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Gewebekultur Dr. Susanne Rühmann Fachgebiet Obstbau
Gewebekultur
Dr. Susanne Rühmann
Fachgebiet Obstbau
GewebekulturIsoliertes Pflanzenmaterial (Explantat)
Gewebekultur
Knospen Wurzeln Internodien Blätter
Antheren/Pollen /Samenanlage Sämling Samen
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat)
GewebekulturIsoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
Gewebekultur
Natrium hypochloritoder/und Ethanol
Oberflächen sterilisiertes
Explantat
autoclaviertes(sterilisiertes)
Wasser
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
GewebekulturIsoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium)
GewebekulturIsoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium)
1. Makro Nährstoffe (N, P, K, Mg, Ca)
2. Mikro Nährstoffe (Spurenelemente)
3. Vitamine, Aminosäuren
4. Kohlehydrate (Zucker)
5. Phytohormone
6. Agar-agar; Gelrite (zur Verfestigung)
Gewebekultur
Nährlösung
Agar Agar; Gelrite
Nährlösung + Agar Agar
kochen In Kulturröhrchen
abfüllen
Autoklavieren der Kultur-gefäße (121°C für 20 min)
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium)
GewebekulturIsoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium) unter sterilen Bedingungen
Glass-schub
Filter
Arbeitsfläche
GewebekulturIsoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium) unter sterilen Bedingungen
kontrollierte Bedingungen
z.B.16h Licht, 23 / 19°C
www.bfhwsd.de/biotechn
ologische_arbeiten.htm
GewebekulturIsoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium) unter sterilen Bedingungen
Wozu braucht man die Gewebekultur oder pflanzliche Zellkultur?
• Eliminierung von Krankheiten (Pilze, Bakterien, Viren)
• Pflanzenvermehren mit hoher Vermehrungsrate
• Archivierung und Lagerung von Zuchtklonen oder wichtigen Sorten
• Züchtung
• Produktion von Pflanzenstoffen (ätherische Öle, SecondärePflanzenstoffe, Karotinoide, Anthocayne …)
• Wissenschaftliches Model System
Voraussetzungen: Totipotenz/Omnipotenz von Pflanzenzellen
Totipotenz:
Fähigkeit von einer Zelle sich zu jeder beliebigen Zelle, Gewebe oder sogar zu einem
ganzen Organsmus zu regenerieren
– Menschen und Tiere => nur embrionale Zellen sind maximal totipotent bis zu
einer Zellteilungsphase von 4-8-Zellen
– Pflanzen => alle Pflanzenzellen sind totipotent?
(Hypothese: Gottlieb Haberland 1902)
Totipotente Pflanzen Zellen:
• nicht-differenzierte Zellen
– meristematische Zellen in
• Knospen (vegetative / generative)
• Wurzeln
• Pollen / Samenanlagen
• Borken-Meristem
• Schlafende Knospen
Voraussetzungen: Totipotenz/Omnipotenz von Pflanzenzellen
Totipotente Pflanzen Zellen:
• De-Differenzierung von Pflanzenzellen
=> Entwicklung von sekundärem Meristem
– Phloem Zellen (Daucus carota 1958 F.C. Steward)
– Mark Gewebe (Nicotiana 1962 A.C. Hildebrandt)
Voraussetzungen: Totipotenz/Omnipotenz von Pflanzenzellen
Geschichte der Gewebekultur
• 1756: Duhamel du Monceau
– Beschreibt die Bildung von Kallus und Wundheilung bei
Bäumen
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1756: Duhamel du Monceau
– Beschreibt die Bildung von Kallus und Wundheilung bei
Bäumen
Kallus: nicht differenzierter Pflanzen-Zell-Komplex (parenchymatisch) mit nicht
gerichtetem Wachstum. Die Bildung von Kallus wird verursacht durch:
– Verwundung (Schnitt, Verwundung durch Insekten oder Fraß ,
Windbruch, …)
=> Kallus verschließt die Wunden (Narben-Gewebe)
– Holzpflanzen (lignifizierte) Pflanzen: Kallus hautsächlich aus Kambium
– Krautige Pflanzen: Kallus hauptsächlich aus dem Parenchym
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1756: Duhamel du Monceau
– Beschreibt die Bildung von Kallus und Wundheilung bei Bäumen
• 1838/39: M.J. Schleiden und T. Schwann
– Zelltherorie (Hypothese): Zelle als Basismodule von allen lebenden Individuen
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1756: Duhamel du Monceau
– Beschreibt die Bildung von Kallus und Wundheilung bei Bäumen
• 1838/39: M.J. Schleiden und T. Schwann
– Zelltherorie (Hypothese): Zelle als Basismodule von allen lebenden Individuen
• 1902: Gottlieb Haberlandt
– erste (nicht wirklich erfolgreich) praktische Versuche von Einzelzellen, die auf
einem synthetischen (künstlichen) Medium
kultiviert wurden [theoretisch möglich]
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1922: Kotte (D) bzw. Robbins (U.S.A.)
