This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Uns scheinen nun nach der Auffindung einer senk-recht zur Faserrichtung liegenden Feinstruktur zu-sätzlich zu dem bereits bekannten Fibrillenbau die Widersprüche nicht mehr so unlösbar wie bisher. Ein Einfluß der beschriebenen Querstruktur auf die polarisationsoptischen Eigenschaften des Muskels ist anzunehmen, da ihre Abstände klein sind gegenüber der Wellenlänge des Lichtes.

Wir hätten uns den Muskel optisch als einen kom-binierten Stäbchen-Scheibenmischkörper oder als ein Stäbchenraumgitter vorzustellen, und zwar, wie be-reits erwähnt, in beiden Fällen mit gleichem Aufbau in a 11 e n Muskelabschnitten. Bei dem Stäbchenraum-gitter sind Volumanteil und Brechungsverhältnisse der Stäbchen in der Querrichtung verschieden von denen der Längsrichtung, eine Annahme, die gerecht-fertigt wird durch das verschiedene Aussehen („Färb-barkeit", Schärfe der Randkonturen) und die unter-schiedlichen Dimensionen von Querstruktur und Fibrillen.

Beide Vorstellungen genügen folgendem Deutungs-versuch: Die Isotropie bestimmter Muskelabschnitte ist erklärbar durch gegenseitige Kompensation der Summen aus positiver Formdoppelbrechung der Stäbchen und negativer des Scheibenmischkörpers und den Eigendoppelbrechungen ihrer Teilchen (bis auf 10% positiver Bestdoppelbrechung). Demgegen-über kommt es innerhalb der anisotropen Abschnitte durch die von I verschiedenen BrechungsVerhältnisse

der zwischen Fibrillen und Querstruktur eingelager-ten gelösten Muskelbestandteile zu einer Abschwä-chung der Formdoppelbrechung in beiden Struk-turen. Die positive Doppelbrechung dieser Abschnitte ist infolgedessen die Summe der erhaltenen Eigen-doppelbrechung der beiden optisch aktiven Kompo-nenten, vorausgesetzt, daß die gelöschte Form-doppelbrechung bei ihnen verschieden stark am Zustandekommen der Gesamtdoppelbrechung betei-ligt war.

Diese Vorstellung verlegt die optischen, färberischen und auch elektronenmikroskopisch erfaßbaren Unter-schiede zwischen isotropem und anisotropem Ab-schnitt mithin in die nicht näher definierten, wahr-scheinlich flüssigen Muskelanteile, die in den Maschen des Aktomyosin-„Skeletts" liegen, eine Annahme, die uns zwangsläufig erscheint, da wir nie sichere Form- und Dichteunterschiede im Feinbau der bei-den Muskelhauptabschnitte beobachten konnten und andererseits die höhere Elektronenabsorption der Q-Abschnitte diffus, d. h. durch Substanzen zwi-schen den Grundstrukturen hervorgerufen ist. Für Z und M kann, wie beschrieben, eine Auflagerung der spezifischen Substanz auf die Fibrille direkt beobach-tet werden.

Es ist somit möglich, die optischen Eigenschaften des Muskels ohne Annahme grundsätzlicher Ver-schiedenheiten im Bauplan seiner Abschnitte zu er-klären.

Einige Beobachtungen

über das Verhalten penicillin-resistenter Mikroorganismen0

V o n K A R L I R R G A N G * * , H . M Ä R A u n d H I L D E S A C H S

(Z. Naturforschg. 5b , 144—149 [1950]; eingegangen am 15. November 1949)

Eine Anzahl von Mikroorganismen, die zum Großteil aus infizierten Penicillin-Ansätzen bzw. -Testen isoliert worden waren, wurde auf ihre Fähigkeit, Penicillinase zu bilden, unter-sucht. Bei allen Organismen, die sich als penicillin-resistent erwiesen hatten, konnte einwand-frei intra- oder extrazelluläre Penicillinase festgestellt werden. Zum raschen Nachweis der Penicillinase-Bildung von Mikroorganismen werden zwei Kulturmethoden beschrieben.

Die leichte Infektions-Anfälligkeit von Gäransätzen zur Penicillin-Gewinnung veranlaßte uns, die-

sem Problem und damit dem Mechanismus der

° 6. Mitt. der Reihe „Über die Bildung antibiotischer Stoffe durch Mikroorganismen" von K. B e r n h a u e r und Mitarbeitern. Aus dem vormaligen Inst. f. Biochemie und Nahrungsmittelchemie der Deutschen Technischen Hochschule in Prag. Sie behandelt Versuche, die bis zum April 1945 abgeschlossen waren.

Penicillin-fnaktivierung durch Penicillinase1 (im fol-genden P-ase genannt) besondere Aufmerksamkeit zuzuwenden.

