpertiter gegen R. equi–Zellextrakt von Impf- und Kontrollgruppe; Werte in EU

Serum - Antikörpertiter: Impfgruppe

Studientag F2 F4 F5 F6 F9 F11 F15 F16 F17 F18 F21 F24 F25 F27 F30 F32 F35 F36 F37 F38 F41 F44 F46 F48 F51 F52 F55 F56 F57 F60

d0 3,6 0,0 3,6 5,5 4,2 5,9 2,7 3,8 1,4 0,0 2,0 1,9 2,7 0,0 3,8 3,2 2,6 3,0 3,8 2,8 2,8 2,9 2,9 2,7 0,0 2,4 2,7 0,0 0,0 0,0

d14 2,9 0,0 3,3 3,9 3,5 5,4 2,2 2,9 0,0 0,0 2,3 1,7 1,8 0,0 2,9 2,7 2,2 2,7 3,1 2,6 2,5 2,9 2,9 2,2 0,0 1,9 2,5 0,0 0,0 0,0

d28 2,4 0,0 3,0 2,8 2,8 4,6 2,5 2,5 0,0 0,0 0,0 2,7 0,0 3,9 2,6 2,9 2,0 4,5 3,0 2,5 2,7 4,7 2,0 2,5 4,9 2,7 2,5 2,4 2,6 1,5

d42 2,8 2,3 2,8 2,8 2,6 3,6 3,3 3,3 0,0 0,0 2,2 2,5 2,6 6,3 2,5 2,9 2,5 7,3 2,7 2,9 4,9 2,6 2,0 3,8 5,9 4,4 2,5 2,5 4,2 8,4

d70 1,3 2,9 4,6 8,4 2,9 2,9 7,0 7,2 1,8 2,8 7,3 7,8 7,2 5,3 4,4 2,7 7,6 7,7 7,5 7,6 8,9 4,4 2,7 5,0 4,6 5,9 2,3 7,5 4,8 8,7

d112 6,0 9,9 2,8 6,1 2,0 4,7 4,9 5,7 2,5 9,4 5,0 5,9 5,5 2,9 3,6 0,0 5,1 2,7 4,5 3,7 4,6 2,0 1,0 2,5 2,1 2,5 0,0 3,7 2,5 4,4

d182 3,6 7,9 0,0 4,9 0,0 1,2 4,0 3,0 1,5 8,3 3,5 4,2 6,5 1,6 1,9 0,0 3,7 2,4 2,8 2,3 2,9 1,0 0,0 0,0 1,3 1,0 0,0 0,0 0,0 3,2

Serum - Antikörpertiter: Kontrollgruppe

Studientag F1 F3 F7 F8 F10 F12 F13 F14 F19 F20 F22 F23 F26 F28 F29 F31 F33 F34 F39 F40 F42 F43 F45 F47 F49 F50 F53 F54 F58 F59

d0 3,0 3,3 2,9 3,0 3,4 0,0 2,5 2,6 2,1 1,7 4,5 5,2 0,0 2,6 2,6 3,5 1,8 3,0 2,2 3,3 1,3 2,7 2,7 1,3 0,0 2,9 3,7 2,9 2,1 0,0

d14 2,7 2,9 2,3 2,4 2,8 0,0 2,1 2,4 0,0 0,0 4,0 4,2 0,0 2,5 0,0 2,5 1,9 2,7 1,2 2,8 1,1 2,3 2,3 0,0 0,0 2,3 2,8 2,5 0,0 0,0

d28 2,7 2,6 1,5 1,1 2,1 0,0 1,1 1,2 6,7 0,0 3,6 4,1 0,0 0,0 0,0 2,4 0,0 2,5 1,1 3,6 3,6 1,7 2,1 6,1 0,0 2,0 2,8 2,5 0,0 2,7

d42 2,0 2,0 0,0 0,0 2,1 0,0 0,0 0,0 8,7 0,0 3,0 3,2 0,0 0,0 0,0 2,2 6,0 2,9 0,0 4,1 4,4 1,3 3,0 5,9 0,0 1,6 4,7 2,4 0,0 6,9

d70 7,6 6,2 0,0 6,7 6,4 9,8 5,0 3,5 6,4 8,4 7,3 3,1 0,0 7,7 2,2 7,6 7,5 4,6 6,8 3,6 4,0 2,8 4,7 3,6 8,3 5,2 4,9 6,2 8,8 8,0

d112 7,5 3,1 7,8 4,4 4,7 8,2 7,9 9,9 4,0 6,9 6,5 3,2 4,3 6,7 6,6 4,9 5,1 1,8 6,7 2,1 3,6 4,4 1,1 2,7 7,0 3,0 4,7 3,3 5,8 5,8

d182 5,5 1,5 5,8 3,2 2,8 6,1 3,3 8,6 2,9 4,9 3,9 2,0 1,6 5,2 3,8 3,6 3,4 0,0 4,4 0,0 1,7 3,5 1,1 2,6 4,7 2,7 3,8 2,6 4,0 3,0

F…= laufende Fohlennummer; d= Studientag

ANHANG

117

Tab. 20: Daten des Multiplexassays für Interleukin-4 der Kontrollgruppe; Werte in pg/ml

