Aus dem Institut für Zelluläre und Molekulare Physiologie
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Christoph Korbmacher
Charakterisierung des L-Typ Ca2+-Stroms
im linken Ventrikel des Herzens
von Gα11-defizienten Mäusen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Vera Schütz
aus
Bamberg
Erlangen 2011
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler
Referent: Prof. Dr. med. Tilmann Volk
Korreferent: Prof. Dr. med. Christoph Korbmacher
Tag der mündlichen Prüfung: 06.04.2011
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................ iv
Zusammenfassung ............................................................................................................ 1
Summary........................................................................................................................... 2
1. Einleitung ..................................................................................................................... 3
1.1 Der Erregungszyklus im Säugerherzen .................................................................. 3
1.2 Das ventrikuläre Aktionspotential und die ihm zugrunde liegenden Ionenströme 4
1.2.1 Die Ionentheorie der Erregung.......................................................................... 4
1.2.2 Ionenkanäle und Ganzzellströme...................................................................... 7
1.2.3 Das Aktionspotential der ventrikulären Kardiomyozyte .................................. 8
1.2.4 Kardiale spannungsabhängige Ca2+-Ströme ................................................... 11
1.2.5 Der kardiale L-Typ Ca2+-Strom...................................................................... 11
1.2.6 Kardiale spannungsgesteuerte K+-Ströme ...................................................... 13
1.2.6.1 Molekularer Aufbau von K+-Kanälen .................................................... 13
1.2.6.2 Der transiente K+-Auswärtsstrom Ito ...................................................... 14
1.2.6.3 Die auswärtsgleichrichtenden K+-Ströme .............................................. 15
1.2.7 Die Interaktion von ICaL und Ito bestimmt den AP-induzierten Ca2+-Influx ... 15
1.2.8 Bedeutung der Ca2+-Dynamik - elektromechanische Kopplung und langfristige
Regulationsmechanismen............................................................................... 15
1.3 Regulation der Herzfunktion ................................................................................ 16
1.3.1 G-Proteine als intrazelluläre Signalträger für extrazelluläre Botenstoffe....... 17
1.3.2 Die Bedeutung von Gαq und Gα11 .................................................................. 19
1.3.3 Mechanismen der Regulation des kardialen L-Typ Ca2+-Stroms................... 21
1.3.4 Regulation der Genexpression von Cav1.2 ..................................................... 23
2 Material und Methoden ............................................................................................... 24
2.1 Verwendete Tiere ................................................................................................. 24
2.2 Isolation von Kardiomyozyten für die elektrophysiologischen Experimente ...... 24
2.3 Elektrophysiologische Methoden ......................................................................... 26
2.3.1 Die Patch-Clamp Technik............................................................................... 26
2.3.1.1 Die cell-attached Konfiguration............................................................. 26
2.3.1.2 Die whole-cell Konfiguration ................................................................. 27
2.3.1.3 Die Spannungsklemme...........................................................................27
2.3.2 Der Patch-Clamp Versuchsstand .................................................................... 28
2.3.2.1 Die mechanischen Komponenten ........................................................... 28
2.3.2.2 Die elektronischen Komponenten .......................................................... 29
2.3.2.3 Die Pipetten ............................................................................................ 30
2.4 Durchführung der elektrophysiologischen Experimente...................................... 30
2.6 Pulsprotokolle....................................................................................................... 31
2.6.1 Bestimmung des L-Typ Ca2+-Stroms (ICaL) .................................................... 31
2.6.2 Bestimmung der Steady-State Inaktivierung von ICaL .................................... 31
2.6.3 Bestimmung der Erholung von der Inaktivierung von ICaL ............................ 31
2.7 Untersuchung der Expression der Cav1.2-Untereinheit durch Western Blots...... 32
2.8 Versuchslösungen................................................................................................. 33
2.9 Auswertung........................................................................................................... 34
2.9.1 Auswertung der elektrophysiologischen Experimente ................................... 34
2.9.1.1 Auswertung der mittleren Strom-Spannungsbeziehung von ICaL........... 34
2.9.1.2 Untersuchung der Aktivierungskinetik von ICaL..................................... 34
2.9.1.3 Bestimmung der Zeitkonstanten der Inaktivierung von ICaL .................. 35
2.9.1.4 Auswertung der Steady-State Inaktivierung von ICaL............................. 35
2.9.1.5 Untersuchung der Erholung von der Inaktivierung von ICaL.................. 35
2.9.2 Auswertung der Western Blots ....................................................................... 36
2.9.3 Statistik ........................................................................................................... 36
2.10 Genehmigung der Organentnahmen...................................................................36
3. Ergebnisse................................................................................................................... 37
3.1 Charakterisierung des L-Typ Ca2+-Stroms........................................................... 37
3.2 Untersuchung der Expression von Cav1.2 ............................................................ 44
4. Diskussion .................................................................................................................. 45
4.1. Veränderungen des L-Typ Ca2+-Kanals in gna11-/--Mäusen............................... 45
4.1.1 Stromdichte und Cav1.2-Expression ............................................................... 45
4.1.2 Kinetik des ICaL in gna11-/--Kardiomyozyten.................................................. 46
4.2 Einfluss des Gαq/Gα11-Signalwegs auf ICaL im Mausventrikel............................. 47
4.3 Elektrophysiologische Veränderungen im linken Ventrikel von Gα11-defizienten
Mäusen................................................................................................................. 48
4.3.1 Konsequenzen für den AP-induzierten Ca2+-Einstrom................................... 49
4.3.2 Veränderungen von ICaL als Ursache für Veränderungen von Ito.................... 49
4.3.3 Der Einfluss von KChIP2b auf ICaL ................................................................ 50
4.4 Pathophysiologische Rolle des L-Typ Ca2+-Stroms und seiner Regulation durch
Gαq/Gα11-Signalwege bei kardialen Erkrankungen ............................................. 51
Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 53
Abbildungsverzeichnis ................................................................................................... 67
Tabellenverzeichnis ........................................................................................................ 68
Abkürzungen .................................................................................................................. 69
Danksagung .................................................................................................................... 71
Lebenslauf ...................................................................................................................... 72
Erklärung ........................................................................................................................ 73
1
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele: Der L-Typ Ca2+-Strom ist wesentlich an der ventrikulären
Kontraktion sowie an der Pathogenese kardialer Erkrankungen wie
Herzhypertrophie, Herzinsuffizienz und Rhythmusstörungen beteiligt. Seine
Regulation erfolgt unter anderem über ETA- und AT1- und α1-Rezeptoren, die unter
anderem G-Proteine der Gq/G11-Familie aktivieren. In dieser Arbeit wurde der L-Typ
Ca2+-Strom Gα11-defizienter Mäuse (gna11-/-) untersucht, um die Bedeutung des
Gα11-Signalwegs für die Regulation kardialer Ionenkanäle aufzuklären.
Methoden: Nach regionalspezifischer Isolation linksventrikulärer Kardiomyozyten
wurde der L-Typ Ca2+-Strom (ICaL) mit Hilfe der Patch-Clamp Technik gemessen. In
Western Blot Analysen wurde die Expression der Cav1.2-Untereinheit des Kanals
untersucht.
Ergebnisse: Bei 0 mV war die Stromdichte von ICaL in gna11-/--Myozyten um 14 %
geringer als in Kontrollzellen (-4.4 ± 0.2 pApF-1, n = 35 vs. -5.1 ± 0.2 pApF-1,
n = 49; p < 0.05). Es wurden keine regionalspezifischen Unterschiede gemessen. Die
schnelle Zeitkonstante der Inaktivierung (τ1) war in gna11-/--Zellen signifikant
verlängert (34.3 ± 1.4 ms vs. 30.8 ± 1.0 ms; p < 0.05 bei VPip = 0 mV). Die Cav1.2-
Expression war in gna11-/--Gewebe um ca. 15 % verringert (n.s., n = 3).
Schlussfolgerungen: Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Gα11, möglicherweise durch
Regulation der Proteinexpression, Einfluss auf ICaL im Mausventrikel nimmt. Dies
bedeutet, dass Gα11 vermutlich eine zentrale Komponente in Signalkaskaden ist, über
die verschiedene Rezeptoren den L-Typ Ca2+-Kanal beeinflussen und zur
Veränderung der Elektrophysiologie unter pathologischen Bedingungen führen
können.
2
Summary
Background and aims: The L-type Ca2+ current plays an important role in ventricular
contractility as well as in the pathogenesis of diseases like cardiac hypertrophy, heart
failure and arrhythmia. The α1-adrenoceptor as well as the ETA- and the AT1-
receptors contribute to its regulation under physiological but also under pathological
conditions. These receptors couple to G proteins of the Gq/11 family. Here we
investigate the L-type Ca2+ current in mice deficient of the Gα11 protein (gna11-/-) to
clarify the role of Gα11 signaling in cardiac ion channel regulation.
Methods: After the isolation of myocytes from the endo- and epicardial region of the
leftventricular wall the L-type Ca2+ current was measured using the ruptured-patch
whole-cell patch-clamp technique. Western Blots were used to investigate the
expression of the channels Cav1.2 subunit.
Results: At 0 mV myocytes from gna11-/- mice displayed a 14 % smaller current
density of ICaL than controls (-4.4 ± 0.2 pApF-1, n = 35 vs. -5.1 ± 0.2 pApF-1,
n = 49; p < 0.05). Differences between endo- and epicardial myocytes were not
detected. The fast time constant of inactivation (τ1) was longer in gna11-/- cells than
in wild type (wt) (34.3 ± 1.4 ms vs. 30.8 ± 1.0 ms; p < 0.05 at VPip = 0 mV). Western
Blots analysis revealed a 15 % decreased Cav1.2 expression in gna11-/- mice than in
wt (not significant, n = 3).
Conclusion: This work suggests that Gα11 influences ICaL in mouse ventricle,
possibly by regulating the protein expression. Thus Gα11 is probably a central
component of the signaling pathway by which several receptors regulate the L-type
Ca2+ channel and may contribute to changes in electrophysiology under pathological
conditions.
3
1. Einleitung
1.1 Der Erregungszyklus im Säugerherzen
Die rhythmische Kontraktion des Herzens beruht auf einer geordneten Abfolge
von elektrischer Erregung und Erregungsrückbildung im Myokard. Ausgangspunkt
dieses Erregungszyklus sind im gesunden Säugerherzen die spontan aktiven Zellen
des Sinusknotens in der Wand des rechten Vorhofs. Die Ausbreitung der generierten
Aktionspotentiale erfolgt über sogenannte gap junctions, elektrisch leitende
Verbindungen zwischen den einzelnen Kardiomyozyten. Zwischen Vorhöfen und
Ventrikeln wird die direkte Erregungsausbreitung durch die bindegewebige und
somit elektrisch isolierende Ventilebene verhindert. Hier erfolgt die Weiterleitung
nur über den Atrioventrikularknoten (AV-Knoten). Dies geschieht mit einer
Verzögerung von etwa 50 ms, um Vorhof- und Ventrikelkontraktion zu koordinieren.
