Die stationäre Phase:

Liganden für den Reversed-Phase Modus

Granick Research Group

University of Illinois at Urbana-Champaign

Wassertropfen auf

einer C18-Lage

1

Nachdem man sich für das optimale Basismaterial für die jeweilige Applikation

entschieden hat, muss man nun den geeigneten funktionellen Liganden

finden. Diese Wahl hat einen großen Einfluss auf die Selektivität der Trennung.

Wahl der Partikeltechnologie:

• Vollporös

• Core-Shell

• Monolithischer Stab

• UHPLC

Wahl des Liganden:

• Alkylphasen

• Phenylphasen

• Polar-embedded Phasen

• Polar-endcapped Phasen

Auflösung (

R)

Liganden / gebundene Phasen

2

Alkylphasen (C18, C8, C4):

Phenylphasen (Phenyl, PFP):

F F

F

FF

Polar-embedded Phasen:

Fusion

Polar-endcapped Phasen:

Hydro

Klassen von RP-Liganden

3

Primärer Retentionsmechanismus

Hydrophob

Alkylphasen

4

Der Test auf Methylengruppen-Selektivität zeigt, wie gut eine stationäre Phase

verwandte Verbindungen trennen kann, die sich nur um eine CH2-Gruppe

unterscheiden. Im Allgemeinen haben sehr hydrophobe Liganden (z.B. C18)

eine höhere Methylengruppenselektivität als weniger hydrophobe Phasen.

min2 4 6 8 10

mAU

0

50

100

150

200

250

min2 4 6 8 10

mAU

0

100

200

300

400

C1

8P

he

nyl

Methylengruppen-Selektivität

5

0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

0.160

0.180

0.200

Luna C18(2)

Synergi Hydro-RP

Jupiter C18

Synergi Max-RP

Luna C8(2)

Luna C5 Luna Phe-Hex

Jupiter C4

Synergi Polar-RP

Prodigy Phenyl

Luna Cyano

Luna Amino

Slo

pe

of

log

k v

s. #

-C

H2-

un

its

C18 > C8 > C5 ≥ Phenyl > CN > Amino

Ste

igung v

on log k

vs.

#-C

H2-E

inheiten

Methylengruppen-Selektivität

6Luna und Jupiter sind eingetragene Markenzeichen von Phenomenex, Inc. Synergi und Prodigy sind Markenzeichen von Phenomenex, Inc.

Phenyl-Phasen sind weniger hydrophob als C18-Phasen und haben häufig

deutlich unterschiedliche chromatographische Eigenschaften, da sie mit einigen

Analytmolekülen π-π-Wechselwirkungen eingehen können. Sie haben

deshalb eine orthogonale Selektivität zu herkömmlich Alkylphasen (z.B. C18).

F F

F

FF

Modes of InteractionRetentionsmechanismen

Hydrophob

Aromatisch (π-π)

Dipol-Dipol

H-Brückenbindung

Phenylphasen

7

Unterschiede zwischen den Phenylphasen sind:

• Länge des Alkyllinkers (C3, C6, Direktanknüpfung)

• Art der Substituenten: H, F, O

• Zahl der Phenylringe

Phenylphasen

Zunehmende Polarität

Kinetex®, Luna®

Phenyl-Hexyl

• hydrophob

Synergi™ Polar-RP®

• Höchste Polarität

• Polares Endcapping

Kinetex® Biphenyl

• Stark aromatisch

• δ−, für Basen

Luna PFP, Kinetex F5

• Hohes Dipolmoment

• δ+, für Säuren

8Luna, Kinetex und Polar-RP sind eingetragene Markenzeichen von Phenomenex, Inc. Synergi ist ein Markenzeichen von Phenomenex, Inc.

XIC of +MRM (10 pairs): 359.300/295.300 Da ID: Prednisone 2 from Sample 17 (KNX 2.6u c18 50x2.1m... Max. 5.3e5 cps.

1.60 1.65 1.70 1.75 1.80 1.85 1.90 1.95 2.00 2.05 2.10 2.15 2.20382 394 406 418 430 442 454 466 478 490 502 514 526

Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

Intens

ity, cp

s

Cortisol/Cortisone

Prednisone

Prednisolone

XIC of +MRM (10 pairs): 361.100/163.200 Da ID: Cortisone 1 from Sample 12 (KNX 2.6u biphenyl 50x2.... Max. 2.8e6 cps.

2.15 2.20 2.25 2.30 2.35 2.40 2.45 2.50 2.55 2.60 2.65 2.70 2.75 2.80 2.85 2.90 2.95514 526 538 550 562 574 586 598 610 622 634 646 658 670 682 694 706

Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

2.8e6

Intens

ity, cp

s

2.61

Cortisone

Cortisol

Prednisone

Prednisolone

4 Steroide per LC/MS/MS

Kinetex® 2,6 µm C18

50x2,1 mm

Kinetex 2,6 µm Biphenyl

50x2,1 mm

Umkehr der

Elutionsreihenfolge!

Phenyl-Selektivität

9Kinetex ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex, Inc.

