Entwicklung und Validierung einer Multimethode zur Bestimmung von Antibiotikarückständen in Milch...

7/26/2019 Entwicklung und Validierung einer Multimethode zur Bestimmung von Antibiotikarckstnden in Milch und Wasser

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Entwicklung und Validierung einer Multimethode zurBestimmung von Antibiotikarckstnden in Milch und

Wasser mittels LC-MS/MS

Masterarbeitim Master-Studiengang Lebensmitteltechnologie/Food Science and

Technology der Beuth Hochschule fr Technik Berlin- University of Applied Sciences -

zur Erlangung des akademischen Grades einesMaster of Science (M. Sc.)

vorgelegt von

Shafira Nur Octavia, B. Sc.

im September 2014

angefertigt imInstitut fr Getreideverarbeitung GmbH

Abteilung Analytik/Testlabor

1. Gutachter: Prof. Dr. Monika Springer2. Gutachter: Dr. Gerd Huschek

Projektbetreuerin: Silvia Aguil-Losa


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Eidesstattliche Erklrung

i

Eidesstattliche Erklrung

Ich versichere, dass ich diese Arbeit selbststndig verfasst und keine anderen als dieangegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Berlin, den 1. September 2014

Shafira Nur Octavia


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Danksagung

ii

Danksagung

Diese Arbeit mchte ich zum Anlass nehmen, einigen Personen meinen Dank

auszusprechen, die mich bei dieser Masterarbeit untersttzt und begleitet haben. In

erste Linie danke ich Frau Prof. Dr. Monika Springer sowie Herrn Dr. Gerd Huschek

von der Firma IGV (Institut fr Getreideverarbeitung) GmbH fr dieses interessante

Thema sowie fr die Untersttzung und Hilfe bei der Erstellung der vorliegenden

Masterarbeit. Von ihnen erhielt ich Anregungen und sie waren immer bereit,

umgehend auf meine Fragen einzugehen.

Speziell bei Frau Silvia Aguil-Losa von der Firma IGV GmbH mchte ich fr dievielen gemeinsamen Stunden im Bro und im Labor sowie fr die tatkrftige

Untersttzung, zahlreiche Anregungen und Hilfe bei den praktischen Versuchen

insbesondere beim Erfahren der LC-MS/MS bedanken.

Ein herzliches Dankeschn auch an Olga Worster und Jurgenal Fatichin, die mir bei

der schriftlichen Korrektur dieser Arbeit geholfen haben.

Des Weiteren danke ich den Mitarbeitern des Prflabors des IGV GmbH fr IhreUntersttzung und gute Zusammenarbeit whrend der praktischen Versuche.

Zu guter Letzt mchte ich meinen lieben Eltern in Indonesien, meiner Schwester

Shofiana Octari und Hariz Adenan fr ihre unendliche Motivation und Untersttzung

danken.


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Abstract

iii

Abstract

Many classes of antibiotics are widely administrated to food-producing animals for

the purpose of prevention and treatment of several diseases. This can result in

residues in several dairy products such as milk, which is highly consumed over the

world. Additionally, the residual antibiotics from both human and animal uses can

also enter the environment via various pathways, including wastewater effluent

discharge, runoff from land to which agricultural or human waste has been applied,

and leaching. Furthermore, antibiotics in the aquatic environment may persist and be

transported to reservoirs supplying source water to drinking water treatment plants.

Those described situations can be problematic because antibiotics residues can

provoke allergic reactions in some hypersensitive individuals. Different studies also

indicate that low-level doses of antibiotics for long periods could result in bacteria

resistance. On the other hand, the residues in milk can also slow or destroy the

growth of the fermentation of bacteria during the production of milk products.

In order to ensure human food safety, the European Union has set maximum residue

limits (MRLs) in milk for some antibiotics, although for some antibiotics it is indicated

that they cannot be used in animals from which milk is produced for human

consumption. For water, there are no national as well as international regulations but

its necessary to distill the existing health information such as ADI etc.

In this masters thesis, a selective method was developed to analyze several

antibiotics in milk and drinking water by high pressure liquid chromatography coupled

to mass spectrometry in a single analytical run after a solid phase extraction. The

selected antibiotics include two beta-lactames, four macrolides, one sulphonamide,

one diamino-pyrimidine derivate, two tetracyclines and one amphenicol.

The extraction procedure for milk, consisting of an extraction of the sample with

acetonitrile:water:acetic acid (10:90:0,1, v/v) with supernatant clean-up using polymer

SPE-cartridge BEKOlut LEOX was performed. Using the same SPE-cartridge,

another SPE method for drinking water sample preparation was also developed prior

to chromatographic analysis.


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Abstract

iv

Chromatographic conditions were developed in order to obtain a fast separation in 13

minutes by use of HPLC column Kinetex-C18. The antibiotics were detected by

electrospray ionization in positive as well as in negative ion mode with multiple

reactions monitoring (MRM).

The developed method for milk was validated by adapting the Commission Decision

2002/EC/657 in terms of linearity, trueness, precision and stability with the exception

for CC and CC, which were replaced by LOD and LOQ in this thesis. With the

exception of recoveries to determine trueness, all parameters have acceptable

values and are in agreement with the criteria of Commission Decision 2002/657/EG.

Six of the analyzed antibiotics in milk did not reach the recovery criteria of the

Commission Decision (the criteria depends on concentration), but the recovery

criteria of IGV test lab between 70 120 % is fulfilled from all analytes in both low

and high concentration levels except azithromycin (55,5 % and 60,5 %) and

chloramphenicol (129 % and 145 %).

The developed method for drinking water could not deliver any recovery of

tetracyclines group (tetracycline and doxycycline). However, the recoveries of other

antibiotics groups, except sulfamethoxazole (recovery of 123 %), lied in acceptablerange between 70120 %.


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Inhaltsverzeichnis

v

Inhaltsverzeichnis

Eidesstattliche Erklrung ......................................................................................................... i

Danksagung ........................................................................................................................... iiAbstract ................................................................................................................................. iii

Abbildungsverzeichnis .......................................................................................................... vii

Tabellenverzeichnis ............................................................................................................... ix

Abkrzungsverzeichnis ........................................................................................................... x

1. Einleitung ....................................................................................................................... 1

1.1 Problemstellung ...................................................................................................... 1

1.2 Zielsetzung .............................................................................................................. 2

2. Theoretischer Teil ........................................................................................................... 42.1 Antibiotika ............................................................................................................... 4

2.1.1 Einleitung ......................................................................................................... 4

2.1.2 Untersuchte Antibiotika .................................................................................... 5

2.1.3 Chemische Eigenschaften und Stabilitt untersuchter Antibiotika..................... 9

2.2 Antibiotikarckstnde .............................................................................................12

2.2.1 Antibiotikarckstnde in Milch .........................................................................12

2.2.2 Antibiotikarckstnde in Wasser .....................................................................13

2.2.3 Risiken und Auswirkungen ..............................................................................14

2.3 Rechtliche Rahmenbedingungen ............................................................................15

2.3.1 Gesetzlich festgelegte Rckstandshchstmengen ..........................................15

2.3.2 ADI-Werte (Acceptable Daily Intake) ...............................................................17

2.3.3 Kriterien der analytischen Methoden ...............................................................18

2.4 Analytik von Antibiotika ..........................................................................................18

2.4.1 Solid-Phase-Extraktion ....................................................................................19

2.4.2 LC-MS/MS-Technik .........................................................................................21

2.5 Methodenvalidierung ..............................................................................................24

3. Material und Methoden ..................................................................................................293.1 Gerte und sonstige Materialien .............................................................................29

3.2 Chemikalien und Reagenzien .................................................................................29

3.2.1 Lsungsmittel ..................................................................................................29

3.2.2 Chemikalien und Reagenzien ..........................................................................29

3.2.3 Lsungen ........................................................................................................30

3.2.4 Standardlsungen ...........................................................................................30

3.2.5 Kalibrierreihe ...................................................................................................32

3.3 Extraktion und Aufreinigung mittels SPE ................................................................33

3.3.1 Milchprobe ......................................................................................................33

3.3.2 Wasserprobe ...................................................................................................34


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Inhaltsverzeichnis

vi

3.4 LC-MS/MS Parameter ............................................................................................35

3.5 Validierung der Methode ........................................................................................36

3.5.1 Selektivitt und Spezifitt ................................................................................36

3.5.2 Arbeitsbereich .................................................................................................373.5.3 Linearitt .........................................................................................................37

3.5.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenze ...............................................................37

3.5.5 Przision .........................................................................................................38

3.5.6 Richtigkeit/Wiederfindung ................................................................................39

3.5.7 Stabilitt ..........................................................................................................39

3.5.8 Matrix-Effekte ..................................................................................................39

4. Ergebnisse und Diskussion ...........................................................................................40

4.1 Entwicklung von LC-MS/MS-Methode ....................................................................40

4.2 Betimmung der Arbeitsbereiche .............................................................................43

4.3 Entwicklung der Extraktionsmethode fr Milch .......................................................46

4.3.1 Methodenauswahl und Optimierung ................................................................46

4.3.2 Vergleich der SPE-Sule .................................................................................49

4.4 Entwicklung der Extraktionsmethode fr Wasser ....................................................51

4.5 Validierung der Methode ........................................................................................53

4.5.1 Selektivitt (Spezifizitt) ..................................................................................53

4.5.2 Kalibrierbereich ...............................................................................................55

4.5.3 Linearitt .........................................................................................................564.5.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenze ...............................................................57

4.5.5 Przision .........................................................................................................58

4.5.6 Richtigkeit/Wiederfindung ................................................................................61

4.5.7 Stabilitt ..........................................................................................................64

4.5.8 Matrix-Effekte ..................................................................................................65

5. Zusammenfassung ........................................................................................................67

6. Literaturverzeichnis .......................................................................................................69

7. Anhang ..........................................................................................................................75

7.1 Formeln ..................................................................................................................75

7.2 Chromatogramme ..................................................................................................78

7.3 Kalibriergeraden (Milch) .........................................................................................84

7.4 Kalibriergeraden (Wasser) ......................................................................................87

7.5 Matrix-Effekte (Milch) .............................................................................................90

7.6 Ergebnisse der Methodenentwicklung ....................................................................92


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Abbildungsverzeichnis

vii


Abbildung 1: Chemische Struktur von Penicillin G und Ceftiofur ............................................ 5

Abbildung 2: Chemische Struktur von Tetracyclin und Doxycyclin ......................................... 6

Abbildung 3: Chemische Struktur von Azithromycin, Clarithromycin, Erythromycin, Tylosin .. 7