Die Ventrikel verfügen über ein spezifisches Erregungsleitungssystem aus
His´schem Bündel, Kammerschenkeln und Purkinjefasern, welches eine schnelle und
geordnete Erregungsausbreitung über das Arbeitsmyokard gewährleistet. Zunächst
werden die Innenwand des interventrikulären Septums, die Papillarmuskeln sowie
die subendokardialen (im Folgenden als endokardial bezeichneten) Bereiche der
freien Wand erregt, bevor sich die Erregung weiter über midmyokardiale und
subepikardiale (im Folgenden als epikardial bezeichnete) Regionen und damit
schließlich über den gesamten Ventrikel ausbreitet (Kalusche & Csapo, 1997). Der
Ablauf der Erregungsausbreitung wird im Wesentlichen durch die
Ausbreitungsgeschwindigkeit im Erregungsleitungssystem und dessen anatomische
Struktur festgelegt. Die Rückkehr in den Ausgangszustand hingegen ist ein Prozess,
der von jeder Kardiomyozyte selbständig durchlaufen wird und somit von Form und
Dauer ihres individuellen Aktionspotentials abhängt. Solange sich jedoch die Zelle
im funktionellen Synzytium des Myokards befindet, wird ihr AP durch die
elektrische Kopplung von den Potentialen der Nachbarzellen mitbestimmt und kann
sich deutlich von dem einzelner isolierter Kardiomyozyten unterscheiden. Dies trägt
zu einer Synchronisierung der im Verhältnis zur Ausbreitung relativ langsam
ablaufenden Erregungsrückbildung bei (Conrath & Opthof, 2006).
4
1.2 Das ventrikuläre Aktionspotential und die ihm z ugrunde
liegenden Ionenströme
Die Basis der experimentellen Elektrophysiologie wurde um 1660 gelegt, als Jan
Swammerdan an präparierten Froschschenkeln einen Zusammenhang zwischen
Nervenstimulation und Muskelkontraktion aufzeigte (Verkhratsky et al., 2006).
Maßgeblichen Fortschritt erfuhr die Elektrophysiologie durch Luigi Galvani, der
1791 eine auf Ladungsverteilungen in Nerv und Muskel beruhende Bioelektrizität
postulierte. Deren zelluläres Korrelat konnte Julius Bernstein 1868 mit der ersten
Aufzeichnung eines Aktionspotentials darstellen (Bernstein, 1868). Die Aufklärung
über die Grundlagen der Bildung von Aktionspotentialen gelang Alan Hodgkin und
Andrew Huxley zwischen 1930 und 1960 mit Hilfe der von ihnen mitentwickelten
voltage-clamp Methode am Riesenaxon des Tintenfischs (Hodgkin et al., 1949;
Hodgkin & Huxley, 1952; Hodgkin et al., 1952). Für ihre Ionentheorie der Erregung
wurden sie 1963 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet.
1.2.1 Die Ionentheorie der Erregung
Jede Zelle wird von einer etwa 5 - 8 nm dicken Membran umschlossen, deren
Grundstruktur von Phospholipiden gebildet wird. Aufgrund derer amphiphiler
Eigenschaften entsteht eine Doppelschicht, in der sich die hydrophoben
Molekülenden einander begegnen, während die hydrophilen Enden zum wässrigen
Milieu des Intra- und Extrazellulärraumes weisen. Wenig polare und kleine Moleküle
wie Sauerstoff und Kohlendioxid können diese Lipiddoppelschicht permeieren. Für
Wasser und darin gelöste Stoffe sowie für größere oder geladene Teilchen wie
Proteine oder Ionen hingegen ist sie weitgehend undurchlässig. In die
Phospholipidschicht sind Membranproteine eingelagert, die als periphere Proteine
nur in der Innen- oder Außenschicht verankert sind oder als integrale Proteine die
gesamte Membran durchqueren. Zu letztgenannten zählen spezielle
Transportproteine sowie Kanalproteine. Durch sie besteht die Möglichkeit, nicht nur
die Zusammensetzung des intrazellulären Milieus, sondern auch das über der
Zellmembran anliegende elektrische Potential über aktive und passive
Transportprozesse zu kontrollieren.
5
Ion
Extrazelluläre
Konzentration (mM)
Intrazelluläre
Konzentration (mM)
Gleichgewichtspotential
(mV)
Na+ 145 12 +67
K+ 4 155 -98
Ca2+ 1.5 (frei) 10-4 (frei) +129
Cl- 123 4.2 -90
Tabelle 1: Freie Ionenkonzentrationen und Gleichgewichtspotentiale einer Skelettmuskelzelle, nach Hille (2001)
In Tabelle 1 sind die intra- und extrazellulären Ionenkonzentrationen am Beispiel
einer Skelettmuskelzelle von Säugetieren angegeben. Viele erregbare Zellen, so auch
Herzmuskelzellen, weisen vergleichbare Verhältnisse auf. Extrazellulär sind Na+ und
Cl- die vorherrschenden Ionen, hingegen dominieren im Zellinneren K+ als Kation
und negativ geladene Proteine als Anionen. Bemerkenswerterweise sind im
Intrazellulärraum normalerweise extrem niedrige Ca2+-Konzentrationen festzustellen.
Besteht über einer Membran für eine Ionenart ein Konzentrationsgradient, so
resultiert, vorausgesetzt die Membran ist für dieses Ion selektiv permeabel, eine
transmembranäre Potentialdifferenz. Entsprechend der chemischen Triebkraft
diffundieren die Ionen aus dem Kompartiment mit der höheren Konzentration auf die
Seite der niedrigeren Konzentration. Die damit erfolgende Ladungsverschiebung
ergibt eine Potentialdifferenz, die auf die Ionen eine dem Konzentrationsgradienten
entgegengesetzte elektrische Triebkraft ausübt. Gleichen sich beide Kräfte aus,
sodass netto kein Ionenfluss mehr stattfindet, stellt sich eine Spannung ein, die als
Gleichgewichtspotential bezeichnet wird. Dieses ist für jede Ionenart durch die
Nernst-Gleichung definiert:
[ ][ ]innen
außenX X
Xln
zFRT
E ⋅=
mit dem Gleichgewichtspotential Ex des betreffenden Ions, der allgemeinen
Gaskonstante R (8.314 J K-1 mol-1), der absoluten Temperatur T, der Ionenwertigkeit
z, der Faraday-Konstante F (96500 C mol-1) und den Ionenkonzentrationen auf der
Außen- und Innenseite der Membran [ ]außenX und [ ]innenX . Kommen Leitfähigkeiten für weitere Ionen hinzu, so ist die Nernst-Gleichung zur Goldmann-Hodgkin-Katz-
Gleichung zu erweitern, die hier in modifizierter Form mit Hilfe der
Ionenleitfähigkeiten dargestellt ist:
6
∑=X
Xm
Xm EG
GV
mit dem Membranpotential Vm, den Leitfähigkeiten Gx für jedes permeable Ion x,
der Gesamtleitfähigkeit Gm und den Gleichgewichtspotentialen Ex der jeweiligen
Ionen. Die Nernst-Potentiale der beteiligten Ionen werden demnach entsprechend
ihrer jeweiligen Anteile an der Gesamtleitfähigkeit gewichtet und ergeben summiert
das Membranpotential. Die im Falle einer typischen ventrikulären Kardiomyozyte
beteiligten Ionen sind Na+, K+, Ca2+ und Cl-. Hinzu kommt eine mit GL bezeichnete
unspezifische „Leckleitfähigkeit“. Als Membranpotential ergibt sich somit:
Lm
L-Cl
m
-ClCa2
m
Ca2K
m
KNa
m
Nam EG
GE
G
GE
G
GE
GG
EG
GV ++++= +
++
++
+
Im unerregten Zustand weist die Zellmembran erregbarer Zellen normalerweise
eine hohe K+-Permeabilität auf, während die Leitfähigkeiten für Na+, Ca2+ und Cl-
vernachlässigbar klein sind. Das Ruhemembranpotential kommt daher dem
Gleichgewichtspotential für K+ nahe: Vm ≈ EK ≈ -90 mV. Eine Änderung der
Leitfähigkeiten ruft einen transmembranären Strom bestehend aus den permeablen
Ionen hervor, bis sich entsprechend der Goldmann-Hodgkin-Katz-Gleichung das
neue Membranpotential eingestellt hat. Dieser Mechanismus liegt der Entstehung
eines Aktionspotentials zugrunde. Wird die Zelle über einen Schwellenwert hinaus
depolarisiert, sinkt die K+-Permeabilität, während GNa und kurz darauf GCa erheblich
ansteigen. Das Membranpotential nähert sich zunächst dem Gleichgewichtspotential
für Na+ an (ENa ≈ +67 mV). Nach kurzer Zeit stellen sich wieder die
Ausgangsverhältnisse ein. Der Na+-Einstrom sistiert und das Ansteigen der
K+-Permeabilität führt zu einem repolarisierenden K+-Ausstrom. Im Zusammenspiel
mit der nun ebenfalls rückläufigen Ca2+-Leitfähigkeit führt dies zu einer Rückkehr
auf das Ruhemembranpotential. Die während eines einzelnen Aktionspotentials
fließenden Ströme sind zu gering, um eine wesentliche Änderung der
Ionenkonzentrationen in den jeweiligen Kompartimenten zu bedingen. Dauerhaft
wird die spezifische Verteilung der Na+- und K+-Ionen auf beiden Seiten der
Zellmembran durch die Na+-K+-ATPase aufrechterhalten. Diese transportiert unter
ATP-Verbrauch jeweils 3 Na+-Ionen aus der Zelle heraus und gegenläufig 2
K+-Ionen in die Zelle hinein. Ebenso trägt der Na+-Ca2+-Transporter durch Austausch
von 3 Na+-Ionen gegen ein Ca2+-Ion zur Ca2+-Homöostase über der Zellmembran
bei.
7
1.2.2 Ionenkanäle und Ganzzellströme
Maßgeblichen Fortschritt erfuhr die Aufklärung der beobachteten Permeabilitäts-
änderungen durch die Patch-Clamp Technik (Neher & Sakmann, 1976; Hamill et al.,
1981). Ihre Anwendung konnte die Existenz der bereits zuvor postulierten
Ionenkanäle bestätigen, welche die Ströme über die Zellmembran bedingen.
Ionenkanäle sind integrale Membranproteine, die als Komplex aus hydrophilen und
hydrophoben Anteilen einen Kanal in der Zellmembran bilden. Dieser erlaubt einen
passiven Ionenfluss gemäß dem elektrochemischen Gradienten. Die Transportraten
erreichen dabei verglichen mit aktiven Transportprozessen (z.B. Na+-K+-ATPase)
sehr hohe Werte (ca. 107 Ionen/s). Ionenkanäle sind durch eine unterschiedlich
ausgeprägte Selektivität bezüglich der sie permeierenden Ionen charakterisiert. So
lassen sich zum Beispiel Na+-, K+-, Ca2+- oder Cl--spezifische Kanäle differenzieren,
während andere weniger selektiv sind und beispielsweise den Durchtritt von
Anionen, Kationen oder aller Ionen gleichermaßen ermöglichen (Hille, 2001).