Unsere Untersuchungen erstreckten sich auf einige P-ase-Bildner der ehemaligen Institutssammlung und eine Beihe von Organismen, die aus infizierten Testen und infizierten Penicillin-Ansätzen isoliert

** Bronnzell bei Fulda, Rhönkurheim.

H.Hoff m a nn-Berling und G.- A. Kausche, Elektronenmikroskcpische Untersuchungen über den Feinbau der Skelettmuskylatur bei Rana temporaria (S. 139)

Abb. 1. 1007/49. Elektronenoptisch 23000 : 1, nachvergrö-ßert auf 45000 : 1. Musculus gastrocnemius von Rana

temporaria, entspannt.

Abb. 3. 1043/49. Elektronenoptisch 23 000 :1 , nachvergr. auf 45000 :1 . M. gastrocnemius von R. temporaria, ent-spannt. Das rechte Segment ist bei der Präparation ge-dehnt worden. Die Pfeile bezeichnen abgesprengte, iso-

liert liegende Fibrillen.

Abb. 5. 1044/49. Elektronenoptisch 23000 :1 , nachvergr. auf 45000 :1 . M. gastrocnemius von R. temporaria, ent-spannt. Anderer Faserteil des gleichen Präparates wie auf

Abb. 2.

Abb. 2. 1044/49. Elektronenoptisch 23 000 :1 , nachvergr. auf 45000 :1 . M. gastrocnemius von R. temporaria, ent-

spannt.

Abb. 4. 1042/49. Elektronenoptisch 23 000 :1 , nachvergr. auf 450000 : 1. M. gastrocnemius von R. temporaria, ent-spannt. Im Querzusammenhalt gestörte Faser, die Quer-struktur ist stellenweise zu kleinen Brücken ausgezogen.

Abb. 6. 1015/49. Elektronenoptisch 26000 : 1, nachvergr. auf 45 800 :1 . M. gastrocnemius von R. temporaria, ent-spannt. Im Querzusammenhalt noch stärker gestörte Faser als auf Abb. 4. Die Querstruktur ist an mehreren Stellen

zu längeren Brücken ausgezogen.

7 (S

9 10

12

Abb. 7. 1192/49. Elektronenoptisch 23000 :1 , nachvergr. Abb. 8. 1192/49. Elektronenoptisch 23 000 :1 , nachvergr. auf 90 000 : 1. M. gastrocnemius von R. temporaria, in auf 90000 : 1. M. gastrocnemius von R. temporaria, in maximaler Dehnung fixiert. Im linken Bildteil ein I-, maximaler Dehnung fixiert. Das Bild schließt redits an rechts ein Q-Absclmitt. Unterhalb des Muskels eine kol- die Aufnahme 7 an. In der Bildmitte eine M-Scheibe, ein-

lagene Fibrille. gefaßt von „Begleitstreifen" und H-Abschnitten. Abb. 9. 1203/49. Elektronenoptisch 23000 :1 , nachvergr. Abb. 10. 1104/49. Elektronenoptisch 23000 :1 , nachvergr. auf 90000 : 1. M. gastrocnemius von R. temporaria, in auf 90 000 : 1. M. gastrocnemius von R. temporaria, in mäßiger Dehnung fixiert. In der Bildmitte eine Z-Scheibe mäßiger Dehnung fixiert. Links Teile eines I-Abschnittes,

und ein I-Abschnitt. rechts anschließend Q, H und M. Abb. 11. 1394/49. Elektronenoptisch 23000 :1 , nachvergr. Abb. 12. 1427/49. Elektronenoptisch 23000 :1 , nachvergr. auf 45000 :1. M. gastrocnemius von R. temporaria, Chloro- auf 45000 :1 . M. gastrocnemius von R. temporaria, iscr-form-Kontraktur, isotonisch. Die beiden kontrastreichen tonische Chloroform-Kontraktur. An beiden Bildseiten je Scheiben an den Seiten des Bildes sind Z-, die in der eine Z-, in der Mitte eine M-Scheibe. I- und Q-Abschnitte

Mitte gelegene Scheibe eine M-Scheibe. sind kaum gegeneinander abzugrenzen.

