Die Fachzeitschrift der berliner kompaktkurse ... · Für diese Methode werden die Tiere fixiert,...

Die Fachzeitschrift der berliner kompaktkurse Versuchstierkunde

ISSN 2625 - 7394

01|18

Genotypisierung bei der Maus

Probenentnahme

Arbeit im Labor

Wirtschaftliche Betrachtung

Aktuelle Rechtslage

im Interview: Prof. Dr. Stephanie Krämer

als Einleger: Kursübersicht 2019

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versuchtierkunde kompakt 01|18 © bkk

Liebe Leserinnen und Leser,

die »Versuchstierkunde kompakt« ist unser neues Fortbil-dungsformat für Sie!

In Zusammenarbeit mit unseren Autoren und Partnern werden wir Ihnen künftig im halbjährlichen Abstand ein Titelthema aus verschiedenen Perspektiven aufarbeiten und in kurzweiligen, deutschsprachigen Artikeln mit großem Praxisbezug darstellen.

In dieser Ausgabe geht es um die »Genotypisierung der Maus«. Unsere Autoren haben vier verschiedene Artikel für Sie zusammengestellt, die Ihnen einen Wechsel der Blickrichtung für Ihre Arbeit ermöglichen sollen. Lesen Sie mehr von den Möglichkeiten der Probenentnahme und der Aufarbeitung im Labor, stellen Sie sich mit uns aber auch betriebswirtschaftlichen und rechtlichen Überlegungen, die zukünftig noch einige Herausforderungen für Wissen-schaftler und Behördenvertreter bieten werden.

Über diese vier Fachartikel hinaus gibt Ihnen Prof. Dr. Stephanie Krämer im Interview »10 Fragen an…« Ein-blicke in die Arbeit des neu-gegründeten 3R-Zentrums in Gießen und das dortige Konzept der interdisziplinären Zusammenarbeit.

Eine andere Blickrichtung bietet Ihnen auch unsere neu-gestaltete Homepage www.berliner-kompaktkurse.de. Das responsive Design macht ein Betrachten auf unter-schiedlichen Endgeräten möglich und lässt Sie auch von unterwegs unser vielfältiges Fortbildungsangebot schnell und übersichtlich finden.

Wir lesen uns wieder!

Dr. Maren Kaepke

IMPRESSUM

Herausgeber und V.i.S.d.P. Dr. Maren Kaepke, Berlin

für die seminarreihe berliner kompaktkurse

der berliner fortbildungen

Heerstraße 18-20, D-14052 Berlin

Tel: +49 (0)30 31 99 08 41

Fax: +49 (0)30 31 99 08 42

www.berliner-kompaktkurse.de

Redaktion

Dr. Maren Kaepke, berliner fortbildungen

Katharina Meyer, berliner fortbildungen

Titelbild

Anja Sárempek, berliner fortbildungen

Autoren dieser Ausgabe

Dr. Sarah Jeuthe

Nadine Sündermann

Dr. Darrell Hoskins

Dr. Britta Wirrer

Anzeigen

Dr. Maren Kaepke, berliner fortbildungen

Produktion/Layout

Anja Sárempek, berliner fortbildungen

Druck

PieReg Druckcenter Berlin GmbH

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Für weitere Informationen

wenden Sie sich bitte an

[email protected]

Nachdruck und Speicherung in elektronischen Medien nur mit

ausdrücklicher schriftlicher Genehmigung von

Dr. Maren Kaepke und unter vollständiger Quellenangabe.

ISSN 2625-7394

Um klar zu sehen, genügt oft ein Wechsel der Blickrichtung. Antoine de Saint-Exupéry (1900-1944), französischer Schriftsteller

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Neben der ganzen Freude über dieses neue Gewand besteht bei uns aber auch eine kleine Unsicherheit. Gefällt unseren Kunden – also Ihnen - der neue Stil genauso gut wie uns? Wird unser Kursangebot gut dargestellt, dass Sie alle Informationen übersichtlich und schnell finden? Sind die von uns gewählten Themen für die Artikel in der Fachzeitschrift auch für Sie interessant?

Wir möchten gern mit Ihnen ins Gespräch kommen und wür-den uns sehr freuen, wenn Sie sich mit uns auf Kongressen und Fortbildungen oder am Telefon austauschen. Sollten wir uns nicht persönlich treffen, können wir Ihnen versichern, dass der gute alte Leserbrief bei uns hoch im Kurs steht. Auch wenn dieser heutzutage sicherlich nicht handschriftlich geschrieben und analog verschickt sondern eher manuell getippt und elektronisch versendet wird, Ihre Meinung zählt für uns!

Vielleicht haben Sie aber auch einen Themenvorschlag für unsere Fachzeitschrift, möchten selber einen Artikel beitra-gen oder geben uns einen Tipp, mit welcher interessanten Persönlichkeit wir einmal ein Interview führen sollten. Melden Sie sich bitte unbedingt bei uns, damit wir mit Ihnen gemeinsam unser Angebot weiterhin aktuell, praxisnah und informativ gestalten und unser Netzwerk an Informationen mit Ihnen gemeinsam weiterspinnen können.

Wir freuen uns auf Ihre Anregungen!

Ihr Team der berliner kompaktkurse

Ihre Meinung zählt!

Wir haben über zwei Jahre gegrübelt, geplant, layoutet und diskutiert und freuen uns, Ihnen neben unserem Firmenlogo auch unsere Informationsmedien – Fachzeitschrift, Kursübersicht und Internetseite – in neuem Format präsentieren zu können.


Inhalt

Genotypisierung bei der Maus...

...Möglichkeiten der Probenentnahme ................................ 6

...die Arbeit im Labor ................................................................... 16

...unter wirtschaftlicher Betrachtung .................................. 22

...derzeitige Rechtslage zu den aktuellen Methoden .. 26

Interview

10 Fragen an…Prof. Dr. Stephanie Krämer ....................... 30

Redaktionelle Beiträge

Ihre Meinung zählt........................................................................... 4

Umfrage zum Titelthema ........................................................... 13

Verzeichnis der Inserenten ...................................................... 33

Berlin ist immer eine Reise wert ............................................ 34

Merkblatt: Reinigung / Wartung von Mikroskopen ........ 35

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Möglichkeiten der Probenentnahme zur Genotypisierung

Gentechnisch veränderte Maus- und Rattenmodelle sind fest in der präklinischen Forschung etabliert. Die eindeutige Genotypisierung dieser Tiere ist unabdingbar für den Einsatz in der Forschung. Für die Probengewinnung stehen unterschiedliche Verfahren zur Verfügung, die ebenso wie die Kriterien zur Auswahl der Methode im folgenden Artikel beschrieben werden.

Im Sinne des Tierschutzes sollte die Probenentnahme so zuverlässig, minimal invasiv und stressarm wie mög-lich erfolgen. Weiterhin muss die fehlerfreie Zuordnung zwischen Tier und Genotypisierungs-Ergebnis durch eine geeignete Kennzeichnung der Tiere jederzeit gewährleis- tet sein. Nur so können Fehlverpaarungen, der Ein-schluss eines Tieres mit unpassendem Genotyp in eine präklinische Studie oder die Notwendigkeit für erneute Probenentnahmen zur Nachgenotypisierung vermieden werden.

Die Genotypisierungen werden derzeit vorwiegend mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder Southern Blot durchgeführt1. Während die PCR mit sehr kleinen DNA-Mengen auskommt, ist für Southern-Blots eine etwas größere Probenmenge notwendig. Der Southern-Blot ist für die Identifikation bestimmter Modifikationen unabdingbar und kann somit nicht immer mittels PCR ersetzt werden. Das eingesetzte Verfahren bestimmt somit die benötigte DNA- und auch die benötigte Gewebemenge und hat dadurch direkten Einfluss auf die gewählte Methode zur Probengewinnung2.

Probenentnahmeverfahren

Für die DNA Gewinnung stehen derzeit verschiedene invasive und nicht-invasive Probenentnahmeverfahren zur Verfügung.

Dr. Sarah Jeuthe

Abbildung 1: Schwanzspitzenbiopsie bei einer 1 Tage alten Maus Abbildung 2: Probe der Schwanzspitzenbiopsie im Größenvergleich mit einem Eppi

© Jeuthe © Jeuthe

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Invasive Methoden Zu den invasiven Methoden zählen:

• die Schwanzspitzenbiopsie

• die Probengewinnung mittels Ohrlochstanze

• die distale Phalanxamputation

• die Entnahme von Blutproben.

Schwanzspitzenbiopsie

Die Schwanzspitzenbiopsie (Abb. 1–2) ist eine der am häufigsten etablierten Methoden zur Genotypisierung1, 3. Ein Vorteil ist die vergleichsweise große Probenmenge, die genug DNA liefert um auch mittels Southern-Blots Ergebnisse zu generieren.

Für diese Methode werden die Tiere fixiert, um mit einer scharfen Schere oder einem Skalpell ein 2 bis maximal 5 mm großes Stück von der Schwanzspitze abzusetzen4, 5. Die Schwanzspitzenbiopsie sollte idealerweise bei etwa zwei Wochen alten Tieren durchgeführt werden4.