Ionenkanäle können verschiedene Zustandsformen annehmen und damit ihre
Durchlässigkeit variieren. Das Schalten zwischen den einzelnen Zuständen (gating)
ist ein stochastischer und sehr schneller Vorgang, bei dem keine stetigen
Zwischenschritte auftreten (eine Ausnahme mögen so genannte sublevels einiger
Ionenkanäle darstellen, die jedoch ebenfalls diskreter Natur sind). Die
Wahrscheinlichkeit, mit der sich ein Kanal im offenen Zustand befindet, kann von
physikalischen Faktoren wie Temperaturänderung, mechanischen Kräften oder
Potentialänderungen beeinflusst werden. Auch chemische Einflüsse wie pH-Wert
und Signalstoffe können relevant sein. Dementsprechend unterscheidet man unter
anderem spannungsabhängige und ligandengesteuerte Ionenkanäle. Die
Öffnungswahrscheinlichkeiten multiplizieren sich mit den Einzelkanalleitfähigkeiten
und der Anzahl der Ionenkanäle zu der Gesamtleitfähigkeit der Zellmembran, welche
zusammen mit dem aktuellen Membranpotential, den Gleichgewichtspotentialen der
durchlässigen Ionen sowie den intra- und extrazellulären Ionenkonzentrationen den
Ganzzellstrom determiniert (Hille, 2001). Dieser ergibt sich in der Regel aus einer
Vielzahl von Strömen durch unterschiedliche Membranproteine, weshalb seine
Auftrennung und Bestimmung in die einzelnen beteiligten Ionenkanäle eine
experimentelle Herausforderung darstellt. Anders als die Schaltvorgänge eines
einzelnen Ionenkanals, zeigen Ganzzellströme stetige Übergänge zwischen
Aktivierung und Inaktivierung. Somit lässt sich das vereinfachte Modell eines
„mittleren“ spannungsabhängigen Ionenkanals entwerfen (Bromm, 1985; Lehmann-
8
Horn & Jurkat-Rott, 1999). Er besteht aus einer Pore, die von zwei Toren
verschlossen werden kann. Es ergeben sich drei mögliche Zustände, die
spannungsabhängig sequentiell durchlaufen werden. Im Ruhezustand ist die Pore des
Kanals durch das Aktivierungstor verschlossen. Der Kanal ist geschlossen aber
aktivierbar. Eine Depolarisation führt zu einer schnellen Konformationsänderung des
Aktivierungstors und damit zur Öffnung des Kanals. Bei anhaltender Depolarisation
tritt mit einer gewissen zeitlichen Verzögerung die Inaktivierungsdomäne in die Pore
ein und blockiert den Ionenstrom. Der Kanal ist nun offen aber inaktiviert. Neben
dieser Form der Inaktivierung sind auch andere, langsamer ablaufende
Inaktivierungsmechanismen bekannt, die auf Konformationsänderungen der
Porenregion selbst beruhen (Lehmann-Horn & Jurkat-Rott, 1999). Mit
Repolarisation der Zellmembran erfolgt die Erholung von der Inaktivierung; der
Kanal kehrt in den aktivierbaren Geschlossenzustand zurück. Tritt die Repolarisation
noch vor der Inaktivierung des Kanals ein, findet durch Schließen des
Aktivierungstors ein direkter Übergang zurück in den aktivierbaren
Geschlossenzustand statt. Dies wird als Deaktivierung bezeichnet. Diese stark
vereinfachte Darstellung bezieht sich wie erwähnt auf das stetige Verhalten von
Ganzzellströmen und nicht auf tatsächliche Abläufe an einzelnen Ionenkanälen. Das
entwickelte Modell ist jedoch bei der Analyse von Vorgängen während eines
Aktionspotentials sehr hilfreich.
1.2.3 Das Aktionspotential der ventrikulären Kardiomyozyte
Noch während am Riesenaxon des Tintenfischs die Grundzüge der elektrischen
Erregung erforscht wurden, gelangen bereits 1949 auch erste Ableitungen
intrazellulärer Potentiale und transmembranärer Aktionspoteniale (AP) an
Herzmuskelfasern des Hundes (Coraboef & Weidmann, 1949). Im Verlauf der
nachfolgenden Jahrzehnte wurde mit Hilfe der Spannungsklemmtechnik und später
der neu entwickelten Patch-Clamp Technik (Neher & Sakmann, 1976; Hamill et al.,
1981) Schritt für Schritt der heutige Kenntnisstand über das ventrikuläre
Aktionspotential und die ihm zugrunde liegenden Ionenströme erreicht. Der Ablauf
eines Aktionspotentials folgt normalerweise dem „Alles oder nichts - Gesetz“. Wird
die Membran einer Kardiomyozyte durch elektrotonisch über gap junctions
fortgeleitete Potentiale der Nachbarzellen über einen Schwellenwert von ca. -65 mV
hinaus depolarisiert („Schwellenpotential“), löst dies eine stereotype Folge von
Ionenströmen und damit Potentialänderungen aus. Diese werden in vier Phasen
9
unterteilt (siehe Abb. 1). Beim Erreichen des Schwellenpotentials öffnen Na+-Kanäle
vorwiegend vom Typ Nav1.5. Es erfolgt ein massiver Na+-Einstrom (INa), der eine
rasche Depolarisation bedingt. Dies wird als Phase 0 bezeichnet. Da zu diesem
Zeitpunkt andere Leitfähigkeiten vernachlässigbar klein sind, strebt das
Membranpotential in Richtung des Na+-Gleichgewichtspotentials (ENa ≈ +67 mV).
Es erreicht einen Wert von ca. +40 mV (overshoot) bevor der Na+-Strom
spannungsabhängig inaktiviert und eine weitere Depolarisation verhindert wird. Es
aktivieren nun der repolarisierende transiente K+-Auswärtsstrom Ito sowie der
depolarisierende L-Typ Ca2+-Strom ICaL. Daraus ergibt sich zunächst eine erste
Repolarisation auf etwa 0 mV (Phase 1). In Phase 2, der so genannten Plateauphase,
wird das Potential um 0 mV relativ konstant gehalten, bevor sich mit Phase 3 die
endgültige Repolarisation auf das Ruhemembranpotential anschließt. Hierfür sind in
erster Linie die verzögert aktivierenden K+-Ströme (delayed rectifier) verantwortlich.
Beim Menschen und anderen Spezies mit langer APD setzen sich diese aus einer
schnellen und einer langsamen Komponente, IKr und IKs, zusammen. In Tieren mit
kurzer Aktionspotentialdauer (APD) führen sowohl Ito als auch die delayed rectifier
IKslow1, IKslow2 und ISS zur Repolarisation der Zellmembran. Das in Phase 4
wiedererreichte Ruhemembranpotential wird von einwärtsgleichrichtenden
K+-Kanälen (IKir) aufrechterhalten. Abbildung 1 zeigt links ein menschliches
ventrikuläres Aktionspotential, rechts eines der Maus, sowie jeweils darunter die
auftretenden Ionenströme (Nerbonne et al., 2001). Die Gegenüberstellung der
abgebildeten Aktionspotentiale zeigt, dass bei der Maus keine eindeutige
Plateauphase existiert und dass das AP mit knapp 50 ms wesentlich kürzer ist als das
menschliche. Dies ermöglicht die der Maus eigene Herzfrequenz von ca. 600 min-1.
Ein Aktionspotential im menschlichen Ventrikel dauert etwa 400 ms. Dauer und
Form der Aktionspotentiale im Herzen unterscheiden sich jedoch je nach
Lokalisation und Funktion der jeweiligen Zelle, um das komplexe Zusammenspiel
aus automatischer Erregungsbildung und koordinierter Kontraktion und Relaxation
zu ermöglichen. So weisen die Schrittmacherzellen des Sinusknotens und des AV-
Knotens aufgrund der fehlenden einwärtsgleichrichtenden K+-Ströme kein stabiles
Ruhemembranpotential auf und depolarisieren selbständig. Dies wird unter anderem
durch den hyperpolarisationsaktivierten Kationeneinstrom If (HCN-Kanäle)
ermöglicht (DiFrancesco, 2006). Die Aktionspotentiale des Arbeitsmyokards ähneln
sich morphologisch, jedoch sind die der Vorhöfe deutlich kürzer als die der
Ventrikel.
10
Abbildung 1: Aktionspotentiale und zugrunde liegende Ionenströme ventrikulärer Kardiomyozyten von Mensch und Maus Die Abbildung zeigt ventrikuläre APs und zugrunde liegende Ionenströme des Menschen (links) und der Maus (rechts). INa, Na
+-Strom; ICaL, L-Typ Ca2+-Strom; INCX, Na
+/Ca2+-Austauscherstrom; Ito,f, transienter K+-Auswärtsstrom (schnelle Komponente); Ito,s, transienter K
+-Auswärtsstrom (langsame Komponente), IKs, langsam aktivierender delayed rectifier Strom; IKr, schnell aktivierender delayed rectifier Strom; IKslow, langsam inaktivierender delayed rectifier Strom; ISS, Steady-State Strom; IK1, einwärtsgleichrichtender K+-Strom (in dieser Arbeit als IKir bezeichnet); IKATP, ATP-sensitiver K+-Strom. Die Abbildung wurde aus Nerbonne et al. (2001) entnommen.
Ergebnisse bezüglich der ventrikulären Erregungsausbreitung und -rückbildung
variieren von Studie zu Studie und sind offensichtlich speziesabhängig. In vivo-
Untersuchungen an Mäusen ergaben eine im apikalen Endokard beginnende
Depolarisation, die sich in Richtung Herzbasis und Epikard ausbreitete (Liu et al.,
2004). Da die APD in später depolarisierten Regionen signifikant kürzer war als in
früher erregten Gebieten, verlief die Repolarisation entgegengesetzt vom Epikard der
Basis zum apikalen Endokard. Auch an menschlichen Herzen konnte gezeigt werden,
dass die APD einer Region negativ mit deren relativem Erregungszeitpunkt
korreliert, sodass sich auch hier bezüglich der Repolarisation eine Richtungsumkehr
ergibt (Franz et al., 1987). Der zeitliche Verlauf der Erregungsrückbildung bestimmt
11
die Polarität der T-Welle im EKG, wobei im menschlichen Ventrikel in erster Linie
ein transmuraler Gradient von Bedeutung zu sein scheint (Mines, 1913; Franz et al.,
1987; Yan et al., 2003; Conrath & Opthof, 2006). Ursächlich für die Unterschiede in
Form und Dauer der APs ist in erster Linie eine unterschiedliche Verteilung der
kardialen K+-Ströme. Im Folgenden werden die in dieser Arbeit behandelten
Ionenströme und ihr Einfluss auf die AP-Variabilität näher beschrieben.
1.2.4 Kardiale spannungsabhängige Ca2+-Ströme
Die Ionenkanäle, die den Ca2+-Einstrom über die Plasmamembran von
Kardiomyozyten ermöglichen, gehören zu der heterogenen Gruppe
spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle. Letztere sind anhand ihrer
elektrophysiologischen Eigenschaften in LVA-Kanäle (low voltage activated) und
HVA-Kanäle (high voltage activated) unterteilt (Bean, 1989). LVA-Kanäle,
aufgrund ihrer schnellen Inaktivierung (transient) und geringen
Einzelkanalleitfähigkeit (tiny) auch als T-Typ Kanäle bezeichnet, scheinen im
Herzen primär in Schrittmacherzellen eine Rolle zu spielen (Hagiwara et al., 1988;
Nerbonne & Kass, 2005). Ebenfalls in Schrittmacherzellen wurde ein HVA-Kanal
gefunden, der durch die α-Untereinheit Cav1.3 gekennzeichnet ist (Matthes et al.,
2004). Der im Arbeitsmyokard dominierende HVA-Kanal beinhaltet die
α-Untereinheit Cav1.2. Er gehört seiner langen Öffnungsdauer entsprechend zu den
L-Typ (long lasting) Ca2+-Kanälen, die aufgrund ihrer Sensitivität gegenüber 1,4-
Dihydropyridinen wie Nifedipin pharmakologisch als Dihydropyridinrezeptoren
charakterisiert sind (Hess et al., 1986; Bean, 1989).
1.2.5 Der kardiale L-Typ Ca2+-Strom
Wie in Abbildung 2 schematisch dargestellt, ist der kardiale L-Typ Ca2+-Kanal ein
aus mehreren Proteinen (α1c-, α2-, β- und δ-Untereinheit) aufgebauter Komplex.
