Diss Kummerfeld Version 16.11.2010 - TiHo Hannover...Generation and characterisation of a polyclonal...

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1. Auflage 2010

© 2010 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,

Gießen

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-005-2

Verlag: DVG Service GmbH

Friedrichstraße 17

35392 Gießen

0641/24466

[email protected]

www.dvg.net

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchung über die Virusausbreitung und -persistenz bei der murinen Theiler-Enzephalomyelitis von

experimentell infizierten Mäusen mittels polyklonaler Antikörper und RNS-Sonden

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Maren Kummerfeld

Neumünster in Holstein

Hannover 2010

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Andreas Beineke

Institut für Pathologie

1. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Beineke

2. Gutachter: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand

Tag der mündlichen Prüfung: 10.11.2010

meinen Eltern in Dankbarkeit

Die Neugier steht immer an erster Stelle eines Problems,

das gelöst werden möchte.

(Galileo Galilei)

Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits vorab veröffentlicht oder zur Veröffentlichung eingereicht: Kummerfeld M., Meens J., Haas L., Baumgärtner W., Beineke A. (2009):

Generation and characterisation of a polyclonal antibody for the detection of Theiler´s

murine encephalomyelitis virus by light and electron microscopy. J. Virol. Methods

160: 185–188

Kummerfeld M., Klein S., Ulrich R., Kreutzer R., Gerhauser I., Baumgärtner W.,

Beineke A. (2010): Periventricular brain lesion development in a viral murine model

for multiple sclerosis, J. Virol. eingereicht

Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits als Poster präsentiert:

Kummerfeld M., Baumgärtner W., Haas L., Alldinger S. Beineke A. (2006):

Generation and characterization of a polyclonal antibody for detection of Theiler´s

murine encephalomyelitis virus in cell culture and animal tissue.

24th Annual Meeting of European Society of Veterinary Pathology (ESVP), The

University of Edinburgh, 31. August - 2. September 2006

Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits als Kongressbeitrag präsentiert:

Kummerfeld M., Baumgärtner W., Beineke A. (2008): Detection and distribution of

Theiler´s murine encephalomyelitis virus in acute and chronic brain lesions of mice.

26th Annual Meeting of European Society of Veterinary Pathology (ESVP),

Dubrovnik, 17. September - 21. September 2008

Sonstige mit der Arbeit in thematischem Zusammenhang stehende Veröffentlichungen in Zeitschriften: Pringproa K., Rohn K., Kummerfeld M., Wewetzer K., Baumgärtner W. (2010):

Theiler´s murine encephalomyelitis virus preferentially infects immature stages of the

murine oligodendrocyte precursor cell line BO-1 and blocks oligodendrocytic

differentiation in vitro. Brain. Res. 1327: 24–37

Navarrete-Talloni M.J.,Kalkuhl A., Deschl U., Ulrich R., Kummerfeld M., Rohn K., Baumgärtner W., Beineke A. (2010): Transient peripheral immune response and

central nervous leaky compartmentalization in a viral model for multiple sclerosis.

Brain. Pathol. in press.

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1

2 Literaturübersicht 3

2.1 Die Multiple Sklerose und ihre Tiermodelle 3

2.2 Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus 8

2.3 Immunreaktion und Demyelinisierung im Verlauf der murinen

Theilervirus-Enzephalomyelitis 13

2.4 Ausbreitung von Viren im Zentralen Nervensystem 16

2.5 Ausbreitung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus

im Zentralen Nervensystem 18

2.6 Ausbreitung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus im extraneuralen

Gewebe nach natürlicher und experimenteller Infektion bei Mäusen 20

2.7 Virale Persistenzmechanismen 22

2.8 Persistenz und Zelltropismus des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus

im Zentralen Nervensystem 24

3 Hypothesen und Ziele 29

4 Generation and characterization of a polyclonal antibody for the detection

of Theiler´s murine encephalomyelitis virus by light and electron microscopy 30

5 Periventricular brain lesion development and region-specific susceptibilities

to demyelination in a viral murine model for multiple sclerosises 31

5.1 Abstract 32

5.2 Introduction 33

5.3 Materials and Methods 36

5.4 Results 42

5.5 Discussion 58

5.6 Acknowledgments 62

5.7 References 63

II Inhaltsverzeichnis

6 Diskussion 72

6.1 Charakterisierung des polyklonalen Antikörpers zum Nachweis des

murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus 73

6.2 Darstellung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus mittels

Immunhistologie und in situ-Hybridisierung 75

6.2.1 Virusausbreitung im Gehirn bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen 75

6.2.2 Virusausbreitung im Rückenmark bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen 78

6.2.3 Phänotypisierung der infizierten Zellpopulationen im Verlauf der murinen

Theiler-Enzephalomyelitis 79

6.3 Entzündungsreaktionen im Zentralen Nervensystem von SJL/J- und

C57BL/6-Mäusen im Verlauf der murinen Theiler-Enzephalomyelitis 81

6.3.1 Entzündungsreaktionen im Großhirn bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen 81

6.3.2 Entzündungsreaktionen im Kleinhirn, Stammhirn und Rückenmark bei

SJL/J- und C57BL/6-Mäusen 82

6.4 Demyelinisierung im Zentralen Nervensystem nach Infektion mit dem


6.4.1 Demyelinisierung im Kleinhirn, Stammhirn und Rückenmark bei

SJL/J-Mäusen 83

6.5 Schlussbetrachtung 86

7 Zusammenfassung 88

8 Summary 91

9 Literaturverzeichnis 94

Inhaltsverzeichnis III

10 Anhang 118

10.1 Ergänzendes Material zu Kapitel 4 118

10.1.1 Vermehrung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus

in BHK21-Zellen 118

10.1.2 Virusreinigung über einen Saccharosegradienten 119

10.1.3 Herstellung eines polyklonalen Antikörpers zum Nachweis vom


10.1.3.1 Herkunft und Haltung der Kaninchen 120

10.1.3.2 Serumgewinnung 121

10.1.3.3 Immunisierung der Kaninchen 122

10.1.3.4 Immunisierungschema zur Herstellung des polyklonalen Antikörpers 123

10.2 Ergänzendes Material zu Kapitel 5 124

10.2.1 Overview of viral distribution in C57BL/6-mice infected with the

Theiler´s murine encephalomyelitis virus 124

10.2.2 Overview of viral distribution in SJL/J-mice infected with the

Theiler´s murine encephalomyelitis virus 126

10.3 Bezugsquellen für Reagenzien, Chemikalien und Einmalartikel 128

10.4 Bezugsquellen für die Tiere 136

10.5 Bezugsquellen für Geräte 136

10.6 Lösungen und Puffer 142

10.6.1 Zellkultur 142

10.6.2 Immunfluoreszenz 143

10.6.3 Western Blot 144

10.6.4 Histologie 147

10.6.5 Immunhistologie 147

10.6.6 RNS-Isolierung, PCR und Sondensynthese 148

10.6.7 in situ-Hybridisierung 149

10.6.8 Elektronenmikroskopie 156

11 Abkürzungen 158

12 Danksagung 162

Einleitung 1

1 Einleitung

Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus („Theiler´s murine encephalomyelitis

virus“, TMEV) aus der Gattung Cardiovirus und der Familie Picornaviridae dient in

einem Tiermodell der Erforschung von Pathogenese und Therapiemöglichkeiten

humaner demyelinisierender Erkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS)

(RACANIELLO, 2001). Das Virus kommt als natürlicher Krankheitserreger bei der

Maus vor. Es persistiert dabei überwiegend in den Enterozyten des Darmes sowie in

den Mesenteriallymphknoten und ruft bei fäkal/oraler Übertragung asymptomatische

Magen-Darm-Infektionen mit Serokonversion hervor (LIPTON et al., 2001). In

seltenen Fällen können jedoch auch spontane zentralnervöse Manifestationen

beobachtet werden (THEILER und GARD, 1940 a und b; THOMPSON et al., 1951).

Es werden verschiedene TMEV-Stämme in hoch- und schwachvirulente

Untergruppen eingeteilt (LIPTON, 1980). Bei den hochvirulenten Stämmen zeigt sich

das Krankheitsbild einer akuten Polioenzephalomyelitis mit oftmals tödlichem

Ausgang. Im Gegensatz dazu verursachen die schwachvirulenten Stämme, wie der

BeAn-Stamm, nach intrazerebraler Infektion einen biphasischen Krankheitsverlauf,

bei dem sich an eine akute, milde Polioenzephalomyelitis eine chronisch-

progrediente, demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis anschließt (LIPTON et al.,

1994). Bei der chronischen Phase der murinen Theiler-Enzephalomyelitis („Theiler`s

murine encephalomyelitis“, TME) persistiert das Virus im ZNS und führt dadurch zu

einer primären Schädigung, woraufhin sich eine sekundäre Hypersensitivitätsreaktion

vom verzögerten Typ gegen Virusepitope und im späteren Verlauf auch gegen

Myelinbestandteile entwickelt (CLATCH et al., 1986; MILLER et al., 2001). Der

Schweregrad dieses Krankheitsverlaufs bei den schwachvirulenten Stämmen wird

durch den Genotyp der infizierten Maus, deren Geschlecht sowie vom Alter

beeinflusst (MONTEYNE et al., 1997, FULLER et al., 2005). Da das histologische

Entzündungsbild und auch die beteiligten Pathomechanismen der TME denen der

Multiplen Sklerose (MS) des Menschen sehr ähnlich sind, dient es der Forschung als

bedeutendes Tiermodell (DAL CANTO und RABINOWITZ, 1982; STOHLMAN und

HINTON, 2001; DRESCHER und SOSNOWSKA, 2008).

2 Einleitung

Ein besonderes Augenmerk wurde in vorausgegangenen Studien auf die chronische,

demyelinisierende Phase im Rückenmark gelegt und weniger auf die akute

Infektionsphase im Gehirn. Es ist bekannt, dass sich das TMEV nach experimenteller

intrazerebraler Infektion zuerst in Neuronen und Astrozyten der grauen Substanz des

Großhirns repliziert, bevor es über eine vermutlich axonale Ausbreitung in die weiße

Substanz des Rückenmarks gelangt und dort in Makrophagen, Oligodendrozyten

und/oder Astrozyten persistiert (DAL CANTO und LIPTON, 1982; RODRIGUEZ et al.,

1983 b; TSONUDA et al., 2003; OLESZAK et al., 2004). Der Verbreitungsweg im

ZNS sowie in extraneuralen peripheren Organen und die Persistenz in der Zielzelle

unterscheiden sich in Abhängigkeit von dem verwendeten Mäusestamm, der

Infektionsart und auch der Virusart. Bisher liegen allerdings nur wenige

Untersuchungen über die Ausbreitung des TMEV im ZNS, besonders in der akuten

Infektionsphase und extraneuralen Organen empfänglicher oder resistenter Mäuse

vor.

Literaturübersicht 3

2 Literaturübersicht

2.1 Die Multiple Sklerose und ihre Tiermodelle

Die Multiple Sklerose (MS) ist die weltweit häufigste demyelinisierende

autoimmunbedingte zentralnervöse Erkrankung des Menschen mit nach wie vor

unbekannter, vermutlich multipler Ätiologie (HAFLER, 1999; LUCCHINETTI et al.,

2000). Eine polygene Veranlagung bei Trägern der humanen Leukozyten-Antigene

(HLA)-DR und –DQ gilt als erwiesen (BERTI und JACOBSON, 1999).

Epidemiologische Untersuchungen gaben Hinweise auf eine mögliche Bedeutung

von Umweltfaktoren, insbesondere von Virusinfektionen in der Pathogenese der MS.

In diesem Zusammenhang wurden die unterschiedlichsten viralen Erreger, wie das

Masern-, das Epstein-Barr-, das Herpes-simplex-, das Varizella-Zoster-, das

Zytomegalie- und das humane Herpesvirus-6 sowie humane Coronaviren und das

kanine Staupevirus als Krankheitsauslöser diskutiert (EBERS et al., 1986; BERTI

und JACOBSON, 1999; WILLER und EBERS, 2000; HAAHR und HÖLLSBERG,

2001). Des Weiteren wurden auch Retroviren wie das humane T-Zell-Leukämie-Virus

(HTLV-1) als mögliche Auslöser der Krankheit genannt (MEINL, 1999; HAAHR und

HÖLLSBERG, 2001). Im Liquor von MS-Patienten wurde weiterhin ein neues, MS-

assoziiertes Retrovirus (MSRV) mittels PCR nachgewiesen und ebenfalls als

potentielles auslösendes Agens vorgestellt (PERRON et al, 1997). Bisher konnte

allerdings keines der genannten Viren in einen eindeutigen, ätiologischen

Zusammenhang mit der MS gebracht werden. Klinisch unterscheidet man eine

schubförmig remittierende („relapsing remitting“) Verlaufsform, bei der es meistens

zur vollständigen Rekonvaleszenz zwischen den Schüben kommt. Diese Form kann

allerdings sekundär in einen progressiven Krankheitsverlauf übergehen („secondary

progressive“; BAR-OR et al., 2000). Weiterhin kommen auch primär progressive

Verlaufsformen ohne intermittierende Symptomfreiheit („primary progressive“) vor. In

seltenen Fällen werden auch akute Formen beobachtet, die rasch zum Tode führen

(HUNTER und RODRIQUEZ, 1995; PRINEAS et al., 2002). Histologisch stellt die MS


eine entzündlich-degenerative Erkrankung der weißen Substanz des Gehirns und

Rückenmarks dar, die durch plaqueförmige T-Zell- und Makrophageninfiltrate mit

primärer Demyelinisierung gekennzeichnet ist. In der progressiven Phase der MS

kommt es außerdem zu diffusen entzündlichen Veränderungen mit generalisierter

Mikrogliaaktivierung sowie sekundärer Demyelinisierung durch die Schädigung und

den Verlust von Axonen (ADAMS et al., 1989; HALFER und WEINER, 1995;

LASSMANN et al., 2007; TSUNODA und FUJINAMI, 2002). Zusätzlich kann eine

ausgeprägte subpiale kortikale Entmarkung des Vorderhirns (Proenzephalon) und

Kleinhirns mit assoziierter Leptomeningitis auftreten (LASSMANN et al., 2007). Die

pathohistologischen Veränderungen in der weißen Substanz bei der MS lassen sich

in vier verschiedene Gruppen unterteilen (LASSMANN et al., 2001). Zu der Gruppe I

zählen Läsionen mit Infiltrationen von T- Zellen und Makrophagen/Mikroglia mit

nachfolgenden Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ

(„delayed type hypersensitivity“, DTH). Die Gruppe II ist durch eine vermehrte

Immunglobulin- und Komplementkomponentenablagerung gekennzeichnet, was für

eine Mitbeteiligung der humoralen Immunantwort an dem autoimmunen Prozess

spricht. Für die Veränderungen der Gruppe III, welche durch einen selektiven Verlust

des Myelin-assoziierten Glykoproteins (MAG) und oligodendrogliale Apoptosen

gekennzeichent sind, werden eine sekundäre ischämische Genese oder eine virale

Infektion als Ursache diskutiert. In den selten vorkommenden Läsionen der Gruppe

IV liegen Zonen mit oligodendroglialen Nekrosen in der Nähe von aktiven

Demyelinisierungsherden der weißen Substanz vor, so dass hier ätiopathogenetisch

ein toxisches Geschehen angenommen wird (LUCCHINETTI et al., 2000)( Tab. 2-1).

In Abhängigkeit vom Alter lassen sich die pathohistologischen Befunde auch in

aktive, chronisch-aktive und chronisch-inaktive Läsionen einteilen (HUNTER und

RODRIGUEZ, 1995).

In der Forschung werden zahlreiche Tiermodelle genutzt, jedoch vereinigt keines der

Modelle die vielfältige Pathogenese und Heterogenität der pathologischen

Organveränderungen bzw. der klinischen Symptomatik der MS in sich. Es existieren

neben experimentellen Tiermodellen, auch einige Modelle bei denen es sich um

natürlich vorkommende, demyelinisierende Enzephalitiden viraler Genese bei


Säugetieren handelt. Die Visna des Schafes oder die demyelinisierende Form der

Staupeenzephalitis des Hundes eignen sich beispielsweise sehr gut als spontan

auftretende Erkrankungen bzw. als natürliche Tiermodelle zur Erforschung der

humanen MS (ALLDINGER et al., 1993; BEINEKE et al., 2009; DAL CANTO und

RABINOWITZ, 1982; BAUMGÄRTNER und ALLDINGER, 2005; SEEHUSEN et al.,

2007; SEEHUSEN und BAUMGÄRTNER, 2010; STOHLMANN und HINTON, 2001).

Tierexperimentelle Studien mit Labornagern, wie die Theiler-Enzephalomyelitis der

Maus, die murine Hepatitisvirus Infektion (MHV) oder die Experimentelle

Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) erlauben jedoch Hypothesen-

gestützte Untersuchungen unter standardisierten Bedingungen.

Diese Mausmodelle repräsentieren verschiedene pathogenetische Aspekte der MS,

die einerseits möglicherweise durch eine primäre Virusinfektion des ZNS bedingt

sein können oder andererseits eine primär autoimmune Erkrankung darstellen (DAL

CANTO et al., 1995; TSUNODA und FUJINAMI, 1996; HALFER, 1999; STOHLMAN

und HINTON, 2001; ULRICH et al., 2006). Zusätzlich werden noch toxische (z.B.

Cuprizone, Lysolezithin und Ethidiumbromid) und genetische („shiverer“ Maus [MBP

„knock-out“-Mutante] und „rumpshaker“ Maus [PLP „knock-out“-Mutante])

Entmarkungsmodelle zur Erforschung demyelinisierender Krankheiten eingesetzt

(EDGAR et al., 2004; ROUSSARIE et al., 2007).

Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus (TMEV) wurde erstmals 1933 von dem

Mikrobiologen Max Theiler bei Labormäusen beobachtet und als auslösendes Agens

für eine akute Polioenzephalomyelitis, die murine Theilervirus-Enzephalomyelitis

(TME) beschrieben (THEILER, 1934). Durch experimentelle Infektionen wurde einige

Jahre später ein biphasischer Krankheitsverlauf in Abhängigkeit von den

verwendeten Virus- und Mäusestämmen bekannt, der sich durch eine initiale, akute

Polioenzephalomyelitis und eine chronische, demyelinisierende Enzephalomyelitis

auszeichnet (DANIELS et al., 1952; LIPTON, 1975 und 1980; LIPTON und DAL

CANTO, 1979). Dieser Verlauf zeigte Parallelen zu demyelinisierenden

Erkrankungen des ZNS des Menschen. Seitdem dient die chronische,

demyelinisierende TME der Forschung als wertvolles Pathogenese- und

Therapiemodell für die MS (DAL CANTO und RABINOWITZ, 1982; STOHLMAN und


HINTON, 2001). Bei der chronischen demyelinisierenden TME verursacht die

Virusinfektion eine primäre Schädigung des Nervensystems, woraufhin sich eine

durch CD4+-T-Zellen vermittelte Immunreaktion gegen Virusepitope entwickelt. Im

weiteren Verlauf entsteht durch den Prozess des „epitope spreading“ eine gegen

Myelinbestandteile gerichtete Autoimmunität (CLATCH et al., 1986; BORROW et al.,

1998; DI ROSA und BARNABA, 1998; VANDERLUGT et al., 1998; KIM et al., 2001;

MILLER et al., 2001). Das klinische Bild der TME entspricht damit der primär

progressiven Verlaufsform der MS und den Gruppen I und II der histologischen MS-

Klassifizierung (LUCCHINETTI et al., 2000; TSUNODA und FUJINAMI, 1996) (Tab.

2-1).

Die Demyelinisierung bei der MHV-Infektion wird durch zytologische Effekte

virusinfizierter Oligodendrozyten induziert. Das MHV repliziert sich in

Oligodendrozyten, wodurch diese zur Apoptoseinduktion veranlasst werden und

dadurch die Entmarkung auslösen (MATTHEWS et al., 2002; STOHLMAN und

HINTON, 2001). Daneben zeigen sich bei der MHV-Infektion, wie auch bei der TME,

Makrophagen mit intrazellulären, phagozytierten Myelinbestandteilen in

demyelinisierenden Läsionen. Da bei der TME je nach Virusstamm wie auch bei der

neurotrophen MHV-Infektion ein hoher Anteil von direkt virusinduzierten

Oligodendrozytenuntergängen in den demyelinisierten Läsionen auftreten, können

durch diese experimentellen Virusinfektionen auch Aspekte der Gruppen III und IV

der MS untersucht werden (LANE und BUCHMEIER, 1997; ZOECKLEIN et al., 2003)

(Tab. 2-1). Bei der EAE wird bei empfänglichen Mäusen, Ratten, Meerschweinchen,

Kaninchen und Affen durch eine Immunisierung mit Myelinbestandteilen, wie dem

basischen Myelinprotein (MBP), Myelin-Proteolipid-Protein (PLP), Myelin-

Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) oder Ganglioside eine autoimmun-bedingte

Entmarkung in der weißen Substanz des ZNS ausgelöst (DE-CARVALHO et al.,

1999). Die EAE entspricht klinisch der schubweise remittierenden Form der MS, sie

kann allerdings auch primär progressiv verlaufen (GOLD et al., 2006; TSUNODA und

FUJINAMI, 1996). Die EAE kann in Abhängigkeit vom experimentellen Design

entweder der Gruppe I oder II der MS nach LUCCHINETTI et al., (2000) zugeordnet

werden (Tab. 2-1). Bei den toxischen Modellen wird die Demyelinisierung entweder


durch die orale Gabe von Cuprizone oder durch direkte Injektion von Substanzen,

wie beispielsweise Ethidiumbromid, Lysolecithin und Lipopolysaccharid, in das ZNS

induziert (FELTS et al., 2005; MATSUSHIMA und MORELL, 2001; TORKILDSEN et

al., 2008; WOODRUFF und FRANKLIN, 1999). Die toxischen Modelle zeigen

Demyelinisierung mit selektiven Schädigungen der Oligodendrozyten oder deren

Vorläuferzellen mit schneller bis langsamer Remyelinisierung, wodurch diese den

Gruppen III und IV der MS nach LUCCHINETTI et al., (2000) entsprechen (Tab. 2-1).

Durch die systemischen (z.B. orale Aufnahme von Cuprizone) und lokal toxischen

Prozesse (z.B. Injektion von Ethidiumbromid, Lysolecithin und Lipopolysaccharid)

können Mikrogliaaktivierungen und Axonopathien standardisiert untersucht werden.

Außerdem ist das Cuprizone-Modell besonders gut zur Untersuchung von

Remyelinisierungsvorgängen im Gehirn geeignet (BEDARD et al., 2007; LINDNER et

al., 2008). Schließlich gibt es noch genetische Modelle mit „knock-out“-Mäusen, wie

den „shiverer“ Mutanten (MBP „knock-out“) oder den „rumshaker“ Mutanten (PLP

„knock-out“), die jeweils durch einen definierten Gendefekt eine fehlerhafte

Ausbildung der Myelinscheiden aufweisen (EDGAR et al., 2004; ROUSSARIE et al.,

2007). Aufgrund des klar definierten Gendefekts kann nach der Bedeutung des

entsprechenden Proteins für den Erhalt und Ausbau einer normal strukturierten und

funktionstüchtigen Myelinscheide geforscht werden. In kombinierten Modellen mit

genetisch veränderten Mäusen konnte außerdem der Einfluss des Myelins auf die

Viruspersistenz bei der TME näher untersucht werden (BRAHIC und ROUSSARIE,

2009).


Tabelle 2-1: Einteilung der Multiplen Sklerose in vier Gruppen mit dem jeweiligen

repräsentativen Tiermodell (modifiziert nach LUCCHINETTI et al., 2000)

MS-Gruppen Mechanismus Experimentelle Tiermodelle

I T-Zell und Makrophagen

vermittelte Demyelinisierung

TME, EAE

II Antikörper und Komplement

vermittelte Demyelinisierung

TME, EAE

III

distale Oligodendrogliopathie

und Apoptose

TME, MHV-Infektion, toxische

Mausmodelle (z.B. Ethidiumbromid,

Cuprizone, Lysolecithin,

Lipopolysaccharid)

IV

primäre oligodendrogliale

Degeneration TME, MHV-Infektion, toxische

Mausmodelle (z.B. Ethidiumbromid,

Cuprizone, Lysolecithin,

Lipopolysaccharid)

TME: murine Theilervirus-Enzephalomyelitis; EAE: Experimentelle Autoimmune

Enzephalomyelitis; MHV: Murines Hepatitisvirus

2.2 Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus

Das TMEV gehört zur Familie der Picornaviridae und stammt mit dem ebenfalls bei

Mäusen vorkommenden Enzephalomyokarditisvirus aus dem Genus Cardiovirus.

Picornaviren sind kleine (Pico), unbehüllte, ikosaedrische, ribonukleinsäure (RNS)-

haltige Viren mit einem Durchmesser von ca. 30 nm (RACANIELLO, 2001) (Abb. 2-

1). Die genetisch sehr eng miteinander verwandten TMEV-Stämme werden in eine

hoch- (GDVII, FA) und in eine schwachvirulente Untergruppe (DA, BeAn 3886, To4,

Yale, WW) eingeteilt (THEILER, 1937; THEILER und GARD, 1940 a und b;

DANIELS et al., 1952; ROZHON et al., 1983; PEVEAR et al., 1988, MONTEYNE et

al., 1997). Sie unterscheiden sich in ihrem in vitro- und in vivo-Verhalten. Die


hochvirulenten Virusstämme zeichnen sich durch die Bildung großer Plaques in der

Zellkultur aus und rufen nach intrazerebraler Infektion eine akute

Polioenzephalomyelitis mit oftmals tödlichem Ausgang für das Tier binnen 24 bis 48

Stunden post infectionem hervor. Die letale Dosis (LD)50 des GDVII-Stammes beträgt

etwa ein bis zehn plaquebildende Einheiten („plaque forming units“ PFU). Diese

Virusstämme zerstören hauptsächlich die Neurone des Großhirnkortex sowie der

spinalen Vorderhörner, wohingegen die weiße Substanz des Kleinhirns und

Rückenmarks nicht von der Infektion betroffen ist (STROOP et al., 1981). Im

Gegensatz zu den schwachvirulenten Virusstämmen, deren LD50 > 106 PFU beträgt,

fehlt den GDVII- und FA-Virusstämmen die Fähigkeit zur Persistenz im ZNS der

Maus (LIPTON, 1980; MONTEYNE, 1997). Die schwachvirulenten Virusstämme

bilden in vitro kleinere Plaques und sind durch eine deutlich geringere Virulenz in

vivo charakterisiert. Die DA- und BeAn-Stämme, auch „Theiler´s original strains“ (TO-

Stämme) genannt, verursachen nach intrazerebraler Infektion in empfänglichen

Mäusestämmen ein biphasisches Krankheitsbild. Dieses beginnt mit einer milden,

akuten Polioenzephalomyelitis und anschließenden chronischen, demyelinisierenden

Leukoenzephalomyelitis (DANIELS et al., 1952; LIPTON, 1975; LIPTON, 1980;

TSUNODA und FUJINAMI, 1996; MURRAY et al., 1998; MCGAVERN et al., 1999;

ZOECKLEIN et al., 2003). Der an die Zellkultur adaptierte, schwachvirulente WW-

Stamm verursacht eine remittierende demyelinisierende Enzephalomyelitis (DAL

CANTO und BARBANO, 1984).