Abbildung 4: Chemische Struktur von Trimethoprim .............................................................. 8

Abbildung 5: Chemische Struktur von Sulfamethoxazol ......................................................... 9

Abbildung 6: Chemische Struktur von Chloramphenicol ........................................................ 9

Abbildung 7: Eintragspfade fr Arzneimittel in die aquatische Umwelt ..................................13

Abbildung 8: SPE-Gert mit Vakuum und SPE-Kartuschen unterschiedlicher Formate ........20

Abbildung 9: Prinzip der SPE-Methode ................................................................................21

Abbildung 10: Aufbauprinzip eines HPLC-Systems ..............................................................22

Abbildung 11: Octadecylsilan (ODS, C18) ............................................................................23

Abbildung 12: Schematische Darstellung der ESI-Ionisierung ..............................................24

Abbildung 13 XIC aller Analyten mit Fusion-RP in positivem Ionisierungsmodus..................41

Abbildung 14: XIC von Trimethoprim und Tetracyclin mit Fusion-RP ....................................42

Abbildung 15: XIC aller Analyten mit KinetexC18 in positivem Ionisierungsmodus ............42

Abbildung 16: XIC von Trimethoprim und Tetracyclin mit Kinetex C18 ...............................42

Abbildung 17: Vergleich verschiedener Methoden ................................................................47

Abbildung 18: Wiederfindung untersuchter Antibiotika mit verschiedenen SPE-Sulen ........50

Abbildung 19: Vergleich der SPE-Sulen LEOX und LEOX Plus fr Wasserextraktion.........52

Abbildung 20: TIC Blank-Probe in positiver Ionisierung ........................................................53

Abbildung 21: TIC Blank-Probe in negativer Ionisierung .......................................................54

Abbildung 22: XIC Tetracyclin in Blank-Probe (a), dotierter Milchprobe 1*MRL (b) und imLsemittelstandard 1*MRL (c) ..............................................................................................54

Abbildung 23: XIC Penicillin G in Blank-Probe (a), dotierter Milchprobe 1*MRL (b) und imLsemittelstandard 1*MRL (c) ..............................................................................................55

Abbildung 24: RSDrund RSDwRbei niedrigem Konzentrationniveau ....................................60

Abbildung 25: RSDrund RSDwRbei mittlerem Konzentrationniveau .....................................61Abbildung 26: RSDrund RSDwRbei hohem Konzentrationniveau .........................................61

Abbildung 27: Stabilittstest der Wirkstoffe in Milchmatrix mittels LC-MS/MS .......................64

Abbildung 28: Messwerte von Trimethoprim in Matrix- und Lsemittel .................................65

Abbildung 29: Messwerte von Tetracyclin in Matrix und Lsemittel ......................................65

Abbildung 30: Messwerte von Tylosin in Matrix- und Lsemittel ...........................................65

Abbildung 31: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Azithromycin K5 (20 g/L) ................................78

Abbildung 32: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Ceftiofur K4 (100 g/L) .....................................78

Abbildung 33: XIC ISTD_neg (15 g/L) und Chloramphenicol K5 (4,5 g/L) .........................79Abbildung 34: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Clarithromycin K4 (15 g/L) ..............................79

Abbildung 35: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Doxycyclin K5 (20 g/L)...................................80


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viii

Abbildung 36: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Erythromycin K4 (40 g/L) ................................80

Abbildung 37: XIC ISTD_neg (15 g/L) und Penicillin G K4 (4 g/L)....................................81

Abbildung 38: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Sulfamethoxazol K5 (20 g/L)..........................81

Abbildung 39: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Tetracyclin K4 (100 g/L).................................82

Abbildung 40: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Trimethoprim K4 (50 g/L) ................................82

Abbildung 41: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Tylosin K5 (75 g/L) .........................................83

Abbildung 42: Kalibriergerade von Azithromycin (Milch) .......................................................84

Abbildung 43: Kalibriergerade von Ceftiofur (Milch) ..............................................................84

Abbildung 44: Kalibriergerade von Chloramphenicol (Milch) .................................................84

Abbildung 45: Kalibriergerade von Clarithromycin (Milch) .....................................................84

Abbildung 46: Kalibriergerade von Doxycyclin (Milch) ..........................................................85

Abbildung 47: Kalibriergerade von Erythromycin (Milch) .......................................................85

Abbildung 48: Kalibriergerade von Penicillin G (Milch) ..........................................................85

Abbildung 49: Kalibriergerade von Sulfamethoxazol (Milch) .................................................85

Abbildung 50: Kalibriergerade von Tetracyclin (Milch) ..........................................................86

Abbildung 51: Kalibriergerade von Trimethoprim (Milch) ......................................................86

Abbildung 52: Kalibriergerade von Tylosin (Milch) ................................................................86

Abbildung 53: Kalibriergerade von Azithromycin (Wasser) ...................................................87

Abbildung 54: Kalibriergerade von Ceftiofur (Wasser) ..........................................................87

Abbildung 55: Kalibriergerade von Chloramphenicol (Wasser) .............................................87

Abbildung 56: Kalibriergerade von Clarithromycin (Wasser) .................................................88

Abbildung 57: Kalibriergerade von Erythromycin (Wasser) ...................................................88

Abbildung 58: Kalibriergerade von Penicillin G (Wasser) ......................................................88

Abbildung 59: Kalibriergerade von Sulfamethoxazol (Wasser) .............................................88

Abbildung 60: Kalibriergerade von Trimethoprim (Wasser) ...................................................89

Abbildung 61: Kalibriergerade von Tylosin (Wasser) ............................................................89

Abbildung 62: Vergleich der Messwerte von Azithromycin in Lsemittel- und in Matrix.........90

Abbildung 63: Vergleich der Messwerte von Ceftiofur in Lsemittel- und in Matrix ...............90

Abbildung 64: Vergleich der Messwerte von Chloramphenicol in Lsemittel- und in Matrix ..90

Abbildung 65: Vergleich der Messwerte von Clarithromycin in Lsemittel- und in Matrix ......90

Abbildung 66: Vergleich der Messwerte von Doxycylin in Lsemittel- und in Matrix ..............90

Abbildung 67: Vergleich der Messwerte von Erythromycin in Lsemittel- und in Matrix ........90

Abbildung 68: Vergleich der Messwerte von Penicillin G in Lsemittel- und in Matrix ...........91

Abbildung 69: Vergleich der Messwerte von Sulfamethoxazol in Lsemittel- und in Matrix ...91

Abbildung 70: Vergleich der Messwerte von Tetracyclin in Lsemittel- und in Matrix ............91

Abbildung 71: Vergleich der Messwerte von Trimethoprim in Lsemittel- und in Matrix ........91Abbildung 72: Vergleich der Messwerte von Tylosin in Lsemittel- und in Matrix ..................91

Abbildung 73: Double-Peak bei Makroliden mit PSM-Gradient .............................................92


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Tabellenverzeichnis

ix

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: pK-Werte untersuchter Antibiotika ........................................................................11

Tabelle 2: Festgelegte Rckstandshchstmengen in Milch in g/kg nach der Verordnung

(EG) Nr. 37/2010 ..................................................................................................................16Tabelle 3: Aktuelle vorhandene ADI-Werte verschiedener Antibiotika nach JECFA sowienach CVMP/EMEA in g/kg KG ............................................................................................17

Tabelle 4: Standardsubstanzen fr die Validierung ..............................................................31

Tabelle 5: Herstellung der Standardmix fr Milch .................................................................32

Tabelle 6: Herstellung der Standardmix fr Wasser ..............................................................32

Tabelle 7: Herstellung der Kalibrierreihe fr Milch ................................................................32

Tabelle 8: Herstellung der Kalibrierreihe fr Wasser .............................................................33

Tabelle 9: LC-Konfiguration ..................................................................................................35Tabelle 10: Gradientzusammensetzung fr die LC ...............................................................35

Tabelle 11: MS/MS-Konfiguration .........................................................................................36

Tabelle 12: MRM-bergange der einzelnen Analyten...........................................................36

Tabelle 13: Zudotiertes Volumina der Antibiotikastandard-Mix und Analyt-Endkonzentrationin den Proben .......................................................................................................................38

Tabelle 14: Arbeitsbereich fr Milch in g/kg und Relationskoeffizient jeweiligerKalibriergeraden ...................................................................................................................45

Tabelle 15: Arbeitsbereich fr Wasser in ng/L und Relationskoeffizient jeweiliger

Kalibriergeraden ...................................................................................................................45Tabelle 16: Vergleich verschiedener Extraktionsmethoden zur Antibiotikauntersuchungmittels SPE ...........................................................................................................................48

Tabelle 17: Linearitt der Kalibrierfunktionen einzelner Wirkstoffe nach Mandel F-Test undBestimmtheitsma R2 ...........................................................................................................56

Tabelle 18: Nachweis- und Bestimmungsgrenze nach DIN 32645 .......................................57

Tabelle 19: Wiederholprzision RSDrund Laborprzision RSDwR in % .................................59

Tabelle 20: Wiederfindungsrate in % bei niedrigen Konzentrationen ....................................62

Tabelle 21: Wiederfindungsrate in % bei hohen Konzentrationen .........................................62

Tabelle 22: WFR Milchextraktion in % - Methodenvergleich (n=3) ........................................92Tabelle 23: WFR Milchextraktion in % - Vergleich SPE-Sulen (n=3) ...................................93

Tabelle 24: WFR Wasserextraktion in % - Vergleich SPE-Sulen (n=3) ...............................93


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Abkrzungsverzeichnis

x


a Achsenabschnitt

Irrtumwahrscheinlichkeit

ACN Acetonitril

AM Azithromycin

amu Atomare Masseneinheit (atomic mass unit)

APCI Chemische Ionisation unter Atmosphrendruck (atmospheric pressure

chemical ionization)

API Ionisation unter Atmosphrendruck (atmospheric pressure ionization)

b Steigung

Massenkonzentration

BG Bestimmungsgrenze

c Konzentration

CAP Chloramphenicol

CC Entscheidungsgrenze (decision limit)

CC Nachweisvermgen (detection capability)

CE Kollisionsenergie (collision energy)

CEFT Ceftiofur

CM Clarithromycin

CV Cone Voltage

CVMP Committee for Veterinary Medicinal Products

CXP Zellausgangsspannung (cell exit potential)

DC Doxycyclin

EG Europische Gemeinschaft

EI ElektronenstoionisationEM Erythromycin

EMEA Europische Arzneimittelagentur (European Agency for the Evaluation

of Medicinal Products)