Nr. Bezeichnung

Penicillin-Empfindlichkeit Penicillinase-Bildung °°

Nr. Bezeichnung Strichtest. Hemm-

zone in mm Platten-

Strichtest °°° Platten-Lochtest

1 B. mesentericus, Berlin 0 + 2 B. mesentericus, Kiel 0 3 B. mesentericus fuscus, Kiel 0 + + (I) 4 B. mesentericus fuscus, Prag 45 0 5 B. mesentericus 0 + + (I) 6 B. mesentericus fuscus 50 0 7 . B. subtilis 2 + + (II) 8 B. subtilis 0 + + (I, II) 9 B. coli IV 0 0 + (II)

10—12° B. coli: Kaufmann 530—11, Cudo 0 528/520, Kaufmann 528/520 (Wachstum im

Pénicillium) 13—19° B. paracolon: 2659, 1946, 2057,

2061, 71739, 12 683, 19 Kauf-mann 52811 0

20 Testinfektion I 16/a 0 + + (I) 21 Testinfektion S X 0 + + (I) 22 Testinfektion X 0 + + (I) 23 Testinfektion 1/16 b 0 0 + (ID 24 Testinfektion 11/17 0 +

+ (ID

25 Testinfektion 111/18—1 0 + 26 Testinfektion III/18—2 0 + + (I, II) 27 Testinfektion IV 0 +

+ (I, II)

28 Testinfektion V 45 0 0 (I) 29 Testinfektion VI 0 0 30 Testinfektion VII 0 + 46 Testinfektion 0 31 Kolbeninfektion VIII 0 (Wachstum im ~'r (I)

Pénicillium) 32 Kolbeninfektion VIII—4 0 + + (II) 33 Kolbeninfektion VIII—5 0 + 34 Kolbeninfektion VIII—5 a 0 0 ' + (I) 35 Kolbeninfektion VIII—5 b 40 0 (I) . 36 Kolbeninfektion X—361 30 37 : Kolbeninfektion X—191 0 + 38 Kolbeninfektion PA—10 40 39 Kolbeninfektion S 910 40 40 Kolbeninfektion S 910/1 30 41 Kolbeninfektion 6511 45 42 Kolbeninfektion 4511a 45 43 Infektion Gärtrommel Gasnau 0 + + (I) 44 Kolbeninfektion, submers 0 + + (I) 45 Kolbeninfektion, submers 0 + + (I) 47 Mischkultur (Kolbeninfektion) 0 + + (I) 48 Mischkultur (Kolbeninfektion) 15 49 Mischkultur (Kolbeninfektion) 0 + + (I)

° D ie Kulturen stammen aus dem Gesundheitsamt der Stadt Prag. " E in leeres Feld bedeutet nicht geprüft bzw. Protokolle verlorengegangen. ( I ) : Es wurde steriles Filtrat der entspr.

Bakterienkultur verwendet. ( I I ) : es kamen autolysierte Bakterienpräparate zur Prüfung. °°° Gibt nur exogene P-ase an.

Tab. 1. Hemmbarkeit durch Penicillin und Penicillinase-Bildung verschiedener Bakterienstämme.

worden waren. Bei den letztgenannten handelte es sich in den meisten Fällen um nicht näher bestimmte

1 Da es sich bei vorliegender Zusammenstellung um die Wiedergabe älterer Versuchsresultate handelt, ist die Bezeichnung Penicillinase beibehalten worden, obgleich die generelle Gültigkeit dieser Bezeichnung für penicillin-inaktivierende Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen fraglich erscheinen muß. So gewann z.B. R. P e r a u l t (C. R. Séances Soc. Biol. Filiales Associées 139, 618 [1945])

sporenbildende Stäbchen der verschiedensten Dimen-sionen und von wechselnder Gram-Färbbarkeit. '

aus B. subtilis ein „Antipenicillin", das sich von der „Peni-cillinase" u. a. durch seine Hitzestabilität untersdieidet. I r r g a n g u. D ö r n b r a c k (Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 285, 17 [1950]) berichten über eine aus einer Test-infektion gewonnene „Penicillinase", bei der etwa 20% der „P-ase-Aktivität" auch bei 2-stdg. Kochen erhalten blieben.

Die insgesamt 49 verschiedenen Stämme wurden im Strichtest auf ihre Hemmbarkeit durch Penicillin und in Plattentesten auf ihr Vermögen, extra- und intrazelluläre P-ase zu bilden, untersucht (s. Tab. 1).

Der Vergleich der in Tab. 1 mitgeteilten Werte vermittelt einige Anhaltspunkte zur Charakterisie-rung verschiedener, im Penicillin-Ansatz und -Test häufiger auftretender Infektionen.

Die Tatsache, daß die aus infizierten Penicillin-Testen isolierten Organismen (mit einer Ausnahme) penicillin-resistent waren, ist nicht weiter verwun-derlich, da ja das spontane Erkennen von Testinfek-tionen diese Resistenz zur Voraussetzung hat.

Die aus infizierten Penicillin-Gäransätzen gewon-nenen Organismen verhielten sich gegen Penicillin ganz verschieden. Die Mehrzahl war penicillin-resi-stent, einige zeigten jedoch eine nicht unerhebliche Penicillin-Empfindlichkeit, trotzdem sie im Gäransatz als anscheinend penicillin-resistent aufgefallen waren.