Ein entscheidender Nachteil dieser Methode ist, dass die Tiere zusätzlich zur Biopsie markiert werden müssen, wozu eine weitere Manipulation der Tiere erforderlich ist.

Arras et. al. haben in einer Studie 2007 die Frage auf-geworfen, ob man die Tiere zur Schwanzspitzenbiopsie im Sinne des Tierschutzes anästhesieren sollte. Sie konnten in ihrer Studie zeigen, dass zumindest beim Einsatz von Methoxyflorane (MOF) und Diethylether ohne Vaporizer als Anästhetikum kein nennens-werter Benefit für das Tierwohl nachzuweisen war6. Auch eine Allgemeinanästhesie mit Isofluran wird im Hinblick auf den Benefit für das Tier kontrovers diskutiert4.

Probengewinnung mittels Ohrlochstanze

Die Ohrlochung oder Ohrkerbung (Abb. 3–4) wird in vielen großen Versuchstierhaltungen zur dauerhaften und individu-ellen Markierung der Tiere eingesetzt7. Dabei fallen kleine Ge- webeproben an, die gleichzeitig für die Genotypisierung genutzt werden können18. Neben der aus der Gentechnik-Sicherheitsverordnung abgeleiteten Notwendigkeit der dauerhaften und individuellen Markierung von gentechnisch veränderten Tieren ist die Zuordnung der Gewebeprobe zum Tier ebenfalls zwingend, wodurch die eindeutige Markierung der Tiere unerlässlich ist8.

Der Vorteil der Gewebegewinnung mittels Ohrlochung und gleichzeitiger Markierung der Tiere ist somit eindeutig, da mit einem Eingriff die Markierung und Probengewinnung erfolgen kann, wodurch die Belastung für die Tiere durch mehrmalige Manipulation umgangen wird8.

Abbildung 4: Probe der Ohrstanzung im Größenvergleich mit einem EppiAbbildung 3: Ohrlochung mittels Ohrlochstanze bei einer Maus

© Jeuthe © Jeuthe

8


Die Ohrlochung sollte idealerweise zwischen dem 18. und 21. Tag nach der Geburt erfolgen, also zum Absetzalter der Jungtiere vom Muttertier.

Bei sehr jungen Tieren (<14 Tage) kann die Ohrkerbung problematisch sein, da die Ohrlochung mit Entfernung eines Gewebestückes den Verlust eines Großteiles des Ohres mit sich bringen kann oder bei Entfernung extra kleiner Gewebestücke die gesetzte Markierung wieder verwachsen kann4.

Distale Phalaxamputation

Die distale Phalanxamputation (Abb. 5–7) ist eine weitere invasive Methode zur Probengewinnung für Genotyp-isierungszwecke.

Laut der Stellungnahme aus dem Arbeitskreis Berliner Tierschutzbeauftragte zur Ausdehnung der Phalanxampu- tation bei Mäusen bis P9, sollte die Probenentnahme zwischen dem 5. und 9. Lebenstag erfolgen, da nur in diesem Zeitraum die Biopsie mit der erforderlichen Präzision durchgeführt wer-den kann und gleichzeitig die Schmerzperzeption noch nicht vollständig ausgeprägt ist9.

Zu beachten ist, dass je Pfote maximal ein Zehenendglied entfernt werden sollte4 und sorgfältig darauf geachtet werden muss, dass das distale Zehenglied vollständig entfernt ist, um eine spätere Regeneration zu vermeiden8.

Vorteil dieser Methode ist, dass die Phalanxamputation ent-sprechend der Ohrkerbung gleichzeitig zur Identifikation der Tiere genutzt werden kann. Somit stellt sie im Vergleich zur Schwanzspitzenbiopsie, bei Tieren die zu Forschungszwecken frühzeitig genotypisiert werden müssen, eine belastungs- ärmere Alternative dar.

Entnahme von Blutproben

Eine Blutprobenentnahme ermöglicht die Gewinnung von 20-30µl DNA je ml Mausblut2. Die Blutprobe kann via Punktion der Schwanzvenen, der Vena saphena oder des retrobulbären Venenplexus erfolgen. Zum letzteren ist gemäß der Empfehlung zur Blutentnahme bei Ver-suchstieren aus dem Ausschuss für Tierschutzbeauf- tragte der GV-SOLAS und dem Arbeitskreis 4 in der TVT eine vorherige Anästhesie der Tiere angebracht10. Generell sind die empfohlenen maximalen Entnahme-volumina zu beachten um die Belastung der Tiere so gering wie möglich zu halten.

Nicht-invasive MethodenZu den nicht-invasiven Methoden der Probenentnahme zählen die Gewinnung von DNA aus11-16:

• Haarfollikeln

• Mund- oder Darmschleimhaut

• Kot

Abbildung 5: Distale Phalanxamputation bei einer 8 Tage alten Maus Abbildung 6: Probe der distalen Phalanx im Größenvergleich mit einem Eppi

© Jeuthe © Jeuthe

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DNA aus Haarfollikeln Zur Gewinnung der Haarfollikel (Abb. 8–9) wird den Tieren mittels Pinzette Fell gezupft, wobei die benötigte Menge an Haaren individuell getestet werden muss. Der Vorteil ist, dass die Tiere für die Probenentnahme nicht im Nackengriff fixiert werden müssen, sondern lediglich am Schwanz gehalten werden können.

Beachtet werden muss, dass diese Methode erst ab einem Alter von 10-14 Tagen nach der Geburt angewendet kann. Neben der geringeren DNA-Ausbeute besteht auch ein gewisses Risiko der Kreuz-Kontamination, welches bei der Probengewinnung durch entsprechende Hygiene-maßnahmen zwingend bedacht werden sollte4.

Abbildung 7: Schematische Darstellung der Schnittstelle für die Probengewinnung mittels distaler Phalanxamputation

� [email protected] � www.plexx.eu �

ENRICHMENT

© bkk

10


DNA aus Mundschleimhaut

Für die Entnahme von Mundschleimhautzellen (Abb. 10–11) müssen die Tiere im Nackengriff fixiert werden. Anschließend wird mittels Wattestäbchen der Mundschleimhautabstrich gewonnen. Hier ist die geübte und sorgfältige Entnahme der Probe besonders wichtig, da es bei unzureichender Zell- und vermehrter Speichelaufnahme schnell zu einer geringen DNA-Ausbeute kommen kann.

Aufgrund der Größenverhältnisse von Maul und Tupfer, sind bei diesem Entnahmeverfahren Limitationen hinsichtlich des Alters der Tiere gegeben.

Auch die Entnahme von Zellen aus der Darmschleimhaut mittels Plastiköse oder die Gewinnung von Kot sind als nicht-invasive Methoden beschrieben12, 13, 17. Kalipke et.al. und Hamman et.al. berichten in ihren Studien von guten Erfolgsraten für die Genotypisierungen11, 17.

Abbildung 10: Abstrich von Mundschleimhautzellen bei einer MausAbbildung 11: Tupfer des Schleimhautabstrichs im Größenvergleich mit

einem Eppi

Abbildung 8: Entnahme von Haarfollikeln bei einer Maus Abbildung 9: Probe der Haarfollikel im Größenvergleich mit einem Eppi

© Jeuthe © Jeuthe

© Jeuthe © Jeuthe

11


Fazit

Im Sinne des 3R-Konzepts sollte immer die belastungs-ärmste Probenentnahmetechnik gewählt werden. Somit empfehlen Bonarparte et.al. wann immer es möglich ist, die Methode zu wählen, bei der eine Markierung und gleichzeitige Gewebegewinnung möglich ist4. Es sollte nur so viel Material entnommen werden, wie es für die Analysen benötigt wird und eine erneute Gewebegewinnung für Nachgenotypisierungen sollte grundsätzlich vermieden werden4. Das bedeutet auch, dass die Methode der Probengewinnung, sei sie inva-siv oder nicht-invasiv, so gut etabliert sein muss, dass die Ergebnisse eindeutig und zuverlässig sind. Damit kann zumindest die Belastung, die durch mehrmalige Manipulationen der Tiere entsteht, gesenkt werden.

Literatur

1. Cinelli P, Rettich A, Seifert B, Bürki K, Arras M.: Comparative

analysis and physiological impact of different tissue

biopsy methodologies used for the genotyping of

laboratory mice. Lab Anim. 2007 Apr;41(2):174-84

2. Stellungnahme der Kommission für

Tierversuchsangelegenheiten des Bundesministeriums

für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft zur

Genotypisierung von transgenen Mäusen, 2014; zuletzt

abgerufen am 23.08.2018 um 14:22 Uhr unter: https://

www.bmbwf.gv.at/fileadmin/user_upload/forschung/

Stellungnahme_zur_Genotypisierung-Nov2014.pdf

3. Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R:

Manipulation the mouse embryo: a laboratory manual.

3rd edition. New York: Cold Spring Harbour Laboratory

Press, 2003

4. FELASA guidelines for the refinement of methods for

genotyping genetically-modified rodents: a report of

the Federation of European Laboratory Animal Science

Associations Working Group. Lab Anim. 2013 July;

47(3):134-145

5. Robinson V, Jennings M; Working Group: Refinement and

reduction in the production of genetically modified mice:

sixth report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint

Working Group on Refinement. Altern Lab Anim. 2004

Jun; 32 Suppl 1A:373-5

6. Arras M, Rettich A, Seifert B, Käsermann HP, Rülicke T:

Should laboratory mice be anaesthetized for tail biopsy?