ESI Elektrospray-Ionisation

EU Europische Union

EWG Europische Wirtschaftsgemeinschaft

Extr. ExtraktF Faktor


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xi

FAO Food and Agriculture Organization

GefstoffV Gefahrstoffverordnung

HPLC Hochleistungsflssigkeitschromatographie

ISTD Interner StandardJECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives

kg Kilogramm

Konz. Konzentration

L Liter

LC Flssigchromatographie(liquid chromatography)

g Mikrogramm

m Masseml Milliliter

m/z Masse zu Ladung - Verhltnis

max. maximal

MeOH Methanol

min Minute

MRL maximale Rckstandshchstmengen (maximum residue limits)

MRM multiple reaction monitoring

MS Massenspektrometrie / Massenspektrometer

MS/MS Tandem-Massenspektrometrie / -Massenspektrometer

MW Mittelwert

ni Anzahl Bestimmungen an einer Probe, Anzahl der Proben

NWG Nachweisgrenze

n.n. nicht nachweisbar

p.a. zur Analyse (pro analysis)

ng Nanogramm

P Wahrscheinlichkeit

PE Polyethylen

Pen G Penicillin G

ppm parts per million (1:106)

ppb parts per billion (1:109)

ppt parts per trillion (1:1012)

Q1 Quadrupol 1

q2 Quadrupol 2 (Kollisionszelle)


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xii

Q3 Quadrupol 3

R2 Bestimmtheitsma

RL Richtlinie

RP Umkehrphase (reversed phase)rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

RSD relative Standardabweichung (relative standard deviation)

RSDr Wiederholprzision (repeatability)

RSDwR Laborprzision (within-laboratory reproducibility)

RT Retentionszeit (retention time)

SD Standardabweichung (standard deviation)

SMTX SulfamethoxazolSPE Festphasenextraktion (solid phase extraction)

STD Standard

t Zeit (time)

TC Tetracyclin

TCA Trichloressigsure

TIC total ion current chromatogram

TMP Trimethoprim

TYL Tylosin

U Umdrehung

UV ultraviolet

V Volumen

v/v Volumen pro Volumen (volume per volume)

VE voll entsalzt

VK Variationskoeffizient

WFR Wiederfindungsrate

WHO World Health Organization

XIC Extracted-ion chromatogram

z Ladung eines Ions


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Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 Problemstellung

Im Vergleich zu den anderen pharmazeutischen Wirkstoffgruppen wie Hormone,

Analgetika, Vitamine u. v. m. werden Antibiotika mit 70 % am hufigsten in der

Veterinrmedizin eingesetzt, um Krankheiten vorzubeugen und kranke Tiere zu

behandeln. Vor allem werden Antibiotika der Klassen Tetracycline, Sulfonamide,

Aminoglykoside, -Lactame sowie Makrolide verschrieben [RDER, 2007].

Lebensmittel, die von behandelten Tieren stammen wie z. B. Milch, knnen daher

Antibiotikarckstnde enthalten. Laut BVL Jahresbericht zum NationalenRckstandskontrollplan im Jahr 2012 wurde Penicillin G (Benzylpenicillin) in einer

von 404 untersuchten Milchproben mit einem Gehalt von 10,9 g/kg nachgewiesen,

wobei der zugelassene Rckstandshchstgehalt 4 g/kg betrgt [BVL, 2012].

Auch in den Ausscheidungen behandelter Tiere sind Antibiotikarckstnde

nachweisbar. Durch das Ausbringen von Glle und Mist knnen diese Rckstnde

auf Oberflchengewsser gelangen, welche fr die Herstellung von Trinkwasser

verwendet und/oder von den Pflanzen aufgenommen werden. Es ist somit

auszuschlieen, dass der Transfer dieser Wirkstoffe in pflanzliche Lebensmittel

generell mglich ist. Nach einer Literaturstudie des Bundesinstitutes fr

Risikobewertung (BfR) wurden in 13 verschiedenen pflanzlichen Matrizen positive

Befunde von 22 pharmakologischen Wirkstoffen oberhalb der jeweiligen analytischen

Bestimmungsgrenzen nachgewiesen, wobei es sich bei dem Groteil der Wirkstoffe

um Antibiotika handelt [BFR, 2011].

Antibiotikarckstnde knnen problematisch sein, da diese das

Fermentationswachstum von Mikroorganismen verlangsamen oder zerstren sowie

allergische Reaktionen bei berempfindlichen Menschen hervorrufen knnen.

Verschiedene Studien haben auch gezeigt, dass diese Low-Level-Dosen von

Antibiotika ber lngere Zeit zu Bakterienresistenzen fhren [MARTNEZ-HUELAMO et

al., 2009].


15/106

Einleitung

2

Aus der tierischen und menschlichen Sicht sind eine verantwortungsvolle

Verwendung von Antibiotika in Tieren sowie die dafr innerhalb der Europischen

Union durchgefhrten berwachungsprogramme von groer Bedeutung. Im Hinblick

auf den Nachweis von Antibiotika in Milch und Milchprodukten sowohl fr die

Qualittskontrolle als auch fr regulatorische Zwecke, kommt ein umfangreiches Feld

von Analysenmethoden mit mikrobiologischen Testverfahren, (schnellen)

immunchemischen Tests oder instrumentellen Methoden (d. h. LC-MS/MS) zum

Einsatz. Jede Analysenmethode hat ihre eigene Strke und Einschrnkungen.

Im nchsten Kapitel wird der Einsatz von Antibiotika in Tieren, gefolgt mit einer

Vorstellung der geregelten Rckstandshchstmengen gem der Verordnung (EG)

Nr. 37/2010, sowie die fr die Antibiotikaanalyse verwendete Methode mit denAnforderungen der EU bezglich der Analyse von Tierarzneimittelrckstnden

gem der Kommissionsentscheidung Nr. 2002/657/EG, die die Kriterien fr die

Durchfhrung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen zur

Umsetzung der Richtlinie 96/23/EC ber Manahmen zur Kontrolle bestimmter Stoffe

und ihrer Rckstnde in lebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen definiert,

beschrieben.

1.2 Zielsetzung

In der Verordnung (EG) Nr. 37/2010 sind fr Antibiotika Hchstmengen (MRLs)

festgesetzt. Somit sollte eine sichere Kontrolle fr diese Wirkstoffe durch eine

validierte, leistungsfhige analytische Methode gewhrleistet werden.

Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, eine LC-MS/MS-Multimethode fr die

Bestimmung von elf Antibiotika aus sechs verschiedenen Wirkstoff-Gruppen: -

Lactame (Penicillin G und Ceftiofur), Makrolide (Azithromycin, Clarithromycin,

Erythromycin und Tylosin), Tetracyline (Tetracyclin, Doxycyclin), Sulfamethoxazol,

Trimethoprim und Chloramphenicol in Milch sowie in Trinkwasser zu entwickeln.

Diese Multimethode soll in der Lage sein, diese Wirkstoffe gleichzeitig zu extrahieren

und dann simultan in einem chromatographischen Lauf massenspektrometrisch zu

besttigen und zu quantifizieren.


16/106

Einleitung

3

Ein weiteres Ziel war, die entwickelte Methode fr Milch zu validieren. Die

Validierung sollte den gesetzlichen Anforderungen der Kommissionsentscheidung

2002/657/EG entsprechen. Die Umsetzung erfolgte mit dem Programm VALISTAT,

angepasst durch GTFCh. Als Validierungsparameter werden Selektivitt (Spezifitt),

Arbeitsbereich, Linearitt, Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Przision, Richtigkeit,

Stabilitt und Matrix-Effekte untersucht.


17/106

Theoretischer Teil

4

2. Theoretischer Teil

2.1 Antibiotika

2.1.1 Einleitung

Antibiotika werden von Pilzen oder Bakterien produziert. Durch seine

bakteriostatische oder bakterizide Wirkung kann Antibiotika das Wachstum von

Bakterien hemmen oder diese abtten [LSCHER, 2010].

Nach GRFE werden Antibiotika nach Herkunft, biologischer Wirkung, chemischer

Struktur, Biosyntheseweg sowie Wirkmechanismus klassifiziert [GRFE,1992]. In der

vorliegenden Arbeit ist zur Entwicklung einer analytischen Methode zur

Untersuchung von Antibiotika die Klassifizierung nach chemischer Struktur von

groer Bedeutung. Von KROKER et al. (Veterinrmedizinische Fakultt, Freie

Universitt Berlin) wird eine Klassifizierung nach chemischer Struktur in 13 Gruppen

genannt [KROKERet al., 2002]:

1. Beta-Lactame2. Aminoglykoside

3. Tetracycline

4. Makrolide

5. Lincosamide

6. Polypeptidantibiotika

7. Amphenicole

8. Pleuromutiline9. Sulfonamide

10. Trimethoprim

11. Nitrofurane

12. Nitroimidazole

13. 4-Chinolone (Gyrasehemmer)


18/106

Theoretischer Teil

5

Die meisten Antibiotika sind amphotere und polare Substanzen [RDER, 2007]. In

dieser Arbeit werden jedoch nur die sechs zu untersuchenden Antibiotikagruppen

ber ihre chemischen Strukturen und Eigenschaften diskutiert.

2.1.2 Untersuchte Antibiotika

2.1.2.1 -Lactame

Charakteristisch fr alle -Lactam-Antibiotika ist der viergliedrige -Lactam-Ring

[CLARK,2006]. Zu -Lactam-Antibiotika gehren zwei Untergruppen Penicilline (aus

6-Aminopenicillansure) und Cephalosporine (aus 7-Aminocephalosporansure),

[MARTNEZ-HUELAMO et al., 2009], die in der Veterinrmedizin hauptschlich

eingesetzt werden [QUANDT, 2006].

In dieser Arbeit werden zwei Wirkstoffe dieser Familie untersucht, und zwar Penicillin

G (Benzylpenicillin) als Vertreter der Penicilline und Ceftiofur aus der Untergruppe

Cephalosporine.

