Fachbereich Biologie - Botanik, Universitat Frankfurt, BRD

Der enzymatische Abbau der Indol-3-Essigsaure bei Phycomyces blakesleeanus BGFF.

Enzymatic Degradation of Indole-3-Acetic Acid in Phycomyces blakesleeanus BCFF.

WILLY HILGENBERG und REINHARD HANKE

Mit 2 Abbildungen

Eingegangen am 2. August 1977 . Angenommen am 15. September 1977

Summary

Protein extracts of Phycomyces blakesleeanus are tested for peroxidase actiVity by guajacol-benzidine after fractionation by polyacrylamide-disc electrophoresis. Only a minor part of the protein zones shows very low peroxidase activity. The indole-3-acetic acid oxidase activity is determined spectrophotometrically. Fungus cultures from different growth condi­tions (light, dark, zinc sufficiency, and zinc deficiency) were used after separation in mycelium and sporangiophores.

Sporangiophores have a noticeably higher indole-3-acetic acid oxidase activity than my­celium. Cultures with stronger sporangiophore growth evidently have lower indoleacetic acid oxidase activity than those with weaker sporangiophore development.

We detected only minor indoleacetic acid oxidase activity in shake cultures with suppressed sporangiophore development.

The inhibition of indoleacetic acid oxidase activity by gallic acid could be proved by in vitro tests.

Key words: Phycomyces blakesleeanus, fAA-oxidase, peroxidase isoenzyme pattern.

Einleitung

Der Pilz Phycomyces blakesleeanus besitzt nach neueren Untersuchungen ein IES abbauendes Enzymsystem (HILGENBERG et aI., 1976). Die Ergebnisse legen die Ver­mutung nahe, dag die Regulation des cndogenen IES-Spiegels auf der einen Seite tiber den Abbau der IES in Form cines IES oxidierenden Enzymsystems, wie es von

MOYED und TULI (1968) in h6heren Pflanzen nachgewiesen wurde, erfolgt. Die en­dogene Konzentration der IES k6nntc andererseits auch tiber ihre Synthese aus der

Herrn Prof. Dr. WILHELM HALBSGUTH zum 65. Geburtstag gewidmet. Abkiirzungen: 1ES: 1ndol-3-Essigsaure, HRP: Meerrettichperoxidase, Zn: Zinkkulturen,

H: Hellkulturen, D: Dunkelkulturen, S: Sporangiophoren, M: Mycel.

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Ausgangssubstanz Tryptophan kontrolliert werden, wie die Hemmung der Trypto­phansynthase durch IES vermuten UiBt (HILGENBERG und HOFMANN, 1977 a). Ne­ben spezifischen IES-Oxidasen vermogen auch Peroxidasen (Donor: H 20 2) IES zu oxidieren. Die bisher nachgewiesenen Enzymsysteme mit IES-Oxidaseaktivitat kon­nen auf der Basis ihrer relativen Peroxidase- und IES-Oxidase-Aktivitat nach SCHNEIDER und WIGHTMAN (1974) in 4 Klassen eingeteilt werden. Diese unter­schiedliche Wirkungsspezifitat sagt u. a. aus, daB das Isoenzym-Muster auf Grund seiner IES-Oxidase- und Peroxidase-Aktivitat von Art zu Art verschieden ist.

In dies em Zusammenhang, ausgehend von den eigenen Untersuchungen, war es von Interesse, welcher dieser 4 Klassen das IES oxidierende Enzymsystem von Phy­comyces blakesleeanus zuzuordnen ist.

Weiterhin sollte die Enzymaktivitat in Abhangigkeit von veranderten Anzuchts­bedingungn naher untersucht werden, da schon die Trennungen mit der Polyacryl­amid-Diskelektrophorese zeigten, daB z. B. in Sporangiophoren deutlich mehr IES­Oxidase-Aktivitat vorhanden ist als im Pilzmycel.