Die einzelsträngige genomische RNS des TMEV hat eine positive Polarität und eine

Länge von etwa 8100 Nukleotiden. Sie enthält keine subgenomische mRNS

(PEVEAR et al., 1987; OHARA et al., 1988). Das TMEV unterscheidet sich von

anderen Picornaviren durch den nicht-kodogenen 5`-Bereich seines Virusgenoms,

welcher durch eine „internal ribosome entry site“ (IRES) gekennzeichnet ist, an die

zelluläre Ribosomen binden können (RACANIELLO, 2001). Unterschiede im 5´-

Bereich des Virusgenoms, die möglicherweise die Bindungseigenschaft der IRES für

die neuronale Form des Polypyrimidintrakt-Bindungsproteins beeinflussen, haben

einen erheblichen Einfluss auf die Neurovirulenz des Virus (JAROUSSE et al., 1999;

PILIPENKO et al., 2001; BRAHIC et al., 2005). Ein großer offener Leserahmen


(„open reading frame“, ORF) kodiert für ein aus 2303 Aminosäuren bestehendes

Polyprotein, dass wiederum in die zwölf reifen Proteine L, VP4, VP2, VP3, VP1, 2A,

2B, 2C, 3A, 3B, 3C, und 3D gespalten wird (Abb. 2-2). Ein weiterer die L/VP4/VP2

kodierende Region überlappender, kleiner ORF kodiert für das 18 kDa alternative

„leader“ (L*)-Protein. Dieses Protein wird nur von schwachvirulenten TMEV-

Stämmen, nicht aber vom neurovirulenten GDVII-Stamm, gebildet und stellt somit

einen wichtigen Bestandteil für die Erregerpersistenz dar (CHEN et al., 1995 a;

DRESCHER et al., 1997; OHARA et al., 2002; BRAHIC et al., 2005; STAVROU et

al., 2010). Das L*-Protein erleichtert die Infektion von Makrophagen/Mikroglia,

verzögert die Apoptose von infizierten Zellen und verhindert die durch CD8+-T-

Lymphozyten hervorgerufene Zytotoxizität (GHADGE et al., 1998; TAKATA et al.,

1998; LIN et al., 1999; VAN EYLL und MICHIELS, 2000). Eine Virusreplikation in

vitro in BHK21-Zellen findet auch ohne das „leader“ (L)- und das alternative „leader“

(L*)-Protein statt, allerdings besitzen die Proteine eine Schlüsselrolle bei der

Entstehung der chronischen demyelinisierenden TME in vivo (BRAHIC et al., 2005).

Das L-Protein ist ein kleines Zink-Finger Protein (CHEN et al., 1995 b), welches die

virale Replikation durch eine Hemmung der Typ-I Interferon-Synthese begünstigt

(VAN PESCH et al., 2001; VAN PESCH und MICHIELS, 2003; WEBER et al., 2004,

TAKANO-MARUYAMA et al., 2006). Des Weiteren zeigten Untersuchungen, dass

dieses Protein auch die intrazelluläre Translokation von Transkriptionsfaktoren

hemmt, was zur Unterdrückung von „immediate early genes“ führt und damit die

frühe antivirale Immunantwort unterdrückt (MAMANE et al., 1999; DELHAYE et al.,

2004; BRAHIC et al., 2005). Eine Grundeinheit des Kapsids setzt sich jeweils aus

einem Molekül der vier Strukturproteine VP1-4 zusammen, wobei VP1-3 an der

Oberfläche liegen und VP4 darunter lokalisiert ist. Das Kapsid besteht aus insgesamt

60 solcher Grundeinheiten und weist 20 dreieckige Flächen und 12 Ecken auf (LUO

et al., 1992; RACANIELLO, 2001) (Abb. 2-1). Durch die verschiedenartigen

Kapsidstrukturen und die daraus resultierenden unterschiedlichen Virusrezeptoren

kann der veränderte Zelltropismus der TMEV-Untergruppen erklärt werden.

Beispielsweise findet sich eine Infektion von Neuronen bei hochvirulenten Stämmen,

während schwachvirulente Stämme auch Mikroglia/Makrophagen infizieren können


(FU et al., 1990; JAROUSSE et al., 1994; SATO et al., 1996; JAROUSSE et al.,

1996; DRESCHER et al., 1997; O´SHEA et al., 1997; JAROUSSE et al., 1999;

MCCRIGHT et al., 1999; CAMERON et al., 2001; BRAHIC et al., 2005). Das virale

Protein 3D stellt die virale RNS-abhängige RNS-Polymerase dar, welche für die

genomische Replikation und RNS-Synthese des Virus verantwortlich ist. Die viralen

Proteine 2A und 3C katalysieren als Proteasen die Spaltung des viralen Polyproteins.

Das Protein 2C stellt eine Nukleosid-Triphosphatase dar und 3B ist ein kovalent an

das 5´-Ende der Virus-RNS gebundenes Protein. Die genauen Funktionen der

viralen Proteine 2B und 3A sind bisher noch nicht eindeutig geklärt worden

(DRESCHER et al., 1997; MONTEYNE et al., 1997; RACANIELLO, 2001; BRAHIC et

al., 2005). In Infektionsversuchen mit einem chimären GDVII/DA-TMEV wurde

bewiesen, dass alle Substämme des TMEV die Fähigkeit besitzen, in empfänglichen

Mäusestämmen eine Demyelinisierung hervorzurufen (FU et al., 1990; RODRIGUEZ

und ROOS, 1992). Allerdings kommt dieses bei den hochvirulenten Stämmen

aufgrund der ausgeprägten Neurovirulenz und der fehlenden Erregerpersistenz nicht

zum Ausdruck. Bisher konnte die Eigenschaft zur Demyelinisierung keinem

spezifischen viralen Genprodukt zugeordnet werden (BRAHIC et al., 2005; LIPTON

et al., 2005 a).

In vitro konnte in Infektionsversuchen mit Gehirnzellkulturen und Organexplantaten

verifiziert werden, dass sowohl die hochvirulenten als auch die schwachvirulenten

Virusstämme Neurone, Astrozyten und Oligodendrozyten sowie Gliavorläuferzellen

und Mikroglia/Makrophagen infizieren können (WROBLEWSKA et al., 1979; O`SHEA

et al., 1997). So konnte gezeigt werden, dass es in Oligodendrozyten und nicht nur in

Astrozyten zu einer persistierenden Infektion mit der Expression von Virusprotein

kommen kann. Weiterhin ist bekannt, dass der DA-Stamm in kultivierten Neuronen-

und Oligodendrozytenzelllinien eine Lyse induziert, im Gegensatz zum GDVII-Stamm

in murinen Makrophagen/Mikrogliazelllinien persistiert und eine produktive Infektion

hervorruft (GRAVES et al., 1986; OBUCHI et al., 1999; OHARA et al., 2002). Der

BeAn-Stamm ist in primären Gehirnzellkulturen von SJL/J-Mäusen vermehrt in

Astrozyten und kaum in Mikrogliazellen nachweisbar (KUMNOK et al., 2008).

Zusätzlich konnte in in vitro-Experimenten gezeigt werden, dass der BeAn-Stamm


Oligodendrozytenvorläuferzellen infiziert und deren Differenzierung in reife

Oligodendrozyten blockiert (PRINGPROA et al., 2010).

Abbildung 2-1: Dreidimensionale schematische Darstellung des unbehüllten TMEV-Virus

mit den Kapselproteinen VP1-4, die die kegelartigen Spitzen auf der Oberfläche des

ikosaedrischen Kapsids bilden (erstellt mit freundlicher Unterstützung von Benjamin Peters

mittels Adobe Photoshop CS3 und Adobe Illustrator CS3).

Abbildung 2-2: TMEV-Genom kodiert für zwölf Proteine, die sich aus vier Kapselproteinen

(VP1-4) und sechs Proteinen (2A-C, 3A-D) sowie den beiden L- und L*-Proteinen für die

Replikation zusammensetzen. Die Translation wird durch einen nicht-kodogenen 5`-Bereich

der „internal ribosome entry site“ (IRES) gesteuert, an die zelluläre Ribosomen binden

können.


2.3 Immunreaktion und Demyelinisierung im Verlauf der murinen Theilervirus-Enzephalomyelitis

Nach experimenteller Infektion zeigen die hochvirulenten Substämme des TMEV,

GDVII und FA histologisch Neuronennekrosen mit mikroglialer Neuronophagie und

lymphohistiozytärer Meningoenzephalomyelitis im Gehirn und Rückenmark

(OLISTKY und SCHLESINGER, 1941; LIPTON, et al., 1994; SETHI und LIPTON,

1981). Diese Läsionen finden sich hauptsächlich in Neocortex, Thalamus,

Hippocampus und Hirnstamm sowie in den Basalganglien und spinalen

Vorderhörnern. Das Kleinhirn und die weiße Substanz des ZNS zeigen in der Regel

keine entzündlichen Veränderungen (STROOP et al., 1981; LIPTON et al., 1994;

SIMAS et al., 1995). Vereinzelt werden intranukleäre Einschlusskörperchen vom

Cowdry B-Typ in Neuronen des Rückenmarks gefunden (OLITSKY und

SCHLESINGER, 1941; SETHI und LIPTON, 1981). Histologisch ist die durch das

GDVII-Virus hervorgerufene akute Polioenzephalomyelitis der Maus nicht eindeutig

von anderen viralen Enzephalitiden abgrenzbar. Ähnliche Veränderungen können

beispielsweise bei der Infektion mit dem Enzephalomyokarditisvirus, Coxsackievirus

oder Vilyuiskvirus auftreten (SETHI und LIPTON, 1981).

Vergleichbar mit diesen Alterationen finden sich nach experimenteller Infektion in der

akuten Infektionsphase bei den schwachvirulenten TMEV-Substämmen (DA- und

BeAn-Stamm) ebenfalls Makrophagen-, Lymphozyten- und Plasmazellinfiltrate in der

grauen Substanz und der Meninx. Die perivaskulären Entzündungszellinfiltrate sind

hauptsächlich im Dienzephalon (Thalamus, Hypothalamus, Subthalamus),

Hippocampus, Hirnstamm und Rückenmark sowie in den Basalganglien (Nucleus

caudatus, Pallidum und Putamen) lokalisiert (OLITSKY und SCHLESINGER, 1941;

RODRIGUEZ et al., 1987; STROOP et al., 1981; ZOECKLEIN et al., 2003). Die

entzündlichen Veränderungen im Groß- und Zwischenhirn sind in der chronischen

Phase (90 bis 180 Tage post infectionem) wieder verschwunden, wobei eine

Astrogliose und in Regionen ausgeprägter Malazie auch Mineralisationen in der

grauen Substanz zurückbleiben können (LIPTON et al., 1994). Die

Entzündungsreaktion in der Leptomeninx und weißen Substanz von Hirnstamm und


Rückenmark besteht überwiegend aus fokalen, perivaskulären Infiltrationen von

Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen, die sich nach ca. sieben Tagen post

infectionem manifestiert (LIPTON, 1975; ZOECKLEIN et al., 2003; ULRICH et al.,

2006). Diese mononukleäre Entzündung greift sukzessiv vom meningealen und

perivaskulären Raum auf das Parenchym der weißen Substanz über und besteht

dort ab dem 30. Tag post infectionem überwiegend aus Makrophagen/Mikroglia, die

sich durch die Phagozytose von Myelinbestandteilen zu Gitterzellen entwickeln

(LIPTON et al., 1994). Ihren Höhepunkt erreicht die Leukomyelitis etwa drei Monate

nach der Infektion (ULRICH et al., 2006). Mittels Durchflusszytometrie konnten im

Rückenmark hauptsächlich CD3+-T-Lymphozyten und CD11b+-Makrophagen in den

Entzündungszellinfiltraten nachgewiesen werden, während nur wenige CD19+-B-

Zellen und vereinzelte NK1.1+ natürliche Killerzellen vorlagen (LIPTON et al. 2005 a).

Die Immunantwort bei der TMEV-Infektion wird stark von der Zytokinexpression der

T-Zellen, Makrophagen/Mikroglia und Astrozyten beeinflusst. DA-TMEV-infizierte

empfängliche Mäuse exprimieren in der akuten Infektionsphase im Gehirn und in der

chronischen Phase im Rückenmark vermehrt den transformierenden

Wachstumsfaktor (TGF)-ß, Interferon (IFN)-γ und Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α

sowie Interleukin (IL)-1, IL-6, IL-12 und IL-10. Die Expression von IL-2 und IL-4

ändert sich im Verlauf der Infektion im Gehirn nicht. Im Rückenmark steigt hingegen

IL-4 in der akuten Phase an, während die IL-2-Expression in der chronischen Phase

vermindert ist (OLESZAK et al. 2004). Bei resistenten Mäusen zeigen sich keine

messbaren Veränderungen der Zytokinexpression im Rückenmark (CHANG et al.,

2000; OLESZAK et al., 1998 b). Resistente C57BL/6-Mäuse weisen während der

akuten Infektionsphase im Gehirn lediglich eine erhöhte IFN-γ-, IL-1-, IL-6-, IL-12-

und IL-10-Expression auf, wohingegen die Expression von TGF-ß, TNF-α, IL-2 und

IL-4 unverändert bleibt. IFN-γ wird von aktivierten NK-Zellen sowie von CD4+-T- und

CD8+-T-Lymphozyten produziert und trägt zur Viruseliminierung in resistenten

Mäusen bei (RODRIGUEZ et al., 1995). CD4+-T-Zellen wirken einerseits in der

frühen Erkrankungsphase protektiv, indem sie die antivirale Immunantwort

induzieren, andererseits sind sie bei empfänglichen Mäusen maßgeblich an der

Entwicklung der entzündungsbedingten Demyelinisierung beteiligt (BORROW et al.,


1993; BORROW et al., 1998). CD8+-T-Zellen eliminieren das Virus bei resistenten

Mäusen über eine Perforinausschüttung in der akuten Erkrankungsphase aus dem

ZNS (BORROW et al., 1992; MURRAY et al., 1998; PENA ROSSI et al., 1998).

Weiterhin verhindert die starke Induktion von ETS-1 und IFN-γ in der Frühphase der

TME eine Viruspersistenz und Entstehung von Läsionen in C57BL/6-Mäusen

(GERHAUSER et al., 2005). Im Vergleich führt die perforinabhängige Zytotoxizität

bei empfänglichen Mäusen in der chronischen Phase zu einer Schädigung von

Axonen und Entmarkung (RODRIGUEZ und SRIRAM, 1988; MURRAY et al., 1998).

Die Zytotoxizität der CD8+-T-Zellen reicht jedoch in diesen Mäusestämmen nicht aus,

um das Virus vollständig zu eliminieren (DRESCHER et al., 1997).

Nur bei TME-empfänglichen SJL/J-Mäusen entstehen eine Hypersensitivitätsreaktion

vom verzögerten Typ und Autoimmunreaktionen gegen endogene Myelinepitope in

der späten demyelinisierenden Krankheitsphase (CLATCH et al., 1986). Die

entscheidenen Zellen für die Entzündungsprozesse sind aktivierte CD4+-T-Zellen. In

der Frühphase richtet sich die DTH-Reaktion direkt gegen TMEV-Epitope. Im Verlauf

der Erkrankung erfolgt durch den Prozess des „epitope spreading“ ein Wechsel zu

MBP- und PLP-spezifischen Immunreaktionen (BORROW et al., 1998; LEHMANN et

al., 1998; VANDERLUGT et al., 1998; KATZ-LEVY et al., 1999; MILLER et al., 2001).

Die Lymphozyten produzieren vermehrt Lymphokine und locken damit Makrophagen

chemotaktisch an. Diese werden durch Phagozytose des Virus infiziert und spielen

somit eine entscheidene Rolle bei der Virusausbreitung im ZNS. Außerdem wird die

DTH-Reaktion durch die fortwährende Virusreplikation und -persistenz

aufrechterhalten (TSUNODA et al., 1996; DRESCHER et al., 1997; LIPTON et al.,

2005 b). In wieweit immunpathologische Prozesse für die Demyelinisierung

verantwortlich sind, wird teilweise kontrovers diskutiert, da die Beteiligung einer

direkten Virusinfektion von Oligodendrozyten oder einer Autoimmunreaktion an der

Zerstörung der Myelinscheiden in Abhängigkeit vom verwendeten Virusstamm variert

(ZOECKLEIN et al., 2003). In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass

der DA-Stamm, welcher hauptsächlich in Oligodendrozyten persistiert, sowohl eine

virusinduzierte Apoptose und Nekrose der Zellen als auch eine zytotoxische T-

Zellantwort auslöst (RODRIGUEZ et al., 1983 a; AUBERT et al., 1987; LINDSLEY et


al., 1991; ZOECKLEIN et al., 2003), während der BeAn-Stamm vor allem

Makrophagen infiziert und damit zunächst eine DTH-Reaktion gegen das TMEV und

im weiteren Krankheitsverlauf zusätzlich eine myelinspezifische Autoimmunität

induziert (CLATCH et al., 1986; LIPTON et al., 1995; KATZ-LEVY et al., 1999;

MILLER et al., 2001; ZOECKLEIN et al., 2003; LIPTON et al., 2005 b).

2.4 Ausbreitung von Viren im Zentralen Nervensystem

Viren besitzen mehrere Möglichkeiten das ZNS zu infizieren und sich innerhalb des

Nervengewebes auszubreiten. Neurotrope Erreger finden sich in zahlreichen

Virusfamilien, wie beispielsweise den Reoviren, Coronaviren, Paramyxoviren,

Bornaviren, Herpesviren und Picornaviren (TYLER und NATHANSON, 2001). Dabei

spielen spezifische Rezeptoren an ihrer Oberfläche eine nicht unerhebliche Rolle.

Diese ermöglichen es den Viren an bestimmten Zellrezeptoren hochaffin zu binden.

Herpesviren binden beispielsweise über Heparansulfat an ihre Zielzellen, während

Tollwutviren an Acetylcholinrezeptoren, Phospholipiden und Gangliosiden binden.

Reo-, Ortho- und Paramyxoviren koppeln an Sialinsäure enthaltene Oligosaccharide

und Polioviren an spezifische Immunglobuline, die sogenannten Poliovirusrezeptoren

(BLAKE, 2010; DALEY et al., 2005; DIETZSCHOLD et al., 2005). Murine

Coronaviren nutzen ein karzinoembryonales Adhäsionsmolekül auf B-Lymphozyten

und Makrophagen als spezifischen Rezeptor (MATTHEUS et al., 2002).

Paramyxoviren, wie das kanine Staupevirus infiziert Lymphozyten über das CD150-

Molekül, den sogenannten „signaling lymphocyte activation molecule“ (SLAM)

Rezeptor (WENZLOW et al., 2007).

Eine experimentelle Virusinfektion muss von der natürlichen Virusinfektion des ZNS

abgegrenzt werden. Bei einer experimentellen Infektion durch direkte intrazerebrale

oder -nervale Injektion des Virus oder auch oro-nasale Verabreichung, lässt sich das

Virus zunächst in der Nähe der Infektionsstelle nachweisen. Im weiteren Verlauf

breitet sich die Infektion axonal, liquorogen oder hämatogen weiter aus. Die

Ausbreitung über das periphere Nervensystem bedingt eine Infektion von Axonen


oder Dendriten. Neurotrope Viren gelangen bei einer natürlichen Infektion des

Wirtstieres zum einen über periphere sensorische, motorische und autonome Nerven

oder zum anderen hämatogen über die Blut-Hirn-Schranke ins Gehirn. Bornaviren

nutzen zum Beispiel den intraaxonalen Weg über die olfaktorischen Nerven zum

ZNS (CARBONE et al., 1987; MORALES et al., 1988). Das obligat neurotrophe

Tollwutvirus nutzt überwiegend motorische Nerven, um sich transsynaptisch über die

Dendriten auszubreiten (DIETZSCHOLD et al., 2005; UGOLINI, 2008). Im ZNS

können sich neurotrope Viren axonal und transsynaptisch (z.B. das Borna- und

Tollwutvirus), über Ependym- und Plexus choroideus-Zellen und weiter in der

zerebrospinalen Flüssigkeit über das Ventrikelsystem (z.B. LCMV, MHV, Polio-,

Influenza A- und Visna-Viren) oder hämatogen über Blutgefäße der Meningen, des

Plexus choroideus sowie des Gehirns ausbreiten (z.B. LCMV, Staupe-, Retro-,

Masern-, Influenza A- und Lentiviren). Das Staupevirus aus der Familie der

Paramyxoviridae nutzt in der frühen Krankheitsphase die Infektion von Lymphozyten

als Strategie, um hämatogen als „Trojanisches Pferd“ in das ZNS der betroffenen

Tiere zu gelangen (BAUMGÄRTNER et al., 1989; SUMMERS et al., 1978). Im

Gehirn breitet sich das Staupevirus anschließend liquorogen aus. Im weiteren

Verlauf kann eine Infektion des Plexus choroideus sowie eine ependymale und

subependymale Infektion in der weißen Substanz bei der Hundestaupe

nachgewiesen werden, wodurch die hierbei auftretende periventrikuläre Entmarkung

erklärt werden kann (VANDEVELDE et al., 1985). Auch eine direkte Ausbreitung des

Hundestaupevirus von meningialen Zellen der Pia mater wird angenommen

(BAUMGÄRTNER et al., 1989). Das Semliki Forest Virus der Mäuse gelangt bei

einer gestörten Blut-Hirnschranke über zerebrale Endothelzellen ins Gehirn, wobei

multifokale perivaskuläre Infiltrate entstehen (FAZAKERLEY, 2002). Bei der

experimentellen Poliovirusinfektion von Mäusen kann ebenfalls eine ependymale

Ausbreitung mit einer Infektion glialer Zellen nachgewiesen werden (IDA-

HOSONUMA et al., 2002). Eine neurogen aszendierende Infektion des Rückenmarks

wird zusätzlich für Polioviren nach einer intramuskulären Inokulation beschrieben.

Hierbei breitet sich das Virus intraaxonal retrograd über den N. ischiadicus aus (REN

und RACANIELLO, 1992; OHKA et al., 1998). Das MHV vom Serotyp 4 und das


neurovirulente Influenza A-Virus breiten sich im Gehirn der Maus nach

intrazerebraler Infektion in der akuten Phase über die Ependymzellen im

Ventrikelsystem aus und sind vier Tage post infectionem periventrikulär in der

weißen Substanz nachweisbar (STOHLMAN und HINTON, 2001; REINACHER et al.,

1983). Bei intranasaler Infektion gelangen sowohl das MHV als auch das Influenza

A-Virus über den N. olfactorius und den N. trigeminus ins Gehirn der Versuchstiere

(PERLMAN et al., 1989; BARNETT und PERLMAN, 1993; REINACHER et al., 1983).

Aus der Familie der Picornaviridae und dem Genus Enterovirus gelangen das

porcine Enterovirus 1, beim Schwein, und das aviäre Enterovirus, beim Vogel,

hämatogen ins ZNS, wo sie eine Enzephalomyelitis beim jeweiligen Tier auslösen

(TYLER und NATHANSON, 2001).

2.5 Ausbreitung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus im Zentralen Nervensystem

Eine natürliche ZNS-Manifestation von TMEV tritt vermutlich nur sehr selten auf und

wurde lediglich auf ein bis zehn Fälle pro 10000 Mäuse geschätzt (THEILER und

GARD, 1940 a und b). Allerdings kam es in einer Mäusekolonie zu einem einmaligen

epidemischen Ausbruch mit einer Mortalität von über 50% durch den hochvirulenten

GDVII-TMEV-Stamm. Die betroffenen Tiere zeigten eine akute Polioenzephalitis

(THOMPSON et al., 1951). Max Theiler gelang es das TMEV aus dem ZNS von

Mäusen mit spontaner schlaffer Gliedmaßenlähmung zu isolieren (THEILER, 1934

und 1937). Alle Mäusestämme entwickeln nach experimenteller intrazerebraler

Infektion mit dem TMEV eine akute Polioenzephalomyelitis von variablem Ausmaß

(BRAHIC et al., 2005).

Der Verbreitungsweg des TMEV in der akuten Infektionsphase im Gehirn und auch

der Weg vom Gehirn ins Rückenmark in der chronischen Erkrankungsphase sind

bisher noch nicht eindeutig geklärt (VILLAREAL et al., 2006; WADA und FUJINAMI,

1993; ZURBRIGGEN und FUJINAMI, 1988). Die Dorsalstränge des Rückenmarks


sind kaum in den Krankheitsprozess einbezogen, was unter anderem darauf

hinweist, dass das Virus über deszendierende Nervenfasern ins Rückenmark gelangt

(TSUNODA et al., 2003). Durch die Lyse der Axone kann das freigesetzte TMEV die

umliegenden Myelinscheiden und Oligodendrozyten infizieren (ROUSSARIE et al.,

2007). Anschließend wird das Virus von Mikroglia/Makrophagen phagozytiert, was

essentiell für die spätere Persistenz des Agens in der weißen Substanz und die

Auslösung der immunpathologischen Reaktionen ist (CLATCH et al., 1986; KATZ-

LEVY et al., 1999; MILLER et al., 2001; TSUNODA und FUJINAMI, 2002; LIPTON et

al., 2005 b). Die Verteilung des Virus im ZNS hängt bei der experimentellen Infektion

von der Injektionsstelle und Infektionsart (orale oder intrazerebrale Infektion) ab (HA-

LEE et al., 1995; VILLARREAL et al., 2006). Nacktmäuse, die mit TMEV in den

olfaktorischen Bulbus oder den Kortex infiziert wurden, weisen zwei Tage post

infectionem das Virus in Neuronen der olfaktorischen Nuklei und in Neuronen der

anteroventralen Kerngebiete des Thalamus und Hippocampus auf. Bis zum zehnten

Tag post infectionem verteilt sich der Erreger im Gehirn in den Regionen des

Dienzephalons sowie in denen des Mittelhirns, Stammhirns und der Medulla. Das

Kleinhirn weist bei diesem Versuchsansatz kein Virusantigen und der N. trigeminus

nur sehr wenige infizierte Zellen auf. Hieraus lässt sich ableiten, dass eine Verteilung

über miteinander verbundene zerebrale Regionen des limbischen Systems im Gehirn

für das TMEV von Bedeutung ist (WADA und FUJINAMI, 1993) (Tab. 2-2). Bei oraler

TMEV-Infektion neonataler Mäuse kann das Virus vorwiegend im Dienzephalon,

Kortex, rostralen Mittelhirn und kaudalen Thalamus nachgewiesen werden. Zuerst

findet sich das Virus bei dieser Infektion in Milz sowie Leber und gelangt

anschließend möglicherweise über vaskuläre Endothelzellen ins Gehirn (HA-LEE et

al., 1995). Über die Virusausbreitung vom Gehirn ins Rückenmark gibt es ebenfalls

verschiedene Hypothesen. In vorangegangenen Studien wurde virale RNS in pialen

Zellen und dem Liquor detektiert, woraufhin eine liquorogene Verteilung postuliert

wurde (YAMADA et al., 1990; TROTTIER et al., 2002). In oral infizierten, neonatalen

Mäusen gelang der Nachweis von TMEV in Ependymzellen der Ventrikelsysteme

oder in der periventrikulären grauen Substanz des ZNS allerdings nicht (HA-LEE et

al., 1995). Der hämatogene Verteilungsweg ist ebensfalls möglich, da virale RNS in


Endothelzellen nachgewiesen wurde (WADA und FUJINAMI, 1993; ZURBRIGGEN

und FUJINAMI, 1988). Bei Mäusen, die mit dem GDVII-Stamm infiziert werden,

wandert das Virus axonal über den N. ischiadicus ins Rückenmark (MARTINAT et

al., 1999). Bei einer Studie mit immundefizienten SCID-Mäusen wurde nach direkter

Injektion des DA-Virusstammes in den N. ischiadicus auch eine Infektion der Nerven

und des Rückenmarks nachgewiesen (DRESCHER und TRACY, 2007).

Bemerkenswert ist, dass es bei einer intraperitonealen Infektion von empfänglichen

Mäusestämmen mit dem DA-Stamm in der Regel nach drei Wochen zu einer

demyelinisierenden Myelitis kommen kann, ohne dass das Gehirn pathologische

Veränderungen ausweist. Diese Tatsache deutet auf eine neurogen aszendierende

Infektion des Rückenmarks hin (GOMEZ et al., 1996)(Tab. 2-2).

2.6 Ausbreitung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus im extraneuralen Gewebe nach natürlicher und experimenteller Infektion bei Mäusen

Das TMEV ist ein natürlich vorkommender Erreger der Maus und wird normalerweise

fäkal/oral übertragen und verursacht in der Regel inapparente Magen-Darm-

Infektionen (OLITSKY, 1939; OLITSKY, 1940; THEILER und GARD, 1940 a und b;

VON ZSCHOCK, 1953; LIPTON et al., 2001). Serumantikörper gegen TMEV können

weltweit in etwa 60% aller freilebenden Hausmäuse (Mus musculus) nachgewiesen

werden, die somit den natürlichen Wirt und das Reservoir für TMEV darstellen

(LIPTON et al., 2001). Bei Labormäusen, die nicht unter spezifisch-pathogenfreien

Bedingungen gehalten werden, kann das TMEV häufig isoliert werden

(DESCOTEAUX et al., 1977). Empfängliche Wühlmäuse (Microtus pennsylvanicus)

können außerdem TMEV-spezifische Antikörper aufweisen (DESCOTEAUX und

MIHOK, 1986; LIPTON et al., 2001).