IL-4 Kontrollgruppe

Med. F1 F3 F7 F8 F10 F12 F13 F14 F19 F20 F22 F23 F26 F28 F29 F31 F33 F34 F39 F40 F42 F43 F45 F47 F49 F50 F53 F54 F58 F59

pre 10 5 0 0 0 0 3 0 0 0 10 5 4 0 0 0 0 0 8 0 0 2 0 0 0 0 53 8 6 11

d1 10 5 0 0 2 0 0 0 0 0 0 5 4 0 0 0 0 0 8 0 0 2 0 0 0 0 8 17 6 11

d14 5 10 0 0 0 2 0 0 0 0 5 5 9 0 3 0 0 0 14 0 0 2 6 0 0 0 8 8 6 6

d28 5 5 0 0 0 2 0 0 0 0 5 5 4 0 0 0 0 0 14 0 0 2 2 0 0 0 4 8 11 6

d56 5 5 0 0 0 2 3 3 0 0 5 5 9 0 3 0 7 0 8 0 0 6 2 0 0 0 4 8 6 11

d84 4 5 0 0 2 2 3 0 0 0 5 5 9 0 0 0 0 6 14 0 0 2 6 0 0 0 13 8 6 11

d112 10 5 0 0 2 2 0 0 1 0 5 5 6 0 0 0 0 0 8 0 0 2 0 0 3 0 8 8 6 6

IL-4 Kontrollgruppe

R.equi F1 F3 F7 F8 F10 F12 F13 F14 F19 F20 F22 F23 F26 F28 F29 F31 F33 F34 F39 F40 F42 F43 F45 F47 F49 F50 F53 F54 F58 F59

pre 5 5 0 0 0 0 3 0 0 0 5 5 4 0 0 0 0 0 8 0 0 2 2 0 0 0 4 8 6 11

d1 10 10 0 0 2 2 3 0 0 0 5 5 4 3 0 0 0 0 14 0 0 2 2 0 0 0 4 8 6 6

d14 5 5 0 0 0 2 0 0 0 0 5 5 4 0 0 2 0 6 8 0 0 2 6 0 0 0 8 8 6 6

d28 10 5 0 0 2 2 0 0 0 0 5 5 4 0 3 0 0 0 14 0 0 6 0 0 0 0 8 8 6 6

d56 42 10 0 0 0 2 3 0 0 0 5 10 9 0 0 0 2 0 14 0 0 6 2 0 0 0 8 8 11 11

d84 10 10 0 0 0 2 0 0 0 0 10 5 4 0 3 0 0 6 6 0 0 2 2 0 0 0 8 8 6 11

d112 10 5 0 0 2 2 6 0 0 0 5 5 4 0 3 0 0 0 8 0 0 6 2 0 0 0 8 8 6 6

IL-4 Kontrollgruppe

PMA F1 F3 F7 F8 F10 F12 F13 F14 F19 F20 F22 F23 F26 F28 F29 F31 F33 F34 F39 F40 F42 F43 F45 F47 F49 F50 F53 F54 F58 F59

pre 10 10 0 0 0 2 202 3 15 0 21 54 83 0 3 172 66 1811 8 596 152 1064 1366 27 367 3927 4112 377 1164 323

d1 3490 1435 572 7073 26893 13663 1156 2165 792 53 105 5249 196 3311 11458 4520 3816 9498 1726 2757 548 9567 1769 5572 25682 53256 33497 1283 1432 967

d14 234 685 2092 504 19397 8783 11662 2852 2951 1089 2786 1632 2492 381 6689 0 0 121 8 6 0 6 53 8 0 360 8 13 21 16

d28 15073 3237 2223 7256 13721 2222 35785 4100 15979 3223 1135 736 7472 4366 1784 2 128 464 61 31 236 146 82 147 3 1009 4 8 199 71

d56 12458 1025 614 2848 3049 638 23056 2149 2587 942 152 6832 445 885 2619 24 179 498 31 858 37 170 37 0 95 210 13 261 155 65

d84 9668 1169 762 4208 15660 7808 804 4064 2275 10684 11653 1488 3289 4165 9736 491 7 20137 483 513 387 4134 621 904 17326 10463 1234 12813 7330 626

d112 964 295 1272 463 832 1784 8823 960 484 11 612 1023 349 223 272 1711 2642 7214 4217 1970 858 22035 2764 31289 4734 20667 29202 27562 3018 1782

Med.= DMEM-Medium; F…= laufende Fohlennummer; pre= Tag vor der Impfung; d= Studientag

ANHANG

118

Tab. 21: Daten des Multiplexassays für Interleukin-4 der Impfgruppe; Werte in pg/ml

IL-4 Impfgruppe


pre 10 1 1 1 0 0 0 0 0 2 0 5 4 4 0 0 0 0 8 8 0 6 0 0 0 8 4 8 8 6

d1 5 4 1 4 0 2 0 0 0 0 0 5 4 4 0 0 0 0 8 8 0 6 0 0 0 8 4 8 8 11

d14 10 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 5 4 6 0 36 0 6 8 8 0 6 0 0 0 8 12 12 8 6

d28 10 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 5 4 4 0 2 0 0 8 14 0 6 0 0 0 8 8 8 8 6