Zinkionen in der Nahrlosung steigern die Tryptophansynthase-Aktivitat bei Neu­rospora crassa (NASON, 1950, NASON et al., 1951). HILGENBERG und HOFMANN (1977 b) konnten durch Zinkionen in der Nahrlosung eine Erhohung der Trypto­phansynthase-Aktivitat in Sporangiophoren bei gleichzeitiger Aktivitatserniedri­gung im Mycel von Phycomyces blakesleeanus nachweisen. Dies zeigt den EinfluB von Zinkionen auf die Synthese der Ausgangssubstanz Tryptophan, von der sich die IES im pflanzlichen Stoffwechsel ableitet. Der Nachweis eines Einflusses von Zinkionen auf das Auftreten oder die Aktivitat von IES-Oxidase konnte einmal zum Versdndnis der Zinkwirkung auf den Organismus und zum anderen zur wei­teren Klarung der endogenen Regulation des Wachstums beitragen.

PILET (1964) zeigte, daB Chlorogensaure das IES-Oxidase-System, isoliert aus Linsenwurzeln, stark hemmt. Ais Folge der Hemmung stieg die Konzentration an extrahierbaren Wuchsstoffen (Indolderivaten) in der Wurzel an. Da seit langem be­kannt ist, daB Phycomyces blakesleeanus groBe Mengen an Gallussaure und Proto­catechusaure, bei Anzucht auf einer Glucose-Asparagin-Nahrlosung synthetisiert (DENNISON, 1959), konnte ein EinfluB dieser 0-Tri-phenolcarbonsauren auf die En­zymaktivitat der IES-Oxidase von Bedeutung sein.

Material und Methoden

Verwendung fand in allen Untersuchungen der Stamm 1 + der Sammlung Halbsguth von Phycomyces blakesleeanus Bgff. Angezogen wurde in 200 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml Nahrlosung bei einer Impfdichte von 100 Sporen pro AnzuchtsgefaE. Die Kulturen wurden 5 oder 6 Tage im Dunkeln oder im Dauerlicht angezogen. Einzelheiten iiber Kul­turbedingungen, Nahrlosungszusammensetzung wurden von HILGENBERG und HOFMANN (1977 a, b) veroffentlicht. Schiittelkulturen wurden auf einer Schiittelmaschine (Biihler 12) bei 120 Umdrehungen pro Minute im Dauerlicht und Dauerdunkel angezogen. Die Ernte

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erfolgte bei den Standkulturen durch Abheben des Pilzmaterials von der Nahrlosung. Das Mycel und die Sporangiophoren wurden anschlieGend zweimal mit aqua dest. gewaschen. Schuttelkulturen wurden uber Millipore Filter abgenutscht.

Zur Aufbereitung des Versuchsmaterials sowie zur Herstellung und elektrophoretischen Auftrennung des Rohextraktes vergleiche HILGENBERG et al. (1976).

Die Gele mit den aufgetrennten Proteinen wurden mit einer spezifischen Farbelosung nach SCHRAUWEN (1966) zur Sichtbarmachung von Peroxidase-Aktivitaten behandelt. Die gewasserten Gele wurden dazu bei 20°C fUr 15-45 min im Dunkeln in einem Gemisch aus 2e'ml 0,2 M CHaCOONa, 5 ml Benzidin-Guajakol-Losung (50 mg Benzidin und 135 mg Guajakol in 25 ml 100f0iger Essigsaure), 2 ml 5 mM MnS04 und 2 ml 0,12 Ofo HzOz-Losung inkubiert. Peroxidasehaltige Banden soli ten sich nach etwa 10 min an der Geloberflache braunrot anfarben. Die Aufbewahrung der so behandelten Gele erfolgte nach Abspulung mit aqua dest. in 2% iger Essigsaure. Die quantitative Auswertung der Gele erfolgte durch Zeichnung, Photographie und Extinktionsmessung bei 546 nm mit einem Zusatzgerat zum Eppendorf-Photometer. Die auf der Ordinate der Densitometerkurven angegebenen Werte stellen die Skalenteile des Schreibers dar. Gleiche Verstiirkereinstellung des Photometers vorausgesetzt, kann sie als MaG fur die Intensitat der Farbung und damit der Enzymakti­vitat gelten (ZIMMERMANN und ROSENSTOCK, 1977). Die Ergebnisse sind mindestens 4mal reproduziert. Die Abweichungen in den einzelnen Versuchen liegen unter 10 Ofo fur die gel­elektrophoretischen Untersuchungen.

