Aus der Medizinischen Universitätsklinik, Abteilung Innere …€¦ · · 2015-06-01Aus der...

Aus der Medizinischen Universitätsklinik,

Abteilung Innere Medizin II,

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br .

Molekulare und klinische Charakteristika

neuroendokriner Karzinome des Kolon

INAUGURAL-DISSERTATION zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität zu Freiburg i. Br.

vorgelegt 2008

von Iris Christine Scharf

geboren in Berlin

ii

iii

Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters

Erster Gutachter: PD Dr. Christian N. Arnold

Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Oliver G. Opitz

Jahr der Promotion: 2008

iv

v

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG ......................................................................................................................................................... 1

1.1 DEFINITION DER GEP-NET ...................................................................................................................................... 1 1.2 GESCHICHTLICHER HINTERGRUND ........................................................................................................................... 1 1.3 KLASSIFIKATION UND TERMINOLOGIE...................................................................................................................... 2 1.4 EPIDEMIOLOGIE ........................................................................................................................................................ 2 1.5 PROGNOSE................................................................................................................................................................ 3 1.6 SPEKTRUM UND CHARAKTERISTIKA ......................................................................................................................... 3

1.6.1 Charakteristika von Hindgut-NET ................................................................................................................... 4 1.6.2 Charakteristika von niedrig differenzierten neuroendokrinen Karzinomen (PDEC)....................................... 5

1.7 KOLOREKTALES KARZINOM (CRC) .......................................................................................................................... 5 1.8 KARZINOGENESE....................................................................................................................................................... 7

1.8.1 Two-hit modell nach Knudson.......................................................................................................................... 7 1.8.2 Genomische Instabilität.................................................................................................................................... 8 1.8.3 Chromosomale Instabilität (CIN)..................................................................................................................... 8 1.8.4 CIMP................................................................................................................................................................ 8 1.8.5 Mikrosatelliteninstabilität (MSI) ...................................................................................................................... 8 1.8.6 Epigenetik......................................................................................................................................................... 9

1.9 KI-67-MARKER....................................................................................................................................................... 12 1.10 AKTUELLER STAND DER FORSCHUNG................................................................................................................... 13

2 ZIELSETZUNG .................................................................................................................................................... 15

3 MATERIALIEN.................................................................................................................................................... 17

3.1 GERÄTE .................................................................................................................................................................. 17 3.2 CHEMIKALIEN UND ENZYME ................................................................................................................................... 18 3.3 ANTIKÖRPER........................................................................................................................................................... 19 3.4 KITS........................................................................................................................................................................ 19 3.5 VERBRAUCHSMATERIALIEN.................................................................................................................................... 19 3.6 PUFFER UND LÖSUNGEN: ........................................................................................................................................ 20 3.7 HERSTELLUNG EINER POSITIV–KONTROLLE: .......................................................................................................... 21 3.8 PATIENTEN.............................................................................................................................................................. 22

3.8.1 Kolon-NET ..................................................................................................................................................... 22 3.8.2 Fore-und Midgut-NET.................................................................................................................................... 22 3.8.3 CRC................................................................................................................................................................ 23

4 METHODEN......................................................................................................................................................... 23

4.1 METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE PCR (MSP)-METHODE........................................................................................... 23 4.1.1 Prinzip der MSP............................................................................................................................................. 23 4.1.2 Mikrodissektion:............................................................................................................................................. 24 4.1.3 DNA-Extraktion für MSP-Analyse: ................................................................................................................ 24 4.1.4 Bisulfitbehandlung ......................................................................................................................................... 24 4.1.5 PCR ................................................................................................................................................................ 25 4.1.6 Gelelektrophorese: ......................................................................................................................................... 28

4.2 MSI- UND LOH-ANALYSE ...................................................................................................................................... 29 4.2.1 DNA-Extraktion für die MSI- und LOH-Analyse: .......................................................................................... 29 4.2.2 Endlabeln eines Primers ................................................................................................................................ 29 4.2.3 Endlabeln des Elektrophoresemarkers........................................................................................................... 29 4.2.4 PCR ................................................................................................................................................................ 30 4.2.5 Polyacrylamid-Gelelektrophorese: ................................................................................................................ 33

4.3 KI-67 FÄRBUNG...................................................................................................................................................... 33 4.4 STATISTISCHE METHODEN...................................................................................................................................... 34

5 ERGEBNISSE ....................................................................................................................................................... 37

5.1 MSI-ANALYSE........................................................................................................................................................ 37 5.2 LOH- ANALYSE ...................................................................................................................................................... 37 5.3 MSP-ANALYSE ....................................................................................................................................................... 39 5.4 CIMP...................................................................................................................................................................... 41 5.5 GENMETHYLIERUNG ............................................................................................................................................... 42 5.6 KI-67-ANALYSE...................................................................................................................................................... 42

vi

5.7 VERGLEICH DER TUMORGRUPPEN........................................................................................................................... 43 5.7.2 MSI ................................................................................................................................................................. 44 5.7.3 LOH................................................................................................................................................................ 44 5.7.4 CIMP.............................................................................................................................................................. 45 5.7.5 Genmethylierung ............................................................................................................................................ 47 5.7.6 Ki-67............................................................................................................................................................... 48

5.8 ÜBERLEBEN............................................................................................................................................................ 48 5.8.1 Überleben nach Tumorgruppen ..................................................................................................................... 48 5.8.2 Überleben nach LOH-Status ..........................................................................................................................49 5.8.3 Überleben nach CIMP-Status ........................................................................................................................ 50 5.8.4 Überleben nach Ki-67-Index.......................................................................................................................... 50 5.8.5 Prognose (multivariate Analyse)....................................................................................................................52

5.9 KORRELATION CIMP-POSITIVER STATUS UND K I-67-INDEX BEI KOLON-NET UND FORE- UND M IDGUT-NET ..... 52

6 DISKUSSION ........................................................................................................................................................ 55

7 ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................................................................... 61

8 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................................. 63

9 ANHANG............................................................................................................................................................... 77

10 PUBLIKATION .................................................................................................................................................. 112

11 DANKSAGUNG.................................................................................................................................................. 113

12 LEBENSLAUF .................................................................................................................................................... 115

vii

Abkürzungsverzeichnis Abb.

Aqua bidest.

Aqua dest.

CIMP

CIN

CRC

Abbildung

Aqua bidestillata

Aqua destillata

CpG-Insel-Methylator-Phänotyp

Chromosomale Instabilität

Kolorektales Karzinom

CpG

DNA

dNTP

GEP

h

Cytidine phosphate guanosine

Desoxyribonukleinsäure

Desoxynukleosidtriphosphat

Gastroenteropankreatisch

Stunde

HE

HNPCC

IHC

kb

LOH

M

min

MMR

MSI

MSI-H

MSI-L

MSP

MSS

n

NCBI

NET

PCR

PDEC

Hämatoxylin-Eosin

Hereditäres-nicht-polypöses Kolonkarzinom

Immunhistochemie

Kilobase

Loss of Heterozygosity

Molar (mol/l)