Die natürliche fäkal/orale Infektion findet bei drei bis sechs Wochen alten Mäusen

kurz nach dem Absetzen statt (OLITSKY, 1939). In einer Kolonie sind dabei häufig


nahezu alle Tiere betroffen (THEILER und GARD, 1940 a und b). Die Virusreplikation

findet vornämlich im Darmtrakt statt, wobei die Ausscheidungsmenge des TMEV in

den Fäzes zwischen sechster Woche und dem sechsten Monat nach der natürlichen

Infektion drastisch abnimmt. Bei einzelnen Mäusen gelingt es das Virus im Kot bis 53

Tage nach der natürlichen Infektion zu reisolieren (OLITSKY, 1939; THEILER und

GARD, 1940 a und b). Vermutlich persistiert das Virus innerhalb einer

Mäusepopulation durch kontinuierliche, fäkal/orale Neuinfektionen von nichtimmunen

Mäusen (THEILER und GARD, 1940 a und b; GOMEZ et al., 1996; VON ZSCHOCK,

1953; TROTTIER et al., 2002).

Experimentell gelang es nach intramuskulärer oder intraperitonealer TMEV-Injektion

die Herz- und Skelettmuskulatur zu infizieren (OLITSKY und SCHLESINGER, 1941;

GOMEZ et al., 1996). Auch induzierter sozialer Stress bei einer experimentellen,

intrazerebralen TMEV-Injektion kann sich negativ auf den klinischen Verlauf mit einer

deutlich verminderten Immunantwort im ZNS und daraus resultierenden erhöhten

Virustitern in der akuten Infektionsphase auswirken. Zusätzlich liegt eine deutliche

Thymusatrophie sowie eine Nebennierenhypertrophie und ein verminderter Gehalt

an Lymphozyten sowie eine Erhöhung von neutrophilen Granulozyten im Blut von

gestressten Mäusen vor (CAMPBELL et al., 2001; JOHNSON et al., 2004). Diese

Veränderungen werden auf einen stress-induzierten Kortikosteroidspiegel

zurückgeführt, welcher eine Immunsuppression und damit eine verminderte

Entzündungszellantwort bedingt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass

wiederholter induzierter Stress in der akuten Infektionsphase auch eine

Virusausbreitung bei der TME in die peripheren Organe wie Lunge, Milz,

Lymhknoten, Thymus und Herz begünstigt (MI et al., 2006). Die Immunsuppression

vermindert auch die Aktivität der natürlichen Killerzellen (NK) und lässt TNF-α im

Serum gestresster Mäuse ansteigen. Dieses trägt ebenfalls dazu bei, dass das

TMEV nicht aus dem ZNS gestresster Mäuse eliminiert wird (WELSH et al., 2004).

Die hochvirulenten Virusstämme (GDVII, FA) zeichnen sich nach intrazerebraler,

intranasaler und seltener nach intraperitonealer Infektion durch das Hervorrufen einer

akuten Polioenzephalomyelitis aus. Eine experimentelle orale, subkutane oder

intravenöse Infektion bleibt überwiegend erfolglos (THEILER und GARD, 1940 a und


b; VON ZSCHOCK, 1953). In der chronischen Infektionsphase nach intrazerebraler

Infektion gelang es bislang nicht, das TMEV mittels Reverse Transkriptase-

Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) in extrazerebralen Organen von

immunkompetenten Mäusen nachzuweisen (TROTTIER et al., 2002).

2.7 Virale Persistenzmechanismen

Viren werden vom Immunsystem als fremd erkannt und induzieren eine

Immunantwort, welche im Idealfall den Erreger eliminiert. Allerdings haben

verschiedene Viren im Verlauf der Evolution effektive Strategien entwickelt dieser

antiviralen Immunität zu entgehen, um eine fortwährende Replikation bzw. Persistenz

im Wirtsorganismus sicherzustellen. Beispielsweise induzieren bestimmte Viren (z.B.

Pockenviren, Adenoviren, Herpesviren) eine verminderte MHC Klasse I-Expression

der infizierten Zellen, sodass diese nicht mehr von CD8+-T-Effektorzellen erkannt

werden können (OLDSTONE, 2006). Gammaherpesviren persistieren latent in B-

oder T-Lymphozyten, dabei spielt das sogenannte „genome maintenance protein“

(GMP), eine entscheidene Rolle (BLAKE, 2010). Das Lymphozytäre

Choriomeningitisvirus (LCMV) persistiert in der Maus in B- und T-Lymphozyten und

Monozyten (OLDSTONE, 2006).

Außerdem vermögen verschiedene Viren, wie zum Beispiel das kanine Staupevirus,

durch ihre Affinität für lymphatische Organe die Immunzellen direkt zu zerstören oder

zu modulieren. In diesem Zusammenhang führt die Infektion bestimmter Zelltypen

des lymphoretikulären Systems zu deren Apoptose oder zu einer gestörten

Zytokinexpression. Hiervon sind häufig antigenpräsentierende Zellen, wie

Makrophagen und dendritische Zellen oder CD4+-T-Helferzellen betroffen, wodurch

eine effiziente Induktion der Immunantwort unterbleibt. Viren haben Mechanismen

entwickelt, dem wirtseigenen Interferon (IFN) Type 1-System entgegen zu wirken

und die IFN-Antwort herunter zu regulieren. Das Masernvirus und Respiratorisches

Syntitialvirus blocken beispielsweise die IFN-Produktion durch Beinflussung des toll-

like Rezeptor (TLR)-Signalwegs in dendritischen Zellen (OLDSTONE, 2006).


Viele negativ-strängige RNS-Viren, wie das Tollwut- und Bornavirus besitzen das

Phosphorprotein, welches als IFN-Antagonist fungiert (HALLER et al., 2006). Eine

immunologische Toleranz mit klonaler Depletion virusspezifischer T-Zellen kann

insbesondere bei fetalen oder frühen postnatalen Virusinfektionen beobachtet

werden. Diesen Persistenzmechanismus findet man bei dem Model der kongenitalen

LCMV-Infektion der Maus (OLDSTONE, 2009). Die gehemmte Immunität ist hierbei

auf das jeweilige Virus beschränkt, während die Immunabwehr gegen andere

Erreger nicht beeinflusst ist. Außerdem besitzen verschiedene virale Proteine

immunmodulatorische Eigenschaften und vermögen so immunologische Funktionen

von infizierten, aber auch von nicht infizierten Zellen zu beeinflussen. Beispiele

hierfür sind die virusinduzierten Hemmungen der Zellproliferation und der

Komplementaktivierung durch Lenti-, Polio- und Herpesviren (OLDSTONE, 2006).

Weiterhin führt eine Dysregulation der Zytokinexpression beispielsweise über

erhöhte IL-10- und verminderte IL-12-Sekretionen zu einer gestörten Immunabwehr.

In diesem Zusammenhang findet sich bei der Infektion mit dem Felinen

Immundefizienz-Virus (FIV) der Katze eine immunologische Anergie mit vermehrter

Apoptoseinduktion von Immunzellen und Expansion von regulatorischen T-Zellen.

Neuere therapeutische Strategien bei chronischen Viruskrankheiten in der Human-

und Tiermedizin basieren daher unter anderem auf der Beeinflussung der Expression

von programmed cell death-1 (PD-1) und IL-10, um virusinduzierte

Immunsuppressionen zu unterbrechen (MARTINIC und VON HERRATH, 2008).

Weiterhin ist die fehlende oder reduzierte Expression von MHC I-Molekülen auf der

Oberfläche von Neuronen ein Grund für die neuronale Persistenz vieler Viren, da die

virusspezifische, zytotoxische T-Zellantwort dadurch erheblich abgeschwächt wird

(JOLY et al., 1991). Neuronale Persistenz zeigen die unterschiedlichsten Viren, wie

z. B. Paramyxo-, Borna- und Tollwutviren (BAUMGÄRTNER et al., 1989; CARBONE

et al., 1987; DIETZSCHOLD et al., 2005). Alphaherpesviren persistieren latent in

sensorischen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Mikroglia dienen

ebenfalls der dauerhaften Persistenz und Replikation von Viren, z.B. von

verschiedenen Morbilliviren sowie von den Semiki Forest Virus oder MHV (BURKE

und COX, 2010; FAZAKERLEY, 2002). Das Gehirn als ein Zielorgan begünstigt eine


virale Persistenz, da die Blut-Liquor-Schranke nur ein limitiertes Einwandern von

Lymphozyten zur antiviralen Abwehr ermöglicht (OLDSTONE und RALL, 1993).

2.8 Zelltropismus und Persistenz des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus im Zentralen Nervensystem

Der Zelltropismus des TMEV im Verlauf der experimentellen Infektion ist maßgeblich

abhängig von dem genetischen Hintergrund und der Immunkompetenz der

verwendeten Mäuse. Vergleichbar der Virusausbreitung wird darüber hinaus die

Infektion der primären Zielzelle in der akuten bzw. chronischen Phase durch den

Versuchsaufbau, insbesondere durch die Injektionsart beeinflusst (Tab. 2-2).

Nach intrazerebraler Injektion mit einem hoch- (z.B. GDVII)- oder einem

schwachvirulenten (z.B. DA oder BeAn)-TMEV-Stamm in die Großhirnhemisphäre

zeigt sich bis zum zehnten Tag post infectionem eine Virusreplikation überwiegend in

den Neuronen der grauen Substanz. Virusantigen und virale RNS können in den

Neuronen und auch deren Axone in der Nähe der Injektionsstelle sowie bilateral

symmetrisch in der Pyramidalzellschicht des Hippokampus nachgewiesen werden.

Dieses ist charakteristisch für die akute Erkrankungsphase nach experimenteller

Infektion in allen Mäusestämmen ungeachtet ihres genetischen Hintergrundes

(AUBERT und BRAHIC, 1995; DAL CANTO und LIPTON, 1975; ZURBRIGGEN und

FUJINAMI, 1988). Anschließend gehen die infizierten Neuronen und ihre Axone

durch Apoptose zugrunde. Allerdings breiten sich das DA-Virus sowie das GDVII-

Virus zunächst in den ersten Tagen nach der Infektion axonal weiter aus (MARTINAT

et al., 1999; DAL CANTO und LIPTON, 1982; TSUNODA et al., 2003) (Tab.2-2).

Neben dem Vorkommen in Neuronen des Gehirns repliziert sich der DA-TMEV-

Stamm vier Tage post infectionem in SJL/J-Mäusen auch zu einem geringen Anteil in

Astrozyten und Makrophagen/Mikroglia. Der GDVII-Virusstamm infiziert zum gleichen

Zeitpunkt annähernd zehnmal mehr Neurone als der schwachvirulente DA-Stamm

(AUBERT und BRAHIC, 1995). Die Apoptose zahlreicher Nervenzellen in der akuten


Phase im Gehirn und Rückenmark ist vermutlich als eine aktive Abwehrreaktion nach

der akuten Virusinfektion mit dem GDVII-Virusstamm zu sehen, wenngleich sie den

Tod der Tiere bedingt (TSUNODA et al., 1997). Bei dem schwachvirulenten DA-

Virusstamm finden sich in der Spätphase der Infektion vorwiegend apoptotische

Oligodendrozyten in den demyelinisierenden Läsionen sowie Apoptosen von

mononukleären Zellen in den perivaskulären Infiltraten und in der weißen Substanz

des Rückenmarks von infizierten SJL/J-Mäusen, welche nicht direkt den Tod der

Mäuse implizieren oder zur Eliminierung des Virus führen (TSUNODA et al., 1997).

Das schwachvirulente DA-Virus kann am vierten Tag post infectionem auch in

einigen Neuronen des Rückenmarks nachgewiesen werden. Ab dem elften Tag nach

der Infektion findet eine Vermehrung des TMEV in der spinalen, weißen Substanz

vor allem in intraläsionalen Makrophagen und Astrozyten statt (DAL CANTO und

LIPTON, 1982; RODRIQUEZ et al., 1983 b). Im Verlauf der experimentellen Infektion

kommt es zu einer Reduktion der Virusmenge im Rückenmark (> 106

PFU/Rückenmark am 15. Tag post infectionem im Vergleich zu 102 bis 104

PFU/Rückenmark am 28. Tag post infectionem). Allerdings ist die Persistenz mit

einer kontinuierlichen Replikation viraler RNS während der chronischen Phase

vergesellschaftet (SETHI und LIPTON, 1983; TROTTIER et al., 2001). Erst am 28.

Tag nach der Infektion befindet sich das TMEV im Zytoplasma von

Oligodendrozyten, Astrozyten und Makrophagen der weißen Substanz und nicht

mehr in Neuronen der grauen Substanz des Rückenmarks von SJL/J-Mäusen. Ab

dem 45. Tag post infectionem kann DA-Virusantigen vorwiegend in Oligodendrozyten

nachgewiesen werden (RODRIQUEZ et al., 1983 a). Mittels in situ-Hybridisierung

wird virale RNS des DA-Virus in 25-40% der Oligodendrozyten, 10% der Mikroglia

und 5-10% der Astrozyten im Zeitraum von zwei bis sechs Monaten post infectionem

detektiert (AUBERT et al., 1987). Andere Untersuchungen zeigen jedoch, dass

Astrozyten die primären Zielzellen für die virale Persistenz darstellen. In dieser

Untersuchung konnte virale RNS und Antigen des BeAn-Stammes vorwiegend in

Astrozyten von infizierten SJL/J-Mäusen dargestellt werden (ZHENG et al., 2001). Im

Gegensatz dazu wurde in anderen Studien eine bevorzugte Replikation und

Persistenz des BeAn-Virus in Makrophagen des Rückenmarks von chronisch


infizierten SJL/J-Mäusen nachgewiesen (CLATCH et al., 1990; LIPTON et al., 1995).

Die Immunfluoreszenzdoppelmarkierung zeigt DA- und BeAn-Virus-Antigen an Tag

45. und 90. post infectionem bei SJL/J-Mäusen in Oligodendrozyten und

Makrophagen/Mikroglia der weißen Substanz des Rückenmarks und Stammhirns

(ZOECKLEIN et al., 2003). Zu keinem Infektionszeitpunkt wurde bislang DA-

Virusantigen in Ependymzellen oder infiltrierten T- und B-Lymphozyten

nachgewiesen (HA-LEE et al., 1995; LIPTON et al., 1995; SETHI und LIPTON, 1983;

ZURBRIGGEN und FUJINAMI, 1988). In vitro gelang es das TMEV in

zerebrospinalen Endothelzellen zu vermehren, so dass eine virale Persistenz in

diesen Zellen und auch eine Ausbreitung in vivo postuliert wurde (SAPATINO et al.,

1995). Im Gehirn und Rückenmark infizierter Nacktmäuse wurde TMEV-RNS in

vaskulären Endothelzellen und in der Nähe von Blutgefäßen mittels in situ-

Hybridisierung detektiert. Vier Monate nach der intrazerebralen Infektion mit dem

BeAn-Stamm wies keine Maus Virus im Herz, Verdauungstrakt und den

mesenterialen Lymphknoten auf (ZURBRIGGEN und FUJINAMI, 1988). Diese

Ergebnisse sprechen für eine primäre Persistenz des TMEV im ZNS und nicht in

peripheren extraneuralen Organen von immunkompetenten Mäusen. Mittels RT-PCR

wurde virale RNS des BeAn-Virus in der chronischen Infektionsphase hauptsächlich

im Rückenmark und in geringen Mengen im Klein- und Stammhirn sowie in der

zerebrospinalen Flüssigkeit von SJL/J-Mäusen detektiert (TROTTIER et al., 2002).

Somit persistiert das schwachvirulente TMEV vorwiegend in der weißen Substanz

des Rückmarks, sowie des Klein- und Stammhirns, jedoch nicht im Großhirn

(YAMADA et al., 1990).

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Hypothesen und Ziele 29

3 Hypothesen und Ziele In vorausgegangenen Untersuchungen über die Pathogenese der TME lag ein

besonderes Augenmerk auf der chronischen, demyelinisierenden Erkrankungsphase

dieses Tiermodells der MS (LIPTON et al., 1994, TSONUDA et al., 2003). Über die

akute Infektionsphase sowie über die Ausbreitung des Virus nach experimenteller

intrazerebraler Infektion im ZNS, insbesondere im Gehirn sowie in extraneuralen

Gewebe der Mäuse, gibt es vergleichsweise wenige Studien. Bei der MS treten die

demyelinisierenden Läsionen vorwiegend im Gehirn auf, so dass sich die Frage

stellt, ob Parallelen zu der MS hinsichtlich der Läsionsentwicklung im Gehirn von

TMEV-infizierten Mäusen gefunden werden können. Außerdem ergibt sich die Frage

nach der Virusausbreitung in verschiedenen Regionen des ZNS (VELLINGA et al.,

2009).

Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit bestand in der Herstellung und

Charakterisierung eines TMEV-spezifischen polyklonalen Antikörpers im Kaninchen,

welcher für weiterführende immunhistologische, immunfluoreszenzmikroskopische

und immunelektronenmikroskopische Studien verwendet werden kann.

Basierend auf den Ergebnissen des ersten Teiles war es das Ziel des zweiten Teils

der vorgelegten Arbeit, mittels des hergestellten Antikörpers die Verteilung des

TMEV in empfänglichen SJL/J- und resistenten C57BL/6-Mäusen während des

Infektionsverlaufes vergleichend zu charakterisieren. Zusätzlich wurde die

Ausbreitung der viralen RNS mittels in situ-Hybridisierung in beiden Mäusestämmen

ermittelt. Schließlich diente die immunfluoreszenzmikroskopische Doppelmarkierung

zur Ermittlung der Persistenz des BeAn-Virus zu verschiedenen Zeitpunkten der

Infektion und in unterschiedlichen Regionen des ZNS.

Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse sollen zu einer detaillierten

Charakterisierung des Verlaufes der experimentellen TME und deren

Vergleichbarkeit mit der MS des Menschen beitragen.

30 Periventricular brain lesion development

4 Generation and characterization of a polyclonal antibody for the detection of Theiler´s murine encephalomyelitis virus by light and electron microscopy

Maren Kummerfeld a, Jochen Meens b, Ludwig Haas c, Wolfgang Baumgärtner a,

Andreas Beineke a*

aDepartment of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg

17, D-30559 Hannover, Germany bDepartment of Microbiology and Infectious Diseases, University of Veterinary

Medicine Hannover, Bischhofsholer Damm 15, D-30173 Hannover, Germany cDepartment of Virology, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17,

D-30559 Hannover, Germany

Published in: The Journal of Virological Methods 160: 185-188, 2009

* Corresponding Author:

Prof. Dr. Andreas Beineke, Dipl. ECVP

Department of Pathology

University of Veterinary Medicine Hannover

Bünteweg 17

D-30559 Hannover

Tel: +49 (0) 511 953 8640

Fax: +49 (0) 511 953 8675

E- mail address: [email protected]

Periventricular brain lesion development 31

5 Periventricular brain lesion development and region-specific susceptibilities to demyelination in a viral murine model for multiple sclerosis

Maren Kummerfeld a, Stephanie Klein a, Reiner Ulrich a, Robert Kreutzer a, Ingo

Gerhauser a, Wolfgang Baumgärtner a, b, Andreas Beineke a

a Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hanover, Bünteweg

17, D-30559, Hanover, Germany. b Center for Systems Neuroscience Hanover, Bünteweg 17, D-30559, Hanover,

Germany.

Submitted 2010

Corresponding author: Prof. Dr. Andreas Beineke, Dipl. ECVP

Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hanover.

Bünteweg 17, D-30559 Hanover, Germany

Phone: +49-(0)511-953-8640

Fax: +49-(0)511-953-8675

Email: [email protected]


5.1 Abstract The Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection of mice is a widely

used animal model for demyelinating disorders, such as multiple sclerosis in humans.

The aim of the present study was to identify topographical differences of TMEV spread

and demyelination in the central nervous system (CNS) of experimentally infected

susceptible SJL/J mice and C57BL/6 mice, which are resistant to virus-induced

demyelination. Viral dissemination within the CNS and extraneural tissues was

quantified by immunohistochemistry and in situ- hybridization. Further, the phenotype

of infected cells was identified by confocal laser scanning microscopy. Inflammatory

responses and demyelination within the CNS was determined by a semiquantitative

scoring system. Furthermore, accumulation of microglia/macrophages was quantified

in different CNS regions by CD107b-specific immunohistochemistry. Results show an

early infection of ependymal and periventricular cells followed by inflammation and

demyelination around the fourth ventricle in susceptible SJL/J mice. While

periventricular demyelination was transient, white matter lesions of brain stem and

spinal cord progressed. Myelin loss was associated with an accumulation of CD107b+

microglia/macrophages. Summarized, the demonstration of ependymal infection and

subjacent spread into the brain parenchyma as well as regional virus clearance

despite ongoing demyelination in other CNS compartment allows new insights into

TME pathogenesis. This novel aspect of virus CNS interaction will enhance our

understanding of region-specific susceptibilities to injury and regenerative capacities of

the brain in this infectious MS model.

Key words: multiple sclerosis, Theiler’s murine encephalomyelitis virus, viral spread,

periventricular demyelination


5.2 Introduction

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune demyelinating disorder of the central

nervous system (CNS) in humans with unknown etiology (Rosche et al., 2003).

Although the likelihood of developing MS is influenced by different genetic and

environmental factors, the underlying mechanisms are poorly understood (Baranzini

et al., 2010). Based on epidemiological data, several infectious agents, including

human herpesvirus-6, Epstein-Barr virus, MS-associated retrovirus, canine distemper

virus and measles virus have been suggested to play a role in the pathogenesis,

however, so far, no direct causality has been established (Cepok et al., 2005; Sips et

al., 2007; Swanborg et al., 2003). The most popular theory linking autoimmunity to

MS is that a triggering infection by a virus induces molecular mimicry due to

antigenetic similarities between viral and host proteins (hit- and run-theory).

Subsequently, autoaggressive immune responses are extended to other CNS-

derived antigens by epitope spreading. Alternatively, immune mediated tissue

damage can result from viral persistence in which the host immune response is

directed against viral rather than self proteins due to the release of myelinotoxic

substances by activated microglia/macrophages (bystander demyelination) or

delayed type hypersensitivity, respectively (Lipton et al., 2007). MS is characterized

by focal to confluent demyelinating plaques in the white matter with axonopathy and

atrophy of the neuroparenchyma. Here, topographically variable susceptibilities to

injury or specific predilection sites, such as the optic nerves, brain stem and

cerebellum can be observed in different MS forms (Hu and Luchinetti, 2009).

Moreover, the periventricular region seems to be particularly vulnerable and often

affected by intense inflammation and myelin loss during the disease course (Adams

et al., 1987; Patrikios et al., 2006). In addition to white matter lesions, patients with

progressive MS exhibit inflammation and myelin damage also in the cerebral and

cerebellar cortical grey matter (Kutzelnigg et al., 2005 and 2007; Pirko et al., 2007

and 2009).

The experimental Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection of mice

is a widely used animal model for demyelinating disorders, such as MS. The agent is


a single-stranded RNA virus which belongs to the cardiovirus genus of the family

Picornaviridae. Two major subgroups of TMEV can be distinguished based on their

neurovirulence after intracerebral infection (Oleszak et al., 2004). Neurovirulent

strains, including the GDVII and FA strains, cause acute fatal encephalitis with

widespread neuronal death in the cerebrum (Aubert and Brahic, 1995). In

comparison, the BeAn and Daniels strains, also called Theiler´s original strains, are

characterized by low neurovirulence and the ability to induce long term CNS

inflammation. Usually, an initial infection of neurons and astrocytes in the

hippocampus, thalamus, hypothalamus and brain stem nuclei associated with an

acute polioencephalitis can be observed in mice after intracerebral infection by these

strains (Rodriguez et al., 1983; Simas and Fazakerly, 1996). The subsequent

disease course depends decisively upon the genetic background of the animals.

Thus, while the virus is eliminated from the brain in resistant C57BL/6 mice after the

initial phase, an inadequate antiviral immune response leads to viral persistence in

susceptible SJL mice (Chamorrow et al., 1988; Gerhauser et al., 2007a, 2007b,

Pavelko et al., 2000). Viral antigen-induced delayed-type hypersensitivity by

activated microglia/macrophages and myelin-specific autoimmunity induce

inflammatory demyelination predominantly in the spinal cord of susceptible mouse

strains, resembling the chronic progressive form of MS. Recently, up-regulation of

gene expression associated with intrathecal antibody production and antigen

presentation has been detected in the spinal cord of TMEV infected mice by

microarray analysis, supporting the view of a CNS-restricted immune response

during disease progression (Ulrich et al., 2010). Similarly, compartimentalized

inflammation within the brain trapped behind a closed blood brain barrier has been

suggested to contribute to prolonged lesion development and therapy failure in MS

patients (Hochmeister et al., 2006; Lassmann et al., 2007). In comparison, during the

early phase of Theiler´s murine encephalomyelitis (TME) immune responses can be

observed in the CNS-draining cervical lymph node, indicative of peripheral antiviral

immunity triggered by dendritic cells (McMahon et al., 2005; Navarrete-Talloni et al.

2010, in press). Since CNS-derived antigen presenting cells gain access to the

lymphatic system via the cerebrospinal fluid and are able to migrate from the


ventricular system to periventricular demyelinating foci in experimental autoimmune

encephalomyelitis (EAE) in rats (Hatterer et al., 2008), these studies have raised the

question of region-specific CNS lesion development and viral spread during the

initiation and progression of experimental TME.

Axonal transport is supposed to be the primary mode of virus transmission within the

CNS grey matter during the acute TME phase and possibly responsible for the

spread to the white matter (Rodriguez et al., 1983b; Tsunoda et al., 2003). In

addition, TMEV RNA has been detected also in the cerebrospinal fluid by reverse

transcriptase-polymerase chain reaction, demonstrating the possibility of additional

routes, such as a liquorogenic transport, to play a role for viral dissemination (Trottier

et al., 2002). Further, TMEV has been detected in forebrain subventricular zone in

experimentally infected mice during the acute disease phase (Goings et al., 2008).

However, ependymal infection and periventricular demyelination, as demonstrated in

other infectious demyelinating disorders, such as canine distemper leukoencephalitis

(Beineke et al., 2009) has not yet been described in this murine MS model.

The aim of the present study was to facilitate a detailed analysis of the spatial and

temporal distribution of TMEV in experimentally infected SJL/J mice in comparison to

C57BL/6 mice to detect region-specific susceptibilities to virus-induced CNS injury.

Special emphasis was given to test the hypothesis of the occurrence of

periventricular demyelination as observed in MS patients.


5.3 Materials and Methods

Experimental design Forty-eight, five-week-old female SJL/J HanHsd mice and 48 C57BL/6 mice (Harlan

Winkelmann, Borchen, Germany) were inoculated into the right cerebral hemisphere

with 1.63x106 plaque-forming units/mouse of the BeAn-strain of TMEV in 20µl

Dulbecco’s Modifid Eagle Medium (PAA Laboratories, Cölbe, Germany) with 2% fetal

calf serum and 50µg/kg gentamycin. The same number of control animals received

20µl of the vehicle only (sham-infected animals). Inoculation was carried out under

general anesthesia with medetomidine (0.5 mg/kg, Domitor, Pfizer, Karlsruhe,

Germany) and ketamine (100 mg/kg, Ketamine 10%, WDT eG, Garbsen, Germany).

All experiments were performed in groups of six TMEV and sham-infected mice,

euthanized one hour after intracerebral inoculation (0 days post infection [dpi]) as well

as 4, 7, 14, 28, 56, 98 and 196 dpi. For histology, immunohistochemistry and in situ-

hybridization, brain was removed immediately after death and transversely transected

within the cerebrum (bregma -2.18 mm) and the cerebellum with brain stem (bregma -

5.88 mm). Subsequently, tissues were fixed in 10% formalin for 24 hours and

embedded in paraffin wax. In addition, thoracic spinal cord segments encased in

vertebral bodies were formalin fixed, decalcified in 25%

dinatriumethylenediaminetetraacetic solution (EDTA) for 48 hours and subsequently

embedded in paraffin wax (Ulrich et al., 2006). In addition, brain and spinal cord

tissue was immediately snap frozen for immunofluorescence double labeling and

stored at -80°C until use.

In order to detect possible systemic viral spread, samples of the gastrointestinal tract,

liver, pancreas, respiratory tract (lung, trachea, and nasal cavity), urogenital tract

(kidney, urinary bladder, uterus, and ovary), cardiovascular system (heart and aorta),

lymphoid organs (spleen and thymus as well as cervical, axillary, brachial,

mediastinal, mesenteric, renal, pancreatic, lumbar, sacral, popliteal, and inguinal

lymph nodes) and peripheral nerves (brachial and sciatic nerves) were fixed in 10%

formalin and embedded in paraffin.