Lab Anim. 2007 Jan;41(1):30-45

7. Wever KE, Geessink FJ, Brouwer MAE, Tillema A, Ritskes-

Hoitinga M: A systematic review of discomfort due to

toe or ear clipping in laboratory rodents. Lab Anim. 2017

Dec;51(6):583-600. doi: 10.1177/0023677217705912. Epub

2017 Apr 21.

8. Dahlborn K, Bugnon P, Nevalainen T, Raspa M, Verbost P,

Spangenberg E: Report of the Federation of European

Laboratory Animal Science Associations Working Group

on animal identification. Lab Anim. 2013 Jan; 47(1):2-11.

doi: 10.1177/002367712473290

9. Stellungnahme aus dem Arbeitskreis Berliner

Tierschutzbeauftragte zur Ausdehnung der

Phalanxamputation bei Mäusen bis P9 Stand: 15.03.2016; Dr.

Konstanze Grote, Dr. Boris Jerchow, Anne Zintzsch, zuletzt

abgerufen am 23.08.2018 um 14:37 Uhr unter http://www.

ak-tierschutzbeauftragte.berlin/stellungnahmen/

10. Fachinformation aus dem Ausschuss für Tierschutz-

beauftragte und dem Arbeitskreis 4 in der TVT

Empfehlung zur Blutentnahme bei Versuchstieren, insbe-

sondere kleinen Versuchstieren Stand: Juli 2017 Autoren:

Dr. André Dülsner, Dr. Rüdiger Hack, Dr. Christine Krüger,

Dr. Marina Pils, Dr. Kira Scherer, Dr. Barthel Schmelting,

Dr. Matthias Schmidt, Heike Weinert (GV-SOLAS) und Dr.

Thomas Jourdan (TVT); zuletzt abgerufen am 23.08.2018

um 14: 41 Uhr unter http://www.gv-solas.de/index.

php?id=39


1. Hamann M, Lange N, Kuschka J, Richter A: Non-invasive

genotyping of transgenic mice: comparison of diffe-

rent commercial kits and required amounts. ALTEX.

2010;27(3):185-90

2. Broome RL, Feng L, Zhou Q, Smith A, Hahn N, Matsui SM,

Omary MB: Non-invasive transgenic mouse genotyping

using stool analysis. FEBS Lett. 1999 Nov 26; 462(1-2):159-60

3. Lahm H, Hoeflich A, Rieger N, Wanke R, Wolf E:

Identification of transgenic mice by direct PCR analysis of

lysates of epithelial cells obtained from the inner surface

of the rectum. Transgenic Res. 1998 Mar; 7(2):131-4

4. Irwin MH, Moffatt RJ, Pinkert CA: Identification of

transgenic mice by PCR analysis of saliva. Nat Biotechnol.

1996 Sep; 14(9):1146-8

5. Schmitteckert EM, Prokop CM, Hedrich HJ: DNA detection

in hair of transgenic mice--a simple technique minimi-

zing the distress on the animals. Lab Anim. 1999 Oct;

33(4):385-9

6. Mitrecić D, Mavrić S, Branica BV, Gajović S: Mice genoty-

ping using buccal swab samples: an improved method.

Biochem Genet. 2008 Apr; 46(3-4):105-12. doi: 10.1007/

s10528-007-9133-7. Epub 2008 Jan 23

7. Kalippke K, Werwitzke S, von Hornung M, Mischke R,

Ganser A, Tiede A: DNA analysis from stool samples: a

fast and reliable method avoiding invasive sampling

methods in mouse models of bleeding disorders.

Lab Anim. 2009 Oct; 43(4):390-3. doi: 10.1258/

la.2008.008057. Epub 2009 Feb 23

8. Empfehlung aus dem Arbeitskreis Berliner

Tierschutzbeauftragte zur Nutzung von Ohrstanzen zur

Genotypisierung von Labornagern Stand: 25.02.2014 Dr. Boris Jerchow, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Anne Zintzsch, zuletzt abgerufen am 23.08.2018 um 14: 42 Uhr unter http://www.ak-tierschutzbeauftragte.berlin/empfehlungen/

Dr. Sarah Jeuthe2005 – 2011 Studium der Veterinärmedizin an der Freien Universität Berlin

2011 Praktische Tierärztin der Tierambulanz Berlin Brandenburg

2012 – 2018 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Deutschen Herzzentrum Berlin

Seit 2017 Tierärztin und Tierschutzbauftragte am Max-Delbrück-Centrum

Fachtierärztin und Weiterbildungsbefugte für das Gebiet Versuchstierkunde

© Jeuthe


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Und wie machen Sie es?

Umfrage zur Probenentnahme für die Genotypisierung auf www.berliner-kompaktkurse.de/umfrage.html

Bitte nehmen Sie sich ca. 2 Minuten Zeit für unsere Umfrage.

Wir möchten gern von Ihnen wissen, welches Probeentnahmeverfahren für die Genotypisierung Sie in Ihrer Einrichtung verwenden.

Die Umfrage erfolgt komplett anonym, Mehrfachnennungen von Methoden sind möglich.

Die Umfrage ist freigeschaltet vom 12.09.2018 – 30.11.2018.

Vielen Dank im Voraus für Ihre Teilnahme!

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Das Ergebnis finden Sie ab dem 03.12.2018 an gleicher Stelle auf unserer Internetseite.

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Fokus - Zucht und Genetik Kursnr.: BK-E18-13 buchbar bis: 31.12.2018

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Fokus - Standardisierter genetischer Hintergrund von Maus- und Rattenstämmen

Kursnr.: BK-E18-20 buchbar bis: 01.05.2019

Mehr Informationen und die Möglichkeit zur Anmeldung finden Sie unter:

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Genotypisierung - die Arbeit im Labor

Vorbereitung

• Bestimmung der Zielsequenz• Primerdesign• Etablierung der PCR

Probengewinnung

• Invasive Methode• Nicht-invasive Methode• Markierung der Tiere

• DNA Isolierung• DNA Reinigung

Proben-aufbereitung

Analyse

• PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion)• Gelelektrophorese• Auswertung/Identi�zierung

Het WT Mut

1000500300

1500(bp)

M.W.500bp 100 bp Posi +/- +/+ -/-

Het WT Mut

Nadine Sündermann

Der Begriff »Genotypisierung« bezeichnet Metho- den zur Untersuchung genetischer Unterschiede zwischen einzelnen Tieren, die sich lediglich in geringen Merkmalen unterscheiden. Dieser Artikel beschreibt den praktischen Ablauf der Genotypisierung im Labor. Zur Vereinfachung beschränken sich die folgenden Ausführungen nur auf die Probenuntersuchung mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), wobei im Prinzip alle Methoden der Probenanalyse grund-sätzlich einem ähnlichen Ablaufschema folgen.

Bei der Genotypisierung werden Proben bereits gene-tisch-definierter Tiere mit Proben genetisch noch unbe-kannter Tiere verglichen.

Um den Genotyp des genetisch noch undefinierten Tieres zu identifizieren und zu unterscheiden, ob es einfach oder mehrfach genetisch modifiziert ist oder ob es homo- oder heterozygot ist, können als Referenz die Proben genetisch modifizierter oder nicht-modifizierter Tiere verwendet werden.

Für die Unterscheidung – einfach oder mehrfach genetisch modifiziert bzw. homo- oder heterozygot - ist der Weg der Probengewinnung und Aufbereitung identisch, jedoch gibt es bei der Analyse einen oder mehrere Ansätze, die in der Auswertung zu berücksichtigen sind.

Mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion wird ein kurzer, genau definierter DNA-Strang im Labor vervielfältigt, der dann später analysiert und mit der Referenzprobe verglichen werden kann.

Die Etablierung der PCR spielt deshalb eine wichtige Rolle, weil die DNA-Menge aus den Gewebeproben der Tiere stark limitiert und eine Wiederholung der Probenentnahme aus Tierschutzgründen unbedingt zu vermeiden ist.

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Abbildung 1: Fließschema des generellen Ablaufs der Genotypisierung

mittels PCR © bkk

Vorbereitung

• Bestimmung der Zielsequenz• Primerdesign• Etablierung der PCR

Probengewinnung

• Invasive Methode• Nicht-invasive Methode• Markierung der Tiere

• DNA Isolierung• DNA Reinigung

Proben-aufbereitung

Analyse

• PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion)• Gelelektrophorese• Auswertung/Identi�zierung

Het WT Mut

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M.W.500bp 100 bp Posi +/- +/+ -/-

Het WT Mut

Vorbereitung und Planung

Vor der eigentlichen Probenanalyse müssen eine Reihe an Planungs- und Arbeitsschritten von den Wissenschaftlern im Labor durchgeführt werden.

