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Kundenzeitschrift der GERSTEL GmbH & Co. KG · Eberhard-Gerstel-Platz 1 · 45473 Mülheim an der Ruhr · Telefon + 49 2 08 - 7 65 03-0 · gerstel@gerstel.deww

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April 2008

G L O B A L A N A L Y T I C A L S O L U T I O N S

Effi ziente Spurenanalytik in der LC (LC/MS)

Automatisierte Probenvorbereitung

und Probenaufgabe

GERSTEL Aktuell Editorial

GERSTEL online

Hinweise zu Produkten, Terminen, Veranstaltungen, Downloads sowie weitere Informationen über das Unternehmen und seine kundenorientierten Lösungen erhalten Sie im Internet unter www.gerstel.de

Herausgeber GERSTEL GmbH & Co. KG Eberhard-Gerstel-Platz 1 45473 Mülheim an der Ruhr

Redaktion Guido Deußing ScienceCommunicationRedaktionsbüro Uhlandstraße 16 41464 Neuss guido.deussing@t-online.de

Wissenschaftlicher Beirat Dr. Eike Kleine-Benne eike_kleine-benne@gerstel.de Dr. Oliver Lerch oliver_lerch@gerstel.deDr. Malte Reimoldmalte_reimold@gerstel.de

Leserdienst Andrea Hamm aktuell@gerstel.de

Gestaltung Paura Design, Hagen www.paura.de

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Guido Deußing, Redaktion »GERSTEL Aktuell«

Als GERSTEL vor rund drei Jahren seine Aktivitäten im Bereich der Flüs-sigchromatographie intensivierte, äußerte die Geschäftsführung in einem Interview (GERSTEL Aktuell 33, Sept. 2005, Seite 8/9) auf die Frage nach der Motivation vor allem den Wunsch, den Kunden analytische Lösungen bieten zu wollen, „um die ganze Bandbreite an polaren und

apolaren Komponenten auch in schwie-rigen Matrices effi zient und sensitiv chro-matographisch bestimmen zu können“. Auf den Erfolg dieses Vorhabens ange-sprochen, gaben sich Holger Gerstel und Eberhard G. Gerstel (Foto, von links), die geschäftsführenden Gesell-schafter, damals ganz zuversichtlich und behaupteten: „Die Nähe zu unseren Kunden und die daraus resultierende

enge Zusammenarbeit hat unseren Blick für das Wesentliche geschärft. Wir wissen, worauf es ankommt.“

Die Existenz dieser »GERSTEL Aktuell LC/MS-Spezial« ist der Beweisdafür, dass die Geschäftsführer richtig lagen: In enger Kooperation mit LC-Applikationsexperten und dem Weltmarktführer AgilentTechnologies hat GERSTEL sein gerätetechnisches und applikatives Knowhow in der automatisieren Probenvorbereitung und Probenaufgabe mit Erfolg auf die Flüssigchromatographie ausgeweitet. Das zeigen die hierzusammengefassten Applikationen zum Nachweis von Chlorampheni-col, Afl atoxinen, Malachitgrün und Pestiziden. Das Unternehmen ist in der Lage, seinen Kunden analytische Lösungen für die LC und LC/MS anzubieten, die nach individuellen Wünschen entstanden sind beziehungsweise die Ansprüche der Routineanalytik mehr als erfüllen. Wichtiger Erfolgsfaktor ist vor allem die automatisierte Festphasenextraktion mit der GERSTEL-SPE. Mehr darüber erfahren Sie in der vorliegenden GERSTEL Aktuell LC/MS-Spezial. Viel Vergnügen bei der Lektüre wünscht Ihnen

Ihr

Liebe Leserinnenund Leser !

Im Innenteil

Schnell Gewissheitüber geringste Afl atoxinbelastungenSeite 8

ForellemalachitgrünSeite 11

Pestizidanalytik leicht gemachtSeite 4

Im Internet

Impressum

2 GERSTEL Aktuell LC Spezial – April 2008

GERSTEL Aktuell Chloramphenicol

Chloramphenicol sicher und effi zient in Lebensmitteln nachweisen

Die SolidPhaseExtraction (SPE) erweist sich vor allem bei komplexen Matrices als Probenvorbereitung der Wahl. GERSTEL hat die SPE auf Kartuschen für den Routinebetrieb

effi zient automatisiert, wie der Nachweis von Chloramphenicol, einem verbotenen Antibiotikum, in tierischen Lebensmitteln mittels LC/MS in Verbindung mit dem GERSTEL-

MultiPurposeSampler und der MAESTRO-Software belegt.

Automatisierte SPE über Standardkartuschen

I n Lebensmitteln tierischen Ursprungs, die aus Drittländern nach Europa eingeführt wurden, fanden Kontrolleure in den letz-

ten Jahren zunehmend Rückstände verbote-ner Antibiotika. Für Aufsehen sorgten Fun-de des Wirkstoffs Chloramphenicol (CAP), dem der Verdacht anhaftet, das Erbgut des Menschen zu schädigen, die Entstehung von Krebserkrankungen zu begünstigen und die Blut bildenden Zellen des Knochenmarks ir-reversibel zu schädigen. Der Nachweis von CAP erfolgt in aller Regel mit der LC/MS: „Wie sensitiv die Methode ist, hängt aller-

wie im Übrigen auch in einer Vielzahl an-derer Applikationsbeispiele aus den Berei-chen Lebensmittel, Umwelt oder Pharma, die Extraktion über ein festes Sorbens. Die SolidPhaseExtraction (SPE) hat sich in den letzten 25 Jahren zu einem der wirkungs-vollsten Werkzeuge ent-wickelt, mit dem sich un-terschiedlichste Verbin-dungen in Spuren oder in präparativem Maßstab iso-lieren und aufreinigen lassen.

„Allerdings haften manuellen SPE-Techniken einige gravieren-de Nachteile an“, erklärt Dr. Helle. Der An-wender müsse nicht nur sehr viel Zeit und Geduld aufbringen, um eine SPE durchzu-führen; Wiederfi ndung und Wiederholbar-keit könnten zudem extremen Schwankun-gen unterliegen, da deren Qualität erheb-lich von der Erfahrung des Anwenders im Umgang mit dieser Art der Probenbearbei-tung abhängt. „Ent-spannter, zeitsparen-der und reproduzier-barer verläuft die SPE über Kartuschen, wenn der Vorgang automati-siert wird“, sagt Helle.