The animal experiments were approved and authorized by the local authorities

(Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz- und Lebensmittelsicherheit

(LAVES), Oldenburg, Germany, permission numbers: 509c-42502-02/589, 509.6-

42502-04/860 and 33-42502-05/963)

Histological examination of brain and spinal cord Transversal sections of formalin fixed, paraffin embedded cerebrum, cerebellum,

brain stem and spinal cord were stained with hematoxylin and eosin (HE).

Inflammatory responses within the CNS were graded based upon the degree of

perivascular lymphohistiocytic infiltrates (PVI) using a semiquantitative scoring

system: 0 = no changes, 1 = scattered perivascular infiltrates, 2 = 2 to 3 layers of

perivascular inflammatory cells, 3 = more than 3 layers of perivascular inflammatory

cells, as described previously (Gerhauser et al., 2007a). The gliosis within affected

CNS areas was graded semiquantitatively as follows: + = 1-25 cells; ++ = 26-50 cells;

+++ = > 50 cells.

For the evaluation of myelin loss, serial sections of the brain and spinal cord were

stained with Luxol fast blue-cresyl violet and the degree of demyelination was

semiquantitatively evaluated as follows: 0 = no change, 1 = 25%, 2 = 25-50% and

3 = 50-100% of the white matter affected (Gerhauser et al., 2007a).

Virus detection Virus dissemination during early (0, 4, 7 and 14 dpi) and late time points (28, 56, 98

and 196 dpi) was investigated by immunohistochemistry and in situ-hybridization in

brain and spinal cord as well as in extraneural tissues.

Immunohistochemistry was performed using a polyclonal rabbit anti-TMEV capsid

protein VP1-specific antibody, as described before (Kummerfeld et al., 2009). Briefly,

for blocking of the endogenous peroxidase, formalin fixed, paraffin embedded tissue

sections were treated with 0.5% H2O2 diluted in methanol for 30 min at room

temperature (RT). Subsequently, slides were incubated with the primary antibody at a

dilution of 1:2000 for 16 hours at 4°C. Goat-anti-rabbit IgG diluted 1:200 (BA9200,

H+L, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) was used as a secondary antibody


for one hour at RT. Sections used as negative controls were incubated with rabbit

normal serum at a dilution of 1:2000 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen,

Germany). Slides were subsequently incubated with the peroxidase-conjugated avidin-

biotin complex (ABC method, PK-6000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) for

30 min at RT. After the positive antigen-antibody reaction visualization by incubation

with 3.3-diaminobenzidine-tetrachloride (DAB) in 0.1M imidazole, sections were

counterstained with Mayer’s hematoxylin.

In situ-hybridization was performed as described before (Gröters et al., 2005; Ulrich et

al., 2006). For the detection of TMEV specific RNA, a polymerase chain reaction

product homologous to the base pair 193 to 322 of the nucleotide sequence for BeAn

8386 strain (Pevear et al., 1987) was generated from a TMEV infected baby hamster

kidney cell culture by reverse transcriptase-polymerase chain reaction using the

sense primer 5`GACTAATCAGAGGAACGTCAGC and the anti-sense-primer

5`GTGAAGAGCGGCAAGTGAGA. The obtained PCR product was cloned in the

PCR 4-TOPO plasmid vector and amplified in DH5α-T1® cells (TOPO TA Cloning Kit

for sequencing; Invitrogen, Karlsruhe, Germany). The plasmid was sequenced

(SEQLAB, Göttingen, Germany) and the sequence is accessible under the GenBank

(accession number: AY618571). In vitro transcription was carried out according to

manufacturer’s instructions with DIG-RNA-labeling Mix and T3- and

T7-RNA-polymerases (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Tissue sections

were dewaxed in xylene, hydrated in graded ethanol, and washed in ultrapure,

pyrogen-free, diethylpyrocarbonate-treated water (DEPC; Sigma-Aldrich Chemie,

Taufkirchen, Germany; 0.1% in ultrapure, pyrogen-free water). After proteolyses (5

µg/ml proteinase K, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), acetylation and pre-

hybridization, hybridization was performed overnight in a moist chamber at 52°C with

a probe concentration of 200 ng/ml. The detection system consisted of an anti-DIG-

antibody conjugated with alkaline phosphatase (1:200, Roche Diagnostics,

Mannheim, Germany) and the substrates nitroblue tetrazoluimchloride (NBT) (both

Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate (BCIP, X-Phosphate) (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany),

which yielded a bluish precipitate.


The absolute numbers of TMEV-infected cells labeled by immunohistochemistry and

in situ-hybridization, respectively, were counted in different regions of the CNS.

Immunofluorescence double labeling and confocal laser scanning microscopy The phenotypes of infected cells within the CNS white matter were determined by

immunofluorescence double labeling on representative slides of the brain and spinal

cord at 4, 28, 56 and 98 dpi.

Astrocytes were detected by the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP),

while oligodendocytes and microglia/macrophages were labeled with CNPase- and

F4/80-specific antibodies, respectively. Methanol-fixed frozen sections of pre-elected

tissues were rinsed in 0.1% Triton X-100 in PBS for 30 min. Non-specific binding was

blocked with 20% goat serum diluted in PBS/0.1% Triton X-100/1% BSA (bovine

serum albumin) for 30 min, before incubation with the primary polyclonal antibody

against TMEV at 4 °C overnight (polyclonal anti-TMEV BeAn VP1 antibody, diluted

1:2000; Kummerfeld et al., 2009). After washing with 0.1 % Triton X-100 in

PBS, incubation with a Cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (H+L, diluted

1:200, Jackson Immuno Research Europe, Newmarket, UK) was performed for 1h at

room temperature. After additional washing steps, sections were incubated with the

second antibody (GFAP, monoclonal mouse anti-pig IgG1, diluted 1:1600, Sigma-

Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany; CNPase, monoclonal mouse anti-human

IgG1, diluted 1:100 Millipore GmbH, Schwalbach/Ts., Germany; F4/80, monoclonal

rat anti-mouse, MCA497, diluted 1:200, Serotec Product, Düsseldorf, Germany) for

2h at room temperature, respectively. GFAP and CNPase were labeled with Alexa

Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG1 Fab fragments at a molar ratio according to

the manufracturer`s instructions (Zenon Mouse IgG labeling Kit, Invitrogen,

Karlsruhe, Germany). The second antibody for microglia/macrophages was a Cy2-

conjugated AffiniPure F(ab`)2 Fragment Goat Anti-Rat antibody (Fragment specific,

diluted 1:200, Jackson ImmunoResearch Europe, Newmarket, UK) and incubated for

one hour. Adjacent further washing steps, sections were post-fixed in 4%

formaldehyde, cell nuclei were counterstained using 1.0 % bisbenzimide and

mounted with fluorescent mounting medium (Dako Diagnostika, Hamburg, Germany).


Controls were incubated with rabbit preimmune serum and/or a mouse or rat IgG1

anti-isotype antibody (Millipore GmbH, Schwalbach/Ts., Germany) instead of primary

antibodies. Expression of cell type specific markers was studied by a Leica TCS SP5

laser confocal microscope (Leica, Wetzlar, Europe) equipped with a 63-fold water

immersion objective as described (Kummerfeld et al., 2009; Kreutzer et al., 2007).

For excitation of Cy2-conjugated secondary antibody and Alexa Fluor 488, a 488 nm

Argon laser was used. For excitation of Cy3, a 546 nm Helium-Neon laser, and for

bisbenzimide, a 405 nm diode pumped solid-state laser was used. Full-frame images

were taken with water immersion objective (63x/1.20 HCX PL-APO CS, Leica,

Wetzlar, Germany), with an interval of 0.5 µm and a flattened z-stack image of the

confocal images (512 x 512 pixels) was generated. Each laser line was scanned

separately for individual excitation of the dyes, and data sets were finally merged and

analyzed employing the Leica application suite advanced fluorescence (LAS AF)

(Leica, Wetzlar, Germany). The different cell types were identified according to their

morphological characteristics and antigen expression (Ulrich et al., 2008).

Quantification of CD107b+ microglia/macrophages by immunohistochemistry For detection of activated microglia/macrophages immunohistochemistry was

performed on formalin fixed and paraffin embedded brain and spinal cord tissue

slides as described (Ulrich et al., 2010). A biotinylated CD107b-specific antibody

(monoclonal rat anti-mouse, clone M3/84, diluted 1:200; AbD Serotec., Oxford, UK)

was used as primary antibody. Sections used as negative controls were incubated

with IgG1 at a dilution of 1:200 (clone 43414, R&D Systems, Minneapolis, MN).

Finally, immunolabeling was visualized by the avidin biotin peroxidase-complex

method (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) with DAB as substrate. Slight

counterstaining was performed with Mayer’s hematoxylin. The numbers of

immunoreactive cells per square unit were counted in different CNS regions using an

ocular morphometric grid. Values represent the number of cells per mm2.


Statistical analysis Statistical analysis was performed using SPSS for Windows (version 17.0, SPSS

Inc., Chicago, USA) and Statistical Analysis System (SAS; version 9.1, SAS Institute,

Cary, NC, USA). A Mann-Whitney-U-Test was performed to determine statistical

differences of the number of CD107b+ cells in TMEV infected SJL/J and C57BL/6

mice using SPSS. For analysis of log-transformed data of the TMEV specific

immunohistochemistry to determine statistical differences between SJL/J and

C57BL/6 mice a Wilcoxon`s two-sample test using SAS was performed. For analysis

of correlation between the number of TMEV infected cells detected by

immunohistochemistry and in situ-hybridization a Spearman`s rank correlation

coefficient (rs) was applied using SPSS. In general, the level of statistical significance

was designated at p ≤ 0.05.

Illustations Immunohistochemical images were obtained with Olympus BX-51 digital

microscope (Olympus Optical Co. (Europe) GmbH, Hamburg) and stored as tagged

image file format (tiff) files using Cell_D images software (Olympus Soft imaging

Solutions GmbH, Münster). Adobe® Photoshop® 7.0 (Adobe Systems, Inc., San

Jose, CA) was used to prepare the figures and insets, with adjustment of contrast,

brightness and sharpness if necessary.


5.4 Results Viral detection in SJL/J and C57BL/6 mice The number of infected cells was determined in different CNS regions by

immunohistochemitry and in situ-hybridization. Virus was present at the entire apical

border of the ependyma of the third and lateral ventricles of investigated infected

SJL/J and C57BL/6 mice at one hour post infection (0 dpi; Figure 5-1).

At 4 dpi virus protein was present in individual ependymal cells as well as within the

periventricular area and corpus callosum of infected SJL/J and C57BL/6 mice as

determined by immunohistochemistry (Figure 5-1, 5-2). The number of TMEV

infected cells in the periventricular region was significantly higher in SJL/J as

compared to C57BL/6 mice at this time point (p=0.05; Figure 5-2, 5-3). While in the

periventricular region infected cells were only present in C57BL/6 mice at 7 dpi,

labeled cells were observed in the corpus callosum only in SJL/J mice at this time

(Figure 5-3). The phenotypes of infected cells in these regions of the forebrain white

matter were determined by immunofluorescence double labeling (see below).

Infected cells were also found in the cortex, hippocampus and

thalamus/hypothalamus at 4 and 7 dpi in both mouse strains (Figure 5-3). Here, viral

protein was located predominately in cell somata and dendrites of neurons as well as

in axons (Figure 5-1). While equal numbers of TMEV infected cells were present in

the cortex of both mouse strains at 4 dpi, a significant reduction of the virus load was

observed in C57BL/6 mice at 7 dpi (p=0.008; Figure 5-2). At 14 dpi immunolabeled

cells were only found in the hippocampus of infected animals, while at later time

points no TMEV infected cells were present in the forebrain (Figure 5-2).

Virus infected ependymal cells of the fourth ventricle were found at 4 dpi in SJL/J and

C57BL/6 mice by immunohistochemistry (Figure 5-4). In the periventricular region

virus was present at 4 and 7 dpi in both mouse strains, while at 14, 28 and 56 dpi

TMEV was only detected in SJL/J mice in this region (28 dpi: p=0.004; Figure 5-4,

5.5). Virus antigen was detected in the brain stem white and grey matter at 28 dpi in

both mouse strains (Figure 5-5). However, at subsequent days TMEV was only

present in SJL/J mice in these regions (Figure 5-4, 5-5). In the thoracic spinal cord


TMEV antigen was found at 14, 28, 56 and 98 dpi only in SJL/J mice (Figure 5-4).

The phenotypes of infected cells in white matter regions of the periventricular area,

brain stem and spinal cord were determined by immunofluorescence double labeling

(see below).

In general, TMEV antigen was colocalized with viral RNA in all investigated CNS

regions. Spearman´s rank correlation between the number of infected cells detected

by immunohistochemistry and in situ-hybridization revealed a significant correlation in

the forebrain for SJL/J mice (p< 0.0001, rs=0.903) and C57BL/6 mice (p< 0.0001,

rs=0.878), in the brain stem and around the fourth ventricle for SJL/J mice (p<

0.0001, rs=0.754) and C57BL/6 mice (p< 0.0001, rs=0.727) as well as in the spinal

cord for SJL/J mice (p< 0.0001, rs=0.757).

No TMEV antigen or RNA was found in extraneural organs including the

gastrointestinal tract, liver, pancreas, respiratory tract, urogenital tract, cardiovascular

system, lymphoid organs and peripheral nerves in both infected mouse strains at any

investigated time point. As expected, no virus was present in the CNS or extraneural

organs of sham-infected control animals.


Figure 5-1: Immunohistochemical detection of Theiler´s murine encephalomyelitis virus

(TMEV) in the brain of SJL/J mice. (A) TMEV antigen at the apical border of the ependyma

(EP) of the lateral ventricle (V) at one hour post infection. (B) TMEV infected cells of the

ependyma (EP) of the lateral ventricle (V) at 4 days post infection (dpi). (C) TMEV infected

cells in the periventricular area (PV) at 4 dpi. (D) Detection of TMEV antigen in cell somata

and dendrites of neurons (arrowhead) and axons (arrow) in the hippocampus at 4 dpi. (E)

TMEV specific labeling of cells in the brain stem grey matter (vestibular nucleus) at 28 dpi.

(F) TMEV antigen in the brain stem white matter (inferior peduncle) at 28 dpi. Avidin biotin

peroxidase-method, slightly counterstained with Mayer`s haemalaun. Scale bars = 20 µm.


Figure 5-2: Quantification of infected cells in different regions of the forebrain of SJL/J and

C57BL/6 mice following experimental Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV)

infection. Number of infected cells in the (A) ependyma of the third and lateral ventricles, (B)

periventricular area of the forebrain ventricular system, (C) corpus callosum, (D) cortex, (E)

hippocampus, and (F) thalamus/hypothalamus. Box and whisker plots display median and

quartiles with maximum and minimum values. Significant differences (p ≤ 0.05) between both

mouse strains are labeled with a star.


Figure 5-3: Schematic illustration of the distribution of Theiler´s murine encephalomyelitis

virus (green labeled areas) in the forebrain of SJL/J (A and B) and C57BL/6 mice (C and D)

during the acute infection phase. At 4 days post infection the virus is distributed in around the

ventricles, cortex and hippocampus as well as in thalamus and hypothalamus of both mouse

strains (A and C). Note also infected cells in the corpus callosum of SJL/J mice at this time

(A). In comparison virus is cleared from the periventricular area in SJL/J mice at 7 dpi (B). co:

cortex, cc: corpus callosum, 3v: third ventricle, lv: lateral ventricle, hi: hippocampus, th/hy:

thalamus and hypothalamus. Coronal section of the forebrain (bregma: -2.18 mm).

Hematoxylin and eosin staining. Slides are composed with mirax slide scanner (Carl Zeiss

AG, Oberkochen, Germany).


Figure 5-4: Quantification of infected cells in different regions of the brain stem, including the

periventricular region of the fourth ventricle, and spinal cord of SJL/J and C57BL/6 mice

following experimental Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection. Number of

infected cells in the (A) ependyma of the fourth ventricle, (B) periventricular area of the fourth

ventricle, (C) brain stem white matter, (D) brain stem grey matter and (E) spinal cord white

matter. Box and whisker plots display median and quartiles with maximum and minimum

values. Significant differences (p ≤ 0.05) between both mouse strains are labeled with a star.


Figure 5-5: Schematic illustration of the distribution of Theiler´s murine encephalomyelitis

virus (green labeled areas) in the brain stem, including the periventricular region of SJL/J

mice during the chronic infection phase. (A) At 28 dpi virus is located predominately around

the fourth ventricle as well as in white matter tracts and grey matter. (B) At 56 dpi the

majority of the virus is present in the brain stem white and grey matter, while only few

infected cells can be found in the periventricular region. ce: cerebellum, 4v: fourth ventricle,

wm: brain stem white matter, gm: brain stem grey matter. Coronal section of the brain stem

and cerebellum (bregma: -5.88). Hematoxylin and eosin staining. Slides are composed with

mirax slide scanner (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).


Immunofluorescence double labeling and confocal laser scanning microscopy Confocal laser scanning microscopy was performed on double stained CNS frozen

sections to determine the phenotypes of TMEV infected cells in the white matter of

both mouse strains (Figure 6). At 4 dpi the majority of TMEV infected cells were

identified astrocytes based on GFAP-expression in both mouse strains (SJL/J mice:

75%; C57BL/6 mice: 68%), located predominantly in the periventricular region.

Approximately 10% of infected cells represented CNPase+ oligodendrocytes and

15% F4/80+ microglia/macrophages in SJL/J mice at this time. In C57BL/6 22% of

infected cells express CNPase and 10% were F4/80+ microglia/macrophages at 4 dpi

in the white matter of the brain. At 28 dpi approximately 52% of infected cells were

identified as microglia/macrophages (F4/80) and 48% as oligodendrocytes (CNPase)

around the fourth ventricle in SJL/J mice, while infected astrocytes were not detected

in this brain region. In C57BL/6 mice 60% of infected cells represented

macrophages/microglia (F4/80), while no oligodendrocytes or astrocytes were found

in this region at 28 dpi in this mouse strain. At 56 dpi approximately 50% of TMEV

infected cells were identified as oligodendrocytes (CNPase) and

microglia/macrophages (F4/80), respectively. At 98 dpi 70% of infected cells express

the oligodendrocyte marker CNPase and 30% the microglia/macrophage marker

F4/80 in brain stem white matter lesions of SJL/J mice. In the spinal cord white

matter were 40% of infected cells represented CNPase-expressing oligodendrocytes

and 60% represented F4/80-expressing microglia/macrophages in susceptible SJL/J

mice. No infected astrocytes were noted in the chronic TME phase (>28 dpi) in the

brain and spinal cord of both mouse strains.


Figure 5-6: Phenotyping of Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infected cells in

the white matter by immunofluorescence double staining. Left column: Determination of cell

phenotype using a glial fibrillary acidic protein (GFAP)-specific antibody as a marker for

astrocytes (top row), F4/80-specific antibody as a marker for microglia/macrophages (middle

row) and a CNPase-specific marker for the detection of oligodendrocytes (bottom row).

Middle column: Detection of TMEV antigen. Right column: colocalization of cell type specific

molecules and TMEV antigen (merged images). Double stained cells exhibit a yellow color

(arrows). Top row: TMEV infected GFAP+ astrocytes in the forebrain periventricular area at 4

days post infection (dpi).


Middle row: TMEV infected F4/80+ microglia/macrophages in the brain stem at 28 dpi.

Bottom row: TMEV infected CNPase+ oligodendrocytes in the brain stem at 28 dpi.

Immunofluorescence was performed using antibodies labeled with Alexa Fluor 488-

conjugated Fab fragments for the detection of GFAP and CNPase (green), Cy2-coupled

secondary antibody for the detection of F4/80 (green) and Cy3-coupled secondary antibody

for the detection of TMEV (red). Nuclei were stained with bisbenzimide (blue). Confocal laser

scanning microscopy. Scale bars = 3 µm.

Histological findings in the central nervous system of SJL/J and C57BL/6 mice Gliosis and/or perivascular lymphohistiocytic infiltrates were first observed in the

forebrain of both infected mouse strains. Here, inflammatory responses were most

intense in the thalamus and hypothalamus, usually associated with the injection site

as well as around the third and lateral ventricles at 4 dpi. Hippocampal and cortical

inflammation was prominent at 7 and 14 dpi, followed by a decline with no or only

minimal changes at later time points. In comparison, inflammatory responses were

detected in the corpus callosum also at later time points (Table 2-1).

Similar to the forebrain ventricular system, gliosis was observed around the fourth

ventricle as early as 4 dpi in both investigated mouse strains following TMEV

infection. Periventricular inflammation was most intense from 7 to 56 dpi in SJL/J

mice and from 7 to 14 dpi in C57BL/6 mice. While inflammation dissolved in C57BL/6

mice, inflammatory responses persisted adjacent to the fourth ventricle in SJL/J

mice. Increasing gliosis and perivascular infiltrates were observed primarily in the

brain stem and spinal cord of TMEV infected SJL/J mice (Figure 5-7). In comparison,

inflammation was minimal or absent in the respective CNS regions of C57BL/6 mice

(Table 5-1).

Besides minimal gliosis at the injection site in the thalamus and hypothalamus at 4

dpi in individual animals, no inflammatory responses have been observed in sham-

infected SJL/J and C57BL/6 mice.


Quantification of demyelination Using LFB-staining, demyelination was only observed in TMEV infected SJL/J mice

in the periventricular region of the fourth ventricle, brain stem and spinal cord. No

myelin loss was present in infected C57BL/6 and sham-infected controls.

Demyelination was prominent around the fourth ventricle in SJL/J mice at 28 (Figure

5-7) and 56 dpi, followed by a decline at later time points (Figure 5-8). In comparison,

myelin loss increased in the brain stem white matter (Figure 5-8), affecting primarily

the spinal trigeminal tract, inferior peduncle and the vestibulocochlear nerve. While

no myelin damage was present in the periventricular region at 196 dpi, myelin

alterations persisted in the brain stem white matter till the end of the study period

(Figure 5-8). Similar to the brain stem white matter demyelination was found in the

spinal cord of SJL/J mice from 28 to 196 dpi (Figure 5-8). Here, myelin loss was

located predominantly in the funiculus ventralis and funiculus lateralis of the spinal

cord white matter.

No alterations of myelin integrity were detected in the forebrain grey and white

matter, including the corpus callosum of infected SJL/J or C57BL/6 mice.

Figure 5-7: Inflammatory demyelination in Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV)

infected SJL/J mice. (A) Demyelinating lesion in the brain stem white matter with perivascular

lymphohistiocytic infiltrations (arrows) and gliosis (arrowheads) at 28 days post infection

(dpi), hematoxylin and eosin staining. (B) Myelin loss around the fourth ventricle in a TMEV

infected SJL/J mice at 28 dpi (PV: periventricular area; EP: ependymal cells), Luxol fast blue-

cresyl violet staining. scale bars: 50µm.


Figure 5-8: Semiquantitative assessment of demyelination in the periventricular area of the

fourth ventricle, brain stem white matter and spinal cord white matter of SJL/J mice with

experimental Theiler´s murine encephalomyelitis. Box and whisker plots display median

and quartiles with maximum and minimum values.

Tabl

e 6-

1: S

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itativ

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PVI

0.

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0

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and

glio

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resp

ectiv

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Quantification of CD107b+ microglia/macrophages by immunohistochemistry In order to determine the role of virus-induced microglia/macrophage activation in the

pathogenesis of myelin injury in different regions of the CNS the numbers of

CD107b+ cells have been quantified. Results of immunohistochemical investigation

are given in figure 5-9.

CD107b+ microglia/macrophages were observed in the cortex and

thalamus/hypothalamus as well as around the ventricles at 7 dpi. Significantly more

CD107b+ cells were found in TMEV infected SJL/J mice as compared to C57BL/6

mice in the corpus callosum at 7, 14 and 28 dpi (p≤ 0.01) and in the hippocampus at

7 and 14 dpi (p≤ 0.01). In contrast, a significantly elevated number of labeled

microglia/macrophages were present in C57BL/6 mice at 14 dpi in thalamic and

hypothalamic regions (p≤ 0.05). Subsequently, at 56 and 98 dpi, infected SJL/J mice

show significantly increased numbers of CD107b+ microglia/macrophages in the

periventricular area of the fourth ventricle and grey matter of the brain stem (56 dpi:

p≤0.05; 98 dpi: p≤0.001), while no labeled cells were detected in infected C57BL/6

mice. In addition, a prominent accumulation of CD107b+ microglia/macrophages was

found in the brain stem white matter of SJL/J mice till the end of the study period

(p≤0.05). In general, demyelination around the fourth ventricle as well as of the brain

stem and spinal cord white matter was associated with an accumulation of CD107b+

microglia/macrophages which exhibited gitter cell morphology, indicative of

myelinophagia (Figure 5-10). No or only few labeled cells were observed in the CNS

of control SJL/J or C57BL/6 mice.


Figure 5-9: Quantification of CD107b+ microglia/macrophages in different regions of the

central nervous system of Theiler´s murine encephalomyelitis infected SJL/J and C57BL/6

mice. Number of accumulated cells in the (A) cortex, (B) corpus callosum, (C) periventricular

area of third and lateral ventricles, (D) hippocampus, (E) thalamus/hypothalamus, (F)

periventricular area of the fourth ventricle, (G) brain stem white matter, (H) brain stem grey

matter and (I) spinal cord white matter. Box and whisker plots display median and quartiles

with maximum and minimum values. Significant differences (p ≤ 0.05) between both mouse

strains are labeled with a star.


Figure 5-10: Accumulation of CD107b+ microglia/macrophages in a demyelinating lesion of

the brain stem white matter at 98 days post infection in a Theiler´s murine encephalomyelitis

virus infected SJL/J mice. Note vacuolated cytoplasm of immunolabeled cells, characteristic

of gitter cell formation and myelinophagia. Avidin biotin peroxidase-method, slightly

counterstained with Mayer`s haemalaun. Scale bar = 10 µm.


5.5 Discussion

Results of the spatiotemporal analysis demonstrate the occurrence of region-specific

susceptibilities to myelin damage in different CNS regions in SJL/J mice. For the first

time ependymal infection and virus-induced periventricular demyelination are shown,

representing a so far not described feature of this murine MS model.

Virus infection of neuronal somata, dendrites and axons in the cortex, hippocampus

and CNS nuclei are indicative of an axonal transport and transsynaptic neuron-to-

neuron transmission within the brain during the acute disease phase, as described

previously (Simas and Fazakerley, 1996; Wada and Fujinami, 1993). While the virus

is eliminated from the brain of C57BL/6 mice, ineffective antiviral immune responses

might represent a prerequisite for the observed viral persistence and demyelination

around the fourth ventricle, brain stem and spinal cord of SJL/J mice. However,

although C57/BL6 mice are able to mount a protective antiviral immunity, neuronal

cell damage and seizures has been demonstrated following infection with the TMEV

Daniels strain. Therefore, experimental infection of C57BL/6 mice with this virus

strain has become a novel animal model for inflammation-induced epilepsy

(Kirkmann et al., 2010; Libbey et al., 2008).

Independently of the mouse strain, an initial infection of ependymal cell in cerebrum,

cerebellum and brain stem has been detected during the early infection phase in the

present study. Previous reports hypothesized a liquorogenic spread, but virus

infection of the ependyma has not been detected before (Ha-Lee et al., 1995; Simas

and Fazakerley, 1996; Stohlmann and Hinton, 2001; Trottier et al., 2001).

Accordingly, observed infection of periventricular cells might represent a sequel of

transependymal viral spread. Here, as demonstrated by immunofluorescence double

labeling, infection of the periventricular region is dominated by an infection of

astrocytes. While the virus is cleared from forebrain periventricular region in both

mouse strains and around the fourth ventricle of C57BL/6 mice, a dominating

infection of microglia/macrophages and oligodendrocytes has been observed during

the chronic demyelinating phase in SJL/J mice. The switch of cell tropism is required

for the induction of myelin loss in susceptible mice (Clatch et al., 1990; Lipton et al.,


1995; Lipton et al., 2005; Schlitt et al., 2003; Zoecklein et al., 2003). Similar to the

present findings, TMEV has been detected previously in macrophages/microglia

during the persistent phase in SJL/J mice infected with the BeAn (Dal Canto and

Lipton, 1982; Lipton et al., 1995) and Daniels strain (Rossi et al., 1997). However, in

contrast to other investigators viral persistence in astrocytes (Zheng et al., 2001) has

not been found during the chronic infection phase. The present study revealed the

occurrence of viral persistence of the BeAn-strain in the brain stem of SJL/J mice

during the chronic disease phase within microglia/macrophages and

oligodendrocytes as observed by others (Zoecklein et al., 2003). In the chronic

phase, viral dissemination within the spinal cord is based upon continuous viral

replication within glial cells and infection of microglia/macrophages by phagocytosis

of infectious material released from apoptotic cells (Lipton et al., 2005; Trottier et al.,

2001). Similar mechanisms of viral persistence and spread in the brain stem white

matter can be postulated for infected SJL/J mice but have to be confirmed in future

studies.

