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Die Rolle von Early Growth Response 1 bei der geb.uni- ?· Die Rolle von Early Growth Response 1...

Date post:18-Sep-2018
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  • Aus dem Fachbereich 08 - Biologie und Chemie -

    der Justus-Liebig-Universitt Gieen

    angefertigt am Max-Planck-Institut fr Herz- und Lungenforschung,

    Bad Nauheim

    Die Rolle von Early Growth Response 1 bei der

    Regulation von Timp1, Tenascin C und Elastin

    whrend des kompensatorischen Lungenwachstums

    und der postnatalen Alveolarisierung

    Inaugural-Dissertation

    zur Erlangung des Grades

    Doktor der Naturwissenschaften

    -Dr. rer. nat.-

    Fachbereich Biologie und Chemie

    der Justus-Liebig-Universitt Gieen

    vorgelegt von

    Dipl.-Biol. Peter Rauschkolb

    aus Mainz

    Gieen 2015

  • Dekan: Prof. Dr. Holger Zorn

    Institut fr Chemie, FB 08

    Justus-Liebig-Universitt Gieen

    Heinrich-Buff-Ring 58, 35392 Gieen

    Erstgutachter: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Lakes-Harlan

    Institut fr Tierphysiologie, FB 08

    Abteilung Integrative Sinnesphysiologie

    Justus-Liebig-Universitt Gieen

    Heinrich-Buff-Ring 38, 35392 Giessen

    Zweitgutachter: Prof. Dr. med. Werner Seeger

    Medizinische Klinik und Poliklinik II

    Exzellenzcluster Kardiopulmonales System (ECCPS)

    Lungenzentrum der Universitt Gieen (UGMLC)

    Justus-Liebig-Universitt Gieen

    Klinikstrae 36, 35392 Gieen

    Tag der mndlichen Prfung: 22.05.2015

  • Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des Graduiertenkollegs Molecular Biology and

    Medicine of the Lung (MBML) am Max-Planck-Institut fr Herz- und Lungenforschung in Bad

    Nauheim in der Zeit von November 2009 bis Dezember 2013 unter der Leitung von Prof. Dr.

    rer. nat. Reinhard Lakes-Harlan angefertigt. Das Thema und das Labor wurden von Prof. Dr.

    med. Werner Seeger und Prof. Dr. med. Robert Voswinckel bereitgestellt, unter deren

    Betreuung diese Arbeit entstand

  • Indes sie forschten, rntgten, filmten und funkten, entstand von selbst die kstlichste

    Erfindung:

    der Umweg als die krzeste Verbindung zwischen zwei Punkten.

    Erich Kstner

  • ____________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis

    Inhaltsverzeichnis

    1 Abkrzungsverzeichnis ..................................................................................... 8

    2 Einleitung .......................................................................................................... 15

    2.1 Anatomie und Physiologie der Lunge ....................................................................... 15

    2.1.1 Zelltypen der Lunge und Feinbau der Alveolen ................................................. 17

    2.2 Entwicklung der Lunge .............................................................................................. 20

    2.2.1 Differenzierung des Lungengewebes ................................................................ 20

    2.2.2 Alveolarisierung und postnatale Lungenentwicklung ........................................ 23

    2.3 Das kompensatorische Lungenwachstum ................................................................ 25

    2.3.1 Initiation des kompensatorischen Lungenwachstums ....................................... 27

    2.3.2 Molekulare Mediatoren des kompensatorischen Lungenwachstums ............... 28

    2.4 Die Extrazellularmatrix ............................................................................................... 31

    2.4.1 Die Extrazellularmatrix der Lunge ...................................................................... 33

    2.4.2 Matrixmetalloproteinasen und deren endogene Inhibitoren .............................. 35

    2.4.3 Das Extrazellularmatrix-assoziierte Protein Tenascin C ................................... 39

    2.4.4 Mechanotransduktion ......................................................................................... 41

    2.5 Der Transkriptionsfaktor Early Growth Response 1 (Egr1) ...................................... 43

    2.6 Die Knockout-Maus ................................................................................................... 44

