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Einführung in dieMikrobielle Ökologie

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3Artenvielfalt

Molecular Fingerprints


Who is there?

How many?

What are they doing?

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Vergleich von amplifizierten 16 S rRNA-Banden von Reinkulturen und Sediment (0 - 10 mm) aus Schiermonnikoog durch DGGE

Elze Wieringa

Sediment depth (mm) IsolatesIsolates

Bakterien im obersten Zentimeter von Sandwatt


Reinkultur

-> Vereinzelung von Zellen

-> Kolonien mehrfach erneut ausstreichen

-> Reinkultur = Abkömmlinge einer Zelle = Klon (mit Stamm bezeichnung)

Cyanobakterien- und Algenkulturen oft nicht axenisch, d.h. sie enthalten Begleitbakterien

Cultivation-based and

cultivation-independent approaches

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Mit wem haben wir es eigentlich zu tun?

Systematik, Taxonomie

Ziel: System mit Übereinstimmung zur natürlichen Verwandtschaft, der Phylogenie

vgl. Stamm bei Tieren


Was ist eine Art?

Bei sexueller Fortpflanzung: Fortpflanzungemeinschaft, die fruchtbare Nachkommen erzeugt

Bei Prokaryoten: Art anhand von diversen Merkmalen operationell definiert, heute zunehmend auf der Basis der 16 S rRNA

OTU = Operational Taxonomic Unit

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Taxonomie

Sollwerte für die Übereinstimmung innerhalb einer Art

≥ 95 %

≥ 70 %

≥ 98 %

Taxonomie ist ein wichtiger Bestandteil der 'Autökologie' der Organismen


Physiologische Eigenschaften von Sulfatreduzierern aus dem Stechlin-See (Henrik Sass)

Charakterisierung von Reinkulturen

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DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen


Artenvielfalt

Wann wurde der Elefant entdeckt?

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Wieviele Prokaryoten-Arten gibt es?

2008: 513 000 Sequenzen der 16 S-rRNA bestimmt

Einige Arten global verbreitet, sehr viele sehr sel ten:

‘Rare Biosphere‘ (Analyse durch Pyrosequencing, s.u.)

(Microbial diversity in the deep sea and the underexplo red "rarebiosphere " , Sogin et al., PNAS 2006)

Prokaryoten EukaryotenBeschrieben (2008): ~ 7200 1.7 MioGeschätzt (2008): 0.12 - 1000 Millionen 10 - 100 Mio

Anzahl der Arten in 30 g Waldboden3 000 (Reassoziationskinetik von DNA)

Torsvik V, Goksoyr J, Daae FL (1990) High diversity inDNA of soil bacteria. Appl. Env. Microbiol. 56:782-787

500 000Dykhuizen DE (1998) Santa Rosalia revisited: Why arethere so many species of bacteria? Antonie vanLeeuwenhoek 73:25-33


Wann wurde das größte Bakterium der Welt entdeckt?

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Mundschleimhautzelle einer gesunden Oldenburger Studentin - Oberfläche


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Struktur der 16 S-rRNAzweidimensional

Das am besten untersuchte Molekül der Welt


Eignung der ribosomalen RNA für phylogenetische Ana lysen

♦ Ribosomen in jeder Zelle vorhanden (bis zu 10 000), Einsatzvon RNA-Sonden (Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung, FISH)Gen für rRNA (rDNA) 1x (manchmal mehrfach) vorhanden

♦ Elementare komplizierte Funktion erlaubt kaumgrundlegende Mutationen. Andererseits wird durch einenBasenaustausch nicht eine Aminosäure eine Proteinsverändert

♦ RNA lang genug für ausreichend Variationsmöglichkeiten,streng konservierte, variable und hypervariable Bereiche,erlaubt Analyse und Sondeneinsatz für weitläufig und näherverwandte Arten (diverse andere 'Fingerprint'-Techniken für sehr eng Verwandte)

♦ Langsame Evolution → 'Molekulares Chronometer', jeweniger Sequenzübereinstimmung, desto früher getrennteEntwicklung

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Phylogenetischer Stammbaum aller Lebewesen


Denaturierung- Schmelzen der DNA

Annealing- Primer-Anlagerung

Elongation- Kettenverlängerung

durch Polymerase

DNA-Doppelstrang5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´ 3´

5´3´

95 °C

50-65 °C

72 °C

Kary B. Mullis, 1983

n ×

Prinzip der Polymerase Chain Reaction

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DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Nukleotid-Methode nach Sanger


PCR

PCR-Maschine (Thermocycler)

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DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Nukleotid-Methode


Ökologie?