Zur quantitativen Bestimmung der IES-Oxidase-Aktivitat wurde ein spektrophotometri­scher Enzymtest nach NANDA et al. (1973) verwendet. Jeder Ansatz enthielt 0,5 ml einer 1 mM IES (K-Salz) in 5 mM MnCl2-Losung und 1 ml einer 5 mM 2,6-Dichlorphenol (DCP)­Losung, aufgenommcn in 0,06 M Phosphat-Puffer, pH 6. Das Reaktionsgemisch wurde auf­gefullt mit 0,5 ml Rohextrak t, der 1 Stunde gegen die 30fache Menge des Extraktionspuffers (0,067 M Phosphatpuffer + to-3 M Mercaptoathanol + 10-4 M EDTA, pH 7,0) dialysiert worden war. Die Inkubation des Gemisches erfolgte fur 1 Stunde bei 30°C im Dunkeln. Nach Ablauf der Reaktion wurden 4 ml Salkowski-Reagenz hinzugesetzt und fur weitere 25 min inkubiert. Nach Zentrifugation wurde die Absorption in einem Spektrophotometer (Zeiss PQM II) bei 530 nm bestimmt. Ais Enzymeinheit (U) definicrten wir die Enzym­menge, die bei 30 "C in einer Minute 1 ,amol IES umsetzt. Spezifische Aktivitiit bezeich­net die Aktivitat pro mg Protein. Die Proteinbestimmung erfolgte nach LOWRY et al. (1951). Zur Untersuchung der Abhangigkeit der IES-Oxidase-Aktivitat von Gallussaure wurden verschiedene Konzentrationen der Phenolcarbonsaure zum Enzym-Testsystem zugesetzt und die Enzymaktivitaten bestimmt.

Ergebnisse

Nachdem fiir Phycomyces blakesleeanus der Nachweis eines IES abbauenden En­zymsystems mit einer spezifischen IES-Oxidase-Farbung auf Polyacrylamid-Gelen erbracht war, blieb die Frage offen, ob die Oxidation zu 3-Methylenoxindol durch spezifische IES-Oxidasen oder unspezifische Peroxidasen katalysiert wiirde. Zur KIarung diente eine Auftrennung von ungereinigtem Pilzextrakt mittels der Disk­Elektrophorese und eine Anfarbung mit Benzidin und Guajakol als Wasserstoffdo­nator auf Peroxidasewirkung nach der von SCHRAUWEN (1966) beschriebenen Me­thode. Es zeigte sich, daB mit den fur die IES-Oxidase-Isolierung verwendeten Ex­traktionshedingungen (0,067 M Phosphat puffer, pH 7) nur geringer Peroxidase-Ak­tivitats-Nachweis mit Benzidin-Guajakol-Farbung auf Polyacrylamidgelen in Phy-

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comyces-Extrakten zu ftihren war. Nur in Zinkkulturen konnte auf den Polyacryl­amidgelen Peroxidaseaktivitat nachgewiesen werden, wie sie in Abbildung 1 darge­stellt ist.

Skt.

60

40

20

Skt. 60

40

20

I e

Zn MH

I I I It>

Zn SH

ZnMO

e

Zn SO

I I I I I e It> e It>

Fig. 1: Patterns of peroxidase isoenzymes in zinc sufficient cultures (Zn) of Phycomyces blakesleeanus MH and SH = Mycelium and sporangiophores from light cultures MD and SD = Mycelium and sporangiophores from dark cultures.

Aus der Abbildung 1 geht hervor, da~ nur maximal 2 Isoenzymbanden eine ge­rade noch nachweisbare Peroxidaseaktivitat in dem verwendeten Nachweissystem zeigten, wahrend die Zinkmangelkulturen nur 1 oder 2 Banden aufwiesen, die un­terhalb der Nachweisgrenze des Photometers lagen. Die Anfarbungen wurden nur erhalten, wenn anstelle der in der Literatur tiblichen Reaktionszeit von 10 min die­se auf mindestens 30 min ausgedehnt wurde. Eine Aktivitatserhohung durch gro~ere Auftragsmengen der Proteinfraktion war nicht moglich, da die mit Amidoschwarz gefarbten Kontrollgele zeigten, da~ das oberste Auflosungsvermogen des Trenngels erreicht war. Da auch im optischen Test mit der Guajakol-Farbreaktion (Messung des gebildeten Farbstoffs bei 436 nm; BERGMEYER, 1974) kein Nachweis zu erzielen