Um die Analyse von CAP sicherer und effi zienter zu gestalten, setzte der Wissenschaft-ler den GERSTEL- MultiPurposeSampler MPS mit SPE-Option ein, mit der sich Fest-phasenextraktionen über handelsübliche Standardkartuschen automatisiert durchführen lassen. Hel-les Fazit: „Wiewohl der Einsatz von SPE-Kartuschen generell gute Ergebnisse lie-fert – konstante Arbeitsbedingungen vo-rausgesetzt –, hat der MPS mit SPE-Opti-

on überzeugt.“ Für Chloramphenicol er-gaben sich relative Standardabweichungen von 2,0 Prozent für die Probenvorbereitung

im MPS und 2,2 Prozent für die manuelle Vorgehensweise.

Die Wiederfi ndungsrate lag bei 92 Prozent (MPS) be-

ziehungsweise 90 Prozent (manuell). (Am Rande bemerkt: Bei den ma-nuell erzielten Ergebnis-

sen, handelt es sich um die Ar-beit eines versierten, routinier-

ten Laboranten.) Allerdings habe vor allem eines dafür gesprochen,

die SPE-Analysen künftig ausschließlich mit dem MPS durchzuführen. Dr. Norbert Hel-le: „Selbst komplexe Proben lassen sich in nahezu der Hälfte der sonst üblichen Zeit komfortabel und sicher abarbeiten.“

Weitere Informationen

fi nden Sie unter www.gerstel.de

Wiederfi ndung und Wiederholbarkeit der Bestimmung von Chloramphenicol (CAP) in Garnelenfl eisch mit manueller bzw. automatisierter Probenvorbereitung.

Detektion eines CAP-Rückstandes von 0,01 μg/kg in einer Garnelenprobe nach automatisierter SPE und Einengung (Faktor 10) auf dem GERSTEL-MultiPurposeSampler MPS. Die Detektion erfolgte mittels ION-TRAP-LC-MS/MS.

dings entscheidend von der Probenvorberei-tung ab. Selbst bei hochselektiven LC-MS/MS-Methoden kann ein extremer Matrix-Untergrund zu einer unzulänglichen Quan-tifi zierung führen“, sagt Dr. Norbert Helle, Applikationsexperte und Inhaber der Te-LA GmbH, eines Auftragslabors aus Bre-merhaven.

Als Probenvorbereitungstechnik der Wahl im Vorfeld chromatographischer-Trennungen erweist sich im Fall des CAP,

Chloramphenicol

3GERSTEL Aktuel LC Spezial – April 2008

GERSTEL Aktuell Pestizide

Pestizidanalytik leicht gemachtoder: Wenn die Probenmatrix keine Rolle mehr spielt

Applikationsexperten der TeLA GmbH haben eine neue Methode auf Basis der LC/MS entwickelt, die den bisherigen Arbeitsaufwand bei der Pestizidanalyse auf ein Minimum reduziert und die Güte des Ergebnisses von der Art und Komplexität der Probenmatrix unabhängig macht.

von Dr. Norbert Helle und Meike Baden (TeLA GmbH, Bremerhaven)

GERSTEL Aktuell Pestizide

E in Grundsatz besagt, dass Rückstände von Pfl an-zenschutzmitteln die Gesundheit des Verbrau-chers nicht beeinträchtigen geschweige denn ge-

fährden dürfen. Für die einzelnen Stoffe wurden da-her Höchstmengen ermittelt, die nach dem Stand der Wissenschaft noch kein gesundheitliches Risi-ko für den Menschen bedeuten. Wird ein defi nierter Wert überschritten, darf das kontaminierte Lebens-mittel nicht im Handel angeboten werden. Die Vor-gabe entstammt höchster europäischer Jurisdiktion und ist von den Mitgliedstaaten in nationales Recht umzuwandeln beziehungsweise bereits umgewandelt worden. In Deutschland fi nden sich die Einzelheiten der Vorgabe in der Rückstandshöchstmengen-Verord-nung (RHmV) des Lebensmittel-, Bedarfsgegenstän-de- und Futtermittelgesetzbuches (LFGB). Da aber Pa-pier bekanntlich überaus geduldig sein kann, genügt es nicht, darauf zu vertrauen, dass alles rechtens ist, es bedarf vielmehr eines fl ächendeckenden Netzes ver-lässlicher Laboratorien, die eine Einhaltung der nati-onalen und internationalen Vorgaben prüfen. Dass es sich hierbei um keine triviale Angelegenheit handelt, zeigen die Ergebnisse von Laborvergleichsmessungen. Dazu später mehr.

Weltweit im Umlauf sind rund 700 verschiedene Pestizide; nur die wenigsten davon dürfen hierzulan-de eingesetzt werden. Die verschiedenen Verbindun-gen lassen sich klassifi zieren, zeigen jedoch eine gro-ße chemische Divergenz, die von hochpolar bis un-polar reicht und die eine rasche Analyse aller Stof-fe, etwa in einem Analyseverfahren, unmöglich er-scheinen lässt. Dennoch sind wirksame Multimetho-den für den Nachweis von Pestiziden im Einsatz; derer braucht es auch, will man ein Gesundheitsrisiko sicher ausschließen. Bei der Untersuchung von Lebensmit-teln auf Rückstände von Pfl anzenschutzmitteln wer-den in Früchten und Gemüsen häufi g die Rückstän-de gleich mehrerer Wirkstoffe gefunden. Und welche Wirkung ein Gemisch aus verschiedenen Wirkstoffen auf den Menschen hat, ist nur für wenige Substanz-gruppen beschrieben.