– Verwendung von meristematischen Zellen aus Wurzelspitzen (apex) und
Knospen
• Kotte: Wurzeln wachsen 2 Wochen, keine Subkultur
• Robbins: Subkulturen von Wurzelkulturen ; Initiation von Sprosswachstum aus
Knospen
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1924 Blumenthal und Meyer
– Entwicklung von Kallus aus Wurzel-Explantaten von Karotten (Daucus carota)
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1924 Blumenthal und Meyer
– Entwicklung von Kallus aus Wurzel-Explantaten von Karotten (Daucus carota)
• 1935 Snow– IAA (Indolessigsäure) stimuliert die Aktivität von Kambium
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1924 Blumenthal und Meyer
– Entwicklung von Kallus aus Wurzel-Explantaten von Karotten (Daucus carota)
• 1935 Snow– IAA (Indolessigsäure) stimuliert die Aktivität von Kambium
• 1939 White, Nobécourt, Gautheret (unabhängig)
– Möglichkeit einer unlimitierten Vermehrung von Pflanzenmaterial (Karotten)
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1924 Blumenthal und Meyer
– Entwicklung von Kallus aus Wurzel-Explantaten von Karotten (Daucus carota)
• 1935 Snow– IAA (Indolessigsäure) stimuliert die Aktivität von Kambium
• 1939 White, Nobécourt, Gautheret (unabhängig)
– Möglichkeit einer unlimitierten Vermehrung von Pflanzenmaterial (Karotten)
• 1948 Caplin und Steward
– Nutzung von Kokusnussmilch für die Vermehrung von in vitro Pflanzen
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1957 Skoog und Miller
– Isolation von Kinetin aus autoclaviertem Hefe-Extrakt => induziert in Kombination mit Auxin (IAA) die Vermehrung von Tabakzellen of tobacco cells
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1957 Skoog und Miller
– Isolation von Kinetin aus autoclaviertem Hefe-Extrakt => induziert in Kombination mit Auxin (IAA) die Vermehrung von Tabakzellen of tobacco cells
• 1962 Murashige und Skoog
– Entwicklung von in vitro Kultur-Medium; bis heute am häufigsten verwendet (modifiziert)
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1957 Skoog und Miller
– Isolation von Kinetin aus autoclaviertem Hefe-Extrakt => induziert in Kombination mit Auxin (IAA) die Vermehrung von Tabakzellen of tobacco cells
• 1962 Murashige und Skoog
– Entwicklung von in vitro Kultur-Medium; bis heute am häufigsten verwendet (modifiziert)
• 1966 Guha und Maheshwari
– Produktion von haploiden Pflanzen aus Datura innoxia Antheren
Quelle: Gautheret 1985
botany.csdl.tamu.eduDatura sp. - Cultivated, from Floriculture
Pflanze
intaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995www.excellup.com/.../tissuesnine.aspx
fig5.jpegaggie-horticulture.tamu.edu442 × 368 - ... or fungal) are physically selected as the explant for tissue culture
Knospe Wurzel
Pflanze
technivit.pagesperso-
orange.fr/GBindex.ht
m
www.thisnext.com/tag/
plants
intaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantat
online-media.uni-marburg.de/.../Vermehrung.html
Kalanchoe
Blatt, Brutknospe
Alliumcanadense
www.plantbuzz.com/allium/Culti/im_prop.htm
intaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantat
Brutknospe
intaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Kallus
Bildung
www.dsmz.de/dsmz/main.php?content_id=65
www.cactus-art.biz/.../dictionary_callus.htm
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantatintaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Kallus
Bildung
generalhorticulture.tamu.edu/YouthAdventurePr. www.sivb.org/edu_outreach.asp
Pflanzen Explantat => Spross- und Wurzel-Regeneration
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantatintaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Kallus
Bildung
Embryogenese
Intakte Pflanzen
Züchtung
www.bfhwsd.de/biote
chnologische_arbeite
n.htm
Somatische Embryonen
herbalgalery.blogspot.com/2009/11/callus-is-a..
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantatintaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Kallus
Bildung
Züchtung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Mazeration: Einweichen von Pflanzen-Material in Flüssig-Medium (Nährlösung )
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantatintaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Kallus
Bildung
Züchtung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
www.nature.com/.../nprot.2010.144_F9.html
www.dsmz.de/dsmz/main.php?content_id=65
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantatintaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung Züchtung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
Embryogenese
Intakte Pflanzen
herbalgalery.blogspot.com/2009/11/callus-is-a..
www.nature.com/.../nprot.2010.144_F9.html
Kallus
Bildung
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantatintaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung Züchtung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
Embryogenese
Intakte Pflanzen
Kallus
Bildung
Fermenter-
Kulturen
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
Pflanze
Zell-Suspension
Fermenter-
Kulturen
www.biosciencetechnology.com/.../www.directindustry.com/prod/eppendorf/combine..
