Acta histochem. Bd. 62, S. 170 -175 (1978)

Institut fUr Anatomie, Histologie und Embryologieder Medizinischen Universitat Szeged, Ungarn

(Direktor: Prof. Dr. B. CSILLIK)

Calcium-Freisetzung in der neuromuskularen Junktionauf die Wirkung von Acetylcholin1)

Calcium utilization in the neuromuscular junctionafter acetylcholin treatment

Von GELLERT PALANKAI, GYULA S..\.VAY und MARIA POBERAI

Mit Tafel II und III

(Eingegangen am 16. November 1977)

Zusammenfassung

Auf die Wirkung wiederholter Acetylcholinverabreichung sowie SCh ist mit Hilfe histo·chemischer Methoden (Schwermetallsubstitution, Tetracyclin·Fluorescenz und Glyoxal. bis (2.hydroxyanil)-Komplexbildung) im Bereich der neuromuskularen Junktion eine Ca++-Freisetzungnachweisbar, ahnlich jener, wie sie friiher nach elektrischer Reizung bzw. Anwendung vonCholinesteraseblockern beschrieben wurde. Mit Hilfe von Glyoxal- bis (2-hydroxyanil) kann diedurch Mg++ verursachte eventuelle aspezifische Reaktion ausgeschlossen werden. Es ist ein Zu.sammenhang zwischen dem geschilderten Phanomen und dem funktionsabhangigen Ablauf dermitochondrialen Energieprozesse anzunehmen.

Summary

In the site of the myoneural junction a liberation of Ca++ ions, which is similar to thatdescribed previously after an electric stimulation or use of cholinesterase inhibitor, can be re­vealed by histochemical methods (heavy metal substitution, tetracycline fluorescence techniqueand glyoxal-bis-(2-hydroxyanil) complex formation) using repeated acetylcholine and SCh ad·ministration. The possible aspecific reaction due to the presence of Mg++ ions can be excludedby means of the glyoxal-bis(2-hydroxyanil) method. It can be suggested that there is a cor·relation between the liberation of Ca++ ions an the function dependent mitochondrial energetic

processes.

Einleitung

1m Rahmen frliherer Untersuchungen hatten CSILLIK und S.(VAY (1963) sowieSAvAY und CSILLIK (1965) festgestellt, daB elektrische Reizung des motorischen Ner­ven im Skeletmuskel von Saugern oder 1njektion von Acetylcholinesterase-Blockern(z. B. Neostigmin) eine histochemisch demonstrierbare Calciumfreisetzung zeitigt,

1) Diese Arbeit wurde vom Wissenschaftlichen Rat des Ministeriums fUr Gesundheitswesender Volksrepublik Ungarn unterstiitzt [4.01-0303.01.1/Cs].

Calcium-Freisetzung in der neuromuskularen Junktion 171

welche auf das postjunktionale Sarkoplasma unterhalb des motorischen Axontermi.nals lokalisiert ist. Obzwar auf einmalige Acetylcholinzufuhr eine derartige Verande­rung nicht zustande kam, erachten sie die Erscheinung als das Ergebnis einer Inter­aktion zwischen dem Acetylcholin und dem Acetylcholin-Receptor. Zu ahnlichenFolgerungen gelangten auch NAKAMURA, NAMBA und GROB (1967) sowie NAMBA undGROB (1967), indem sie feststellten, daB eine enge Korrelation besteht zwischen demdie divalenten Kationen bindenden Locus und der Ca-Freisetzung sowie zwischenden acetylcholinesterase-aktiven Loci und dem Acetylcholinreceptor.

In der vorliegenden Arbeit trachteten die Autoren, einen exakten Nachweis dafiirzu erbringen, daB fUr die oben geschilderte Ca-Freisetzung tatsachlich das Acetyl­cholin verantwortlich zu machen ist, wobei gleichzeitig 2 neuere spezifische Methodenzur Lokalisierung des auf diese Weise freigesetzten Calcium erprobt wurden.

