Acta hi stoehem. 76, 89-96 (1985)

Anatomisches Institut der Universitiit Basel, Schweiz (Loitung: Prof. Dr. med. K . S. LUDWIG,Prof. Dr. med. D. SASSE)

Das Verhalten von Glykogen und Enzymaktivitaten des Kohlen­hydratstoffwechsels wahrend der physiologischen Degeneration

des Gaumenplattenepithels

Glycogen and the activities of enzymes of carbohydrate metabolism during thephysiological degeneration of the epithelial cells of the secondary hard palate

Von JEAN FASEL

Mit 3 Abbildungen

(Eingegangen am 21. Miirz 1984)

Zusammenfassung

Der sekundare harte Gaumcn ent steh t durch Verschmelzung der seitlichen Gaumenplatten.Deren Epithel verschwindet dabei in der Fusionszone. Di eses Beispiel physiologischer Degenerationwurde in entsprechenden Stadien der Fetalentwicklung des Goldhamsters mit qualitativ-histo­che m ischen Techniken untersucht. Nachgewiesen wurden der Glykogengehalt und die Enzym­aktivitiiten von Phosphorylase, Glucose-6-Phosphat-D ehydrogenase (G6PDH), Lactat-Deh ydro­genase (LDH) und Succinat-Deh ydrogenase (SDH).

Zum Zeitpunkt des Kontakts der Gaumenplatten zeigt das Epithel im Fusionsbereich einelei chte Zunahme de s Glykogengehalts sowie der Akt.ivitaten von Phosphorylase, LDH und SDH.Di ese Enzymaktivitiiten s ind bi s zur Auflosung des Epithelsaums naohweisbar, wiihrend di oG6PDH-Aktivitiit durchgeh end negativ bleibt.

Die Befunde deuten darauf hin , dall es hei diesem phy siolog isch en Zelluntergang nicht Zll

e inem allgemeinen Lei stungsv erlust in den betroffenen Zellen kommt, sondern zu einer metaboli.sch en Spezialisierung.

Summary

The secondary hard palate is formed by fusion of the right and left palatal shelves. Duringthis process the cells of the m edial edge epithelium (MEE) undergo autolysis. The present study,ca rr ied out on golden hamsters demonstrates that the glycogen content and the activities of phos­phorylase, lactate-dehydrogenase (LDH), and succinic dehydrogenase (SDH) increase in the MEE­cells wh en the palatal shelves con t ac t . These histochemical cha rac ter ist ics persist during the phaseof degeneration of MEE. Thus, the in creased glycogen co n tent of the degenerating cell s can n otbe ex pla ined by a decrease of activity of these enzymes.

Einleitung

Eine der Voraussetzungen fur die normale Entwicklung des sekundaren hartenGaumens ist die Degeneration des Epithels der Gaumenplatten in der Fusionszone(SHAH und HALPERIN; in PERSAUD 1981). Zum Mechanismus dieses Vorgangs gibtea 2 grundsatzliche Hypothesen: Nach POURTOIS (1966), SMILEY und KOCH (1972)ist der Tod der Epithelzellen genetisch determiniert ("programmed cell death");

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nach GARTNER et aI. (1978) hingegen erfolgt er unter dem Druck der aufeinander­stoBenden Gaumenplatten ("epithelial stretching") .

Hi stochemische Befunde im Verlauf dieser epithelia len Degeneration wurdenfilr den Glykogengehalt von DE ANGELIS (1969) , SHAH und CHAUDHRY (1974) , DRUM­l\lOKD et aI. (1974) sowie MELLER und BARTON (1979) beschrieben. Andere Unter­suchungen betrafen: cAMP (GREENE et aI. 1980) , di e saur e Phosphatase (SHAHund CHAUDHRY 1974 ; GREENE und PRATT' 1978 ; SHAH und CRAWFORD 1980) unddie Succinat-Dehydrogenase (GARTNER et aI. 1978) ; die Aktivitiit der Glutamin­synthetase wurde in Homogenaten bestimmt (GREENE und SALOl\lON 1981). Dagegenfehlen bisher histochemiseh e Untersuchungen der energieliefernden Enzymaktivi­taten , die in enger metabolischer Beziehung zum Glykogengehalt stehen .