Minute

Mismatch Repair

Mikrosatelliteninstabilität

MSI-High

MSI-Low

Methylierungsspezifische PCR

Mikrosatelliten-stabil

Anzahl

National Center for Biotechnical Information

Neuroendokriner Tumor

Polymerasekettenreaktion

Poorly differentiated endocrine carcinoma

PET Pancreatic endocrine tumor

RER

Rpm

Replication error

Umdrehungen pro minute

s Sekunde

viii

TSG Tumorsuppressorgen

WDEC well differentiated endocrine carcinoma

WDET well differentiated endocrine tumor

WDHA- Syndrom watery diarrhea, hypokalemia, achlorhydria-

Syndrom

Gen-Abkürzungen

APC Adenomatosis polyposis coli Tumorsuppressorgen

HIC 1 Hypermethylated in cancer 1 Tumorsuppressorgen

hMLH1 Human mutL homolog 1 MMR-System/DNA-Reparatur

MEN 1 Multiple endocrine neoplasia type 1 Tumorsuppressorgen

MGMT O-6-Methylguanine-DNA-

Methyltransferase

DNA-Reparaturenzym

p16 Cyclin- dependent kinase inhibitor

2A, (CDKN2A)

Cyclin-abhängiger Kinaseinhibitor,

Zellzyklusregulation

RASSF1A Ras Association domain Family 1A Zellzyklusregulation, Apoptose

TIMP 3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase Tumorsuppressorgen

Sonstige:

BAX Bcl-2 associated X-Protein (19q13) Apoptose- Regulation

Bcl2 B-cell lymphoma protein 2 Apoptose-Regulation

BRAF B-raf proto- oncogene

seron/threonine proteinkinase (p94);

Braf transforming

BRCA1 Breast Cancer 1 Onkogen

c-myc Myelocytomatosis oncogene Proto-onkogen

COX2 Cyclooxygenase 2 Prostaglandinsynthese-Enzym

DAP-

Kinase

Death associated protein kinase Enzym

DCC Deleted in colorectal carcinoma

(18q21)

Kolorektales Tumorsuppressorgen

ER Östrogen-Rezeptor Zellwachstum

hMSH3 Human mutS/homolog3 MMR/DNA-Reparatur

ix

hMSH6 Human mutS/homolog6

IGF2R Insulin-like growth factor 2

Receptor

Wachstumsfaktor-Rezeptor

k-ras Ki rat sarcoma viral oncogene

homolog

Proto-oncogen

MBD Methyl binding domain Komplex nahe bei Promotorregionen

MLH1 MutL homolog 1 MMR-System/DNA-Reparatur

MINT1,2,31 Methylated in Tumor Methylierte CpG-Inseln in CRC

PTEN phosphatase and tensin homolog

deleted on chromosome 10

Tumorsuppressorgen

RARβ Retinoic acid receptor β Embryonalentwicklung,Apoptose-

Induktion, Sehfunktion

Rb Retinoblastom-Gen Tumorsuppressorgen

SMAD2 SMAD4

Kolorektales Tumorsuppressorgen

TGFβRII Transforming growth factor β

Rezeptor II

Hemmung von Zellwachstum

THBS1 Thrombospondin1 Angiogenese-Inhibitor

TP53

Tumorprotein p53

Tumorsuppressorgen:Apoptose-

Regulation

x

1

1 Einleitung

1.1 Definition der GEP-NET

Neuroendokrine Tumoren (NET) sind seltene Neoplasien des diffusen neuroendokrinen

Zellsystems, die sich durch heterogenes biologisches Verhalten und ein breites Spektrum

unterschiedlich differenzierter Tumoren auszeichnen [142]. NET können an allen Lokalisationen

auftreten, an denen es endokrine Vorläuferzellen gibt [15]. Diese befinden sich am häufigsten

verstreut in der Mukosa des Magen-Darm-Trakts (gastroenteropankreatisches System (GEP))

[93,101], aber auch in anderen Geweben, die sich aus dem embryonalen Darmkanal herleiten, wie

der Lunge [142]. Darüber hinaus können sich neuroendokrine Merkmale auch erst während der

Onkogenese entwickeln [171].

Die Begriffe Fore-, Mid-und Hindgut -NET werden heute nur zur Bestimmung der Lokalisation

verwendet [142]: Foregut-NET (Vorderdarm) befinden sich im Respirationstrakt, Magen,

Duodenum, proximalen Jejunum und Pankreas; Midgut-NET (Mitteldarm) schließen distales

Jejunum, Ileum, Appendix und proximale 2/3 des Kolon ein; Hindgut-NET (Enddarm) liegen im

distalen Kolon und Rektum [173].

Die meisten NET sind funktionell inaktiv [15,39]. Im Falle der Produktion von bioaktiven

Substanzen, wie Peptidhormonen, biogenen Aminen, Wachstumsfaktoren und -rezeptoren [135],

spiegeln sie das Verteilungsmuster endokriner Zelltypen im Normalgewebe wider, z.B. Gastrin in

Duodenal-NET [142], s. auch Tab.1. Meist dominiert die Produktion einer Substanz [93,157]. Dies

kann klinisch als Hypersekretionssyndrom bzw. als klassisches Karzinoidsyndrom, mit Flush,

Diarrhoe und kardialen Symptomen, auffallen; entsprechend sind die NET dann bereits in die Leber

metastasiert [115].

NET exprimieren in ihrer phänotypischen Verwandtschaft zu neuronalen Zellen molekulare

Differenzierungsmarker wie Chromogranin A, Synaptophysin [91] und viele andere [142], die eine

spezifische immunzytochemische Erkennung ermöglichen. Die meisten NET sind maligne [12].

1.2 Geschichtlicher Hintergrund

Als erste Beschreibung gastrointestinaler endokriner Tumoren gilt eine Veröffentlichung von

Merling aus dem Jahre 1838 [94]. Langerhans beschrieb 1869 nestförmig gelagerte Zellen

(Inselzellen) im Pankreas [142].

Lubarsch [104] (1888) und Ranson [134] (1890) beschrieben ähnliche Tumoren und auch deren

klinische Manifestation mit Flush und Diarrhoe, waren sich aber noch nicht deren endokriner

Eigenschaften bewusst. Oberndorfer bezeichnete 1907 [116] erstmals diese intestinalen Tumoren

als „Karzinoide“, da sie sich durch ein indolenteres Verhalten als Adenokarzinome des Darms

2

auszeichneten, also nur „karzinomähnlich“ waren. Ihr endokriner Charakter wurde erstmals 1906

von Ciaccio [35] und von Gosset und Masson [65] 1914 vorgeschlagen, die sie auch wegen ihrer

Anfärbbarkeit mit Silber „Argentaffinome“ nannten. Feyrter fasste die topographisch disseminierten

Zellen 1938 als „diffuses neuroendokrines System“ zusammen [53]. Stout fand Hinweise auf eine

Herkunft rektaler Karzinoide von neuroendokrinen Zellen des Rektums, sog. Erspamer-Zellen [52].

Pearse prägte 1964 den Begriff der APUD- Zellen („Amin precursor uptake and decarboxylation“)

[120] und postulierte eine gemeinsame embryonale Herkunft der APUD–Zellen von der

Neuralleiste, die aber durch Le Douarin und Teillet widerlegt wurde [1,97]. Jedoch konnte Pearse

auf den gemeinsamen, neuroendokrinen Charakter der NET hinweisen, denn mittlerweile wird

vermutet, dass endokrine Tumoren aus gemeinsamen „Stammzellen” entstehen [155] bzw. sich von

endodermalen Zellen des Vorder-, Mittel- und Enddarms herleiten, die das APUD-Programm

zusammen mit der Expression eines neuroendokrinen Phänotyps angenommen haben [5,171]. Im

Jahr 2000 sorgte die WHO –Klassifikation für begriffliche Klarheit und übernahm den von Pearse

eingeführten Begriff des „neuroendokrinen Tumors“ (NET) [149].