d56 7 4 4 1 0 2 0 2 0 0 0 5 4 9 0 0 0 0 8 8 0 2 0 0 0 8 4 8 8 6

d84 10 1 1 4 0 0 0 2 0 0 0 5 9 4 3 0 0 0 8 8 0 6 0 0 0 13 4 8 10 6

d112 5 4 4 4 0 0 0 2 0 0 0 5 4 4 3 0 0 6 8 8 0 2 0 0 0 8 8 8 8 11

IL-4 Impfgruppe


pre 5 4 1 1 0 0 0 0 0 0 0 5 4 4 0 0 0 0 8 3 0 6 0 0 0 8 8 8 8 6

d1 5 4 4 1 0 2 0 0 0 0 0 5 4 9 0 0 0 6 14 14 0 2 0 0 0 8 8 8 8 6

d14 7 1 1 0 0 2 0 0 0 0 0 5 4 9 0 128 0 0 14 14 0 6 0 0 0 8 8 8 4 11

d28 5 4 4 1 2 0 0 0 0 0 0 5 4 4 0 18 0 0 3 8 0 2 0 0 0 8 4 8 4 11

d56 5 1 1 4 0 2 0 2 0 2 0 5 9 9 3 7 0 0 8 8 0 2 0 0 0 13 4 4 4 11

d84 5 4 4 4 0 2 0 0 0 0 0 5 9 4 3 0 0 0 14 8 0 2 0 0 0 13 4 4 8 11

d112 5 4 4 1 0 2 3 2 0 0 0 5 9 9 0 0 0 0 8 8 0 2 0 0 0 8 8 8 8 6

IL-4 Impfgruppe


pre 31 74 7 1 0 11 10 174 27 32 0 10 9 9 3 3354 444 6232 8 26 4740 250 78 739 1267 377 3416 1242 94 1730

d1 647 3038 816 5386 4227 23421 2710 2690 1447 1653 936 339 473 583 376 32867 1369 2930 4127 483 37954 25766 1387 4348 85151 12383 6400 1331 1547 16841

d14 513 8886 2088 5913 25225 8959 1503 11047 12224 18505 489 829 1349 5982 918 13 101 69 210 96 0 152 0 3 2113 8 57 122 150 316

d28 1245 2505 4639 7160 9832 15224 4727 6869 7003 4806 1899 503 2897 2540 723 7 192 166 61 37 216 235 0 0 0 13 542 57 159 187

d56 819 1072 1972 3464 2140 18054 2927 7851 2313 5284 1586 163 661 1386 1818 1303 95 44 397 752 164 455 2194 941 597 185 150 1004 162 390

d84 790 1072 2913 1428 3151 30167 11970 16316 4891 9409 5892 4779 5193 11982 3358 84 2592 3263 1929 4131 269 1117 4884 637 0 32 2249 3668 640 1343

d112 138 181 431 638 357 3138 1285 928 329 12116 53 593 2025 476 552 21471 2282 166 5021 3253 7397 548 4683 6932 20590 46810 10088 4040 4881 40250

Med.= DMEM-Medium; F…= laufende Fohlennummer; pre= Tag vor der Impfung; d= Studientag

ANHANG

119

Tab. 22: Daten des Multiplexassays für Interferon- der Kontrollgruppe; Werte in pg/ml

IFN- Kontrollgruppe


pre 6 5 11 13 8 8 12 9 9 8 12 13 8 8 8 5 5 13 11 11 10 8 6 6 7 7 8 5 10 15

d1 6 6 16 14 15 14 12 11 9 8 12 13 10 8 9 7 7 10 12 15 12 6 6 9 5 8 11 15 8 16

d14 7 6 19 15 15 12 12 12 13 9 12 14 12 10 11 6 5 14 21 12 12 3 11 6 7 9 8 14 11 13

d28 7 7 17 12 16 17 11 12 9 8 12 15 16 9 11 5 7 14 14 12 12 6 6 10 8 7 7 15 12 13

d56 5 7 13 20 15 15 11 11 14 8 14 14 16 9 13 5 7 16 17 12 16 11 9 9 9 8 10 16 12 12

d84 7 7 16 15 15 17 12 11 11 9 15 14 15 10 11 6 7 17 21 12 15 9 11 13 9 8 16 11 10 15

d112 7 6 16 19 12 14 11 12 14 8 14 16 15 14 12 7 5 14 12 15 14 10 5 9 12 8 11 15 13 12

IFN- Kontrollgruppe


pre 5 5 12 11 10 9 12 9 8 8 9 14 7 9 7 6 4 13 9 12 14 5 6 5 6 7 6 14 10 11

d1 6 7 15 19 18 11 11 11 8 6 14 13 10 14 10 6 8 13 12 11 12 5 6 6 7 7 6 13 12 8

d14 6 7 13 17 15 13 11 10 9 9 15 16 15 10 11 6 4 5 17 12 14 6 10 9 7 8 13 10 12 8

d28 7 6 17 20 15 16 11 11 9 8 13 15 14 12 13 5 5 12 15 11 14 8 5 6 5 7 11 8 12 10

d56 7 7 16 17 15 14 12 12 8 8 16 16 15 12 13 6 7 17 14 14 12 11 6 9 10 7 13 11 13 12

d84 7 6 18 17 16 14 10 9 8 9 17 14 15 12 12 5 5 14 11 12 14 8 6 11 8 8 13 11 8 15

d112 7 7 14 16 17 14 13 11 9 12 17 14 16 14 12 5 6 14 11 11 12 11 6 9 12 2 7 11 10 13