. Ausgehend von den Befunden von SHAH und CHAUDHRY (1974), die beim Gold­hamster einen Glykogenanstieg im Epithel der Fusionszone bei Kontaktaufnahmezwischen rechter und linker Gaumenplatte registrierten, wurde die Arbeitshypothescaufgestellt, daf3 die Zunahme des Glykogengehalts in den degenerierenden Zellendurch eine allmahliche Verringerung der Aktivitiiten energieliefernder Enzymebedingt wird.

Material und Methoden

Al s Versuehstiere wurden Gold ha mste r (Meaocricetu s ouratus ; aus institutseigener Zueht)ge wa hlt , weil s ie sieh fur e ine se hr genaue Datierung der Embryonal - und Fetalstadien besondorsgut. e ignen . Nach \VARD (1948) gil t als Zeitpunkt 0 di e Uhrz ei t 01 h des Tages, wel ch er auf donTag del' beobachteten K opulation (zwi sch en 18 h und 19 h) folg t , Aile Mut.tert.iere wurden be ie ine r H ellphase von 07 h bi s 19 h bei 20 °C gehalten, sic er h ielten Normalfutter und Wasser adlibitum.

D ie Totung der Muttert iere er folg te durch Aetherinhalation zu folg enden Zeitpunkten derGestation: II d 12 h , II d 18 h, 12 d 00 h und 12 d 06 h . Di e Embry on en wurden aus den Uterus­h ull en en t n om m en und sofort a uf e ine Edelstahlplatte bei -80 · C aufgefroren. Sie wurden dannin di ch t, verschlietsenden GefaBcn in e ine r Tiefkiihltruhe bei -80 °C bi s zur weiteren Verarbeitunggolagert, Pro Muttertier wurden je 2 F eten fur die lupenanatomisch e Untersuchung der Gaumen­fu sion in 70 % Alkohol Fixiert ,

Von den Kopfen del' boi - 80 °C gelagerten Ernbryonen wurden fron tale, 10 p.m d ieke Kryo­s tatschnitte angefertigt (fur den Phosphorylase-Nachweis 20 p.m) . Die Region, in der das jew eil sin t.eress ierende Stadium del' Gaumenplattenentwicklung er reich t war, wurde in Serie geschnitten.An den aufeinanderfolgenden Gefrierschnitten wurden folgende Nachweise durchgefiihrt :

Glykogen: P AS-Reaktion nach McMANUS (1948) mit del' Modifikation des Schiffschen R ea gen snach GRAUMANN (1953).

Phosphorylase: nach TAK~:UCur und KURIAKI (1955) mit e inem nach Ln'DBERG und PALKAMA(1972) modifizierten Inkubationsmedium.

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH): nach RIEDER et a l. (1978), verbunden m it del'Lipidextraktion nach JA COBSEN und JORGENSEN (1973).

L actat-Dehudroqenase (LDH) : anschlieuend an eine Lipidextraktion mit 100 % Chl oroform bei± 0 °C. Nachweis analog nach R IEDER et al . (1978) .

Succinat-Dehsfdroqena se (SDH) : na ch GOEBEL und P UCHTLER (19 55) mit der ~Iodifikation

nach N UBER et al. (1980).

Ergebnisse

Die histochemischen Befunde wurden in folgenden Entwicklungsstadien dessekundaren harten Gaumens erhoben (Abb. 1):

V: die Ga umenpla t ten stehen ver t ikal neben der Zunge.H : die Gaumenplatten stehen - noch deutlieh voneinander entfernt - horizontal

tiber der Zunge.

Abb. 1. Grundsatzliche Stadien der Entwicklung des aekundaren harten Gaumens. Ansicht voncaudal nach Resektion des Unterkiefers und der Zunge. Aile Vergrofierungen 10: 1. Definitionder Abkiirzungen s. Text..