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war, mu£~ angenommen werden, dag die auf Polyacrylamidgelen aufgetrennten und angefarbten 1soenzymbanden (HILGENBERG et a!., 1976) im wesentlichen IES-Oxi­dase-Aktivitat und nur vereinzelt auch geringe Peroxidase-Aktivitat zeigen. Weitere Untersuchungen, durch veranderte Extraktionsbedingungen (pH -Verschiebung, Phosphat-Konzentrationsanderung im Puffer) erhohte Peroxidase-Aktivitat im Ex­trakt zu erhalten, verliefen ebenfalls negativ und bestatigten dieses Ergebnis.

Da polyacrylamidgelelektrophoretische Trennungen in allen untersuchten Fallen auf Grund der intensiven Untergrundfarbung der Gele eine quantitative Auswer­tung der Banden nicht einwandfrei gestatten, wurde zur Bestimmung der IES-Oxi­dase-Aktivitat die Umsetzung der IES in einem spektrophotometrischen Enzymtest gemessen. Dabei kamen Extrakte verschieden angezogener Kulturen zur Verwen­dung und gleichzeitig wurden Sporangiophoren und Mycel von Phycomyces blakes­leeanus getrennt untersucht. Die Ergebnisse der umgesetzten IES-Mengen in einer Stunde pro mg Protein der Extrakte von Kulturen unterschiedlicher Anzuchtsbe­dingungen gibt Tabelle 1 wieder.

Tab. 1: IES-Oxidasc-Aktivitat in Kulturen bei verschiedenen Anzuchtsbedingungen.

Zinkmangel­knlturen

Zinkkulturen

umgesetzte lES pro h und mg Protein in .lIg

spezifischc lES-Oxidase-Aktivitat in mU

umgesetzte lES pro h und mg Protein in ,lIg

spezifische lES-Oxidase-Aktivitat in mU

Mycel hell dunkel

15,14 6,7

1,18 0,52

9,6 4,6

0,75 0,36

Sporangiophoren hell dunkel

80,85 48,59

6,33 3,8

42,2 25,5

3,3 2,0

Tabelle 1 zeigt, dag der weitaus groBte Teil der IES-Oxidase-Aktivitat in den Sporangiophoren vorliegt. Ein Vergleich der Hell- und Dunkelkulturen untereinan­der sagt aus, daB die Aktivitat in den Sporangiophoren von Hellkulturen knapp doppelt so hoch liegt wie in denen von Dunkelkulturen und im Mycel von Hellkul­turen etwa das 2,5fache von der der Dunkelkulturen ausmacht. Dies gilt gleicher­maBen fur Zink- und Zinkmangelkulturen. Vergleicht man dagegen die Aktiviraten der Extrakte aus beiden Anzuchtsbedingungen untereinander, so zeigt sich, daB die IES-Oxidase-Aktivitat in allen Extrakten der Zinkmangelkulturen doppelt so hoch liegt wie die solcher Kulturen, die unter Zusatz von Zink zur Nahrlosung angezo­gen wurden. Dies gilt fur Sporangiophoren wie fur Mycelmaterial.

Die Aufarbeitung der Kulturen geschah deshalb getrennt nach Sporangiophoren­und Mycelmaterial, wei I Vorversuche gezeigt hatten, dag Unterschiede der 1ES-

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Oxidase-Aktivitat von ungetrenntem Material (Hell- und Dunkelkulturen) auf den Sporangiophorenanteil des Gesamtmaterials zuriickzufiihren waren. Deutlicher kam dies noch bei Kulturen zum Ausdruck, die 6 Tage lang auf der Schiittelmaschine angezogen wurden. Das dauernd submers gehaltene Mycel bildete unter solchen Be­dingungen im Licht nur kleine Hohlkugeln aus, in deren Innenraum winzige Spo­rangiophoren ragten, deren Anteil am Trockengewicht, verglichen mit dem des My­eels, verschwindend gering war. 1m Dunkeln dagegen war eine Tendenz zur stiirke­ren Sporangiophorenentwicklung an den Kugeln selbst, wie auch durch eine ver­starkte Anheftung von Mycel an die KulturgefaBwand festzustellen. Tabelle 2 zeigt die IES-Umsetzung in {lg pro mg Protein und Stunde yom Extrakt der unter Schiit­telbedingungen angezogenen Kulturen verglichen mit normalen Standkulturen, bei den en der Sporangiophorenanteil am Trockengewicht wesentlich hoher lag.