Mit GC und LC Rückständen auf den Leib rückenDie klassische Pestizidanalyse erfolgt mit der Gaschro-matographie (GC) in Verbindung mit einem Elektro-neneinfang- (ECD) oder einem Stickstoff-Phosphor-Detektor (NPD). Heute gängig und üblich ist der mas-senselektive Detektor (MSD), zunehmend auch die MS/MS, also ein mehrdimensionales Verfahren. Als Analyten im Fokus stehen vor allem Pestizide, die in der DFG S19, einer europäisch anerkannten Multime-thode zur Bestimmung von Pfl anzenschutzmitteln in Lebensmitteln, enthalten sind. Die Analyse der rund 270 Substanzen bedingt allerdings in der Regel eine ar-beits- und zeitintensive Probenvorbereitung, die etwa eine gelchromatographische Abtrennung der Analy-ten von der Matrix einschließt.

Die Flüssigchromatographie (LC) kommt zum Einsatz, um polare bis moderat unpolare Pestizide nachzuweisen; gemessen wird mit einem massen-selektiven Detektor. Als Probenvorbereitung der Wahl etabliert hat sich sowohl in der GC als auch in der LC die QuEChERS-Methode, entwickelt von Dr. Mi-chelangelo Anastassiades vom Chemischen und Ve-

ter inäruntersuchungs-amt (CVUA) in Stuttgart. Das Akronym QuEChERS steht für „Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe“ und beschreibt eine vergleichsweise neue, schnelle und kostengünsti-ge Multirückstandsmetho-de zum Nachweis von Pes-tiziden in fettfreien Matri-ces. Die mit QuEChERS er-zielten Ergebnisse sind mit jenen der DFG S19-Metho-de vergleichbar; die Proben-vorbereitung mit der QuE-ChERS-Methode umfasst allerdings weniger Arbeits-schritte, und die Proben lassen sich mühe- und rei-bungslos aufgeben, wenn die „problematische“ Ma-trix über einen Liner automatisiert entfernt wird (GERSTEL-AutomatedLinerEXchange / ALEX).

Bei der QuEChERS-Methode werden 10 g homo-genisierte Probe mit 10 mL Acetonitril versetzt und gut durchmischt. Anschließend werden 4 g Magnesi-umsulfat und 1 g Natriumchlorid zudosiert. Die Pro-be wird geschüttelt, mit dem internen Standard ver-setzt und erneut geschüttelt. Ein Aliquot des Über-standes wird entnommen, mit Magnesiumsulfat und einem Sorbens versetzt, das selektiv mit extrahierte Matrixbestandteile entfernt, geschüttelt, zentrifugiert und chromatographisch analysiert. (Vgl. GERSTEL Aktuell 33, Seite 20, „Dank ALEX Rückstände effi zien-ter nachweisen ... Bevor Lebensmittel krank machen“; www.gerstel.de/aktuell_33_20_23.pdf)

Die Vorteile der QuEChERS-Methode gegenüber klassischen Verfahren zur Analyse von Pestiziden in Obst und Gemüse liegen im geringen Verbrauch teils toxischer Lösemittel, dem reduzierten manuellen Ar-beitsaufwand, der schnellen Aufarbeitung der Probe sowie dem breiten Spektrum erfassbarer Pestizide. Der Probendurchsatz ist hoch, die Kosten für die zur Pro-benaufbereitung benötigten Materialien sind mit et-wa einem Euro je Probe vergleichsweise gering. Alles in Allem also eine wirklich effi ziente Multimethode, die im Gegensatz zu herkömmlichen Vorgehenswei-sen eine schnelle Probenvorbereitung für die GC/MS- und LC/MS-Bestimmung aller gängigen Pestizide aus Lebensmitteln erlaubt. Die Analyse wird allerdings zur Herausforderung, handelt es sich bei den Proben um komplexe Matrices mit einem hohen Anteil an Stör-substanzen, wie sie etwa in Knoblauch, Zwiebeln, Ar-tischocken oder Avocados enthalten sind. Hier kommt es häufi g zu Problemen bei der Analyse, insbesondere bei der Quantifi zierung.

Festphasenextraktion (SPE) schließt die LückeUm auch problematische Proben zuverlässig und un-abhängig von ihrer Matrix auf Pestizide untersuchen zu können, haben wir uns auf die Suche nach einer alternativen, ähnlich wirkungsvollen Probenvorbe-reitung gemacht. Gelandet sind wir bei der automa-tisierten Festphasenextraktion (SolidPhaseExtrac-tion / SPE) mit dem GERSTEL-MultiPurposeSamp-

Kalibrierkurve von neun Pestiziden, analysiert mit der Pestizid-SPE-HPLC-MS/MS-Multi-Methode.

5GERSTEL Aktuel LC Spezial – April 2008

Norbert Helle und Maike Baden nutzten für die Pestizid-SPE-HPLC-MS/MS-Multi-Methode ein System bestehend aus dem für die automatisierte SPE erforderlichen GERSTEL-SPE, einem Agilent Serie LC 1200 sowie einem Agilent 6410 MS/MS (Triple Quadrupol).