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V H Fa F1 F2 FJStadium

~~ :;) C ::»C ::I: ..... --- -+ + + +

Glykogcn - + + - + + --- - - - - -

+ + + + +Phosphorylase - + - + + --

- - - - - -

+ - - - - - -G6POH - - - - -- - - - - -

+ + + + + + +LOH - - 4- + -

- + + + + -

- - - + + +SOH + - - + + -- + - - - +

Abb. 2. Synopsis der Verteilung von Glykogen sowie der Aktivitaten von Phosphorylase, G6PDH,LDH und SDH im Epithel der Gaumenplatten wahrend der Entwicklung des sekundaren hartenGaumens. Aktivitaten: + deutlich, - keine oder seh» achwach.

F: die seitlichen Gaumenplatten fusionieren. Dieses Stadium laBt sich wie folgtunterteilen:

F o: unmittelbar praefusionales Stadium.F 1: die Gaumenplatten sind in Kontakt getreten, so daB ihre epithelialen "Ober­

ziige einen einheitlichen Saum bilden.F 2 : der Epithelsaum wird durch die beginnende mesenchymale Durchwachsung

in Epithelperlen zerlegt.F s: der Epithelsaum ist vollstandig verschwunden.

Die histochemischen Parameter verhielten sich wahrend dieser Stadien wie folgt(Abb. 2,3):

Glykogen: Das Epithel der Gaumenplatten ist an der prospektiv oralen Flachewahrend der ganzen Entwicklung des sekundaren harten Gaumens frei von Glykogen.Die nasale Flache dagegen ist - insbesondere in ihrem lateralen Anteil - konstantP AS-positiv. Das Epithel der medialen Flache ist bis unmittelbar praefusional(Fo) glykogenfrei, wird aber bei der Kontaktnahme der Platten (F1) PAS-positiv.Der Glykogengehalt der Zellen nimmt wahrend der Auf10sung des Epithelsaums(F 2 ) nicht abo Erst nach dem vollstandigen Verschwinden der letzten epithelialenZellreste (Fs) ist keine Perjodat-Reaktivitat mehr vorhanden.

Phosphorylase: Die Verteilung der Phoaphorylase-Akbivitat im Epithel der Gau­menplatten entspricht ortlieh und zeitlich dem Glykogengehalt.

G6PDH: Eine deutliche Aktivitat der G6PDH ist nur im Epithel der prospektivoralen Flache im Stadium der vertikalen Gaumenplatten (V) nachweisbar, die iibri­gen Epithelbereiche verhalten sich in allen Stadien negativ.

Abb. 3. Befunde in den Stadien Fo, F 1 und F 2• Erlauterungen im Text.

Glykogen

Phospho­rylase

G6 POH

LOH

SOH

.... -.

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LDH: Die LDH-Aktivitat im Epithel der medialen Flache fehlt bis unmittelbarpraefusional (Po), wird dann nachweisbar (F1 und F 2 ) und verschwindet im StadiumFa' An der oralen Flacho ist das Epithel in allen Stadien positiv mit Ausnahme vonFa' Die nasale Flache ist durchgehend positiv. .'

SDH: Das Epithel der oralen Flache zeigt eine positive SDH-Reaktion, mit Aus­nahme der Stadien F o bis F 2• An der medialen Flache ist eine SDH-Aktivitat bisunmittelbar praefusional nicht, anschlieBend (F1 und F 2 ) deutlich nachweisbar.Das nasale Epithel ist praefusional negativ, dann (F1 bis Fa) durchgehend positiv.

