Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 3
Enzym-Dynamik einzelner Moleküle
● Bis vor ca. 20 Jahren: Chemische Reaktionen
(in Lösung) im Wesentlichen nur im Ensemble
untersucht
● Messung von Konzentrationen der Ausgangs-
(u.U. Zwischen-) und Endprodukte
● Einzelne Molekülparameter konnten kaum
untersucht werden
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 4
Enzym-Dynamik einzelner Moleküle
● Neue Verfahren (z.B. Fluoreszenzmikroskopie) erlauben die Beobachtung einzelner Moleküle während der Reaktion in Echtzeit
Quelle: (1)Fluoreszenzbild von COx
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Cholesterol Oxidase (COx)
● Enzym● katalysiert Oxidation von Cholesterol
Quelle: (4)
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 7
Flavin Adenin Dinukleotid (FAD)
Quelle: (3b)
Koenzym Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD)
im aktiven Zentrum nicht-kovalent gebunden
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 8
Flavin Adenin Dinukleotid (FAD)
fluoreszierend im oxidierten Zustand
Quelle: (1)
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 9
Experiment: COx in Aktion
● Gewinnung von COx aus Bakterium
(Brevibacterium sp.)
● kleine Anzahl COx – Moleküle (33)
in Agarose Gel (99% Wasser)
● Cholesterol (0,2 mM) / O2 (0,25 mM gesättigt)
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 10
Experiment: COx in Aktion
Pufferlösung: Agarose Gel● Keine Translation der COx Moleküle,
aber: Substrat Moleküle beweglich● schnelle Rotation ( >> 20 Hz) verhindert
Binden an das Gel
Fluoreszenz Mikroskopie● Rasterscan der Probe, HeCd-Laser (442 nm)● Detektion der Photonenemission / Molekül
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 11
Experiment: Beobachtungen
Quelle: (1)Rasterscan der Probe
Rasterscan der Probe:jeder Peak = einzelnes COx Molekül
Zeitliche Trajektorie eines Moleküls: „Blink“-Verhalten
Quelle: (1)
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Emissionsverhalten eines Moleküls
Blink - Zyklus ⇔ Reaktionszyklus (FAD↔FADH
2)
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 13
Experiment
● Kontrollexperimente:
– Ohne Cholesterol kein Blinken
– Zyklenraten unabhängig von Anregungsintensität
– mittlere Zyklenraten ⇔ mittleren Reaktionsraten
aus Ensemble-Experimenten
(unter gleichen Bedigungen)
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 14
Auswertung des Experiments
● Lange Trajektorien (> 500 Zyklen, 10 – 20 min) ermöglichen statistische Analyse
● Trajektorien weisen stochastische Eigenschaften auf
→ Verteilung der An- und Aus-Perioden wird statistisch untersucht
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 15
Auswertung des Experiments
Aus der Trajektorie ergibt sich ein Histogramm:
Quelle: (1)Verteilung der On-times bei 0.2 mM Cholesterol
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Auswertung des Experiments
Ein Schritt zurück...
Was erwarten wir eigentlich zu sehen?
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 17
Vom Ensemble zum Molekül
● Konzentrationen:[E], [S], [P]
● Konzentrationsrate: k[S] [P]
k
aus an
P● Zustand: An oder Aus● Wahrscheinlichkeit: P● Wahrscheinlichkeits-
verteilung: p(t)
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 18
Einfachstes Schema
E−FADan
⇄kb
kf
E−FADH2aus
d [FAD]
dt=−kf [FAD ]kb[FADH2]
d [FADH2]
dt=k f [FAD]−kb[FADH2]
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 19
Einfachstes Schema
[FAD ] ∝ exp−kfkbt
[FADH2] ∝ −exp−k fkbt
Quelle: (7)
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 20
Einfachstes Schema
● Wahrscheinlichkeitsverteilung
(Poisson-Prozess):
pont =ce−kt
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Wahrscheinlichkeitsverteilung
Quelle: (1)
... aber es zeigt sich:
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 22
Reaktionskinetik
„Ping-Pong“-Mechanismus
E−FAD San
⇄k−1
k1
E−FAD⋅San
→k2
E−FADH2 Paus
E−FADH2O2aus
⇄k'−1
k'1
E−FADH2⋅O2aus
→k'2
E−FAD H2O2an
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 23
Reaktionskinetik
● Zwei Michaelis-Menten Reaktionen im Wechsel
● Reduktions-Reaktion → FAD an
Oxidations-Reaktion → FAD Aus
● Annahme: Weitere Reaktionsschritte sind keine
limitierenden Faktoren für die Gesamtreaktion
→ können vernachlässigt werden
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 24
Reaktionskinetik
● Aus den Reaktionsgleichungen mit
Zwischenprodukt erhält man:
pont =k1k2
k2−k1[e−k1t−e−k2t ]
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 25
Wahrscheinlichkeitsverteilung pon
(t)
...was gut zu den gemessenen Daten passt:
[S]=0.2 mMk
1=2.9 s-1
k2=17 s-1
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 26
Wahrscheinlichkeitsverteilung pon
(t)
Erhöhung der Cholesterol-Konzentration
[S]=2 mMk
1=33 s-1
k2=17 s-1
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 27
Ergebnisse der Analyse
● mittlere An-Zeiten werden kürzer
● k1∝ Cholesterol-Konzentration,
k2 bleibt konstant
● Die Verteilung der Aus-Zustände bleibt unverändert
→ Konsistenz mit Michaelis-Menten
Erhöhung der Cholesterol-Konzentration
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 28
Michaelis-Menten-Mechanismus
Quelle: (6)
V 0=Vmax [S ]
Km[S]
pre-steady-state: v0 ~ [S]
Sättigung: v = Vmax
= const.