Cav1.2 formt als α1c-Untereinheit die Kanalpore und enthält den Spannungssensor,
den Selektivitätsfilter sowie Bindungsstellen für Antagonisten. Sie besteht aus vier
homologen Domänen, von denen jede sechs Transmembranschleifen (S1-S6) sowie
eine innerhalb der Membran liegende Schleife zwischen S5 und S6 ausbildet. Die
Pore des Kanals wird dabei von den Segmenten S5 und S6 zusammen mit den
intramembranären Schleifen geformt. Die positiv geladenen S4-Schleifen fungieren
als Spannungssensor und bewirken die zur Aktivierung des Kanals führenden
Konformationsänderungen. Die intrazellulär liegende Untereinheit β2 und das Dimer
12
α2δ haben regulatorische Funktion. Sie nehmen Einfluss auf die Expression der
Kanalproteine und modulieren Amplitude und Kinetik des Ca2+-Stroms (Catterall,
1991, 2000; Nerbonne & Kass, 2005). Die α1- und β-Untereinheiten sind zudem
Substrate der Proteinkinase A (PKA), der Proteinkinase C (PKC), der
calmodulinabhängigen Kinase II (CaMKII) und anderer Proteinkinasen, was die
Regulation des Kanals durch Phosphorylierung ermöglicht (Curtis & Catterall, 1985;
Kamp & Hell, 2000).
Abbildung 2: Struktur des kardialen L-Typ Ca 2+-Kanals Die die Kanalpore bildende α1c-Untereinheit Cav1.2 setzt sich aus vier homologen Domänen (I-IV) zusammen, von denen jede sechs Transmembranschleifen ausbildet. Die α2-Untereinheit liegt extrazellulär und ist über Disulfidbrücken an die δ-Untereinheit gekoppelt. Zusammen mit der sich intrazellulär befindenden β-Untereinheit nimmt das α2δ-Dimer regulatorische Funktion ein. Die Abbildung wurde modifiziert übernommen aus Adachi-Akahane (2004).
Während die Aktivierung des kardialen L-Typ Ca2+-Kanals spannungsgesteuert
bei Membranpotentialen ab ca. -40 mV einsetzt, wird seine Inaktivierung nicht nur
durch die Membranspannung, sondern auch durch die intrazelluläre
Ca2+-Konzentration reguliert (Eckert & Chad, 1984; Findlay, 2004; Lacinova &
Hofmann, 2005). So konnte 1999 gezeigt werden, dass konstitutiv an der
α1c-Untereinheit gebundenes Calmodulin durch Interaktion mit Ca2+ oder anderen
divalenten Kationen zur Inaktivierung des Kanals führt (Peterson et al., 1999; Qin et
al., 1999; Zuhlke et al., 1999). Der Zeitverlauf der Inaktivierung des ICaL kann durch
zwei Zeitkonstanten beschrieben werden. τ1 entspricht mit Werten zwischen 7 und
50 ms der beschriebenen schnellen Ca2+-abhängigen Inaktivierung, während τ2 mit
Werten zwischen 65 und 400 ms die langsamere spannungsabhängige Inaktivierung
13
kennzeichnet (Sun et al., 2000; Lacinova & Hofmann, 2005). Findlay (2002)
postuliert zudem eine schnelle spannungsabhängige Inaktivierung, die vor allem bei
zunehmender Depolarisation an Bedeutung gewinnt und die Ca2+-abhängige
Inaktivierung zurückdrängt. Umgekehrt führt PKA-Aktivierung nach Findlay zu
einer Unterdrückung der schnellen spannungsabhängigen Inaktivierung, wodurch der
Anteil der Ca2+-abhängigen Komponente zunimmt (Findlay, 2002). Ob diese nach
Phosphorylierung beobachteten Veränderungen jedoch tatsächlich auf die Existenz
einer schnellen spannungsabhängigen Komponente zurückzuführen sind, ist fraglich
(Lacinova & Hofmann, 2005). Ein weiterer Mechanismus der Autoregulation des
Ca2+-Kanals wurde 1989 von Gurney beschrieben (Gurney et al., 1989). Er
beobachtete eine Ca2+-induzierte Verstärkung des Ca2+-Einstroms in
Kardiomyozyten von Frosch und Meerschweinchen. Dieses später als facilitation
bezeichnete Phänomen der Bahnung ist - ebenso wie die Ca2+-abhängige
Inaktivierung - Calmodulin-vermittelt (Zuhlke et al., 1999). Welcher Effekt
überwiegt, hängt unter anderem von der jeweiligen Bindungsstelle des Ca2+/CaM-
Komplexes am L-Typ Ca2+-Kanal ab (Han et al., 2010). Zudem wird durch Bindung
von Ca2+ an Calmodulin die calmodulinabhängige Kinase II aktiviert, die durch
Phosphorylierung des Kanals ebenfalls zur facilitation beiträgt (Anderson et al.,
1994; Yuan & Bers, 1994).
Anders als bei den kardialen K+-Strömen sprechen bezüglich des ICaL mehrere
Untersuchungen dafür, dass dessen Stromdichte normalerweise unabhängig von der
APD in den verschiedenen Regionen konstant ist. Zwar wurde in endokardialen
Kardiomyozyten von Ratten ein höherer AP-induzierter Ca2+-Gesamteinstrom
beobachtet als in epikardialen Zellen (Volk et al., 1999); dies war jedoch auf einen
verringerten Ito und damit eine verlängerten Ca2+-Einstromphase zurückzuführen, da
sich bezüglich der Stromdichte im transmuralen Vergleich keine Differenzen ergaben
(Bryant et al., 1999; Volk et al., 1999). Ein Vergleich der Expression der
α1c-Untereinheit des L-Typ Ca2+-Kanals zwischen Apex und Basis des
Hundeventrikels zeigte ebenfalls eine gleichmäßige Verteilung auf (Szentadrassy et
al., 2005).
1.2.6 Kardiale spannungsgesteuerte K+-Ströme
1.2.6.1 Molekularer Aufbau von K +-Kanälen
Die spannungsabhängigen K+-Kanäle (Kv) setzen sich aus 4 porenbildenden
α-Untereinheiten zusammen. Diese bestehen jeweils aus 6 Transmembransegmenten
14
S1-S6, wobei S4 als positiv geladene Struktur den Spannungssensor darstellt (Jan &
Jan, 1992; Pongs, 1992). Die Kvα-Untereinheiten lassen sich anhand ihres
genetischen Ursprungs in Unterfamilien einteilen (Kv1-Kv11), die jeweils mehrere
Mitglieder aufweisen (Gutman et al., 2005). Moduliert werden die Kanäle durch
verschiedene β-Untereinheiten. Sie können mit den α-Untereinheiten assoziieren und
die Oberflächenexpression sowie die kinetischen Eigenschaften der Kanäle
beeinflussen. Maßgeblich vorangetrieben wurde die Strukturanalyse von K+-Kanälen
sowie die Aufklärung der Selektivitätsmechanismen von Roderick MacKinnon
(Doyle et al., 1998; MacKinnon, 2004), der für diese Leistung 2003 mit dem
Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurde.
1.2.6.2 Der transiente K +-Auswärtsstrom I to
Der transiente K+-Auswärtsstrom (Ito) weist eine schnelle Aktivierung bei
Membranpotentialen ab -30 mV auf. Bezüglich der Inaktivierungskinetik wird er von
einigen Autoren in eine langsam und eine schnell inaktivierende Komponente, Ito,s
(slow) und Ito,f (fast), untergliedert (Xu et al., 1999), die sich zudem in der Dauer
ihrer Erholung von der Inaktivierung unterscheiden. Die ungleiche Verteilung dieser
Ströme in verschiedenen Spezies sowie innerhalb des einzelnen Ventrikels lässt
einen Beitrag zu den unterschiedlichen Aktionspotentialformen vermuten
(Brahmajothi et al., 1999; Brunet et al., 2004). Bereits 1983 wurde eine heterogene
Expression von Ito als Grundlage der regionalen APD-Differenzen im Rattenherz
vermutet (Watanabe et al., 1983). Diese These wurde von der Gruppe um
Antzelevitch durch Untersuchungen der freien Wand des linken Ventrikels von
Hunden gestützt, welche eine niedrige Ito-Stromdichte in endokardialen und eine
hohe Stromdichte in epikardialen Regionen ergaben (Litovsky & Antzelevitch, 1988;
Antzelevitch et al., 1991). Im Verlauf konnte diese Beobachtung unter anderem auf
die Ratte (Clark et al., 1993; Pandit et al., 2001), die Maus (Xu et al., 1999; Brunet
et al., 2004) und den Menschen (Wettwer et al., 1994; Näbauer et al., 1996) erweitert
werden. Inwieweit der Ito an der Modulation der APD beteiligt ist, ist jedoch
wahrscheinlich von Spezies zu Spezies unterschiedlich. Beim Hund und beim
Menschen wird vorrangig die Tiefe des notch (Einkerbung am Ende der Phase 1)
vom Ito beeinflusst (Tseng & Hoffman, 1989; Greenstein et al., 2000; Sun & Wang,
2005), wohingegen sowohl für die Ratte (Clark et al., 1993; Volk et al., 1999) als
auch für die Maus (Barry et al., 1998; Guo et al., 2000; Gussak et al., 2000) ein
klarer Zusammenhang zwischen Ito-Stromdichte und APD gezeigt werden konnte.
15
Bezüglich der molekularen Grundlagen transienter K+-Auswärtsströme konnte in
Untersuchungen an Mäusen gezeigt werden, dass dem Ito,s wahrscheinlich Kv1.4-
Kanäle zugrunde liegen (London et al., 1998b), während der Ito,f von Kv4.2 und
Kv4.3 zusammen mit der β-Untereinheit KChIP2 und weiteren β-Untereinheiten
gebildet wird (Barry et al., 1998; Guo et al., 2005; Nerbonne & Kass, 2005).
1.2.6.3 Die auswärtsgleichrichtenden K +-Ströme
Im Arbeitsmyokard von Menschen und Hunden sind die verzögert aktivierenden
auswärtsgleichrichtenden K+-Ströme (delayed rectifier) IKr und IKs die vornehmlich
die APD beeinflussenden Ströme. Diese sind in Tieren mit kurzem AP wie Mäusen
nicht oder nur in sehr geringer Menge nachweisbar. Die delayed rectifier sind hier
IKslow1, IKslow2 und Iss. Bei der Maus sind neben Ito der IKslow1 und der IKslow2
maßgeblich an der Festlegung der APD beteiligt (Fiset et al., 1997; London et al.,
1998a; Kodirov et al., 2004; Li et al., 2004). Detaillierte Darstellungen kardialer
K+-Ströme und deren molekularer Korrelate bieten einschlägige Übersichtsarbeiten
(Nerbonne, 2000; Roden et al., 2002; Jiang et al., 2003; Nerbonne & Kass, 2005).
1.2.7 Die Interaktion von ICaL und Ito bestimmt den AP-induzierten
Ca2+-Influx
Aus dem Gegenspiel von ICaL und Ito ergibt sich die Form des APs während der
Phasen 1 und 2. In Säugetieren mit langer APD wie Hunden und Menschen bestimmt
der Ito vornehmlich das Ausmaß der auf die Phase 0 folgenden Repolarisation (notch)
(Tseng & Hoffman, 1989), damit die Höhe des Plateaupotentials und somit den
Antrieb für den Ca2+-Einstrom während des Plateaus, der einer sofortigen
Repolarisation entgegenwirkt. In Tieren mit kurzer APD wie Ratten und Mäusen
wird der Ca2+-Einstrom weniger von der Ausprägung des Plateaus als vielmehr von
der Dauer des APs bestimmt. Diese wird hier maßgeblich vom Ito beeinflusst (Clark
et al., 1993; Volk et al., 2001).
1.2.8 Bedeutung der Ca2+-Dynamik - elektromechanische
Kopplung und langfristige Regulationsmechanismen
Die durch die L-Typ Ca2+-Kanäle in die Zelle gelangenden Ca2+-Ionen erzeugen
die Plateauphase des Aktionspotentials und lösen eine weitere Ca2+-Freisetzung aus
dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) über Ryanodinrezeptorkanäle aus (calcium
induced calcium release, CICR) (Näbauer et al., 1989; Bers & Perez-Reyes, 1999).