XIC of +MRM (10 pairs): 361.100/163.200 Da ID: Cortisone 1 from Sample 12 (KNX 2.6u biphenyl 50x2.... Max. 2.8e6 cps.

2.15 2.20 2.25 2.30 2.35 2.40 2.45 2.50 2.55 2.60 2.65 2.70 2.75 2.80 2.85 2.90 2.95514 526 538 550 562 574 586 598 610 622 634 646 658 670 682 694 706

Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

2.8e6

Intens

ity, cp

s

2.61

Cortisone

Cortisol

Prednisone

Prednisolone

Cortison

Log P = 1,66

Cortisol

Log P = 1,28

Prednison

Log P = 1,66

Prednisolon

Log P = 1,27

Kinetex® 2,6 µm Biphenyl

50x2,1 mm

Mehr Wasserstoffbrücken Mehr Retention

Erhöhte - Wechselwirkungen auf Core-Shell Biphenyl10

Phenyl-Selektivität

Kinetex ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex, Inc.

Durch die gezielte Einführung von polaren funktionellen Gruppen (durch Endcapping oder eingebettet im Liganden) können mittels spezifischer sekundärer Wechselwirkungen polare Verbindungen besser retiniert werden. Vorteile dieser Phasen sind:

a. Polare Selektivität für polare Analyten

b. Stabilität in 100 % wässrigen mobilen Phasen

c. Verbesserte Peakform für basische Arzneimittel (weniger Silanole)

Synergi Fusion-RP

Polar-embedded

Synergi™ Hydro-RP

Polar-endcapped

Polar-embedded und polar-endcapped Phasen

Luna® Omega Polar C18 mitpolarer Oberfläche

Luna Omega PSC18 mit geladener OberflächeLuna ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex Inc.

Synergi ist ein Markenzeichen von Phenomenex Inc.

Nukleinsäurebasen:

Day 2

min2 4 6 8 10 12 14

0

Day 1

2 4 6 8 10 12

0

Phasenkollaps!

konventionelle C18

Tag 1

Tag 2

100 % Wasserstabilität

Liganden

Kieselgel

Day 1

0 2 4 6 8 10 12

0

Day 6

2 4 6 8 10 12 14

0

Synergi™ Hydro-RP

Tag 1

Tag 6

12Synergi ist ein Markenzeichen von Phenomenex, Inc.

100 % Wasserstabilität

PyridoxinNicotinsäure

Luna® Omega C18 1,6 µm beginnend mit 3% ACN:

Luna Omega Polar C18 1,6 µm beginnend mit 0% ACN:

13Luna ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex, Inc.

Bessere Retention polarer Analyten

14

Vergleichende Trennungen sind möglicherweise

nicht für alle Applikationen repräsentativ.

Vollporöse 1,8 µm

polare C18 Phase

Luna® Omega 1,6 µm PS C18

Vollporöse 1,8 µm polare C18

Luna ist ein eingetragenes Markenzeichen von Phenomenex, Inc.

Oxymetazolin und Oxidationsprodukt:

min2 2.5 3 3.5 4 4.5

mAU

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,100 (C:\CHEM32\1\DATA\JL121310\JEFF 2010-12-13 09-02-10\SELECT3C1800001.D)

3.233

3.336

C18

Rs 1,45

min2 2.5 3 3.5 4 4.5

mAU

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,100 (C:\CHEM32\1\DATA\JL121310\JEFF 2010-12-13 09-18-10\SELECT3C1800001.D)

3.684

3.902

Phenyl

Rs 2,1

min2 2.5 3 3.5 4 4.5

mAU

-1

0

1

2

3

4

5

6

DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,100 (C:\CHEM32\1\DATA\JL121310\JEFF 2010-12-13 09-58-12\SELECT3C1800001.D)

3.049

3.563

Polar-embedded

Phenyl

Rs 3,2

Oxymetazoline

• Bessere Rs mit Phenyl • Optimale Rs mit polar-

embedded und polar-

endcapped Phenylphase

Erweiterte polare Selektivität

15

Kinetex Biphenyl

Kinetex F5

Synergi Polar-RP®

Luna® Omega C18

Kinetex® C18

Gemini® C18

Universelle C18

Luna Omega Polar

C18

Kinetex Biphenyl

Kinetex Polar C18

Synergi™ Fusion-RP

Polare Basen &

Neutralver-

bindungenLuna Omega PS C18

Luna Omega Polar

C18

Kinetex F5

Synergi™ Hydro

Polare Säuren

Kinetex F5

Kinetex Biphenyl

Kinetex Phenyl-

Hexyl

Gemini C6-Phenyl

Positions-

isomers

Kinetex EVO C18

Gemini C18

Gemini-NX C18

Gemini C6-Phenyl

Basische mobile

Phase

Luna Omega PS C18

Kinetex EVO C18

Kinetex XB-C18

Synergi Max-RP

Peaktailing

für Basen

Orthogonal

zu C18

Phasenauswahl Tipps

Luna, Gemini, Kinetex und Polar-RP sind eingetragene Markenzeichen von Phenomenex, Inc. Synergi ist ein Markenzeichen von Phenomenex, Inc.