Abbildung 1: Chemische Struktur von Penicillin G und Ceftiofur nach KROKERet al.[2002]

2.1.2.2 Tetracycline

Das fr alle Tetracycline charakteristische viergliedrige Ringsystem (sog. Tetracen)

hat zur Namensgebung dieser Antibiotikagruppe gefhrt [ALTHAUSet al., 2013]. An

die vier linear kondensierten 6er-Ringe sind verschiedene funktionelle Gruppen


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Theoretischer Teil

6

angehngt. Fr Tetracycline gilt eine hohe Affinitt zu zwei- und dreiwertigen

Kationen (Ca2+, Mg2+, Fe3+) unter der Bildung von nicht resorbierbaren

Chelatkomplexen. Tetracycline sind typische Vertreter von Breitbandantibiotika

[SATTELBERGERet al., 2005]. Nach einer Studie der FEDESA (European Federation

of Animal Health) in 1997 waren Tetracycline in der EU mit 66 % die am hufigsten

eingesetzten Veterinrantibiotika [STEINBERG et al., 2003]. In dieser Arbeit werden

zwei Mitglieder dieser Gruppe untersucht, und zwar Tetracyclin und Doxycyclin. Ihre

chemischen Strukturen werden nach KROKER et al. in der folgenden Abbildung

dargestellt.

Abbildung 2: Chemische Struktur von Tetracyclin und Doxycyclin nach KROKERet al.[2002]

2.1.2.3 Makrolide

Nach der Studie der FEDESA im Jahr 1997 stellen die Makrolide mit 12 % die nach

den Tetracyclinen am hufigsten genutzte Antibiotika-Gruppe in der

Veterinrmedizin dar [STEINBERG et al., 2003].

Makrolide bestehen aus einem 14- bis 16-gliedrigen Laktonring, wonach diese

Klasse in drei Untergruppen unterteilt wird. An ein bis drei Stellen ist der Laktonring

an glykosidisch gebundenen Amino- oder Neutralzuckern gebunden. Dadurch

erhalten Makrolide einen basischen Charakter und sind im sauren Milieu sehr

instabil. [FREY, 2007]


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Theoretischer Teil

7

Erythromycin ist der erste Vertreter der Makrolid-Antibiotika und wurde 1952 aus

Streptomyces erythreus isoliert [QUANDT, 2006]. Mittlerweile werden Makrolide

ausgehend von dieser Grundstruktur halb- oder vollsynthetisch hergestellt.

Zustzlich ist Ester- und Salzbildung mglich [KROKER et al., 2002].

In der Veterinrmedizin werden Makrolide wie Erythromycin und Tylosin

beispielsweise zur Therapie von Atemwegserkrankungen angewendet, wobei

Azithromycin und Clarithromycin in der Humanmedizin zum Einsatz kommen [FREY,

2007].

In der folgenden Abbildung werden die chemischen Strukturen der in dieser Arbeit

vier zu untersuchenden Makrolid-Antibiotika gezeigt.

Abbildung 3: Chemische Struktur von Azithromycin, Clarithromycin, Erythromycin,Tylosin nach KROKERet al. [2002] und OGACH [2006]


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Theoretischer Teil

8

2.1.2.4 Trimethoprim

Trimethoprim ist ein Derivat des 2,4-Diaminopyrimidins. Es handelt sich hierbei um

einen Antimetaboliten des Folsurestoffwechsels [QUANDT, 2006].

In der Veterinrmedizin wird Trimethoprim hufig in Kombination mit Sulfonamiden

eingesetzt [QUANDT, 2006]. Durch die Kombination verschiedener Sulfonamide mit

Trimethoprim kann eine Potenzierung der Solfonamideffekte und damit eine

Steigerung der antimikrobiellen Wirksamkeit dieser Substanzen erreicht werden

[KROKERet al., 2002].

Abbildung 4: Chemische Struktur von Trimethoprim [www.sigmaaldrich.com]

2.1.2.5 Sulfonamide

Damals waren Sulfonamide die wichtigsten Antibiotika, bevor Penicillin eingefhrt

wurde. Die Bezeichnung Sulfonamid wird in der organischen Chemie fr alle Amide

aromatischer Sulfonsuren verwendet. Sie werden rein synthetisch aus dem

Grundgerst Sulfanilamid hergestellt. [QUANDT, 2006]

Laut der FEDESA-Studie im Jahr 1997 kamen in der Veterinrmedizin europaweit

nur 2,1 % Sulfonamide einschlielich Trimethoprim zum Einsatz. Zu den in derVeterinrmedizin hufig eingesetzten Sulfonamiden gehrt auch der Wirkstoff

Sulfamethoxazol, welcher in der vorliegenden Arbeit untersucht werden soll.

Die chemische Struktur von Sulfamethoxazol wird in der folgenden Abbildung

dargestellt.


22/106

Theoretischer Teil

9

Abbildung 5: Chemische Struktur von Sulfamethoxazol nach KROKERet al. [2002]

2.1.2.6 Amphenicole

Amphenicole ist eine Antibiotikagruppe mit einer Phenylpropanoide-Struktur. Der

bekannteste Stoff dieser Gruppe ist Chloramphenicol [STEINBERGet al., 2003]. ImMolekl findet man zwei fr Naturstoffe ungewhnliche Gruppen: eine aromatische

Nitrogruppe und einen Dichloroacetamido-Rest. Innerhalb der EU ist seit 1994 die

Anwendung von Chloramphenicol bei lebensmittelliefernden Tieren verboten

[BALTES UND MATISSEK, 2011]. Jedoch gab es trotz des Verbots noch ein Zeichen,

dass dieser Stoff immer noch eingesetzt wurde. Nach der Durchfhrung des

nationalen Rckstandskontrollplans im Erzeugerbetrieb wurden im Jahr 1999

positive Befunde in vier von 878 Proben beim Kalb, zwei von 1215 Proben beimMastrind und einer von 181 Proben bei Khen nachgewiesen [STEINBERG et al.,

2003].

Abbildung 6: Chemische Struktur von Chloramphenicol [www.gbiosciences.com]

2.1.3 Chemische Eigenschaften und Stabilitt untersuchter Antibiotika

Die Entwicklung einer praktikablen Analysenmethode, welche gleichzeitig

verschiedene Antibiotika analysieren kann, ist durch unterschiedliche physikalische


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Theoretischer Teil

10

und chemische Eigenschaften einzelner Antibiotika eine groe Herausforderung.

Beispielsweise haben Antibiotika einen breiten Umfang von pKs-Werten, z. B. 7,59

bei Makroliden, 3 4, 7 8 und 9 10 bei Tetracyclinen. Daher ist es wichtig, ein

richtiges Gleichgewicht von analytischen Bedingungen, insbesondere der

physikalisch-chemischen Eigenschaften zu bercksichtigen und zu definieren. Dazu

zhlen die Lslichkeit, pK-Werte, chemische und thermische Stabilitt sowie die

Polaritt. [WANG et al., 2012]

-Lactamesind empfindlich gegenber Suren und Basen und diese Empfindlichkeit

variiert je nach Seitenkette. Im sauren Milieu des Magens sind sie stabil [ALTHAUSet

al., 2005]. Bei einer monobasischen Verbindung wie Penicillin G liegt die maximale

Stabilitt im pH-Bereich 67 [WANGet al., 2012].

Makroliden sind einfache und lipophile makrocyclischen Lactone, die in Wasser

wenig lslich, aber in organischen Lsungsmitteln gut lslich sind. Im Allgemeinen

sind neutrale oder leicht basische Bedingungen gewhlt, um Makrolide zu

extrahieren. Somit wird der Abbau von einigen Mitgliedern dieser Gruppe, wie

Erythromycin, das in einer sauren Umgebung abgebaut werden kann, vermieden.

[WANGet al., 2012]

Tetracycline knnen unter extremen pH-Werten mit starken Suren sowie Basen

durch Epimerisierung (im Bereich pH 2 6), Dehydrierung, Isomerisierung und

andere Prozesse abgebaut werden [HU Berlin].

Ein pH-Wert von 4 wurde am hufigsten fr die Extraktion von Tetracyclinen aus

verschiedenen Matrizen gewhlt. Es gibt eine Tendenz der Tetracycline zur Bildung

von Chelatkomplexen mit Metallionen, welche mit Matrixkompenenten binden und zu

Problemen bei der Analyse fhren knnen. [WANGet al., 2012]

Chloramphenicolist eine hochpolare, stabile Verbindung, welche in der Regel sich

unter neutralen Bedingungen in wssrigen Pufferlsungen und/oder polaren

organischen Lsungsmitteln extrahieren lsst [WANGet al., 2012].

Die genaueren pK-Werte der untersuchten Antibiotika sind in der Tabelle 1 zu finden.


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Theoretischer Teil

11

Tabelle 1: pK-Werte untersuchter Antibiotika [WANGet al., 2012]

Antibiotika-

klasseWirkstoff pK-Werte

Beta-Lactame Penicillin G 2,7Ceftiofur n/a

Makroliden

Azithromycin8,7

9,5

Clarithromycin 8,99

Erythromycin 8,6

Tylosin 7,7

Tetracyclinen

Tetracyclin

3,3

7,7

9,7

Doxycyclin

3,2

7,6

8,9

11,5

Sulfonamide Sulfamethoxazol 5,6

Diaminopyrimidin-

derivate Trimethoprim 6,6

Amphenicol Chloramphenicol n/a


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Theoretischer Teil

12

2.2 Antibiotikarckstnde

2.2.1 Antibiotikarckstnde in Milch

Milchproduzierende Khe, die mit Antibiotika behandelt werden, produzieren Milch,

die Antibiotikarckstnde enthlt. Daher sollten behandelte Khe fr einen

bestimmten Zeitraum von der Milchversorgung ausgeschlossen werden, um

sicherzustellen, dass die Antibiotikarckstnde in ihrer Milch nicht mehr bleiben.

Management-Fehler nach medikamentser Behandlung von Khen sind also der

Hauptgrund, der Antibiotikarckstnde in Milch verursacht [KNAPPSTEIN et. al.,2004].

Es gibt viele Wege fr das Entstehen von Antibiotikarckstnden in Milch. Dabei wird

zwischen sekretorischer und postsekretorischer Kontamination der Milch

unterschieden.

Unter sekretorischer Kontamination wird das Gelangen von Antibiotika ber den

Stoffwechsel des Tieres in die Milch verstanden. Sie ist u. a. abhngig von der

Resorption, Fettlslichkeit und Persistenz in den verschiedenen Organsystemen

[TPEL, 2004]. Als die hufigste Ursache ist es, dass die Wartezeit nachAntibiotikabehandlung unabsichtlich nicht eingehalten wurde: z. B. keine richtige

Kennzeichnung, so dass dies zu Verwechslungen fhrt [BAUMGARTNER, 2008]. Bei

unsachgemer Anwendung von Arzneimitteln, wie z. B. berdosierung kann es

ebenfalls zu einer Kontamination kommen, da Wartezeiten nur fr die jeweilige

zugelassene Anwendungsart und Dosierung gelten.