1.3 Klassifikation und Terminologie

1980 brachte eine WHO-Klassifikation zum ersten Mal Licht in die uneinheitliche Terminologie der

Karzinoide, APUDome, Endokrinen Tumoren und Karzinome [15]. Sie verwendete für die meisten

NET den Begriff „Karzinoid“ [174]. Jedoch wurde sie der morphologischen und biologischen

Heterogenität der NET nicht gerecht, so dass im Jahr 2000 eine weitere WHO-Klassifikation folgte,

die auch klinisch und prognostisch nützlich war [15,149]. Ebenso wurde „NET“ als Oberbegriff

festgelegt [27,149]. Der Terminus „Karzinoid“ sollte nur noch für hochdifferenzierte

extrapankreatische GEP-NET verwendet werden [142].

Entsprechend werden NET in hoch differenzierte endokrine Tumoren (benignes Verhalten, sehr

gute Prognose), hoch differenzierte endokrine Karzinome (malignes Verhalten, günstige Prognose)

und niedrig differenzierte endokrine Karzinome (meist kleinzellig, hochmaligne mit schlechter

Prognose) unterteilt. Weitere, selten verwendete, Kategorien sind gemischt exokrin-endokrine

Neoplasien und tumorähnliche Läsionen [149]. Zudem wird heute auch intensiv die Möglichkeit

einer molekularen Charakterisierung der GEP-NET erforscht [91].

1.4 Epidemiologie

NET sind sehr seltene Neoplasien mit einer Inzidenz von 1-2 /100.000 pro Jahr [91,152], die im

höheren Lebensalter auftreten [93]. Männer und Frauen sind gleich häufig betroffen, wenn NET des

Appendix nicht einbezogen werden [93,133]. Die meisten NET treten sporadisch auf und ihre

3

Ätiologie ist größtenteils unbekannt [91,142], während nur ca. 1% [152] der NET mit einer

Erbkrankheit wie dem MEN1–Syndrom (Wermer-Syndrom), der von-Hippel-Lindau- Erkrankung

(VHL) und der Neurofibromatose Typ 1 assoziiert sind [142].

1.5 Prognose

Grundlage einer prognostischen Einteilung ist die Klassifikation [142]. Hierbei werden vor allem

folgende Kriterien berücksichtigt: Primärtumorlokalisation, Tumorgröße und histologische

Differenzierung [15]. Eine präzisere Aussage ist durch Parameter wie funktionelle Aktivität,

Angioinvasion, lokale Ausbreitung, Metastasenstatus und Ki-67-Index möglich [142]. Derzeit

werden prognostische Marker wie Ki-67, p53, Onkogene, Tumorsuppressorgene und

Adhäsionsmoleküle untersucht, ob sie bezüglich der Prognose von NET aussagekräftig sind. Davon

hat sich bisher Ki-67 als prognostisch signifikant hervorgehoben [14]. Allgemein ist die Prognose

von GEP-NET günstiger als die der Adenokarzinome des Gastrointestinaltrakts [15].

1.6 Spektrum und Charakteristika

NET befinden sich hauptsächlich im gastroenteropankreatischen System und in der Lunge

[152,164], wobei GEP-NET am häufigsten im Dünndarm, Appendix und Rektum [164]

vorkommen. NET können auch in Thymus, Nieren, Ovar, Prostata, Brust und Haut gefunden

werden [15]. Patienten mit NET haben ein erhöhtes Risiko an synchronen und metachronen, nicht-

endokrinen Tumoren zu erkranken. Diese Sekundärtumoren entstehen dann vor allem in Kolon und

Rektum [15,57,111,152,156].

GEP-NET wachsen langsam, verglichen mit Adenokarzinomen des Gastrointestinaltrakts [15], sind

jedoch meistens maligne [12]. Die meisten NET sind funktionell inaktiv. Funktionelle NET, die

gehäuft im Pankreas entstehen, äußern sich, je nach ursprünglicher hormoneller Differenzierung der

Tumorzelle, durch spezifische Symptome (s. Tab.1) [15]. Allgemein gilt, dass Foregut-NET durch

ein Hypersekretionssyndrom, Midgut-NET durch das Karzinoid-Syndrom klinisch auffallen.

Hindgut-Tumoren sind generell funktionell inaktiv [15].

NET Sekretionsprodukt Syndrom/Symptome

Insulinom Insulin Hypoglykämie, Verwirrtheit

Gastrinom Gastrin Zollinger-Ellison-Syndrom: peptische

Ulcera, Diarrhoe, Refluxkrankheit

VIPom Vasoaktives intestinales Polypeptid

Diarrhoe, Hypokaliämie, Hypo-oder

Achlorhydrie (WDHA/Verner-Morrison

–Syndrom)

4

NET Sekretionsprodukt Syndrom/Symptome

Somatostatinom Somatostatin Diabetes, Steatorrhoe, Gallensteine

GHRHom Growth-hormone-releasing-

hormone Akromegalie

ACTHom Adrenocorticotropes Hormon Cushing–Syndrom

Karzinoide Serotonin, Tachykinine,

Prostaglandine

Flush, Diarrhoe, Bronchokonstriktion,

Endokardfibrose im rechten Herz

Glukagonom Glukagon Erythema necrolyticans migrans,

Diabetes mellitus, Gewichtsverlust

Tab.1

1.6.1 Charakteristika von Hindgut-NET

Kolon- und Rektum-NET sind selten, sie unterscheiden sich deutlich, sowohl von anderen NET, als

auch vom CRC in Symptomen, diagnostischem und therapeutischem Management und der

Prognose [164]: Hindgut-NET sind immer nicht-funktionell [15] und zeigen Deletionen des

Chromosom 18q (DCC-Gen) [135,160], wohingegen MEN1-Gen-Alterationen (Chromosom 11q)

kaum vorkommen [135].

1.6.1.1 NET des Kolon

Kolon-NET sind seltene (8-12% der GEP-NET [110]), histologisch meist niedrig differenzierte

neuroendokrine Karzinome und in 50-60% der Fälle bei Diagnosestellung bereits metastasiert mit

entsprechend schlechter Prognose [68,93]. Häufig werden sie mit undifferenzierten

Adenokarzinomen verwechselt [164]. Immunzytochemisch sind sie an ihrem Synaptophysingehalt

zu erkennen und können verstreut serotonin-und somatostatinpositive Zellen enthalten [91], wobei

die Expression von Chromogranin A in malignen NET herunterreguliert sein kann [142]. Häufige

Lokalisation der Kolon-NET ist das proximale Kolon aufgrund der erhöhten Anzahl

neuroendokriner Zellen in der Mukosa.

Bei einem Durchschnittsalter der Patienten von 65 Jahren, das geringer ist als das der Patienten mit

kolorektalem Karzinom (70 Jahre), sind Männer etwas häufiger betroffen.

Da gut differenzierte NET des Kolon selten sind, ähneln sich die 5-Jahres-Überlebenszeiten von

NET und Adenokarzinomen oder sind geringfügig schlechter für die malignen Kolon-NET [164].

Synchrone und metachrone Tumoren, z.B. Adenokarzinome, können auch bei Patienten mit Kolon-

NET gefunden werden (13% der Fälle) [110].