ler (MPS), mit der wir bereits bei der Analyse von Af-latoxinen, Chloramphenicol oder Malachitgrün in Le-bensmitteln sehr gute Erfahrungen gemacht haben. So viel vorweggenommen: Unsere automatisierte Pesti-zid-SPE-HPLC-MS/MS-ESI-Multimethode reduziert die manuelle Arbeit auf ein Mindestmaß und steigert den Durchsatz. Die Ergebnisse sind sicher und repro-duzierbar bei hoher Sensitivität des Nachweisverfah-rens. Technische Voraussetzungen: Der MultiPurpose-Sampler (MPS) verfügt über ein Injektionsventil; die Probenaufgabe erfolgte online in ein Agilent Serie LC 1200; detektiert wurde mit einen Agilent 6410 MS/MS-Triple-Quadrupol-Gerät.Probenvorbereitung: Fünf Gramm einer Obst- oder Gemüseprobe wurden mit 15 mL einer Mischung von Acetonitril (ACN) und Wasser (80:20) versetzt und extrahiert. Die Konditionierung der SPE-Kartusche (M&N C-18ec, 6 mL, 1 g) erfolgte mit 10 mL Metha-nol (MeOH) und 10 mL Wasser; alle Schritte der Pro-benvorbereitung einschließlich Probenaufgabe verlie-fen automatisiert. 5 mL Probe wurden auf die Säule ge-geben, anschließend wurde mit 5 mL Wasser gespült. Die Elution der Analyten erfolgte mit einem Acetoni-tril/Wasser-Gemisch mit einer Geschwindigkeit von 600 μL/min. Dabei wird die Elutionsgeschwindigkeit anders als bei manuellen Verfahren (hier wird in der Regel mit einem Unterdruck eluiert) durch den Druck einer Kolbenspritze erzeugt und ist deshalb unabhän-gig vom Gegendruck der Kartusche vollkommen re-produzierbar. Anschließend wurde das Eluat sechs Mi-nuten lang bei 50 °C eingedampft und der Rückstand in 5 mL eines Gemisches Acetonitril/Ameisensäure (30:70) aufgenommen.Probenaufgabe und Trennung: 20 μL des aufbereite-ten Extraktes wurden direkt in das LC/MS-MS-System injiziert. Die Temperatur der Säule (ZorbaxXDB C-18 100x2.1mm, 1.8 μm rapid resolution) betrug 50 °C, die Flussrate 0,5 mL/min und der resultierende Druck 420 bar. Es wurde ein Lösemittelgemisch aus 5mM Amei-sensäure (A) und Acetonitril (B) mit folgendem Gra-dientenprogramm verwendet: 0 min (20 % B); 5 min (20 % B), 30 min (90 % B). Detektion: Bestimmt wurde im positiven Elektro-spray-Modus (ESI) mit der Elektrospray-Ionen-quelle oder alternativ mit der Agilent-Multimode-

Quelle. Dabei zeigte sich, dass mit der Multimode-Quelle einige Pestizide im Vergleich zur ESI-Quelle deutlich niedrigere Bestimmungsgrenzen aufwiesen, andere wiederum zeigten eine geringere Response als mit der Standardquelle. Die Einstellungen der Ionen-quelle wurden an den Fluss beziehungsweise den Elu-enten angepasst. Folgende Parameter wurden einge-stellt: N2-Temperatur: 340 °C, Trägergas-Fluss (N2): 9 L/min; Zerstäuberdruck: 30 psi. Das Triple-Quad-rupol Instrument wurde im MRM-Modus betrieben, dabei wurden in fünf verschiedenen Zeitsegmenten jeweils zwei Übergänge für jedes Pestizid detektiert. In jedem Segment konnten somit simultan 40 bis 50 Analyten gemessen werden.

Was zu beweisen warUm es auf den Punkt zu bringen: Im Rahmen der QuE-ChERS-Methode ist es üblich und notwendig, die Pro-benaufreinigungsschritte (clean-up) der zu untersu-chenden Probe anzupassen. Es hat sich gezeigt, dass für „einfache“ Matrices wie Salat oder Gurken nach der Extraktion mit Acetonitril/Wasser im Prinzip kei-ne weitere Aufreinigung des Probenextraktes notwen-dig ist. Dagegen bedarf es bei der Analyse komplizier-ter Matrices aufgrund der darin enthaltenen hohen Konzentrationen an Begleitstoffen eines weiteren Auf-reinigungsschrittes.

Wir haben zu diesem Zweck obligatorisch, das heißt für alle Proben, den MPS-Autosampler einge-setzt, wobei die Probenextrakte automatisch auf kon-ventionelle SPE-Kartuschen gegeben und aufgereinigt wurden. Als gut geeignet erwies sich das „C-18 Rever-sed Phase Material“ der Firma Macherey-Nagel. Die Aufreinigung dauerte insgesamt rund 20 min. Diese Zeit fällt jedoch nur bei der ersten Probe ins Gewicht, da alle späteren Aufarbeitungen in die HPLC-MS/MS-Methode mit dem Analysenlauf verschachtelt werden können, folglich die Probenaufarbeitung simultan mit der Messung der vorangehenden Probe erfolgt.

Die HPLC wurde auf einer Agilent LC 1200 Rapid Resolution-Anlage durchgeführt, wobei wir zuguns-ten der Robustheit der Methodik sowie einer guten Trennleistung die Messzeit bewusst nur moderat ver-kürzt haben. Die gesamte Analyse der zur Zeit erfass-ten rund 140 Komponenten dauert deshalb etwa 35 Minuten; in dieser Zeit lässt sich die jeweils nachfol-

GERSTEL Aktuell Pestizide

6 GERSTEL Aktuell LC Spezial – April 2008

gende Probe „just in time“ für die Aufgabe mühelos aufreinigen und präparieren. Alle Proben werden so-mit exakt zum gleichen Zeitpunkt relativ zur Aufga-be vorbereitet, was das Resultat der Messung sicherer und reproduzierbar macht.

Die Probenaufreinigung mittels MPS-SPE kommt nicht allein der Robustheit der Methode zugute, son-dern verbessert auch ihre Reproduzierbarkeit und Li-nearität unabhängig von der Matrix. Als Beispiel wur-de eine Paprikaprobe mit einer Pestizidmischung do-tiert und analysiert. Ergebnis: Sowohl die Retentionszeiten als auch die die resultierenden Peakfl ächen der Analyten zeigen ext-rem geringe Schwankungen. Die Linearität der Me-thode ist sowohl für polare Komponenten wie Car-bendazim und Thiabendazol als auch für unpolare Pestizide wie Diazinon und Pirimiphosmethyl aus-gezeichnet. Orangenöle wurden auf eine gegenüber dem vorangehenden Beispiel leicht abgeänderte Wei-se aufgereinigt. Deutlich ist der Reinigungseffekt der SPE-Behandlung bereits daran zu erkennen, dass die zunächst tiefgelb gefärbte Probe nach der Behandlung ein farbloses Eluat ergibt, während die gelbe Farbe auf der Kartusche verbleibt. Die Wiederfi ndungen der einzelnen Komponenten lagen bei dieser problemati-schen Matrix bei noch guten 70 bis 90 Prozent, wäh-rend bei der Aufarbeitung von Obst- und Gemüsepro-ben bei der überwiegenden Anzahl der Analyten 80 bis 100 Prozent der Ausgangsmenge wiedergefunden wurden. Zu beachten ist auch die mit der eingesetz-ten Zorbax SB-C18 Rapid Resolution-Säule erreich-ten gute Peaksymmetrie.