    2.7 Ziele der Arbeit .......................................................................................................... 46

    3 Material & Methoden ........................................................................................ 48

    3.1 Material ...................................................................................................................... 48

    3.1.1 Laborgerte ........................................................................................................ 48

    3.1.2 Chemikalien ........................................................................................................ 52

    3.1.3 Laborbedarfsartikel............................................................................................. 53

    3.1.4 Operations- und Prparationsmaterialien, Pharmaka ....................................... 55

    3.1.5 Kulturmedien, Medienzustze und Zelllinien ..................................................... 58

    3.1.6 Kits und Standards ............................................................................................. 59

    3.1.7 Oligonukleotide ................................................................................................... 59

  • ____________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis

    3.1.8 Versuchstiere...................................................................................................... 63

    3.2 Methoden ................................................................................................................... 64

    3.2.1 Induktion des kompensatorischen Lungenwachstums ...................................... 64

    3.2.2 Versuchsgruppen ............................................................................................... 68

    3.2.3 Messungen der Lungenfunktion......................................................................... 72

    3.2.4 Stereologische Analysen .................................................................................... 75

    3.2.5 Molekularbiologische Methoden ........................................................................ 85

    3.2.6 Zellbiologische Methoden .................................................................................. 97

    3.2.7 Proteinbiochemische Methoden ....................................................................... 100

    3.2.8 Statistische Analyse ......................................................................................... 104

    4 Ergebnisse ...................................................................................................... 105

    4.1 Vergleichende Gen-Expressionsanalyse der Bestandteile elastischer Fasern whrend

    der murinen postnatalen Entwicklung (Alveolarisierung) und des kompensatorischen

    Lungenwachstums der Maus ..................................................................................... 105

    4.2 Extrazellularmatrix-modulierende Faktoren whrend des kompensatorischen

    Lungenwachstums der Maus ..................................................................................... 111

    4.2.1 Aktivitt von Matrixmetalloproteinasen (MMP 9 und 2) whrend des

    kompensatorischen Lungenwachstums ........................................................... 111

    4.2.2 mRNA-Expression von MMP 9, Timp1 und Tenascin C whrend des

    kompensatorischen Lungenwachstums ........................................................... 112

    4.3 Kompensatorisches Lungenwachstum in Timp1-defizienten Musen ................... 114

    4.4 Messung der Lungenfunktion bei Timp1-/- Musen ................................................. 118

    4.4.1 Vernderte Zelleigenschaften von SAEC Zellen und primren Fibroblasten

    durch Timp1 ...................................................................................................... 119

    4.5 Kompensatorisches Lungenwachstum in TnC-defizienten Musen ...................... 120

    4.6 Messung der Lungenfunktion bei TnC-/- Musen .................................................... 124

    4.7 Einfluss einer mechanischen Stimulation auf die mRNA-Expression der untersuchten

    Gene ........................................................................................................................... 126

    4.8 Expressionsanalyse von Egr1 whrend des kompensatorischen Lungenwachstums der

    Maus ........................................................................................................................... 127

    4.8.1 Expressionsanalyse von Egr1 und TnC in der murinen postnatalen Entwicklung

    (Alveolarisierung) ............................................................................................. 129

  • ____________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis

    4.9 Einfluss einer Deletion des Gens fr Egr1 auf die mechanische Stimulation der mRNA-

    Expression der untersuchten Gene ........................................................................... 131

    4.10 Analyse der Expression von Elastin in primren Egr1-/- Fibroblasten .................... 132

    4.11 Expression von Bestandteilen elastischer Fasern whrend des kompensatorischen

    Lungenwachstums in Egr1-defizienten Musen ........................................................ 133

    4.12 Expression von TnC und Timp1 whrend des kompensatorischen Lungenwachstums

    in Egr1-defizienten Musen ....................................................................................... 134

    4.13 Einfluss einer Deletion des Ge

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