IFN- Kontrollgruppe


pre 6 5 13 12 9 10 44 10 9 7 12 14 8 8 9 6 7 105 10 82 95 121 69 9 8 27 14 8 73 34

d1 263 61 143 775 786 540 144 73 121 18 25 367 23 265 271 99 82 369 188 411 646 346 853 264 107 212 73 16 167 22

d14 22 52 543 153 711 728 723 307 154 131 409 220 309 76 259 5 7 24 14 18 16 10 17 9 7 10 11 4 17 12

d28 390 225 521 733 588 386 1132 725 710 492 263 250 841 517 118 6 8 37 17 15 46 18 17 10 7 20 6 8 25 15

d56 755 178 241 570 441 199 1051 285 436 348 75 1031 111 375 480 5 11 55 16 223 35 18 15 11 24 8 13 13 28 18

d84 393 109 396 215 696 555 57 274 330 699 744 135 636 549 269 15 8 425 65 165 41 123 140 33 279 42 18 34 329 37

d112 37 17 118 29 42 110 212 42 32 12 43 38 24 39 21 57 142 312 363 531 211 529 533 400 295 385 85 100 122 85 Med.= DMEM-Medium; F…= laufende Fohlennummer; pre= Tag vor der Impfung; d= Studientag

ANHANG

120

Tab. 23: Daten des Multiplexassays für Interferon- der Impfgruppe; Werte in pg/ml IFN- Impfgruppe


pre 5 12 8 10 14 9 9 11 9 8 7 12 8 10 7 5 12 14 9 9 14 8 6 7 6 13 5 7 15 11

d1 6 17 19 13 20 11 10 13 10 11 8 16 12 12 9 5 13 16 12 20 12 6 6 6 7 11 8 11 14 12

d14 7 16 19 14 19 11 10 10 9 8 11 19 14 13 11 6 20 16 12 16 12 10 10 10 8 10 15 19 9 12

d28 8 17 9 15 23 11 10 13 9 10 8 14 12 14 11 4 14 12 10 17 12 10 6 6 7 12 9 13 9 12

d56 7 18 19 13 15 11 8 14 11 11 12 15 12 18 11 7 16 13 12 12 14 6 9 7 7 16 8 9 13 13

d84 6 19 14 16 16 13 11 19 10 9 11 12 16 14 15 6 17 14 14 16 15 6 11 9 6 18 9 14 16 6

d112 5 23 16 19 19 13 12 13 10 13 8 12 13 12 12 6 14 17 16 11 14 8 9 9 6 8 13 15 9 16

IFN- Impfgruppe


pre 6 15 10 10 13 10 8 9 10 9 8 13 10 8 7 6 16 17 9 10 11 10 5 7 8 14 3 9 9 8

d1 7 15 17 14 15 15 10 13 10 12 9 16 12 15 10 5 12 14 12 19 12 5 6 5 8 11 9 15 8 11

d14 8 14 15 6 18 17 10 10 9 9 12 9 14 12 11 5 14 9 19 25 11 12 15 9 7 10 16 8 5 16

d28 7 18 16 14 19 14 10 12 12 9 9 14 15 13 14 5 13 14 10 15 15 10 7 6 7 14 9 10 7 13

d56 7 11 14 18 15 17 11 12 11 13 11 14 18 16 10 6 14 10 12 15 15 9 9 7 9 20 6 7 7 16

d84 7 19 15 16 18 13 8 14 9 12 9 15 16 14 10 5 18 12 14 12 14 9 10 9 7 19 6 8 11 15

d112 6 20 16 15 16 15 12 14 13 12 8 14 13 12 11 6 17 14 12 14 12 8 9 9 6 8 8 11 11 10

IFN- Impfgruppe


pre 6 38 13 9 10 9 9 17 12 12 7 13 10 10 9 42 140 64 9 10 132 38 6 16 73 14 75 33 18 37

d1 30 480 159 324 223 824 144 926 346 324 193 75 69 36 58 791 648 564 237 77 1206 854 13 215 561 27 445 35 133 25

d14 27 831 845 729 1116 344 269 1013 992 1124 159 141 274 271 161 7 22 20 20 17 14 15 11 10 19 10 14 13 9 13

d28 126 579 926 961 888 483 480 1192 1070 929 305 191 770 438 200 7 24 27 15 21 20 20 7 10 9 18 25 15 14 21

d56 116 633 600 720 349 935 474 1173 616 1052 418 73 199 217 629 99 24 17 68 50 26 18 43 37 7 19 13 61 21 27

d84 67 546 547 233 412 841 547 1060 421 557 647 552 515 565 470 8 285 169 116 112 53 34 108 53 6 14 145 151 47 97


ANHANG

121

Tab. 24: Daten des Multiplexassays für Interleukin-10 der Kontrollgruppe; Werte in pg/ml IL-10 Kontrollgruppe