wapedia.mobi/en/Bioreactors
wapedia.mobi/en/Bioreactors
Mazeration von
frischen
Explantaten
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantatintaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung Züchtung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
Embryogenese
Intakte Pflanzen
Kallus
Bildung
Fermenter-
Kulturen
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
Pflanze
NucleusNucleolus
ChloroplastenMitochondrion
VacuoleCytoplasma
ZellwandZellmembran
Pflanzen Zelle
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
Pflanze
NucleusNucleolus
ChloroplastenMitochondrion
VacuoleCytoplasma
ZellwandZellmembran
Pflanzen Zelle
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
+
Enzyme
Protoplast
löst die Zellwand auf
Pflanze
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
(auch bei nicht kreuzbaren Arten möglich)
www.freewebs.com/deebio111l/lab6.htm
A B
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
Pflanze
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
www.freewebs.com/deebio111l/lab6.htm
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
de.wikipedia.org/wiki/Protoplast
H.-U. KOOP, H.-G. SCHWEIGER, 1985
Pflanze
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
www.freewebs.com/deebio111l/lab6.htm
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
www.sciencephoto.com/media/156406/enlarge
Pflanze
Quelle: Neumann 1995
Explantatintaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung Züchtung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
Embryogenese
Intakte Pflanzen
Kallus
Bildung
Fermenter-
Kulturen
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
Embryogenese
Intakte Pflanzen
Mikrosporen Kultur
Pflanze
Antheren
Mikro-Sporen
Kultur
Kallus
Bildung
Embryo-
genese
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Sprossbildung
source: Neumann 1995
Pflanzen Vermehrung Züchtung
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
intaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Explantat
Kallus
Bildung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
Embryogenese
Intakte Pflanzen
Fermenter-
Kulturen
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
Embryogenese
Intakte Pflanzen
source: Heß 1992
BlüteAnthere
Antheren Kultur
Antheren Kultur
source: Heß 1992
BlüteAnthere
Antheren Kultur
source: Heß 1992
Kallus aus Anthershaploide Embryonen aus Anthers
haploider kallus
Antheren Kultur
BlüteAnthere
Antheren Kultur
source: Heß 1992
haploid callus
Differezierung des Kallus
Kallus aus Anthershaploide Embryonen aus Anthers
haploider kallus
Antheren Kultur
BlüteAnthere
Antheren Kultur
source: Heß 1992 Haploide Pflanze
Differezierung des Kallus
Kallus aus Anthershaploide Embryonen aus Anthers
haploider kallus
Antheren Kultur
BlüteAnthere
Antheren Kultur
www.biolcell.orgBiology of the Cell (2006) 97, 709-722
Anther-Kultur und Regeneration von haploiden Pflanzen:
(a) Anthere am Anfang der Kultur.
(b) Anthere nach 6 Tagen Kultur.
(c, d) Embryonen entwickeln sich aus Antheren nach 30 days Kultur,
zeigen Wurzeln (c)
und Sprosse (d).
(e–g) Pflänzchen mit Kotyledonen
(e) und mit Blättern
(f, g) subkultiviert in Wachstumsmedium.
(h) 80-Tage-alte, regenerierte haploide Pflanzen aus Antheren (links)
und eine diploide Kontrolle im gleichen Alter (rechts).
Skalierung:
(a–d), 2.5 mm; in (e–h), 5 mm.
Pfeffer (Capsicum annuum)
source: Heß 1992
Pollen Kultur
Pollen Kultur
Haploide Pflanze
Differezierung des Kallus
Kallus aus Anthershaploide Embryonen aus Anthers
haploider kallus
Antheren Kultur
BlüteAnthere
Antheren Kultur
source: Heß 1992
isolierte Pollen Pollen-Vorstufe und Pollen
Kultur
Vielzellige Pollen-Kultur
Pollen Kultur
Pollen Kultur
Haploide Pflanze
Differezierung des Kallus
Kallus aus Anthershaploide Embryonen aus Anthers
haploider kallus
Antheren Kultur
BlüteAnthere
Antheren Kultur
source: Heß 1992
Pro-Embryo
isolierte Pollen Pollen-Vorstufe und Pollen
Kultur
Vielzellige Pollen-Kultur
Pollen Kultur
Pollen Kultur
Haploide Pflanze
Differezierung des Kallus
Kallus aus Anthershaploide Embryonen aus Anthers
haploider kallus
Antheren Kultur
BlüteAnthere
Antheren Kultur
source: Heß 1992
Embryo
Embryo aus Pollen
isolierte Pollen Pollen-Vorstufe und Pollen
Kultur
Vielzellige Pollen-Kultur
Pollen Kultur
Pollen Kultur
Haploide Pflanze
Differezierung des Kallus
Kallus aus Anthershaploide Embryonen aus Anthers
haploider kallus
Antheren Kultur
BlüteAnthere
Antheren Kultur
Pro-Embryo
source: Heß 1992
Embryo
Embryo aus Pollen
isolierte Pollen Pollen-Vorstufe und Pollen
Kultur
Vielzellige Pollen-Kultur
Pollen Kultur
Pollen Kultur
Differezierung des Kallus
Kallus aus Anthershaploide Embryonen aus Anthers
haploider kallus
Antheren Kultur
BlüteAnthere
Antheren Kultur
Pro-Embryo
Haploide Pflanze
Haploide Pflanzen:
• In der Natur vorkommend:
• Bilden sich spontan bei:
• Tomaten, Baumwolle, Kaffee, Rüben, Bohnen, Flax, Kokusnuss, Perlhirse, Weizen,
• Methoden zur Iinduktion von haploiden Pflanzen:
1. interspezifische und intergenetische Hybridisierung
2. Bestrahlung und chemische Behandlung
3. Anther und Pollen Kultur
Wozu werden haploide Pflanzen benötigt?