1.6.1.2 NET des Rektum

Rektum-NET machen ungefähr 10-20% der GEP-NET aus [28,91,93,164], sind häufiger und haben

eine bessere Prognose als Kolon-NET [91] und Adenokarzinome gleicher Lokalisation [164], wobei

5

die Tumorgröße der wichtigste Prognosefaktor ist. Rektum-NET, die größer als 2cm sind, neigen zu

Metastasierung. Viele Rektum-NET sind jedoch klein und asymptomatisch und werden frühzeitig in

der Endoskopie entdeckt. Außerdem sind im Rektum gering differenzierte neuroendokrine

Karzinome die Ausnahme [91]. Hier ist das Durchschnittsalter der Erkrankung das 52. bis

60.Lebensjahr, folglich sind jüngere Patienten als bei Adenokarzinomen betroffen [164].

1.6.1.3 Gemeinsamkeiten von Adenokarzinomen und NET des Kolorektums

Es wurden neuroendokrine Tumorzellen beschrieben, die in Adenokarzinomen des Kolorektums

vorkommen und mit einer schlechteren Prognose verbunden sind [83]. Ebenso gibt es auch

Adenome in NET, sog. Kollisionstumore. Die Tumorkomponente mit dem jeweils höheren Grading

bestimmt den Verlauf [164].

1.6.2 Charakteristika von niedrig differenzierten n euroendokrinen Karzinomen (PDEC)

Sogenannte PDEC finden sich vor allem im Magen, der Papilla Vateri und im Kolon [91,93]. Eine

schlechte Prognose haben kolorektale PDEC vom kleinzelligen oder intermediären Typ [93].

Chromosomale Instabilität (CIN) ist eine typische Eigenschaft von PDEC, oft ist das p53-Gen

involviert. Nur wenige Studien konzentrierten sich bisher auf PDEC [135], die in dieser Arbeit

untersucht werden.

1.7 Kolorektales Karzinom (CRC)

Das CRC ist die dritthäufigste krebsassoziierte Todesursache bei Männern und Frauen in

Industrienationen. Die meisten CRC treten sporadisch auf, 3-4% gehen auf eine familiäres Syndrom

zurück wie die FAP (Familiäre Adenomatöse Polyposis) und das Lynch-Syndrom (HNPCC=

hereditary non polyposis colorectal cancer) [9]. Im Rahmen der Adenom-Karzinom-Sequenz lässt

sich eine Akkumulation von Veränderungen verschiedener wachstumsregulierender Gene

beobachten (s. Abb.1).

Das Kolonkarzinom gehört zu den am besten erforschten Tumoren, an ihm zeigt sich am

deutlichsten das Ineinandergreifen verschiedener Alterationen, die zu genomischer Instabilität

beitragen und bei der Tumorentstehung beteiligt sind wie CIN, MSI und CIMP [8].

6

Abb.1 Adenom-Karzinom-Sequenz CIN leichte schwere Dysplasie Dysplasie MSI- CRC : ,

CIMP-CRC: Hypermethylierung von und anderen Tumorsuppressorgenen: * Quelle: Christian N. Arnold: Vorlesung Gastroenterologie 11.01.2007 durch LOH oder Mutation inaktivierte Gene durch Insertion/Deletion veränderte Gene, ausgelöst durch hMLH1- Mutation oder Methylierung Mutationen in Genen, ausgelöst durch Hypermethylierung von hMLH1 u.a. u Hypermethylierte Gene, s.Abkürzungsverzeichnis

MSI-Adenom

MSI-Karzinom

Karzinom Mittelschwere

Dysplasie Normales

Kolonepithel

Normales Kolonepithel

K-ras-Mutation

p53-Mutation

APC, bcl-2, c-myc, COX2

SMAD2/ SMAD4/

DCC (18q)

MLH1, MSH2, MSH6, MSH3

Hyper- Methylierung (von hMLH1)

BAX, MBD4,

TGFβRII, IGFIIR

hMLH1

Rb, p16, MGMT, BRCA1,PTEN, DAP-Kinase, E-cadherin, APC,TIMP3, RASSF1A [8]

APC, bcl-2, c-myc, COX2,

SMAD2/ SMAD4/

DCC (18q)

MLH1, MSH2, MSH6, MSH3

Bax, MBD4,

TGFβRII, IGFIIR

Rb, p16, MGMT, BRCA1,PTEN, DAP-Kinase, E-cadherin, APC,TIMP3, RASSF1A [8]

Hypo- methylation

7

1.8 Karzinogenese

Tumoren resultieren aus der Akkumulation von Veränderungen in den Genen, die direkt

Zellentstehung und Zelltod kontrollieren [100]. Dominante Onkogene transformieren bei ihrer

Aktivierung die Zelle zur Tumorzelle, eine Inaktivierung rezessiver Onkogene bzw. der

Tumorsuppressorgene (TSG) geht der Tumorentstehung voraus [101]. Diese genomische Instabilität

fördert durch den unkontrollierten Zellzyklus das Wachstum der Zelle und begünstigt ihre klonale

Expansion zum Tumor [100].

1.8.1 Two-hit modell nach Knudson

Für Tumorsuppressorgene (TSG) entwickelte Knudson anhand des Retinoblastoms im Jahr 1971

die Hypothese, dass bereits zwei Mutationsereignisse („hits“) beider Allele ausreichen, um ein TSG

auszuschalten und damit möglicherweise die Zelle in eine Tumorzelle zu transformieren [95]. Bei

hereditären Tumoren findet ein solches Ereignis bereits in der Keimbahn statt, das notwendige

zweite in einer somatischen Zelle. Bei sporadischen Tumoren erfolgt beides in einer somatischen

Zelle. Manche Tumoren können aber auch drei bis sieben Mutationsereignisse aufweisen, bis der

Tumor entsteht [16].

Abb.2 erläutert einen möglichen Ablauf:

*Quelle: A. Sosnowski: Inaugural-Dissertation (2005): Die Bedeutung genetischer und epigenetischer Mechanismen für die Patho-genese neuroendokriner Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems

Abb.2: Two- hit modell nach Knudson Der erste “hit” erfolgt sowohl bei sporadischen als auch bei hereditären Tumoren durch Mutation, bei sporadischen auch durch Stilllegung des Gens durch aberrante Promotorhypermethylierung [42,82,101]. Beim zweiten Allel ist sowohl Methylierung als auch ein Allelverlust (LOH) möglich [99,101]. Dass zwei Mutationen in einer Zelle zur Tumorentstehung führen, ist selten, jedoch kann eine Methylierung beider Allele durchaus vorkommen [42,82,74].

8

1.8.2 Genomische Instabilität

Unter dem Begriff „genomische Instabilität“ werden Instabilitäten auf Nukleotidebene,

chromosomale Instabilitäten, z.B. LOH oder Translokationen, Mikrosatelliteninstabilitäten und der

CpG-Insel-Methylatorphänotyp (CIMP) aus dem Bereich der Epigenetik zusammengefasst

[100,161].

1.8.3 Chromosomale Instabilität (CIN)

Die meisten Tumore zeigen genomische Instabilitäten auf chromosomaler Ebene mit häufigen

Verlusten und Gewinnen chromosomaler Abschnitte [108].

Diese erhöhte Rate nennt man CIN, die zur Aneuploidie oder Polyploidie der Zelle führt. Der

Verlust eines Allels eines Gens wird als „loss of heterozygosity“(LOH) bezeichnet [100].

