Beitr. Path. Bd. 156,280-288 (1975) Practical Notes

Institut fiir Pathologie der Universitat Hamburg (Geschaftsfiihrender Direktor: Prof. Dr. G. Seifert)

Einbettung mineralisierten Knochengewebes fur die Elektronenmikroskopie1

)

Embedding of Undecalcified Bone Tissue for Electron Microscopic Investigation

A.SCHULZ

Mit 2 Abbildungen und 1 Tabelle . Eingegangen am 30. Juni 1975 . Angenommen am

6. August 1975

Key words: Electron microscopy - Bone, undecalcified - Embedding me­dium - Anhydride-epoxide ratio - Cutting procedure

Abstract Introduction: The preparation of undecalcified bone tissue for electron microscopic

investigation depends on the quality of the embedding medium. Penetration of bone tissue is improved by a low viscosity of the monomer plastic material. Hardness of polymerized embedding medium should be similar to bone tissue, but a good cutting quality must be maintained.

A low viscosity resin proposed by Spurr (1969) proved to be in compliance with these conditions.

Material and methods: The embedding medium is composed of four components: vinylcyc1ohexenedioxide (ERL, 4206), polyglycolepoxide (DER 736), nonenyl succinic an.hydride (NAS) and dimethylaminoethanol (DMAE).

The most favourable molar ratio between anhydride (NSA) and epoxide (ERL 4206 and DER 736) was A : E = 0.81 : 1. Hardness and brittleness of polymerized epoxy resin can additionally be influenced by varying the amounts of both epoxy components in the final mixture. ;

1) Mit Unterstiitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft, SFB 34 - Endokrinologie, Hamburg.

Elektronenmikroskopie des Knochens - Einbettungsmedium . 281

Human iliac crest trabecular bone as well as rat bone tissue were embedded to test the quality of the medium.

Results: Ultra-thin sections were performed at low cutting speed (0.5 mm/sec) using diamond knives. Artificial alterations of bone surfaces did hardly occur due to a good penetration of the bone tissue. The special hardness of the embedding medium stabilized the tissue, thus chattering of the transition from osteoid to mineralized bone could be markedly reduced.

In der Aufarbeitung unentkalkten Knochengewebes hat sich Methyl­methacrylat als Einbettungsmedium bewahrt (Delling, 1972). Dieser Kunststoff wurde anfangs auch in der Elektronenmikroskopie des Kno­chengewebes benutzt (Scott and Pease, 1956; Gonzales and Karnovsky, 1961; Cameron, 1961), ist jedoch wegen seiner nachteiligen Eigenschaften (Schrumpfung bei der Polymerisation, Sublimation im Elektronenstrahl) weitgehend verlassen worden (Plattner, 1973). Unter den heute gebrauch­lichen Epoxyharzen wie Maraglas, Araldit und Epon hat sich besonde'rs Epon 8 I2 durchgesetzt (Cooper et aI., 1966; Malkani et aI., 1973; Criss­man and Low, 1974; Brighton and Hunt, 1974).

Gunstige Ergebnisse liefert die Epon-Einbettung nach Luft (1961), da bei dieser Methode eine Variation der Harte des Polymerisates durch Mi­schen zweier Stammlosungen von Epon 8 I2 mit verschiedenen Hartern ermoglicht wird. Eigene Erfahrungen in der Verwendung dieses Einbet­tungsmediums haben gezeigt, da6 eine ausreichende Harte fur gering mi­neralisiertes tierexperimentelles Knochengewebe erreicht werden kann (Donath und Delling, 1971; Delling und Donath, 1973; Schulz et aI., I974). Fur die unentkalkte Praparation komplett mineralisierten Knochengewebes aus menschlichem Biopsiematerial sind die Ergebnisse jedoch unbefriedigend. Bei der Erprobung anderer Einbettungsmedien fur die unentkalkte Auf­arbeitung des Knochengewebes wurden folgende Vorstellungen zugrunde gelegt:

I. Die Penetration des Gewebes solI durch Verwendung eines monome­meren Kunststoffes mit moglichst niedriger Viskositat verbessert wer­den.

2. Die Harte des Polymerisates solI bei erhaltener Schneidbarkeit mog­lichst weit der Harte des mineralisierten Knochens angeglichen wer­den.