Bei allen penicillin-resistenten Infektionskeimen war es möglich, intra- oder extrazellulärePenicillinase nachzuweisen. Organismen, bei denen die P-ase streng intrazellulär fixiert ist, gestatten zwar keine direkte Testablesung, jedoch bleibt bereits gebildetes Penicillin unbeeinflußt. Sterile Filtration kann hier noch die Penicillin-Auswertung ermöglichen. B e n e -d i c t , S c h m i d t und C o o g h i 11 2 berichteten über Organismen, die gegen 200 Penicillin-Einheiten/ccm resistent waren und dennoch keine P-ase an die Nährlösung abgaben, so daß gleichzeitig anwesendes Penicillin unbeeinflußt blieb 3. B o n d i und D i e t z 4

fanden bei gram-positiven Keimen einen engen Zu-sammenhang zwischen Penicillin-Resistenz und P-ase-Produktion, wobei deren Bildungsgeschwindig-keit maßgebender ist als die Menge der produzierten P-ase. G i 1 s o n und P a r k e r 5 konnten bei ihren Untersuchungen an Staphylokokken eine streng-gültige Beziehung zwischen Penicillin-Resistenz und P-ase-Gehalt nicht feststellen.

Bei den untersuchten 8 Stämmen von B. mesenteri-cus und B. subtilis, von denen 2 penicillin-empfind-lich waren, zeigten 5 eine starke Produktion von exogenem Ferment. Die untersuchten CoZi-Stämme verfügten nur über endogene P-ase. Von den 21 peni-

2 R. G. B e n e d i c t , W. H. S c h m i d t u. R. D. C o o g h i l l , Arch. Biochem. (Am.) 8, 377 [1945].

3 Anläßlich einer im Oktober 1944 in Berlin-Babels-berg stattgefundenen Penicillin-Tagung wurde bereits auf die Dreiteilung der möglichen Arten von Infektionskeimen bei der Penicillin - Darstellung, nämlich: P-empfindlich, P-resistent ohne Beeinflussung des Penicillins und P-resi-stent unter Penicillin-Inaktivierung, hingewiesen.

cillin-resistenten Infektionsorganismen bildeten 15 exogene P-ase, bei den restlichen ließ sich einwand-frei die Bildung endogener P-ase nachweisen. Wir fanden keinen penicillin-resistenten Organismus, bei dem nicht Penicillinase-Produktion nachgewiesen werden konnte.

Nach B e n e d i c t , S c h m i d t und C o o g h i l l 2

wird durch die Infizierung von Penicillin-Kulturen mit Organismen, die exogene P-ase bilden, je nach dem Zeitpunkt des Zusatzes und der Menge der In-fektionskeime entweder das Pilzwachstum gestört und damit die Penicillin-Produktion behindert oder aber die P-ase-Bildung gehemmt bzw. völlig sistiert. Sie sprechen von einem empfindlichen Gleichgewicht (delicate balance) zwischen der Entwicklung des Pilzmycels und der der Bakterienzellen.

Wir haben, allerdings von anderen Voraussetzun-gen ausgehend, ähnliche Versuche unternommen. Sie hatten den Zweck, den Einfluß der zu verschiedenen Zeitpunkten erfolgenden Infektion eines Penicillin-Gäransatzes mit einem hochresistenten, exogene P-ase bildenden Organismus, festzustellen. Nachfolgend ist das Protokoll eines derartigen Versuches wieder-gegeben.

Oberflächenkultur; Nährlösung: Czapek-Dox-Salze mit 4% techn. Glucose und 0,5% Maiseiweiß; pH 5,5; Peni-cillium: Stamm P 395 {Pen. bruneo-rubrum Dierckx); In-fektions-Organismus: B 44 (gram-negatives, sporenbilden-des Stäbchen); Gärgefäße: Erlenmeyer-Kolben 300 ccm mit je 100 ccm Nährlösung.

Die Versuchsanordnung war folgende: a) Animpfung mit Bakterien, b) Animpfung mit Penicillium, c) Animpfung mit Bakterien und Penicillium gleich-

zeitig, d) Animpfung mit Penicillium; nach 6 Tagen Bakterien

nachgeimpft, e) Animpfung mit Bakterien; nach 6 Tagen Penicillium

nachgeimpft.

In Tab. 2 sind die Versuchsresultate tabellarisch zu-sammengestellt.

In analoger Weise auf Petri-Schalen angesetzte Ver-suche ergaben im Prinzip gleiche Ergebnisse.