Tab. 2: Vergleich der IES-Oxidase-Aktivitat von Standkulturen mit Schiittelkulturen.

hell dunkel umgesetzte IES pro h und mg

Schiittelkulturen Protein in flg 2,6 4,7

spezifische IES-Oxidase-Aktivitat inmU 0,2 0,37

umgesetzte IES pro h und mg Protein in flg 20,7 25,66

spezifische IES-Oxidase-Aktivitat Standkulturen

inmU 1,62 2,0

Aus Tabelle 2 wird deutlich, daB die 6 Tage alten ungetrennten Normalkulturen etwa die siebenfach hohere IES-Oxidase-Aktivitat aufweisen als die gleichlang an­gezogenen Schiittelkulturen. Die hier auftretende hohere Aktivitat in den Dunkel­kulturen kann damit erklart werden, daB die Fahigkeit zur Sporangiophorenent­wicklung von im Dunkeln angezogenen Schiittelkulturen, verglichen mit Hellkultu­ren, starker ist. Die gesteigerte Enzymaktivitiit kann mit Sicherheit auf den erhoh­ten Sporangiophorenanteil der Schiittelkulturen in Dunkelheit zuriickgefiihrt wer­den.

Da es sich in den Enzymtests zeigte, daB bei 0,25 mM Gallussaurezusatz die En­zymaktivitat unterschiedlicher Extrakte etwa 50 Ofo gehemmt werden konnte, sollte eine Gallussaurekonzentrationsreihe, zugesetzt zum Testansatz, ein genaues Bild iiber die Hemmwirkung der IES-Oxidase liefern. Gallussaure wurde in Konzentra­tionen zwischen 0,025 mM und 2,5 mM zugesetzt und die Abnahme der IES-Oxi­dase-Aktivitat nach 1 h gemessen. Verwendet wurde der Extrakt einer 6 Tage im Licht angezogenen Normalkultur.

Abbildung 2 gibt den Verlauf der Aktivitatsabnahme bei Erhohung der Gallus­saurekonzentration wieder. Bei 2,5 mM Gallussaurezusatz entspricht die Aktivitats-

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~ 75

] :; ~ ~ 50 >­N C W

25

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\ 0\

~'-----0----------_______ 0 __

0,25 0,75 1,25

Gallussdure [mMJ

2,5

Fig. 2: The activity of indole-3-acetic acid oxidase from Phycomyces blakesleeanus inhibited by gallic acid in an in vitro test.

minderung der IES-Oxidase etwa 88 %. Eine erkennhare Hemmung tritt erst hei 0,025 mM Gallussaurekonzentration ein, his hei einer Konzentration von 0,25 mM 47 % der Ausgangsaktivitat gehemmt wird. Die Kurve der Inaktivierung zeigt hei hoheren Gallussaurekonzentrationen einen exponentiellen Veri auf.

Diskussion

In mehreren Arheiten (VAN DER MAST, 1969; SEQUEIRA und MINEO, 1966; JANS­SEN, 1969) konnten IES-Oxidase-Fraktionen nach Gelfiltration nachgewiesen wer­den, die frei von Peroxidase-Aktivitat waren. SIEGEL und GALSTON (1967) versuch­

ten eine Erklarung fiir dieses Verhalten zu finden, indem sie elektrophoretisch ge­rcinigte Meerrettich-Peroxidase mit kaltem angesauerten Aceton behandelten. Durch diese Einwirkung wird die prosthetische Gruppe der HRP yom Apoenzym getrennt. Das Apoenzym verliert hierhei seine Aktivitat gegeniiher Peroxidasesuh­straten wie Guajakol, zeigt aher weiterhin IES-Oxidase-Aktivitat. Es scheint, daB zur Oxidation der IES in diesem Fall die prosthetische Hamgruppe der HRP nicht notwendig ist oder durch Manganionen und Dichlorphenol ersetzt werden kann. Da in Phycomyces-Extrakten mit den angegehenen schonenden Extraktionsmetho­den nur geringc Peroxidase-Aktivitat nachzuweisen war, - die meisten Proteinhan­den hesaBen keine oder, wenn in Einzelfallen, dann nur geringe Peroxidase-Aktivi­tat - ist in diesem Organismus mit iiherwiegend spezifischen IES-Oxidasen zu

rechnen. Diese Enzymaktivitat scheint nach den vorliegenden Ergehnissen groBten­teils in den Sporangiophoren vorzuliegen. Da an deren Spitz en die Streckungszonen und dam it die One des eigentlichen Streckungswachstums lokalisiert sind, sollte