Auch die Ftterung von Antibiotika-haltigem Futter fhrt zu Antibiotikarckstnden in

Milch [TPEL,2004].

Jedoch erfolgt die Kontamination der Tankmilch in ber 50 % der Flle erst nach

dem Melken (postsekretorische Kontamination). Als Ursache dafr sind u. a. falsche

Melkreihenfolge (d. h. die behandelten Khe werden nicht zuerst gemolken),

kontaminiertes Melkgeschirr, ungengende Zwischenreinigung von Leitungen bzw.

Oberflche oder Kontamination von Antibiotika ber Melkpersonal (kontaminierte

Hnde). [BREMUS, 2012]


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Theoretischer Teil

13

2.2.2 Antibiotikarckstnde in Wasser

Veterinrantibiotika knnen in erster Linie auf landwirtschaftlich genutzte Bden

gelangen [RDER, 2007], whrend Humanpharmazeutika im Gegensatz dazu nach

therapeutischer Anwendung von Medikamenten, aber auch durch unsachgeme

Entsorgung unverbrauchter Arzneimittel ber die Toilette in kommunale Abwsser

gelangen knnen [RNNEFAHRTet al., 2012].

Wirkstoffe, die in der Klranlage ungengend zurckgehalten oder abgebaut werden,

knnen in Oberflchengewsser, vor allem in Flsse, bergehen.

Trinkwasserbrunnen, die sich in unmittelbarer Nhe zu Flssen befinden, knnen

einen erheblichen Anteil von Wasser aus diesen Gewssern frdern (sogenanntes

Uferfiltrat). Das Wasser wird zwar filtriert und biologisch gereinigt, aber es ist

mglich, dass Wirkstoffe aus den Oberflchengewssern bis in die

Trinkwasserbrunnen gelangen. [LFUBAYERN, 2010]

Abbildung 7: Eintragspfade fr Arzneimittel in die aquatische Umwelt [TRK, 2007]


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Theoretischer Teil

14

Laut der Publikation des Umweltbundesamtes aus dem Jahr 2011 wurden

deutschlandweit 51 Einzelwirkstoffe im Trinkwasser untersucht, wobei 23 davon

positiv waren [BERGMANNet al., 2011]. In einem Risiko-Untersuchungsprogramm des

bayerischen Landesamtes fr Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL) im Jahr

2007 waren in fnf der insgesamt 84 untersuchten Trinkwasserproben, die aus

oberflchenwasserbeeinflussten Wasserversorgungsanlagen in Bayern stammen,

Rckstnde von Sulfamethoxazol mit Konzentrationen zwischen 0,019 und 0,056

g/L feststellbar. [LFUBAYERN, 2010]

Jedoch gibt es fr Arzneimittel weder national noch international gesetzlich

festgelegte Trinkwasser-Grenzwerte. Gem 6 Abs. 1 TrinkwV 2001 drfen im

Wasser fr den menschlichen Gebrauch chemische Stoffe, also auch Arzneistoffe,nicht in gesundheitsschdlichen Konzentrationen enthalten sein [TRINKWV, 2001].

Deshalb ist es notwendig, eine Aussage ber gesundheitliche Wirkung mit Hilfe der

ADI-Werte oder anderer gesundheitlicher Leitwerte z. B. aus anderen Institutionen zu

bilden.

2.2.3 Risiken und Auswirkungen

Durch die Konsumption von Milch und Milchprodukten sowie anderen

Lebensmittelprodukten, die mit Antibiotikarckstnden kontaminiert sind, ist

insbesondere bei berempfindlichen Menschen die Auslsung von Allergien als

bedeutsames toxikologisches Risiko anzusehen. Bis heute gelten noch die -

Lactam-Antibiotika, vor allem Penicilline, als die Hauptursache fr die allergischen

Reaktionen [TORRES et. al., 2003]. Darber hinaus werden allergische Reaktionen

auf Tetracyclinen und Makroliden nach dem Konsum von Lebensmitteln, die mit

Antibiotikarckstnden belastet sind, berichtet [WOODWARD, 1991].

Reaktionen auf die Aufnahme von Antibiotika knnen sofort oder spter kommen,

wobei als mgliche klinische Symptome z. B. mehr oder weniger schwere

Hautreaktionen, aber auch anaphylaktischer Schock sein knnen [WOODWARD, 1991;

BLANCAet. al. 2002].


28/106

Theoretischer Teil

15

Ein weiteres Risiko ist das zunehmende Auftreten bakterieller Resistenzen.So wird

eine Therapie von Patienten, die mit antibiotikaresistenten Bakterien infiziert worden

sind, sehr schwierig und sogar unmglich. Laut Schtzungen der

Weltgesundheitsorganisation (WHO) ist jhrlich etwa ein Drittel aller Todesflle auf

Infektionen zurckzufhren. Die Aufnahme von bereits resistenten Bakterien ber

tierische Lebensmittel oder der Austausch von Resistenzgenen zwischen nicht

pathogenen Bakterien und Krankheitserreger stellen groe Risiken dar. Die zwischen

Mensch und Tier bertragbaren Krankheiten (Zoonosen) sind wegen ihrer schlechten

Therapierbarkeit ein besonderes Risiko, wie zum Beispiel Darminfektionen durch

Salmonellen. [MICHEL, 2010]

Hinsichtlich der Milchverarbeitungsbetriebe gibt es technologische Probleme bzw.Risiken, die durch kontaminierte Milch hervorgerufen werden knnen. Die

Rckstnde in der kontaminierten Milch knnen die fr Fermentation bentigten

Milchsurebakterien abtten, so dass dies zu Verlusten bei der Herstellung von

fermentierten Milchprodukten wie Joghurt, Kse, Butter und Sauermilcherzeugnissen

fhren kann [QUANDT,2006].

2.3 Rechtliche Rahmenbedingungen

2.3.1 Gesetzlich festgelegte Rckstandshchstmengen

Die Rckstandsfreiheit von Milch wird schon seit langem gefordert. Im LMBG

(Lebensmittel- und Bedarfsgegenstndegesetz) in der Fassung von 1974, wird aus

Grnden des Verbraucherschutzes die weitgehende Rckstandsfreiheit von

Lebensmitteln gefordert. Da eine absolute Rckstandsfreiheit unter Bercksichtigung

der Mglichkeiten der modernen Rckstandsanalytik bei behandelten Tieren kaumerreicht werden kann, muss bei der Beurteilung zwischen akzeptablen und nicht

akzeptablen Rckstnden unterschieden werden.

Im Jahr 1990 wurden in der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 sog. MRL-Werte

(Maximum Residue Limit bzw. Rckstandshchstmengen) definiert [HEESCHEN,

2010]. Nach ber 20 Jahren wurde diese Verordnung 2009 durch die EU -

Rckstandshchstmengen-Verordnung VO (EG) Nr. 470/2009 ersetzt, die seit


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Theoretischer Teil

16

Februar 2010 durch die Verordnung (EU) Nr. 37/2010 ergnzt wird. In dieser

Verordnung sind alle MRL-Werte pharmazeutisch wirksamer Substanzen, welche in

der Verordnung (EG) Nr. 470/2009 zugelassen sind, je nach Art der tierischen

Lebensmittelprodukte geregelt.

Tabelle 2: Festgelegte Rckstandshchstmengen in Milch in g/kg nach derVerordnung (EG) Nr. 37/2010

Antibiotikaklasse WirkstoffMRL in Milch

[g/kg]

Beta-LactameBenzylpenicillin (Penicillin G) 4

Ceftiofur 100

Makroliden

Azithromycin -

Clarithromycin -

Erythromycin 40

Tylosin 50

TetracyclinenTetracyclin 100

Doxycyclin -

Sulfonamide Sulfamethoxazol -

Diaminopyrimidin Trimethoprim 50

Amphenicol Chloramphenicol nicht zugelassen

Die MRL-Werte sind aus den Anhngen der ehemaligen VO 2377/90 beibehalten,

jedoch in neuer Sortierung aufgefhrt. Unterschieden wird in zulssige Stoffe

(Tabelle 1 der Verordnung) und verboteneStoffe (Tabelle 2 der Verordnung).

Diese Regelungen werden auch im LFGB (Lebensmittel- und

Futtermittelgesetzbuch), 10, aufgegriffen. Demnach ist es verboten, tierische

Lebensmittel in den Verkehr zu bringen, wenn Tierarzneimittel mit

Anwendungsverbot eingesetzt wurden, Hchstmengen berschritten wurden oder

festgelegte Wartezeiten nicht eingehalten wurden.

Demzufolge wird ein Antibiotika-haltiges Produkt bei berschreitung des jeweiligen

MRL-Werts (also konzentrationsabhngig) unter lebensmittelrechtlichen Aspekten als

nicht verkehrsfhig beurteilt.


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Theoretischer Teil

17

2.3.2 ADI-Werte (Acceptable Daily Intake)

Bei der Festlegung von Rckstandshchstmengen bzw. MRL fr Antibiotika wird sog.

mikrobiologischer ADI-Wert (Acceptable Daily Intake) verwendet [EMEA/CVMP,

2002]. Zum Beispiel fr Trinkwasserprobe, wobei keine festgelegten

Rckstandshchstmengen vorhanden sind, knnen zur Beurteilung des

regelmigen tglichen Trinkwassergebrauchs ADI-Werte verwendet werden. Der

ADI-Wert wird in der Einheit mg pro Kilogramm Krpergewicht [mg/kg KG]

angegeben.

In der folgenden Tabelle werden vorhandene ADI-Werte in g/kg KG/Tag fr die

untersuchten Wirkstoffe nach dem Expertengremium der JECFA (Joint FAO/WHO

Expert Committee of Food Additives) sowie nach CVMP (Committee for Medicinal

Products for Veterinary Use)/EMEA (European Medicines Agency) dargestellt.