Material und Methoden

Zu den Untersuchungen wurde das Diaphragma von 25 Albinoratten im Gewicht von 150bis 200 g verwendet. Die Reizung des Zwerchfells geschah mit protrahiert intraperitoneal (inGaben von 50 bis 100 mg/kg in Intervallen von 3 bis 10 min, insgesamt binnen 30 bis 60 min)eingefiihrtem Acetylcholin (Acecoline, Lematte-Boinot). Als Kontrollen dienten 10 Tiere, die

intraperitoneal 1 mg/kg Neostigmin-methylsulfuricum (Stigmosan, Chinoin) erhielten.25 weiteren Tieren wurde intraperitoneal bzw. unter die FuJ3sohlenhaut 1 mg/kg SCh (Succinyl.

cholin Asta ®, 5% i. v., Asta-\Verke A. G., Chern. Fabrik, Brachwede, BRD) gespritzt. Ver­arbeitet wurden das Diaphragma und der M. flexor digitorum brevis dieser Tiere.

Zum Calciumnachweis fanden 3 Methoden Verwendung:

1. Die Tetracyclin-Fluorescenzmethode

Die Tiere erhielten 2 bis 24 h vor der Stimulation 25 bis 50 mg/kg Oxytetracyklin-HCI(Tetran, i. v. Inj., Chinoin), insgesamt Ibis 3 Dosen. Unmittlebar nach der Stimulation wurdendie Ratten durch Decapitation getotet, aus ihrem Diaphragma Kryostat-Schnitte gefertigt unddiese nach Fixieren in Aceton und Waschen mit 70%igem Alkohol mit Glycerin oder (nach demEntwassern) mit Fluormount iiberdeckt. Die Untersuchung der Schnitte erfolgte im ZeissschenMF-Fluoreszenzmikroskop unter Benutzung einer Quecksilberdampflampe Zeiss HBO-200 undder Filterkombination BG 12jOG I-GG 11. Die Aufnahmen wurden mit Orwochrom-Film UT 21hergestellt.

2. Glyoxal- bis (2-hydroxyanil)-Methode

Nach der Reizung aus dem Diaphragma hergestellte Kryostat-Schnitte wurden - bei ge­ringfiigiger Modifizierung des Verfahrens von KASHIWA und ATKINSON (1963) - sofort in dieFarblosung von O°C gegeben; in anderen Fallen wurde die Farbung nach Fixieren in Acetonund Auswaschen in Alkohol vorgenommen. Nun folgte Spiilcn in 70%igem Alkohol, dann kamendie Schnitte - in einem Teil der Faile ~ in alkoholige Na2COs-KCN-Losung, wurden nachnochmaligem Waschen in Alkohol auf Objekttrager gezogen, entwassert und mit Fluormountbedeckt.

3. 8chwermetallsubstitutions-Methode

Ais Kontrolle der Methoden lund 2 wurden die aus dem stimulierten Diaphragma ange.fertigten Kryostatschnitte - bei geringfiigiger Abwandlung der Methode von CSILLIK und SA­VAY - auch einer in vitro-Blei-Substitutionsbehandlung unterzogen. Nach Fixieren in Aceton

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wurden die Schnitte in 70%igem Alkohol gewaschen und dann in O,2%ige Pb/NOa/2-Losunggegeben. Nach Auswaschen in dest. Wasser folgte Behandlung mit (NH4)2SX oder H 2S-haltigemWasser und schlie13lich nach erneutem griindlichem Waschen, EntwSssern und Eindecken mitCanada-Balsam.

Ergebnisse

1. In den Endplatten des ruhenden (nicht gereizten) Muskels war mit keiner derobigen Methoden histochemisch Calcium nachweisbar. Nur in vereinzelten Schnittenschienen blaB homogen tingierte Mastzellen - besonders in der Umgebung groBererGefaBe und nahe der Innervationszone - auf, wie frtiher von S,{VAY und CSILLIK(1963) beobachtet.