Unter den Kunststoffen, die erprobt wurden, erzielten wir die besten Resultate mit einem Epoxyharz, das von Spurr (I969) unter der Bezeich­nung "low viscosity resin" vorgestellt wurde. Vber Praparatioq, Technik und Schnittergebnisse solI im folgenden berichtet werden. Die erfolgrei-

282 . A. Schulz

che Anwendung dieses Einbettungsmediums bei der experimentellen Un­tersuchung der Knorpelverkalkung (Thyberg, 1974) bestatigt unsere Er­fahrungen.

Material und Methoden Material

In der von Spurr (I969) angegebenen Einbettung besteht die Losung des monomeren Kunststoffes aus vier Komponenten: Die beiden Epoxyharze sind Vinylcyclohexendioxid (ERL 4206) und Polyglykolepoxid (DER 736), als Harter wird Nonenyl-Bernsteinsaure­Anhydrid (NSA) verwendet, der Beschleuniger ist Dimethylaminoaethanol (DMAE)2).

r. Die harte Epoxyharzkomponente Vinylcyclohexendioxid ist ein cycloalipathisches Di­epoxid mit einem Molekulargewicht von I40,0. Es besitzt mit 7,8 cP (25 0 C) die niedrig­ste Viskositiit aller iiblicherweise verwendeten Epoxyharze (Spurr, I969). Das Epoxid­aquivalent der im Handel erhaltlichen Substanz liegt bei 74-78 g.

2. Ais weiche Epoxidkomponente wird ein Polyglykolepoxid (DER 736) mit einem Mo­lekulargewicht von 380,0 verwendet. Dieser Diglycidylather von Propyl en glycol hat ebenfalls eine relativ niedrige Viskositat von 30-60 cP (25 0 C), das Epoxidaquiva­lent des handelsiiblichen Praparates liegt zwischen I75 und 205 g.

3. Das als Harter dienende Nonenyl-Bernsteinsaure-Anhydrid, hat ein Molekulargewicht von 224,0 und besitzt verglichen mit anderen Hartern eben falls eine niedrige Visko­sitat von II7 cP (25 0 C).

4. Ais Beschleuniger des Polymerisationsvorganges wird Dimethylaminoaethanol zuge­setzt. Die Viskositat betragt 3,32 cP (25 0 C).

Die physikalischen Eigenschaften des polymerisierten Epoxyharzes werden beeinflu6t durch das molekulare Verhaltnis von Anhydrid zu Epoxid (A : E) im Einbettungsme­dium (Burke and Geiselman, I97I). Durch Variation dieser beiden Bestandteile andert sich die Anzahl der Quervernetzungen zwischen den Molekiilen wahrend des Polymeri­sationsvorganges (Luft, I96I). In der industriellen Kunstharzproduktion werden iibli­cherweise A : E-Verhaltnisse von 0,6 : I bis I : I angewendet (s. Spurr, I969). Ein niedri­ges A : E-Verhaltnis bewirkt ein weiches Polymerisat, ein hohes A : E- Verhaltnis ein har­tes Polymerisat; bei Annaherung an das Verhaltnis I : I wird der Kunststoff sprode und briichig und ist fiir die elektronenmikroskopische Praparation nicht mehr geeignet.

Den giinstigsten Kompromi6 zwischen Harte des Polymerisates und erhaltener Schnei­defahigkeit ergab ein Verhaltnis von A: E = 0,8I : r. Dieser Quotient liegt etwas nied­riger als der von Spurr (I969) empfohlene (A : E = 0,88 : I). Eine bessere Hartung des Polymerisates konnte durch Veranderung des Verhaltnisses der beiden Epoxyharzkom­ponenten zueinander erreicht werden. Nach der Rezeptur von Spurr (I969) variiert das Verhaltnis der weichen Komponente DER 736 zur harten Komponente ERL 4206 von I : I,25 (weich) bis I : 2,5 (hart). Fiir die Einbettung unentkalkten Knochengewebes mu6-te der Gehalt der weichen Komponente des Gesamtgemisches weiter reduziert werden, so da6 sich ein Gewichtsverhaltnis von DER 736: ERL 4206 = I : 8 ergab. Die Be­rechnung des von uns durchgefiihrten Ansatzes gibt Tabelle I wieder.

2) Die Substanzen sind in der BRD iiber die Firma SER V A, Heidelberg, sowie iiber die Firma Dr. Hert-Mikrotechnik KG, Miinchen (Vertrieb der POLARON-Erzeugnisse) zu beziehen.