Für die Etablierung der PCR muss zunächst die Zielsequenz, welche die genetisch modifizierten Tiere von den Wildtypen unterscheidet, definiert werden. Sofern diese Sequenz weder durch Fluoreszenz noch durch andere Marker, sondern im Idealfall mit einer einfachen Unterscheidung auf DNA-Ebene durch den Erhalt unterschiedlich großer PCR-Fragmente möglich ist, sind die ersten beiden Schritte erfolgt. Anschließend werden die Primer - kurze DNA-Sequenzen, die für die Vervielfältigung der DNA benötigt werden - designet.

Diese Primer lagern sich bei dem Prozess der Polymerase-Ketten-Reaktion an die spezifisch zu ver-vielfältigenden Abschnitte der genomischen DNA an und flankieren gleichzeitig die DNA-Zielsequenz. Bestenfalls ist diese Sequenz sowohl in der genomischen DNA der Wildtyptiere, als auch der genetisch modifi-zierten DNA enthalten und führt später im Ergebnis zu unterschiedlich großen Fragmenten.

Nachdem die Primer designet und die PCR mittels Kontrollen etabliert wurde, kann die Probenentnahme bei den Tieren erfolgen.

Probengewinnung

Um die Analyse durchführen zu können, muss von dem zu untersuchenden Tier eine Probe genommen und das Tier markiert werden. Die Probenentnahme kann dabei auf unterschiedlichen Wegen erfolgen – mit invasiven

oder nicht-invasiven Probenentnahmeverfahren.

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Die Markierung der Probanden ist dabei entscheidend, um das Ergebnis dem Tier nach der Analyse korrekt zuordnen zu können. Kontaminationen der Probe, wie sie besonders bei der Entnahme von Gewebeproben auftreten können, sind unbedingt zu vermeiden.

Neben den unterschiedlichen Probenentnahmemöglich-keiten für die Genotypisierung gibt es auch unterschied-liche Aufbereitungsmöglichkeiten, die von dem jeweils bevorzugten Analyseverfahren abhängen. Da sich die-ser Artikel nur auf die Probenuntersuchung mit PCR beschränkt, wird im Folgenden auch nur der Ablauf der Probenaufbereitung für die PCR beschrieben, wobei sich die Durchführung grundsätzlich im Ablaufschema aller Analysemethoden ähnelt.

Probenaufbereitung

Der generelle Ablauf für die praktische Durchführung der Probenaufbereitung besteht aus drei Schritten:

• Aufschluss des Gewebes

• Isolierung der DNA

• Aufreinigung der DNA

Aufschluss des Gewebes

Im Fall der PCR wird die Biopsieprobe in einem Lysispuffer, in der Regel in Anwesenheit von Proteinase K und unter Wärmezufuhr, inkubiert, um das Gewebe aufzuschließen. Nach vollständiger Verdauung muss das genetische Material von den restlichen Gewebekomponenten getrennt werden.

Im ersten Schritt werden alle unverdauten Komponenten mittels Zentrifugation pelletiert. Das nach der Zentrifugation im Überstand befindliche Lysat wird mit einer Pipette abgenommen und in ein neues Probengefäß überführt.

Abbildung 2: Fließschema der Arbeitsschritte zur Genotypisierung

mittels PCR © bkk

De�nition der Zielsequenz

Methoden-wahl

Primerdesign

Proben-material

DNA-Isolierung

PCR

Bei diesem kritischen Schritt ist darauf zu achten, dass möglichst nur der klare, aber nahezu vollständige Überstand sauber abpipettiert wird, da jegliche Verunreinigungen für die anschließende Analyse hinderlich sein können. Gleichzeitig sollte jeglicher Verlust an genetischem Material vermieden werden.

Isolierung der DNA

Anschließend wird die DNA durch Ausfällen von dem restlichen Lysat isoliert. Die Eigenschaften von Alkohol eignen sich zur Fällung der DNA, so dass diese nach kur-zer Inkubationszeit mittels Zentrifugation in einem Pellet gesammelt und vom übrigen Lysat abgetrennt werden kann. Je nach DNA-Menge lässt sich das gefällte Pellet nach dem Zentrifugationsschritt als weißer Punkt erkennen.

Aufreinigung der DNA

Um noch restliche Verunreinigungen zu entfernen, wird das Pellet einige Male mit hochprozentigem Alkohol gewa-schen, indem jeweils der flüssige Überstand abgenommen

und frischer Alkohol auf das Pellet gegeben wird. Zwischen jedem Waschschritt wird das Pellet zentrifugiert.

Bei dem gesamten Prozess ist unbedingt darauf zu ach-ten, das im Pellet enthaltene genetische Material nicht zu verlieren.

Als abschließender Schritt der Probenaufbereitung wird das Pellet getrocknet und in sterilem doppelt destilliertem Wasser resuspensiert (gelöst). Das Volumen sollte dabei eher gering gehalten werden, um eine konzentrierte DNA Lösung für den folgenden PCR-Ansatz zu erhalten. In der Routine werden im Regelfall 50-100µl Wasser verwendet, um anschließend 1-2µl für die PCR einzusetzen.

Bei der Etablierung der Methode sollte man nach der Aufbereitung des genetischen Materials eine Bestimmung der DNA- Konzentration durchführen.

Für die Aufbereitung der Proben können zur Vereinfachung auch spezielle Kits herangezogen werden, die von der Grundidee äquivalent funktionieren, jedoch das Handling vereinfachen.



Analyse

Nach der Vervielfältigung der zu analysierenden DNA-Abschnitte mittels PCR werden die Fragmente der Größe ent-sprechend in einem Agarosegel mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Durch die Zusammensetzung des Agarosegels werden die replizierten DNA-Fragmente nach der Gel- elektrophorese unter UV-Licht sichtbar. Eine Fotografie dieses Gels wird anschließend zur Auswertung und Identifizierung herangezogen.

Fazit

Zusammengefasst ist eine Kombination aus der richtigen Wahl der Analysemethode gemeinsam mit einer korrekten und verantwortungsbewussten Vorgehensweise die beste Voraussetzung für das tierschutzgerechte Arbeiten mit verschiedenen genetischen Stämmen.

Literatur

Bonaparte D, Cinelli P, Douni E, Hérault Y, Maas M, Pakarinen P, Poutanen M, Lafuente MS, Scavizzi F; Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group: FELASA guidelines for the refinement of methods for genotyping genetically-mo-dified rodents: a report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group. Lab Anim. 2013 Jul; 47(3):134-45. Hauk, A: Quantifizierung von DNA durch Absorptions-messung. Biologie in unserer Zeit (2013), 43: 278-278. doi:10.1002/biuz.201390093

Nadine Sündermann

2002 – 2007 Biologie-Studium an der Technischen Universität Braunschweig

2007 – 2009 Promotion am Helmholtz-Zentrum für Infektionsbiologie

2010 – 2013 Wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Medizinischen Fakultät der OvG Universität Magdeburg

2013 – 2016 Tierhausleitung an der Medizinischen Universität Innsbruck

2016 – 2017 Verkaufsleiterin und Produktexpertin für Gesundheit und Genetik von Versuchstieren bei GVG Diagnostics & GVG Genetic Monitoring GmbH

2017 – 2018 MBA-Studium an der London Metropolitan University

seit 2018 Key Account Sales Manager Int. bei der Zoonlab GmbH

© Sündermann

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ZOONLAB ist seit über 60 Jahren einer der führenden Hersteller und Anbieter für Komplettlösungen für wissenschaftliche Tierhaltungen.Ein Beispiel: Der UniProtect NG für die SPF-Haltung von Nagern. Zur Schaffung konstanter Klima- und Beleuchtungsbedingungen ist der UniProtect NG mit einer optionalen industriellen Befeuchtung, einer Heizung und einem programmgesteuerten Beleuchtungssystem aus-gestattet.Nicht nur das umfangreiche Angebot an Produkten für die Tierhaltung, sondern auch die über mehrere Jahrzehnte gesammelte Erfahrung, die erstklassige Qualität und die innovativen und individuellen Produkt-lösungen sind Gründe dafür, dass Kunden aus aller Welt auf ZOONLAB vertrauen.Erfahren Sie mehr über unsere Erfahrung – wir freuen uns auf Ihre Anfrage: [email protected] oder +49 / 23 05 / 97 30 40

ZOONLAB GmbHHermannstraße 6 | 44579 Castrop-Rauxel | Germany

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Genotypisierung unter wirtschaftlicher Betrachtung

Interne vs. externe Probenbearbeitung

Verzögerungen bei der Genotypisierung verhindern eine effiziente ökonomische biomedizinische Forschung und widersprechen dem 3R-Prinzip, Tierzahlen zu reduzieren und an Tieren durchgeführten Prozeduren zu minimieren. Der Artikel nennt die wichtigs-ten Kostenfaktoren die bei einer wirtschaftlichen Betrachtung einbezogen werden müssen und die möglicherweise auch zu einer Entscheidung führen können, ein Outsourcing in Betracht zu ziehen.

Die Genotypisierung ist eine unvermeidliche und notwen-dige Aufgabe bei der Arbeit mit gentechnisch veränderten Organismen. Ein vollständiges Verständnis des Genotyps von Versuchstieren ist von grundlegender Bedeutung für die Generierung und Publikation verantwortungsbe-wusster und reproduzierbarer wissenschaftlicher Daten. Die wirtschaftliche Betrachtung der Genotypisierung ist multifaktoriell.