16
Bindung von Ca2+-Ionen an das Regulatorprotein Troponin C führt zur Freilegung
der Myosinbindungsstelle des Aktins und setzt den Querbrückenzyklus in Gang. Die
AP-induzierte massive Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration bewirkt
somit die Kontraktion. Insofern sind Ca2+-Ionen die Schaltstelle zwischen
elektrischer Erregung und mechanischer Funktion der Zelle. In der Relaxationsphase
werden die eingeströmten Ca2+-Ionen über den Na+/Ca2+-Austauscher aus der Zelle
transportiert bzw. über Ca2+-Pumpen (SERCA) in das SR zurückgeführt (Bers,
2008). Das Gleichgewicht zwischen Ca2+-Einstrom bzw. Ca2+-Freisetzung aus dem
SR einerseits und dem Rücktransport bzw. der Wiederaufnahme des Ca2+ in das SR
andererseits ist ein empfindlicher Regulator der Kontraktilität (Wier, 1990; Barry &
Bridge, 1993). Da das Ausmaß des CICR vom Ca2+-Einstrom über L-Typ
Ca2+-Kanäle abhängt, stellen diese eine wichtige Zielstruktur für akute
Regulationsmechanismen dar, durch die die Kontraktilität des Herzmuskels schnell
an wechselnde Anforderungen angepasst werden kann (Kamp & Hell, 2000).
Ca2+ ist jedoch nicht nur in unmittelbare Abläufe, sondern auch in langfristige
zelluläre und auch pathologische Regulationssysteme involviert. Beispielsweise kann
Ca2+-Überflutung zu Apoptose der Zelle führen (Bers, 2008). Durch das enge
Zusammenspiel zwischen Ca2+-Kanälen und verschiedenen anderen Ionenkanälen
und Transportern ergibt sich zudem ein komplexes elektrophysiologisches System, in
dem bereits kleinste Abweichungen in Arrhythmien münden können (Bers, 2008).
Auf Ebene der Genexpression nimmt Ca2+ ebenfalls Einfluss. In Verknüpfung mit
dem Ca2+-Sensor Calmodulin (CaM) aktivieren erhöhte intrazelluläre Ca2+-Spiegel
die Phosphatase Calcineurin (Cn) im Zytosol. Diese dephosphoryliert
Transkriptionsfaktoren aus der NFAT-Familie (nuclear factor of activated T cells),
welchen dadurch die Translokation in den Zellkern ermöglicht wird. Auch die
Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase (CaMK) ist in die Regulation der Transkription
involviert, möglicherweise auch über den Calcineurinsignalweg (Xiao et al., 2008).
So können Ca2+-Ionen unter anderem die Expression anderer Kanalproteine
beeinflussen (Perrier et al., 2004; Xiao et al., 2008) oder zur Entwicklung einer
Zellhypertrophie führen (Bers, 2008).
1.3 Regulation der Herzfunktion
Die Arbeit des Herzens muss zu jedem Zeitpunkt den Anforderungen der
jeweiligen Situation entsprechen. Die Regulation der Herzfunktion erfolgt zum Teil
über dem Herzen selbst innewohnende Mechanismen. Davon ist die als Frank-
17
Starling-Mechanismus bekannte Anpassung des Schlagvolumens an unterschiedliche
diastolische Füllungsvolumina sicherlich besonders hervorzuheben (Zimmer, 2002).
Daneben existiert eine Reihe extrinsischer Regulationsmechanismen, von denen die
sympathisch-parasympathische Wechselwirkung im Vordergrund steht.
Sympathische Fasern aus den paravertebralen Ganglien innervieren als Nervi
cardiaci alle Substrukturen des Herzens. Aktivierung dieser Fasern bewirkt über
lokale Noradrenalinfreisetzung eine Frequenzsteigerung am Sinusknoten, eine
beschleunigte Erregungsweiterleitung am AV-Knoten sowie eine Steigerung der
Kontraktionskraft am Vorhof- und Ventrikelmyokard. Gleichartige Effekte erzielt bei
systemischer Sympathikusaktivierung freigesetztes Adrenalin. Eine
parasympathische Innervation erfolgt insbesondere in Schrittmacher- und
Vorhofzellen. Vom N. Vagus freigesetztes Acetylcholin senkt die Herzfrequenz und
verzögert die Erregungsüberleitung am AV-Knoten. Durch die Einflüsse weiterer
neurohumoraler Stoffe wie Trijodthyronin oder Angiotensin II sowie reflektorischer
Elemente entsteht ein komplexes System, in dem das Zusammenspiel von Herz und
Kreislauf im gesunden Organismus optimal an situative Anforderungen angepasst
wird.
1.3.1 G-Proteine als intrazelluläre Signalträger für extrazelluläre
Botenstoffe
Die an der Regulation der Herzfunktion beteiligten Signalstoffe agieren häufig als
Liganden sogenannter G-Protein-gekoppelter membranständiger Rezeptoren
(GPCR), deren Funktionsweise in Abbildung 3 stark vereinfacht dargestellt ist
(Wettschureck & Offermanns, 2005). GPCR besitzen sieben membranspannende
Domänen und sind intrazellulär mit einem heterotrimeren G-Protein assoziiert,
welches im Ruhezustand aus einer GDP-bindenden α-Untereinheit und einer
βγ-Untereinheit besteht. Die Bindung eines Liganden an den Rezeptor führt zum
Austausch von GDP durch GTP an der α-Untereinheit sowie zu deren Trennung von
der βγ-Untereinheit. Die Untereinheiten wirken nun über die Bildung weiterer
Signalmoleküle (second messenger) unter anderem auf die Proteinkinasen A (PKA)
und C (PKC), welche verschiedene Effektormoleküle phosphorylieren und damit
deren Eigenschaften verändern. Eine Gegenregulation dieser Kinasenaktivität wird
durch Phosphatasen ausgeübt. Die GTPase-Aktivität der α-Untereinheit beendet die
Signalkaskade, indem sie GTP zu GDP hydrolysiert und damit zu einer
18
Reassoziation der Untereinheiten an den Rezeptor führt (Wettschureck &
Offermanns, 2005).
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Aktivierungszyklus von G-Proteinen Die Bindung eines Agonisten (Ag) an einen G-Protein gekoppelten Rezeptor führt zu einem Austausch von GDP zu GTP an der α-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins. GTP-Gα und Gβγ dissoziieren und modulieren - zum Teil über die Bildung intrazellulärer Signalmoleküle - die Funktion der Effektoren. Nach Hydrolyse des GTP reassoziiert GDP-Gα mit Gβγ am Rezeptor. Die Abbildung wurde modifiziert aus Wettschureck & Offermanns (2005) übernommen.
Für die Entdeckung der G-Proteine wurden Alfred G. Gilman und Martin Rodbell
1994 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Inzwischen sind im
Säugerorganismus mehr als 1000 verschiedene GPCR bekannt, die in Abhängigkeit
ihrer Lokalisation vielfältige Funktionen erfüllen (Wettschureck & Offermanns,
2005). Beispielsweise sind die Aufnahme von Geruch oder der
Geschmacksqualitäten bitter und süß wie auch die retinale Phototransduktion über
GPCR vermittelte Prozesse. Aber auch die Effekte zahlreicher nichtsensorischer
Liganden wie Hormone und Neurotransmitter werden durch GPCR vermittelt. Die
gekoppelten G-Proteine sind anhand ihrer α-Untereinheiten und der damit
determinierten second messenger Kaskaden in vier verschiedene Familien eingeteilt
worden (Wettschureck & Offermanns, 2005):
Gs-Proteine bewirken die Umwandlung von Adenosintriphosphat (ATP) zu
zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) durch die Adenylatcyclase (AC).
Erhöhte cAMP-Spiegel aktivieren die PKA. Sie phosphoryliert bestimmte Enzyme,
19
Ionenkanäle und Transkriptionsfaktoren, was sowohl eine kurzfristige Variation der
Zellfunktionen als auch eine langfristige Steuerung über Regulation der
Genexpression ermöglicht (Wettschureck & Offermanns, 2005). Am Herzen kommt
es beispielsweise bei Zunahme des Sympathikotonus und darauf folgender
Aktivierung β1-adrenerger Rezeptoren über den Gs-Protein Mechanismus zu
gesteigerter Kontraktilität der Ventrikel (Wettschureck & Offermanns, 2005).
Ebenfalls β1-Rezeptor-vermittelt sind die positiv chronotropen und positiv
dromotropen Effekte der sympathischen Aktivierung.
Der Parasympathikus übt seinen Einfluss hingegen über muskarinerge
Acetylcholinrezeptoren (M2) aus. Die assoziierten Gi-Proteine hemmen die AC und
wirken durch Reduktion des cAMP-Spiegels adrenerg vermittelter Stimulation
entgegen (Wettschureck & Offermanns, 2005).
Rezeptoren der Signalstoffe Angiotensin II (AT1), Endothelin-1 (ETA) und auch
Katecholamine (α1) sind mit G-Proteinen aus der Gq/G11-Familie assoziiert (Kamp &
Hell, 2000). Sie regen die Phospholipase Cβ (PLCβ) zur Spaltung von
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) an. Die entstehenden second messenger
Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) erhöhen den
intrazellulären Ca2+-Spiegel und aktivieren die PKC (Wettschureck & Offermanns,
2005; Domeier et al., 2008).
G-Proteine der G12/G13-Familie sind häufig ebenfalls an die eben genannten
Gq/G11-aktivierenden Rezeptoren gekoppelt. Sie werden im Organismus ubiquitär
exprimiert und sind Bestandteil verschiedener Signalkaskaden (Wettschureck &
Offermanns, 2005). Unter anderem können sie durch Aktivierung der GTPase RhoA
die Formation von Aktomyosin in Muskelfasern und damit deren Kontraktilität
beeinflussen (Wettschureck & Offermanns, 2005).
1.3.2 Die Bedeutung von Gαq und Gα11
Ein Vergleich von Gα11 und Gαq auf cDNA-Ebene ergab eine 88 %ige
Kongruenz, während die Analyse der Aminosäuresequenzen eine Homologie von
97 % zeigte (Strathmann & Simon, 1990). Gαq/Gα11 werden somit innerhalb der G-
Proteine als eigene Klasse angesehen, da die Übereinstimmung mit
Aminosäuresequenzen anderer G-Proteine bei lediglich 50 % liegt (Strathmann &
Simon, 1990). Im gesunden Säugerorganismus findet sich eine beinahe ubiquitäre
Expression der α-Untereinheiten beider Proteine (Gαq und Gα11), die gemeinsam
lebenswichtige Funktionen erfüllen (Wettschureck & Offermanns, 2005). Dabei kann
20
ein Gα11-Mangel offensichtlich durch Gαq ausgeglichen werden, während das
Kompensationspotential umgekehrt deutlich geringer ist (Offermanns et al., 1998;
Offermanns, 2001; Wettschureck & Offermanns, 2005). So zeigten Gαq/Gα11- wie
auch Gαq-defiziente Mäuse multiple Defekte, unter anderem neurologischer und
hämostatischer Natur (Offermanns, 2001; Wettschureck & Offermanns, 2005). Das
alleinige Fehlen der Gα11-Untereinheit (Gα11-/-) ging ohne erkennbare Auffälligkeiten
einher, jedoch zeigten auch diese Tiere eine reduzierte Antwort auf Gαq/Gα11-
aktivierende Stimuli wie Endothelin-1 (Wettschureck et al., 2001). Auch die nach
operativ generierter Aortenstenose in Mäusen entstehende Herzhypertrophie war in
gna11-/--Mäusen geringer ausgeprägt als in Kontrolltieren (Wettschureck et al.,
2001). Bereits in der Embryonalentwicklung nehmen Gαq/Gα11-vermittelte
Signalwege eine essentielle Rolle ein. Mäuseembryonen, die kein intaktes
Gαq/Gα11-Allel besitzen (Gαq-/-/Gα11
-/-) sterben in utero an den Folgen kardialer
Hypoplasie (Offermanns et al., 1998). Ähnliches wurde bei Embryonen beobachtet,
die defizient für den Gαq/Gα11-koppelnden Serotoninrezeptor 5HT2B (Nebigil et al.,
2000) oder für Endothelinrezeptoren (ETA/ETB) sind (Yanagisawa et al., 1998).