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 29
Bisher: 1 Molekül
→ Jetzt: Vergleich der Reaktionsraten mehrerer Moleküle
Unordnung von k2
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 30
Statische Unordnung
Sättigungsfall: k
2 soll
limitierende Rate werden
also: k2 << k
1
→ Verwendung eines langsameren Substrats (5-pregene-3β-20α-diol),
mit k2=3,9 s-1
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 32
p(t) im Sättigungsfall
E−FADan
⇄kb
kf
E−FADH2aus
sehr praktisch:
hier reicht also das
reversible Schema aus!
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 33
Reaktionsraten k2 mehrerer Moleküle
Mittlere Raten von 33 COx Molekülen
starke Streuung
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 34
Statische Unordnung
→ statische Inhomogenität der Moleküle
Ursachen:
● Posttranslationale Modifikationen ● statische Verformung der Enzym-Moleküle
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 35
Dynamische Unordnung
Neben statischen Inhomogenitäten:
dynamische Fluktuationen
der Raten einzelner Moleküle
Ohne Einzelmolekül-Analyse
nicht zu entdecken!
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 36
Dynamische Fluktuationen
x y
aufeinander folgende Zyklen x, y
m=1 m=10m
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 37
Dynamische Fluktuationen
Ein molekulares Gedächtnis?
Quelle: (1)
m=1 m=10
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 38
Memory-Effekt
● Diagonales Merkmal für m=1
● → p(x,y) ≠ p(x)p(y)
● für m=10 keine Korrelation mehr
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 40
Memory-Effekt
→ k2 fluktuiert auf Zeitskala ≈ 1s
ist vergleichbar mit 1/k2 → Memory-Effekt
Quelle: (8)
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 41
Woher kommt diese Fluktuation?
● Spektrale Analyse ergibt:
Emissions-Spektrum fluktuiert auf der gleichen Zeitskala wie k
2
● Konformative Veränderungen des Proteins um das FAD-Molekül
→ Subzustände des Enzyms
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 42
2-Stufen-Modell
Simulation mit diesem Modell liefert tatsächlich ein ähnliches Gedächtnis-Verhalten
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 43
Was wurde also beobachtet?
● COx-Reaktion folgt im Wesentlichen dem
Michaelis-Menten-Schema
● statische Unordnung der Reaktionsraten
bedingt durch die Umgebung
● Molekül-spezifische dynamische Unordnung
erzeugt Memory-Effekt
Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen 44
Einzelmolekül vs. Ensemble
● Konzentrationsmessungen im GG● für Fließgleichgewicht o. während
der Reaktion: Stop-Flow, o.ä.
● Untersuchungen statischer und dynamischer Fluktuationen, u.U. mit biologischer Funktion
● im Ensemble nicht sichtbare, molekulare Eigenschaften
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Quellen
(1) Lu et al., SCIENCE vol.282, p.1877 (1998)
(2) RCSB Protein Data Bankhttp://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3COX
(3) Wikipedia
a) http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cholesterol_oxidase&oldid=171284374
b) http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Flavin-Adenin-Dinukleotid&oldid=38470261
(4) A. Vrielink, L. F. Lloyd, D. M. Blow, J. Mol. Biol. 219, 533 (1991)
(5) http://elm-asse-kultur.de/PDF/bb3-2005.pdf
(6) D. Nelson, M. Cox, Lehninger Biochemie, Springer-Verlag (2001)
(7) Ch. E. Mortimer, U. Müller, Chemie, Das Basiswissen der Chemie (2001)
(8) http://bernstein.harvard.edu/research/enzymatickinetics.htm