1.8.4 CIMP

CIMP beschreibt eine weitere molekulare Instabilität, die durch Methylierung und damit

Inaktivierung von TSG Tumorentstehung und -wachstum fördert [162]. Diese Instabilität interagiert

auch mit anderen Wegen der Tumorentstehung wie MSI [162]. Beim CRC gibt es zwei Arten der

Methylierung, die mit der Tumorprogression einhergehen und auch für die NET des Hindgut

wichtig sein könnten: Die Typ A-Methylierung, die altersassoziiert ist, und die Typ C-

Methylierung, die „carcinomspezifisch“ im Rahmen von CIMP vorkommt [162].

So ist der CpG-Insel-Methylator-Phänotyp (CIMP) durch die Methylierung multipler CpG-Inseln

(s.1.8.6) charakterisiert [161] und wird durch eine bestimmte Anzahl von Methylierungen in

verschiedenen Genen eines Tumors festgelegt [62].

1.8.5 Mikrosatelliteninstabilität (MSI)

Mikrosatelliten-DNA besteht aus 10-50 Kopien von Folgen aus 1-5 Basenpaaren, die mehrmals

wiederholt werden, z.B. (A)13 [31], und überall im Genom verteilt sind. Sie findet sich in Introns

sowie in Exons (z.B. in Coding region des BAX- Gens oder TGFßRII-Gens) [31].

Mikrosatelliten sind hochpolymorph, d.h. in der Bevölkerung bestehen große Unterschiede

bezüglich der Anzahl der Wiederholungen [96]. Diese Unterschiede sind stabil und erblich und

eignen sich daher gut als Marker für die Forensik (genetisches Fingerprinting), die Untersuchung

von genetischen Deletionen (LOH) und das Auffinden von krankheitsverursachenden Genen durch

„Linkage –Untersuchungen“ mit diesen Markern [31].

MSI liegt vor, wenn sich das ursprüngliche Keimbahn-Mikrosatellitenallel durch Insertion oder

Deletion verändert hat. Daraus folgt eine somatische Änderung der Länge eines Gens, also eine

9

Leserastermutation, welches sich aber nur bei klonaler Expansion einer solchen Zelle zeigt [31].

Diese Zellen wurden als Mutator- oder Replikationsfehler-Phänotyp (englisch: RER-phenotype für

„replication error“ [25]) bezeichnet und später in „mikrosatelliteninstabil“ umbenannt [31].

Im hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinomsyndrom (HNPCC oder Lynch-Syndrom)

wurden zahlreiche Mikrosatelliteninstabilitäten zuerst entdeckt. Dort liegt eine Keimbahnmutation

der DNA-Mismatch-Repair-Gene (MMR) hMLH1 und hMSH2 vor [31,60]. Sie gehören zum

Reparatursystem der DNA, das Fehlpaarungen nach der Replikation korrigiert, und begünstigen bei

Schädigung ihrer Funktion auch weitere Mutationen in anderen Genen [31,100].

DNA-MMR-Defekte können auch durch Mutationen [54] oder Promotorhypermethylierung [76],

z.B. bei sporadischen Tumoren, verursacht werden. So finden sich beim sporadischen CRC ca. 15%

der Tumoren mit Alterationen im MMR-System. Hier führt eine Promotorhypermethylierung von

hMLH1 zur Stilllegung der Transkription und damit zu einem Defekt im MMR-System [40].

Ähnliche Häufigkeiten für MSI finden sich in sporadischen Endometrium- und Magen-Karzinomen

[44,128,148,151]. Karzinome mit MSI unterscheiden sich von stabilen Tumoren häufig in Klinik,

pathologischen und molekularen Eigenschaften, z.B. haben sie oft eine bessere Prognose als

Tumoren mit CIN [7].

1.8.6 Epigenetik

Epigenetik ist als erbliche Modifikation der genetischen Aktivität definiert, die nicht mit der

Änderung der DNA-Sequenz einhergeht. Dies geschieht durch Methylierung von vor allem Cytosin

in CpG-Dinukleotidreichen Regionen der DNA (CpG- Inseln) zu 5’Methylcytosin.

CpG-Inseln sind ca.0.5-4kb große Abschnitte der DNA, die eine hohe Anzahl von Cytosin-

Guanosin-Dinukleotiden enthalten (cytosine phosphate guanosine) und zumeist in transkriptions-

regulierenden Promotorregionen der Hälfte der menschlichen Gene beobachtet werden [74]. Sie

sind normalerweise vor Methylierung geschützt. Die meisten CpG-Dinukleotide außerhalb der

CpG-Inseln sind methyliert [74]. Erfolgt eine Methylierung innerhalb einer CpG-Insel einer

Promotorregion, so wird das Gen nicht transkribiert („transcriptional silencing“) [6,74].

Dies kommt sowohl in der normalen Zelle als auch der Tumorzelle vor. Im Normalfall hat die

Stilllegung von Genen in menschlicher und Säugetier-DNA den Sinn, schädigende Anteile des

Genoms, wie ‚repeat’ Elemente, Transposons und eingebaute Viren–Genome an deren

Transkription zu hindern [22,23]. Auch ist dies ein wichtiger Regulationsmechanismus der

differenzierten Inaktivierung von Genen während der Embryonalentwicklung, der X-

chromosomalen Inaktivierung und des Imprintings, dem differenzierten Ausschalten eines

elterlichen Allels während der Gametogenese [6,74]. Zudem steigt der Anteil methylierter DNA im

Genom mit zunehmendem Alter an [3,165].

10

In Tumorzellen wurde zuerst eine globale Hypomethylation des Genoms beobachtet [36]. Diese

kann eine verminderte Repression stillgelegter Genabschnitte, z.B. Aktivierung eines Virus-

Genoms, zur Folge haben. Außerdem löst ein Wegfall von Repression eine Instabilität von

Chromosomen aus [21,50,51,63]. Desweiteren fanden sich in Tumorzellen regionale Promotor-

hypermethylierungen von meist Tumorsuppressorgenen und damit eine Inaktivierung derselben

[73,84,85]. Insgesamt wird vermutet, dass mehr Gene durch epigenetische Modifikationen ihre

Funktion verlieren als durch genetische Defekte [21,72,74,107].

Auf Proteinebene sind die Folgen von Methylierung bzw. Mutation ähnlich [73,84,85]: Das Protein

wird nicht translatiert.

An epigenetischen Modifikationen sind viele Mechanismen beteiligt (s. Abb.3). Hauptsächlich sind

hier die DNA-Methyltransferasen (DNMT1, 3a, 3b), die methylbindenden Proteine (MBP, MBD,

MeCP2) und die Interaktion von Histondeacetylasen (HDAC), Histonacetylasen (HAT) und der

Chromatinstruktur zu nennen [6,74].

Epigenetische Veränderungen treten früh während der Tumorgenese auf [21,49], in sogenannten

Vorläuferläsionen (z.B. kolorektales Adenom), und können so Zellen auf bestimmte

Signaltransduktionswege festlegen und den Weg zur definitiv malignen Zelle ebnen. Diese

Festlegung lässt auch die Anreicherung genetischer Defekte zu. Das eröffnet der Zelle einen

Selektionsvorteil und trägt somit zur klonalen Expansion bei [169]. Ganze Netzwerke von Genen

können gleichzeitig von epigenetischer Modifikation betroffen sein [21], daher lässt sich

mittlerweile auch ein Hypermethylator-Phänotyp oder auch CIMP (CpG-Insel-

Methylierungsphänotyp) für einige Tumoren charakterisieren [81,161], wofür bereits 3 bis 4

methylierte Gene ausreichen [41].