pre 3 5 0 0 3 0 1 0 0 0 22 16 5 19 0 1 1 0 17 0 0 0 0 0 8 5 49 0 0 0

d1 17 7 0 0 17 6 0 0 0 21 12 16 0 0 162 9 10 0 63 10 129 0 0 0 0 4 43 4 7 0

d14 2 1 34 0 11 0 6 0 0 0 17 29 0 7 7 5 0 0 46 0 8 0 0 0 0 15 0 3 3 0

d28 0 59 18 0 26 0 28 7 0 20 22 48 157 6 38 0 0 8 56 0 1 0 0 0 2 3 7 10 0 2

d56 24 1 0 24 6 0 35 0 0 8 60 7 4 15 21 4 0 13 20 26 8 0 0 3 0 13 2 2 3 5

d84 4 0 0 0 12 11 0 0 0 0 31 40 8 7 31 0 0 0 33 0 35 0 0 3 7 15 10 1 12 1

d112 6 4 0 0 9 0 0 0 8 5 17 36 44 4 16 6 1 33 26 21 19 0 0 11 9 1 2 10 0 7

IL-10 Kontrollgruppe


pre 5 2 0 0 0 0 0 0 1 0 2 0 0 0 0 1 0 0 1 0 26 0 5 0 0 0 1 6 0 0

d1 96 12 0 81 23 10 3 0 8 0 35 73 0 46 278 42 104 0 83 3 80 2 0 26 9 8 18 7 32 0

d14 4 1 0 0 73 39 15 0 0 1 60 34 26 32 36 3 0 0 32 10 21 0 0 1 0 0 0 0 8 0

d28 48 167 0 44 21 2 114 43 1 82 53 26 251 16 37 4 0 0 49 0 0 0 0 0 0 2 2 3 0 7

d56 422 29 30 0 1 2 97 2 8 72 47 109 20 28 17 0 4 0 32 12 9 0 0 0 9 0 4 4 0 4

d84 1 0 10 0 0 0 0 0 0 12 69 47 6 51 18 0 5 0 64 15 38 0 0 0 9 1 5 4 0 0

d112 4 8 0 0 0 0 0 0 4 0 31 2 10 15 6 9 30 13 38 18 21 8 16 34 9 0 11 16 3 0



pre 0 7 0 0 0 2 15 0 8 0 8 48 0 19 13 4 11 108 44 60 116 126 51 3 8 31 41 6 78 23

d1 727 266 185 2340 752 887 179 70 210 19 63 1262 33 650 1706 751 374 786 547 504 712 1013 1455 377 158 613 46 8 392 36

d14 39 64 1307 306 3262 1848 878 403 270 172 508 521 757 113 1294 0 3 9 32 0 14 0 0 8 11 0 6 0 5 3

d28 2843 691 1458 2367 1255 646 2825 2215 1632 557 375 446 2350 1326 517 1 3 42 1 19 66 0 0 0 0 12 0 0 24 0

d56 6564 739 399 2322 825 253 5191 602 924 844 220 4710 330 1244 2526 3 16 34 33 153 191 0 15 8 19 9 7 5 30 14

d84 2832 778 1061 828 2771 1720 113 416 1225 2070 2466 429 2417 2148 2105 72 9 1246 204 209 58 85 442 53 584 110 12 34 662 192


ANHANG

122

Tab. 25: Daten des Multiplexassays für Interleukin-10 der Impfgruppe; Werte in pg/ml IL-10 Impfgruppe


pre 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 4 36 0 7 8 3 0 0 20 9 0 0 0 6 9 0 9 0 22 0

d1 4 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 55 0 0 11 1 30 23 16 25 21 15 0 1 77 33 27 0 9 6

d14 2 0 2 0 0 5 0 0 0 0 0 62 12 33 30 0 2 16 24 32 13 0 0 9 0 6 5 10 14 0

d28 11 0 0 0 78 4 1 0 0 0 7 50 51 27 5 0 0 13 15 32 3 0 0 16 0 8 4 5 8 0

d56 13 0 22 0 0 53 12 0 0 15 0 44 5 32 23 0 16 2 7 37 0 0 0 0 8 9 3 8 11 17

d84 2 0 5 0 0 12 0 0 0 0 4 1 0 33 29 5 30 9 15 40 0 0 0 0 3 6 4 21 15 0

d112 1 4 0 0 4 1 1 0 0 0 0 5 0 0 26 31 11 18 24 36 7 0 0 6 18 3 12 21 8 0

IL-10 Impfgruppe


pre 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 64 0 16 12 23 6 17 32 16 0 0 0 0 17 6 5 0 2 0

d1 2 18 0 0 0 49 11 0 51 0 31 74 0 0 8 47 69 20 17 18 359 0 12 37 73 100 89 9 14 23

d14 4 1 0 0 97 0 8 147 0 88 0 37 10 10 22 1 17 0 24 35 0 0 0 5 22 0 2 25 0 7

d28 30 9 17 30 149 0 19 102 85 37 38 67 166 48 29 2 0 11 0 46 25 0 0 10 18 0 2 14 3 17

d56 33 31 0 13 33 35 57 19 23 131 3 2 62 69 16 0 9 0 9 41 2 0 8 7 18 2 0 8 5 14

d84 1 0 36 0 62 20 5 0 79 0 9 65 41 114 25 0 12 5 37 14 4 0 15 8 8 7 2 11 14 28

d112 4 0 0 7 0 16 12 0 0 0 4 43 22 27 26 103 8 39 21 42 48 0 18 19 8 3 61 17 25 17

IL-10 Impfgruppe


pre 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 22 8 186 83 62 13 25 75 0 10 3 44 0 331 49 5 29

d1 47 224 235 359 534 889 218 652 424 504 240 210 305 88 193 3865 1255 380 330 117 3228 915 0 494 353 13 565 36 170 594

d14 30 1078 3224 2339 5449 492 251 2019 2175 5682 210 344 496 687 534 3 18 33 52 71 0 0 0 0 71 2 16 10 14 11

d28 292 528 4886 2743 3283 738 1235 3660 2230 2812 684 310 1587 901 376 0 35 0 20 7 5 0 3 0 0 3 10 11 6 20

d56 420 1435 2231 1574 1121 4003 1403 4129 1467 3817 1074 177 310 575 1460 151 30 11 57 110 0 0 69 62 5 3 0 45 24 26

d84 420 988 2986 592 1385 4279 1595 3878 1178 1762 2241 1896 1172 2483 1601 13 891 236 332 458 91 64 251 120 7 13 234 245 129 167