Direkte und indirekte Kosten

Bei einer Kalkulation müssen folgende direkte Kosten berück-sichtigt werden:

• Materialkosten

• belegter Laborarbeitsplatz

• Arbeitszeit für

• die Bestellung von Reagenzien

• die Organisation und Lagerung von Verbrauchsmaterialien

• die Probenaufbereitung und Durchführung der Assays

• das manuelle Lesen von Gelen

• die Interpretation der Ergebnisse

• die Protokollierung und Dokumentation

Dr. Darrell Hoskins

Tabelle 1: Direkte Kosten für die manuelle Genotypisierung

Direkte Kosten für die manuelle Genotypisierung

Reagenzien (Lyse, Oligos, Taq, Gel…)

Einweg-Verbrauchsmaterialien (Eppis, Spitzen, PCR-Platten, Laborhandschuhe,..)

Nutzung von Ausrüstung und Geräten (Pipetten, Zentrifugen, PCR, Gel, Transilluminator…)

die Bestellung von Reagenzien

die Organisation und Lagerung von Verbrauchsmaterialien

die Probenaufbereitung und Durchführung der Assays

das manuelle Lesen von Gelen

die Interpretation der Ergebnisse

die Protokollierung und Dokumentation

die Eingabe in die Datenmanagement-Systeme

belegter Arbeitsplatz

statistisch gesehen ca. 10-15%

Einarbeitung

Konsultation

Materialkosten

Arbeitszeit für

Fixkosten

Wiederholungen

Sonderaufwände

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Die genannten direkten Kosten (Tab. 1) summieren sich zu einem überraschend hohen Preis. Weitere versteckte, indirekte Kosten, die aufgrund von Verzögerungen bei internen Genotypisierungs-Prozessen anfallen, müssen jedoch ebenfalls mit einbezogen werden.

Hohe Fehlerquoten im Labor aufgrund nicht routinier-ter Abläufe, damit verbundene Verzögerungen bei der Absetzung oder Separation unbrauchbarer Tiere führen zu unnötig hohen Tierhaltungskosten und Bindung der Wissenschaftlerkapazität (Tab 2). Gebundene Zeit, die nicht direkt auf die Generierung neuer wissenschaftli-cher Daten, die Veröffentlichung von Ergebnissen und Einwerbung von Fördergeldern verwendet werden kann.

Kostenreduktion durch Outsourcing?

In den vergangenen Jahren war das Outsourcing mit Ausnahme von sehr spezialisierten Techniken fast nicht

existent. In jüngster Zeit sind die Kosten für Reagenzien jedoch gesunken und ein wettbewerbsintensiver Markt hat dazu geführt, dass eine große Anzahl von Outsourcing-Dienstleistungen für Forscher verfügbar geworden ist. Sogar Standardtechniken wie PCR und Plasmid-Klonierung können an renommierte Unternehmen ausgelagert werden, so dass der Empfang zuverlässiger und kosteneffizienter Daten einfacher denn je ist.

Die Auslagerung der Genotypisierung an Dienstleistungs-unternehmen kann Wissenschaftlern helfen, ihre Forschung zu beschleunigen, schneller zu publizieren und neues Vertrauen in die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit ihrer Forschung zu gewinnen. Darüber hinaus kann ein Outsourcing Wissenschaftler auch darin unterstützen, die Pünktlichkeit Ihrer Züchtungs- und Absetzprozesse zu gewährleisten und ihre Forschung im Sinn des 3R-Prinzips zu verbessern.

Tabelle 2: Indirekte Kosten, die für die Kostenkalkulation der Genotypisierung einbezogen werden müssen

Indirekte Kostenfallen

Erhöhte Tierhaltungskosten - Indirekt wegen Verzögerung in der Genotypisierung

Haltungskosten von noch unbestimmten, schon abgesetzten, aber unbrauchbaren Tieren

ggf. wiederholter Kommunikationsaufwand mit Forschungsgruppen

Zusatzaufwand im Fall von wiederholten Probennahme

Verluste durch Abweichung vom Plan

Tierhaltungskosten (auf Labor- und

Institutionsebene)

Arbeitszeit des Wissenschaftlers


Fazit

Die Genotypisierung wird auch zukünftig nicht in ihrer Wichtigkeit einbüßen. Mit der Technologie von CRISPR/Cas9 und der zunehmenden Komplexität von Mausmodellen gewinnt es immer mehr an Bedeutung, effiziente und genaue Genotypisierungspraktiken zu haben. Spezialisierte Dienstleistungsunternehmen können Wissenschaftler unterstützen, den Fokus auf ihre eigene Arbeit zu richten und durch Reduktion versteckter Kosten wirtschaftlicher und tierschutzgerechter zu arbeiten.

Dr. Darrell Hoskins

Studium der Veterinärmedizin an der Louisiana State University

Diplomate des American College of Laboratory Animal Medicine

Bisherige Arbeitsstationen: Stellv. Leitung der Tierforschung der Firma Procter & Gamble

Forschungsleitung bei Wyeth-Ayerst Research

Direktor der Abteilung für Veterinärmedizin und Bioressourcen für das Southern Research Institute

Direktor des Animal Welfare Training für Charles River Laboratories

Tierschutzbeauftragter am St. Jude Children‘s Research Hospital Derzeitige Tätigkeit: Verwaltungsleiter der veterinärmedizinischen Fakultät der University of Georgia

Stellvertretender Vizepräsident bei Transnetyx, Inc.

5 Gründe warum Outsourcing von Genotypisierung zu Refinement und Reduktion betragen kann:• Eliminiert menschliche Fehler

• Beschleunigt die Forschungsarbeit

• Reduziert die Zahl der Tiere in der

Haltung

• Verwendet eine genauere Technologie

• Ermöglicht genaue Planung und

planmäßige Zucht

© Hoskins

Zoltan Bognar | Regional Sales Manager+49 (0) 160 8804080 | [email protected]

GermanGenotyping

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Die Umsetzung der Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere und des Durchführungsbeschlusses der Kommission zur Festlegung eines gemeinsamen Formats für die Vorlage der Information gemäß der RL 2010/63/EU und des Rates zum Schutz der für wissenschaft-liche Zwecke verwendeten Tiere (2012/707/EU) brachte im Zusammenhang mit der Genotypisierung von Versuchstieren einige Änderungen mit sich, die im nachfolgenden Beitrag erläutert werden.

Vor Umsetzung der RL 2010/63/EU wurden invasive Maßnahmen zur Genotypisierung von Versuchstieren von den verschiedenen Tierversuchsgenehmigungsbehörden unterschiedlich eingestuft.

Teilweise ging man davon aus, dass es sich hier um zuchttechnische Praktiken handelt, die nicht als Tierver-such anzusehen waren. Bei einigen Genehmigungsbe-hörden mussten für diese Zwecke Anzeigen zur Organ-entnahme zu „anderen als wissenschaftlichen Zwecken“ vorgelegt werden. Mitunter wurde auch die Auffassung vertreten, dass es sich hier um eine anzeigepflichtige Or-ganentnahme zu wissenschaftlichen Zwecken handelte.

Rechtsgrundlagen

Entsprechend Art. 3 Nr. 1 der RL 2010/63/EU wird jede invasive oder nichtinvasive Verwendung eines Tieres zu Versuchszwecken oder anderen wissenschaftlichen Zwecken, die bei Tieren mit Belastungen einhergehen kann, als „Verfahren“ definiert. Die Richtlinie gilt gemäß Art. 1 Abs. 2 für Tiere, die in Verfahren verwendet wer-den oder verwendet werden sollen oder die speziell gezüchtet werden, damit ihre Organe oder Gewebe zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet werden.

Nach § 7 Abs. 2 TierSchG werden Eingriffe oder Behand-lungen an Tieren zu Versuchszwecken als Tierversuch

Artikel 3 der RL 2010/63/EUDefinitionenIm Sinne dieser Richtlinie bezeichnet der Ausdruck1. „Verfahren“ jede invasive oder nicht invasive Verwendung eines Tieres zu Versuchszwecken oder anderen wissenschaftlichen Zwecken mit bekanntem oder unbekanntem Ausgang, oder zu Ausbildungszwecken, die bei dem Tier Schmerzen, Leiden, Ängste oder dauerhafte Schäden in einem Ausmaß verursachen kann, das dem eines Kanüleneinstichs gemäß guter tierärztlicher Praxis gleichkommt oder darüber hinausgeht.Dies schließt alle Eingriffe ein, die dazu führen sollen oder können, dass ein Tier in einem solchen Zustand geboren oder ausgebrütet oder eine genetisch veränderte Tierlinie in einem solchen Zustand geschaffen und erhalten wird, schließt jedoch das Töten von Tieren allein zum Zwecke der Verwendung ihrer Organe oder Gewebe aus; […]

Artikel 1 der RL 2010/63/EUGegenstand und Anwendungsbereich[…](2) Diese Richtlinie gilt für Tiere, die in Verfahren verwendet werden oder verwendet werden sollen oder die speziell gezüchtet werden, damit ihre Organe oder Gewebe zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet werden können. […]

Derzeitige Rechtslage zu den aktuellen Methoden der Genotypisierung

Problemdarstellung und Schlussfolgerungen für die Planung und Durchführung von Tierversuchen

Dr. Britta Wirrer


definiert, wenn sie mit Belastungen für diese Tiere ver-bunden sein können. Als Tierversuche gelten auch Ein-griffe oder Behandlungen, die nicht zu Versuchszwecken dienen und durch die Gewebe entnommen werden, um diese zu wissenschaftlichen Zwecken zu untersuchen, wobei solche Maßnahmen gemäß § 8a Abs. 1 Nr. 3b TierSchG nicht der Genehmigung bedürfen, sondern lediglich anzeigepflichtig sind.