Das Gebiet der Epigenetik ist derzeit intensiver Gegenstand der Forschung, da man sich ein

besseres Verständnis der Karzinogenese und neue Möglichkeiten in Prävention, Diagnostik und

Therapie erhofft: So sind epigenetische Modifikationen prinzipiell reversibel im Gegensatz zu

genetischen Mutationen. Hier könnten DNMT-Inhibitoren, wie 5Àzacytidin, z. T. in Kombination

mit Histondeacetylase-Inhibitoren zum Einsatz kommen [74,146]. Gene mit methylierten

Promotoren sind einfacher durch sensitive Methoden wie die MSP, die mit geringen DNA-Mengen

auskommt, zu erfassen und könnten präventiv und diagnostisch relevante Marker liefern [74].

Außerdem wird die DNA in Tumoren genomweit auf methylierte Abschnitte untersucht, um noch

unbekannte Tumorsuppressorgene zu finden [21].

11

Abb.3 Normale Zelle : In der normalen Zelle sind die CpG-Inseln des Promotorabschnitts um Exon1 nicht methyliert (leere Kreise): Transkriptionsfaktoren (TF), Histonacetylasen (HAT), die durch Acetylierung von Resten in Histon3 und Methylierung von Lysin4 in Histon3 die Chromatinstruktur für die RNA-Polymerase III (PolymIII) offen halten, und Ko-Aktivatoren (KA) können binden: das Gen wird transkribiert (Pfeil). Die DNA-Methylierungsmaschinerie (DNMT=DNA-Methyltransferasen) hat keinen Zugang zu den nicht-methylierten kodierenden Abschnitten. Im Genom liegen vereinzelt methylierte CpG-Inseln vor (schwarze Kreise). An sie binden methylbindende Proteine (MBD), an die wiederum Histondeacetylasen (HDAC) binden. HDAC halten Histone in einem deacetylierten Zustand, der die DNA für den o.g. Transkriptions-Aktivations-Komplex unzugänglich macht. Meist liegen diese CpG–Inseln in nicht-kodierenden Abschnitten und sind daher stark methyliert. Eine Aufhebung der Methylierung hätte in diesen Bereichen Non-sense-Transkriptionen und eine Instabilität des Chromosoms zur Folge [74].

Abb.4 Tumorzelle In der Krebszelle sind weite Teile des Genoms hypomethyliert (leere Kreise). In anderen Bereichen hat die DNA-Methylierungsmaschinerie in Form von DNA-Methyltransferasen (DNMT) durch einen noch nicht genau verstandenen Prozess Zugang zu den Promotor-Regionen kodierender Abschnitte erhalten und diese methyliert. Durch den Komplex aus MBD und HDAC wird dieser Zustand aufrechterhalten und der Transkriptionsaktivationskomplex (mit TF, KA und Polymerasen) an seiner Bindung an die Promotorregion gehindert, das Gen ist ausgeschaltet [74]. Aus beiden Abbildungen wird deutlich, dass DNA-Methylierung und Histondeacetylierung synergistisch arbeiten, eine reine DNA-Methylierung führt nicht zur Geninaktivierung [24,87].

Exon1 Exon2 Exon3

TF KA

HAT

MBD MBD

HDAC

HDAC

DNMT CR Polym

III

Exon1 Exon2 Exon3

MBD MBD

HDAC

DNMT

HDAC

HAT TF

KA Polym

III

DNMT

12

1.9 Ki-67-Marker

Das Ki-67-Antigen ist ein nukleäres Protein, das durch seine Reaktion mit dem monoklonalen

Antikörper des Ki-67-Klons definiert wird (z.B. MIB-1). Während der Interphase wird das Ki-67-

Antigen ausschließlich im Kern gefunden, wohingegen der größte Teil des Proteins sich während

der Mitose wieder auf den Chromosomen befindet. Das Ki-67-Antigen wird während der späten G1,

S-, M- und G2–Phase des Zellzyklus in allen proliferierenden Zellen exprimiert. In ruhenden Zellen

(G0-Phase) und nicht stimulierten normalen menschlichen Zellen wird das Ki-67-Antigen nicht

gefunden [143]. Die Menge des Ki-67-Antigens in der Zelle wird durch präzise Synthese-und

Degradationssysteme stark reguliert [26,143]. So ist der Ki-67-Antikörper ein spezifischer und

sensitiver Marker für proliferierende Zellen.

In vielen verschiedenen malignen Neoplasien, inklusive NET, konnte die immunhistochemische Ki-

67-Markierung mit dem klinischen Verlauf der Erkrankung in Zusammenhang gebracht werden,

u.a. GEP-NET [123,136,143]. D.h. ein erhöhter Ki-67-Index zeigt einen schnell wachsenden,

aggressiven Tumor mit einer folglich schlechten Prognose an [136].

Welche Funktion das Ki-67-Antigen jedoch genau hat, ist bis heute nicht vollständig geklärt.

Bekannt ist, dass es ohne Ki-67-Antigen keine Zellproliferation jeglicher Art gibt [26]. Bisher sind

nur wenige Studien veröffentlicht, die die Ki-67-Anfärbung in GEP-NET untersuchen und mit

deren Prognose in Zusammenhang bringen [26,112].

13

1.10 Aktueller Stand der Forschung

Das sporadische CRC entsteht auf zwei voneinander unabhängigen Wegen, CIN (~50%), und

CIMP (~35-40%) [20,61,85].

CIN ist durch eine ausgeprägte Aneuploidie gekennzeichnet, die u. a. aus sequenzieller

Inaktivierung des APC-Gens 5q (in bis zu 50% der CRC [48]), des DCC/SMAD2/SMAD4

Genlokus, des K-ras-Onkogens und des p53-Gens resultiert [8,99].

CIMP ist in einem bestimmten Subtyp von sporadischen CRC repräsentiert, der in Abwesenheit von

CIN auftritt und umgekehrt [62]. CRC, die durch CIMP entstehen, sind im proximalen Kolon

lokalisiert, betreffen häufiger weibliche und ältere Patienten, sind schlecht differenziert, weisen

Wildtyp-p53, mehr K-ras- und BRAF-Mutationen und häufig auch MSI auf [70,98,140,161,163].

CIMP ist ein frühes Ereignis während der Tumorgenese und hat das Potential mehrere

Tumorsuppressorgene gleichzeitig zu inaktivieren. Das wiederum beschleunigt den neoplastischen

Prozess [161].

Zudem spielt CIMP eine Rolle bei der Entstehung der in 15% der sporadischen CRC auftretenden

MSI, die durch Promotorhypermethylierung von hMLH1 verursacht wird [62,76,86], mit daraus

folgenden weiteren Mutationen in so genannten „target-Genen“ wie TGFβRII-Rezeptor [119],

IGF2-Rezeptor, BAX und den MMR-Genen hMSH3 und hMSH6 [8,61].

CIMP und MSI finden sich beide häufig im proximalen Kolon [161]. Ebenso haben

Kolonkarzinome mit MSI keine K-ras-und TP53-Mutationen und damit auch eine bessere Prognose

[141].