ANHANG

123

Tab. 26: Daten des Multiplexassays für Interleukin-17 der Kontrollgruppe; Werte in pg/ml IL-17 Kontrollgruppe


pre 5 3 2 3 4 4 3 3 3 3 4 4 3 3 2 2 4 4 2 2 4 4 2 2 2 2 131 2 3 5

d1 5 5 3 3 5 5 3 3 3 3 2 2 2 3 3 2 4 2 4 2 2 2 7 2 2 3 2 4 3 5

d14 5 5 3 3 4 5 3 3 3 3 2 2 3 3 3 2 4 4 6 2 2 7 4 2 2 3 2 4 5 5

d28 5 3 3 3 4 5 3 3 3 3 2 4 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 4 2 3 2 4 5 3

d56 3 5 3 5 4 4 3 3 3 3 2 2 3 3 3 2 2 4 4 2 4 4 4 2 2 2 2 4 5 5

d84 5 5 3 3 5 5 5 3 3 3 2 4 3 2 3 2 2 2 4 2 4 2 4 4 3 2 7 4 5 5

d112 3 3 3 3 4 5 3 3 3 3 2 4 3 3 3 4 4 4 2 2 4 4 2 4 5 3 4 4 5 5



pre 3 3 3 2 4 4 3 3 3 3 2 4 2 2 3 4 2 4 2 8 2 2 2 2 2 3 13 4 15 5

d1 18 3 5 10 7 4 3 5 3 2 2 56 3 12 587 6 21 4 99 112 12 16 22 8 3 3 9 4 5 3

d14 5 5 20 3 14 4 3 3 3 3 21 4 5 3 15 4 2 4 4 2 2 2 4 4 2 3 4 4 5 3

d28 8 8 8 5 4 4 13 7 7 9 2 19 37 2 23 6 2 4 4 2 2 4 2 2 2 3 2 2 5 3

d56 1604 3 10 7 4 5 30 3 5 9 4 68 3 3 5 2 4 4 4 4 2 4 4 2 3 2 4 4 5 5

d84 5 3 10 3 5 4 3 3 3 3 35 4 3 2 3 2 4 4 4 4 2 4 4 4 3 3 4 2 3 8

d112 3 3 7 3 4 4 5 3 2 3 4 4 3 3 3 12 4 6 14 88 73 20 9 4 3 2 7 7 5 5



pre 3 3 2 2 4 4 10 15 3 3 4 8 5 3 3 4 25 18 4 79 48 187 87 8 5 173 622 26 68 28

d1 364 212 501 1631 230 762 499 51 413 45 220 2454 68 822 4174 724 257 484 5260 358 1550 2010 1208 338 755 1814 470 74 177 73

d14 54 121 3230 361 4837 1912 1190 464 1041 418 1213 2234 1438 363 2629 10 2 12 4 150 23 7 49 6 2 27 4 2 10 8

d28 3554 2308 6570 3265 2659 939 2599 1631 5418 3579 2060 1539 3151 5912 2764 12 21 271 56 13 671 114 131 143 3 272 2 7 111 56

d56 14532 1117 5965 3978 691 347 6435 1177 1590 3543 319 15522 1178 2087 5268 8 234 258 56 1696 831 11 138 6 65 50 15 13 76 23

d84 6531 1256 4303 813 1559 3855 84 583 644 4062 8969 415 3730 3701 2650 117 10 4893 1115 1096 215 475 1587 130 2132 80 196 518 1439 437


ANHANG

124

Tab. 27: Daten des Multiplexassays für Interleukin-17 der Impfgruppe; Werte in pg/ml IL-17 Impfgruppe


pre 3 4 4 4 3 4 3 3 3 3 3 4 3 3 2 2 4 2 4 2 2 4 2 4 2 4 2 2 2 3

d1 3 4 4 4 7 4 3 3 3 3 3 4 3 3 2 4 2 4 4 6 2 2 2 2 2 2 2 4 4 5

d14 5 4 4 4 3 4 2 5 2 3 3 4 3 3 3 2 4 4 2 4 2 4 4 4 2 2 4 4 4 5

d28 3 4 2 4 3 4 3 3 3 3 2 4 2 3 3 2 2 2 2 4 4 4 4 2 2 2 2 2 2 5

d56 5 4 4 4 3 4 3 3 3 17 3 4 3 3 2 4 4 4 4 4 2 2 2 2 3 4 2 4 4 5

d84 5 4 4 4 3 4 3 5 3 3 3 2 3 3 3 4 2 2 2 4 4 2 4 2 3 4 2 2 4 3

d112 3 5 4 4 3 4 3 3 3 3 3 4 3 2 3 4 4 4 4 4 2 2 6 4 21 4 4 4 2 5

IL-17 Impfgruppe


pre 5 4 4 4 3 4 3 3 3 3 3 4 3 3 3 4 2 4 4 4 2 4 4 8 3 4 2 4 2 3

d1 3 11 4 4 7 12 21 14 10 3 2 21 5 3 2 6 4 6 2 6 38 53 6 9 9 9 13 4 4 5

d14 3 44 11 55 183 4 3 28 3 19 3 4 3 3 3 2 4 2 4 6 2 4 6 4 3 2 4 2 2 5

d28 3 5 9 108 93 5 3 9 22 5 3 4 32 3 3 4 4 4 2 4 2 4 4 4 2 4 4 2 2 5

d56 5 201 12 42 10 25 7 3 9 236 5 2 5 5 3 4 4 2 4 2 2 2 4 4 3 7 0 2 2 5

d84 5 5 39 4 7 4 3 3 3 5 5 4 3 5 3 4 4 2 4 4 4 4 4 4 2 4 2 2 4 5

d112 3 5 4 4 3 5 3 3 5 7 3 4 5 3 3 66 4 4 26 40 6 4 4 2 29 13 25 4 4 5

IL-17 Impfgruppe


pre 15 14 4 11 3 4 8 3 10 10 3 4 3 3 3 290 33 128 2 4 35 20 11 170 262 67 790 27 8 71

