Acta histochem. 75, 85-90 (1984)

Institnt HiI' Morphologie del' Bulgarischen Akademie del' vVissenschaften (Direktor: Prof. Dr. 1. GORANOV), Sofia, BuIgarien

Eine direkte Bleisalzmethode zum histochemischen Nachweis der Myosin-Adenosintriphosphatase bei optimalem pH

Direct method with lead salts for enzyme-histochemical demonstration of myosin-adenosintriphosphatase at optimal pH

Von ANGEL DIKOV und IVAN GORANOV

::Vlit 2 Abbildungen

(Eingegangon am 22. November 1983)

Zusammenfassung

In del' vorliegenden Arbeit wird eine direkte Bleisalzmethode zum histochemischen Nachweis del' Myosin-AdenosiYltriphosphatase beschrieben, die bei optimalem pH = 9.4 durchgefiihrt wire!.

Den Autoren ist es gelungen, bei alkalischem pH einen sehr stabilen Komplex zwischen Tris­(hydroxymethyl)aminomethan und Blei(II)-citrat zu bilden, del' eine direkte Priizipitation del' frei­gesetzten Phosphationen als Bleiphosphat zuliiLlt_

Diese einstufige Methode zum histochemischen Nachweis der Myosin-Adenosintriphosphatase gibt gute und reproduzierbare Ergebnisse und kann als Enzymmarker des Muskelfasertyps II bei del' Fasertypendifferenzierung und Beurteilung del' Skeletmuskulatur in der klinischen Patho­logie bei del' Diagnose del' degenerativen Muskelerkrankungen von primiirer und sekundiirer Natur crfoIgreich verwendet werden.

Summary

The authors propose a direct method for enzyme-histochemical demonstration of myosin­adenosintriphosphatase, throught lead ions and optimal pH = 9.4_

They havc succeeded in developing a stable complex between tris(hydroxymethyl)aminomethan and lead(II)citrate, as result of which, at the alcaline pH of the enzymic reaction a direct precipi­tation of the liberated phosphate takes place in the form of lead phosphate.

This one-step method for histochemical demonstration of the enzyme makes possible well reproducible result,s as an enzyme marker of muscle fibres type II in the differentiation of the type of muscle fibre and the evaluation of the sceletal musculature in general.

Because of this, the reaction may be applied with succes in clinical pathology for the diagnosis of the degenerative muscular diseases of primary or secondary origin.

Einleitung

Die Adenosintriphosphatase (EO 3.6.1.3. Adenosintriphosphat-Phosphohydrolase) besteht nach zahlreichen biochemischen und histochemischen Untersuchungen aus mehreren Typen, die sich vor aHem gegentiber Aktivatoren, Inhibitoren, pH-Opti­mum und intrazeHularer Lokalisation unterscheiden. Einer dieser Typen ist die Myo­sin-Adenosintriphosphatase (Myosin-ATPase), die ein pH-Optimum von pH = 9 auf-

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weist und von Calciumionen aktiviert wird. Ihr histochemischer Nachweis spielt als Enzymmarker des Muskelfasertyps II eine sehr wichtige Rolle in der klinischen Patho­logie bei der Diagnose der degenerativen Muskelerkrankungen von primarer und se­kundarer Natur (RATH 1981).

ZUlll histochemischen Nachweis der Myosin-ATPase bei pH = 9.4 wird die Calcium­Cobalt-Methode nach PADIKULA und HERMAN (1955) oder ihrer Modifikation nach LOJDA et al. (1976) verwendet. Diese Methoden sind 2stufig und wei sen die gleichen Schwierigkeiten und Artefakt-Ursachen wie die fiir die alkalische Phosphatase nach GOMORI (1939) auf.

In dieser Arbeit wird eine direkte BIeisalzmethode zum histochemischen Nachweis der Myosin-ATPase bei ihrem optimalem pH = 9.4 beschrieben.

Material und Methoden

::\Iuskelgewebe (M. quadriceps femoris) wurde als Autopsiematerial erwachsenen Menschen (ca. 6 It nach dem Tod) entnommen und sofort in flussigem Stickstoff eingefrol'en. Es wurden Kryo­statschnitte verwendet, die fUr 5 min mit eiskalter 1 %iger Paraformaldehydlosung in 0,1 mol Cacodylatpuffer, 0,15 mol NaC!, pH = 7,4 vorfixiert wurden. Nach 4maligem 'Vaschen mit kalter 0,9%iger Kochsalzlosung folgte die Inkubation mit einem Gelsubstratmedium.