Elektronenmikroskopie des Knomens - Einbettungsmedium . 28 3

Tabelle 1 Berechnung und Ansatz des Einbettungsmediums Table 1. Composition of the embedding medium

Anhydrid NSA

Epoxide ERL 4206 DER 736

Starter DMAE

Gesamtgewicht

Mol-Gewicht Epoxidaqui­valent ,:.)

224

75 175

Ansatz Molares In g Verhaltn.

500 2,2

200 2,6

25 0,1

73 0

':') Epoxidaquivalent laut Angabe des Herstellers.

Ansetzen der Losung

Anhydrid Epoxid

0,81

1.0

A

E

Die Gesamtlosungsmenge (nam Tab. I) von 730 g wird in einem Erlenmyerkolben angesetzt. Die einzelnen Komponenten in der Reihenfolge ERL 4206, DER 736, NSA zusammengegeben und anschlie~end noch 5 g des Beschleunigers DMAE hinzugefiigt. Nach einer griindlichen Durchmischung von etwa 15 Minuten (Magnetriihrer) wird das Einbettungsmedium fiir I Stunde in einem Exsikkator bei leichtem Vakuum entliiftet. Die Aufbewahrung der gebrauchsfertigen Mischung erfolgt tiefgekiihlt in Polyathylen­flaschen mit SchraubverschluE. Unter dies en Bedingungen ist das Einbettungsmedium 2

bis 3 Monate trotz mehrfachen Auftauens verwendbar. Von der Gesamtcharge wird je­wei Is nam dem Neuansatz eine Probepolymerisation von 2 bis 4 Blockmen ohne Ge­webe vorgenommen, urn sicherzugehen, da~ die physikalischen Eigenschaften (Harte, Schneidfahigkeit) den Erwartungen entsprechen.

Praparation des Gewebes

Das operativ, bioptisch oder experimentell gcwonnene Knochengewebe wird fiir 4 Stunden in 2,3% Glutaraldehy-Cacodylatpufferlosung (pH 7,4, 300 mosmol) fixiert, in Natrium-Cacodylatpuffer gespiilt und anschlieBend in 1,3010 Osmium Tetroxyd-S-Col­lidinpuffergemisch nachfixiert (Schulz et aI., 1974). Nach Entwasserung in der aufstei­genden Alkoholreihe erfolgt ein mehrstufiger Obergang vom 100010 Alkohol in das Ein­bettungsmedium.

Einbettung

Zu den Probenglaschen mit 100010 Alkohol wird die gleiche Menge an Einbettungs­medium mit allen Komponenten hinzugesetzt. Nach I Stun de wird die Hiilfte dieses Gemisches abgegosscn und emeut die gleiche Menge reinen Einbcttungsmediums hinzu­gefiigt. N ach einer weiteren Stunde wird die gesamte Mischung abgegossen und durch reines Einbettungsmedium ersetzt. Zur griindlichen Penetration des Gewebes werden die

284 . A. Schulz

Proben iiber Nacht bei Zimmertemperatur in einem Exsikkator bei leichtem Vakuum aufbewahrt. Am nachsten Morgen erfolgt das GieBen in Gelatine-Kapseln, wobei sich die Verwendung einer medizinischen Tropfpipette bewahrt hat. AnschlieBend werden die Blockchen fiir mindestens 8 Stun den im Brutschrank bei 70° C polymerisiert. Eine langere Inkubationszeit hat keine nachteiligen Folgen.

Schneidetechnik

Nach Abweichen der Gelatinekapseln konnen von den Blockchen sofort Semidiinn­schnitte mit Glasmessern hergestellt werden. Die Ibis 2 f1 dicken Semidiinnschnitte wer­den auf einem Wassertropfen gestreckt und anschlieBend iiber einer Warmeplatte ge­trocknet. Die besten Farbeergebnisse erreichten wir mit der auch von Spurr (1969) ange­gebenen Azur-II-MethylenbHiufarbung nach Richardson et at. (1960).

Ultradiinnschnitte werden nach dem Zutrimmen der Blocke auf rechteckige oder tra­pezformige Schnittflachen mit einer unteren Kantenlange von 0,3 bis 0,5 mm durchge­fiihrt. Dabei hat sich die Verwendung von Diamantmessern mit einer schmal en Schnei­dekante von 1,0 bis 1,2 mm bewahrt. Bei geringer Schneidegeschwindigkeit (0,5 mm/sec) ist die Herstellung silberner Schnittbander mit guter Reproduzierbarkeit moglich. Die Schnitte werden auf Formvar-befilmten, kohlebedampften Kupfernetzen (Maschenzahl: Square 100) durch Adhasion aufgefangen. Eine Streckung der Schnitte ist im allgemei­nen nicht erforderlich. Die Kontrastierung erfolgt mit einer gesattigten alkoholischen Uranyl ace tat- und einer wasserigen Bleicitratlosung (Donath und Delling, 1971).