Der Versuch zeigt in Übereinstimmung mit den Resultaten von B e n e d i c t S c h m i d t und C o o g -h i l l 2 , daß sich bei einer gleichzeitigen Verimpfung von Pilzsporen und Bakterien eine normale Pilzdecke nicht entwickeln kann. Eine nachträglich erfolgende Infektion bleibt im Gegensatz zu den Ergebnissen

4 A. B o n d i jr. u. C. C. D i e t z , J. Bacteriol. 55, 843 [1948],

5 B. St. C. G i 1 s o n u. R. F. P a r k e r , J. Bacteriol. 55, 801 [1948].

° W Wachstum, T Testresultat (Penici l l inbi ldung in HE /cm : 1 ) ; bei denVersuchen c und d wurden die Kulturlösungen vor dem

Test steril filtriert. 0 0 H E Penicil l in-Hauseinheit; 1 H E ~ 2 IE .

Tab. 2. Penicillinbildung in Gäransätzen, die zu verschiedenen Zeitpunkten mit P-ase bildenden Mikroorganismen infiziert wurden.

Vers.-Tag a b c d e

4. W° starke Trübung normales fast nur Bakt.- normales starke Trübung P.-Wachstum Wachstum, einzelne P.-Wachstum

starke Trübung

P.-Kol. am Rande P.-Wachstum

T° — 10 H E o c 0 10 HE —

6. W häutige normales häutige Bakt.- normales häutige Bakt.-Decke P.-Wachstum Decke, am Rand P.-Wachstum Bakt.-Decke

einige P.-Kol. T — 25 HE 0 25 HE —

8. W Autolyse normales Bakt.-Autolyse, normales Autolyse der P.-Wachstum Pilz breitet sich P.-Wachstum Bakt.-Decke, kein

langsam aus leichte Trübung Pilz-Wachstum T — 25 HE 0 10 HE —

10. W dass. dass. dass., Pilz jedoch dass., Trübung dass. nur unzusammen- etwas stärker

hängendes Wa. T — 17 HE — 1 HE —

der genannten Autoren bei den von uns angewandten Infektionskeimen jedoch nicht wirkungslos. Es zeigt sich aber, daß in einem derartigen Fall ein nur lang-sames Absinken des Penicillin-Titers erfolgt. Auf die Penicillin-Produktion übertragen würde das bedeu-ten, daß eine Frühinfektion des Ansatzes diesen sicher zerstört, während bei später erfolgenden In-fektionen, wenn sie innerhalb kürzerer Zeitspannen erkannt werden, noch beträchtliche Anteile des schon gebildeten Penicillins gerettet werden können.

In ausgedehnteren Untersuchungen prüften wir die Beeinflußbarkeit des Wachstums bzw. der P-ase-Produktion einer Reihe in Frage kommender Infek-tionsorganismen durch verschiedene Zusätze zu den Nährböden (Antiseptika, Chemotherapeutika, Hemm-stoffe, Schwermetalle usw.) mit dem Ziele, bei der Penicillin-Darstellung evtl. eintretende Infektionen dadurch unwirksam machen zu können, ohne die Penicillin-Produktion des Schimmelpilzes zu stören.

Soweit es die reine Beeinflussung der P-ase-Bil-dung bzw. des Wachstums der P-ase-bildenden Orga-nismen betrifft, sind darüber inzwischen Arbeiten be-kannt geworden. Nach W o o d r o f f und F o s t e r 6

wird P-ase durch Natriumazid, Indoylessigsäure, Ferrochlorid und Sulfhydrilgruppen inaktiviert. Nach R e i d , F e i t o n und P i t r o f f 7 hemmen Natrium-

6 H . ß. W o o d r o f f u. J. W. F o s t e r, J. Bacteriol. 49; 1 [1945],

sulfanilate und Natriumbenzoat die Aktivität der P-ase, während Bromsaligenin eine Hemmwirkung auf das Wachstum von Esch, coli und anderer gram-negativer Organismen entfaltet. Die Wirkung von Natriumazid ist nach D i e t z und B o n d i jr.8 nicht auf eine Hemmung der P-ase-Aktivität zurückzufüh-ren, sondern es handelt sich hier um eine Beeinflus-sung des Stoffwechsels der betreffenden Organismen in Richtung einer Sistierung der P-ase Produktion.

Über unsere eigenen Versuche in dieser Richtung kön-nen wir nur resümierend berichten, da nahezu unsere ge-samten diesbezüglichen Unterlagen verlorengegangen sind. Es gelang zwar, eine ganze Reihe von Stoffen zu finden, die das Wachstum bzw. die P-ase-Produktion ver-schiedener Infektionskeime sistierte oder zumindest stark behinderte, ohne die Penicillin-Produktion selbst zu be-einflussen. Technisch anwendbar erwies sich jedoch dieses Verfahren nicht, da es nicht gelang, durch derartige Zu-sätze einen generellen Infektionsschutz zu erreichen, nach-dem die auftretenden Infektionskeime eine zu unter-schiedliche Ansprechbarkeit zeigten. Wenn wir allerdings Gäransätze mit einem bekannten, penicillin-zerstörenden Organismus infizierten, die Nährlösung jedoch die Zu-sätze enthielt, die das Wachstum oder die P-ase-Produk-tion eben dieses Organismus hemmte, so wurde gegen-über den Kontrollversuchen mit nicht „geschützter" Nähr-lösung ein voller Erfolg erzielt.