• Es gibt in der Züchtung viele Probleme:
• Bei Genverschmelzungen (=> Offsprings from a cross)
=> hohe genetische Variabilität
• (Mono-)Haploide Pflanzen besitzen nur ein Basis-Genome (x)
Vorteile von haploiden Pflanzen in der Züchtung?
• rezessive Mutationen werden sichtbar
• Kleinere Pflanzen (bei Zierpflanzen erwünscht)
• Längere Blüte (bei Zierpflanzen erwünscht)
• Kürzere Produktionszeit bis zur Reife
• Direkte Entwicklung von homozygoten Individuen
• Basis-Material für doppelt-haploide Pflanzen (Homodiploide)
Aber: in haploiden Pflanzen:
• Meiose ist sehr ungleichmäßig
• Bei der Metaphase I ist der Spindelapparat sehr unorganisiert. Bei der Anaphase I ist die
Verteilung der Chromosomen zu den entgegengesetzten Polen teilweise ungeordnet
• Nachkommen von Doppel-Haploiden Pflanzen sind dagegen bei allen wichtigen Merkmalen
genetisch gleichmäßiger.
Diploid plants:
meiosis
wesleyliu12.blogspot.com/2011/05/blog-11-get-..
plants (2n)
Diploid plants:
meiosis
wesleyliu12.blogspot.com/2011/05/blog-11-get-..
plants (2n)
meiosis
meiosis 1. div.
div. = division
Chromitin forming pairing ofhomologouschromosome
N = 2A: fathera: mother
meiosis 2. div.
gametes
N = 1
Diploid plants:
plants (2n)
meiosis
wesleyliu12.blogspot.com/2011/05/blog-11-get-..
Diploid plants: Haploid plants:
plants (n)
plants (2n)
meiosismeiosis
wesleyliu12.blogspot.com/2011/05/blog-11-get-..
X
no generative multiplication possible
anther culture
floweranther
anther culture
source: Heß 1992
callus fromanthers
haploid callus
differetiated callus
pollen culturecold treatment
anther culture
isolated pollen pre-stage and pollen
culture
multicellular pollen culture
pro-embryos
embryos
embryo form pollen
haploid embryonsfrom anthers
heterozygotic diploid plant
Diploid plants? (double haploid)
haploid plant
N=2 Replication crossingover
haploid 4x N=1
diploid plants
N=2 Replication crossingover
haploid 4x N=1
2 x N = 1Replication crossingover
haploid 4x N=1
diploid plants
Double haploid plants
Benefits of double-haploid plants:
• Conventional inbreeding procedures (di- or polyploid plants)
six generations to achieve approximately complete homozygous plants
• doubled haploidy
one generations to achieve approximately complete homozygous plants (identical gen-sets)
• Potential to produce cultivars earlier
• more efficient screening for grain quality and disease resistance
• Tetra-ploide plants => microspore culture
Develop diploid plants (be important for breeding programs that involve diploid wild types)
• Poly-ploide plants => microspore culture
Reduction of chromosome set (important for breeding)
Doubled Haploids:
• Methods of doubled haploid induction in plant species:
1. Production of haploid embryos by
• Parthenogenesis (in vivo)
• Pseudogamy (in vivo)
• Chromosome elimination after wild crossing (in vivo)
• gynogenesis (ovary and flower culture) and androgenesis (anther and microspore
culture) (in vitro)
2. chromosome-doubling produces doubled haploids
anther culture
floweranther
anther culture
source: Heß 1992
callus fromanthers
haploid callus
differetiated callus
pollen culturecold treatment
anther culture
isolated pollen pre-stage and pollen
culture
multicellular pollen culture
pro-embryos
embryos
embryo form pollen
haploid embryonsfrom anthers
heterozygotic diploid plant
Colchicin treatment
haploid plant
double haploid
Colchicin:
Property: toxic alcaloid
Occurence: seeds, flowers, Knolle,
leaves of Herbstzeitlose (Colchicum
autumnale)
Effect of Colchicin:
• induce embryogenesis
• doubled haploids
• In situ and in vitro (seedlings, plamtlets)
• Mode of action as mitose inhibitor
1. Disruption of mitotic cell division => inhibiting the formation of spindle fibers and
polar migration of chromosomes (colchicin ligates to microtubuli subunits)
(Metaphase)
2. No separation of doughter-chromatids caused by missing spindle fibers (Anaphase)
3. At cell division => 1 cell with nucleus 1 cell without nucleus (nonviable)
4. First cell doubeling of chromatides (Interphase) => polymerisation
problems:
• Not all organs show doubling in the same degree
• Zea maize => doubling chromosome number in the tassel or the ear, but often not in both,
which will make self-pollination impossible (Wan et al., 1989)
• high mortality
• abnormal plant development
Alternatives:
• doubling before plantlet regeneration
• colchicine treatment of embryogenic, microspore-derived haploid calli => stable doubled-
haploid maize plants at high frequency (Wan et al. (1989) and Wan and Widholm (1995))
• colchicine together with a 7-days cold shock to cultured maize anthers => increase in
chromosome doubling in microsporederived plants (Saisingtong et al., 1996; Antoine-
Michard and Beckert, 1997).