Bereits ein funktionsfähiges Allel ermöglichte die Entwicklung ex utero
lebensfähiger Mäuse. Diese präsentierten jedoch kraniofaziale Malformationen sowie
ebenfalls eine ausgeprägte kardiale Hypoplasie, die bei allen Gαq-/-/Gα11
-/+-
Individuen in den ersten Lebensstunden zum Tod führte (Offermanns et al., 1998).
Lediglich einige wenige Gαq-/+/Gα11
-/--Mäuse erreichten das Erwachsenenalter
(Offermanns et al., 1998). Gαq/Gα11-abhängige Prozesse sind demnach entscheidend
für eine adäquate myokardiale Zellproliferation während der Embryonalphase. Von
einem Zusammenhang mit im Erwachsenenalter unter pathologischen Bedingungen
entstehender Herzhypertrophie wird ausgegangen, seit eine in hypertrophen Herzen
stattfindende Reaktivierung embryonaler Genprogramme beobachtet wurde (Chien et
al., 1993). Die zentrale Bedeutung von Gαq/Gα11 bei der Hypertrophieentstehung
wurde in zahlreichen Studien demonstriert (Glennon et al., 1995; Akhter et al., 1998;
Wettschureck et al., 2001; Esposito et al., 2002; Dorn & Force, 2005). Im
Zusammenhang mit transienten Episoden mäßiger Myokardischämie wird dem
Gαq/Gα11-Signalweg eine kardioprotektive Wirkung zugeschrieben (Kang et al.,
2007). Konstitutive Gαq-Aktivität kann jedoch neben zellulärer Hypertrophie
(D'Angelo et al., 1997) auch Mitochondrienschäden und Apoptose induzieren. Dies
konnte an Gαq-überexprimierenden Kardiomyozytenkulturen gezeigt werden (Adams
et al., 1998; Adams et al., 2000). Auch der Zusammenhang mit den vorgeschalteten
21
Rezeptoren bzw. deren Liganden Noradrenalin, ET1 und AngII ist durch zahlreiche
Studien belegt (Sadoshima & Izumo, 1993; LaMorte et al., 1994; Milano et al.,
1994; Yamazaki et al., 1996), wobei der AT1-Rezeptor auch allein durch
mechanische Dehnung aktiviert werden kann (Zou et al., 2004). Die erörterten
Abläufe können demnach auch agonistenunabhängig durch mechanischen Stress wie
z.B. Volumenüberlastung angestoßen werden.
1.3.3 Mechanismen der Regulation des kardialen
L-Typ Ca2+-Stroms
Wie in Abschnitt 1.2.7 dargestellt wird, ist der kardiale L-Typ Ca2+-Strom in
zahlreiche Adaptationsprozesse involviert und daher Angriffspunkt verschiedener
regulatorischer Mechanismen. Eine bedeutende Rolle kommt dabei den GPCR-
vermittelten Signalwegen und den hierbei involvierten Proteinkinasen A und C zu.
Die PKA ist das Effektorenzym des Gαs-vermittelten Signalwegs, welcher am
Herzen beispielsweise durch β1-Rezeptoren aktiviert wird. Sie ist über sogenannte
AKAPs (A kinase anchor proteins) mit dem L-Typ Ca2+-Kanal assoziiert (Gao et al.,
1997) und phosphoryliert dessen α1-Untereinheit an einem Serinrest des C-Terminus
(De Jongh et al., 1996). Auch die β-Untereinheit kann Substrat der PKA sein (Gao et
al., 1997; Kamp & Hell, 2000). Durch die Phosphorylierung werden die Anzahl
aktivierbarer Kanäle sowie deren Öffnungswahrscheinlichkeit erhöht (Ono &
Fozzard, 1993). Wie in zahlreichen Studien gezeigt wurde, führt
β1-Rezeptoraktivierung dementsprechend zu einer Vergrößerung des Ca2+-Einstroms
(Catterall, 2000; Kamp & Hell, 2000; Keef et al., 2001). Auch die
Inaktivierungskinetik von ICaL wird durch die PKA beeinflusst. In zahlreichen
Studien wurde nach PKA-Aktivierung eine Verringerung des Anteils der
spannungsabhängigen zugunsten der Ca2+-abhängigen Inaktivierung beobachtet
(Findlay, 2004; Lacinova & Hofmann, 2005; Findlay et al., 2008). Ein weiterer
möglicher Effekt PKA-abhängiger Phosphorylierung wurde von Sculptoreanu et al.
(1993) beschrieben: Er beobachtete bei aufeinander folgenden Depolarisationen eine
Potenzierung des L-Typ Ca2+-Stroms, welche in Abwesenheit der PKA ausblieb.
Möglicherweise ist dies ein Mechanismus, welcher zur Zunahme der Kontraktilität
bei steigender Herzfrequenz beiträgt (Sculptoreanu et al., 1993). Ähnlich stellt sich
das als facilitation bezeichnete Phänomen der Bahnung dar, welches von Calmodulin
(Zuhlke et al., 1999) sowie von der calmodulinabhängigen Kinase II (Anderson et
al., 1994; Yuan & Bers, 1994) vermittelt wird.
22
Die Wirkung der zur Aktivierung der PKC führenden Gαq/Gα11-Proteinkaskade
auf den ICaL stellt sich in zahlreichen Studien uneinheitlich dar (Kamp & Hell, 2000).
So wurde sowohl bei ET1-induzierter Aktivierung des Gαq/Gα11-Signalwegs als auch
bei direkter Aktivierung der PKC durch Phorbolester Erhöhung (Dosemeci et al.,
1988; He et al., 2000) oder Verminderung (Cheng et al., 1995; Zhang et al., 1997)
der Stromgröße gefunden. Auch biphasische Effekte wurden beobachtet. Inkubation
neonataler Rattenkardiomyozyten mit einem Phorbolester führte zunächst zu einem
Anstieg des ICaL, langfristig jedoch zu einer Abnahme des Stroms (Lacerda et al.,
1988). Ebenso hatte die Aktivierung Gαq/Gα11-gekoppelter Rezeptoren in einigen
Studien biphasische Auswirkung auf den Stromverlauf (Liu & Kennedy, 1998;
Watanabe & Endoh, 1999; Woo & Lee, 1999). In Kombination mit β-
Rezeptoraktivierung steht jedoch der hemmende Einfluss im Vordergrund (Boutjdir
et al., 1992; Delpech et al., 1997; Watanabe & Endoh, 1999). Die daraus abgeleitete
Hypothese, dass der Gαq/Gα11 Signalweg β-adrenerg vermittelte Stimulation des
L-Typ Ca2+-Stroms antagonisiert, wurde von Mitarai et al. an Kardiomyozyten Gαq-
überexprimierender Mäuse verfestigt (Mitarai et al., 2000). Letztendlich ist die
PKC-abhängige Modulation des L-Typ Ca2+-Stroms ein komplexes Zusammenspiel
verschiedener Effekte. Dieses wird nicht zuletzt auch von dem Vorhandensein
unterschiedlicher PKC-Isoenzyme beeinflusst, deren Expression unter anderem von
Spezies zu Spezies sowie mit Reife des Organismus variiert (Kamp & Hell, 2000;
Yang et al., 2005). Es ist durchaus denkbar, dass verschiedene Isoenzyme
gegensätzliche Auswirkungen auf den L-Typ Ca2+-Strom haben (Kamp & Hell,
2000), wobei der jeweilige Effekt auch von isoenzymspezifischen RACKs (receptors
for activated c kinase) moduliert wird (Mochly-Rosen & Gordon, 1998). Des
Weiteren wurden mehrere Substrate der PKC identifiziert, deren jeweilige
Phosphorylierung gegenteilige Effekte hervorruft. Die PKC phosphoryliert sowohl
die α1c-Untereinheit als auch die β-Untereinheit des L-Typ Ca2+-Kanals (Puri et al.,
1997). Es wurde gezeigt, dass Interaktion der PKC mit dem N-Terminus der α1c-
Untereinheit für die Modulation der Stromgröße von zentraler Bedeutung ist, wobei
ein primär hemmender Einfluss des N-Terminus diskutiert wird (Shistik et al., 1999;
McHugh et al., 2000). Hierbei scheint in erster Linie die Öffnungswahrscheinlichkeit
ein wesentlicher zu modifizierender Faktor zu sein, weniger die Expression oder der
Transport der Kanalproteine zur Zellmembran (Shistik et al., 1999).
Phosphorylierung eines Serinrests am C-Terminus der α1c-Untereinheit welcher auch
als Substrat der PKA identifiziert wurde (Yang et al., 2005) hebt die hemmende
23
Wirkung des N-Terminus auf und ruft somit eine Erhöhung von ICaL hervor (Shistik
et al., 1999). Demgegenüber wird die Hemmung durch Phosphorylierung zweier
Threoninreste am N-Terminus verstärkt; dies führt somit zu einer Abnahme von ICaL
(McHugh et al., 2000). Die nach Gαq-Stimulation beobachtete Inhibition des ICaL
hängt jedoch möglicherweise mit einer Hemmung der Phosphatidylinositol-3-kinase
(PI3K) zusammen (Fan et al., 2005; Lu et al., 2005) und könnte damit ein PKC-
unabhängiger Prozess sein (Asai et al., 1996).
Eine Analyse der beschriebenen Gαq/Gα11-vermittelten Effekte erfordert auch die
Beachtung der jeweils angewandten Methodik. Im Gegensatz zur ruptured patch
Technik erlaubt die perforated patch Methode eine Strommessung unter
Beibehaltung des intrazellulären Milieus. Damit konnte demonstriert werden, dass
die AngII-Wirkung (Aiello & Cingolani, 2001; Ichiyanagi et al., 2002), der
Endothelineffekt (Kelso et al., 1996; He et al., 2000) sowie die Auswirkung einer α1-
Rezeptoraktivierung (Liu & Kennedy, 1998; Zhang et al., 1998; O-Uchi et al., 2005)
auf ICaL von intrazellulären Signalmechanismen wie Ca2+-Freisetzung (Aiello &
Cingolani, 2001), PKC-Aktivierung (Aiello & Cingolani, 2001) oder CaMKII (O-
Uchi et al., 2005) abhängig sind.