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hier der Organismus tiber ein Regulationssystem des endogenen Wuchsstoffgehaltes verftigen. DaB IES ftir das Wachstum des Pilzes und speziell das Sporangiophoren­wachstum notwendig ist, kann aus dem ersten nachweisbaren Auftreten im Verlauf der Entwicklung des Pilzes zu Beginn des Sporangiophorenwachstums geschlossen werden (BURSTELL und HILGENBERG, 1975). Eine erhohte IES-Oxidase-Aktivitat in dies em Bereich erscheint daher sinnvoll. Der niedrigere Gehalt an IES-Oxidase-Ak­tivitat in Zinkkulturen gegentiber Zinkmangelkulturen steht in Einklang mit dem zu beobachtenden verstarkten Wachstum der Reproduktionsorgane des Pilzes bei Zinkzusatz zur Nahr16sung. Eine niedrige IES-Oxidase-Aktivitat konnte einen ho­heren Wuchsstoffgehalt im Organismus hervorrufen, was das verstarkte Wachstum in Zinkkulturen erklaren wtirde, vorausgesetzt, daB die IES-Biosynthese in Zink­und Zinkmangelkulturen gleich hoch liegt. Auch die Korrelation von Wachs tums­verhalten und IES-Oxidasegehalt der Schtittelkulturen laBt sich mit diesen Vorstel­lungen in Einklang bringen. Die Bedeutung des Ox in dol systems liegt dann jedoch allein in der Inaktivierung der endogenen IES. Die ftir den Pilz notwendige Befa­higung zum H 20 2-Abbau braucht auch bei der gering en Peroxidaseaktivitat kein Problem darzustellen, denn der Pilz verftigt tiber erhebliche Katalaseaktivitat (HIL­GENBERG und LUKEN, 1978). Die Konzentration an Gallussaure, mit der eine er­kennbare Hemmung der IES-Oxidase in Phycomyces blakesleeanus erzielt werden kann, liegt tiber der Konzentration der Chlorogensaure, mit der PILET (1964) das IES-Oxidase-System in Linsenwurzeln signifikant hemmte. Ein Vergleich mit Ergeb­nissen von KAHL und MULLER (1976), die die Phosphoglucomutase in Extrakten aus Kartoffelknollen bei Zugabe von 1 mM Gallussaure nach einer Stunde nur zu 60 0J0 hemmen konnten, wahrend bei Zusatz der gleichen Konzentration an Chi orogen­saure nicht mehr als 20 0J0 Aktivitat dieses Enzyms im Extrakt vorhanden war. Dies deutet auf eine starkere Hemmwirkung der Chlorogensaure, verglichen mit der Gallussaure, gegentiber enzymatischen Reaktionen hin. Dieses Ergebnis darf aber nicht tiberbewertet werden, solange tiber die Kompartimentierung der IES­Oxidase im Organismus nichts bekannt ist. Da tiber die Lokalisation der IES-Oxi­dase-Aktivitat in Phycomyces blakesleeanus und anderen untersuchten Objekten noch keine Aussage gemacht werden kann, bleibt die Frage offen, ob eine Hemm­wirkung der Gallussaure auf die IES-Oxidase, die in vitro nachweisbar ist, im in­takten Organismus tiberhaupt verwirklicht wird.

Frau BRIGITTE GLUCK danken wir fur ihre ausgezeichnete technische Assistenz. Der Heinz Thomae GmbH sind wir fur eine Sachs pen de zu Dank verpflichtet.

Literatur

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Prof. Dr. W. HILGENBERG, Fachbereich Biologie - Botanik der Universitat, SiesmayerstraEe 70, D-6000 Frankfurt, BRD.

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