Eine Bemerkung zu guter Letzt: Jede Methode muss sich in der Praxis bewähren, sonst taugt sie nicht viel. Die Probe aufs Exempel haben wir im Rahmen einer europaweiten Laborvergleichsuntersuchung an

Ausschnitt eines Chromatogramms: Separate Aufarbeitungen und Injektionen einer dotieren Paprikaprobe. Als Analyten sind die Peaks der in der Standardmischung enthaltenen Pestizide Terbutylazin, Cyprodinil, Prochloraz, Flusilazol und Fenoxycarb (je 100 ng/mL) aus dem mittleren Polaritätsbereich des Chromatogrammes dargestellt.

GERSTEL Aktuell Pestizide

Carbendazim

Thiabendazol

Beleg für die gute Linearität und Reproduzierbarkeit der Pestizid-SPE-HPLC-MS/MS-Multimethode beim Nachweis polarer und unpolarer Pestizide.

einem Gemüsehomogenat (Salat) gemacht, in der es darum ging, Rückstände von Pestiziden, insgesamt 185 verschiedene Analyten, zu identifi zieren und zu qua-lifi zieren. Die TeLA GmbH gehörte zu zwölf von 46 teilnehmenden Laboratorien, die den Ringversuch mit Erfolg bestanden. 128 der gesuchten Pestizide konn-ten wir mit unserer Pestizid-SPE-HPLC-MS/MS-Mul-timethode bestimmen, 90 Substanzen mit der GC/MS (GC 6890 mit MSD 5973, beide Agilent Technologies, in Verbindung mit dem GERSTEL-MultiPurposeSam-pler MPS) unter Verwendung der Retention Time Lo-cking-Software.

7GERSTEL Aktuel LC Spezial – April 2008

GERSTEL Aktuell Alfatoxin

Schnell Gewissheit übergeringste Afl atoxinbelastungen

Wer in Rohstoffen oder Lebensmitteln, insbesondere solchen, die für die Herstellung von Arzneimitteln und Babynahrung bestimmt sind, Schimmelpilzgifte, so genannte Mykotoxine, sicher und sensitiv bestimmen will, setzt auf die LC/MS nach vorangegangener Festphasenextraktion (SPE). Das garantiert, dass man die Nachweisgrenzen erreicht, die unterhalb der vom Gesetzgeber festgelegten Grenzwerte liegen. Während das eigentliche Probenhandling im Vorfeld der LC/MS-Analyse von Afl atoxinen, den gefährlichsten Mykotoxinen überhaupt, nur begrenzt Spielraum für Optimierung bietet, lassen sich zuverlässige und verwertbare Messergebnisse in weniger als der Hälfte der bisher üblichen Zeit erreichen, wenn die Festphasenextraktion automatisiert wird.

Bevor Lebensmittel krank machen

A uch wenn die wohl sortierte Käsetheke vom Gegenteil überzeugen mag: Wer verschimmelte Lebensmittel verzehrt

– die nicht Schimmelkäse sind – setzt sei-ne Gesundheit aufs Spiel. Grund sind so ge-nannte Mykotoxine: Gifte, die beim Stoff-wechsel bestimmter Schimmelpilze entste-hen und denen, wie es das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Le-bensmittelsicherheit (Laves) beschreibt, eine chronische und akute Toxizität zugeschrie-ben wird, hervorgerufen durch krebserzeu-gende, erbgutverändernde und hormonakti-ve Eigenschaften, die insbesondere für Säug-linge und Kleinkinder schädlich sind.

Natürliches Karzinogen birgt die größte GefahrWissenschaftlich beschrieben wurden bis-lang mehr als 300 Mykotoxine, die von rund 250 Schimmelpilzarten gebildet wer-den können. Für die Lebensmittelsicherheit bedeutend sind allerdings nur wenige My-kotoxine beziehungsweise Schimmelpilze, etwa die der Gattung Aspergillus fl avus und Aspergillus parasiticus, die vor allem unter

feucht-warmen Bedingungen auf öl- und stärkehaltigen Samen, Erd-, Wal- und Ha-selnüssen, Pistazien, Mandeln, Feigen, Ko-kos, Obst, Getreide, Reis, Mais und Soja so-wie in Trockenfrüchten und Gewürzen ge-deihen. Die vom Aspergillus fl avus und As-pergillus parasiticus produzierten Afl a-toxine B1, B2, G1 und G2 sowie M1 zählen zu den po-tentesten Mykoto-xinen überhaupt, wobei vom Afla-toxin B1 die größ-te Gefahr ausgeht aufgrund seines krebserregenden Potenzials.

Das Risiko ei-ner akuten Vergif-tung durch hohe Mykotoxinkonzentratio-nen ist aufgrund der allgemein guten Le-bensmittelqualität in Deutschland laut Laves eher niedrig. Anders verhalte es sich in Afri-ka und Asien, wo der Verzehr verschimmel-

ter Erdnüsse oder Maisprodukte, bedingt durch schlechte Wachstums-, Lagerungs- und Transportbedingungen, immer wie-der zu akuten Afl atoxin-Vergiftungen mit Todesfällen führe; die letale Afl atoxin-Do-sis für einen Erwachsenen liegt laut Litera-

tur bei 1 bis 10 mg pro Kilogramm Körper-gewicht.„Die Mykotoxinkon-tamination von Le-bens- und Futtermit-teln ist ein weltwei-tes Problem. Die UN Food and Agriculture Organization (FAO) schätzt, dass bis zu 25 Prozent der Welt-produktion von Nah-rungsmitteln mit My-kotoxinen kontami-

niert sind. Etwa 20 Prozent der Cerealie-nernte der EU enthält messbare Mengen Mykotoxine.

Über die Wirkung geringer Mengen oder einer Mischung von Mykotoxinen –

„Zuverlässige und verwertbare Messergebnisse lassen sich in der Hälfte der bisher üblichen Zeit erreichen, wenn

die Immunoaffi nitätschromato-graphie an Festphasen-kartuschen automatisiert wird.“

Dr. Norbert Helle

8 GERSTEL Aktuell LC Spezial – April 2008

GERSTEL Aktuell Alfatoxin

vor allem bei lebenslanger Aufnahme – lie-gen dagegen kaum Erkenntnisse vor“, heißt es auf der Homepage des Bayerischen Staats-ministeriums für Umwelt, Gesundheit und Verbraucherschutz.