•
anther culture
floweranther
anther culture
source: Heß 1992
callus fromanthers
haploid callus
differetiated callus
pollen culturecold treatment
anther culture
isolated pollen pre-stage and pollen
culture
multicellular pollen culture
pro-embryos
embryos
embryo form pollen
haploid embryonsfrom anthers
heterozygotic diploid plant
double haploid plant
Colchicin treatment
haploid plant
www.biolcell.orgBiology of the Cell (2006) 97, 709-722
Anther culture and haploid plants regeneration:
(a) Anther at the onset of the culture.
(b) Anther after 6 days in culture.
(c, d) Embryos emerging from the anthers after 30 days in culture,
showing roots (c)
and shoots (d).
(e–g) Plantlets with cotyledons
(e) and with leaves
(f, g) subcultured in growing medium.
(h) 80-day-old regenerated haploid plant from anther culture (left-
hand side) and a diploid control of the same age (right-hand side).
Scale bars in
(a–d), 2.5 mm; in (e–h), 5 mm.
pepper (Capsicum annuum)
First stages of microspore-derived embryogenesis
Cellular organization (a–g, k–l) and starch cytochemistry (h–j).
Semi-thin sections observed under light microscopy.
(a) Vacuolated microspores contained in the anthers at the
time of setting the cultures;
(b) two-celled pro-embryos, showing similar cells and the
formation of a cell wall between them;
(c) multicellular pro-embryos surrounded by the exine (Ex);
(d) multicellular pro-embryos being released as the exine
breaks down (arrows);
(e–j) progression from multicellular pro-embryos to globular
embryos,
(e–g) observed under phase-contrast
(h–j)and bright-field microscopy after I2KI staining to reveal
starch.
(k) Heart-like microspore-derived embryo showing a
peripheral protodermis.
(l–m) High-magnification micrographs showing the
protodermis of microspore-derived (l) and zygotic (m)
embryos. Scale bars, 10 mm.
www.biolcell.orgBiology of the Cell (2006) 97, 709-722
ONTOGENETIC EVENTS IN ANDROGENESIS OFBRAZILIAN BARLEY GENOTYPESSILVA, A. L. S. da,1 MORAES-FERNANDES, M. I.2 and FERREIRA, A. G.3
www.scielo.br/scielo.php?pid=S0034-7108200000...
(a): first mitotic division of a microspore (1250x)(b): multicellular pollen grain after 12 days in culture, containing 12 cells, separated by cell wall (200x)(c):globular pro-embryos liberated from inside the anthers after the rupture of the exine (200x)(d) Longitudinal cut through an isolated embryo (100,8x)(e) Petri dish with cultured anthers showing the induction of androgenetic structures which give rise to plantlets in the same medium(f) plantlets
Different stages in the development of the unpollinated ovaries culture of durum wheatand production of fertile doubled haploids plant: (a) Ovary after 2 weeks in inductionmedium in the dark at 27°C (b) Callus obtained after 6 weeksof in vitro induction culture
(c) Callus with green shoots obtained after3 weeks in differentiation medium with a 16-h photoperiod at 25°C (d) Green plantlets regenerated after 4 weeks in development medium with a 16-h photoperiod
Induction stage Development stage Regeneration stage
Gewebekultur, in vitro Kultur
Dr. Susanne Rühmann
Fachgebiet Obstbau
Pflanzliche Gewebekultur:
• Wachstum von Gewebe und/oder Zellen separiert vom Gesamtorganismus
(Embryos, Seitenknospen oder Wurzeln, Blätter, Kallus, Pflanzen-Zellen,
Protoplasten)
• Kultivierung auf synthetischem Nährmedium
• flüssig
• halbfest
• fest
• Pflanzen leben unter sterilen Bedingungen
• Pflanzen leben unter kontrollierten Umweltbedingungen (Licht, Temperatur, Luft, …)
Wein (Vitis vinifera)
Yaroslav Shevchenko -TU-ForscherInnenStevia-Pflanzen
• Wird seid mehr als 20 Jahren verwendet
• Methode zur Vermehrung von (wichtigem) Pflanzenmaterial
• Methode zur Züchtung (Hybrid-Züchtung)
• Methode zur Lagerung und Archivierung von Pflanzen-Sorten (Genbank)
• Spezial Methoden ….