Tabelle 3: Aktuelle vorhandene ADI-Werte verschiedener Antibiotika nach JECFAsowie nach CVMP/EMEA in g/kg KG [http://www.ema.europa.eu/ema/],[http://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/]

WirkstoffADI [g/kg KG/Tag]

nach JECFA

ADI [g/kg KG/Tag]

nach CVMP/EMEA

Ceftiofur 50 2

Penicillin G 30 /

Erythromycin 0,7 5

Tylosin 30 6

Tetracyclin 30 3

Doxycyclin / 3

Trimethoprim / 4,2
http://www.ema.europa.eu/ema/http://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/search.aspxhttp://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/search.aspxhttp://www.ema.europa.eu/ema/


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Theoretischer Teil

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Sollte kein ADI-Wert fr den untersuchten Wirkstoff vorhanden sein, kann aus den

verfgbaren toxikologischen Daten von verschiedenen Institutionen ein

gesundheitlicher Leitwert fr Trinkwasser abgeleitet werden. Wenn die gefundenen

Konzentrationen unter dem Leitwert liegen, kann ausgeschlossen werden, dass vom

lebenslangen tglichen Gebrauch des Trinkwassers eine Gesundheitsschdigung

ausgeht. Die Anforderung des 6 Abs. 1 der TrinkwV 2001 ist dann erfllt. [LFU

BAYERN, 2010 ]

2.3.3 Kriterien der analytischen Methoden

Die Kommissionsentscheidung 2002/657/EG definiert die Kriterien fr die

Durchfhrung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen sowie dieallgemeinen Anforderungen hinsichtlich Probenbehandlung, Analysendurchfhrung

sowie Interpretation der Ergebnisse. Das Dokument legt zudem Leistungskriterien fr

Screening- und Besttigungsmethoden fr alle Tierarzneimittelrckstnde gem

Richtlinie 96/23/EG. Fr die quantitative Bestimmung werden in diesem Dokument

die Durchfhrung der Validierung sowie die Anforderungen an die Validierung

beschrieben.

In der Komissionsentscheidung 2003/181/EG werden die gefrderten

Mindestleistungsgrenzen (Minimum Required Performance Limit, MRPL) fr

verbotene Stoffe bzw. Stoffe, fr die keine zulssigen Grenzwerte festgesetzt worden

sind, fr einige Wirkstoffe definiert. Zum Beispiel wird fr Chloramphenicol ein MRPL-

Wert von 0,3 g/kg festgelegt.

2.4 Analytik von Antibiotika

In der modernen instrumentellen Analytik kommt die Kopplung von

Hochleistungsflssigkeitschromatographie an einen Massenspektometer immer

strker zum Einsatz. Diese Methode ist besonders durch die Empfindlichkeit und den

geringen Zeitaufwand fr die Routineanalytik sehr gut geeignet. Auch die Analytik

von Antibiotikarckstnden in Lebensmitteln wurde in den letzten Jahren in sehr

vielen Untersuchungen fast ausschlielich mit LC-MS/MS-Technik durchgefhrt. In

dieser Masterarbeit wurde eine LC-MS/MS-Multimethode mit


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Theoretischer Teil

19

Elektronensprayionisierung (ESI) fr die quantitative Bestimmung von elf

verschiedenen Antibiotika aus sechs verschiedenen Familien entwickelt und validiert.

Neben der LC-Trennung, der ESI-Ionisierung und der massenspektrometrischen

Detektion hat vor allem auch die Probenaufbereitung einen entscheidenden Einfluss

auf die Leistung der Gesamtmethode. In diesem Fall bietet sich die

Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE) als zuverlssige

Extraktionsmethode an, wobei in der Regel organische Stoffe auf polymeren

funktionalisierten Adsorbermaterialien bis in den tiefen ng/l-Bereich quantifiziert

werden knnen [SINGERet al., 2009].

Eine Analysenmethode bestehend aus SPE, LC und MS/MS bietet damit im Prinzip

die Mglichkeit, sowohl eine Identifizierung als auch Quantifizierung von Antibiotika

im tiefen Spurenbereich durchzufhren.

2.4.1 Solid-Phase-Extraktion

Die Probenvorbereitung beeinflusst den spteren Analysenschritt mittels LC-MS/MS

und ist daher sehr wichtig fr eindeutige Identifikation und Quantifizierung von

untersuchten Analyten.

Wegen der Komplexitt von Lebensmittelmatrizen sowie der in Lebensmitteln

vorhandenen Kontaminanten ist eine Analyse von Analytverbindungen in sehr

geringem Konzentrationsbereich (ppb bis ppt) fast nur nach Pre-Konzentrierung- und

Aufreinigungsschritten mglich. Somit sind die Analyten besser fr Trennung und

Detektion geeignet. In bioanalytischen Methoden werden oft Flssig-Flssig-

Extraktion (Liquid-Liquid Extraction, LLE) und Festphasenextraktion (Solid Phase

Extraction, SPE) zur Probenvorbereitung verwendet [TRK, 2007, WANGet al., 2012].

In der vorliegenden Arbeit wird die letztere Methode angewendet.

SPE ist derzeit die wichtigste Methode zur Probenaufreinigung und hat langsam LLE

ersetzt. Die Vorteile liegen im Vergleich zur Flssig-Flssig-Extraktionen u. a. in dem

geringeren Lsemittelverbrauch, der geringen Probenmenge, den hheren

Anreicherungsfaktoren und dem geringeren Zeitaufwand [FRITZ UND MACKA,2000].


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Theoretischer Teil

20

Abbildung 8: SPE-Gert mit Vakuum und SPE-Kartuschen unterschiedlicher Formate

[UNIVERSITAT JAUME I,2013/2014]

SPE wird vor allem zur Aufreinigung flssiger Proben verwendet und kann halb-

flchtige oder nicht-flchtige Analyte extrahieren. Zudem dient SPE auch zur

Probenkonzentrierung, z. B. von festen Proben zu Lsungen.

Die Auswahl an Sorbentien ist der wichtigste Faktor in SPE, da dies wichtige

Parameter wie Selektivitt, Affinitt und Kapazitt beeinflussen kann. Die Auswahl

hngt vor allem von den Analyten und ihren physikalisch-chemischen Eigenschaftenab, welche deren Wechselwirkung mit dem verwendeten Sorbent definieren. Die

Arten von SPE-Sorbentien variieren von chemisch gebundenen Kieselsuren, z. B.

C8 und C18 organische Gruppen, bis graphitisiertem Karbon, Ionenaustauscher und

polymeren Verbindungen. [WANGet al., 2012]

In der SPE kommen ausschlielich Sorbentien aus Silika und Polymer oft zum

Einsatz. Fr die Anreicherung verschiedener Antibiotika aus verschiedenen

biologischen Matrices werden meistens Polymermaterialien oder hnliche Ko-

Polymere verwendet [TRK, 2007]. In der vorliegenden Arbeit wird Sorbent aus

Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymere (PS-DVB) verwendet.

Polymeres Sorbent ist im Vergleich zu Silika-Sorbent in breitem pH-Bereich stabiler.

Auerdem enthlt Silika-Sorbent Silanol, welches an einigen Verbindungen, z. B.

Tetracycline, irreversibel binden kann. [WANGet al., 2012]


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Theoretischer Teil

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SPE besteht normalerweise aus drei Schritten, und zwar Konditionieren,

Probenladung und Elution. Ein Aufreinigungsschritt resultiert so, indem strende

bzw. nicht relevante Matrixkomponente wie z. B. Salze nicht extrahiert, und/oder

diese vor dem Elution bei dem Waschschritt von dem Sorbent entfernt werden

knnen.

Abbildung 9: Prinzip der SPE-Methode [UNIVERSITAT JAUME I,2013/2014]

2.4.2 LC-MS/MS-Technik

In verschiedenen Literaturen hat sich die Kopplung der Flssigchromatographie aneinen Massenspektrometer (LC-MS/MS) aufgrund der guten Selektivitt,

Schnelligkeit und Nachweisempfindlichkeit sowie der breiten Erfassbarkeit von

polaren und unpolaren Analyten bei Analysen von verschiedenen Antibiotika als

zuverlssige Methode herausgestellt. Fr die Kopplung kommt ausschlielich die

Ionisierung bei Atmosphrendruck (Atmospheric Pressure Ionization, API)

einschlielich der Elektrospray Ionisation (ESI) und der Ionisierung unter

atmosphrischem Druck (APCI), die sich fr die Analyse vieler umweltrelevanter

Verbindungen bis zu einem m/z-Verhltnis von 4000 amu, von ionischen

Verbindungen bis hin zu PAKs eignet [LBCKE, 2004].

2.4.2.1 Flssigchromatographie

Die Flssigchromatographie (Liquid Chromatography, LC) dient zur Auftrennung von

Stoffen aufgrund ihrer chemischen Struktur. Dabei wird die untersuchende Substanz

zusammen mit dem Laufmittel oder sogenanntes Eluent durch die Trennsule


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Theoretischer Teil

22

gepumpt, welche die stationre Phase enthlt. Die heutzutage am hufigste, auch in

der vorliegenden Arbeit eingesetzte Art der LC ist die

Hochleistungsflssigkeitschromatographie (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC).

Abbildung 10: Aufbauprinzip eines HPLC-Systems [UNIVERSITAT JAUME I,2013/2014]

Es gibt auch viele Varianten der LC, welche von dem Trennprinzip zu unterscheiden

sind.

In den Literaturen bestehen die meisten Methoden zur Untersuchung vonAntibiotika aus flssigkeitschromatographischen Trennungen mit RP-18-Phasen.

In der vorliegenden Arbeit wird daher nur auf die Umkehrphasen-HPLC (Reversed

Phase Liquid Chromatography, RP-LC) eingegangen, wobei das Trennprinzip in

der Verteilung (und Adsorption) liegt. Hierbei sind organische stationre Phasen (z.

B. Alkylketten) an Kieselgelpartikel oder an ein Polymer gebunden, weshalb die

stationre Phase sich im Gegensatz zu den Normalphasen-HPLC (Normal Phase

Liquid Chromatography, NP-LC) unpolar bzw. hydrophob verhlt [ETHZRICH]. Der

Trennmechanismus basiert auf Van-der-Waals-Krften. Je hnlicher der Analyt der

Kohlenwasserstoffkette der Phase ist, umso grer sind seine Wechselwirkungen mit

der Sule [UNIVERSITT WIEN]. Mit zunehmender Kettenlnge werden die Phasen

unpolarer. Fr die LC-MS/MS von Antiobiotikaanalytik werden Octadecyl- bzw. C18-

Ketten als Trgermaterial eingesetzt.


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Theoretischer Teil

23

Abbildung 11: Octadecylsilan (ODS, C18) [CHEMGAPEDIA]

Die meistgeigneten Lsungsmittel fr die RP-LC sind polare Lsungsmittel wie

Wasser, Methanol und Acetonitril, die sich aufgrund ihrer Oberflchenspannung und

Dielektrizittskonstanten gut fr die Elektronensprayionisierung eignen [CACH ET AL.,

2001]. So lassen sich in polaren Lsungsmitteln lsliche Substanzen trennen, was

auf die meisten fr biologische, medizinische, pharmazeutische und

umweltanalytische anwendungsrelevanten Molekle zutrifft [MATISSEK et al., 1992].