2. Nack protrakierter Acetylckolinverabreickung treten mittels Bleisubstitution inbraunlich-schwarzer Farbe die motorischen Endplatten hervor. Die Reaktion zeigtein ahnliches Bild wie auf die Wirkung der Cholinesteraseinhibitoren: sie erstrecktsich ausschlieBlich auf das postjunktionale Sarkoplasma. Bei starkerer VergroBerungzeigt sich, daB der Bleisulfidniederschlag aus 1/-lm groBen oder noch kleineren Korn­chen mit blasserem homogenem Hintergrund besteht. Die fundamentalen Zellkernebleiben ungefarbt, wahrend ihre Kernmembran sich scharf abhebt. Die Intensitatder Reaktion ist bei ktirzerer Acetylcholin-Einwirkungsdauer(30 min) auBerstschwach, erreicht aber auch bei langerer Reizung den bei Anwendung der Cholin­esteraseinhibitoren beobachteten Grad nicht (Tafel II, Abb. 1).

Bei Anwendung des SCh resultiert mit der Bleisubstitutionsmethode im Bereichder motorischen Endplatten ebenfalls eine positive Reaktion. Am Ort des subneu­ralen Apparates erscheint eine aus feinen Kornchen bestehende typische Zeichnung.In den umgebenden Gebieten ist ein auf eine positive Reaktion hindeutender Blei­sulfidniederschlag nicht bemerkbar. Das morphologische Bild erinnert an das nachcholinesterasehemmern bzw. protrahierter ACh-Verabreichung beobachtete (Tafel II,Abb.2).

3. Nach chemischer Reizung im AnschluB an die in vivo- Vorbekandlung mit Oxy­tetracyklin zeigen die motorischen Endplatten eine intensiv gelbe Fluorescenz. DasFluorochrom weist eine homogenere Verteilung auf als im FaIle der Substitutions­reaktion und ist ebenfalls nur auf das DOYERE-Protoplasma beschrankt, wahrenddie fundamentalen Zellkerne dunkel bleiben. An der Oberflache der Muskelfasernwird neben der blaulichgrtinen Autofluorescenz eine blasse, stellenweise intensivereGelbfarbung sichtbar (Tafel II, Abb. 3).

4. Nach Farbung der chemisch stimulierten Muskeln mit Glyoxal- bis (2-hydroxy­anil)- im weiteren "GBHA" - scheinen die motorischen Endplatten in roter Farbeauf, wahrend die Muskelfasern vollig ungefarbt bleiben. Der farbige GBHA·Nieder­schlag bildet im postsynaptischen Sarkoplasma Kornchen vom Durchmesser = 0,5bis 1'0/-lm, doch gestaltet sich das Bild weitaus abwechslungsvoller als bisher beob·achtet. In den meisten Endplatten zeigen auch die fundamentalen Zellkerne eineblaBrote· Tingierung; vereinzelt werden innerhalb des Zellkernes starker gefarbteStrukturen von 2 bis 3/-lm GroBe sichtbar. Manche Endplatten zeigen eine davonganz abweichende Struktur: die Sohlenplatten weisen marginal oder an der ganzen

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Oberflache eine Querstreifung auf; an anderen Stellen zeichnet sich die charakte­ristische Form des COUTEAuxschen subneuralen Apparates ab, so daB der zwischenden einzelnen "Trogen" befindliche Teil ungefarbt bleibt (Tafel II, Abb. 4,5).

Diskussion

REGNA et a1. (1951) teilten mit, daB die Tetracykline mit Calcium und Magnesium schwerwasserlosliche Komplexe bilden. Auf Grund del' Fluorescenz diesel' Komplexe fanden MILCH et al.(1957) die in vivo eingefuhrten Tetracykline geeignet zum Nachweis des in die Knochen frischinkorporierten Calciums, und die Methode fand binnen kurzer Zeit eine ausgedehnte Verbreitung(HELANDER und BOTTIGER 1953, FROS1' und VILLANUEVA 1960, FROS1' 1963, KASHIWA und A1'­KINSON 1963, ERICSON und BAKER 1967). Ein umfassendes Bild uber die fluorescenz-histochemi·schen Methoden del' Untersuchung del' Mineralisation bietet die zusammenfassende Arbeit vonM6DIS, PE1'K6 und FOLDES (1969).