Vermehrung von (wichtigem) Pflanzenmaterial
Vorteile der Gewebekultur
Vermehrung von (wichtigem) Pflanzenmaterial
• Vermehrung in kurzer Zeit
• Viele Pflanzen mit gleicher Qualität (Massenvermehrung auf kleinem Raum
möglich)
• Pathogenfreie Pflanzen
• Einfach zu transportieren, auch über Landesgrenzen hinweg
Vermehrung von (wichtigem) Pflanzenmaterial
• Vermehrung in kurzer Zeit
• Viele Pflanzen mit gleicher Qualität (Massenvermehrung auf kleinem Raum
möglich)
• Pathogenfreie Pflanzen
• Einfach zu transportieren, auch über Landesgrenzen hinweg
Erstellung von Gewebekultureinrichtung braucht:
• Hohe Investitionskosten
• Erfahrungen im Umgang mit der Technik
• Platz zur Kultivierung
• Zeit zur Optimierung der Kulturbedingungen
Aber
Vorteile der Gewebekultur
Vermehrung und Züchtung
Massenvermehrung
• In vitro Zellkulturen
Regeneration von vielen Pflanzen mit identischem genetischen Material
• Knospen aus Blattachsel aus der Kartoffelnolle
Innerhalb von 10 Monaten
10.000 Knollen
Kombination von nicht (schlecht) kompatiblen Pflanzen
• Fusion von Pflanzenzellen [ohne Zellwand (Protoplasten)] von
unterschiedlichen Pflanzen
Systematische Kombination von Genen (auch von Pflanzen, die sich unter
natürlichen Umständen nicht (nicht so einfach) kreuzbar sind
Vermehrung und Züchtung
Herstellung von homozygoten Pflanzen ohne extensive Rückkreuzung
• Kultur von Pollen
Herstellung von Pflanzen mit halber Ploidität
(diploide Pflanzen (haploide Pollen) => haploider Kallus)
Regeneration zu diploiden Pflanzen (homozygot)
(haploider Kallus => haploide Pflanzen => diploide Pflanzen (Colchizin))
Erhaltung von Zuchtklonen
Herstellung von gesunden Pflanzen
Erdbeeren, Kartoffeln, … => weisen viele Krankheiten auf (Viren, bodenbürtige
Pilze, Bakteriosen)
in der Industrie immer bedeutsamer
Firma (Gemany) Obst und Gehölze
Baumschulen Oberdorla GmbH • Massenvermehrung• Virusfreiheit• Somatische Embryogenese
www.baumschulen-oberdorla.de [email protected]
Reinhold Hummel GmbH+Co.KG Erdbeerzüchtung, Gewebekulturlabor, Pflanzenproduktion
• Beeren• Gehölze• Zierpflanzen• in vitro Vermehrung• in vitro Lagerung (Genbank)
www.hummel-invitro.de
Institut für Pflanzenkultur • Massenvermehrung• Methodenentwicklung• In vitro Selektion (Züchtung)• Gehölze
www.pflanzenkultur.de
Robert Mayer Gartenbau -Gewebekulturen
• Massenvermehrung• Zierpflanzen• Beeren
www.RobertMayer.de
Piccoplant Mikrovermehrungen GmbH
• Rhododendron • Syringa (Flieder)• Bamboo (Bambus)• Graminaceous (Gräser) • Herbaceous perennial (Stauden)
und Gehölze
www.piccoplant.de
Firma (Gemany) Zierpflanzen
Hubert Brandkamp Jungpflanzen Gärtnerei Homepage: www.brandkamp.de [email protected]
• Chrysanthemen • Beet- und Balkonpflanzeben• Mutterpflanzen • Massenvermehrung• Langzeitlagerung
Willi Endisch GbR • Pelargonien • Neuguinea-Impatiens• Meristem Vermehrung• in vitro cloning• in vitro pathogen screenig
www.geranien-endisch.de [email protected]
Dr. Haas von SchmudeGartenbaulabor
Orchidaceae
Fritz Hark Orchideen GmbH & Co. KG Orchidaceae www.hark-orchideen.de
Klemm und Sohn GmbH & Co. KG Jungpflanzenbetriebe
• Petunia• Gerbera • in vitro Lagerung• Beet- und Balkonpflanzeben
Robert Mayer Gartenbau -Gewebekulturen
• Massenvermehrung• Zierpflanzen
www.RobertMayer.de
Frank Silze Jungpflanzen • Pelargonium www.silze.de
Steri Plant GmbH • Orchideen • Anthurien
www.steri-plant.de
Firma (Gemany) Landwirtschaftliche Kulturen
Bioplant Biotechnologisches Forschungslabor GmbH
Solanum tuberosum (Kartoffel) Homepage: www.bioplant.de
GHG-Saaten GmbH • Asparagus (Spargel) • Massenvermehrung
Planta GmbH • Landwirtschaftliche Kulturen• Haploide Pflanzen • In vitro Lagerung
www.kws.com
Saaten-Union Biotec GmbH • Landwirtschaftliche Kulturen• Antheren-/Mikrosporen Kulturen• Haploide Pflanzen
www.saaten-union-biotec.com
Firma (Gemany) Pharmacie
BioPlanta GmbH Pharmazeutische Wirkstoffe www.bioplanta-leipzig.de
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG A Feinchemikalien PE Phytochemikalien
Pharmazeutische Wirkstoffe [email protected]
Institut für Pflanzenkultur • Massenvermehrung• Methodenentwicklung• In vitro Selektion• Pharmaceutische Pflanzen
www.pflanzenkultur.de
PHARMAPLANT Forschungs- u. Saatzucht GmbH
• Massenvermehrung• Kallus / Embryogenese• Lagerung• Optimierung von Medien • Eliminierung von Pathogenen in
pharmaceutischen Pflanzen
www.pharmaplant.de
Firma (Gemany) Wasserpflanzen
BioPlanta GmbH Wasserpflanzen www.bioplanta-leipzig.de
Grenzland Produktions- und Handels GmbH Zweigstelle Rhede
• Anthurium• Wasserpflanzen
Rainer Dietz Wasserpflanzen
World Aquatic Ecosystem Sdn Bhd Wasserpflanzen
Firma (international) culture country
BioTree • Paulownia Bulgaria (Sofia)
Sun Agrigenetics PVT. LTD. • Tindora• Lemon• Ornamental plants: Cordyline; Ophiopogon; Gerbera;
Hosta; ornamental Banana; Rosa; Anthurium
India
A– One Biotech & Tissue Culture Pvt. • Philodendron• Banana• Spathyphyllum• Syngonium
India
Sristi Agro Biotech Private • Pinapple India
Sri Balaji Biotech (Grand Naine B.; RedB., Hill B.)