Aufgrund der Gesundheitsgefährdung,die von Schimmel ausgeht, und seiner natür-lichen ubiquitären Verbreitung hat der Ge-setzgeber Grenz- beziehungsweise Höchst-werte für Mykotoxine im Bereich weniger Mikrogramm pro Kilogramm (μg/kg) fest-gelegt:

Unter anderem gelten für Erdnüsse, Schalenfrüchte, Trockenfrüchte und Ge-treide, die für den direkten Verzehr oder als Lebensmittelzutat vorgesehen sind, zulässige Höchstmengen von 2 μg/kg Afl atoxin B1 beziehungsweise 4 μg/kg als Summenwert für B1, B2, G1 und G2. Der Wert für Af-latoxin M1 in Milch darf 0,05 μg/kg nicht überschreiten. Bei Nah-

Aflatoxin B1

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Aflatoxin G1

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bromiertes Aflatoxin B1O O

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bromiertes Aflatoxin G1 O O

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Chemische Struktur

der Afl atoxine

Afl atoxine sind fl uoreszierende, hete-rozyklische Verbindungen, bestehend aus einer Dihydro- oder Tetrahydrofu-ran-Einheit, die mit einem substituier-ten Cumarin-Ring verbunden ist. Die Gruppe der Afl atoxine umfasst mehr als 20 verschiedene Toxine. Relevant sind vor allem aber die Afl atoxine B1, B2, G1, und G2 , wobei B1 in der Häu-fi gkeit überwiegt. Afl atoxin M1, das un-ter anderem in Milch und Milchproduk-ten gefunden wird, entsteht im Ver-lauf des Stoffwechsels bei Tieren und Menschen, wenn sie zuvor Afl atoxin B1 über kontaminierte Nahrungs- be-ziehungsweise Futtermittel aufgenom-men haben. Afl atoxin M1 ist in seiner Giftigkeit mit Afl atoxin B1 vergleichbar; die karzinogene Wirkung des M1 ist aber deutlich reduziert.

rungsmitteln für Säuglinge und Kleinkin-der begrenzt die Diätverordnung die zuläs-sige Menge an Afl atoxin B1 auf 0,05 μg/kg, die für M1 auf 0,025 μg/kg.

Mittel der Wahl zum sicheren und sen-sitiven Nachweis von Afl atoxinen ist die LC/MS nach vorangegangener spezifi scher Fest-phasenextraktion (SPE) beziehungsweise Affi nitätschromatographie; das garantiert, dass man die Nachweisgrenzen erreicht, die unterhalb der vom Gesetzgeber festgelegten Grenzwerte liegen. „Während das eigentli-che Probenhandling im Vorfeld der LC/MS-Analyse von Afl atoxinen nur begrenzt Spiel-

raum für Optimierung bietet“, er-klärt Dr. Norbert Helle, Appli-

kationsspezia-list und Inha-ber der TeLA

Transport des Probenvials in die SPE-Vial-PTransport der Kartusche in den Schlitten(SPE-Waste-Position)

Aufgabe von 4 mL Probe auf die KartuscheTropfgeschwindigkeit: 50 L/s

Spülen der Säule mit 20 mL H2O,Tropfgeschwindigkeit: 50 L/s

Transport des Schlittens mit der Kartuschevon der SPE-Waste- zur SPE-Vial-Position

Elution der Aflatoxine mit 0,5 mL MeOH,Tropfgeschwindigkeit: 30 L/s

Elution der Aflatoxine mit 0,5 mL MeOH,Tropfgeschwindigkeit: 30 L/s

Elution der Aflatoxine mit 0,5 mL MeOH,Tropfgeschwindigkeit: 30 L/s

30 Sekunden warten, damit das Eluatabtropfen kann

Abwerfen der Kartusche in das Abfallgefäß

Transport des Schlittens von derSPE-Vial- zur SPE-Waste-Position

Transport des Probenvials zum Tray

Die Probenvorbereitungsmethode wird einfach per Mausklick aus einem Menü der MAESTRO-Software zur fertigen Prozedur zusammengestellt.

GERSTEL-MultiPurposeSampler

MPS mit SPE-Option

9GERSTEL Aktuel LC Spezial – April 2008

Monobromierte Afl atoxine zeigen längere Retentionszeiten als nicht-bromierte Verbindungen, woraus eine bessere Trennung der vier Afl atoxine resultiert und was zu einer deutlichen Minimierung von Interferenzen durch Matrixbestandteile führt (Abb. oben). Die Derivatisierung der Afl atoxine B1 und G1 führt zu einer signifi kant besseren MS-Response, verbunden mit einem charakteristischen Brom-Muster im Massenspektrum: Die Nachweisgrenze für alle untersuchten Afl atoxine liegt unter 0,01 μg/kg (Abb. links).

GERSTEL Aktuell Alfatoxin

GmbH, einem Auftragslabor in Bremerha-ven, „lassen sich zuverlässige und verwertba-re Messergebnisse in weniger als der Hälfte der bisher üblichen Zeit erreichen, wenn die Immunoaffi nitätschromatographie an Fest-phasenkartuschen automatisiert wird.“

Dr. Nobert Helle hat eine LC/MS-Me-thode zum Nachweis der Afl atoxine B1, B2, G1 und G2 in Lebensmitteln entwickelt, die zum Beispiel für Pistazien, Paprikagewürz und verschiedene Früchte geeignet ist und bei der die Afl atoxine B1 und G1 nach Auf-reinigung mittels Immunoaffi nitätschroma-tographie über Einwegkartuschen bromiert, sprich derivatisiert werden und schließlich ein Aliquot der Probe auf die LC-Säule ge-geben wird.

rum wir die Nachweisgrenze für alle unter-suchten Afl atoxine unter 0,01 μg/kg sen-ken konnten.“