7 R. D. R e i d , L. C. F e i t o n u. M. A. P i t r o f f , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 63, 438 [1946].

8 C. C D i e t z u. A. B o n d i jr., J. Bacteriol. 55, 849 [1948].

Der Nährlösung zu-gesetzte Substanz

Zusätze in °/0 der Nährlösung

Der Nährlösung zu-gesetzte Substanz

0,1 0,01 0,001 0,0001 Der Nährlösung zu-gesetzte Substanz

Penicillin-Bildung in °/o der jewei-ligen Kontrollversuche ohne Zusatz

Trypaflavin . . . . 0°° 0°° 125 170 Rivanol — — 25 —

Nipagin — 65 125 —

Salicylsäure . . . . 100 77 — —

Na-Salicylat . . . 100 77 — —

Salicyl 40 — — —

o-Amino-benzoesäure . . 100 — — —

Sulfanilsäure . . . 100 — —

Hg(N03)-> — 100 100 —

HgCf- 0°° 65 160 —

AgNOa — — 100 —

CuS04 • aq . . . . — 120 100 —

Bi(N03)3 — 0 e " — —

(NH^AsO, 100 — 80 —

NiCl,-aq — 100 — —

Co S0 4 — 100 — —

Cr,(S04)3 134 80 — —

MnCl — 80 — —

ZnSO, — O s 0 0 — —

KJ 52 — — —

Borsäure 100 100 100 —

Borax 100 — — —

Ammonwolframat 52 Ammonmolybdat . 60 40 40 —

Uranvlnitrat . . . — 80 — —

Cernitrat — 100 , — —

Titansulfat . . . . — 100 — —

° Es wurden folgende Penicillium-Stämme untersucht: P 226 (Pen. baculatum Biourge), P 312 (Pen. cyaneofulvum Biourge), P 395

(Pen. bruneo-rubrum Dierckx), P 417 (Pen. baculatum Biourge) °° Pilz nicht angewachsen

0°° Pilzdecke nicht sporuliert

Tab. 3. Beeinflussung der Penicillin-Bildung verschiedener Penicillium - Stämme9 durch Antiseptika und Schwer-

metalle.

Tab. 3 zeigt einige Teilresultate, welche die eine Seite des eben erörterten Problems, nämlich die Beeinflußbar-keit der Penicillin-Bildung durch verschiedene Zusätze zum Nährboden, betreffen. Die meisten der dort ange-führten Verbindungen hatten auf die Entwicklung eines oder mehrerer der in Tab. 1 angegebenen Organismen einen hemmenden Einfluß bzw. es wurde deren P-ase-Produktion in einigen Fällen weitgehend unterdrückt. In einigen Modellversuchen mit bekannten Infektionskeimen hatten wir z. B. mit Trypaflavin als Infektionsschutz recht gute Erfolge zu verzeichnen9.

In letzter Zeit scheint dieses Problem jedoch auch tech-nisch gelöst worden zu sein. S t e v e n s e n und M i t -

9 Die betr. Protokolle stehen uns leider nicht mehr zur Verfügung; ebenso das umfangreiche photographische Aufnahmematerial entsprechender Agar-Platten-Versuche. Es muß daher auf eine genauere Spezifizierung der Resul-tate verzichtet werden.

10 E. C. S t e v e n s o n u. J. W. M i t c h e l l , Science [New York] 101, 642 [1945]; US-Pat. 2437766, Mar. 16. 1948, ref. Chem. Abstr. (Am.) 42, 3811 [1948].

c h e l . l 1 0 beriditen, daß in Kulturlösungen die 0,02 bis 0,08 % 2.4-Dichlor-pheiioxyessigsäure (2,4 D) enthalten, das Wachstum verschiedener Bakterien, wie B. subtilis, Phytomonas tumefaciens, Staph. aureus, verhindert und das von Aerobacter clocae verzögert wird, während Fusarien und Peniciilien in ihrem Wachstum nicht be-einflußt werden.

Bei unseren Versuchen ergaben sich nebenher ander-weitig verwertbare Beobachtungen, so konnte z. B. die bis dahin dogmatisch angenommene Schädlichkeit von Kupfer- und Arsenspuren im Gäransatz als weitgehend unbegründet erkannt werden.