Since the cerebrospinal fluid and CNS interstitial fluid drains to regional lymph nodes

(Kida et al., 1993), various extraneural tissues have been tested for the presence of

virus by immunohistochemistry and in situ-hybridization to exclude systemic infection.

Besides the mouse genetic background and virulence of the agent, viral spread and

cell tropism is influenced by the host immune response and age. For example,

stress-induced immunosuppression leads to disease exacerbation and systemic viral

spread in TMEV infected animals (Mi et al., 2006; Welsh et al., 2010; Young et al.,

2010). Similarly, congenital immunodeficiency (e.g. in nude mice and severe

combined immunodeficient [SCID] mice) leads to accelerated TMEV dissemination in

experimentally infected animals due to the lack of virus-specific immune responses

(Drescher and Tracy, 2007; Gomez et al., 1996; Love, 1987; Wada and Fujinami,

1993, Zurbriggen and Fujinami, 1988). Accordingly, the present extensive analysis of

several lymphoid organs and other extraneural tissues is indicative of a CNS-

restricted infection of immunocompetent mice as demonstrated by others (Sethi et

al., 1983; Trottier et al., 2002).


Periventricular lesions have been recognized as characteristic and frequent findings

in MS patients. Here, the most commonly affected site is around the lateral ventricles

of the forebrain, followed by the neuroparenchyma around the fourth ventricle, third

ventricle and aqueduct (Adams et al., 1987). Although virus and inflammation is

observed in the forebrain periventricular region during the acute disease phase in

both infected mouse strains, demyelination was only observed adjacent to the fourth

ventricle in TMEV infected SJL/J mice in the present study. In contrast to prolonged

myelin damage in the brain stem and spinal cord white matter, periventricular

demyelination in SJL/J mice represents a transient process with termination of

inflammation and subsequent tissue recovery. Proposed causes for this phenomenon

include an efficient antiviral immune response which clears the virus from the

periventricular area and/or a more effective regenerative capacity of this CNS region

as compared to the brain stem and spinal cord in mice. In accordance with this,

recent studies showed that T-cell mediated immunity leads to viral elimination from

the ependyma but not from the brain parenchyma in experimental attenuated

lymphocytic choriomeningitis virus infection of mice (Pinschewer et al., 2010). In

addition, remyelination has been observed in the rat brain stem after chemically

induced demyelination by intraventricular ethidium bromide injection (Levine and

Reynolds, 1999). Similar to MS, limited remyelination due to dysfunctional

oligodendrocyte precursor cells has been described in the murine spinal cord

following TMEV infection (Ulrich et al., 2008). Additionally, maturation and

differentiation of an oligodendrocyte precursor cell line has been shown to be

impaired by TMEV in vitro (Pringproa et al., 2010). Currently, CD45+ hematopoietic

cell accumulation and associated neuroblast emigration has been described in the

forebrain subventricular zone of TMEV infected mice during the acute disease phase

(Goings et al., 2008). The importance of the periventricular region in the

pathogenesis of myelin loss disorders has been stressed by the demonstration of

glial progenitor cell activation in the subventricular zone of MS patients (Nait-

Oumesmar et al., 2007). Similarly, activation of subventricular derived neural

progenitor has been described in autoimmune MS models, such as murine EAE,

indicating a potential therapeutic target of this brain region to stimulate endogenous


myelin regeneration in demyelinating inflammatory diseases (Picard-Riera et al.,

2002). Remyelination is frequently observed in early MS lesions and influenced by

the anatomical localization. Though, in contrast to the present findings the

periventicular region is regarded as a compartment of limited regenerative capacities

in affected humans (Goldschmidt et al., 2009). Usually, clinical magnet resonance

imaging of the “Dawson´s fingers” demonstrates lesions extending from the lateral

ventricle to surrounding lesions, suggesting that the periventricular regions are

particularly sensitive to MS (Barkhof and Scheltens, 2002; Boster et al., 2009).

Nevertheless, remyelination is influenced by a variety of factors which have to be

taken into account in clinical trials to promote CNS regeneration (Patrikios et al.,

2006). So far, transplantation of oligodendrocyte precursor cells and remyelination

strategies have been investigated predominately in chemically induced demyelination

models (Einstein et al., 2009). Therefore, the investigation of dynamical changes of

myelin integrity within the periventricular region of TMEV infected SJL/J mice offers a

new opportunity to study endogenous myelin repair mechanisms in future studies.

The observed periventricular accumulation of CD107b+ macrophages/microglia in the

present study is supposed to perpetuate the infection of SJL/J mice and possibly

accelerates bystander demyelination and delayed type hypersensitivity. Similarly,

CD107b+ cell accumulations were associated with myelin loss in the brain stem and

spinal cord white matter of the susceptible mouse strain. Interestingly, CD107b+

macrophages/microglia within the forebrain white matter, especially the prolonged

presence of this cell type within the corpus callosum did not induce demyelination.

Thus, virus infection of the white matter and subsequent microglial activation per se

does not induce myelin damage in this MS model. Topographical differences of the

CNS microenvironment or functionality of glial cells might be responsible for the

observed variable sensitivities to injury of the white matter in SJL/J mice. For

example, a reduced myelin degrading proteolytic activity of microglia and

macrophages might explain the lack of demyelination as described in C57BL/6 mice

(Liuzzi et al., 1995). The absence of myelin loss within the corpus callosum, which is

particularly susceptible to cuprizone-induced myelin damage, indicates differing

myelin damaging processes between viral and toxic demyelination models (Lindner


et al., 2008; Tayler et al., 2009). However, in analogy to the concept of region-

specific lesion development in TME and human MS, recent studies have

demonstrated topographical differences of de- and remyelination within the brain of

cuprizone fed mice, which might be attributed to unequal densities or functions of

microglia, astrocytes and oligodendocyte progenitor cell in the respective CNS areas

(Gudi et al., 2009; Skripuletz et al., 2008, Skripuletz et al., 2010).

Summarized, the demonstration of ependymal infection and subjacent spread into

the brain parenchyma as well as regional virus clearance despite ongoing

demyelination in other CNS compartment allows new insights into TME

pathogenesis. This novel aspect of virus CNS interaction will enhance our

understanding of region-specific susceptibilities to injury and regenerative capacities

of the brain in this infectious MS model.

5.6 Acknowledgments The authors wish to thank Danuta Waschke and Julia Schirrmeier for their excellent

technical assistance. This study was supported by the Deutsche

Forschungsgemeinschaft (DFG, BE 4200/1-1).


5.7 References Adams, C.W., Y.H. Abdulla, E.M. Torres and R.N. Poston. 1987. Periventricular

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72 Diskussion

6 Diskussion Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Darstellung des TMEV im ZNS und

im peripheren Gewebe von SJL/J- und C57BL/6-Mäusen nach experimenteller

intrazerebraler Infektion. Im ersten Teil dieser Studie wurde ein polyklonaler

Antikörper gegen das virale Kapselprotein 1 (VP1) des schwach virulenten BeAn-

Virus im Kaninchen hergestellt. Der Antikörper wurde mittels Western Blot und

Massenspektrometrie auf seine Spezifität geprüft. Im Weiteren wurde die Applikation

des Antikörpers zum Nachweis von viralem Antigen in TMEV-infizierten Zellkulturen

mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Lasermikroskopie getestet. Zusätzlich war

es möglich mit diesem Marker sowohl parakristallin angeordnete als auch dissoziierte

intrazytoplasmatische Viruspartikel in infizierten BHK21-Zellen mittels

Elektronenmikroskopie zu visualisieren. Als Grundlage für den zweiten Teil der Arbeit

konnte außerdem eine spezifische Reaktivität des hergestellten Antikörpers in

Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Geweben von infizierten Mäusen

mittels Immunhistologie nachgewiesen werden.

Dieser Antikörper diente im zweiten Teil der Studie der genauen Beschreibung der

Ausbreitung und des Zelltropismus des TMEV-BeAn-Virus im Verlauf der

experimentellen TMEV-Infektion. Da sich bisherige Untersuchungen vorwiegend mit

den pathologischen Prozessen im Rückenmark bei der experimentellen TME

beschäftigten, wurde in der vorliegenden Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die

Virusausbreitung und assoziierte Entmarkungen während der akuten und

chronischen Erkrankungsphase im Gehirn gelegt (SETHI und LIPTON, 1983;

LIPTON et al., 2005 a). Außerdem wurden die Vorgänge in empfänglichen SJL/J-

und resistenten C57BL/6-Mäusen vergleichend analysiert.

Diskussion 73

6.1 Charakterisierung des polyklonalen Antikörpers zum Nachweis des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus

Die chronische demyelinisierende Form der TME in empfänglichen Mäusestämmen,

dient aufgrund vieler ähnlicher Aspekte in der Pathogenese und Klinik seit mehr als

30 Jahren als Tiermodell für die chronisch progressive Form der MS (DRESCHER

und SOSNOWSKA, 2008). Allerdings liegen bislang wenige Untersuchungen über

die Virusausbreitung in der akute Infektionsphase in diesem MS Modell vor

(DRESCHER und TRACY, 2007; NJENGA et al., 2004). Es ist bekannt, dass sich

das TMEV nach intrazerebaler Injektion zunächst in Neuronen des Gehirns vermehrt

(LIPTON, 1975). Über die anschließende Ausbreitung des TMEV und die zelluläre

Persistenz liefert die Literatur nur wenige und zum Teil widersprüchliche Ergebnisse

(Tab. 2-2). Insbesondere stellt sich die Frage, ob Mikrogliazellen bzw. Makrophagen

oder aber Astrozyten bzw. Oligodendrozyten die primären Zielzellen in der

chronischen Phase der TME darstellen (LIPTON et al., 2005 a; ZHENG et al., 2001).

Im ersten Teil der Arbeit wurde daher ein TMEV-spezifischer polyklonaler Antikörper

durch Immunisierung im Kaninchen hergestellt und charakterisiert. Zunächst wurde

hierzu eine Western Blot-Analyse durchgeführt, um die gebundenen viralen Proteine

zu visualisieren. Die spezifische Bande lag bei 37kDa, was der Molekülmasse des

Kapselproteins VP1 des TMEV entspricht. Für die nähere Charakterisierung des

Antikörpers wurde die Aminosäuresequenz des gebundenen Proteins mittels

Massenspektrometrie ermittelt. Diese Technik ermöglicht die einzelnen

Aminosäuren, aus denen ein Protein zusammengesetzt ist, spezifisch zu ermitteln

und zu quantifizieren (KOLKER et al., 2006). Die unterschiedlichen

schwachvirulenten TMEV TO-Stämme (DA- und BeAn-TMEV-Stamm) ähneln sich in

92% der Nukleotid- und 94% der Aminosäurenzusammensetzung. Die

massenspektrometrische Analyse des 37kDa-Proteins ergab eine 61%ige Homologie

mit dem gesamten BeAn-VP1-Protein und eine vollständige Übereinstimmung in den

drei detektierten Segmenten der Aminosäuresequenz. Ob der hergestellte Marker

jedoch selektiv nur das Kapselprotein des BeAn-TMEV erkennt oder zusätzlich

74 Diskussion

Kreuzreaktivitäten mit weiteren TMEV-Stämmen aufweist, muss in weiteren

Untersuchungen ermittelt werden. Bei der Infektion mit TMEV besitzt das VP1-

Kapselprotein eine gesonderte Relevanz, da mittels in vitro-Neutralisationstest

gezeigt werden konnte, dass vornehmlich Anti-VP1-Antikörper, neben Anti-VP2-, -

VP4- und -VP2A- und -VP2C-Proteinen im Serum infizierter Mäuse vorkommen.

Sowohl Kapsel- als auch Nicht-Kapsel-Proteine scheinen bei den

immunpathologischen Prozessen im Verlauf der TME eine Rolle zu spielen

(CAMERON et al., 2001). In demyelinisierenden Arealen des ZNS konnten

beispielsweise infiltrierende T-Zellen, die spezifisch gegen das VP1-Protein gerichtet

waren, identifiziert werden (KIM et al., 1998; YAUCH und KIM, 1994). Genauso spielt

die Struktur des VP1-Kapselproteins bei der Viruspersistenz eine wichtige Rolle

(McCRIGHT et al., 1999). Mittels Röntgenkristallographie konnte gezeigt werden,

dass sich die VP1-Proteinstruktur im C-Terminus zwischen dem hochvirulenten

GDVII-Stamm und den schwachvirulenten, persistierenden Virusstämmen

unterscheidet (LUO et al., 1996).

Die meisten Versuche das TMEV im Gewebe während der chronischen Phase

ultrastrukturell darzustellen misslangen (DAL CANTO und LIPTON, 1975; DAL

CANTO und LIPTON, 1979; DAL CANTO und LIPTON, 1980). Als Ursache hierfür

wird diskutiert, das die Virionen auf Grund ihrer geringen Größe und Ähnlichkeit mit

Ribosomen nur nach Aggregation mittels Elektronenmikroskopie nachgewiesen

werden können, was bei der Infektion älterer Mäuse in vivo nur selten vorkommt

(DAL CANTO und LIPTON, 1982). Vergleichbar den vorliegenden Ergebnissen in der

Zellkultur (BHK21-Zellen) konnten jedoch in einzelnen Untersuchungen typische

parakristalline Strukturen in Oligodendrozyten und Myelinscheiden

elektronenmikroskopisch detektiert werden (BLAKEMORE et al., 1988). Der

immunelektronenmikroskopische Nachweis vom BeAn-TMEV-Stamm wurde in der

Literatur bisher nicht beschrieben. Im ersten Teil dieser Studie konnten auf

subzellulärer Ebene mittels Immunogold-Markierung des hergestellten Antikörpers

parakristallin angeordnete Virusaggregate im Zytoplasma infizierter BHK21-Zellen

visualisiert werden. Darüber hinaus ermöglichte der Antikörper die Lokalisierung von

dissoziierten, frei im Zytoplasma befindlichen Viruspartikeln, welche mit der

Diskussion 75

konventionellen Transmissionselektronenmikroskopie nicht nachweisbar waren. In

der Literatur wurde eine derartige Virusverteilung bisher nur bei dem GDVII- und FA-

Stamm in der Zellkultur beschreiben (FRIEDMANN und LIPTON, 1980; FRIEDMANN

und LORCH, 1984). Der DA-Stamm wurde ultrastrukturell in infizierten BHK21-Zellen

auch in Aggregaten angeordnet dargestellt, er war jedoch ohne

Antikörpermarkierung nicht von humanen Polioviren zu unterscheiden (POWELL et

al., 1977). Unmarkierte schwachvirulente TMEV (DA, WW, TO, YALE, BeAn) wiesen

ansonsten eine kettenartige Anordnung im Zytoplasma von infizierten BHK21-Zellen

auf (LORCH et al., 1981).

Die Immunfluoreszenzfärbung ergab in infizierten murinen L-Zellen eine positive

Markierung im Zytoplasma. Darüberhinaus stellt die konfokale Lasermikroskopie eine

weitere Methode zum Nachweis des TMEV auf subzellulärer Ebene dar. Zusätzlich

wurde der Antikörper auf seine Kreuzreaktivität in BeAn-Virus-infizierten Geweben

vom ZNS und BHK21-Zellen in der Immunhistologie getestet. Hierzu wurden die

Gewebe und Zellkulturen in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Hierbei

konnte eine spezifische Markierung im Zytoplasma der Zellen in vivo und in vitro

nachgewiesen werden. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass sich der polyklonale

Antikörper sowohl für den Virusnachweis in der Gewebekultur als auch im

archivierten Gewebe eignet. So konnte beispielsweise mittels des hier hergestellten

polyklonalen Antikörpers in weiteren in vitro-Experimenten gezeigt werden, dass der

BeAn-Stamm des TMEV Oligodendrozytenvorläuferzellen infiziert und deren

Differenzierung in reife Oligodendrozyten blockiert (PRINGPROA et al., 2010).

6.2 Darstellung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus mittels Immunhistologie und in situ-Hybridisierung

6.2.1 Virusausbreitung im Gehirn bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen Aus verschiedenen Studien an Mäusen ist bekannt, dass nach experimenteller

intrazerebraler Infektion schwachvirulente TMEV-Stämme in den Neuronen der

grauen Substanz des Großhirns replizieren und sich anschließend axonal im ZNS

76 Diskussion

ausbreiten (OLESZAK et al., 2004). Das TMEV vom DA-Stamm konnte in der akuten

Infektionsphase in Nacktmäusen in den Strukturen des limbischen Systems im

Großhirn nachgewiesen werden. Daher wurde postuliert, dass sich das Virus

möglicherweise entlang anatomisch verbundener Strukturen in der akuten

Infektionsphase ausbreitet (WADA und FUJINAMI, 1993). Beim TMEV vom BeAn-

Stamm wird ebenfalls ein axonaler Transport sowie eine postsynaptische

Übertragung von Neuron zu Neuron im Kortex, Hippokampus, Thalamus und

Hypothalamus während der Frühphase diskutiert (SIMAS und FAZAKERLY, 1996).

Die Ergebnisse des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit bestätigten die Resultate

vorheriger Studien. Mittels Immunhistologie und in situ-Hybridisierung konnte zu

Beginn der Infektion (Tag 4 und 7 post infectionem) das BeAn-TMEV im

Hippokampus, Kortex, Corpus callosum, Thalamus und Hypothalamus in SJL/J- und

C57BL/6-Mäusen nachgewiesen werden (Abb. 6-1). Hierbei fand sich eine

vorwiegende Infektion von Neuronen sowie ein Ausbreitung des Virus entlang der

Axone. Des Weiteren konnte eine periventrikuläre Infektion in beiden

Mäusestämmen zu diesem Zeitpunkt aufgezeigt werden. Als charakteristisches

Zeichen einer liquorogenen Ausbreitung und eines transependymalen Transports

des Agens fand sich bereits eine Stunde nach der experimentellen Infektion das

TMEV am apikalen Ziliensaum der Ependymzellen des Ventrikelsystems im

Großhirn. In diesem Zusammenhang konnte Virusantigen und RNS im Zytoplasma

von Ependymzellen und von periventrikulären glialen Zellen am vierten Tag nach der

Infektion nachgewiesen werden. Eine subventrikuläre Infektion in Verbindung mit

einer Aktivierung CD45+ hämatopoetischer Zellen konnte in TMEV-infizierten Mäusen

nachweisen werden (GOINGS et al., 2008). Allerdings wurde eine virale Infektion von

Ependymzellen in vivo bei der TME bisher noch nicht beschrieben (HA-LEE et al.,

1995; SIMAS und FAZAKERLY, 1996; STOHLMAN und HINTON, 2001; TROTTIER

et al., 2001). Diese Ergebnisse der zweiten Studie lassen daher die Hypothese eines

liquorogenen und periventrikulären Transports als alternativen Mechanismus zu der

bereits beschriebenen axonalen Erregerausbreitung zu. Diesbezüglich konnte in

vorangegangenen Studien mittels PCR virale RNS im Liquor von TMEV-infizierten

Mäusen detektiert werden (TROTTIER et al., 2002). Im weiteren Verlauf der Infektion

Diskussion 77

kam es in der vorliegenden Studie zu einer Elimination des Virus aus dem Ependym

und der periventrikulären Region in beiden Mäusestämmen (Abb. 6-1). Allerdings

führte eine unzureichende antivirale Immunantwort zur Viruspersistenz in

empfänglichen SJL/J-Mäusen, während resistente C57BL/6-Mäuse das TMEV

vollständig aus dem ZNS entfernten. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass es

insbesondere in SJL/J-Mäusen in Abhängigkeit von der Region zu unterschiedlich

effektiven Immunreaktionen gegen das Virus kommt. In diesem Zusammenhang

findet sich bei experimentellen Infektionen mit attenuiertem LCMV eine effektive T-

Zellantwort, welche den Erreger im Ependym, allerdings nicht im Neuroparenchym

zerstört (PINSCHEWER et al., 2010). Auch bei anderen Virusinfektionen wie

beispielsweise der MHV-Infektion findet sich der Erreger initial in Ependymzellen und

anschließend in der periventrikulären Region des Gehirns (STOHLMAN und

HINTON, 2001; REINACHER et al., 1983). In Analogie zu der beobachteten

periventrikulären Virusausbreitung mit Myelinverlust in TMEV-infizierten SJL/J-

Mäusen, findet sich eine periventrikuläre Entmarkung bei der MS des Menschen

(ADAMS et al., 1987) und bei der Staupevirusinfektion des Hundes (BEINEKE et al.,

2009; SUMMERS et al., 1978).

Vergleichbar den Befunden im Großhirn konnte eine nahezu identische Verteilung

des TMEV am apikalen Saum des Ependyms des vierten Ventrikels in beiden

Mäusestämmen nach einer Stunde post infectionem nachgewiesen werden.

Außerdem fand sich der Erreger am vierten Tag nach der Infektion im Zytoplasma

der Ependymzellen sowie in Zellen der periventrikulären weißen Substanz und der

ventrikelnahen Kerngebiete (Abb. 6-1). Erst ab dem Tag 28 post infectionem zeigte

sich im Stammhirn ein deutlicher Unterschied im Virusverteilungsmuster zwischen

den beiden Mäusestämmen. Während die resistenten C57BL/6-Mäuse das TMEV

eliminierten kam es zu einer Persistenz in SJL/J-Mäusen. Hierbei verschwand das

Virus im Verlauf der Infektion aus dem periventrikulären Bereich und fand sich in der

späten chronischen Phase (196 Tage nach der Infektion) vorwiegend in der weißen

Substanz des Stammhirns. Das Stammhirn stellt damit zusammen mit dem

Rückenmark (ZOECKLEIN et al., 2003) die Hauptregion für die Erregerpersistenz dar

(Abb. 6-1).

78 Diskussion

6.2.2 Virusausbreitung im Rückenmark bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen Nach intrazerebraler Infektion des TMEV persistiert das Virus während der

chronischen Infektionsphase in empfänglichen Mäusestämmen in der

demyelinisierten weißen Substanz des Rückenmarks (TSUNODA und FUJINAMI,

2002). Als möglichen Ausbreitungsweg des TMEV vom Gehirn ins Rückenmark wird

der Kortikospinaltrakt diskutiert, da dort virusinfizierte gliale Zellen nachgewiesen

werden. Außerdem wird eine hämatogene Ausbreitung postuliert, weil das Virus

zusätzlich auch in den ventralen Anteilen der Spinalnerven des Rückenmarks

detektierbar ist (WADA und FUJINAMI, 1993). Mittels PCR wurden in der

chronischen Infektionsphase 10-100mal höhere BeAn-Virus RNS-Äquivalente im

Rückenmark im Vergleich zum Klein-, Stamm- und Großhirn von SJL/J-Mäusen

detektiert (TROTTIER et al., 2002).

Über die Foramina luschkae könnte das TMEV in der vorliegenden Studie

theoretisch vom Ventrikelsystem des Gehirns in den Subarachnoidalraum gelangen

und von dort aus das Rückenmark infizieren (WELLER et al., 2009). Andererseits

konnte im Subarachnoidalraum des Rückenmarks kein TMEV in dieser Studie

nachgewiesen werden, wie es bei MHV- oder Herpes simplex Virus-Infektionen in

experimentellen Mäusestudien beschrieben ist (BOERMANN et al., 1992;

TAKATSUKI et al., 2010). Hinweise für eine hämatogene Virusausbreitung ergaben

sich bei dieser Studie nicht, da das Virus weder in der Nähe von Blutgefäßen noch in

Endothelzellen selbst detektiert wurde. Eine axonale Ausbreitung des TMEV nach

intrazerebraler Infektion wird von anderen Forschergruppen beschrieben

(RODRIGUEZ et al., 1983 a; WADA und FUJINAMI, 1993). Bei dem hochvirulenten

GDVII-Stamm konnte eine aufsteigende, intraaxonale Infektion ins Rückenmark über

den N. ischiadicus gezeigt werden (MARTINAT et al., 1999). Bei einer weiteren

Studie mit immundefizienten SCID-Mäusen wurde nach direkter Injektion des DA-

Virusstammes in den N. ischiadicus auch eine Infektion der Nerven und des

Rückenmarks mit Demyelinisierung nachgewiesen (DRESCHER und TRACY, 2007).

Höchstwahrscheinlich war dieses im ersten Fall durch die Neurovirulenz des GDVII-

Diskussion 79

Virus und im zweiten Fall durch die Immundefizienz des Mäusestammes sowie die

direkte Infektion des peripheren Nervens bedingt. In der vorliegenden Studie wurde

hingegen kein Virus in den abgehenden peripheren Nerven der Mäuse

nachgewiesen. Bei resistenten Mäusen war zu keinem Infektionszeitpunkt Virus im

Rückenmark in dieser Studie nachweisbar. Dieses entspricht den Ergebnissen

anderer Arbeitsgruppen. Die empfänglichen Mäuse wiesen, wie in der Literatur

beschrieben, ab Tag 14 post infectionem das Virus in der demyelinisierten weißen

Substanz der Ventral- und Lateralhörner des Rückenmarks auf (LIPTON et al., 1995;

PENA ROSSI et al., 1997). In beiden Mäusestämmen wurde das TMEV

ausschließlich im ZNS nachgewiesen. Wie schon in der Literatur beschrieben, erfolgt

nach intrazerebraler Injektion des TMEV in immunkompetenten Mäusen keine

Ausbreitung in extraneurale Organe (LIPTON et al., 2005 a; OLESZAK et al., 2004;

TROTTIER et al., 2002). Lediglich nach oraler Infektion von neonaten,

immundefizienten Mäusen oder nach induziertem Stress, gelang es das Virus in

extraneuralen Organen nachzuweisen (HA-LEE et al., 1995; MI et al., 2006; YOUNG

et al., 2010). Somit steht bei der experimentellen TME die zentralnervöse Persistenz

des Virus im Zusammenhang mit der Immunkompetenz der Versuchstiere und der

Infektionsart (DRESCHER und TRACY, 2007; WADA und FUJINAMI, 1993).

6.2.3 Phänotypisierung der infizierten Zellpopulationen im Verlauf der murinen Theiler-Enzephalomyelitis

In der zweiten Studie wurde mittels Immunhistologie- und in situ-Hybridisierung die

Virusverteilung im Gewebe untersucht und mittels Doppelimmunfluoreszenzfärbung

und konfokaler Lasermikroskopie die infizierten Zellen näher charakterisiert. Die

Ergebnisse ergaben einen Virusnachweis ab Tag 28 nach der Infektion im

Stammhirn und Rückenmark in Makrophagen und Oligodendrozyten (Abb. 6-1). Wie

in vorangegangenen Studien beschrieben, war das TMEV bis zum 14. Tag post

infectionem sowohl in Astrozyten, Makrophagen und Oligodendrozyten nachweisbar

(PENA ROSSI et al., 1997).

80 Diskussion

In vitro-Doppelimmunfluoreszenzfärbungen mit dem DA-Stamm infizierter

Mäusezellkulturen ergaben eine lytische Infektion von Neuronen und

Oligodendrozyten und eine Persistenz in Astrozyten und Makrophagen (GRAVES et

al., 1986). Untersuchungen mittels Immunhistologie und Elektronenmikroskopie

zeigten in der chronischen Infektionsphase von DA-Virus infizierten Mäusen eine

primäre Persistenz in Oligodendrozyten im Rückenmark (RODRIQUEZ et al., 1983 a;

AUBERT et al., 1987). In einer anderen Studie wurde aus dem Rückenmark von

SJL/J-Mäusen mit Hilfe einer diskontinuierlichen Percoll-Gradienten-Zentrifugation

gezeigt, das Makrophagen ca. 90% der BeAn-Virus infizierten Zellen in der

chronischen Infektionsphase darstellen (CLATCH et al., 1990).

Doppelimmunfluoreszenzfärbungen und konfokale Lasermikroskopie zeigten

ebenfalls, dass das TMEV überwiegend in Makrophagen in der weißen Substanz

persistiert und deren Anzahl vom 14. bis zum 49. Tag post infectionem ansteigt.