d1 57 855 257 527 720 126 889 377 437 1272 233 637 81 69 349 3331 1347 1304 187 91 2537 4150 1821 343 4520 1777 3387 46 937 1745

d14 160 5140 5131 5101 4933 89 354 2108 1260 3036 114 471 178 850 692 6 22 20 60 10 27 13 6 6 154 4 25 6 31 10

d28 1254 4188 5870 6314 5690 514 2795 2577 6972 4819 2616 946 2000 3427 1136 21 210 140 20 32 137 53 6 36 10 22 227 120 61 222

d56 1380 13333 6443 4299 1311 3267 3126 3979 6974 7985 2569 174 115 1278 2010 1606 28 90 209 388 106 125 1415 121 122 237 25 147 340 48

d84 954 2983 5468 853 2835 7326 3458 2651 10946 2772 5171 2543 751 4160 1165 47 1025 1797 741 539 306 238 743 119 2 4 941 380 1079 687


ANHANG

125

Tab. 28: Befundbogen zur Dokumentation der Ergebnisse der klinischen Untersuchung

Datum T° T° K Hu Nabel Durchfall leukos A/Pn Therapie Sonstiges Unterschrift

Wo

chen

ob

B

verschärft

rasseln/giem

en

ob

B

rau

rasseln

oh

ne

serös/m

ukö

s

pu

rulen

t

ob

B

vergröß

ert

0 1 2 0 1 2 0 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Lunge Trachea Nasenausfluss Lnn

ANHANG

126

Ultraschalluntersuchung der Lunge

17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3

A

B

C

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

A

B

C

Mit:

Untersucher:

Sonstiges:

Bemerkung:

Stutenummer: Datum:

Symptome:

Stall/Weide:

Allgemeinzustand:

Nachkontrolle am*:

Behandelt ab:

Rechts

Links

T °C:

Abb. 20: Befundbogen der Ultraschalluntersuchung der Lunge

ANHANG

127

Tab. 29: Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrades respiratorischer

Symptome (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998)

Merkmal Befund Punktzahl

Nasenausfluss

nein 0

serös, seromukös 1

purulent 2

Hustenauslösung

nicht auslösbar 0

mehrfach 1

spontan 2

Lnn. Mandibulares o.b.B. 0

vergrößert 1

Ruhedyspnoe nein 0

Einsinken der Interkostalräume, Nüsternblähen

3

Lungenauskultation vesikulär, vesikulär verschärft 0

Rasseln, Knistern, Giemen 2

Tracheaauskultation o.b.B. 0

Rasseln 2

Gesamtscore 0 - 12

Gradeinteilung der klinischen Befunde:

Klinischer Score von 0 - 1 = lungengesund

Klinischer Score von 2 - 3 = geringgradig erkrankt

Klinischer Score von 4 - 5 = mittelgradig erkrankt

Klinischer Score von > 5 = hochgradig erkrankt

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

128

Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Die zelluläre Immunantwort auf R. equi (GIGUÈRE et al. 2011) 26

Abb. 2: Anzahl der an einer Lungenentzündung erkrankten und nicht

erkrankten Fohlen im Studienzeitraum 49

Abb. 3: Der Abszessscore bei der Diagnosestellung „Pneumonie“ im

Zusammenhang mit dem Erkrankungszeitpunkt der Fohlen aus

der Impf- und Kontrollgruppe 51

Abb. 4: Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung „Pneumonie“ bis

zur Genesung der Fohlen, die milde Befunde aufwiesen 53

Abb. 5: Dauer der Erkrankung von der Diagnosestellung „Pneumonie“ bis

zum Therapiebeginn der Fohlen 54

Abb. 6: Diarrhö im Impfzeitraum und deren Einfluss auf den Impferfolg 55

Abb. 7: Verlauf der R. equi–Antikörpertiter der Fohlen der Impf- und

Kontrollgruppe 56

Abb. 8: IL-4 Konzentration im Medium-Ansatz für die Fohlen der

Impfgruppe (n = 30) und der Kontrollgruppe (n = 30) zu den

gegebenen Messzeitpunkten 58

Abb. 9: IL-4 Konzentration im R. equi-Ansatz für die Fohlen der



Abb. 10: IL-4 Konzentration im PMA-Ansatz für die Fohlen der Impfgruppe

(n = 30) und der Kontrollgruppe (n = 30) zu den gegebenen

Messzeitpunkten 60

Abb. 11: IFN- Konzentration im Medium-Ansatz für die Fohlen der



Abb. 12: IFN- Konzentration im R. equi-Ansatz für die Fohlen der



ABBILDUNGSVERZEICHNIS

129

Abb. 13: IFN- Konzentration im PMA-Ansatz für die Fohlen der









Abb. 16: : IL-10 Konzentration im PMA-Ansatz für die Fohlen der









Abb. 19: IL-17 Konzentration im PMA-Ansatz für die Fohlen der



Abb. 20: Befundbogen der Ultraschalluntersuchung der Lunge 126

TABELLENVERZEICHNIS

130

Tabellenverzeichnis Tab. 1: Mikrotiterplattenanordnung des ELISAs zur Antikörpertiter-

Bestimmung aus dem Fohlenserum

39

Tab. 2: Mikrotiterplattenanordnung des Multiplexassays zur

Cytokinmessung (Luminextechnologie)