Versuchsleil

D e r S t r i c h t e s t zur B e s t i m m u n g der P e n i c i l l i n - R e s i s t e n z

Es wurde die bewährte Methode von F l e m i n g mit den von B e r n h a u e r und R a u c h 1 1 angegebenen Modifikationen angewendet. Als Nährboden diente ein von den vorgenannten Autoren als Mischung I bezeich-neter Spezial-Agar von folgender Zusammensetzung: 3 Tie. Bouillon-Agar, 1 Tl. Bierwürze-Agar (aus 8-grädiger Bier-würze hergestellt), 1 Tl. Glucose-Hefeautolysat (2% Glu-cose, gelöst in 10-proz., auf Frischhefe bezogenem Hefe-autolysat). Mit diesem Spezial-Agar wurden Platten ge-gossen und ein penicillin-bildender Penicillium-Stamm (P 395, P. bruneo-rubrum Dierdix) strichförmig eingeimpft. Nach 4—5 Tagen Bebrütung bei 26° war das gebildete Penicillin-Gefälle für den Versuch ausreichend. Mit gleich gutem Erfolg wendeten wir auch die von Fleming an-gegebene Methode an, indem wir aus der Agar-Platte eine Rinne ausstachen und diese mit Penicillin-Agar aus-füllten. Die zu prüfenden Organismen wurden nun senk-recht gegen diesen Penicillium-Strich bzw. die Penicillin-Agar-Rinne in bekannter Weise eingeimpft, bei 37° C 18 bis 24 Stdn. bebrütet und die Hemmzonen ausge-messen.

D e r P e n i c i l l i n a s e - N a c h w e i s

D i e P l a t t e n - L o c h - M e t h o d e . Mischung -1 -Agar (wie vorstehend angegeben) mit einem Agar-Gehalt von 2% wurde mit Penicillin-Lösung versetzt und mit Wasser so verdünnt, daß der Penicillingehalt 0,1 bis 0,2 HE/ccm (etwa 0,2 bis 0,4 IE) und der Agar-Gehalt etwa 1,2% betrug12. Der Penicillin-Agar wurde in Men-gen von je 20 ccm in Petri-Schalen von 10 cm 0 ge-gossen. Während dieser Operation hatte der Agar eine Temperatur von etwa 55°. Die Arbeiten wurden so rasch als möglich durchgeführt. Nach dem Erkalten wurde in den Agar ein Loch von 9 mm 0 gestanzt und der Boden durch Einbringen von 2 Tropfen verflüssigtem Agar ab-gedichtet, damit die nachträglich eingefüllte P-ase-Lösung nicht unter der Agarschicht wegdiffundiert. In die so vor-

» K. B e r n h a u e r u. J. R a u c h , Z. Naturforschg. 4 b, 208 [1949],

12 Vorversuche hatten ergeben, daß bei dieser Penicil-lin- tind Agar-Konzentration die klarsten Resultate erhal-ten werden.

bereiteten Platten wurde der Staphylokokkenstamm H 51113

in strahlenförmig um das Loch angeordneten Impfstrichen (6—8) eingeimpft und 0,1 ccm steriles Kulturfiltrat des zu untersuchenden P-ase-Bildners bzw. filtriertes Bakterien-autolysat in das Loch vorsichtig einpipettiert. Die Plat-ten wurden anschließend 18—24 Stdn. bei 37° bebrütet.

Eine P-ase-Wirkung manifestierte sich in einer um das Loch gelegenenen Enthemmungszone, in welcher der Staph. aureus angewachsen war.

Die verschiedenen P-ase-Bildner ergaben nach dieser Methode keine wesentlichen Unterschiede in der Breite des enthemmten Hofes. Eine Verlängerung der Bebrü-tungsdauer veränderte die Resultate nur unwesentlich.

Nachfolgend ist zur näheren Erläuterung eine kleine Zusammenstellung einiger Resultate wiedergegeben.

Breite des enthemmten Hofes

Versuchsbedingungen in m m nad i Stdn.

24 72 168

Mischung I-Agar mit 0,1 HE Penicillin/ccm 5 6 7

Mischung I-Agar mit 1,0 HE Penicillin/ccm 3 3 6

Kontrolle (ohne P-ase) 0 0 0

P-ase-Bildner: B. subtilis (B 8). Probelösung: 0,1 ccm einer 18 Tage alten, steril filtrier-

ten Kulturlösung. D i e P l a t t e n - S t r i c h - M e t h o d e . In gleicher

Weise, wie vorstehend geschildert, wurde Penicillin-Agar vorbereitet und in Petri-Schalen (10 cm 0) gegossen. Der zu prüfende P-ase-Bildner wurde am Rande der Platte strichförmig eingeimpft und der Staph. aur., Stamm H 511, entweder gleichzeitig oder am folgenden Tage senkrecht dazu gegengeimpft. In einigen Fällen wurde auch so vor-gegangen, daß am Rande zunächst der Staphylokokkus strichförmig eingeimpft wurde und senkrecht zu diesem gleichzeitig 4—5 der zu prüfenden verschiedenen P-ase-Bildner. Eine P-ase-Wirkung wird durch ein Anwachsen des Staph. aur. in der näheren Umgebung des zu prüfen-den Bakteriums angezeigt. Die erstgenannte Anordnung ergibt klarere Resultate, während die zweite eine raschere Vororientierung ermöglicht. * Ganz allgemein hatten wir den Eindruck, daß die Platten-Strich-Methode deutlichere Enthemmungszonen zeigt als die Platten-Loch-Methode.