Hierbei wird angenommen, dass das Virus von Zelle zu Zelle übertragen wird

(LIPTON et al., 1995). Ähnliche Ergebnisse lieferten

Doppelimmunfluoreszenzfärbungen in der chronischen Phase (45-90 Tag post

infectionem) im Rückenmark, die zeigten, dass vorwiegend Mikroglia/Makrophagen

infiziert sind (ZOECKLEIN et al., 2003). Im Gegensatz zu diesen Arbeiten und den

Ergebnissen der eigenen Untersuchungen ergab eine weitere Studie, dass das Virus

während der chronischen TME-Phase vorwiegend in Astrozyten und seltener in

Mikroglia/Makrophagen repliziert (ZHENG et al., 2001). Weiterhin fand sich der

Erreger in BeAn-infizierten CBA-Mäusen im Gehirn und Rückenmark ab dem 50. Tag

nach der Infektion hauptsächlich in Oligodendrozyten und in einzelnen Astrozyten,

während keine Infektion von Makrophagen nachweisbar war (SIMAS und

FAZAKERLEY, 1996). Diese Befunde konnten im zweiten Teil der Studie nicht

bestätigt werden. In der chronischen Infektionsphase wurde das TMEV lediglich in

Mikroglia/Makrophagen und Oligodendrozyten nachgewiesen, während keine

Infektion von Astrozyten im Stammhirn und Rückenmark der untersuchten Tiere

detektierbar war.

Diskussion 81

6.3 Entzündungsreaktionen im Zentralen Nervensystem von SJL/J- und C57BL/6-Mäusen im Verlauf der murinen Theiler-Enzephalomyelitis

6.3.1 Entzündungsreaktionen im Großhirn bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen Die Entzündungsreaktionen im Großhirn von empfänglichen und resistenten Mäusen

wiesen in der akuten Infektionsphase ein sehr ähnliches Verteilungsmuster auf. An

den Tagen vier, sieben und 14 post infectionem zeigten sich im Kortex, Corpus

callosum, Hippokampus, Thalamus und Hypothalamus bei SJL/J- und C57BL/6-

Mäusen perivaskuläre Infiltrate und Gliosen. Vergleichbare Entzündungsreaktionen

fanden sich auch in der periventrikulären Region des Großhirns. Im Thalamus und

Hypothalamus waren die perivaskulären Entzündungszellinfiltrate und glialen

Reaktionen am siebten Tag post infectionem bei beiden Mäusestämmen am

deutlichsten ausgeprägt (Abb. 6-1). In der Literatur wird ein vergleichbares

Entzündungsmuster in der akuten Infektionsphase bei schwachvirulenten

Virusstämmen sowie für andere empfängliche CBA- und resistente Balb/c-Mäuse

beschrieben (RODRIGUEZ et al., 1987; SIMAS und FAZAKERLEY, 1996;

ZOECKLEIN et al., 2003). In der chronischen Infektionsphase (> 28 Tage nach der

Infektion) nahmen die Entzündungsreaktionen kontinuierlich ab. Lediglich im

Thalamus und Hypothalamus waren bis zum 196. Tag post infectionem entzündliche

Reaktionen sichtbar. Dieses Ergebnis entspricht vorherigen Studien, in denen im

Großhirn in der chronischen Phase zusätzlich Mineralisationen und Malazien,

vermutlich als Folge der intrazerebralen Infektion beschrieben wurden (LIPTON,

1994; RODRIGUEZ et al., 1993).

Schließlich konnten in der akuten Phase mittels Immunhistologie deutliche

Infiltrationen bzw. Proliferationen von CD107b+-Mikroglia/Makrophagen in den

periventrikulären Bereichen des Großhirns und des Corpus callosums bei beiden

untersuchten Mäusestämmen beobachtet werden. Das zeitgleiche Auftreten von

Virusantigen bzw. -RNS in den entsprechenden Arealen spricht hierbei für das

Vorliegen von erregerbedingten Entzündungsreaktionen. Hinweise auf

82 Diskussion

immunpathologische Reaktionen bzw. Myelinverluste konnten im Großhirn der

infizierten Versuchstiere hingegen nicht nachgewiesem werden.

6.3.2 Entzündungsreaktionen im Kleinhirn, Stammhirn und Rückenmark bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen

Klein- und Stammhirn wiesen am vierten Tag post infectionem bei beiden

Mäusestämmen ähnliche Läsionen, wie sie im Großhirn sichtbar waren, auf. Um den

vierten Ventrikel zeigten sich hyperzelluläre Areale mit perivaskulären Infiltraten. Im

weiteren Verlauf der Infektionsphase blieben diese Entzündungsreaktionen bei den

SJL/J-Mäusen bis zum 196. Tag post infectionem im Stammhirn, überwiegend in der

weißen Substanz, bestehen. Die resistenten C57BL/6-Mäuse zeigten ab den 28. Tag

nach der Infektion keine perivaskulären Infiltrate in den ventrikelnahen Regionen. In

der grauen und weißen Substanz des Stammhirns nahmen die entzündlichen

Infiltrate von der akuten zur chronischen Phase bei empfänglichen SJL/J-Mäusen

hingegen zu. Am stärksten ausgeprägt war die Entzündung am 28. Tag post

infectionem. Die Entzündungszellinfiltrationen im ZNS der SJL/J-Mäuse sind sehr

wahrscheinlich für „bystander“- und DTH-Reaktionen im chronischen

Krankheitsverlauf verantwortlich (FUJINAMI et al., 2006; GIRAUDOU und

BERNARD, 2010). Resistente Mäuse zeigten hingegen nur eine minimale Gliose im

Verlauf der Infektion und in einem sehr geringen Ausmaß perivaskuläre

Entzündungszellinfiltrate. Die abnehmende Entzündungsreaktion in resistenten

Mäusestämmen ist als Folge der effektiven antiviralen Immunantwort und der damit

verbundenen vollständigen Viruseliminierung zu interpretieren (OLEASZEK et al.,

2004). Vergleichbar den Prozessen im Stammhirn ließen sich in der weißen

Substanz des Rückenmarks bei SJL/J-Mäusen zunehmend perivaskuläre und diffuse

Entzündungszellinfiltrate sowie Demyelinisierungen ab dem 14. Tag post infectionem

nachweisen. Im Gegensatz hierzu zeigten die resistenten Mäuse eine nur

geringgradige Gliazellaktivierung im Rückenmark und nahezu keine perivaskulären

Infiltrate. Diese Ergebnisse konnten in vorangegangenen Studien ebenfalls gezeigt

Diskussion 83

werden und scheinen mit dem genetischen Hintergrund der Tiere und deren

antiviraler Immunabwehr im Zusammenhang zu stehen (GERHAUSER et al., 2005;

ULRICH, 2006; ULRICH et al., 2006; OLEASZEK et al., 2004; CHAMORRO et al.,

1996). Im Stammhirn und Rückenmark von SJL/J-Mäusen waren die CD107b+-Zellen

in der chronischen Phase im Gegensatz zur akuten Phase im Großhirn deutlich

vermehrt. Die CD107b+-Zellansammlungen waren hier in der Regel mit

Gitterzelltransformationen und Entmarkungsherden assoziiert. Die Befunde

unterstützen daher die Hypothese des Vorliegens von „bystander“-

Demyelinisierungen bzw. DTH-Reaktionen in den entsprechenden ZNS-Regionen.

Die Ursache der beobachteten unterschiedlichen Sensitivitäten im ZNS bleibt

aufgrund der vorliegenden Ergebnisse spekulativ, allerdings muss von

topographischen Unterschieden des Mikromilieus, der Bluthirnschranke, und/oder

der Zusammensetzung der glialen Zellen im ZNS der Versuchstiere ausgegangen

werden. Vergleichbare regionale Differenzen bezüglich der Entzündungsantwort und

Demyelinisierung finden sich in diesem Zusammenhang bei der MS des Menschen

(ADAMS et al., 1987; LASSMANN et al., 2001 und 2007; NEWCOMBE et al., 1991).

6.4 Demyelinisierung im Zentralen Nervensystem nach Infektion mit dem murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus

6.4.1 Demyelinisierung im Kleinhirn, Stammhirn und Rückenmark bei

SJL/J-Mäusen Bei den empfänglichen SJL/J-Mäusen zeigte sich ab Tag 28 post infectionem eine

ausgeprägte Demyelinisierung um den vierten Ventrikel. Dabei waren auch Anteile

des Kleinhirns, dorsal um den Ventrikel betroffen. Ab dem 56. Tag nahm die

periventrikuläre Entmarkung ab und war am 196. Tag nach der Infektion nicht mehr

nachweisbar. In der weißen Substanz des Stammhirns und Rückenmarks war die

Entmarkung hingegen deutlich ausgeprägt und mit Entzündungszellinfiltrationen und

Myelinophagie vergesellschaftet. Wie in anderen Arbeiten beschrieben war die

84 Diskussion

Demyelinisierung in der weißen Substanz des Stammhirns in der Regel mit einem

Virusnachweis in den jeweiligen Regionen verbunden (ZOECKLEIN et al., 2003;

Abb. 6-1). Für die Entstehung der Demyelinisierung bei der TME ist die Infektion der

Oligodendrozyten ausschlaggebend. Im weiteren Verlauf kommt es durch die

Mikrogliaaktivierung und Sekretion von IFN-γ zur Infiltration von Makrophagen. Durch

die weitere Akkumulation von CD4+-T-Zellen werden DTH-Reaktionen im ZNS

induziert (STOHLMAN und HINTON, 2001). Bei der MS zeigt sich in der chronischen

Demyelinisierungsphase ein sehr ähnliches Verteilungsmuster der Läsionen in der

weißen Substanz des Klein- und Stammhirns sowie vergleichbare

immunpathologische Prozesse (OLESZAK et al., 2004). Die Demyelinisierung in der weißen Substanz des Rückenmarks begann ab dem 28.

Tag post infectionem und beschränkte sich hauptsächlich auf die lateralen und

ventralen Funiculi. Bis zum Tag 196 konnten in der vorliegenden Arbeit

Entmarkungsherde mit Myelinophagie und Entzündungszellinfiltraten nachgewiesen

werden. Diese Ergebnisse konnten in vorherigen Studien ebenfalls beobachtet

werden (ZOECKLEIN et al., 2003; ULRICH, 2006; ULRICH et al., 2006). Außerdem

zeigt sich im Rückenmark von MS-Patienten ein vergleichbares Verteilungsmuster

der Demyelinisierung in der weißen Substanz (LASSMANN et al., 2007;

NEWCOMBE et al., 1991; OLESZAK et al., 2004).

Diskussion 85

Abbildung 6-1: Schematische Darstellung des Infektionsverlaufes bei der experimentellen

Theiler-Enzephalomyelitis in SJL/J- und C57BL/6-Mäusen. Nach intrazerebraler Injektion findet sich das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus vom

BeAn-Stamm in beiden Mäusestämmen während der akuten Infektionsphase (bis zum 14.

Tag nach der Infektion [dpi]) überwiegend im Großhirn (A1). Hierbei liegt initial eine Infektion

von Ependymzellen (A2), Neuronen (A3) und Astrozyten (A4) vor. Die resultierende akute

Polioenzephalitis ist in SJL/J- und C57BL/6-Mäusen gleichermaßen durch perivaskuläre

lymphohistiozytäre Infiltrationen (A5) und Gliosen (A6) gekennzeichnet. Während C57BL/6-

Mäuse das Virus im weiteren Verlauf eliminieren, führt eine unzureichende antivirale

Immunantwort zur Erregerpersistenz im Stammhirn und Rückenmark von SJL/J-Mäusen

(B1). In der chronischen Infektionsphase (28. bis 196. dpi) findet sich der Erreger hierbei

überwiegend in der weißen Substanz (B2) in Mikroglia/Makrophagen (B3) und

Oligodendrozyten (B4). Aufgrund der periventrikulären Ausbreitung kann anfänglich (28. dpi)

eine periventrikuläre Demyelinisierung um den vierten Ventrikel (B5) beobachtet werden, die

sich ab dem 56. dpi auf die weiße Substanz des Stammhirns und Rückenmarks weiter

ausbreitet (B6).

86 Diskussion

TMEV: murines Theiler-Enzephalomyelitisvirus; A1 = Virusausbreitung im ZNS während der

akuten Infektionsphase; A2 = Immunhistologischer Nachweis des TMEV in Ependymzellen;

A3 = Immunhistologischer Nachweis des TMEV in Neuronen; A4= Immunfluoreszenz-

mikroskopische Doppelmarkierung (konfokale Lasermikroskopie) zum Nachweis des TMEV

(rot) in Astrozyten (GFAP = grün), TMEV-infizierte Astrozyten (doppelmarktierte Zellen)

stellen sich gelb dar; A5 und A6 = Histologischer Nachweis perivaskulärer Infiltrate und

Gliose mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung; B1 = Virusausbreitung im ZNS während der

chronischen Infektionsphase; B2 = Immunhistologischer Nachweis des TMEV-infizierten

Zellen in der weißen Substanz; B3 und B4 = Immunfluoreszenzmikroskopische

Doppelmarkierungen (konfokale Lasermikroskopie) zum Nachweis des TMEV (rot) in

Mikroglia/Makrophagen (F4/80 = grün) und Oligodendrozyten (CNPase = grün), TMEV-

infizierte Mikroglia/Makrophagen bzw. Oligodendrozyten (doppelmarktierte Zellen) stellen

sich gelb dar; B5 und B6: Histologischer Nachweis der Entmarkung im periventrikulären

Bereich und der weißen Substanz mittels Luxol Fast Blue-Kresylechtviolett-Färbung.

6.5 Schlussbetrachtung In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Teil ein polyklonaler Antikörper zum

spezifischen Nachweis des TMEV in infizierten Geweben und Zellkulturen

hergestellt. Neben seiner Einsetzbarkeit in der Immunhistologie und

Immunfluoreszenz ermöglicht der Marker darüber hinaus die Detektion des Virus auf

subzellulärer Ebene mittels Elektronenmikroskopie und konfokaler Lasermikroskopie.

Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen außerdem die besondere Bedeutung der

Western Blot-Technik und Massenspektrometrie zur spezifischen Charakterisierung

von Antikörpern.

Die Ergebnisse des zweiten Teils der Arbeit unterstützen die Hypothese einer

liquorogenen Ausbreitung des TMEV. Die ependymale Infektion und konsekutive

periventrikuläre Entmarkung stellt ein bislang nicht beschriebenes Phänomen in

diesem Tiermodell für demyelinisierende Krankheiten dar (HA-LEE et al., 1995;

STOHLMAN und HINTON, 2001; TROTTIER et al., 2001). Diese Beobachtung sowie

die Darstellung regional unterschiedlicher Empfindlichkeiten im ZNS zeigen deutliche

Diskussion 87

Parallelen zur Läsionsentwicklung bei MS-Patienten (ADAMS et al., 1987). In diesem

Zusammenhang wird die periventrikuläre Region im Gehirn als ein potentielles Ziel

für innovative Therapieansätze, insbesondere von Remyelinisierungsstrategien, bei

der MS angesehen (EINSTEIN et al., 2009; LEVINE und REYNOLDS, 1999).

Weiterhin findet sich bei der MS und TME eine gestörte

Oligodendrozytendifferenzierung (ULRICH et al., 2008; PRINGPROA et al., 2010), so

dass die Untersuchung der Markscheidenveränderungen in periventrikulären

Gehirnregionen von TMEV-infizierten Mäusen einen neuartigen Ansatz darstellt, um

endogene Myelinisierungsmechanismen zu studieren.

88 Zusammenfassung

7 Zusammenfassung Untersuchung über die Virusausbreitung und -persistenz bei der murinen Theiler-Enzephalomyelitis von experimentell infizierten Mäusen mittels polyklonaler Antikörper und RNS-Sonden

Maren Kummerfeld Die experimentelle Infektion mit dem murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus

(TMEV), einem einzelsträngigen RNS-Virus, welches zum Genus Cardiovirus und

der Familie Picornaviridae gehört, ruft eine demyelinisierende Leukomyelitis in

empfänglichen Mäusestämmen hervor. Nach einer akuten Infektionsphase im Gehirn

wird das Virus in resistenten C57BL/6-Mäusen eliminiert, wohingegen eine nicht

ausreichende antivirale Immunantwort in empfänglichen SJL/J-Mäusen eine

Viruspersistenz bedingt. Weiterhin führt das Virusantigen zu einer

Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ und Myelin-spezifischen

Autoimmunität, welche eine entzündliche Demyelinisierung vorwiegend im

Rückenmark empfänglicher Mäusestämme hervorrufen. Diese Veränderungen

entsprechen daher denen der chronisch progressiven Verlaufsform der Multiplen

Sklerose (MS) des Menschen. Aufgrund der Ergebnisse vorangegangener Studien

stellt sich die Frage nach der Virusausbreitung und der Entstehung der Läsionen im

Zentralen Nervensystem (ZNS) zu Beginn und während des chronischen Verlaufes

der experimentellen murinen Theiler-Enzephalomyelitis in resistenten und

empfänglichen Mäusestämmen.

Das Ziel der ersten Studie bestand in der Herstellung und Charakterisierung eines

spezifischen polyklonalen Antikörpers zur Erkennung des TMEV in infizierten

Geweben und Zellkulturen. Hierfür wurden drei weiße Neuseeländische Kaninchen

mit gereinigtem TMEV des BeAn-Stammes immunisiert. Die Spezifität des

Antikörpers wurde mittels Western Blot bestimmt und eine Sequenzanalyse des

erkannten Antigens mittels Massenspektrometrie durchgeführt. Das

Postimmunisierungsserum wurde auf Spezifität des polyklonalen Antikörpers in

Zusammenfassung 89

TMEV-infizierten L-Zellen (Lungenzelltumorlinie der Maus) mittels Immunfluoreszenz

getestet. Zusätzlich, wurde an Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten TMEV-

infizierten BHK21-Zellpellets und Gehirngewebe TMEV-infizierter Mäuse das Virus

immunhistochemisch detektiert. Außerdem konnten mittels

Immunelektronenmikroskopie Picornavirus-typische parakristalline Ansammlungen

und dissoziierte Viren im Zytoplasma TMEV-infizierter BHK21-Zellen nachgewiesen

werden.

Das Ziel der zweiten Studie bestand in der Identifizierung von topographischen

Unterschieden in der Virusausbreitung und Demyelinisierung im ZNS von infizierten

empfänglichen SJL/J- und resistenten C57BL/6-Mäusen. Die Virusverteilung im ZNS

und in extraneuralen Geweben wurde immunhistochemisch mit Hilfe des

hergestellten polykonalen TMEV-spezifischen Antikörpers quantifiziert. Weiterhin

wurde zusätzlich virale RNS mittels in situ-Hybridisierung detektiert und der

Phänotyp der infizierten Zellen mittels Immunfluoreszenzdoppelmarkierung in der

konfokalen Lasermikroskopie dargestellt. Entzündungszellreaktionen sowie die

Demyelinisierung wurden histologisch semiquantitativ ausgewertet. Des Weiteren

wurden Makrophagen und Mikroglia mittels CD107b-spezifischer Immunhistologie in

unterschiedlichen ZNS-Lokalisationen quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten eine frühe

Infektion der ependymalen und periventrikulären Zellen, begleitet von einer

Entzündungs- und Entmarkungsreaktion um den vierten Ventrikel in empfänglichen

SJL/J-Mäusen. In der chronischen Phase lag eine Viruspersistenz im Stammhirn und

Rückenmark infizierter SJL/J-Mäuse vor. Die primären Zielzellen der Persistenz des

BeAn-Virus waren Mikroglia/Makrophagen und Oligodendrozyten. Während die

periventrikuläre Demyelinisierung um den vierten Ventrikel in der chronischen Phase

abnahm, stieg der Schweregrad der Läsionen in der weißen Substanz des

Stammhirns an. Der Myelinverlust war von einer Ansammlung von CD107b+-

Mikroglia/Makrophagen begleitet.

Die Ergebnisse des ersten Teils zeigten die vielfältige Verwendungsmöglichkeit des

polyklonalen Antikörpers zur Untersuchung des TMEV-Zelltropismus und der

Virusausbreitung auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Mit Hilfe dieses Antikörpers

konnte eine Untersuchung der Virusverteilung in verschiedenen Regionen des ZNS

90 Zusammenfassung

an unterschiedlichen Zeitpunkten und der damit verbundenen

Entzündungsreaktionen im Rahmen der zweiten Studie erfolgen. Die ependymale

Infektion und konsekutive periventrikuläre Entmarkung stellt ein bislang nicht

beschriebenes Phänomen bei der TME dar. Die neuen Aspekte bezüglich der

Virusausbreitung im ZNS liefern daher einen Beitrag zum besseren Verständnis

regionabhängiger Entzündungsreaktionen und regenerativer Vorgänge in diesem

viralen MS-Modell.

Summary 91

8 Summary

Examination of viral distribution und persistence during the Theilers-Encephalomyelitis in experimentally infected mice using polyclonal antibodies and RNA probes Maren Kummerfeld The experimental infection with the Theiler‘s murine encephalomyelitis virus

(TMEV), a single-stranded RNA virus which belongs to the cardiovirus genus of the

family Picornaviridae causes a demyelinating leukomyelitis in susceptible mice

strains. Thus, while the virus is eliminated from the brain in resistant C57BL/6 mice

after the initial phase, an inadequate antiviral immune response leads to viral

persistence in susceptible SJL/J mice. Subsequent, viral antigen-induced delayed-

type hypersensitivity and myelin-specific autoimmunity induce inflammatory

demyelination predominantly in the spinal cord of susceptible mouse strains,

resembling the chronic progressive form of human multiple sclerosis (MS). Previous

studies have raised the question of region-specific viral spread and central nervous

system (CNS) lesion development during the initiation and progression of

experimental Theiler´s murine encephalomyelitis (TME) in resistant and susceptible

mice strains.

The intention of the first part of the study was to generate and characterize a specific

polyclonal antibody for the detection of TMEV in infected tissues and cell cultures.

Therefore, New Zealand white rabbits were immunized with purified TMEV of the

BeAn strain. The specificity of the antiserum was confirmed by Western blotting and

sequence analysis of the recognized antigen by high resolution mass spectrometry.

The presence of TMEV-specific polyclonal antibodies in postimmunization sera was

tested on TMEV-infected L-cells (murine lung tumor cell line) using an

immunofluorescence assay. Additionally, the rabbit serum enabled virus detection in

formalin-fixed and paraffin-embedded TMEV-infected BHK21 cell pellets and brain

92 Zusammenfassung

tissue of TMEV-infected mice by immunohistochemistry. Immune electron

microscopy revealed colloid gold-labeled picornavirus-typical paracrystalline arrays

and non-aggregated viral particles of TMEV-infected BHK21 cells. Strikingly, apart

from labeling of aggregated virus particles arranged in paracrystalline arrays, which

are detected easily by conventional electron microscopy, the postimmunization sera

also allowed the detection of non-aggregated individual viral particles of infected

BHK21 cells.

The aim of the second part of study was to identify topographical differences of

TMEV spread and demyelination in the CNS of experimentally infected susceptible

SJL/J mice and resistant C57BL/6 mice. Viral dissemination within the CNS and

extraneural tissues was quantified by immunohistochemistry using the generated

TMEV-specific polyclonal antibody. Further, viral RNA was detected by in situ-

hybridization and the phenotype of infected cells was identified by confocal laser

scanning microscopy. Inflammatory responses and demyelination within the CNS

were determined by histology using semiquantitative scoring systems. Furthermore,

accumulation of microglia/macrophages was quantified in different CNS regions by

CD107b-specific immunohistochemistry. Results show an early infection of

ependymal and periventricular cells followed by inflammation and demyelination

around the fourth ventricle in susceptible SJL/J mice. Persistence of the virus was

observed in the brain stem of SJL/J mice during the chronic disease phase. Here,

microglia/macrophages and oligodendrocytes represented the primary targets of the

TMEV. While periventricular demyelination was transient, white matter lesions of

brain stem and spinal cord progressed. Myelin loss was associated with an

accumulation of CD107b+ microglia/macrophages.

The results of the first part of the study demonstrate the applicability of the generated

polyclonal antibody for investigating TMEV cell tropism and viral spread at a cellular

and subcellular level. Using this marker a spatiotemporal analysis of virus

dissemination and associated injuries in different CNS regions was performed in the

second part of the study. Here, the demonstration of ependymal infection and

subjacent spread into the brain parenchyma as well as regional virus clearance

despite ongoing demyelination in other CNS compartment allows new insights into

Summary 93

TME pathogenesis. This novel aspect of virus CNS interaction will enhance the

understanding of region-specific susceptibilities to injury and regenerative capacities

of the brain in this infectious MS model.

94 Literaturverzeichnis


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Theiler´s virus infection in nude mice: viral RNA in vascular endothelial cells. J.

Virol. 62, 3589-3596

118 Anhang

10 Anhang

10.1 Ergänzendes Material zu Kapitel 4

10.1.1 Vermehrung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus in BHK21-Zellen

Die BHK21-Zellen (permanente Fibroblastenzelllinie aus Babyhamsterniere) wurden

freundlicherweise von Prof. R. Roos von der Universität in Chicago zur Verfügung

gestellt.

Die Kultivierung erfolgte in T75-Zellkulturflaschen bei 37 °C und 5% CO2 im

Brutschrank (Heraeus) bis zu einem 50-60% konfluenten Zellrasen. Als

Wachstumsmedium diente Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM) mit L-

Glutamin, 4500 mg/l D-Glucose, 50 µg/ml Gentamicin und 10% fötalem Kälberserum

(FKS). Die BHK21-Zellen wurden mit 5 ml Trypsin vom Flaschenboden abgelöst und

bei 400 x g und 4 °C für 5 Minuten zentrifugiert. Dann wurden 200 µl der

Zellsuspension mit 400 µl einer 0,2%igen Trypanblaulösung vermischt und in eine

Zählkammer nach Neubauer (Roth) pipettiert. Das Verhältnis der Zellsuspension zu

der Trypanblaulösung betrug 1:3 und in einem Quadranten der Zählkammer lagen

genau 0,1 µl des Gemisches vor. Unter dem Auflichtmikroskop (IX 70, Olympus)

wurde die Zellzahl in 3 Gruppenquadranten in der Zählkammer nach Neubauer

(Roth) ausgezählt und so konnte auf die Zellzahl in 0,1 µl geschlossen und daraus

die Gesamtzellzahl pro ml berechnet werden.

Formel: Durchschnittliche Zellzahl x 3 x 10000 = Zellen/ml

3

Für die Infektion mit dem BeAn-Stamm des TMEV wurden 3 Millionen Zellen pro

Zellkulturflasche ausgesät und 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank

(Heraeus) bis zu einem 75% konfluenten Zellrasen inkubiert. Der Virusstamm wurde

Anhang 119

dem Institut für Pathologie freundlicherweise von Prof. H. Lipton von der North-

Western Universität in Chicago überlassen. Die BHK21-Zellen wurden mit einer

multiplicity of infection (MOI) von 0,1 pro Zelle der Passage 7 des BeAn-Stammes in

DMEM 2% FKS infiziert. Die Virusadsorption in den infizierten Zellen erfolgte auf

einem Horizontalschüttler (New Brunswick) bei 75 Umdrehungen pro Minute und

Raumtemperatur. Anschließend wurde der Zellrasen einmal mit DMEM ohne FKS

gewaschen und mit DMEM 2% FKS bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank (Heraeus)

für 19 Stunden inkubiert.

Bei einem zytopathischen Effekt von mehr als 95% der BHK21-Zellen erfolgte die

Virusernte mittels der Trockeneis-Azetonmethode (BAUMGÄRTNER et al., 1981).

Die infizierten und vom Zellkulturflaschenboden abgeschabten Zellen wurden in ein

Zentrifugenröhrchen überführt. Dazu wurde ein Gemisch, welches aus Azeton

(Fluka) und Trockeneis in einem Verhältnis 1:1 bestand, hinzugefügt. Zur

Freisetzung der Viruspartikel wurde diese Suspension dann dreimal eingefroren und

anschließend in kaltem Leitungswasser wieder aufgetaut. Abschließend wurde die

Virussuspension durch eine 10-minütige Zentrifugation in blauen Greiner-

Zentrifugengefäßen bei 380 x g und 4°C gereinigt und der Überstand bei -80°C

gelagert.

10.1.2. Virusreinigung über einen Saccharosegradienten Die Virusaufreinigung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus erfolgte in

Kooperation mit Prof. Dr. Ludwig Haas am Institut für Virologie der Stiftung

Tierärztliche Hochschule Hannover.