Diskussion

Der G1ykogengehalt in den Epithelzellen der Gaumenplatten wahrend der Entwicklung dessekundaren harten Gaumens wird unterschiedlich beschrieben: DEANGELIS (1969: Ratte, Maus)sowie MELLER und BARTON (1979: Mensch) fanden unmittelbar praefusional einen Abfall desGlykogens in den oberf'lachlichen Epithelzellen der Flusionszone. Diese Abnahme des Glykogen­gehalts wird von den genannten Autoren damit gedeutet, daB diese Polysaccharidreserve fiirdie Synthese von Glykoproteiden verwendet wird, urn durch die Bildung einer Glycocalix unmittel­bar praefusional die Voraussetzung fur die Verschmelzung der Epithelzellen zu schaffen (PRATTund HASSELL 1975; GREENE und SALOMON 1981). SHAH und CHAUDHRY (1974: Goldhamster)dagegen stellten eine Zunahme des Glykogens in den Epithelzellen der Fusionszone bei Kontakt­aufnahme der beiden Gaumenplatten fest. Diese Befunde werden durch die vorgelegten Unter­suchungen bost.at.igt.. Auch die quantitativen Daten von DRUMMOND at al. (1974: Kaninchen)deuten eher auf eine Erhohung des Glykogengehalts hin, obwohl die Homogenatmessungen nichtnur Epithelzellen umfaBten.

Die widerspruchlichen Befunde sind wahrscheinlich als Species-Varietaton anzusehen, dabei der gleichen Species Goldhamster die eigenen Resultate mit den von SHAH und CHAUDHRY(1974) erhobenen Befunde iibereinstimmen.

Ais Ursache fur die Glykogenzunahme vermuteten SHAH und CHAUDHRY (1974) einen ver­minderten Energiebedarf in den fusionierenden Epithelien oder einen Aktivitatsverlust vonglykogenolytischen Enzymen. Gegen eine solohe Interpretation sprechen die hier vorgelegtenenzymhistochemischen Befunde: Mit Ausnahme der G6PDH nehmen aile untersuchten Enzymebei der Kontaktaufnahme der beiden Gaumenplatten an Aktivitiit zu und sind auch noch wahrendder Auf'losung des Epithelsaums nachweisbar. Dieses Verhalten wurde fur die SDH-Aktivitiitauch von GARTNER et al, (1978: Wiistenmaus) beobachtet und als mit autolytischen Vorgangenin der Zelle unvereinbar gewertet: Im Gegensatz dazu stehen die Befunde von FALLON et al.(1974), die auch in degenerierenden Zellen SDH-Aktivitaten messen konnten. Nach den Aus­fiihrungen von WYLLIE (in BOWEN und LOCKSHIN 1981), wonach der physiologische Zelltod(im Gegensatz zur pathologischen Nekrose) ein Energie verbrauchender Prozel3 ist , ist die SDHsogar Voraussetzung fur die physiologische Degeneration, also ein Hinweis auf die Richtigkeit derprogrammed cell death-Hypothese. Damit vereinbar ist auch das Persistieren derLfjHi.Akt.ivitat.

Die Erhohung der Phosphorylase-Aktivitiit und damit von Gluoose-L'Phosphat bei Kontakt­aufnahme der Gaumenplatten ist mit der erstmals von PRATT und HASSEL (1975) vorgebrachtenAnsicht vereinbar, dal3 Glykoproteide in die Glycocalix eingelagert werden und so eine Klebrigkeitder Oberf'lache bedingen, die das Aneinanderhaften der Gaumenplatten erlaubt , Unter diesemAspekt wiirde der G1ykogengehalt iiber die Phosphorylase-Aktivitat als Bausubstrat-Speicherdienen, .

Die fehlende Akt.ivibat der G6PDH, des Leitenzyms des Pentose-Phosphat-Zyklus, kannals Hinweis entweder auf eine fehlende Nucleinsauresynt.hesc gewertet werden oder auf die Sistie­rung NADPH.abhangiger reduktiver Synthesen,

Das Verhalten der hier untersuchten Enzymakt.ivitaton in den degenerierenden Epithelzellender Gaumenplatten deutet darauf hin, daB es bei einern sol chen physiologischen Zelluntergangkeinesfalls zu einem allgerneinen Leistungsverlust in den betroffenen Zellen kommt, sondern zueiner offenbar kontrollierten m etabolischen Spezialisierung.

Verhalten von Glykogen und Enzyrnaktivitaten

Literatur

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Anschrift de s Verfassers : Dr. m ed . JEAN FABEL, Anatomisches Institut der Universitat., P esta­lozzistra13e 20, CH . 40 56 Basel.