H erstellen des T1'is/ BleicitratpufJers: 0,2 mol Tris(hydroxymet hyl)aminomethan z. A. (E . Merck, BRD) und 4 mol BIei(I1)-citrat-!l-hydrat [fur die Elektronenmikroskopie (E. Merck, BRD)] wurden mit 2/3 des entsprechenden Volumens frischer Aqua bidestiIIata durch Verruhren und Erhitzen bei 90°C gelost. Nach Abkuhlen del' Losung wurden 0,15 mol NaCl und 5 mmol CaCI2 (vorher im Wasser gelost) zugefugt und danach bis zum entsprechenden Volumen mit Wasser nachgefUllt. Del' so vorbereitete Puffer ist klar, hat bereits ein pH = 9,4, das keine Korrigierung braucht, und ist in gut verschlossener Flasche bei Zimmertemperatur lange Zeit halt bar, ohne Trubung zu zeigen.

Zusammensetzung des Gelinkubationsmediums: 7,5 ml yom oben beschriebenen TrisfBleicitrat­Puffer wurden auf 50°C erwarmt, mit 2 ml 3%iger Agaroselosung gut gemischt und 20 mg (ca. 4 mmol) Adenosintriphosphat-di-Natriumsalz, gelost in 0,5 ml 'Vasser, zugegeben. Das flussige Medium wurde auf Objekttrager aufgegossen und nach Gelifizieren wurden die die Deckglaschen mit den Kryostatschnitten auf das Gelmedium leicht gedruckt und bei 37°C fUr 45 bis 60 min bebrutet. Danach wurden die Deckglaschen mit den Kryostatschnitten yom Gelmedium abge­trennt, 4- bis 5mal mit 0,15 mol NaCI Losung gewaschen und mit 4%iger neutraler Formaldehyd­IOsung fur 15 min nachfixiert. Die gut mit Wasser gespUlten Schnitte wurden fUr 2 min in I %iger gelber Ammoniumsulfidlosung eingebracht, fUr 10 min gewassert und in Glycerin-Gelatine einge­deckt.

KOlltrollversuche: Del' histochemische Nachweis del' alkalischen Phosphatase (EC 3.1.3.1.) erfolgte auf den wie oben vorfixierten Schnitten mit einem Inkubationsmedium mir folgender Zusammensetzung: 0,25 mol Tris/HCI-Puffer, pH = 9,6, 5 mmol MgCI2, 2 mmol Napthtol-AS­MX-phosphat und 0,8 mg/ml Variaminblausalz B. Die Inkubation wurde bei 37°C fur 1 h durch­gefiihrt.

Inhibieren del' Myosin-ATPase-Aktivitat mit 4-Chlormercuribenzoesiiure (4-CMB). Nach del' Vorfixation wurden die Schnitte fiir 30 min in 3 mmol 4-CMB gelost in 0,2 mol TrisiHCl-Puffer, pH = 9,4, prainkubiert und danach im Gelsubstratmedium bebrutet.

Ergebnisse

Die Aktivitat der Myosin-ATPase - nachgewiesen mit der von uns vorgeschla­genen histochemischen Methode -lokalisiert sich durch Auftreten von braun gefarb­tem Bieisulfid an den enzymaktiven Stellen. Wie am Querschnitt der Skelletmusku­latur zu sehen ist (Abb. la), sind die Muskelfasern des Typs II stark angefarbt, da­gegen die des Typs I fast oder vollig negativ, was dem histochemischen Bild einen

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Abb. 1. Querschnitt des 1\1. quadriceps femoris. l\Iyosin-ATPase-Reaktion nach der direkten BIei­salzmethode, pH = 9,4. 8ehr starke Enzymaktiyitat del' Typ II-, sehr geringe bis fehlende Aktivi­tat del' Typ I-l\luskelfasern_ Ct: 50 : 1, b: 400 : 1.

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Abb. 2. Langsschnitt vom M. quadriceps femoris. Myosin-ATPase-Reaktion nach der direkten Bleisalzmethode, pH = 9,4. Sehr starke Enzymaktivitat der Typ II-, sehr geringe his fehlende Aktivitiit der Typ I-Muskelfasern. a: 50: 1, b: 400 : 1.

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starken Kontrast verIeiht. Bei starkerer VergroBerung (Abb. 1 b) sieht man, daB das Reaktionsprodukt nicht diffus, sondern myofibrillar lokalisiert ist, wobei es in der intermyofibrillaren Substanz fehlt. AIle GefaBwande sind stark braun-schwarz ge­farbt. Bei Langsschnitt der Skeletmuskulatur (Abb. 2a, b) heben sich wieder die stark angefarbten Muskelfasern des Typs II von denen des Typs 1 ab, die fast negativ sind.

Die Kontrollversuche mit dem histochemischen Nachweis der alkalischen Phospha­tase zeigten, daB die Muskelfasern vollig negativ sind und daB das Reaktionsprodukt nur in den Kapillaren- und Arteriolenwanden lokalisiert ist. Die Hemmversuche der Myosin-ATPase Aktivitat durch Prainkubation mit 3 mmol 4-CMB zeigen eine totale Inhibition der Enzymaktivitiit in den Muskelfasern.