Der zuvor eingefrorene Überstand der Virussuspension (siehe 10.1.1) wurde

aufgetaut und anschließend zum Trennen von restlichen Zelltrümmern für 30

Minuten (10.000 x g bei 4°C) (Kühlzentrifuge J2-21 mit JS13-Rotor, Beckman)

zentrifugiert. Der virushaltige Überstand wurde in 0,1% Sodiumdodecylsulfat (SDS)

überführt und anschließend in einem Zentrifugenröhrchen mit 3 ml 30%iger

Saccharoselösung (w/v) in PBS unterschichtet. Danach wurde der Überstand für 3

Stunden in einer Ultrazentrifuge (Beckman, Rotor SW32) bei 120.000 x g bei 4°C

120 Anhang

zentrifugiert. Das entstandene virushaltige Pellet wurde in 500 µl PBS resuspendiert

und zur Reinigung über einen kontinuierlichen Saccharosegradienten (20%, 50% und

60% w/v in PBS) geschichtet. Nach einer weiteren zweistündigen Ultrazentrifugation

(Beckman, Rotor SW55) von 150.000 x g bei 4°C wurde die im durchscheinenden

Licht sichtbare, grau-milchige Virusbande mit einer 1 ml Spritze mit aufgesetzter

Kanüle abgenommen und in 3,5 ml PBS gegeben. Die refraktrometrisch gemessene

Dichte lag bei 1,39 g/cm3. Es schloss sich eine einstündige Zentrifugation bei 4°C

und 150.000 x g in der Ultrazentrifuge (Beckman, Rotor SW55) an. Der Überstand

wurde danach verworfen. Das Pellet des gereinigten Virusmaterials wurde kurz

angetrocknet und 100 µl PBS hinzugegeben. Abschließend wurde der Proteingehalt

(mg/ml) in einem Photometer (Pharmacia Biotech) bei einer Wellenlänge von 260 nm

bestimmt und die Probe bei -80°C bis zur Verwendung eingefroren.

10.1.3 Herstellung eines polyklonalen Antikörpers zum Nachweis vom murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus

10.1.3.1 Herkunft und Haltung der Kaninchen

Die Haltung der Kaninchen zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers zum

Nachweis des murinen Theiler-Enzepalomyeltisvirus (TMEV) wurde von dem

Niedersächsichen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit

nach § 10a des Tierschutzgesetzes (TSchG) vom 25.05.1998 in der zurzeit

geltenden Fassung unter dem Aktenzeichen 33-42502-05 A 331 vom 15.4.2005

genehmigt. Es wurden 18 Wochen alte, weibliche, weiße neuseeländische

Kaninchen (Oryctalagus cuniculus) (Harlan Winkelmann) verwendet. Die Kaninchen

waren spezifisch-pathogen frei (SPF) und somit serologisch negativ für Pasteurella

multocida, Bordetella bronchiseptica und Encephalitozoon cuniculi. Die

Quarantänezeit am Institut für Pathologie betrug 14 Tage und der Versuch begann

mit der 20. Lebenswoche der Kaninchen bei einem Körpergewicht von ca. 2,6 kg.

Anhang 121

Die Versuchstiere wurden artgerecht nach § 2 TSchG in Edelstahlkäfigen

(Techniplast) mit 4200 cm2 + 1650 cm2 in zweiter Ebene entsprechend der Norm der

Europarat Konvention EST 123 Appendix A in einem Versuchstierstall des Instituts

für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover untergebracht.

Die Einstreu bestand aus einer Schicht Sägemehl (ssniff bedding ¾ Faser, Ssniff

Spezialitäten GmbH). Als Trinkwasser wurde Leitungswasser ad libitum in einer

Trinkflasche angeboten. Als Futter erhielten die Tiere pelletiertes

Kaninchenerhaltungsfutter (Ssniff Spezialitäten GmbH), Heu ad libitum und zur

Beschäftigung Nageholz. Die Raumtemperatur betrug 23°C im Durchschnitt und die

relative Luftfeuchte lag bei 45%. Es bestand ein natürlicher Tag-Nachtrhythmus.

Nach einer gründlichen Allgemeinuntersuchung bei Lieferung der Kaninchen, folgte

eine täglich protokollierte Routinekontrolle des Allgemeinzustandes mit einer

Überprüfung der Futter- und Wasseraufnahme jeden Tieres. Die drei Kaninchen

waren mit Ohrtätowierungen gekennzeichnet (Tier Nummer 1: FBC2; Tier Nummer 2:

FBI4; Tier Nummer 3: FBG7).

10.1.3.2 Serumgewinnung

Das präimmune und postvakzinale Serum wurde durch die Punktion der zentralen

Ohrarterie bzw. der marginalen Ohrvene gewonnen. Hierzu wurde ein Ohr des

Kaninchens mit 70% igem Ethanol desinfiziert und mit einer 22G Kanüle (Thermo)

wurde zwischen 5 – 10 ml Blut in einem Serumröhrchen (Sarstedt) aufgefangen.

Eine Hilfsperson fixierte das Kaninchen in einem Handtuch als rutschfeste Unterlage.

Nach erfolgter Blutabnahme wurde dem Tier ein Ohrdruckverband aus Zellstofftupfer

(Hartmann) und Heftpflaster (W. Söhngen) angelegt und nach wenigen Minuten, bei

sistierender Blutung wieder entfernt. Das Serumröhrchen wurde leicht geschwenkt

und anschließend bei 4-8°C für Nacht aufbewahrt. Am nächsten Tag wurde das

Serum für 20 Minuten bei 1000 x g zentrifugiert, anschließend zu 1 ml Portionen

aliquotiert und bei -80°C gelagert. Einzelne Portionen wurden bei 56°C für 30

122 Anhang

Minuten im Wasserbad hitzeinaktiviert und in 50 bzw. 100 µl Portionen für den

direkten Verbrauch bei -80°C gelagert.

10.1.3.3 Immunisierung der Kaninchen Nach 14 Tagen Quarantänezeit wurde vor der eigentlichen Immunisierung bei jeden

Kaninchen das Präimmunserum entnommen und auf das Vorhandensein von TMEV-

kreuzreagierenden Antikörpern mittels Immunfluoreszenz und Immunhistologie

gestestet (HARBOW und LANE, 1988). Nach Herstellerangaben wurde das

lyophilisierte Adjuvans (Linaris) für 10 Minuten im 37°C warmen Wasserbad erwärmt

und der Inhalt des Fläschens mit 2 ml PBS und der gewünschten Menge Antigen-

Konzentration (siehe Immunisierungsschema, 10.1.3.4) gelöst. Für die

Erstimmunisierung und die erste Boosterung wurde das Ribi`s komplette Adjuvans

(ABM-ZK, Linaris) verwendet und für die 2. bis 4. Boosterung das Ribi`s inkomplette

Adjuvans (ABM-N, Linaris). Im Bereich der Injektionstelle wurde das Fell rasiert, mit

70%igen Ethanol gereinigt und desinfiziert. Das angesetzte Virus-Adjuvansgemisch

(Linaris) wurde immer mittels 25 G Kanüle subkutan (s.c.) zwischen den

Schulterblättern appliziert. Nach jeder Immunisierung wurde auf ein ungestörtes

Allgemeinbefinden der Kaninchen geachtet. Das jeweilige postvakinale Serum wurde

entsprechend (siehe Kapitel 10.1.3.2) beschrieben aufgearbeitet und in der

Immunfluoreszenz, Immunhistologie und im Westernblot auf das Vorhandensein von

spezifischen Antikörpern gegen das TMEV getestet. Die Tiere wurden am Ende des

Immunisierungversuches tierschutzgerecht (siehe Immunisierungsschema, 10.1.3.4)

euthanasiert und das Blut entnommen (FEHR, 2002).

Anhang 123

10.1.3.4 Immunisierungsschema zur Herstellung des polyklonalen Antikörpers

1.Tag: Erstimmunisierung mit 250 µg aufgereinigtem Virus in Ribi´s komplette

Adjuvans (ABM-ZK, Linaris) 1,0 ml subkutan (s.c.)

14. Tag: 1. Boosterung mit 250 µg aufgereiningtem Virus in ABM-ZK 0,5 ml s.c.

24. Tag: 1. Serumgewinnung

48. Tag: 2. Boosterung mit 200 µg aufgereinigtem Virus in Ribi´s inkompletten

Adjuvans (ABM-N, Linaris) 0,5 ml s.c.

62. Tag: 3. Boosterung mit 200 µg aufgereinigtem Virus in ABM-N 0,5 ml s.c.


86. Tag: 4. Boosterung mit 200 µg aufgereinigtem Virus in ABM-N 0,5 ml s.c.


106. Tag: 4. Serumgewinnung 136. Tag: letzte Serumnahme: Narkose (Ketamin 50 mg/kg KM intramuskulär [i.m.]

und Xylaxin 5 mg/kg KM [i.m.]) und Euthanasie (Pentobarbital 100 mg/kg

KM intraperitoneal [i.p.]) der drei Kaninchen und anschließende

Blutentnahme

124 Anhang

10.2 Ergänzendes Material zu Kapitel 5

10.2.1 Overview of viral distribution in C57BL/6-mice infected with the Theiler`s murine encephalomyelitis virus

CNS localisation 4 dpi 7 dpi 14 dpi 28 dpi 56 dpi 98 dpi 196 dpi

IHC - - - - - - - meninx cerebrum ISH - - - - - - - IHC + - - - - - - ependyma cells 1

ISH + - - - - - - IHC - - - - - - - plexus coroideus 1

ISH - - - - - - - IHC + - - - - - - periventricular area 2 ISH + - - - - - - IHC + + - - - - - habenular nucleus 2

ISH + + - - - - - IHC + + - - - - - paraventricular thalamic

nucleus 2 ISH + + - - - - - IHC - - - - - - - caudate putamen 2

ISH - - - - - - - IHC + + - - - - - cerebral cortex

ISH + + - - - - - IHC + + - - - - - corpus callosum

ISH + + - - - - - IHC + + + - - - - hippocampus*

ISH + + + - - - - IHC + + - - - - - thalamus

ISH + + - - - - - IHC + - - - - - - hypothalamus

ISH + - - - - - - IHC - - - - - - - amygdala ISH - - - - - - - IHC - - - - - - - truncus opticus

ISH - - - - - - - IHC - - - - - - - median eminence

ISH - - - - - - - IHC - - - - - - - meninx cerebellum

ISH - - - - - - - IHC + - - - - - - ependyma cells 3 ISH + - - - - - - IHC - - - - - - - plexus coroideus 3

ISH - - - - - - - IHC + - - - - - - periventricular fourth ventricle 4 ISH + - - - - - - IHC - + - - - - - medial longitudinal fasciculus 4 ISH - + - - - - - IHC + - - - - - - prepositus nucleus 4 ISH + - - - - - - IHC + + - - - - - vestibular nuclei 4

ISH + + - - - - - IHC - - - - - - - inferior cerebellar peduncle 5 ISH - - - - - - - IHC - - - + - - - spinal trigeminal tract 5 ISH - - - + - - - IHC - - - + - - - vestibulocochlear

nerve 5 ISH - - - + - - - IHC - - - - - - - nervus fascialis

nucleus 6 ISH - - - - - - - IHC - - - - - - - ventral cochlear

nucleus 6 ISH - - - - - - - IHC - - - + - - gigantocerebellar reticular

nucleus 6 ISH - - - + - - IHC - - - - - - - spinal cord white matter 7 ISH - - - - - - -

IHC: immunohistochemistry; ISH: in situ -hybridization; CNS: central nervous system;

dpi: days post infection; -: no virus detection; +: virus detection

Anhang 125

1 ependyma and plexus coroideus of the third and lateral ventricle; 2 periventricular area of the third and lateral ventricle, including: cerebral white matter

surrounding the ventricles, medial and lateral habenular nuclei, paraventricular thalamic

nucleus and caudate putamen; 3 ependyma and plexus coroideus of the fourth ventricle; 4 periventricular area fourth ventricle including: cerebellar white matter adjacent to the fourth

ventricle, brain stem white matter adjacent to the fourth ventricle, prepositus nucleus, medial

longitudinal fasciculus, lateral vestibular, medial vestibular and superior vestibular nuclei,

vestibular cerebellar and medial cerebellar nuclei; 5 brain stem white matter including: inferior cerebellar peduncle, spinal trigeminal tract and

vestibulocochlear nerve; 6 brain stem grey matter including: nervus fascialis nucleus, ventral cochlear and

gigantocerebellar reticular nuclei; 7 spinal cord white matter including: ventral and lateral funiculus;

* hippocampus including: cornu ammonis 1,2,3, oriens layer, pyramidal cell layer, stratum

radiatum, lacumosum moleculare layer, gyrus dentatus and fimbria of hippocampus.

126 Anhang

10.2.2 Overview of viral distribution in SJL/J-mice infected with the Theiler`s murine encephalomyelitis virus

CNS localisation 4 dpi 7 dpi 14 dpi 28 dpi 56 dpi 98 dpi 196 dpi

IHC - - - - - - - meninx cerebrum ISH - - - - - - - IHC + - - - - - - ependyma cells 1


ISH - - - - - - - IHC + - - - - - - periventricular areas 2

ISH + - - - - - - IHC + - - - - - - habenular nucleus 2

ISH + - - - - - - IHC + - - - - - - paraventricular thalamic

nucleus 2 ISH + - - - - - - IHC - - - - - - - caudate putamen 2 ISH - - - - - - - IHC + + - - - - - cerebral cortex ISH + + - - - - - IHC + + - - - - - corpus callosum

ISH + + - - - - - IHC + + - - - - - hippocampus*

ISH + + - - - - - IHC + + - - - - - thalamus

ISH + + - - - - - IHC + - - - - - - hypothalamus

ISH + - - - - - - IHC - - - - - - - amygdala ISH - - - - - - - IHC - - - - - - - truncus opticus

ISH - - - - - - - IHC - - - - - - - median eminence

ISH - - - - - - - IHC - - - - - - - meninx cerebellum

ISH - - - - - - - IHC + - - - - - - ependyma cells 3


ISH - - - - - - - IHC + + + + + - - periventricular fourth ventricle 4 ISH + + + + - - - IHC - - - + + - - medial longitudinal fasciculus 4 ISH - - - + + - - IHC + - - - + - - prepositus nucleus 4

ISH + - - + + - - IHC - - + + - - - vestibular nuclei 4 ISH - - + + - - - IHC - - - + + - + inferior cerebellar peduncle 5 ISH - - - + + - + IHC - - - + + - + spinal trigeminal tract 5 ISH - - - + + - + IHC - - - + - - - vestibulocochlear nerve 5 ISH - - - + - - - IHC - - - - - - - nervus fascialis

nucleus 6 ISH - - - - - - - IHC - - - - - - - ventral cochlear

nucleus 6 ISH + - - - - - - IHC + - - + + + - gigantocerebellar reticular

nucleus 6 ISH + - - + + + - IHC - - + + + + - spinal cord white matter 7 ISH - - + + + + -

IHC: immunohistochemistry; ISH: in situ-hybridization; CNS: central nervous system; dpi:

days post infection; -: no virus detection; +: virus detection

Anhang 127

1 ependyma and plexus coroideus of the third and lateral ventricle; 2 periventricular area of the third and lateral ventricle, including: cerebral white matter

surrounding the ventricles, medial and lateral habenular nuclei, paraventricular thalamic

nucleus and caudate putamen; 3 ependyma and plexus coroideus of the fourth ventricle; 4 periventricular area fourth ventricle including: cerebellar white matter adjacent to the fourth

ventricle, brain stem white matter adjacent to the fourth ventricle, prepositus nucleus, medial

longitudinal fasciculus, lateral vestibular, medial vestibular and superior vestibular nuclei,

vestibular cerebellar and medial cerebellar nuclei; 5 brain stem white matter including: inferior cerebellar peduncle, spinal trigeminal tract and

vestibulocochlear nerve; 6 brain stem grey matter including: nervus fascialis nucleus, ventral cochlear and

gigantocerebellar reticular nuclei; 7 spinal cord white matter including: ventral and lateral funiculus;

* hippocampus including: cornu ammonis 1,2,3, oriens layer, pyramidal cell layer, stratum

radiatum, lacumosum moleculare layer, gyrus dentatus and fimbria of hippocampus.

128 Anhang

10.3 Bezugsquelle für Reagenzien, Chemikalien und Einmalartikel

AbD Serotec., Oxford, UK Rat anti mouse F4/80, monoclonal IgG2b, MCA497

Rat anti mouse CD107b, monoclonal, clone M3/84, MCA2293T

ABgene® Advanced Biotechnologies, Hamburg, Deutschland „Superladder-Low” (100bp ladder), SLL-100 „6x gel loading buffer” AB-0594

Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Immunbiologische Produkte, Kronshagen, Deutschland Aszitesflüssigkeit von nicht-immunisierten Balb/cJ Mäusen, CL8100

Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland SeaKem® LE Agarose, 840004

Bio-Rad, München, Deutschland 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 (2,6% C), 161-0156

Ammoniumpersulfate, 161-0700

Bromphenol Blue, 161-0404

TEMED N; N, N`, N`- Tetramethylendiamine, 161-0801

Trans Blot® Transfer medium pure nitrocellulose membrane, 162-0115

Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, USA (Vertriebspartner: New England

Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland)

Anti-rabbit, IgG, HRP-linked, 7074

Anhang 129

Chroma GmbH + Co. KG, Münster, Deutschland Kresylechtviolett, 1A 396 Luxolechtblau MBS, 1B 389

DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland (ehemals Dako® Diagnostika

GmbH)

DakoCytomation Pen®, S 2002

GlycergelTM, Eindeckmedium C 0563

Dako® Fluorescent Mounting Medium, S3023

Edeka, Hannover, Deutschland Sucofin Magermilchpulver Fischer, Frankfurt, Deutschland 96-Fachloch-Mikrotiterplatte, Falcon Becton Dickinson, 3072

Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig, Deutschland

SuperFrost®Plus Objektträger, J1800AMNZ

Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland

50 ml Zentrifugenröhrchen, 227261

Hartmann, Heidenheim, Deutschland Pur-Zellin®, Zellstofftupfer, 4 x 5 cm, 1432525

130 Anhang

Invitrogen™ GmbH, Karlsruhe, Deutschland RNAse Out®, 10777-019

TRIZOL®, 15596-026

See Blue Plus® Prestained Standard, LC 5925

Simple Blue Safe Stain®, LC 6060

ZenonTm Alexa Fluor® 488 Mouse IgG1 Labeling Kit from Molecular Probes,

Z25002

Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Suffolk, UK (Vertriebspartner: dianova

GmbH, Hamburg, Deutschland)

CyTm 3-conjucated AffiniPure Goat anti-Mouse IgG (H+L), 115-165-166

CyTm 3-conjucated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 115-165-144

CyTm 2-conjucated AffiniPure Goat anti-Rat IgG, F (ab`) 2, 112-226-072

Knittel W. Glasbearbeitung GmbH, Braunschweig, Deutschland Deckgläser (24 x 50 mm) LINARIS Biologische Produkte GmbH, Wertheim-Bettingen, Deutschland Antibody-Multiplier, Ziege/Kaninchen (ABM-ZK) komplett, A3190VG

Antibody-Multiplier, normal (ABM-N) inkomplett, A3120VG

Macherey-Nagel GmbH & Co KG, Düren, Deutschland

„NucleoSpin® Extract II Kit”, 740609.50

Menno Chemie Vertriebsges. mbH, Noderstedt, Deutschland Venno-Vet 1 super

Millipore GmbH, Schwalbach/Ts. , Deutschland Mouse Anti-CNPase, anti-human IgG1, clone 11-5B, MAB326

Goat anti-Rat IgG, HRP conjugate, AP136P

Goat anti-Mouse IgG, Peroxidase conjugated, H+L, AP124P

Anhang 131

NuncTM, GmbH und Co. KG, Wiesbaden, Deutschland Zellkulturflaschen, 25 cm2: 156367; 75 cm2: 156499

6-Loch-Platte

PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland Dulbeccos modified eagle medium (DMEM), E15-810

Fötales Kälberserum, A11-041

Pferdeserum (unverdünnt), B15-023

Plano, Wetzlar, Deutschland LR-White Harz, R1281

200 Mesh Nickel Trägernetz, G2200N

EM-Goat anti-Rabbit IgG (BBInternational), 10 nm Gold, EM GAR 10

Perbio, Frankfurt, Deutschland Chemiluminescence for Westenblot: Super signal west pico chemiluminescene

Substrate for HRP detection, 34080

Perkin Elmer, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland „GeneAmp RNA PCR Core Kit“, N8080143

Promega GmbH, Mannheim, Deutschland „Random Primers“ 500μg/ml, C1181

Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland Omniscript® RT Kit, 205113

RNase-free DNase-Set, 79254

„RNeasy Lipid Tissue Mini Kit“, 74804

RNeasy Mini Kit, 74104

132 Anhang

R&D Systems, Minneapolis, US Rat IgG1 Isotype Control, clone 43414, MAB005

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland Anti-Digoxigenin-AP, “Fab fragments”, vom Schaf, 1093274

DNase I, RNase-frei, 776785

DIG RNA Labeling Mix, 10 x konz., 1 277 073

Proteinase K 5 ml, 1373196

Restriktion Endonuklease Eco RI, 1175084

RNase, DNase-frei, 1119915

RNase T1, 109207

T 3-RNA-Polymerase, 1 031 163

T 7-RNA-Polymerase, 881 767

Roth C. GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland Chloroform Rotipuran®, 3313.1

Ethylendiamin-tetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (di-Natrium-EDTA-

dihydrat; MW 372,24), 8043.2 Essigsäure-n-butylester (EBE), 4600.7

Ethanol Rotipuran®, 9065.2

Ethanol, vergällt, K928.2

Hämalaunlösung sauer nach Mayer, T865.2

Natriumhypochlorit-Lösung, 9062.1

2-Propanol Rotipuran® (Isopropanol), 6752.2

Roti®-Histol (Xylol-Ersatz), 6640.2

Roti®-Histokitt II, T160.1 Rotiprotect®-Nitrilhandschuhe, P777.1

D (+)-Saccharose, Sucrose minimum 99,5%, p.a., 4621

Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Niederlande Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound, 4583

Anhang 133

Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland

Serumröhrchen 10 ml, 26.367

Serva, Heidelberg, Deutschland Tween® 20 pure, 37470

SeqLab, Göttingen, Deutschland Sequenzierung von PCR-Produkten

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland Anti-GFAP-Antikörper, monoklonal Maus anti-pig IgG, Klon G-A-5, G3893 Azeton, 24201

Bisbenzimide H33258, B 2883

Borsäure (MW 61,83), B6768

Bovines Serumalbumin (BSA), A3059

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphat (X-Phosphat) 500 mg, B6777

“Deoxyribonucleic acid type XIV from Herring testes“(ssDNS) 250 mg, D689

Parafilm M, P-7543

Dextransulfat, Na-Salz aus Leuconostoc 10 g, 31403

3, 3`-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB)-Dihydrat purum p.a., 32750

Diethylpyrocarbonat (DEPC) 100 ml, 32490

N, N-Dimethylformamid, D4551 Ethidiumbromid-Lösung 10mg/ml, E1510

Kodak®, X-Omat AR Film, XAR-5, Size: 8 in. X 10 in., F5513-50EA

Lektin aus Bandeiraea simplicifolia BS-1 (biotiniliert), L3759

Levamisol, L9756

Lithiumcarbonat, 13010

2-Mercaptoethanol, M3148

“Nitro Blue Tetrazolium“(NBT) 1 g, N6639

Paraformaldehyd (PFA), 76240

134 Anhang

Piperazin-N, N`-bis(2-ethansulfatsäure) di-Natrium Salz (PIPES) 25 g, P3768

Polyvinylpyrrolidone (PVP), P5288

Normales Schafserum, steril, S2263

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für kleine Klauentiere, Hannover, Deutschland Ziegenserum

Ssniff Spezialitäten GmbH, Soest, Deutschland ssniff bedding ¾ Faser, H1505-05

ssniff Kaninchen Erhaltungsfutter, 39494

Stratagene® Europe, Amsterdam, Niederlande „Brilliant® SYBR® Green QPCR Core Reagent Kit“, 600546

Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien Neoplus Einwegkanülen 22-G x 1 ¼ “ (0,7 x 30 mm) Luer

Neoplus Einwegkanülen 24-G x 1“ ( 0,55 x 25 mm) Luer

Neoplus Einwegkanülen 25-G x 1“ (0,5 x 16 mm) Luer

TPP AG, Trasadingen, Switzerland 96- Well- Microtiterplatte, ISO 9001, 92096

Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA, über Biologo, Kronshagen Biotiniliertes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, BA 1000

Vectastain Elite ABC-Kit, PK-6100

VOKO Bürozentrum, Gießen, Deutschland

Fixogum, “Rubber Cement“, Marabu

Anhang 135

VWR TM International GmbH, Darmstadt (ehemals Merck KGaA, Darmstadt), Deutschland

Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2 2 H2O), 1.02382.0500

Eosin (gelblich), 1.15935.0100 Formaldehydlösung, mind. 37%., 1.03999.2500

Formamid p.a., 1.00983

Glycin, p.a., 1.04201.1000

Hämatoxylin, krist., 1.15938.0100

Kaliumchlorid (KCl), p.a., 1.04936.0500

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) p.a., 1.04873.0250

Lithiumchlorid Lösung 8M, 50 ml, 62479

Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2 6 H2O), 1.05833.1000

Natriumchlorid (NaCl), reinst, 1.06400.1000

di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 2 H2O), p.a., 1.06580.1000

Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) p.a., 1.06498.1000

Natronlauge (NaOH) p.a., 1.09137

Salzsäure (HCL) 2 N, 1.09063.1000

Salzsäure 25%, reinst, 1.00312.2500

Triethanolamin (TEA), p.a., 1.08379.0250 Tris (hydroxymethyl) -aminomethan (MW 121, 14), 108386

Triton® X-100, p.a., 1.08643

Wasserstoffperoxid 30% H2O2 (Perhydrol®) p.a., 1.07209.0250

Xylol, reinst, 1.08685

WDT Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG, Garbsen, Deutschland

Ketamin 10%, Ketamin 100 mg/ml

136 Anhang

10.4 Bezugsquellen für die Tiere Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland weibliche, SPF-freie New Zealand White (NZW) Kaninchen, 2.00-2.49 Kg

weibliche, SJL/J HanHsd-Mäuse, 3-4 Wochen alt

weibliche, C57BL/6-Mäuse, 3-4 Wochen alt

10.5 Bezugsquellen für Geräte Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, US

Adobe® Photoshop® 7.0

Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland

Spektralphotometer GeneQuant™ II

Applied Biosystems, Foster City, CA, US

Voyager-DE-Pro Biospectrometry Workstation

Beckman, München, Deutschland Ultrazentrifuge Optima LE-80 K mit Rotor SW 32 u. SW 55

Kühlzentrifuge J2-21 mit Rotor JS 13 Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen, Deutschland

BioDocAnalyse video

Anhang 137

Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland Gelbond® Film, 863748

Multicycler® PTC 200

Pipettenspitzen SafeSeal-Tips Premium 10µl, 693010





Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland

PCR-Gefäß 0,5ml, 781310

Consort N.V., Turnhout, Belgien

Mikrocomputer "Elektrophoresis Power Supply", E 425

Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Elektrophorese-Netzgerät Typ 143, P004.1

Gelgießmodul, Y008.1

Glasplatten, 0513.1

Kämme (0,75 mm Dicke, 12 Taschen), N640.1

Laufmodul, Y007.1

MINI-Blotingmodul, 0666.1

MINI-Vertikal-Doppel-Elektrophorese-Kammer, Y001.1

Ohrenglasplatten, 0520.1

Spacer (0,75 mm Breite), N624.1

Zählkammer nach Neubauer CE, T 728.1

138 Anhang

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Eppendorf Zentrifuge 5417 R

Pipette Research® 20 μl

Pipette Research® 200 μl

Pipette Reference® 10 μl



GE Healthcare Life Sciences, Freiburg, Deutschland (ehemals Amersham

Biosciences Europe GmbH)

Spektralphotometer GeneQuant™ pro

IKA®-Labortechnik, Staufen, Deutschland Vortexer VF2

Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold, Deutschland Heraeus Wärmeschrank UT 6

Heraeus Biofuge 13

Heraeus LaminAir® Sterilwerkbank, HLB 2472 GS

Keutz Laborgeräte, Reiskirchen, Deutschland

Flachgel-Elektrophoresekammer "Midi", horizontal, 0030191-00

Gießvorrichtung, 0030191-03

Konica Minolta Photo Imaging Europe GmbH, Unterföhring, Deutschland

MINOLTA DiMAGE Scan Multi Pro

Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Deutschland

Färbegerät Leica ST 4040

Anhang 139

Leica, Wetzlar, Deutschland

Leica TCS SP5 konfokales Lasermikroskop

63x/1.20 HCX PL-APO CS

Leica application suite advanced fluorescence (LAS AF)

Medite Medizintechnik, Burgdorf, Deutschland Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000

Memmert GmbH + Co. KG, Schwalbach, Deutschland Wasserbad WB22

Wasserbad WB45

Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Deutschland Laborwaage PC180 Präzisionswaage LabStyle 204

Microm, Heidelberg, Deutschland

Microm HM500

New Brunswick Scientific GmbH, Nürtingen, Deutschland Innova 2000, Plattformschüttler

Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland Exposure Control Unit PM30 Mikroskop IX 70 Netzmikrometerplatte U-OCMSQ 10/10, 034077

Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Deutschland

analySIS® 3.1.