Der Durchführungsbeschluss 2012/707/EU legt das For-mat der Berichterstattung nach Art. 54 Abs. 1 der RL 2010/63/EU fest, nach der neben den Daten für die Ver-suchstiermeldeverordnung zusätzliche Informationen zu Tierversuchen alle 5 Jahre vorgelegt werden müssen.

So sind im Zusammenhang mit der Entnahme von Ge-webeproben genetisch veränderter Tiere gemäß dem Grundsatz der 3R (Vermeidung, Verminderung, Verbes-serung) repräsentative Informationen über die ungefäh-ren Tierzahlen, die verwendeten Tierarten und die Arten von Methoden für die Entnahme von Gewebeproben (mit Angabe des Schweregrades) zur genetischen Cha-rakterisierung mit und ohne Projektgenehmigung sowie Informationen über die getroffenen Maßnahmen zur Verfeinerung dieser Methoden zu erfassen

Problembeschreibung

Invasive Methoden zur Genotypisierung - wie z. B. Schwanzspitzenbiopsien, Blutentnahmen oder Ohrstan-zen - sind nach derzeitiger Rechtsauffassung als Tierver-such einzustufen, da sie mit Belastungen für die betrof-fenen Tiere einhergehen und z. B. die in Frage stehenden Schwanzspitzenbiopsien der Feststellung dienen, ob die betreffenden Tiere den beabsichtigten Genotyp einer bestimmten Linie besitzen. Es wird somit festgestellt, ob die jeweiligen Tiere für die Zucht oder die Verwendung in einem bestimmten Tierversuch geeignet sind.

Mit der Genotypisierung alleine wird zwar noch keine wissenschaftliche Fragestellung beantwortet, sie zielt

§ 7 TierSchG[…](2) Tierversuche im Sinne dieses Gesetzes sind Eingriffe oder Behandlungen zu Versuchszwecken1. an Tieren, wenn sie mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für diese Tiere verbunden sein können,[…]Als Tierversuche gelten auch Eingriffe oder Behandlungen, die nicht Versuchszwecken dienen, und[…]2. durch die Organe oder Gewebe ganz oder teilweise entnommen werden, um zu wissen-schaftlichen Zwecken[…]c) isolierte Organe, Gewebe oder Zellen zu untersuchen,[…]

§ 8a TierSchG(1) Wer ein Versuchsvorhaben, in dem Wirbeltiere oder Kopffüßer verwendet werden, durchführen will, […]3. das ausschließlich Tierversuche nach § 7 Absatz 2 Satz 2 Nummer 1 oder 2 zum Gegen-stand hat, die nach bereits erprobten Verfahren […]b) zu diagnostischen Zwecken vorgenommen werden, […] hat das Versuchsvorhaben der zuständigen Behörde anzuzeigen.

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aber darauf ab, künftige Versuche vorzubereiten. Daher liegt ein Versuchszweck im Sinne von § 7 Abs. 2 des Tier-schutzgesetzes vor.

Das Markieren von Versuchstieren mittels Ohrlochung wird in erster Linie zur Kennzeichnung von Versuchstie-ren durchgeführt. Das dabei anfallende Gewebe kann gleichzeitig zur Genotypisierung verwendet werden. Da die Ohrlochung zur Kennzeichnung jedoch nicht vom Amputationsverbot des § 6 Abs. 1 Nr. 1 TierSchG ausgenommen ist, stellt diese Gewebsentnahme eine anzeigepflichtige Maßnahme gemäß § 8a Abs. 1 Nr. 3b TierSchG dar.

Um die Anwendung des 3R-Prinzips zu gewährleisten, ist die Wissenschaft angehalten, Alternativmethoden zur invasiven Genotypisierung zu entwickeln, die mit weni-ger Belastungen für die Tiere verbunden sind und deren Etablierung in ihren Einrichtungen voranzutreiben.

Schlussfolgerungen

Die Durchführung von Biopsien zur Genotypisierung ist im Genehmigungsantrag bzw. in der Tierversuchs-anzeige mit aufzuführen. Steht eine Genotypisierung nicht in direktem Zusammenhang mit einem bestimm-ten Tierversuch, sondern wird beispielsweise im Zu-sammenhang mit der Zucht durchgeführt, so ist sie als

anzeigepflichtiger Tierversuch gem. §§ 8a Abs. 1 Nr. 3b i. V. m. 7 Abs. 2 Satz 2 Nr. 2c TierSchG einzustufen und als Anzeige der jeweils zuständigen Behörde vorzulegen. Sammelanzeigen sind in diesem Zusammenhang bei-spielsweise innerhalb einer Arbeitsgruppe möglich.

Die Genehmigungsbehörden sind gefordert, darauf hin-zuwirken, dass in Zukunft soweit möglich auf invasive Maßnahmen zur Genotypisierung verzichtet wird und stattdessen Alternativmethoden zum Einsatz kommen.

Literatur

Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22.9.2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere (ABl L 276/33)

Durchführungsbeschluss der Kommission vom 14.11.2012 zur Festlegung eines gemeinsamen Formats für die Vorlage der Informationen gemäß der Richtlinie 2010/63/EU des Euro-päischen Parlaments und des Rates zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere (2012/707/EU) (ABl L 320/33)

Tierschutzgesetz (TierSchG) vom 18.5.2006 (BGBl. I S 1207), zuletzt geändert durch Art. 141 G v. 29.3.2017 BGBl I S 626

Verordnung über die Meldung zu Versuchszwecken verwendeter Wirbeltiere oder Kopffüßer oder zu bestimmten anderen Zwecken verwendeter Wirbeltiere (Versuchstiermeldeverord-nung) vom 12.12.2013 (BGBL. I S. 4245) zuletzt geändert durch Artikel 395 der

Verordnung vom 31.8.2015 (BGBl. I S. 1474)

§ 6 TierSchG(1) Verboten ist das vollständige oder teilweise Amputieren von Körperteilen oder das vollständige oder teilweise Entnehmen oder Zerstören von Organen oder Geweben eines Wirbeltieres. […]

Dr. Britta Wirrer

Studium der Veterinärmedzin an der LMU München

1991 – 1993 Anfertigung der Dissertationsarbeit am Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Lebensmittel tierischen Usprung der LMU München

1992 – 1999 Mitarbeit und freiberufliche Tätigkeit in verschiedenen Großtierpraxen

1995 – 1996 Vorbereitungsdienst für den Amtstierärztlichen Dienst

1999 – 2000 Amtstierärztin am Landratsamt München

Seit Februar 2000 Referentin für den Fachbereich Tierschutz an der Regierung von Oberbayern

© Wirrer

Frühjahrestagung der IGTP vom 28. – 29. März 2019

am Deutschen Zentrum für

Neurodegenerative Erkrankungen in Bonn

und das erwartet Euch:praxisnahe Workshopsinteressante VorträgeErfahrungsaustausch

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10 Fragen an ...

... Prof. Dr. Stephanie Krämer

Prof. Dr. Stephanie Krämer hat im Oktober 2017 die Professur für Versuchstierkunde und Tierschutz an der Justus-Liebig-Universität in Gießen angenommen und leitet dort das neu gegründete 3R-Zentrum. Trotz Ihres neuen Wirkungsortes ist Prof. Krämer weiterhin als Kursleiterin und Referentin in verschiedenen Fortbildungen der berliner kompaktkurse tätig und erhält regelmäßig sehr gute Evaluationen der Teilnehmer aufgrund ihrer interaktiven Vermittlung des 3R-Konzepts.

Liebe Frau Prof. Krämer, herzlichen Glückwunsch zu Ihrem Ruf nach Gießen. Sie haben lange auf eine Professur warten müssen. Die Professuren an deutschen veterinärmedizi-nischen Fakultäten sind an einer Hand abzählbar und in Berlin und Hannover wurden die Positionen vor kurzem erst neu besetzt. Haben Sie selber noch daran geglaubt, dass Sie diesen Schritt eines Tages gehen können?

Liebe Frau Kaepke, in der Tat sind die Möglichkeiten im Gebiet der Versuchstierkunde, des Tierschutzes oder des Tierverhaltens an einer veterinärmedizinischen Universität in Deutschland tätig zu werden schon auf Grund des Umstandes stark limitiert, dass es bundesweit nur fünf Standorte gibt, an denen Tiermedizin studiert werden kann. Insofern muss man grundsätzlich über eine gehö-rige Portion Optimismus und Idealismus verfügen, wenn man diesen Weg einschlagen möchte! Umso glücklicher bin ich, dass ich nun in Gießen angekommen bin und sehr zufrieden, mit den Möglichkeiten, die sich hier an der Justus-Liebig-Universität bieten.