2.4.2.2 Tandenmassensp ektrom etrie (MS/MS)

Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren, welches Ionen aufgrund ihres

unterschiedlichen Masse-zu-Ladungs-Verhltnis (m/z) trennt [OHLS, 2010]. Ein

Massenspektrometer besteht im Prinzip aus einem Interface zur Ionenerzeugung,

einem Analysator zur Ionenauftrennung und einem Detektor.

Es gibt verschiedene Ionisierungstechniken, die zum Einsatz finden:

Elektrospray-Ionisation (Electrospray Ionization, ESI)

Ionisierung unter atmosphrischem Druck (Atmospheric Pressure Chemical

Ionization, APCI)

Matrix-untersttzte Laser-Desorption/Ionisation (Matrix-Assisted Laser

Desorption Ionization, MALDI)

Chemische Ionisierung (Chemical Ionization, CI)

Elektronenstoionisation (Electrion Ionization, EI)

Die in dieser Arbeit verwendete Ionisierungstechnik ESI ist eine schonende, sanfte

Ionisierungsmethode, wobei nur geringe bis keine Fragmentierungen entstehen

[GALENSAet al., 1995].

ESI ist eine Zerstubungsmethode, bei der Ionen unter Verwendung von

Hochspannung und bei atmosphrischem Druck direkt aus der flssigen Phase in die

Gasphase berfhrt werden [HO et al., 2003]. Hierbei werden Ionen durch eine

Coulomb-Explosion (Zerfall) erzeugt [MEYER, 2009].


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Theoretischer Teil

24

Abbildung 12: Schematische Darstellung der ESI-Ionisierung[http://penyfan.ugent.be/labo/joelv/Esquire.html]

Zum Auftrennen der Ionen knnen verschiedene Massenanalysatoren eingesetzt

werden. Heute finden z. B. Quadrupole, Ion Trap, Orbitrap und Time-of-Flight

Analysatoren breite Anwendung. In der vorliegenden Arbeit wurden

Massenanalysatoren mit Triple-Quadrupolen verwendet.

Ein Triple-Quadrupol besteht aus vier gleich groen Metallstben, die in einemQuadrat angeordnet sind. An die jeweiligen Stbe werden eine positive bzw.

negative Gleichspannung und gleichzeitig Wechselspannung angelegt, so dass die

jeweils gegenberliegenden Stbe die gleiche Polaritt der Gleichspannung und die

gleiche Phase der Wechselspannung haben [LEHMANN, 1996]. Dadurch knnen nur

Ionen mit einem bestimmten m/z-Verhltnis auf einer stabilen Flugbahn den

Quadrupol passieren und den Detektor erreichen [BUDZIKIEWICZet al., 2003]. Ionen

mit einem anderen m/z-Verhltnis haben somit nicht stabile Flugbahnen und werdenauf die Stbe prallen, so dass sie nicht mit detektiert werden.

2.5 Methodenvalidierung

Fr eine zuverlssige quantitative Bestimmung ist es sehr wichtig, eine geeignete

Prfmethode zu verwenden. Diese Eignung ist im Rahmen einer

Methodenvalidierung zu verifizieren und zu dokumentieren.


38/106

Theoretischer Teil

25

Fr die Validierung von quantitativen Besttigungsmethoden sollten die EU-weit

geltenden Anforderungen im Sinne der Kommissionsentscheidung 2002/657/EG

umgesetzt werden. Entsprechend der Entscheidung kann in dieser Arbeit die

Validierung nach dem herkmmlichen Validierungsansatz durchgefhrt werden.

Die gem der Kommissionsentscheidung zu validierten Prfparameter wie

Spezifitt, Kalibrierkurve (einschlielich Arbeitsbereich und Linearitt), Przision,

laborinterne Reproduzierbarkeit, Richtigkeit (Wiederfindung), Nachweis- und

Bestimmungsgrenze, sowie Stabilitt wurden mit VALISTAT (Prfkriterien nach

GTFCh, Gesellschaft fr Toxikologische und Forensische Chemie) ausgewertet.

Zustzlich werden in dieser Arbeit noch die Matrix-Effekte geprft.

Selektivitt (Spezifizitt)

Eine selektive Methode erfasst direkt interpretierbare Ergebnisse fr alle

interessierenden Wirkstoffe, wohingegen eine spezifische Methode direkt

interpretierbare Ergebnisse fr einen Wirkstoffe erfasst, whrend andere Wirkstoffe

sich gegenseitig stren knnen. Die Selektivitt kann geprft werden, indem die

Richtigkeit der Methode mit einem Standard, der alle denkbaren Matrixkomponente

enthlt, geprft und vergleicht wird und/oder die Analysen- und Messbedingungen

systematisch variiert werden. [KROMIDAS, 2011]

Arbeitsbereich

Zur Festlegung des Arbeits- bzw. Kalibrierbereiches werden die

Rckstandshchstmengen bercksichtigt, um zu schtzen, wie hoch der Analytgehalt

in der Probe sein knnte. Auerdem sollten auch die angeforderten

Mindestleistungsgrenzen (MRPL) nach 2003/181/EG bercksichtigt werden (s.2.3.3). Die intern festgelegte MRPL liegen bei IGV Prflabor bei 0,1*MRL, wobei alle

Kalibrierpunkte quidistant verteilt werden sollen.

Die Anzahl der Konzentrationsniveaus und der Messungen pro Konzentration sollte

sich auf die gesetzlichen Anforderungen beziehen. Im Dokument 2002/657/EG

werden mindestens fnf Konzentrationsniveaus einschlielich Nullpunkt empfohlen.

Fr jedes Niveau sollte nach Richtlinie der GTFCh der Messwert mindestens 6-mal

unter Wiederholbedingungen gemessen werden.


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Theoretischer Teil

26

Linearitt

Die Linearitt einer analytischen Methode ist ihre Fhigkeit, innerhalb eines

gegebenen Bereiches Testergebnisse zu liefern, die direkt proportional zur

Konzentration (Menge des Analyten in der Probe) sind. Mit dem Mandel-F-Test

(Signifikanzniveau: 99 %) wird berprft, ob quadratische Regression eine signifikant

bessere Anpassung als lineare hervorruft. Ist keine Signifikanz gegeben, kann eine

lineare Anpassung verwendet werden [GTFCh, 2009].

Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Bei einer Validierung werden zwei unterschiedliche analytische Grenzen bestimmt.

Die Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) wird fr die qualitative Bestimmung

benutzt, das heit es wird geprft, ob der Wirkstoff in der Probe berhaupt

vorhanden ist. Fr eine quantitative Bestimmung wurde die Bestimmungsgrenze

(Limit of Quantitation, LOQ) bentigt.

Wenn das Analyseergebnis unterhalb der Nachweisgrenze liegt, wird es als nicht

nachweisbar deklariert. Zwischen Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze ist eine

quantitative Aussage noch nicht mglich. Erst wenn die Analysenwerte grer als dieBestimmungsgrenze sind, darf eine quantitative Aussage getroffen werden.

In der Kommissionsentscheidung 2002/657/EG werden die LOD und LOQ mit

Entscheidungsgrenze CCund Nachweisvermgen CC ersetzt. In der vorliegenden

Arbeit werden jedoch lediglich LOD und LOQ bestimmt.

Przision

Unter Przision wird der Grad der Streuung der einzelnen Werte um den Mittelwertverstanden und ist somit ein Ma fr die zuflligen Fehler. Przision wird

normalerweise als Unprzision ausgedruckt und als Standardabweichung (SD)

bzw. relative Standardabweichung (RSD) berechnet. In der Praxis knnen

unterschiedliche Przisionsarten bestimmt werden. Unter Wiederholprzision wird

die Przision verstanden, welche unter Wiederholbedingungen innerhalb kurzer

Zeitabstnde erhalten wird, d. h. unabhngige Ergebnisse mit demselben Verfahren,

Material (Probe), Bearbeiter, Gerten und innerhalb desselben Labors werden


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Theoretischer Teil

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erhalten. Zudem steht die Laborprzision, welche unabhngige Messergebnisse

desselben Materials, innerhalb eines Labors bei bewusster nderung eines

Parameters (z. B. Bearbeiter, Gert, Zeit) liefert. Eine bliche Variante ist die

Bestimmung der tagesverschiedenen Laborprzision, wobei eine Probe an mehreren

aufeinander folgenden Tagen untersucht wird. [KROMIDAS,2011]

Richtigkeit/Wiederfindung

Richtigkeit und Przision werden unter dem Oberbegriff Genauigkeit

zusammengefasst. Unter Richtigkeit wird der Ma fr die Abweichung des

Mittelwertes vom richtigen Wert, dem Soll- bzw. wahrer-Wert aufgrund eines

systematischen Fehlers (Bias), verstanden. [KROMIDAS,2011]

Die berprfung von Richtigkeit kann anhand von Referenzmaterialien erfolgen.

Sollte ein solches Referenzmaterial nicht vorhanden sein, kann die Richtigkeit mittels

Wiederfindung durch Aufstocken einer Leermatrix bestimmt werden [2002/657/EG].

Stabilitt/Robustheit

Die Untersuchung der Stabilitt von Probenlsungen hat einen Einfluss auf die

Verfahrensstabilitt und somit auch auf die Robustheit der Methode. Da die Stabilitt

eines Analyten vom Zeitpunkt der Probenahme bis zum Ende der Analyse

gewhrleistet sein sollte. Hier sind sowohl die Stabilitt von Standardlsungen als

auch von Probenlsungen z. B. durch lange Standzeiten auf dem Autosampler, von

Bedeutung.

Robustheit ist laut 2002/657/EG die Anflligkeit einer Methode gegenber

nderungen in den Versuchsbedingungen. Zur Untersuchung der Robustheit knnenauer der Prfung auf Stabilitt die Variationen der Versuchsbedingungen z. B. pH-

Wert, Temperatur sowie die berprfung der Anwendbarkeit (Wechsel von

Anwender, Gert) sein [KROMIDAS, 2011].

Matrix-Effekte

In der Routineanalytik ist es blich mit einer Lsungsmittelkalibrierung zu arbeiten,

da die Matrixgewinnung zur Verwendung einer Matrixkalibrierung relativ aufwndig


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Theoretischer Teil

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ist. Jedoch knnen das Vorhandensein von Matrix in der Probenmesslsung und

somit die darin enthaltenen nicht-Zielanalyten oder andere strende Substanzen zu

einer Vernderung des Messsignals fhren und damit die Quantifizierung

verflschen. Obwohl die LC-MS/MS Analyte trotz Anwesenheit von Matrix hoch

selektiv messen kann, knnen Matrixeffekte sowohl zu Signalschwankungen (ion

suppression) als auch zu Signalerhhungen (ion enhancement) fhren [BECKER,

2005]. Aus diesen Grnden ist es notwendig zu prfen, dass zwischen

Lsungsmittel- und Matrixkalibrierung keine signifikanten Unterschiede bestehen.