45

Tab. 3: Signifikanz errechneter p-Werte 47

Tab. 4: Alter der Fohlen bei der Diagnosestellung „Pneumonie“ 49

Tab. 5: Erkrankungsrate in Abhängigkeit vom Alter der Fohlen zum

Zeitpunkt der ersten Impfung

50

Tab. 6: p-Werte der Antikörpertiter für den Vergleich beider Gruppen 57



61

Tab. 8: Zusammenhang zwischen den Inkubationsansätzen für IL-4 61

Tab. 9: IFN- Mittelwerte der Impf- und Kontrollgruppe vergleichend in

den verschiedenen Ansätzen

65

Tab. 10: Zusammenhang zwischen den Inkubationsansätzen für IFN- 66

Tab. 11: IL-10 Mittelwerte der Impf- und Kontrollgruppe vergleichend in


70


Tab. 13: IL-17 Mittelwerte der Impf- und Kontrollgruppe vergleichend in


74


Tab. 15: Daten der Impfgruppe: Geschlecht und Alter 112

Tab. 16: Daten der Kontrollgruppe: Geschlecht und Alter 113

Tab. 17: Klinische und sonografische Befunde der Fohlen der Impfgruppe 114

Tab. 18: Klinische und sonografische Befunde der Fohlen der

Kontrollgruppe

115

Tab. 19: Antikörpertiter gegen R. equi–Zellextrakt von Impf- und

Kontrollgruppe

116

Tab. 20: Daten des Multiplexassays für Interleukin-4 der Kontrollgruppe 117

TABELLENVERZEICHNIS

131

Tab. 21: Daten des Multiplexassays für Interleukin-4 der Impfgruppe 118

Tab. 22: Daten des Multiplexassays für Interferon- der Kontrollgruppe 119

Tab. 23: Daten des Multiplexassays für Interferon- der Impfgruppe 120





Tab. 28: Befundbogen zur Dokumentation der Ergebnisse der klinischen

Untersuchung

125

Tab. 29: Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrades

respiratorischer Symptome (modifiziert nach OHNESORGE et al.

1998)

127

DANKSAGUNG

132

Danksagung Frau Dr. Dr. habil. Monica Venner, PhD, möchte ich für die Überlassung dieses

interessanten Themas, die fachliche Unterstützung, jederzeitige Hilfsbereitschaft und

die Korrektur meiner Dissertation danken.

Frau Prof. Dr. Bettina Wagner danke ich für die fachliche Anleitung im

immunologischen Labor, jederzeitige Hilfsbereitschaft, Unterstützung bei der

Auswertung der Proben sowie die unvergessliche Erfahrung an der Cornell

University.

Herrn Paul Schockemöhle danke ich für die Unterstützung der Studie auch unter

schwierigen Bedingungen.

Herrn Dr. Marc Lämmer danke ich für die Organisation der Studie und seine stetige

Unterstützung bei der praktischen Durchführung.

Dem Team von MSD aus Boxmeer, NL, vor allem Tom Nell, Ton Jacobs und Martine

Reijnders, danke ich für ihr Vertrauen, mich die Studie durchführen zu lassen und die

finanzielle Unterstützung.

Herrn Dr. Dieter Runge möchte ich dafür danken, dass ich meine Proben in seinem

Labor bearbeiten konnte. Besonderer Dank gilt dabei auch dem Laborteam, vor

allem Anett Ullrich, für ihre Hilfsbereitschaft und Unterstützung bis hin zum

Probenversand.

Frau PD Dr. Ingrid Vervuert möchte ich vielmals für die Unterstützung bei der

statistischen Auswertung der Laborergebnisse danken. Besonders das kurzfristige

Einspringen hat mir sehr geholfen.

DANKSAGUNG

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Ein herzlicher Dank gilt den anderen Doktorandinnen in der Lewitz im Jahr 2013, die

mich beim Schallen, den Untersuchungen und der Probennahme unterstützten und

mir auch die Zeit drumherum unvergesslich machten: Eva Hebel, Anja Kirschbaum,

Lisa Tscheschlok und Franziska Hildebrand. Ihr ward großartig!

Weiterer Dank gilt meinen Helfern auf dem Heidehof, Matthias Schulze und Martin

Bock, die mir über Monate halfen die Pferde zu versorgen und zu untersuchen. Ohne

euch hätte ich das nicht geschafft!

Andreas Finze, meinem lieben Ehemann danke ich für die mentale Unterstützung

während der Durchführung und des Schreibens, und auch während des Weges dahin

im Studium. Du warst immer für mich da, Danke!

Meinen Eltern und Geschwistern danke ich für die stetige Unterstützung während der

Arbeit und überhaupt. Ihr habt mich zu dem Menschen gemacht, der ich nun bin.

Ich danke dem gesamten Team in der Lewitz, von Abfohlstall, Fahrdienst,

Fohlenrunde bis Klinik und wer sonst noch mit „Heidehoffohlen“ zu tun hatte. Ihr habt

alle viel zusätzliche Arbeit auf euch genommen und habt mich großartig unterstützt.

Ein besonderer Dank gilt den Assistenten aus Bettina Wagners Labor in Cornell.

Susanna Babasyan, Heather Freer, Laura Goodman, Alison Keggan und natürlich

Dr. Gillian Perkins, ihr ward wahnsinnig geduldig beim Schulen des Laborhandwerks

und hattet auch danach immer ein offenes Ohr für meine Fragen. Thank you very

much!

Date post:	05-Aug-2019
Category:	Documents
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