Sie haben in Berlin Tiermedizin studiert und nach Abschluss des Studiums zunächst auch als Kleintierärztin in einer Tierarztpraxis gearbeitet. Wieso haben Sie sich für die Versuchstierkunde entschieden?

Da muss ich vielleicht sogar noch etwas früher anfangen. Eigentlich wollte ich immer in die Pferdepraxis. Daher habe ich auch bereits als Studentin in einer Pferdeklinik im Berliner Umland gearbeitet. Durch einen wirren Umstand habe ich dort meinen zukünftigen Mann ken-nengelernt, der sich in dieser Zeit als Kleintierpraktiker niederließ. Somit arbeitete ich in der Anfangsphase bei meinem Mann mit, hatte dann aber die Möglichkeit an der Charité-Universitätsmedizin Berlin eine Doktorarbeit durchzuführen. Insgesamt war ich dann 10 Jahre lang an der Charité tätig und konnte dort auch die Weiterbildung zum Fachtierarzt für Versuchstierkunde machen.

Wer hat Sie auf Ihrem beruflichen Weg als Mentor über die Jahre begleitet und wie bzw. womit hat diese Person Sie geprägt?

Das mag jetzt vielleicht etwas kitschig klingen, aber in der Tat hat mich mein Mann immer unterstützt und beraten. Hier habe ich sicherlich von der Tatsache profitiert, dass er Tierarzt ist und sich in tierärztlichen Belangen sehr

© bkk

gut auskennt, aber dennoch den nötigen Abstand zur Versuchstierkunde hat und somit die Dinge aus einer gewissen Distanz heraus beurteilen kann. Einen wirkli-chen Mentor hatte ich nie, ganz im Gegenteil! Gerade an der Charité lernte ich, wie Hierarchien funktionieren und wie man in diesen existieren kann! Es gab aber eine Person, die mich an der Uni schier begeistert hat: Herr Prof. Juhr hat damals die Versuchstierkunde gelesen und seine Vorlesungen zählten für mich definitiv zu den besten!

Sie sind vor kurzem von Berlin nach Gießen umgezo-gen. Haben Sie schon alle Umzugskisten ausgepackt und fühlen Sie sich wohl an Ihrem neuen Wirkungsort?

Gießen repräsentiert meinen Zweitwohnsitz, somit bin ich nicht wirklich umgezogen, vielmehr hat sich mein Habitat ausgedehnt. Da ich es sehr reduziert mag, gab es nicht viel mitzunehmen. Am aufwendigsten war der Transport meiner beiden Pferde und ja, die habe ich bereits aus ihren Transportkisten ausgepackt (lacht). Tatsächlich fühle ich mich sehr wohl und ich liebe den Charme der 70er Jahre dieser Stadt. Darüber hinaus ist Gießen wahrhaftig eine Universitätsstadt, die durch das studentische junge Leben geprägt wird.

Für das 3R-Zentrum sind zwei neue Professuren entstanden, die eine Professur ist mit Ihnen besetzt, die andere führt ein humanmedizinischer Kollege. Welche Vorteile sehen Sie in dieser Kooperation aus Veterinär- und Humanmedizin?

Diesen Ansatz der Kooperation sehen wir als unerlässlich an, um das 3R-Prinzip von Russel und Burch tatsächlich mit Nachhaltigkeit zu erfüllen. Das 3R-Konzept verstehen wir dabei als einen ganzheitlichen Ansatz. Jedes R, ob es nun das Replacement, die Reduction oder das Refinement ist, hat viele Überschneidungspunkte mit den jeweiligen anderen Rs. Somit kann sich das Konzept nur umsetzen lassen, wenn alles 3Rs stringent ineinandergreifen. Daher arbeiten wir auch eng mit einer weiteren 3R-Professur der Goethe-Universität in Frankfurt zusammen, die sich mit der Verfahrensentwicklung zum Alternative Drug Testing befasst.

Wie möchten Sie das 3R-Zentrum zukünftig ausrichten, welche Projekte haben Sie und Ihre Mitarbeiter sich vor-genommen?

Persönlich möchte ich meine Forschung zum Refinement und den Möglichkeiten zur Verbesserung der Belastungseinschätzung vorantreiben. Sowohl unter Haltungs- als auch Versuchsbedingungen haben wir noch deutlichen Optimierungsbedarf. Wir neigen dazu, von "der Maus" oder "der Ratte" zu sprechen. Doch beobachten wir große individuelle Unterschiede bei den Tieren und erkennen zunehmend den Aspekt der sogenannten "Animal Personality" an. Da es für jeden Wissenschaftler von größ-ter Bedeutung ist, sein Modell mit all seinen Stärken und Schwächen zu kennen, müssen wir unser Verständnis hin-sichtlich verhaltensassoziierter Einflussgrößen verbessern, da gerade diese bei zunehmender Standardisierung stärker

© bkk


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zum Tragen kommen. Gleichzeitig arbeiten wir in unserem Zentrum daran, Konzepte zu entwickeln, mit denen wir die Versuchstierzahlen senken können. Das ist unser über-geordnetes und erklärtes Ziel! Solange aber noch Tiere in Versuchen eingesetzt werden, sehe ich meine persönliche Aufgabe darin, das Leid und die Belastungen der Tiere so gering wie möglich zu halten und idealerweise Endpunkte zu definieren, die vor einem tatsächlichen Belastungseintritt liegen. Damit betreibe ich keine "Augenwischerei", wie es so oft von den Tierversuchsgegnern propagiert wird, sondern leiste in meiner persönlichen Wahrnehmung einen aktiven Beitrag zum Tierschutz. Natürlich sind hier genauso Wissenschaftler angesprochen, daher die enge Zusammenarbeit zwischen den Fachbereichen.

Sie wollen unter anderem zusammen mit einer Mitarbeiterin, die einen Abschluss in Sozialpädagogik erworben hat, die Mensch-Tier-Beziehung beleuchten. Wie passt dieses Thema zur Versuchstierkunde?

Auch hier zeigen wir ein hohes Maß an Interdisziplinarität! Kaum etwas hat sich in den letzten Jahren so sehr verän-dert wie die Mensch-Tier-Beziehung. Wir können diese gesellschaftlichen Änderungen in der Wahrnehmung nicht ignorieren, weder im versuchtierkundlichen Bereich, noch in der landwirtschaftlichen Nutztierhaltung, aber auch nicht im Bereich der Haus- und Heimtierhaltung. Daher liegt es nahe, sich eine absolute Expertin auf diesem Gebiet mit ins Boot zu holen. Ich freue mich schon sehr auf die gemeinsame Zusammenarbeit!

Ihre Familie lebt in Berlin und Sie pendeln regelmäßig von Gießen in die Hauptstadt und zurück. Zu welcher Musik singen Sie im Auto laut mit?

Ehrlich gesagt höre ich keine Musik während der Autofahrt. Auch hier mag ich es eher reduziert. Die Fahrt hilft mir, über viele Dinge nachzudenken. Keine Störung oder

Unterbrechung für 500 km. Auch hilft es mir dabei, eine gewisse Distanz zwischen Arbeit und Familie zu bringen. Dies fällt nicht immer leicht, zumal die Tage in der Professur nicht selten 14 Stunden haben. Dafür höre ich gerne zu Hause Musik und hier mag ich Kings of Leon, Mumford and Sons oder The Black Keys, noch lieber aber live im Konzert, zum Beispiel in der Waldbühne in Berlin!

In Gießen steht die veterinärmedizinische Fakultät derzeit hart in der Kritik von Tierversuchsgegnern. Wie ist Ihre Strategie der Öffentlichkeitsarbeit – im Allgemeinen zum Thema Tierversuche und im Speziellen zur Positionierung des 3R-Zentrums?

Aus meiner Sicht kann nur eine proaktive Vorgehensweise zielführend sein. Wir müssen uns öffnen und darlegen, warum Wissenschaftler Dinge tun und wie sie es tun. Noch immer hat die Öffentlichkeit nur eine vage Vorstellung davon, wie es in einer Versuchstierhaltung aussieht. Aus meinen Erfahrungen kann ich berichten, dass fast alle, denen ich einmal eine derartige Haltung gezeigt habe, absolut überrascht waren. Die meisten waren von dem hohen technischen und personellen Aufwand beeindruckt. Auch war vielen nicht klar, wie strikt derartige Haltungen kontrolliert und überwacht werden. Allerdings kann eine proaktive Vorgehensweise nur fruchtbar sein, wenn auch auf der anderen Seite die Bereitschaft zum Dialog gegeben ist. Ich schätze die Arbeit von Tierschutzvereinigungen außer-ordentlich! Manchmal braucht man ein lautes Sprachrohr, damit Dinge überhaupt offensichtlich werden und sich ändern. Ich bin jedoch fest davon überzeugt, dass die meisten Menschen tatsächlich in den Dialog gehen und nicht andere Menschen diskreditieren wollen. Dabei kann und muss es vielleicht auch extreme Positionen geben. Das ist das Recht unserer Gesellschaft! Sie merken hier bereits, wie eng soziologische und ethische Aspekte mit dem Tierschutz verwoben sind.