Cell_D images software

140 Anhang

Olympus Optical Co. (Europe) GmbH, Hamburg, Deutschland Olympus BX-51 digitales Mikroskop

Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland

Mikrozentrifuge MC210

Polaroid, Massachusetts, USA

Kamera MP 4

Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschand Reaktionsgefäß 1,5 ml, 72.690

Reaktionsgefäß 2,0 ml, 72.695

Zellschaber, 83.1830

Sartorius AG, Göttingen, Deutschland Elektronische Präzisionswaage L310, WL-6006-m88091

Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland Parafilm M, P-7543

Stratagene® Europe, Amsterdam, Niederlande

Mx3005P™ QPCR System

Optical cap 8x Strip, 401425

Strip tube 8x 0,2 ml Format, 401428

Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting, Deutschland PCR Tissue Homogenizing Kit; Omni TH220 Homogenisator

Wechselspitzen; Omni Tip® Standard

Systec GmbH, Wettenberg, Deutschland Autoklav 3850 ELC

Anhang 141

Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg, Deutschland Edelstahl-Gestell Size: P, Typ 4541P, 4P02B700

Käfigschale aus Noryl, 4541P009

Kotschale aus Noryl, 4501K389

Edelstahl-Futterautomat, 4401S960

Zweite Ebene aus Noryl, 4541P610

Tränkeflaschen 750 ml, ACBT0752

Tränkeklappe mit 30° gebogenem Nippel, ACCPS1246

Vertikaler Edelstahl-Flaschenhalter, ACSAV309

Thermo Fisher Scietific, Langenselbold, Deutschland (ehemals Abgene®

Advanced Biotechnologies, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH und

NuncTm GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Deutschland; Vertriebspartner: LAT-Labor-

und-Analyse-Technik GmbH, Garbsen, Deutschland und Omnilab-Laborzentrum

GmbH & Co KG, Gehrden, Deutschland) Heraeus Wärmeschrank, UT 6

Heraeus Wärmeschrank, ST6200

Heraeus Wärmeschrank, B6030

Heraeus Zentrifuge Biofuge 13 Heraeus LaminAir® Sterilwerkbank, HLB 2472 GS

Nunc EasYFlasks™ Nunclon™ Δ, 156367

Tierärztebedarf J. Lehnecke GmbH, Schortens, Deutschland Zählkammer Neubauer 3711-62-06

VWR TM International GmbH, Darmstadt, Deutschland (ehemals Merck KGaA,

Darmstadt) Test Tube Shaker, MELB 1719

142 Anhang

Zeiss, Oberkochen, Deutschland Zeiss Axiophot Mikroskop

Zeiss EM 10C

Ziegra-Eismaschinen GmbH, Isernhagen, Deutschland Eismaschine ZBE 70-35

10.6 Lösungen und Puffer

10.6.1 Zellkultur

Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) 40 g Natriumchlorid (NaCl)

1 g Kaliumchlorid (KCl)

1 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)

3, 823 g Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat (Na2HPO4xH2O)

Mit destilliertem Wasser (dH2O) auf 5000 ml auffüllen. Währenddessen den

pH-Wert auf 7,22 einstellen und anschließend sterilfiltrieren. Trypanblaulösung (0,2%) 200 mg Trypanblau in 100 ml PBS lösen.

Sterilfiltrieren und bei 4°C lagern.

Anhang 143

Puffer für die Proteinextraktion Nonidet® P40 Lysispuffer

4 ml 1 M NaCl

50 ml Nonidet® P40 (10%)

2 µl 0,5 M Ethyldiamintetraessigsäure (EDTA)

100 µl 1 M Tris (pH 7,5)

500 µl 0,2 M Natriumfluorid (NaF)

50 µl 0,2 M Natrium-Orthovanadat (Na3VO4)

1 ml Glycerol

400 µl Protease Inhibitor

Saccharose-Gradient für die Virusreinigung 60%ige Saccharose-Lösung: 6 g Saccharose zu 4 ml PBS

50%ige Saccharose-Lösung: 5 g Saccharose zu 5 ml PBS



10.6.2 Immunfluoreszenz Herstellung des Paraformaldehyds zur Zellfixierung Material Lösung A: 0,2 M NaH2PO4 (24 g in 1000 ml Aqua bidest.)

Lösung B: 0,2 M Na2PO4 (28,4 g in 1000 ml Aqua bidest.)

Paraformaldehyd, reinst

Saccharose (für eine bessere Zellerhaltung)

Herstellung Aqua bidest (60 °C) 25 ml

Paraformaldehyd 2 g

NaOH (1N) 1-2 Tropfen

Auf einem heizbaren Rührer mischen bis Lösung klar

144 Anhang

Lösung B 20 ml

Lösung A 5 ml

Saccharose 2 g

pH-Wert überprüfen (7,4)

vor Anwendung auf 37° C erhitzen.

Lagerung: Bei 4 °C bis zu einer Woche zu lagern, bei kritischen Anwendungen frisch (direkt vor Gebrauch) zubereiten! Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) Siehe unter Zellkultur PBS mit 0,25% Tween (PBST) 40 g NaCl

1 g KCl

1 g KH2PO4 x H2O

3,823 g Na2HPO4 x H2O

12,5 ml Tween

Mit dH2O auf 5000 ml auffüllen. Währenddessen den pH-Wert auf 7,22

einstellen.

10.6.3 Western Blot

Lösungen für die Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Tris/SDS, pH 6,8 (für das Sammelgel und den Probenpuffer) 6,05 g Tris Base vorlegen.

Mit dH2O auf 40 ml auffüllen und den pH-Wert auf 6,8 einstellen.

Mit dH2O auf 100 ml auffüllen und filtrieren.

4 ml 10%iges SDS zufügen.

Anhang 145

Bei 4°C aufbewahren.

Sammelgel Für 2 Minigele mit einer Dicke von 0,75 mm:

650 µl 30% Acrylamide/0,8% Bisacrylamide

1250 µl Tris/SDS pH 6,8

3050 µl dH2O

50 µl 10% Ammoniumpersulfat

50 µl Bromphenolblau

10 µl N; N, N`, N´- Tetramethylendiamin (TEMED)

Durch leichtes Schwenken mischen und ohne Blasenbildung bis ca. 2 cm

unterhalb des oberen Randes der zusammengebauten Glasplatten zwischen

die Glasplatten gießen. Mit Isopropanol überschichten. Gel für 15 Minuten

polymerisieren lassen. Isopropanol abgießen und mit dH2O gut spülen.

Tris/SDS, pH 8,8 (für das Trenngel) 91 g Tris Base vorlegen.

Mit dH2O auf 300 ml auffüllen und den pH-Wert auf 6,8 einstellen.

Mit dH2O auf 500 ml auffüllen und filtrieren.

20 ml 10%iges SDS zufügen.

Bei 4°C aufbewahren.

Trenngel Für 2 Minigele mit einer Dicke von 0,75 mm:

2528 µl 30% Acrylamide/0,8% Bisacrylamide

1896 µl Tris/SDS pH 8,8

3160 µl dH2O

50 µl 10% Ammoniumpersulfat

10 µl TEMED

Sammelgel-Lösung über das polymerisierte Trenngel schichten, den Kamm

Einsetzen und das Gel erhärten lassen.

146 Anhang

Probenpuffer (6x) 7 ml Tris/SDS pH 6,8

0,6 ml 2-Mercaptoethanol

1,2 mg Bromphenolblau

3 ml Glycerol

1 g SDS

Für den Gebrauch 1:6 mit dem Proteinextrakt verdünnen.

SDS- Laufpuffer (10x) 30,2 g Tris Base

144 g Glycine

100 ml 10%iges SDS

Mit dH2O auf 1000 ml auffüllen.

Bei 4 °C aufbewahren.

Für den Gebrauch 1:10 mit dH2O verdünnen.

Lösungen für das Blotten Transfer Puffer 10x 30,3 g Tris Base

144 g Glycine


Für den Gebrauch 100 ml Transfer Puffer (10 x ) mit 200 ml Methanol

sowie 700 ml dH2O vermischen. Auf Eis bis zum direkten Verbrauch lagern.

Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) 500 ml 1 M Tris (pH 7,5)

45 g NaCl


TBS mit Tween (TBST)

Anhang 147

500 ml 1 M Tris (pH 7,5)

45 g NaCl

2,5 ml Tween 20


TBST mit 5% Magermilch 10 ml TBST

0,5 g Magermilchpulver Durch Filterpapier filtrieren. Stets frisch ansetzen. 10.6.4 Histologie

Luxol-Fast-Blue Kresylechtviolett-Färbung Markscheidenfärbung nach Klüver und Barrera (Romeis,1989):

Luxol-Fast-Blue-Lösung:

0,1 g Luxol Fast Blue / 100 ml abs. Ethanol und 0,5 ml 10 %ige Essigsäure

Kresylechtviolett-Lösung:

0,1 g Kresylechtviolett / 100 ml Aqua dest.

kurz vor Gebrauch 5 Tropfen 10 %ige Essigsäure auf 30 ml Farblösung

0,05 %ige Lithiumcarbonatlösung

10.6.5 Immunhistologie

DAB-Lösung

100 mg DAB in 200 ml PBS, pH 7,1 lösen und mischen (Magnetrührer),

anschließend filtrieren und 200 µl H2O2 (30 %) zugeben

0,5 %iges H2O2 in Methanol

148 Anhang

3ml 30% iges H2O2 in 200 ml Methanol geben und auf dem Magnetrührer

mischen

Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)

40 g NaCl und 8,97 g NaH2PO4 in 5 Litern Aqua dest. auflösen und mit 1 M

NaOH auf pH 7,1 einstellen

10.6.6 RNS-Isoliereung, PCR und Sondensynthese Aqua Diethylpyrokarbonat (DEPC)-behandelt

1 ml DEPC-Reinsubstanz mit Aqua bidest. auf 1000 ml auffüllen und schütteln.

16- 24 Stunden bei Raumtemperatur unter einem Abzug stehen lassen

(Magnetrührer), danach autoklavieren

2 %iges, ethidiumbromidhaltiges Agarosegel (104,3 cm2)

1,82 g Agarose werden in einem Glaskolben in 91 ml TBE-Puffer in der

Mikrowelle aufgekocht. Danach bis auf 64°C abkühlen lassen, 1,8µl

Ethidiumbromidlösung hinzufügen, mischen, in Gießkammer blasenfrei

ausgeben und erstarren lassen.

0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0

18,6 g di-Natrium-EDTA-dihydrat (MW 372,31; entspricht 4,6 g EDTA) in 60 ml

DEPC-Aqua bidest. lösen (Magnetrührer), mit 5 M NaOH auf pH 8,0 einstellen,

mit DEPC-Aqua bidest auf 100 ml auffüllen und autoklavieren.

10 x TBE-Elektrophoresepuffer (Stammlösung) 108,8 g Tris(hydroxymethol)-aminomethan (MW 121,14),

55,0 g Borsäure (MW 61,83)

40,0 ml 0,5 M EDTA-Na2 (pH 8,0)

mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen (Magnetrührer) und autoklavieren.

Anhang 149

1 x TBE-Elektrophoresepuffer (Gebrauchslösung)

100 ml 10 x TBE-Puffer

900 ml Aqua dest.

0,2 M EDTA-Na2, pH 8,0 0,4 ml 0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0

0,6 ml A.bidest.-DEPC 4 M Lithiumchloridlösung 0,5 ml 8 M Lithiumchloridlösung

0,5 ml A.bidest.-DEPC

10.6.7 in situ-Hybridisierung

Alle Lösungen und Puffer werden, soweit nicht anders angegeben, autoklaviert (20

Minuten bei 121°C und 210 kPa). Prähybridisierungspuffer, Hybridisierungspuffer

und deren einzelne Bestandteile werden nicht autoklaviert, sondern von vornherein

RNase-frei hergestellt.

Aqua Diethylpyrokarbonat (DEPC)-behandelt 1 ml DEPC-Reinsubstanz mit Aqua bidest. auf 1000 ml auffüllen und schütteln.

16- 24 Stunden bei Raumtemperatur unter einem Abzug stehen lassen

(Magnetrührer), danach autoklavieren

Aqua bidest. steril A. bidest in sterile Flaschen füllen

5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (X-Phosphat, BCIP) 50 mg/ml (Stammlösung)

500 mg X-Phosphat

10 ml 100%iges Dimethylformamid

entspricht Stammlösung mit 50 mg/ml Endkonzentration

in Originalpackung ansetzen, aufbewahren bei -20°C

150 Anhang

0,1 M CaCl2 1,47 g CaCl2 (MW 147,02)

100 ml A. bidest.

0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0 18,6 g di-Natrium-EDTA-di-Hydrat (MW 372,31)

60 ml A. bidet.-DEPC

mit 5 N NaOH auf pH 8,0 einstellen, auf 100 ml auffüllen

50 x Denhardts 5 g Ficoll

5 g Polyvinylpyrolidone

5 g bovines Serumalbumin

500 ml A. bidest.-DEPC

in 50 ml Aliquots abfüllen und bei -20 °C lagern

steril herstellen, nicht autoklavieren

0,2 %iges Glycin in 1 x PBS 1g Glycin

500 ml 1 x PBS, pH 7,4

Lagerung bei 4°C

Heringssperma-DNS (ssDNS)-Lösung, 10 mg/ml in Originalpackung Lyophilisat mit Puffer 4, pH 8,0 lösen

bei 250 mg Lyophilisat hinzufügen von 25 ml Puffer 4 (Endkonz. 10 mg/ml)

Lagerung bei 4 °C, nicht autoklavieren

Hybridisierungs-Puffer (steril herstellen) 16 ml 100%iges Formamid, deionisiert

8 ml 20 x Hybridisierungssalze

Anhang 151

3,2 ml 50 x Denhardts

320 µl Heparin

320 µl 10%iges Triton X-100

aliquotieren in 40 Aliquots a 696 µl, Lagerung bei -20°C, nicht autoklavieren

im Versuch je Aliquot hinzufügen:

18 µl RNS-Lösung

20 µl ssDNS-Lösung

80 µl Dextransulfat

200 ng/ml RNS-Sonde

gesamten Ansatz inkl. Sonde für 5 Minuten kochen und danach auf Eis

20 x Hybridisierungssalze 10 ml 0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0

10 ml 0,5 M PIPES, pH 7,0

30 ml % M NaCl

1 M MgCL2 20,33 g Mg Cl2 (Hexahydrat, MW 203,3)


steril filtrieren, nicht autoklavieren (Mg Cl2 fällt sonst aus)

NaCl 5 M: 29,22 g NaCl (MW 58,44)

100 ml A. bidest.

3 M: 87,66 g NaCl (MW 58,44)

500 ml A. bidest.

5 N NaOH

20 g NaOH-Plätzchen (MW 40)

100 ml A. bidest.

152 Anhang

Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) 75 mg/ml (Stammlösung)

1 g NBT

13,3 ml 70%iges Dimethylformamid (14 ml 100%igesDMF + 6 ml A. bidest.)

entspricht Stammlösung mit 75 mg/ml Endkonzentration

in Originalpackung ansetzen, aufbewahren bei 4 °C

4 %iges Paraformaldehyd (PFA), pH 7,35-7,4 40 g Paraformaldehyd

100 ml 1 x PBS, pH 7,4

CAVE, mit Atemmaske unter dem Abzug argeiten, rührend auflösen bei ca.

60 °C, pH auf 7,35-7,40 einstellen, nicht autoklavieren, kann bis zu 4 Wochen

aufbewahrt werden

10 x PBS („Phosphat buffered saline“)-Puffer (Stammlösung)

80,0 g NaCl

2,0 g KCl

14,4 g Na2HPO4

2,4 g KH2PO4

ad 1000 ml A. bidest.

1 x PBS, pH 7,4 (Gebrauchslösung)

100 ml 10 x PBS

900 ml A. bidest., erst dann pH auf 7,4 einstellen

1 x PBS + 5 mM MgCl2 100 ml 10 x PBS

5 ml 1 M MgCl2 (steril filtriert)


steril filtriert (auf Vorrat)

im Versuch frisch angesetzt:

6 ml 10 x PBS

300 µl MgCl2 (steril filtriert)

Anhang 153


0,5 M Piperazin-N,N`bis (2-ethansulfatsäure) (PIPES), pH 7,0 8,6575 g PIPES (MW 346,3)


steril herstellen, nicht autoklavieren

Prähybridisierungs-Puffer (steril ansetzen)

450 ml 20 x SSC

675 ml 100 %iges Formamid, deionisiert

150 ml 50 x Denhardts


entspricht insgesamt 30 Aliquots mit 49,5 ml, Lagerung bei -20°C, nicht autoklavieren

im Versuch je Aliquot hinzufügen:

0,5 ml ssDNS-Lösung (zuvor 5 Minuten auf 95°C erhitzen und auf Eis

abschrecken)

1,25 ml RNS-Lösung

Puffer 1, pH 7,5 12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,44)

8,77 g NaCl (MW 58,44)

1000 ml A.bidest.

pH-Einstellung mit konzentrierter HCl unter dem Abzug

Puffer 3, pH 9,5 12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,44) 5,84 g NaCl

1000 ml A. bidest., auf pH von 9,5 einstellen, autoklavieren

im Versuch frisch angestzt:

2,03 g MgCl2+H2O

200 ml Stammlösung Puffer 3

154 Anhang

Puffer 4, pH 8,0 1,21 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,44)

0,37 g EDTA-Na2 (MW 372,3)

1000 ml A. bidest.

Ribonukleinsäure (RNS)-Lösung, 10 mg/ml in Originalverpackung Lyophilisat mit A. bidest.-DEPC lösen

bei 250 mg Lyophilisat hinzufügen von 25 ml A. bidest.-DEPC

(Endkonzentration 10 mg/ml), Lagerung bei -20°C, nicht autoklavieren

20 x SSC („standard saline citrat“), pH 7,0 (Stammlösung)

175,3 g NaCl

88,2 g Na-Citrat (Tri-Natrium-Di-Hydrat)

ad 800 ml A. bidest.

mit 1 N HCL auf pH 7,0 einstellen, auf 1000 ml auffüllen 2 x SSC + 5 mM EDTA-Na2

50 ml 20 x SSC

5 ml 0,5 M EDTA-Na2

500 ml A. bidest.-DEPC 1 M Tris-HCL, pH 8,0 12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,44)

100 ml A. bidest.

pH mit konzentrierter HCl einstellen

im Versuch werden folgende Lösungen stets frisch angesetzt (alle Angaben

beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Volumen einer vollen

Standküvette, 60 ml):

Anhang 155

Antikörper-Lösung (3 ml-Ansatz ; 1 :200)

3 ml Puffer 1 * 31 µl normales steriles Schafserum *

94 µl 10%iges Triton X-100 * * bei 37°C vorinkubieren

unmittelbar vor Gebrauch Zugabe von:

15 µl Anti-DIG-Antikörper, AP konjugiert

0, 25%iges Azetanhydrid in 0, 1 M Triethanolamin, pH 7,5 894 mg Triethanolamin


pH auf 7,5 einstellen

150 µl Azetanhydrid unmittelbar vor Inkubation zugeben und 60 sec. Rühren Dextransulfat-Lösung 250 mg Dextransulfat

400 µl A. bidest.-DEPC

in 1,5 ml Eppendorf-Hütchen geben und im ca. 70°C warmen Wasserbad

lösen Färbelösung (50 ml)

225 µl NBT (Stammlösung)

175 µl X-Phosphat (Stammlösung)

12 mg Levamisol

50 ml Puffer 3, bis zum unmittelbaren Gebrauch mit Alufolie abdunkeln Proteinase K-Lösung 1 ml 1 M Tris-HCL, pH 8,0 *

1 ml 0,1 M CaCl2 *

60 ml A. bidest.-DEPC * * bei 37°C vorinkubieren unmittelbar vor Gebrauch Zugabe von:

4,3/3,9 µl bzw. 21,5/19,5 µl Proteinase K (14,0/15,6 mg/ml)

156 Anhang

(Endkonzentration 1 bzw. 5 µg Prot. K/ml Verdaulösung)

Puffer 2 (Blockierungsreagenz) 1,2 ml normales steriles Schafserum

1,8 ml 10%iges Triton-X-100 (autoklaviert)

60 ml Puffer 1 RNase-Lösung 10 ml 3 M NaCl *

600 µl 1 M Tris-HCL, pH 8,0 *

120 µl 0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0 *

49 ml A.bidest. (steril) * * bei 37 °C vorinkubieren

unmittelbar vor Gebrauch Zugabe von:

15 µl RNase, DNase frei (RNase A)

10 µl RNase T 6 x SSC + 45% Formamid, 120 ml

36 ml 2 x SSC

54 ml 100%iges Formamid, nicht ionisiert

30 ml A. bidest. (steril)

10.6.8 Elektronenmikroskopie

PBS: NaCl 8,766 g

Na2HPO4 (wasserfrei) 1,478 g

KH2PO4 0,430 g

Aqua bidest. 1000 ml

Alles gut mischen, dass die Salze gut gelöst sind, anschließend pH-Wert auf 7.6

einstellen.

Anhang 157

Inkubationspuffer: BSA 2,5 g

Cold water fish skin (CWFS)-Gelatine 0,5 ml

PBS 500 ml

0.1 M Glycine in 0.1 M PBS: Glycine 0,075 g

PBS 50 ml

2 % Glutaraldehyd in PBS: 25 % Glutaraldehyd 8 ml

PBS 92 ml

158 Anhang

11 Abkürzungen Abb. Abbildung

ABC avidin-biotin-peroxidase-complex

Aqua dest. Aqua destillata

Aqua bidest. Aqua bidestilla

BHK21 -Zellen permanente Fibroblastenzelllinie aus Babyhamsternieren

BSA bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

°C Celsius

C57BL/6-Mäuse C57 black-6-Mäuse

ca. circa

CD Cluster of differentiation

CDV canine distemper virus

CNS central nervous system

DA Daniel`s Stamm

DAB 3’3’Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid

DEPC Diethylpyrokarbonat

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium

dpi days post infection

DTH delayed type hypersensitivity

EAE Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis

EDTA Dinatriumethylendiamintetraessigsäure

ETS E twenty-six (avian retrovirus)

Fig. Figure

FIV Felines Immundefizienz-Virus

Anhang 159

g Gramm

GFAP glial fibrillary acidic protein

GMP genome maintenance protein

H2O Wasser

H2O2 Wasserstoffperoxid

HE Hämatoxylin-Eosin

i.c. intra cerebral

Ig Immunglobulin

IHC immunohistochemistry (Immunhistologie)

IFN-γ Interferon -γ

IL Interleukin

i.m. intra muskulär

i.p. intra peritoneal

IRES internal ribosome entry site

ISH in situ-hybridisation (in situ-Hybridiserung)

kDa Kilo-Dalton

LD 50 letale Dosis 50

LFB-CV Luxol Fast Blue-Kresylecht Violett

L/ L*-Protein leader-Protein

LCMV Lymphozytäres Choriomeningitis Virus

M Molarität

MAG Myelin-assoziiertes Glykoprotein

MBP basisches Myelinprotein

MHC major histocompartibility complex

MHV murines Hepatitisvirus

Min. Minuten

160 Anhang

ml Milliliter

MOG Myelin-Oligodendrozyten Glykoprotein

MOI multiplicity of infectivity

mRNS messenger RNS

MS Multiple Sklerose

MSRV MS-assoziiertes Retrovirus

µl Mikroliter

µm Mikrometer

N. Nervus

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxid

NBT Nitroblau-Tetrazoliumchlorid

NK natürliche Killerzelle

nm Nanometer

Nr. Nummer

ORF open reading frame

PBS phosphate buffered saline

PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

PD-1 programmed cell death-1

PFA Paraformaldehyd

PFU plaque forming units

p.i. post infectionem

PNS peripheres Nervensystem

PLP Myelin Proteolipid Protein

PVI perivascular infiltrate

PVR Poliovirusrezeptoren

Anhang 161

RNA ribonucleic acid

RNS Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

RT- PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

SDS Natriumdodecylsulfat

SJL/J-Mäuse Swiss Jim Lambert-Mäuse

SLAM signaling lymphocyte activation molecule

SPF spezifisch-pathogen frei

SSC standard saline citrat

Tab. Tabelle

TEMED Tetramethylendiamin

TGF-ß transformierender Wachstunsfaktor –ß

TLR toll-like Rezeptor

TME murine Theilervirus-Enzephalomyelitis

TMEV murines Theiler-Enzephalomyelitisvirus

TNF-α Tumor Nekrose Faktor-α

TO-Stämme Theiler´s original strains

TschG Tierschutzgesetz

VP 1 virales Kapselprotein 1




z.B. zum Beispiel

ZNS Zentrales Nervensystem

ZPE zytophatischer Effekt

162 Danksagung

12 Danksagung

An erster Stelle gilt mein besonderer Dank Herrn Prof. Dr. Andreas Beineke für die

Bereitstellung des interessanten und umfassenden Themas sowie für seine

ausgezeichnete, fachkompetente Betreuung, die hervorragende methodische und

inhaltliche Unterstützung bei der Fertigstellung dieser Arbeit und stets freundliche

Zusammenarbeit.

Ein großes Dankeschön geht an Herrn Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D. für

seine stets motivierende, kompetente und konstruktive Unterstützung bei der

Anfertigung dieser Arbeit.

Danuta Waschke und Julia Schirmeier gilt mein Dank für die geduldige Einführung in

die Arbeitsmethoden der Zellkultur und ihre ständige Hilfsbereitschaft.

Bettina Buck, Kerstin Rohn, Petra Grünig und Kerstin Schöne danke ich für diverse

Paraffinschnitte und Routinefärbungen und für ihre zahlreichen Hilfestellungen.

Bei Frau Martina Kaps aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover möchte ich mich für gute und zuverlässige Zusammenarbeit bei der

Virusaufreinigung am Anfang dieser Arbeit bedanken.

Meinen beiden Kollegen Mihaela und Robert Kreutzer gilt mein Dank für die

praktische Hilfe bei der Massenspektrometrie und bei der Durchführung der

konfokalen Lasermikroskopie.

Vielen lieben Dank der gesamten „Theiler-Arbeitsgruppe“ des Institutes für

Pathologie für unzählbare kleine und große Ratschläge und die unermütliche

Unterstützung.

Danksagung 163

Ein sehr herzliches Dankeschön geht an meine Zimmergenossen aus dem zweiten

Stock, Patricia und Susi sowie Enzo und Mahela, für das so entspannte Arbeitsklima,

die aufmunternden Gespräche und stets fröhliche Büroatmosphäre.

Bei Patricia, Dorothee und Kathrin, möchte ich mich besonders für die zahlreichen

unvergesslichen Kaffeepausen sowie lustigen Spieleabende nach der Arbeit

bedanken.

Ich möchte mich bei allen „Schreibkräften“ für viele spaßige, auch intensive,

manchmal anstrengende Vormittage in der Halle sowie Nachmittage im Sekretariat

bedanken. Nach dem Motto: „einmal Tüte, immer Tüte!“

Danke sveKlein(77) für die „Novell Netware Messages“, die immer zum richtigen

Zeitpunkt für meine Heiterkeit und Ermunterung sorgen.

Vielen lieben Dank spreche ich meiner Kollegin und Freundin Henrike aus, für

erholsame Momente in Büsum und gemütliche, aufmunternde Teestunden in

Hannover.

Dankeschön außerdem an alle namentlich nicht aufgeführten Kollegen und

technischen Mitarbeiter aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover für das tolle Arbeitsklima und die zahlreichen Hilfestellungen.

Danken möchte ich an dieser Stelle allen Laufkameraden, die an mich geglaubt

haben und mit mir unzählige, stets fröhliche Laufrunden absolviert haben.

Eike, lieben Dank, für deine Hilfe beim „Feinschliff“ meiner Arbeit, danke, dass es

dich gibt.

Meinen Eltern danke ich in besonderem Maße für den Rückhalt in allen Lebenslagen

sowie die unermüdliche emotionale und finanzielle Unterstützung meiner Pläne.

Date post:	25-Feb-2021
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Diss Kummerfeld Version 16.11.2010 - TiHo Hannover...Generation and characterisation of a polyclonal...

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