1.3.4 Regulation der Genexpression von Cav1.2
Auch auf Ebene der Genexpression tragen Mechanismen zur Regulation von ICaL
bei. Drei Signalwege, die die Transkription der α1c-Untereinheit beeinflussen sind
beschrieben: In vitro führt β-adrenerge Stimulation durch Isoproterenol PKA-
vermittelt zu einer erhöhten α1c-Gentranskription (Fan et al., 2000; Liu et al., 2000;
Akuzawa-Tateyama et al., 2006). Zudem greift die PKA in posttranslationale
Regulationsschritte des L-Typ Ca2+-Kanals ein (Fan et al., 2000). PKC-vermittelte
Einflüsse auf die α1c-Transkription wurden ebenfalls beschrieben. So kommt es bei
α1-adrenerger Stimulation sowohl in vivo (Golden et al., 2002) als auch in vitro
langfristig zu einer vermehrten mRNA-Produktion, auch wenn in einigen Studien
zunächst eine Abnahme der mRNA-Menge gefunden wurde (Maki et al., 1996; Liu
et al., 2000; Golden et al., 2002). Ebenfalls PKC-vermittelt führt AngII in
Vorhofmyozyten zu einem erhöhten ICaL über gesteigerte α1c-mRNA-Produktion
(Tsai et al., 2007). Schließlich ist auch eine durch intrazelluläres Ca2+ induzierte
Transkriptionssteigerung des L-Typ Ca2+-Kanals bekannt (Davidoff et al., 1997). Die
vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Vergleich von aus gna11-/--Mäusen
isolierten Kardiomyozyten mit Zellen aus wt-Tieren bezüglich des L-Typ
24
Ca2+-Kanals und untersucht damit die Rolle tonischer Gα11-Aktivität auf dessen
Regulation. Mit Hilfe der Patch-Clamp Technik wurde das Verhalten des L-Typ
Ca2+-Stroms untersucht. Zudem wurde in Western Blot Experimenten die Expression
der α1c-Untereinheit des L-Typ Ca2+-Kanals beleuchtet.
2 Material und Methoden
2.1 Verwendete Tiere
Die Gα11-Knockout-Mauslinie wurde von Professor Stefan Offermanns (Max-
Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung, Bad Nauheim) zur Verfügung
gestellt (Offermanns et al., 1998). Als Kontrollgruppe dienten C57B6-Mäuse. Alle
für diese Arbeit verwendeten Tiere wurden aus der Tierhaltung des
Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf bezogen.
Durch PCRs aus einer Schwanzbiopsie einer jeden verwendeten Maus wurde der
jeweilige Genotyp verifiziert.
Die verwendeten Mäuse waren männlich, wogen ca. 35g und waren ca. 300 Tage
alt.
2.2 Isolation von Kardiomyozyten für die
elektrophysiologischen Experimente
Nach Bestimmung des Körpergewichtes wurden die Tiere durch eine ip.-Injektion
von fünfprozentiger Thiopental-Natrium-Lösung (100 mg/kg KG, Nycomed GmbH,
Unterschleissheim) narkotisiert. Die Aufrechterhaltung der Narkose erfolgte durch
Inhalation von Isofluran (Baxter Deutschland GmbH, Unterschleissheim). Die
Narkosetiefe wurde durch kurze Schmerzreize im Zwischenzehenraum getestet. Zur
Herzentnahme wurden die Tiere im Abdominal- und Thoraxbereich rasiert. Der
Hautschnitt erfolgte im Bereich des Abdomen und wurde in der Medianlinie
Richtung Thorax erweitert. Dieser wurde parasternal bis zur oberen Thoraxapertur
eröffnet, das Herz entnommen und in 4 °C kalte kardioplege Tyrodelösung gegeben.
Unter 16-facher Vergrößerung (Leica MZ 75, Wetzlar, Deutschland) wurde der
Aortenbogen aufgesucht und bis auf einen Aorta ascendens-Stumpf abpräpariert, an
25
dem das Herz an einer Glaskapillare, die mit einem Langendorff-Apparat verbunden
war, aufgehängt werden konnte.
Die Zellisolation war an die von Isenberg und Klöckner (1982) beschriebene
Methode angelehnt. Um möglichst Ca2+-freie Bedingungen herzustellen wurde das
Herz zunächst retrograd über die Koronararterien mit Tyrode-Lösung 5 Minuten lang
perfundiert. Diese enthielt 4.5 mM Ca2+ und 5 mM EGTA, was einer freien
Ca2+-Konzentration von ca. 10-6 mM entspricht. Der Verdau erfolgte anschließend
über 19 Minuten mittels 25 ml derselben Tyrode-Lösung, die zusätzlich Kollagenase
(160 U ml-1, CLSII, Biochrom AG, Berlin) und Protease (0.6 U ml-1, Typ XIV,
Sigma, München) enthielt. Diese Enzymlösung wurde rezirkuliert. Abschließend
wurde für 5 Minuten mit 0.1 mM Ca2+-haltiger Inkubationslösung perfundiert. Die
Perfusion fand bei 37 °C und unter Begasung der Lösungen mit 100 % Sauerstoff
statt.
Wiederum unter dem Mikroskop (50-fache Vergrößerung) wurde nun der linke
Ventrikel längs eröffnet und mit feinen Pinzetten zunächst Papillarmuskeln aus
dessen freier Wand entnommen. Ebenso wurden Bereiche des Epikards aus der
freien Wand des linken Ventrikels isoliert. Beide Gewebeportionen wurden in
separate, mit 0.1 mM CaCl2-haltiger Inkubationslösung gefüllte Petrischalen
gegeben. Mit Hilfe zweier Einmalskalpelle und anschließend mehrmaligen
Aufsaugens mit einer Pipette wurden die Gewebestücke vorsichtig zerkleinert. Durch
zweimaliges jeweils unvollständiges Absaugen des Überstandes und Auffüllen mit
1 mM Ca2+-haltiger Inkubationslösung wurden die auf dem Boden abgesetzten
Zellen schrittweise an höhere extrazelluläre Ca2+-Konzentrationen gewöhnt, bis in
einem letzten Schritt die Flüssigkeit vollständig ausgetauscht wurde. Die Zellen
wurden nun bei 37 °C einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 5 % CO2
aufbewahrt.
Um Bakterien- und Pilzwachstum vorzubeugen, waren die zur Isolation und
Aufbewahrung der Zellen verwendeten Lösungen steril filtriert (0.22 µm
Porenweite). Die zur Aufbewahrung verwendete modifizierte Tyrode-Lösung
enthielt zudem 100 IU ml-1 Penicillin (Sigma) sowie 100 µg ml-1 Streptomycin
(Sigma).
26
2.3 Elektrophysiologische Methoden
2.3.1 Die Patch-Clamp Technik
1991 wurde der Nobelpreis für Physiologie oder Medizin an Erwin Neher und Bert
Sakmann für den „direkten Nachweis von Ionenkanälen in Zellmembranen“
verliehen. Sie hatten die Patch-Clamp Technik (patch = Zellmembranfleck,
clamp = Spannungsklemme) entwickelt, die es erstmals ermöglichte, Ströme durch
einzelne Ionenkanäle zu messen (Neher & Sakmann, 1976). Maßgeblichen
Fortschritt erfuhr dieses Verfahren bis 1981, als der sogenannte Gigaseal
(Abdichtwiderstand von 1-100 GΩ zwischen Pipette und Zellmembran) entwickelt
wurde (Hamill et al., 1981).
Wird die Spitze einer mit Elektrolytlösung gefüllten Patchpipette auf die
Zellmembran einer Zelle gesetzt, bildet sich ein Abdichtwiderstand von einigen
Megaohm aus. Dieser steigt nach Anlegen eines Unterdrucks auf einige Gigaohm an.
Der unter der Pipettenöffnung liegende Membranfleck ist dadurch elektrisch von der
Umgebung isoliert. Zudem ist eine stabile mechanische Verbindung zwischen Pipette
und Zelle gewährleistet. Die exakten physikalischen Vorgänge, die zur Bildung
dieses Gigaseals führen, konnten bis heute nicht vollständig ergründet werden
(Milton & Caldwell, 1990). Es besteht nun die Möglichkeit, zwischen der Pipette und
der Referenzelektrode im Bad eine bestimmte Haltespannung (VPip) anzulegen und
mit einem geeigneten Verstärker die durch den unter der Pipette liegenden
Membranfleck fließenden Ströme zu messen (voltage clamp, Spannungsklemme).
Des Weiteren lässt sich auch ein bestimmter Stromfluss einstellen und das
resultierende Potential messen (current clamp, Stromklemme).
2.3.1.1 Die cell-attached Konfiguration
Das Erreichen des Gigaseals führt zu der sogenannten cell-attached Konfigu-
ration. Unter Erhalt der Membranstruktur können nun Ströme gemessen werden, die
durch den von der Pipette abgedichteten Membranfleck fließen. Die cell-attached
Konfiguration bildet den Ausgangspunkt für die weiteren möglichen
Konfigurationen der Patch-Clamp Technik: die inside-out Konfiguration, die outside-
out Konfiguration sowie die whole-cell Konfiguration (Hamill et al., 1981). In dieser
Arbeit fand ausschließlich letztere Verwendung.
27
2.3.1.2 Die whole-cell Konfiguration
Sie wird ausgehend von der cell-attached Konfiguration erreicht, indem der
Membranfleck unter der Pipette durch vorsichtige Über- oder Unterdruckpulse
zerrissen wird, wobei die Abdichtung erhalten bleibt. Die Pipette erlangt somit
direkte Verbindung zum Zellinneren. Da dessen Volumen sehr viel kleiner ist als das
Pipettenvolumen, gleicht sich das intrazelluläre Milieu schnell an die
Elektrolytkonzentration der Pipettenlösung an (Marty & Neher, 1983). Elektrisch
besteht ein niederohmiger Zugang (ca. 1-10 MΩ) zur Zelle. In der nun bestehenden
so genannten ruptured-patch whole-cell Konfiguration gemessene Ganzzellströme
stellen die Summenströme der einzelnen Ionenkanäle dar (Spannungsklemme).
Üblicherweise sind sie so groß, dass Schaltvorgänge einzelner Kanäle nicht
differenziert werden können.
2.3.1.3 Die Spannungsklemme
Ziel der Spannungsklemme ist es, zwischen Patchelektrode und Referenzelektrode
ein bestimmtes Potential aufrecht zu erhalten, auf einen Zielwert zu „klemmen“,
sodass das Pipettenpotential bis auf einen geringen, vom Proportionalitätsfaktor
(gain) abhängigen Fehler dem Kommandopotential (Haltepotential) entspricht. Dafür
wird über einen Rückkopplungswiderstand ein zur Differenz zwischen dem
Kommandopotential und dem aktuellen Pipettenpotential proportionaler Strom in die
Patch-Pipette geschickt. Abgesehen von Leckströmen und durch den
Serienwiderstand bedingten Abweichungen ist dieser Strom der
Membranleitfähigkeit bei der jeweiligen Kommandospannung proportional und stellt
somit direkt die Aktivität der Ionenkanäle dar.
Die Zellen betreffende Potentiale werden aus Sicht des Zellinneren angegeben.
Das normale Ruhemembranpotential einer Kardiomyozyte liegt bei etwa -90 mV.
Wird das intrazelluläre Potential gegenüber dem Extrazellulärraum positiver,
bedeutet dies eine Membrandepolarisation, wird es negativer, erfolgt eine
Hyperpolarisation.
Einwärtsströme sind definiert als Kationenfluss in die Zelle hinein
beziehungsweise als Anionenfluss aus der Zelle heraus. Sie führen zu einer
Membrandepolarisation. Vereinbarungsgemäß erhalten Einwärtsströme ein negatives
Vorzeichen. Fließen Kationen aus der Zelle heraus oder Anionen in die Zelle hinein,
wird dies als Auswärtsstrom bezeichnet, gekennzeichnet mit einem positiven
Vorzeichen. Es resultiert eine Hyperpolarisation.
28
Das Kommandopotential entspricht im statischen Zustand nicht dem effektiv an
der Zellmembran anliegenden Potential Vm, da es sowohl über dem
Zellmembranwiderstand Rm als auch über dem dazu in Serie geschalteten
Serienwiderstand Rs abfällt. Letzterer setzt sich aus dem Pipettenwiderstand und dem
Widerstand des zerrissenen Membranstücks zusammen. Der durch Rs bedingte
Fehler bezüglich VPip nimmt mit steigender Stromstärke zu. Dynamische
Leitfähigkeitsänderungen der Zellmembran werden damit durch den aus Rs und der
Membrankapazität Cm bestehenden Filter verzögert und verzerrt wiedergegeben.