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The man who led the private-sector effort to sequence the humangenome is seeking exclusive commercial rights to the bareessentials for life in the hope of one day creating a living organism from scratch.It is not Craig Venter's first brush with controversy. His company Celera raced publicly-funded researchers to sequence the humangenome. Now his research institute is trying to patent a "minimalgenome", which could be used to make synthetic life forms

„Naive Fragen zu stellen ist überhaupt eine der erfolgreichsten Methoden voranzukommen.“– Craig Venter

Ökologie?

Martin A. SchwartzThe importance of stupidity in scientific researchJournal of Cell Science 121, 1771 (2008)


Biochemische Systeme in Lebewesen integrieren

- Hefe- Biotransformation: Spez. Umsetzung mit Hilfe von Organismen- Klonieren- Überproduktion, z.B. Labferment, Insulin- Minimalorganismus: ‘Mycoplasma laboratorium‘- Organismus mit gewünschten Stoffwechselfähigkeiten designen…

Synthetische Biologie

Anti-Ökologie

Vergl. Gentest für Arbeitnehmer und Ungeborene

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Statt zu klonieren kann man oft auch mit PCR amplifizieren

Analyse von Umweltproben basierend auf rRNA


Molekularbiologische Ansätze (Auswahl)

•••• 16 S-rRNA: Ribosomen (DGGE, FISH = Fluoreszenz- in-situ-Hybridisierung, CARD-FISH) oder Gen der rRNA (-> PCR, evtl. nachUmsetzung mit reverser Transkriptase)

•••• Gene, die Schlüsselenzyme codieren:

z.B. Sulfitreduktase von Sulfatreduzierern, Ammonium-Monooxygenase von Nitrifikanten etc.

•••• Metagenomik:

Analyse des gesamten Genoms von einem Standort undSuche nach Schlüsselgenen und deren Nachbarn

•••• Messenger-RNA als Indikator für aktuell gebildete E nzyme

•••• Kombination mit Aktivitätsindikatoren:

z.B. Stable-Isotope-Probing, Autoradiographie, NanoSI MS [s.u.]

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Vergleich von amplifizierten 16 S rRNA-Banden von Reinkulturen und Sediment (0 - 10 mm) aus Schiermonnikoog durch DGGE

Elze Wieringa

DGGE trennt nach Unterschieden der Sequenz, ohne da ss man die kennen muss ☺☺☺☺

Sediment depth (mm) IsolatesIsolates

Denaturierende G radienten-G el-Elektrophorese, DGGE


DGGE

TGGE nutzt thermischen Gradienten zum Denaturieren der DNA Phylotypen

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FISH

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung

Nevskia ramosa

Anaerobes Methan-oxidierendes Konsortium aus methanogenen Archaeen (rot) und Sulfat-reduzierenden Bakterien (grün)

Boetius, A. et al.( 2000) A marine microbial consort ium apparently mediating anaerobic oxidation of methane. Nature 407:623-626


FISH

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung

Engl. probe = Sonde

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CARD-FISH

Catalyzed Reporter Deposition-Fluorescence in situ Hybridisation

HRP: Peroxidase aus Meerrettich

Viele Tyramid-Moleküle fluoreszieren nach Reaktion mit HRP

1000-fache erhöhte Empfindlichkeit bei schwach leuchtenden Bakterien

Pernthaler et al. (2002) Appl Environ Microbiol

Engl. probe = Sonde

© Heribert Cypionka www.pmbio.icbm.dehttp://www.pyrosequencing.com/graphics/3019.pdf

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NanoSIMS

•••• Kombination von Identifizierung (Fluor-markierte RNA-Sonde) und Aktivitätsindikatoren ( 13C- oder 15N-markierte Substrate) bei einzelnen Zellen

Dr. Peter Hoppe vom Mainzer Max-Planck-Institut für Chemie vor der Nanosims-Ionenmikrosonde, einem neuartigen Sekundärionenmassenspektrometer.

Die Bilder aus dem Nano-SIMS zeigen einzelne Zellen und ihre Stickstoff- und Kohlenstoffaufnahme. Hier eine Zelle von Chromatium okenii.Quelle: Niculina Musat, MPI Bremen

Date post:	29-Mar-2019
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