Bei den bisher untersuchten GEP-NET, also vor allem Fore-und Midgut NET, stach besonders der

Verlust der Tumorsuppressorgenfunktion durch Allelverlust oder somatische Mutation hervor

[101,124]. Allelverluste sind häufig in NET [58,154,160] und variieren je nach Lokalisation des

Tumors [101,160].

MSI scheint bei GEP-NET eine geringe Rolle zu spielen: In manchen Studien konnte kein MSI

nachgewiesen werden [13,58,89], in anderen wurde MSI zu 10% in Pankreastumoren gefunden

[79].

Die Promotorhypermethylierung weiterer tumorassoziierter Gene wurde in kleineren Studien an

NET beschrieben [30,144,172] und auch für eine größere Anzahl NET des Fore-und Midgut gezeigt

[13]. Letztere Studie ergab, dass CIMP eine wichtige Rolle bei der Entstehung von GEP-NET

spielt. Zudem zeigte sich, dass die Methylierung von HIC1, RASSF1A und APC sehr häufig war

(83.1%, 71.3 % und 54.1%) [13].

Obwohl die Rolle von HIC1 nicht vollkommen klar ist, ist bekannt, dass dieses Gen den

Tumorsuppressor p53 heraufreguliert [33] und damit z.B. eine Apoptose einleitet, in Tumoren wird

es hauptsächlich durch Promotorhypermethylierung inaktiviert [129]. Verschiedene Studien geben

14

Hinweise darauf, dass der Ras-Signalweg vor allem durch die Methylierung des RASSF1A-

Promotors an der Pathogenese von gut differenzierten GEP-NET beteiligt ist [13,36,80,102]. APC

ist als Teil des wnt-Signalweges in die Pathogenese von GEP-NET involviert [13,47], wie auch bei

anderen gastrointestinalen Tumoren [11].

Weniger häufig hypermethyliert waren das DNA-Reparaturgen O6-MGMT und das mit dem MEN1-

Syndrom assoziierte MEN1-Gen (16.1%, 14.3%) [13]. Das MEN1-Gen wird in sporadischen GEP-

NET vor allem durch Mutation inaktiviert [64], wobei hier vor allem Tumoren des Foregut

betroffen sind [135]. Promotorhypermethylierung scheint eine geringere Bedeutung zu haben.

MGMT ist ein DNA-Reparaturgen, das vor allem bei Kolonkarzinomen, Lungen-und Hirntumoren

methyliert vorgefunden wird. Bei GEP-NET scheint es geringere Bedeutung zu haben [13,43].

Keine Methylierung wiesen TIMP3, p16INK4a/CDKN2A und hMLH1 auf [13]. p16 scheint dennoch

wichtig zu sein, da die p16-Proteinexpression auf 58% der Tumoren beschränkt war [13].

Außerdem wurden in anderen Studien Promotorhypermethylierungen [30,80,144,147]

nachgewiesen, die ebenfalls mit einem Expressionsverlust assoziiert waren [30,105].

In weiteren Studien wurden auch Promotorhypermethylierungen bei folgenden Genen gezeigt: p19

[36], RARß bei endokrinen Pankreastumoren [80], p14, THBS1, COX 2, Östrogen-Rezeptor-Gen

(ER) bei pankreatischen NET und NET mit Karzinoidsyndrom [30]. Diese Untersuchungen wurden

aber nur an kleinen Fallzahlen vorgenommen.

An anderen Tumoren häufig beteiligte Onkogene wie k-ras und Tumorsuppressorgene wie Rb und

p53 haben bei gut differenzierten GEP-NET keine Bedeutung [19,34,114,168,175]. In schlecht

differenzierten NET werden jedoch häufig Veränderungen von p53 und Rb beobachtet [131].

Zu schlecht differenzierten NET (PDEC) ist bisher wenig bekannt: sie weisen häufig LOH am APC,

DCC, TP53–Lokus auf [56]. Laut einer Zusammenfassung von Rindi und Bordi [135] sei CIN eine

typische Eigenschaft von PDEC, unabhängig von der Lokalisation des Tumors. Oft sei das p53-Gen

involviert. Die Autoren legen aufgrund histologischer und molekularer Beobachtungen die

Vermutung nahe, dass gemeinsame genetische Ereignisse der Tumorentstehung von PDEC des

Hindgut und Adenokarzinomen zugrunde liegen [135]. Daher werden auch in dieser Arbeit PDEC

des Hindgut und CRC auf Ähnlichkeiten untersucht.

Nur der Proliferationsmarker Ki-67 und das Ausmaß des spontanen Tumorwachstums wurden

bisher als bedeutsam für die Prognose gefunden [14]. In einer Studie konnte gezeigt werden, dass

signifikant mehr Tumoren mit Ki-67–Index >10% CIMP-positiv waren als NET mit einem

niedrigeren Ki-67–Index. Zudem zeigten CIMP-negative NET ein besseres durchschnittliches

Überleben als CIMP-positive [13].

15

2 Zielsetzung

In der vorgelegten Arbeit wurden die sehr seltenen, schlecht differenzierten NET des Kolon und

Rektum (kurz: Kolon-NET) hinsichtlich der Beteiligung genetischer und epigenetischer Prozesse an

ihrer Pathogenese untersucht. Diese Tumorgruppe gehört zu den GEP-NET des Hindgut und nennt

sich auch „neuroendokrine Karzinome“.

Ziele dieser Arbeit waren die Analyse

• des Methylierungsstatus der Promotorregionen acht verschiedener Tumorsuppressorgene

(p16, APC, HIC1, RASSF1A, TIMP3, MGMT, MEN1, hMLH1) mittels MSP, und des CIMP-

Status,

• der genomischen Instabilität (MSI und LOH) der Tumoren mit Hilfe entsprechender Marker,

• des Ki-67-Index zur Feststellung einer Korrelation von Proliferationsrate und

Genmethylierung.

Zusätzlich wurden folgende Fragestellungen bearbeitet:

1. wie unterscheiden sich NET in unterschiedlichen Loci ?

2. wie unterscheiden sich schlecht differenzierte NET vom sporadischen CRC ?

Hierzu wurden Untersuchungsergebnisse aus sowohl der eigenen Arbeitsgruppe (gut differenzierte

Fore-und Midgut-NET) als auch aus dem Labor von Prof. Boland, Dallas, USA (CRC)

hinzugezogen, und folgende Vergleiche aufgestellt:

• MSI-Status bei Kolon-NET, CRC und Fore-und Midgut-NET

• LOH-Status bei Kolon-NET und Fore-und Midgut-NET

• CIMP-Status bei Kolon-NET, CRC und Fore-und Midgut-NET

• Methylierungsmarker von Kolon-NET und Fore-und Midgut NET

• Überlebenszeiten bei Kolon-NET und Fore-und Midgut-NET

Zusätzlich wurde

• eine multivariate Analyse der Überlebenszeiten auf prognostische Faktoren (Ki-67-Index,

CIMP-Status, LOH-Status, Tumorgruppe)

und

• eine Untersuchung der Korrelation von CIMP-Status und Ki-67-Index bei Kolon-NET und

Fore-und Midgut-NET

durchgeführt.