Helle gelangt zudem sehr viel schnel-ler zu sensitiven, sicheren und aussagekräf-tigen Ergebnissen, als es herkömmlich der Fall sei: „Während die manuelle Aufarbei-tung der Kartuschen bei acht Proben alles in allem rund vier Stunden erfordert“, er-klärt der Wissenschaftler, „betrug der Zeit-aufwand unter Einsatz des MultiPurpose-Samplers MPS mit SPE-Option für die glei-che Anzahl an Proben gerade einmal 80 bis 95 Minuten, je nach verwendeter Kartu-sche. Das bedeutet eine Zeitersparnis von weit über 50 Prozent.“

Seine Methode entwickelte Dr. Norbert Helle auf einem 1100 LC/MSD von Agilent Technologies mit integriertem GERSTEL-MultiPurposeSampler MPS mit SPE-Op-tion zur automatisierten Probenvorberei-tung und Probenaufgabe. Das LC/MS-Sys-tem wurde mit Elektronenspray-Ionisierung im positiven Ionenmodus betrieben. Bei der verwendeten Säule handelte es sich um ei-ne Phenomenex synergi max RP (250*2,1 Millimeter, 4 μm Partikelgröße) mit einer Flussgeschwindigkeit von 0,3 mL/min. Die Trennung erfolgte unter Einsatz eines Löse-mittelgradienten (Eluent A: 0,1-%ige Amei-sensäure, Eluent B: Acetonitril). Die Steue-rung des kompletten Systems – einschließ-lich Autosampler und LC/MSD – sowie die Datenauswertung erfolgten aus der Chem-Station von Agilent Technologies.

„Sämtliche Schritte der Probenvorbe-reitung, von der Zugabe des internen Stan-dards über die SPE und Derivatisierung bis zur Probenaufgabe, verlaufen voll automa-tisiert“, erklärt der Applikationsexperte und ergänzt: „Durch die softwaregesteuerte Ver-schachtelung von Probenvorbereitung und Analyse besteht zu keinem Zeitpunkt das Ri-siko etwa eines Substanzverlusts oder un-erwünschter chemischer Reaktionen, weil sämtliche Schritte der Probenvorbereitung – einschließlich Derivatisierung – sozusagen just in time erfolgen.“

Niedrigste Nachweisgrenzen in kürzerer Zeit erreichenZur Derivatisierung versetzte der Chemi-ker den Probenextrakt mit einer Lösung elementaren Broms in Chloroform. Dr. Norbert Helle: „Dibromierte Komponen-ten waren nicht zu detektieren.“ Den Er-gebnissen nach zu urteilen, sagt der Appli-kationsexperte, zeigen die erhaltenen mo-nobromierten Afl atoxine längere Retenti-onszeiten in der Umkehrphasenchromato-graphie als nicht-bromierte Verbindungen, was unter anderem in einer besseren Tren-nung der vier Afl atoxine resultiert. Auch wird eine deutliche Minimierung von In-terferenzen durch Matrixbestandteile be-obachtet. Wichtiger noch sei aber die Tat-sache, dass die Derivatisierung zu einer si-gnifi kant besseren MS-Response verbun-den mit einem charakteristischen Brom-Muster im Massenspektrum führe – letzt-lich der Grund, sagt Dr. Nobert Helle, „wa-

Dr. Norbert Helle: „Dank MPS zu sensitiven sicheren und aussagekräftigen Ergebnissen.“

10 GERSTEL Aktuell LC Spezial – April 2008

GERSTEL Aktuell Malachitgrün

Qualitätssicherung in der Lebensmittelanalytik

Forelle malachitgrün

D er Triphenylmethanfarb-stoff Malachitgrün (MG) be-kämpft wirksam Pilze, Bak-

terien und Einzeller. MG steht allerdings auch in dem Ver-dacht, das Erbgut zu ver-ändern und Krebs auszu-lösen, gelangt der Wirk-stoff über den Verzehr kontaminierter Lebensmit-tel in den menschlichen Organismus. Malachitgrün (MG) wird traditionell eingesetzt, um Aquakulturen vor Pilz-infektionen zu bewahren beziehungsweise sie zu behandeln. Einmal im Fischorganis-mus angekommen, wird MG zu Leukoma-lachitgrün (LMG) reduziert und im Fettge-webe eingelagert. Fisch, der mit MG konta-miniert ist, sollte aufgrund des erheblichen Gesundheitsrisikos nicht verzehrt werden.

2003 hat die EU-Kommission 2 μg/kg als höchstzulässigen Grenzwert für MG und LMG festgesetzt.

Eine Fischfi letprobe wird homogeni-siert, mit einer Lösung von Acetonitril und

Wasser extrahiert und zentrifugiert. Der fl üssige Überstand wird entnom-

men und gesammelt. Der Ex-traktionsvorgang wird zweimal

wiederholt. Die gesammelten Extrakte werden einge-

dampft und der Rück-stand wird mit einer Mischung aus Metha-nol und Wasser aufge-

nommen. Die Aufreini-gung der Probe er-

folgt mittels Festphasenextrak-tion (SPE) automatisch in ei-nem GERSTEL-Multi-Pur-

poseSampler MPS.Der MPS war integ-

riert in ein Agilent 1100 LC/MS-Iontrap-Sys-tem, bestehend aus Bi-närpumpe, thermosta-tisiertem Säulengehäu-se, Dioden-Array-Detek-tor und einem XCT+-Iontrap-MS. Das LC/IT-MS wurde mit Elektro-nensprayionisierung im (ESI) Positiv-Io-nen-Modus verwendet. Das für alle Analy-sen verwendete Injektionsvolumen betrug 5 μL. Die Trennungen erfolgten auf einer Zorbax SB-C18 (50 x 2,1 mm, 1,8 μm) mit einer Flussrate von 0,6 mL/min im Gra-dientenmodus (Eluat A: 0,1 % Ameisen-säure, Eluat B: Acetonitril). Die Säule war auf 50 °C temperiert. Die vollständige Sys-temsteuerung, einschließlich Probenvor-bereitung, LC/MS-Analyse und Daten-bearbeitung, erfolgte mit der GERSTEL-MAESTRO-Software, eingebunden in die ChemStation von Agilent Technologies (Rev. A10.03).