• Sucrane• Cordyline australis• Cordyline terminalis• Limonium Caspia Hyb. (Blue Diamonnd)• Stevia rebaudiana• Vanilla
India
Cadila pharmaceuticals Limited • teak India
Aqua Princess Co • Water plants• Anubias barteri var nana
Thailand
Banana
Cadila pharmaceuticals Limited
Bio green plant
Tissue culture project
IITA
Nusantara biotech enterprise
Sri Balaji Biotech (Grand Naine B.; Red B., Hill B.)
Agro-Genetic Technologies LTD (
Sristi Agro Biotech Pvt. Ltd. (India)
Thiruvensun bio botanica (India)
• Bananas • Coffee • Tea • cassava • Yams• Ornamentals• forest trees
Clonal Solutions Australia Pty. LTD• Acacia mangium hybrids• Banana• Cocoa• Coffee• E. grandis x E. camaldulensis• Indian Sandalwood (Santalum album)• Khaya (African Mahogany)• Pongamia (Millettia)• Teak
Uganda (Africa)
Australia
Dazhong flowerplant tissue culture
Tropical plants, orchids, aquarium plants
Trade and Market:• North America, Southeast Asia, Oceania, Eastern Asia, Western Europe• Total annual sales volume: US $ 10 Million – US $ 50 Million • Total Annual Purchase Volume:US $ 2.5 Million – US $ 5 Million
tropical plant tissue culture , moss plants, plant culture, orchids tissue culture, teak plants, aquarium plant tissue culture
Shanghai (China)
Universitäten (Germany)
Rhein. Friedr.-Wilh.-Universität (Bonn)
Institut für Nutzpflanzenwissenschaften und Ressourcenschutz (INRES), Bereich Pflanzen- und Gartenbauwissenschaften
MeristemkulturLeistungsprüfung Pathogeneliminierung
53121 Bonn www.uni-bonn.de
Technische Universität München (TUM) Wissenschaftszentrum Weihenstephan
Gewächshauslaborzentrum Dürnast
Mikrovermehrung Somatische Embryogenese Transformation
85350 Freising www.wzw.tum.de/ghl
Universität Freiburg Pflanzenbiotechnologie / ZAB Physcomitrella patensTransformation Massenvermehrung MutantenanalyseKryokonservierung
79104 Freiburg www.plant-biotech.net/
Universität Hamburg Biozentrum Klein Flottbek & Botanischer Garten
PhalaenopsisGentianaTemporary Immersion System Somatische Embryogenese Sproßvermehrung
22609 Hamburg www.uni-hamburg.de/fachbereiche-einrichtungen/biologie/index.html
Universität Hohenheim Institut für Pflanzenzüchtung, Saatgutforschung u. Populationsgenetik
Transformation Massenvermehrung Apfel Mais Hopfen
70599 Stuttgart http://www.uni-hohenheim.de/biotechnologie
Justus-Liebig-Universität (Gießen)
Institut für Phytopathologie & Angew. Zoologie (IPAZ)
Transgene Pflanzen Impfmöhre/Hypoallergene Möhren Somatische Embryogenese
35392 Gießen Homepage: www.uni-giessen.de/ipaz
Universitäten /Hochschulen (Germany)
Humboldt-Universität (Berlin) Institut für Biologie In vitro Kultur Zier-, Forstpflanzen Somatische Embryogenese Protoplastentechniken Gentransfer, Physiologie Kryokonservierung
10115 Berlin
Inst.f. Gartenbauwissenschaften AG Vermehrungstechnologie/Baumschulwesen
Gehölzvermehrung RejuvenilisierungAkklimatisation Leistungsprüfung
14195 Berlin www.agrar.hu-berlin.de/struktur/institute/nptw/ugb
LFG gärtnerische Pflanzensysteme
KryokonservierungSomatische Embryogenese HaploidenkulturEinfluß physikal. Faktoren Mikrovermehrung
14195 Berlin www.agrar.hu-berlin.de/struktur/institute/nptw/gpfs
Fachhochschule Hannover Fak. II, Abt. Bioverfahrenstechnik, FG Produktion NawaRo
Organogenese, RhizogeneseHistol. + Cytogen. Untersuchungen
30453 Hannover www.fakultaet2.fh-hannover.de
Fachhochschule Osnabrück Fachgebiet Pflanzenzüchtung und Saatguterzeugung
49090 Osnabrück www.aw.fh-osnabrueck.de
Hochschule Wismar Fakultät für Ingenieurwissenschaften Fachgebiet Biochemie/Biotechnologie
Arbeitsgebiete in vitro Kultivierung Temporäre Immersionssysteme
23952 Wismar Fax: 03841-753 132
Leibniz-Institut Gemüse- und Zierpflanzenbau Großbeeren-Erfurt e.V.