Unsere mit del' Oxytetracyklin-Methoue hergestellten Schnitte bekraftigen, daB die in denmotorischen Endplatten fruher mit den weniger spezifischen Farbungsverfahren beobachtetoSubstanz in del' Tat Calcium ist. Die Tetracykline bilden zwar auch mit Magnesium einen Kom·plex, doch kommt dieses Kation im quergestreiften Muskel entschieden an die Muskelfasern ge·bunden vor; in den Muskelfasern aber ist nach unseren Untersuchungen bei der Reizung nul'eine minimale gelbe Fluorescenz wahrnehmbar, wahrscheinlich deshalb, weil auch diese auf dieMuskelfasern lokalisierte Farbung eher mit dem anlaBlich del' Kontraktion aus dem sarkoplas­matischen Retikulum mobilisierten Calcium in Beziehung zu bringen ist.

Unsere GBHA-Untersuchungen schlieBen von vornherein die Moglichkeit einer durch Mag­nesium verursachten, eventuellen pseudo-positiven Reaktion aus. Die chemischen Grundlagendel' Methode hatten seinerzeit GOLDSTEIN und S1'ARK-MAYER (1958) geklart, die festgestellten,da/3 das GBHA in alkalisch-athanoliger Losung mit den Ca-, Ba-, Sr-, Cd-, Cu-, Co- und Ni-Ionenein Chelat bildet, bei Anwendung von NazCO a und KCN aber nul' del' Ca-GBHA-Komplex farbigbleibt und die ubrigen sich entfarben. Die Methode hatten KAsHIwA und A1'KINSON (1963) zurLokalisierung von ionalem Calcium ausgearbeitet. In unseren Versuchen erhielten wir mit del'von diesen Autoren empfohlenen Farbung in nicht entparaffiniertem Zustand, wie auch bei del'mit der Kryostattechnik kombinierten Fiirbung eine iihnliche Lokalisation. Es ist allerdings nichteinwandfrei klarzustellen, ob das etwas polymorphe Bild ein Diffusions-Kunstprodukt odeI' abel'eine Folge del' auLlerordentlichen Empfindlichkeit del' GBHA-Methode ist (in vitro zeigt sie be­reits weniger als 0,05 f-lg Ca-Ionen pro Schnitt an!).

Obzwar wir uber keinen direkten Beweis dafiir verfiigen, daLl die Depolarisation del' post­synaptischen Membran von dem durch den synaptischen Spalt gelangten Acetylcholin ausge­lost ist, ist es ja sogar moglich, da/3 sie seine Wirkung uber Transmissionen entfaltet (KOELLE1962, CSILLIK und SAVAY 1963, CSILLIK 1965, SAVAY und CSILLIK 1965, CSILLIK und KNIHAR1968, CSILLIK 1971). Doch wird die Rolle des Actylcholin im Ingangsetzen des pra- und post­synaptischen Geschehens durch zahlreiche experimentelle Befunde unzweifelhaft gemacht. Rei­zung des motorischen N erven zeitigt Acetylcholinfreisetzung; das mittels Perfusion oder Mikro­elektrophorese in die Nahe der Endplatte gebrachte Acetylcholin lost deren Depolarisation aus.Cholinesteraseinhibitoren, wie beispielsweise Neostigmin, zeitigen durch Anreicherung des frei­gesetzten Acetylcholins cine dauernde bzw. anhaltende Depolarisation. Ein ebenfalls prolongierterEffekt resultiert auch bei Anwendung des dem Acetylcholin iihnlich strukturierten SCh, in dessenWirkungsmechanismus neben einem postsynaptischen Angriffspunkt auch prasynaptische Ef­fekte angenommen werden (KovAcs und TARISKA 1974).