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Material und Methoden

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3. Material und Methoden

3.1 Gerte und sonstige Materialien

3.1.1 Kolbenhubpipetten mit Pipettenspitzen 1-10 l, 10-100 l, 100-1000 l und 2-2,5 ml

3.1.2 15-ml-Polypropylen-Einmal-Zentrifugenrhrchen, mit Schraubverschluss

3.1.3 Zentrifuge 5430R (Eppendorf)

3.1.4 Vortexmischer

3.1.5 pH-Meter

3.1.6 Vials (1,5 ml)

3.1.7 SPE-Gert Agilent Technologies mit Vakuum

3.1.8 SPE-Sule BEKOlutLEOX, 3 ml, 200 mg

3.1.9 LC-MS/MS Gert API 4000 QTRAP (Fa. Applied Biosystems mit HPLCAnlage der Fa. Dionex)

3.1.10 HPLC Sule KinetexC18 (Fa. Phenomenex)

3.2 Chemikalien und Reagenzien

Soweit nicht anders angegeben, wurden analysenreine Chemikalien verwendet. Die

Lsungsmittel waren von hoher Reinheit und fr das LC-MS/MS geeignet.

3.2.1 Lsungsmittel

3.2.1.1 Methanol LC-MS Chromasolv (Fa: Fluka, CAS: 47-56-1)

3.2.1.2 Acetonitril LC-MS Th.Geyer (Fa: J.T. Baker, CAS: 75-05-8)

3.2.1.3 3-fach destilliertes Wasser LC-MS

3.2.2 Chemikalien und Reagenzien

3.2.2.1 Isopropanol fr LC-MS (Fa: Chemsolute, CAS: 67-63-0)

3.2.2.2 Ameisensure 99100 % (Th.Geyer, Fa: Chemsolute, CAS: 64-18-6)

3.2.2.3 Essigsure 99100 %


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3.2.3 Lsungen

3.2.3.1 Extraktionsmittel, Acetonitril:Wasser:Essigsure (10:90:0,1)

100 ml Acetonitril (4.2.1.2) werden mit 900 ml Wasser (3.2.1.3)

gemischt und anschlieend mit 1 ml Essigsure (99 100 %ig)

(3.2.2.3) versetzt.

3.2.3.2 Mobile-Phase-Lsung, Methanol:Wasser (90:10, v/v)

100 ml Wasser (3.2.1.3) werden mit 900 ml Methanol (3.2.1.1)

vermischt.

3.2.3.3 Laufmittel A, 0,1 % Ameisensure in Wasser:

1 ml Ameisensure (99 100 %ig) (3.2.2.2) werden mit Wasser

(3.2.1.3) auf 1000 ml verdnnt.

3.2.3.4 Laufmittel B, 0,1 % Ameisensure in Methanol

1 ml Ameisensure (99 100 %ig) (3.2.2.2) werden mit Methanol

(3.2.1.1) auf 1000 ml verdnnt.

3.2.3.5 Kolbensplung fr das LC-MS/MS-Gert10 ml Isopropanol (3.2.2.1) werden mit 190 ml Wasser (3.2.1.3)

vermischt.

3.2.4 Standardlsungen

Zur Herstellung von Standard- und Kalibrierlsungen wurden reine Standards der

Wirkstoffe von der Firma Neochema bezogen. Die Standards wurden in 5 ml

Flaschen geliefert und waren in Acetonitril (MeCN) gelst. Sie wurden bei -18C im

Tiefkhlschrank aufbewahrt. Als interner Standard (ISTD) wurden isotopenmarkierte

Standards Trimethoprim-13C3 (ISTD_pos) sowie Bezafibrate-D4 (ISTD_neg) aus

Universitt Bonn verwendet. Die verwendeten Standardsubstanzen sind in Tabelle 4

aufgelistet.


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Tabelle 4: Standardsubstanzen fr die Validierung

Arzneistoff CAS-Nr. Konzentration [g/ml]

Azithromycin 83905-01-5 100,00

Chloramphenicol 56-75-7 100,00

Ceftiofur 80370-57-6 100,00

Ciproflaxacin 85721-33-1 100,00

Clarithromycin 81103-11-9 100,00

Doxycyclin-monohydrat 17086-28-1 100,00

Erythromycin 114-07-8 100,00

Penicillin G-Ka 113-98-4 100,00

Sulfamethoxazol 723-46-6 100,00Tetracyclin-HCl 64-75-5 100,00

Trimethoprim 738-70-5 100,00

Tylosin-tartrat 74610-55-2 100,00

Trimethoprim-13C3 1189970-95-3 100,00

Bezafibrate-D4 1189452-53-6 100,00

Fr die Matrix-basierte Kalibrierreihe fr Milch sowie zum Aufstocken der Milchprobe

fr Wiederfindungsexperimente wurde ein Mix aus allen Antibiotikastandards

hergestellt. Hierfr wurden die Standardsubstanzen mit MeOH, welches auch als

mobile Phase fr die sptere Messung mit LC-MS/MS diente, je nach Antibiotika auf

eine Endkonzentration von 0,06 g/ml 0,08 g/ml, 0,2 g/ml, 0,8 g/ml, 1 g/ml und 2

g/ml (siehe Tabelle 5) hergestellt. Fr Wasseranalyse wurde ein Mix mit einer

Endkonzentration von 25 g/L hergestellt (siehe Tabelle 6).

Von den internen Standards wurde jeweils eine Standardlsung hergestellt. Diese

Standardlsung wurde sowohl fr die Matrix-Kalibrierung (nur bei Milchanalyse) als

auch fr die Dotierung der Matrix am Beginn der Extraktion verwendet. Fr

Milchanalyse wurden 100 l des ISTD Trimethoprim-13C3 Standards (100 g/ml) bzw.

10 l des ISTD Bezafibrate-D4 Standards (100 g/ml) mit Methanol auf 10 ml

aufgefllt. Dies entspricht einer Konzentration von 1 g/ml (ISTD_pos) bzw. 0,1 g/ml

(ISTD_neg). Fr Wasseranalyse wurden jeweils 50 l des ISTD Standards mit

Methanol auf 10 ml aufgefllt. Dies entspricht einer Konzentration von je 50 g/L(siehe Tabelle 6).


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Tabelle 5: Herstellung der Standardmix fr Milch

Endkonz.(g/ml)

Vol. aus 100 g/mlStandard (l)

Endvolumen(ml)

CEFT, TC 2 200 10TYL, TMP 1 100 10

EM 0,8 80 10

AZI, CM, DC, SMTX 0,2 20 10

PEN G 0,08 8 10

CAP 0,06 6 10

ISTD_pos 1 100 10

ISTD_neg 0,1 10 10

Tabelle 6: Herstellung der Standardmix fr Wasser

Endkonz.(g/L)

Vol. aus 100 g/mlStandard (l)

Endvolumen(ml)

Alle Analyten 25 2,5 10

ISTD_pos 50 5 10

ISTD_neg 50 5 10

3.2.5 Kalibrierreihe

In Tabelle 7 und 8 sind die Konzentrationen der einzelnen Kalibrierpunkte fr Milch-

bzw. Wasseranalyse aufgelistet. Als Lsemittel fr die Kalibrierlsungen fr

Wasseranalyse wurde eine Mischung von 90:10 Methanol:Wasser (3.2.3.2)

verwendet.

Tabelle 7: Herstellung der Kalibrierreihe fr Milch

K0 K1 K2 K3 K4 K5

- 0,1*MRL 0,5*MRL 0,75*MRL 1,0*MRL 1,5*MRL

V Standards-Mix in l 0 5 25 50 75 100

V ISTD pos (1 g/ml) inl

15 15 15 15 15 15

V ISTD neg (0,1 g/ml)

in l 20 20 20 20 20 20Matrix in l 965 960 940 915 890 865


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Endkonzentration ing/L:

CEFT, TC 0 10 50 75 100 150

TYL, TMP 0 5 25 37,5 50 75

EM 0 4 20 30 40 60

AZI*, CM*, DC*, SMTX* 0 1 5 10 15 20

PEN G 0 0,4 2 3 4 6

CAP* 0 0,3 1,5 2,25 3 4,5

ISTD_pos 15 15 15 15 15 15

ISTD_neg 2 2 2 2 2 2

*Wirkstoffe ohne MRL

Tabelle 8: Herstellung der Kalibrierreihe fr Wasser

K0 K1 K2 K3 K4 K5

V Standards-Mix in l 0 1 2 4 8 12

V ISTD pos (50 g/L) inl

2 2 2 2 2 2

V ISTD neg (50 g/L) inl

2 2 2 2 2 2

Lsemittel in l 996 995 994 992 988 984

Endkonzentration ing/L:

Alle Analyten 0 0,025 0,05 0,1 0,2 0,3

ISTD_pos und ISTD_neg 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

3.3 Extraktion und Aufreinigung mittels SPE

In den folgenden Punkten 3.3.1 und 3.3.2 werden die optimierten Methoden (End-

Methoden) fr die Analyse von Antibiotikarckstnden in Milch und Wasser

beschrieben. Die beiden Methoden basieren auf SPE-Applikationen der Firma

BEKOlut, die im Rahmen dieser Arbeit optimiert wurden.

3.3.1 Milchprobe

2,0 0,002 g Milch wurden in ein leeres 15 ml Falkon-Rhrchen eingewogen.

Danach wurden die ISTDs (bzw. auch der Antibiotikastandardmix zur Untersuchung


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der Wiederfindung) zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Minute mit Hilfe des

Vortexmischers homogenisiert und dann 10 Minuten stehen gelassen. 5 ml

Extraktionsmittel (3.2.3.1) wurden in die Milch zugegeben und das Gemisch wurde

15 Sekunden krftig von Hand geschttelt und dann wieder bei Raumtemperatur

stehen gelassen. In dieser Zeit erfolgte bereits eine Phasentrennung. Danach wurde

das Gemisch fr 15 Minuten bei 4000 g zentrifugiert. Der berstand wurde nach dem

Zentrifugieren in ein neue

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Entwicklung und Validierung einer Multimethode zur Bestimmung von Antibiotikarückständen in Milch...

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