Somatische Embryogenese Physiologie, Histologie, CytogenetikGenexpressionsanalysen Qualität Cyclamen
99189 Erfurt-Kühnhausenwww.igzev.de
Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK)
KryokonservierungIn vitro Genbank MeristemkulturAllium / Gemüse Heil- / Gewürzpflanzen
6466 Gaterslebenwww.ipk-gatersleben.de
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
KryokonservierungPhytopharming
38124 Braunschweig www.dsmz.de
Geschäftsstelle des ADIVK c/o Institut für Pflanzenkultur 29465 Schnegawww.adivk.de
Bayer. Landesanstalt für Landwirtschaft
Institut für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung IPZ
AntherenkulturEmbryokultur Protoplastenfusion Gentransformation Genomanalyse
85354 Freising www.LfL.bayern.de
Johann Heinrich von Thünen-Institut (vTI)
Institut für Forstgenetik Forstgehölze Methodenprüfung Versuchspflanzenanbau Risikobeurteilung
15377 Waldsieversdorf www.vti.bund.de/de/institute/fg
Max-Planck-Institut Züchtungsforschung 50829 Köln
Julius-Kühn-Institut (JKI) Institut für gartenbauliche Kulturen
Protoplastenfusion Embryokultur Gentransfer In-vitro-VerklonungGenomanalyse
6484 Quedlinburg www.jki.bund.de
Institut für Züchtungsforschung an gartenbaulichen Kulturen und Obst
Obstgehölze Beerenobst Gentransfer Genomanalyse Kryokonservierung
1326 Dresden www.jki.bund.de
Institut für Resistenzforschung und Stresstoleranz
In vitro Kultur Solanum tuberosumPhysiol. Untersuchungen
18190 Sanitz, OT Groß-Lüsewitzwww.jki.bund.de
Institut für Pflanzenschutz in Gartenbau und Forst
38104 Braunschweig www.jki.bund.de
Staatliche Forschungsanstalt für Gartenbau an der Hochschule Weihenstephan-Triesdorf
Massenvermehrung PathogeneliminierungEmbryo rescueSomatische Embryogenese Akklimatisierung
Institut für Gartenbau, Abt. Pflanzenschutz
85354 Freising Homepage: www.hswt.de
Nordwestdeutsche Forstliche Versuchsanstalt (NW-FVA)
Abt. Waldgenressourcen Forstgehölze Mikrovermehrung RejuvenilisierungKlonprüfung Kryokonservierung
34346 Hann.MündenHomepage: www.nw-fva.de
Forschungsanstalt Geisenheim Fachgebiet Botanik in vitro Kultur Entwicklungsbiologie Molekulargen. Diagn. Resistenzzüchtung Weinrebe
65366 GeisenheimHomepage: www.fa-gm.de
Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
Abt. Baumschule Etablierung Bewurzelung somatische Embryogenese Transformation Embryo rescue
30419 Hannover Homepage: www.baum.uni-hannover.de
Abt. Zierpflanzenbau Somatische Embryogenese Protoplastentechniken In-vitro-Kultur Transformation
30419 Hannover Homepage: www.zier.uni-hannover.de
Institut für Biologische Produktionssysteme Fachgebiet Biosystem- und und Gartenbautechnik
30419 Hannover Homepage: www.bgt.uni-hannover.de
Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH
UFZ In vitro Kultur von Eichen EktomykorrhizasymbiosenGenexpressionsanalysen
6120 Halle/Saale Homepage: www.ufz.de
Entwicklung einer in vitro Kultur
Susanne Rühmann
Fachgebiet Obstbau
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Embryo Kultur
Organ Kultur
Kallus Kultur
Zell Kultur
Adulte Pflanze
Neue adulte Pflanze
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Embryo Kultur
Organ Kultur
Kallus Kultur
Zell Kultur
Adulte Pflanze
Neue adulte Pflanze
Meristem Kultur
Spross-Kultur
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Embryo Kultur
Organ Kultur
Kallus Kultur
Zell Kultur
Adulte Pflanze
Neue adulte Pflanze
Meristem Kultur
Spross-Kultur
Nur meristematisches Gewebe wird verwendet (0,1 mm)
Explantat zur Kultivierung beinhaltet Blattknospenschuppen (0,2 – 0,4 mm)
www.nature.com/.../v4/n3/fig_tab/nrg1002_F1.html
Für Gewebekultur verwendete Meristeme:
www.nature.com/.../v4/n3/fig_tab/nrg1002_F1.html
Spross apical meristem
Blatt primoriumBlatt Primorium
Für Gewebekultur verwendete Meristeme:
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Embryo Kultur
Organ Kultur
Kallus Kultur
Zell Kultur
Adulte Pflanze
Neue adulte Pflanze
Meristem Kultur
Spross-Kultur
Spross
Seiten Knospe
Terminal Knospe
Sprosskultur
OberflächenSterilisation
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Embryo Kultur
Organ Kultur
Kallus Kultur
Zell Kultur
Adulte Pflanze
Neue adulte Pflanze
Meristem Kultur
Spross-KulturSpross
Seiten Meristem
Terminal Meristem
Sprosskultur
OberflächenSterilisation Wärme behandlung