Malachitgrün (MG) und sein Metabolit Leukomalachitgrün (LMG) lassen sich mit-tels Elektronensprayionisation (ESI) im Po-sitiv-Ionen-Modus leicht ionisieren. Im Ge-gensatz zu MG bildet LMG ein doppelt ge-ladenes Ion (m/z 166) zusätzlich zum ein-fach geladenen molekularen Ion [M-H]+, und zwar aufgrund der nicht-planaren ste-rischen Struktur des zentralen Kohlenstoffs in der Leukoform. Im MS2-Modus der Io-nenfalle bildet das MG-Vorläuferion ein

Obwohl Malachitgrün für die Behandlung tierischer Lebensmittel in der EU verboten ist, stoßen chemische Untersuchungsämter bei Routine-Überprüfungen von Aquakulturen immer wieder auf Rückstände der gesundheitsschädlichen Verbindung. Experten von GERSTEL, TeLA und Agilent Technologies ist es gelungen, den Nachweis von MG und seines Metaboliten Leukomalachitgrün (LMG) mittels LC/Iontrap-MS zu sensitivieren und dank automatisierter Festphasenextraktion (SPE) effi zienter zu gestalten.

Produkt (m/z 313), während der doppelt geladene LMG-Vorläufer ein Fragment bil-det, das auch doppelt geladen ist. Der Über-gang ist hochsensitiv und lässt sich nutzen, um LMG äußerst empfi ndlich zu analysie-ren. Unter Verwendung beider Übergänge ließen sich Bestimmungsgrenzen von 0,5 μg/kg für MG und 0,05 μg/kg für LMG ver-wirklichen.

Die automatisierte SPE in direkter Kopplung mit dem LC/MS-System garan-tiert hohe Wiederfindung, im äußersten Fall 90 Prozent, und eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit der Probenvorberei-tungsschritte. Zudem erfordert die automa-

tisierte Probenvorbereitung nur etwa 50 Prozent der Zeit, die für die ma-nuelle Vorgehensweise zu veran-schlagen gewesen wäre.

Das beschriebene automa-tisierte SPE- und LC/IT-

MS-System ermög-licht es, die Probe au-

tomatisiert aufzurei-nigen und das Ex-trakt direkt zu ana-

lysieren. Die Methode lässt sich leicht und den

individuellen Erfordernissen ent-sprechend per Mausklick aus ei-

nem übersichtlichen Menü zusammen-stellen und anschließend automatisch aus der ChemStation von Agilent Technologies heraus ausführen. Dank der Aufreinigung lassen sich störende Matrixbestandteile aus dem Extrakt entfernen, was zu einer erheb-lich besseren MS-Response und niedrige-ren Detektionslimits führt. Die Methode ist robust und stabil (RSDs 3,4 – 5,3 %) und garantiert eine gute Wiederfi ndung (89,5 – 90,3 %).Massenspektren von Malachitgrün und

Leukomalachitgrün

MS2-Spektrum von MG und LMG Kalibrierkurve für Leukomalachitgrün

von Dr. Norbert Helle und Martina Bohlje (TeLA GmbH, Bremerhaven), Dr. Jürgen Wendt (Agilent Technologies, Waldbronn), Frederick D. Foster (GERSTEL Inc., Baltimore, USA), Carlos Gil (GERSTEL GmbH & Co. KG, Mülheim an der Ruhr)

Leukomalachitgrün

Malachitgrün

11GERSTEL Aktuel LC Spezial – April 2008

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GERSTEL-MAESTRO-Software

MAESTRO gestaltet das Zusammenspiel aller GERSTEL-Module und -Systeme effi zient und komfortabel:

„Stand-alone“-Betrieb oder vollintegriert in die Agilent ChemStation

Eine Sequenztabelle steuert das gesamte System inklusive GC/MS beziehungsweise LC/MS

Probenvorbereitung per Mausklick mit dem „PrepBuilder“

PrepAhead: Automatische Mehrfach-Verschachtelung von Probenvorbereitung und Analyse für optimale Produktivität

Dringende Proben können jederzeit eingeschoben werden

LOG-fi le und Service-LOG-fi le Automatische Benachrichtigung per E-Mail bei

Systemstörung Steuerung von bis zu vier Systemen Echtzeit-Anzeige zum Status jedes Moduls Interaktive Online-Hilfe in deutscher Sprache

Probenvorbereitung und

Probenaufgabe per Mausklick

Der GERSTEL-MultiPurposeSampler MPS ist der multifunk-tionale Autosampler für die automatisierte Probenvorberei-tung und Probenaufgabe in der GC und LC. Jeder einzelne Schritt lässt sich per Mausklick aus einem übersichtlichen Menü der MAESTRO-Software auswählen und mit GC-(GC/MS)- beziehungsweise LC-(LC/MS)-Methoden kombinieren. Die Probenvorbereitung erfolgt, während die vorausgehen-de Probe analysiert wird. Die zeitliche Mehrfach-Verschach-telung von Probenvorbereitung und Analyse garantiert Ihnen höchste Produktivität.

Mit dem MPS automatisieren Sie unter anderem folgende Pro-benvorbereitungsschritte und Techniken: Zudosierung interner Standards und Derivatisierung Verdünnung und Extraktion Geheiztes oder gekühltes Konditionieren/Mischen

der Proben Festphasenextraktion (SPE) Wägen von Proben SolidPhaseMicro Extraction (SPME) AutomatedLinerEXchange (ALEX) TwisterDesorption und Analyse (SBSE) TwisterBackExtraction (TBE) Automated TDU Liner EXchange mit Micro-Vials (ATEX) Dynamische Headspace (DHS)

Sämtliche erforderlichen Parameter lassen sich bequem per Mausklick aus einem Menü zu einer Methode zusammenstellen. Beispiel:

ADDHinzufügen von Lösungsmitteln, Standards oder Reagenzien

MOVETransport des Vials oder der Kartusche

MIXSchütteln oder Rühren/Heizen der Probe

INJECTAufgabe der Probe in das GC- oder LC-System

GERSTEL Aktuell Innovation