Wie ist Ihre Vision für die Forschung 4.0? Was wird sich aus Ihrer Sicht bis in das Jahr 2040 für die tierexperimen-tell arbeitenden Wissenschaftler und die Mitarbeiter in Tierhäusern ändern?

Hier müsste ich ein Prophet sein! Ich will Ihre Frage anders beantworten: Ich hoffe, dass sich die Dinge für die Tiere ändern und wir zunehmend auf Alternativverfahren zurück-greifen können und die Unterstützung hier seitens der Politik nicht nachlässt! Das wäre mein Wunsch!

Vielen Dank, liebe Frau Prof. Krämer für dieses interessante Gespräch.

Das Interview führte Dr. Maren Kaepke in den Räumen der berliner fortbildungen. Die Fotos entstanden im Verlauf des Gesprächs und während eines Versuchstierkunde-Basiskurses Maus/Ratte, den Prof. Krämer als Kursleitung begleitet.

INSERENTENVERZEICHNIS TECNIPLAST Deutschland GmbH

Bahnhofstraße 69

82383 Hohenpeißenberg

www.tecniplast.de ..................................................Seite 2

PLEXX B.V.

P.O. Box 86

NL-6660 AB Elst

www.plexx.eu ..........................................................Seite 9

Fine Science Tools GmbH

Vangerowstraße 14

69115 Heidelberg

www.finescience.de .............................................Seite 13

berliner kompaktkurse

Heerstraße 18-20

14052 Berlin

www.berliner-kompaktkurse.de .....................Seite 15

ZOONLAB GmbH

Hermannstraße 6

44579 Castrop-Rauxel

www.zoonlab.de ...................................................Seite 21

Transnetyx Inc.

8110 Cordova Rd. Suite 119

US-TN 38016 Cordova

www.transnetyx.com ..........................................Seite 25

IGTP - Interessengemeinschaft

der Tierpfleger/innen und

des technischen Personal

www.gv-solas.de ...................................................Seite 29

GIM - Gesellschaft für innovative

Mikroökologie mbH

Waldheimstraße 47

14552 Michendorf OT Wildenbruch

www.gim-brandenburg.de ...............................Seite 36

Sie haben Interesse an einer Anzeigenplatzierung?

Wir freuen uns auf Ihre Anfrage!

Dr. Maren Kaepke

Tel: +49 (0)30 31 99 08 41

[email protected]

In folgenden Kursen können Sie mit Prof. Stephanie Krämer über das 3R-Konzept diskutieren: Versuchstierkunde-Basiskurs Maus/Ratte Kursnr.: BK-K18-15 | BK-K19-03 | BK-K19-09

Versuchstierkunde Aufbaukurs Kursnr.: BK-K19-01 | BK-K19-07 | BK-K19-12

Workshop für Tierschutzbeauftragte Kursnr.: BK-K18-34 | BK-K19-30

Weitere Informationen und die Möglichkeit zur Anmeldung finden Sie unter www.berliner-kompaktkurse.de

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Berlin ist immer eine Reise wert…… und wenn Sie schon mal da sind, dann gibt es an dieser Stelle handgeprüfte Tipps von uns für ein wunderbares Rahmenprogramm in der Hauptstadt.

Zu Gast bei den Wühlmäusen Kabarett und Comedy gleich ums Eck…

Das Berliner Kabarett-Theater »Die Wühlmäuse« wurde im Dezember 1960 von Dieter Hallervorden und einigen Schauspielkollegen gegründet und zog im Jahr 2000 - zum Anlass des 40-jährigen Bestehens des Theaters - in ihr derzei-tiges Domizil am Theodor-Heuss-Platz. In unmittelbarer Nähe der Seminarräume der berliner kompaktkurse können Sie mit wenigen Schritten einen amüsanten Abend verbringen und sowohl Newcomer als auch etablierte Künstler erleben. Das abwechslungsreiche Programm bietet Kabarett, Comedy, Konzerte und Lesungen. Von Dieter Nuhr, Mathias Richling, Ingo Appelt und Eckart von Hirschhausen, über Heinz-Rudolph Kunze und Karat bis hin zu Axel Hacke, Jürgen von der Lippe und Jan Weiler waren alle schon zu Gast in den Wühlmäusen. Und auch junge Künstler wie Johann König, Florian Schroeder und Bodo Wartke dürfen ihr Können unter Beweis stellen.

Weitere Informationen und den aktuellen Spielplan finden Sie auf der Internetseite der Wühlmäuse

www.wuehlmaeuse.de/aktuelles

Die Ankündigungstexte in unserer Rubrik »Berlin ist immer eine Reise wert…« sind z.T. den angegebenen Internetseiten der Locations entnommen.

Licht aus – Taschenlampen an! Abendführungen im Aquarium Berlin

Klick-klack. Es ist 18 Uhr, das Licht im Aquarium Berlin geht aus: doch bei einer Vielzahl der Bewohner ist von Feier-abendstimmung nichts zu spüren. Unerwartete Geräusche hallen durch die abendlichen Räume, das Geäst in den Terrarien raschelt, die Becken gluckern wild vor sich her, ungleichmäßiges Plätschern aus allen Ecken. Jetzt bringen nur noch Taschenlampen Licht ins Dunkel! Die Taschenlampe im Schlepptau geht es an der Seite von erfahrenen Zooschul-Guides durch die menschenleeren Etagen. Lichtkegel weisen Schritt für Schritt den Weg – und enttarnen links und rechts die geheimnisvollen Tiere der Nacht. Denn mit Einbruch der Dämmerung treten all die Aquarium-Bewohner in Erscheinung, die sich tagsüber in ihren Höhlen und Nestern verkriechen: Mächtige Welse und Muränen ziehen ihre Bahnen, Schlangen begeben sich auf die Jagd, Skorpione wuseln lebendig umher, Zipfelkrötenfrösche beginnen ihr nächtliches Konzert.

Weitere Informationen und die anstehenden Termine finden Sie auf der Internetseite des Aquariums Berlin

www.aquarium-berlin.de/de/erlebnis-aquarium/fuehrun-gen/taschenlampen-touren

© 2018 Aquarium Berlin

Bei behutsamer und sachgemäßer Behandlung haben Mikroskope eine lange Lebensdauer. Durch die Beachtung einiger einfacher Pflegehinweise können Sie maßgeblich dazu beitragen. Lesen und befolgen Sie stets die Gebrauchsanleitung Ihres Mikroskops.

Reinigung und Wartung von Mikroskopen

WICHTIG!Vor dem Ausschalten die Licht leistung minimieren.Vor der Reinigung den Netzstecker ziehen! ImmersionsölReste bevorzugt mit Xylol oder Benzol entfernen. Nicht benötigte Objektive in ihren Schutzkapseln aufbewahren.Unbenutzte Mikroskope abdecken!Das Mikroskop stets aufrecht und mit beiden Händen transportieren.

9AufstellungDie Aufstellung des Mikroskops erfolgt staubgeschützt auf einem sauberen, ebenen Untergrund. Es darf niemals direkter Sonnen-einstrahlung, Hitze, Frost oder Feuchtigkeit ausgesetzt sein.

9Entfernung von StaubBei Bedarf erfolgt die Entfernung von Staub mit einem fettfreien Blasebalgpinsel. Dieser wird staubgeschützt aufbewahrt. Die Verwendung leichter Druckluft (z. B. aus der Kartusche) ist zur Staubentfernung ebenfalls sehr gut geeignet.

9Entfernung von FingerabdrückenGlasflächen werden mit einem weichen, fusselfreien Baumwolltuch oder einem Wattestäbchen immer feucht und mit kreisförmigen Bewegungen von der Mitte nach außen gereinigt. Ein spezielles Reinigungsfluid, Benzol und Xylol sind als Hilfsmittel dazu besonders gut geeignet. Ebenso kann 70%iger Ethylalkohol/Met-hanol verwendet werden.

9Reinigung der Okulare und ObjektiveOkulare müssen unbedingt in den Tuben belassen werden, lediglich die äußere Fläche wird gereinigt. Die Reinigung der Objektive beschränkt sich auf das Sauberhalten der vorderen und hinteren Flächen sowie des Anschlussgewindes und der Anlagefläche.

9Wechseln der LampeBeim Lampenwechsel wird das Mikroskop vorsichtig auf die Seite ge-legt und die Lampenabdeckung geöffnet. Es ist darauf zu achten, die neue Lampe nicht mit den Fingern zu berühren, um eine Einschrän-kung der Leuchtkraft und Lebensdauer zu vermeiden.

9Einschicken des MikroskopsFür die rechtzeitige Reparatur kleiner Schäden und für die von Zeit zu Zeit empfohlenen Generalüberholungen werden Mikroskope am besten in der Originalverpackung zum Fachhändler eingeschickt.

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Die Akkreditierung nach DIN EN ISO/IEC 17025 gilt für den in der Urkundenanlage festgelegten Umfang

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