Nimmt man schliel3lich die Frage von der Receptor-Seite her in Angriff, so wissen wir, da/3das d-Tubocurarin, dessen Rezeptor-Bindung WASER und HADORN (1961) mit Hilfe del' licht­mikroskopischen Autoradiographie erweisen konnten, die Wirkung del' elektrischen odeI' chemi.schen Reizung hemmt und somit aUe jene molekularen Veranderungen, welche die Grundlage des

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Calcium-Release bilden konnen. Die Beobachtung von SAVAY und CSILLIK (1965), wonach ein­malige Acetylcholinzufuhr dennoch keine Calciumfreisetzung verursachte, ist damit zu erklaren,daB - selbst wenn die eingefiihrte Menge (1 bis 5 mg/kg) zur Erzielung del' zur Depolarisationerforderlichen lokalen Konzentration ausgereicht hatte - die anwesende Acetylcholinesteraseden hineingelangton Ester so schnell hydrolysierte, d~B diesel' binnen so kurzer Zeit nicht im­stande war, eine histochemisch demonstrierbare Menge Calcium freizusetzen. In dem hier erorter­ten Versuch diirfte das prolongiert wirkende, in extremer Gesamt-Dosis angewandte (0,1 bis 0,2 gpro Ratte!) Acetylcholin eine ahnliche protrahierte Depolarisation hervorgebracht haben, wiedie Wirkung del' lokalen Perfusion, die bereits eine auch lichtmikroskopisch visualisierbare Cal­ciumfreisetzung zeitigt.

Beachtenswert ist, daB die in den Organismus gelangten Tetracykline besonders in den ener­giebediirftige Funktionen vollziehenden Organen - Niere, Leber, Milz, Darme usw. - odor inTumoren hohere Konzentrationen erreichen (HELANDER und BOTTIGER 1953, SUZUKI und MAT­HEWS 1966). Nach den Untersuchungen von Du Buy und SHOWAERE (1961) zeigen die Mitochon­drien in den lebenden Zellen diesel' Organe eine lebhafte Fluorescenz. Moglicherweise hangt dieunsererseits beobachtete granulare Calciumlokalisation mit den lebhaften (genauer gesagt: beilangerer Stimulation lebhafter werdenden) Energieprozessen del' Mitochondrien des DOYERE­Protoplasmas zusammen, was in Einklang mit del' Tatsache zu bringen ist, daB in den motori­schen Endplatton von mit Dinitrophenol behandelten Tieren eine iihnliche Calciumfreisetzungzu beohachten ist.

Literatur

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Anschrift der Verfasser: Prof. Dr. GYULA S,iVAY, Institut fUr Anatomie, Histologie und Em­bryologie der Medizinischen Universitat Szeged, Kossuth sugarut 40, H - 6701 Szeged.

Tafel II

Ahb. I. Auf die vVirkung von Acetylcholin zustande kommende Calciumfreisetzung im Dia­phragma der Ratte, Blei-Substitutionsmethode.

Abb.2. Nach Succinylcholinverabrcichung auftretende Calciumfreisetzung im Diaphragma clerRatte, Blei-Substitutionsmethode.

Abb. 3. Mit der Tetmcyklin-Pluoreszenzmethode nachgewiesene Calciumfreisetzung im Diaphragmacler Ratte.

Tafel III

Abb.4. Mit Glyoxal-bis (2-hyclroxyanil) nachgewiesene Calciumfreisetzung im Diaphragma derRatte. Der Pfeil deutet auf einen fundamentalen Zellkern.

Abb.5. Das gleiche wie in Abb. 4; der Pfeil weist auf den sich abzeichnenden subneuralen Ap­parat.

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Palankai u. a.VEB GUSTAV FISCHER VERLAG lENA

Acta histochem. Bd. 62 Tafel III

Palankai u. a.

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