Diskussion

Die Methoden, die die ~Iyosin-ATPas3 bei ihrem optimalen pH = 9,4 nachweisen, sind nul' diejenigen, bei denen del' Nachweis mit dem Calcium·Cobalt-Verfahren nach dem klassischen GOMom-Prinzip erfolgt (GoMORI 1939). Hierzu gehoren die Calcium-Cobalt-Methode nach PADI­KULA und HERl\IAN (1955) und ihre Modifikation nach LOJDA et aI. (1976) sowie die Calcium-Citro­Phosphat-Methode nach KHAN et aI. (1972) Diese Methoden sind 2stufig und weisen aile Xacht~jje del' GOMoRI-Methode zum histochemischen Nachweis del' alkalischen Phosphatase auf. lIIEIER (1970) hat eine direkte Bleisalz-Methode zu histochemischem Nachweis del' Myosill-ATPa~e vorgeschlagen, die abel' bei pH = 7,2 durchgefiihrt wird und deswegen eine Vorinkubation del' Schnitte in alkalischem Puffer pH = 9,4 benotigt, um eine gro13ere Differenz del' Enzymreaktion zwischen den beiden Typen von Muskelfasern zu erreichen (MEIJER et aI. 1977). Das pH = 7,2 des Inkubationsmediums diesel' ::\Iethode, das weit von dem pH-Optimum del' ::\Iyosin-ATPase liegt, erklart sich mit del' Tatsache, dal3 Bleiionen in alkalischer Losung unlosliche Bleihydroxid­niederschlage bilden, was auch verschiedene Komplexbildner nicht verhindern konnen.

1m Laufe unserer Untersuchungen iiber den elektronenmikroskopischen Nachweis del' fllka­lischen Phosphatase del' Lymphocyten (DIKOW et aI., im Druck) hab3n wir eine bleiionelllnltigc Pufferlosung von pH = 9,4 entwickelt, die keine Bleihydroxidniederschlage bildet und lango Zeit haltbar ist. Diesel' TrisjBlcicitrat-Puffer hat sich auch als sehr geeignet fiir den histochemi,chen Nachweis del' Myosin-ATPase erwiesen. DdS Stabilisieren del' Bleiionen bei alkalischem pH i:st uns gelungen, indem wir einen sehr stabilen Komplex direkt zwischen Tl'is(hydroxymethyl)­amillomcthaa und Blei(II)-citl'at bildeten. Diese Pufferlosung braucht keine pH-Korl'ektur, und auch die Zugabe von Calciumionen als Aktivatol' del' Myosin-ATPase weist keine naeht2ilige 'Vil'kung auf. Die Endkonzentration von 3 mmol Bleiionen hemmt die Enzymaktivitiit nicht und erlaubt eine gute Fallung del' freigesetzten Phosphationen. Die Benutzung del' Inkubationslosung als Gelmeclium verhindel't die Ablagerung eines unspezifischen Niederschlages, del' sich bei del' Hydrolyse des Ade::lOsintriphosphates in Gegenwart von Bleiionen bildet (MOSES et aI. 1968).

Die Spezifitatskontl'ollen iiber den Einflu13 del' Aktivitat del' alkalischen Phosphatase bei del' Myosin-ATPas8-Reaktion sowie die Hemmversuche mit 4-CMB el'gaben, dal.l es sich bei del' von und beschriebenen um eine spezifische Reaktion del' Myosin-A TPase handelt. Die Vol'inkubation del' Schnitte im alkalis chen :\Iedium (~IEIJER et aI. 1977) fiihrt zu einer Inaktivierung del' Myosin­ATPase in den Muskelfasern des Typs I (ZIEGA=" 1979), was auch bei del' von uns vorgeschlagonen Methode zu beobachten ist. Die3e "Aufheliung" (ZIEGAN 1979) ist sehr erwllnscht und filhrt zu einer noeh gro13eren Differenz zwischen den beiden l\Inskelfasertypen und verleiht dem histo­ehemisehen Bild noch mehr Kontrast.

Die von uns beschriebcne l\lethocle zum histochemischen Nachweis del' }fyosin-ATPas3 bei ihl'em optimalen pH ist leicht durchzufiihl'en, gibt gute und repl'oduzierbare Ergebnisse nUll kann routinemiWig als Enzymmal'kerreaktion des :\Iuskelfasertyps II hei Fasertypendifferenzierung und Beurteilung del' Skeletmuskulatur in del' klinischcn Pathologic fiir die Diagnose del' degcnera­tiven }fuskderkrankungen verwendet werden.

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Anschrift des Verfassers: Dr. med. Dr. reI'. nat. A "GEL DIKO\\', Institut fi.ir Morphologie del' Bulgarischen Akademie cler VVissenschaften, ul. Akad. G. BontsellY, 21i, BG - 1113 Sofia.