Es mag noch darauf hingewiesen werden, daß nach der Platten-Strich-Methode nur extrazelluläre P-ase nachge-wiesen wird, während nach der Platten-Loch-Methode je nach Art oder Vorbereitung der zupipettierten Lösung

13 Der Stamm H 511, der später unter der Bezeichnung SG511 bekannt wurde, ist uns von Hrn. Dr. Ö p p i n g e r , Höchst, liebenswürdigerweise zur Verfügung gestellt wor-den.

14 Die Protokolle über den reaktionskinetischen Ver-gleich der Penicillin-Inaktivierung durch die von verschie-denen Organismen stammende „Penicillinase" sind ver-lorengegangen. Es ist geplant, diese aufschlußreichen Ver-suche zu wiederholen.

sowohl intra- wie extrazelluläre P-ase bzw. beide erfaßt werden können.

D e r P - a s e - N a c h w e i s in der V e r d ü n n u n g s -r e i h e . Getestete Penicillin-Lösungen (etwa 5 HE/ccm enthaltend) wurden mit verschiedenen Mengen einer P-ase-Lösung (Kulturfiltrat oder Bakterienautolysat) versetzt und bei 37° bebrütet. Zur Gewinnung der für die ver-schiedenen Bebrütungszeiten geltenden Bezugswerte und als Kontrollen liefen 2 Röhrchen derselben Penicillin-Lösung ohne P-ase-Zusatz mit. Nach verschiedenen Zeiten wurden von den einzelnen Ansätzen und den Kontrollen Proben entnommen und der Penicillintiter bestimmt. Die zu den entsprechenden Zeiten gefundenen Werte der Kontrollen wurden als Bezugswerte zur Einstufung der Penicillin-Inaktivierung ( = P-ase-Wirkung) herangezo-gen14.

D i e G e w i n n u n g v o n i n t r a c e 11 u 1 ä r e r P e n i c i l l i n a s e

In einigen Fällen — insonderheit bei denen der Plat-ten-Strich-Test die Abwesenheit von extrazellulärer P-ase ergeben hatte — wurde die P-ase-Lösung für den Platten-Loch-Test bzw. zur Durchführung anderer Versuche nach zwei verschiedenen Methoden gewonnen.

Die auf Platten angewachsenen Bakterien wurden durch Abschwemmen oder Anschaben mit einem breiten Spatel geerntet, mit Aceton gefällt, mit Äther nachgewaschen und im Vakuum getrocknet. In einigen Fällen genügte diese Behandlung bereits, um die Bakterienhülle zu spren-gen. In solchen Fällen war eine Aufschwemmung mit Wasser ausreichend, um wirksame P-ase-Lösungen zu er-halten. Auf den Platten wuchs in diesen Fällen kein Bak-terienrasen mehr an. In der Mehrzahl der Fälle waren nach dieser Behandlung die Bakterienhüllen jedoch noch völlig intakt. Durch Zerreiben mit feinem Sand oder Glas-staub (vgl. auch 15), oder durch längere Maceration mit chloroform-gesättigtem Wasser bei 37° konnte die endo-gene P-ase freigemacht werden16.

In anderen Fällen züchteten wir die P-ase-Bildner in der Ruhekultur in flüssigem Nährmedium, das zu gleichen Teilen aus Czapek-Dox-Nährlösung (mit 4% technischer Glucose) und Bouillon bestand, bei 37°. Der P-ase-Ge-halt der Nährlösung erfuhr meist erst dann einen stärke-ren Anstieg, wenn die Bakterien Autolyse-Erscheinungen zeigten.

Die bei diesem Verfahren in der Nährlösung vorhan-dene P-ase kann sowohl exogener wie endogener Natur sein. Der exakte Nachweis von „nur endogener" P-ase ist bei Vorliegen des negativen Platten-Strich-Testes durch die penicillin-inaktivierende Wirkung des Autolysates der von einer Agarplatte geernteten Bakterien erbracht.

15 G. H e n n e b e r g , Einführung in die bakteriolo-gische Untersuchungstechnik zur Penicillin-Therapie, Jena 1947.

16 G i l s o n und P a r k e r 5 empfehlen zur Darstel-lung der Staphylokokken-P-ase die Behandlung mit Aceton und Äther bei tiefer Temperatur.