Diese Fehler können durch Niedrighalten des Serienwiderstandes und durch
Kompensationsschaltungen minimiert werden.
2.3.2 Der Patch-Clamp Versuchsstand
2.3.2.1 Die mechanischen Komponenten
Patch-Clamp Experimente sind sehr anfällig gegenüber äußeren Störfaktoren. Um
mechanische Erschütterungen auszugleichen war der Versuchsstand daher auf einem
schwingungsgedämpften Tisch errichtet. Ein umgebender Faraday-Käfig diente der
Abschirmung elektrischer Störfelder (Eigenbau der Werkstatt des Instituts für
Zelluläre und Molekulare Physiologie der Universität Erlangen). Die
Versuchskammer, ein Eigenbau der Werkstatt des Physiologischen Instituts der
Universität Frankfurt, bestand aus einer 7 x 5 cm2 großen und 1 cm dicken
Plexiglasscheibe, in die ein Versuchs- und ein Absaugkanal eingefräst waren. Ein
aufgeklebtes Deckglas bildete den Boden der Kammer. Der Versuchskanal maß etwa
3 x 25 mm2. Von der linken Seite mündeten über einen Einlaufstutzen sechs
Schläuche, welche mit Perfusorspritzen verbunden waren, in die die
Versuchslösungen gegeben wurden. Die Behälter waren etwa 40 cm oberhalb der
Versuchskammer montiert, sodass die Lösungen beim Lösungswechsel entsprechend
dem hydrostatischen Druck mit konstanter Geschwindigkeit von etwa 15 ml/min in
die Kammer gelangten. Innerhalb weniger Sekunden war die Lösung vollständig
ausgetauscht. Die Versuchskammer endete rechts über einen Tunnel in dem 10 mm
breiten und 30 mm langen Absaugkanal. Die Lösungen gelangten somit auf der einen
Seite in die Versuchskammer hinein, flossen gegenüber durch den Tunnel und
wurden in der Absaugkammer von einer von oben hineinreichende Pipette abgesaugt.
Da nur beim Lösungswechsel ein potentiell störender elektrisch leitender Kontakt
zwischen der Pipette und der Flüssigkeit bestand, waren während der Versuche
rauscharme Bedingungen gewährleistet. Rechts des Absaugkanals befand sich eine
29
weitere ca. 6 x 12 mm2 große Kammer, in die die Referenzelektrode des Patch-
Clamp Verstärkers hineinragte. Sie war während der Versuche mit Pipettenlösung
gefüllt und stand über eine Agarbrücke mit der Badlösung im Absaugkanal in
Kontakt. Die beschriebene Versuchskammer war in den Kreuztisch eines inversen
Mikroskops (Leica DM IRB, Leica Microsystems AG, Wetzlar, Deutschland)
integriert, sodass darüber genügend Raum für das Arbeiten mit der Pipette war. Das
im Mikroskop eingestellte Bild konnte wahlweise direkt betrachtet oder mittels einer
angeschlossenen Kamera (IonOptix MyoCam, Milton, MA, USA) auf einen
Bildschirm übertragen werden.
Der Pipettenhalter war am Vorverstärker montiert und konnte mit einem mit
diesem verbundenen Mikromanipulator (Luigs & Neumann, Ratingen, Deutschland)
gesteuert werden. Der Druck in der Pipette konnte über einen am Pipettenhalter
befestigten Schlauch reguliert werden. Dieser führte über Dreiwegehähne zu einem
U-Rohr mit einer Wassersäule, einer Spritze und einem Mundstück zur Applikation
kurzer Über- oder Unterdruckpulse.
2.3.2.2 Die elektronischen Komponenten
Den Kontakt zwischen der jeweiligen Elektrolytlösung und der Referenzelektrode
beziehungsweise dem Eingang des Vorverstärkers gewährleisteten
Silber/Silberchloridelektroden. Ein ca. 0.3 mm dünner Silberdraht, der elektrisch in
0.1 M KCl-Lösung chloriert worden war, bildete die Elektrode des Vorverstärkers. In
die hintere Öffnung der Patch-Pipette eingeführt, ragte er in die Pipettenlösung
hinein. Als Referenzelektrode diente ein aus Silber/Silberchlorid gepresstes „Pellet“,
welches sich in der mit Pipettenlösung gefüllten Referenzkammer befand. Diese
wiederum war über eine Agarbrücke mit der Badlösung verbunden. Die Agarbrücke
war aus einem Glasröhrchen gefertigt, welches mit 2 % Agar-Agar enthaltender
Pipettenlösung gefüllt war. Das Grenzflächenpotential der Brücke wurde bestimmt
und bei den Versuchen berücksichtigt. Sein Wert betrug ca. 9 mV.
Als Patch-Clamp Verstärker fand ein EPC-10 (HEKA Elektronik, Lambrecht,
Deutschland) Verwendung. Er wurde über einen Pentium IV-Computer mit der
Software Pulse (HEKA Elektronik) angesteuert.
Die Stromsignale wurden bereits im EPC-10 mittels der eingebauten Bessel-Filter
bei 10 kHz vor- und 1 kHz nachgefiltert und mit 5 kHz Abtastrate digital
aufgezeichnet. Strom- und Spannungssignal waren auf dem Computerbildschirm
sichtbar und wurden auf Festplatte gespeichert.
30
2.3.2.3 Die Pipetten
Die Patch-Pipetten wurden mit einem programmierbaren Elektrodenziehgerät (P-97,
Sutter Instruments, Novato, CA, USA) aus Borosilikatglaskapillaren (GC 150-15
Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA oder Hilgenberg GmbH D-Maisfeld)
gezogen. Die Kapillaren beider Hersteller maßen im Durchmesser außen 1.5 mm und
innen 0.86 mm und waren in ihren elektrischen Eigenschaften identisch. Kurz vor
dem Einsatz wurden die Pipettenspitzen hitzepoliert (Micro Forge MF 830,
Narishige, Japan), um deren Oberfläche zu glätten. Mit Pipettenlösung gefüllt hatten
sie in der Badlösung einen Widerstand von durchschnittlich 3.8 MΩ.
2.4 Durchführung der elektrophysiologischen Experim ente
Die elektrophysiologischen Messungen wurden stets am Tag der Zellisolation
durchgeführt. Die Myozyten wurden in die Versuchskammer einpipettiert und
setzten sich innerhalb einiger Minuten auf dem Kammerboden ab, bevor unter
100-facher Vergrößerung eine Zelle ausgewählt wurde. Verwendet wurden nur
stabförmige bewegungslose Einzelzellen mit deutlicher Querstreifung.
Nun wurde eine Pipette hitzepoliert und über einen kurzen Silikonschlauch mit
einer Einwegspritze verbunden. So konnte zunächst in die Spitze der Pipette etwas
steril filtrierte (0.22 µm Porenweite) Pipettenlösung eingesaugt werden, bevor die
Pipette mit Hilfe einer Spinalnadel (Spinocan Braun AG Melsungen, Deutschland)
von hinten aufgefüllt wurde. Verbleibende Luftblasen entwichen durch leichtes
Beklopfen mit dem Finger. Ehe die Pipette im Pipettenhalter befestigt wurde, wurde
sie bis auf das vordere Drittel leer gesaugt, sodass der Elektrodendraht nur einige
Millimeter in die Pipettenlösung eintauchte. Um Verschmutzung der Pipettenspitze
zu vermeiden wurde nun ein leichter Überdruck angelegt und die Pipette in die
Badlösung gefahren. Mittels des Mikromanipulators wurde sie der Zelle zunächst
unter 100-facher Vergrößerung, dann unter 400-facher Vergrößerung langsam
angenähert. Nach Reduktion des Überdrucks wurden durch eine in die Pulse
Software integrierte Funktion eventuelle durch Elektrodenasymmetrie entstandene
Potentiale (offset-Potentiale) kompensiert und das extrazelluläre Potential auf Null
gesetzt (V0-Abgleich). Unter akustischer Kontrolle des Widerstandes wurde die
Pipette nun auf die Zellmembran gesetzt. Hatte jener etwa 130 % des
Pipettenwiderstandes erreicht, trat nach Anlegen eines Unterdrucks in der Regel eine
weitere Zunahme bis in den Gigaohmbereich ein. In der nun bestehenden cell-
attached Konfiguration erfolgte über die Pulse Software die automatische
31
Kompensation der Pipettenkapazität (Cfast). Durch kurze Spannungs- und Druckpulse
wurde der Membranfleck unter der Pipette zerstört und so die whole-cell
Konfiguration erreicht. Hier wurden Zellkapazität Cm und Serienwiderstand Rs
ebenfalls über die Pulse Software bestimmt. Über den EPC-10 wurden im weiteren
Verlauf der Serienwiderstand zu 85% und die Zellkapazität kompensiert. Hierdurch
wurde der Spannungsklemmfehler möglichst gering gehalten.
Ein Überdruck von ca. 5 cm H2O, der von der Wassersäule im U-Rohr auf die
Pipette übertragen werden konnte, sollte den Serienwiderstand während des
Versuches möglichst konstant halten. Bei den Messungen lag der oberste tolerierte
Wert für den unkompensierten Rs bei 12 MΩ. Stieg der Serienwiderstand über diesen
Grenzwert an, wurde versucht, ihn durch erneute Druckpulse zu korrigieren.
Das an der Agarbrücke auftretende Grenzflächenpotential wurde während der
Experimente durch Subtraktion ausgeglichen. Alle Versuche wurden bei
Raumtemperatur durchgeführt (21-24 °C).
2.6 Pulsprotokolle
2.6.1 Bestimmung des L-Typ Ca2+-Stroms (ICaL)
Um den L-Typ Ca2+-Strom auszulösen, wurde die Membran in 10 mV-Schritten
für je 600 ms auf Potentialen zwischen VPip = -40 mV und VPip = +60 mV gehalten.
Das Ruhepotential im Intervall betrug VPip = -90 mV. Die Zykluslänge lag bei
3000 ms. Als Pipettenlösung wurde CsCl-Lösung verwendet. Im Bad befand sich
Na+-freie NMDG-Lösung.
2.6.2 Bestimmung der Steady-State Inaktivierung von ICaL
Die Steady-State Inaktivierung von ICaL wurde mittels eines zweiphasigen
Protokolls ermittelt, indem das Kommandopotential von VPip = -90 mV zunächst für
600 ms auf Werte zwischen VPip = -90 mV und VPip = +10 mV (in 10 mV-Schritten)
angehoben wurde. Dies bewirkte eine unterschiedlich stark ausgeprägte
Inaktivierung des ICaL. Anschließend wurde das Kommandopotential für 600 ms auf
VPip = 0 mV gehalten. Die Zykluslänge betrug 3 s. In der Pipette war CsCl-Lösung,
im Bad befand sich NMDG-Lösung.
2.6.3 Bestimmung der Erholung von der Inaktivierung von ICaL
Die Erholung von der Inaktivierung wurde anhand eines zweistufigen
Pulsprotokolls bestimmt. Zunächst wurde der ICaL in einem 600 ms langen
32
Spannungssprung auf VPip = 0 mV inaktiviert. Die Erholung erfolgte während einer
Repolarisation auf VPip = -90 mV, deren Dauer zwischen 0 ms und 1460 ms
exponentiell anstieg. Ein zweiter Spannungssprung auf VPip = 0 mV über 600 ms
löste den L-Typ Ca2+-Strom erneut aus. Als Pipettenlösung diente CsCl-Lösung, als
Badlösung wurde NMDG-Lösung verwendet.
2.7 Untersuchung der Expression der Ca v1.2-Untereinheit
durch Western Blots
Die Narkose der Tiere sowie die Entnahme der Herzen für