Ergebnisse Die Schnittergebnisse wurden kontrolliert auf artefaktfreie Darstel­

lung der endostalen Knochenoberflachenzellen und der Osteozyten. Die endostalen Mesenchymzellen und die Osteoklasten, die auf der komplett mineralisierten Knochenoberflache liegen, werden abgebildet, ohne daB storende Einrisse oder Ablosungsartefakte an der Kontaktflache zwischen Zellen und Knochen auftreten (Abb. I). Die im mineralisierten Knochen

Abb. 1. Spongiosa aus emer Beckenkammbiopsie. Oben: Spongiosaoberflache mit an­grenzendem Markraum (Semidiinnschnitt, X 400). Mitte: Osteoidsaum mit quergeschnittenen Kollagenfaserbiindeln. Dariiber eine endostale Belegzelle und Fettzellen des Markraumes (X 5400). Unten: Osteozyt im mineralisierten Knochen (X 6000).

Fig. 1. Cancellous bone of an iliac crest bone biopsy. Top: Endosteal bone surface with adjacent marrow cavity (semi-thin section, X 400). Middle: Electron micrograph of an osteoid seam with collagen fiber bundles convered by a lining cell and fat vacuoles (X 5,400). Bottom: Electron micrograph of mineralized bone with an osteocyte in its lacunae (X 6,000).

Elektronenmikroskopie des Knochens - Einbettungsmedium . 28 5

286 . A. SdlUlz

Abb.l

Elektronenmikroskopie des Knochens - Einbettungsmedium . 287

gelegenen Osteozyten zeigen ebenfalls eine gute Haftung an der Lakunen­wand, auch bei alteren resorbierenden oder degenerierenden Osteozyten ist der perizellulare Spaltraum erhalten (Abb. 2).

Eine Verbesserung ergibt sich weiterhin in der Darstellung der Osteo­blasten, bei denen leicht infolge der unterschiedlichen Konsistenz von Osteoidsaumen und mineralisiertem Knochen Stauchungsartefakte auftre­ten. Das Einbettungsmedium scheint durch seine gute Penetrationsfahig­keit und ausreichende Harte die Osteoidsaume auf dem mineralisierten Knochen zu stabiIisieren. Dies ermoglicht eine gute BeurteiIung der La­gerung von KollagenfaserbUndeln und der Anordnung der Mineralisa­tionsfront.

Eine Schnittkontrastierung ist erforderlich, da der Eigenkontrast der Schnitte gering ist. Eine Sublimation oder Verarrderung des Einbettungs­mediums auch bei langerer Betrachtung im Elektronenmikroskop wurde nicht beobachtet. Die Haltbarkeit der Schnitte im Elektronenstrahl ist gut, sie wird durch Verwendung Formvar-befiImter und kohlebedampf­ter Netze noch verbessert.

Zusammenfassung Die Verwendung eines niedrig-viskosen Epoxyharzes mit regulierbarer Harte des Poly­

merisates verbessert die Pdiparation unentkalkten Knochengewebes fur die Elektronen­mikroskopie. Die gute Penetrationseigenschaft der Einbettungslosung erhoht die Haftung der Zellen an den Knochenoberflachen. Durch die Harte des Polymerisates wird das Gewebe stabilisiert, so daB Stauchungsartefakte weitgehend vermieden werden konnen. Die Schnittergebnisse werden anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen demonstriert.

Besonderer Dank gilt der sorgfaltigen technischen Assistenz durch Fraulein Karin Heigl.

Abb. 2. Spongiosa aus der Tibiamethaphyse der Ratte. Oben : endostale Spongiosaober­flache mit einer Kapillare ( X 7000). Unten: Osteozyt mit mineralisierten Knochen (X 6 500). Fig. 2. Cancellous bone of the rat (tibial metaphysis). Top: Electron micrograph of endosteal bone surface with a capillary (X 7,000). Bottom: Electron micrograph of an osteocyte in its lacunae (X 6,500).

288 . A.ScilUlz

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Dr. med. Andreas Schulz, Institut fur Pathologie des Universitatskrankenhauses Ep­pendorf, D-20oo Hamburg 20, MartinistraBe 52