16

17

3 Materialien

3.1 Geräte

Autostainer DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland

Base Runner 200 inkl. Glasplatten, Spacer und Kamm International Biotechnologies Inc., New Haven, CT, USA

Biofuge Fresco Heraeus, Osterode, Deutschland

Elektrophoresekammern für Agarosegele inkl. Zubehör:

Wide Mini-Sub Cell GT System

Bio-Rad, München, Deutschland

Eismaschine AF20 Scotsman, Bettolino di Pogliano, Mailand, Italien

Filme BioMax MR(14650) Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA

Filmentwicklungsmaschine CP 1000 AGFA, Gevaert N.V:, Köln, Deutschland

Gel- Dokumentationssystem UVT-28 MP /ICU-1

(Transilluminator)

Herolab, Wiesloch, Deutschland

Gel Dryer Model 583 Bio-Rad, München, Deutschland

Heizblock“ Blockthermostat BT 200 „ Kleinfeld Labortechnik GmbH, Gehrden, Deutschland

Laboratory Vacuum Manifold( Vac-Man) Promega, Mannheim, Deutschland

Lichtmikroskop Zeiss, Oberkochem, Deutschland

Magnetrührer IKAMAG KMO-1 IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland

Membranpumpe Vacuubrand, Wertheim, Deutschland

Membranvakuumpumpe Vacuubrand, Wertheim, Deutschland

Mikrowellenherd Siemens, München, Deutschland

pH- Meter Knick, Berlin, Deutschland

2, 20, 100, 200, 1000 µl Pipetten ABIMED, Langenfeld, Gilson, Frankreich

Pipettierhilfe Pipettboy acu INTEGRA Biosciences, Fernwald, Deutschland

Plexiglaskammer “Clene Cab” Herolab, Wiesloch, Deutschland

Röntgenkassette 8x10 Siemens, München, Deutschland

Schutzschild aus Plexiglas ZITT-THOMA, Freiburg, Deutschland

Stromversorgungsgeräte:

Modell 3000 Xi (für Polyacrylamidgele) Bio-Rad München, Deutschland

PS305 (für Agarosegele) Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland

Thermocycler MultiCycler PTC 220 DYAD Biozym, Oldendorf, Deutschland

Tischzentrifuge QUALITRON, Korea

Ultrospec 3000 pro UV/Visible Spectrophotometer Pharmacia Biotech, Cambridge, England

Vortex Genie 2 Scientific Industries, Bohemia, NY, USA

Waagen:

PM 460 Mettler, Giessen, Deutschland

Präzisionswaage Sartorius, Göttingen, Deutschland

Wasserbad

JULABO SW U3

JULABO Labortechnik, Seelbach, Deutschland

18

3.2 Chemikalien und Enzyme

40% Acrylamid/ Bis Lösung ( 19:1) Bio-Rad, Hercules, CA, USA

Agarose Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Ammoniumacetat Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Ammoniumpersulfat (APS) Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Ammoniumsulfat Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

[γ- 32P] ATP (10mCi/ml) Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland

β- Mercaptoethanol Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Borsäure Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Bromphenolblau/ Xylen Cyanol Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

CpG Methylase inkl. 10x NEBuffer und S-

Adenosylmethionin

New England BioLabs Inc., Beverly, MA, USA

dNTPs 25 µM ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

DAKO K5005 Detektionssystem für Autostainer DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland

EDTA Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Eisessig Merck, Darmstadt, Deutschland

Elektrophorese- Marker Φ X 174 RF DNA/HAE III

Fragments

Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland

Ethanol Merck, Darmstadt, Deutschland

Ethidiumbromid Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Formamid 98% Promega, Mannheim, Deutschland

GeneReleaser® BioVentures Inc., Murfreesboro, TN, USA

Gene Ruler 100bp DNA Leiter equimolar Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Glycerol Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Glykogen Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Harnstoff Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

HotStarTaq DNA-Polymerase (containing 15mM MgCl2)

inkl. 10x PCR-Puffer

QIAGEN, Hilden, Deutschland

Hydrochinon Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Isopropanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Mineralöl Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

NaOH (1M) Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumbisulfit Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Orange G Dye Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Proteinase K QIAGEN, Hilden, Deutschland

Salzsäure Merck, Darmstadt, Deutschland

Sigmacote (zur Imprägnation der Deckplatte für

Polyacrylamidgele)

Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

T4 Polynukleotid Kinase (10 U/µl) inkl. 5x Forward

Reaction Puffer

Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

19

Taq DNA Polymerase(5U/µl) inkl. 10x PCR Puffer und 50

mM MgCl2

TEMED

Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Merck, Darmstadt, Deutschland

Trizma Base Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

Xylen Sigma- Aldrich, Steinheim, Deutschland

3.3 Antikörper

Monoclonal Mouse Anti-HumanKi-67 Antigen

Clone MIB-1,Code-Nr. M 7240

DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland

3.4 Kits

Wizard DNA Clean-Up System Promega, Madison, WI, USA

QIAmp DNA Blood Mini Kit (50) QIAGEN, Hilden, Deutschland

DakoREAL™DetectionSystem, Alkaline Phosphatase RED

Rabbit/Mouse Code K5005

DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland

3.5 Verbrauchsmaterialien

KIMWIPES Lite 200 Laborwischtücher Kimberly-Clark, Forchheim, Deutschland

Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Menasha, WI, USA

“96 well” PCR Plate Standard PEQLAB, Erlangen, Deutschland

PCR- Platten Omniplate 96 mit Deckel Hybaid, Ashford, Middlesex, England

Pipettenspitzen ohne Filter VWR International, Darmstadt, Deutschland

MµlTIFlex Flat.4mm Tips( Pipettenspitzen zum Beladen

von Polyacrylamidgelen)

Sorenson BioScience, Salt Lake City, UT, USA

Pipettenspitzen mit Filter:

10µl Nerbe plus, Winsen/Luhe, Deutschland

Universalfit Filter Tips 30µl Corning Inc., Corning, NY, USA

PEQGold SafeGuard Filter Tips (200µl) PEQLAB, Erlangen, Deutschland

Aeroject Tips( 1000µl) Ratiolab, Dreieich- Buchschlag, Deutschland

Reaktionsgefässe:

CellStar 50 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland

1,5 ml Reaktionsgefässe Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland

0,5 ml PCR Tubes ultradünn Biozym, Oldendorf, Deutschland

Skalpelle Hammacher, Solingen, Deutschland

Stericup Filtereinheit Millipore, Schwalbach, Deutschland

Stripette 5ml Corning Inc., Corning, NY, USA

Wägepapier MN 266 Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Whatman Chromatografiepapier Whatman International, Maidstone, England

20

3.6 Puffer und Lösungen:

8% Acrylamidlösung

200ml 40 % Acrylamid/Bis Lösung (19:1)

450g Harnstoff (Endkonzentration 7.5M)

50ml 10x TBE-Puffer (Endkonzentrationen 45µM Trizma Base, 45µM Borsäure, 1mM EDTA)

wurden mit Aqua bidest. auf ein Volumen von 1l aufgefüllt, durch Stericup Filtereinheit filtriert und

bei Raumtemperatur lichtgeschützt aufbewahrt.

10% Ammoniumpersulfat (APS)

1g APS wurde in 10ml Aqua bidest. gelöst und als Aliquots zu 1ml bei -20°C aufbewahrt.

10mM dNTP

je 10µl 100mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP wurden gemischt und mit je 60µl Aqua bidest.

verdünnt.

0.5M EDTA, pH 8

93.05g EDTA wurden in etwa 400ml Aqua bidest. aufgelöst; Titrierung des pHs auf 8.0 mithilfe

1M NaOH-Lösung. Das Volumen wurde mit Aqua bidest auf 500ml aufgefüllt.

10mM Hydroquinone

55mg Hydroquinone (Sigma H9003) auf 50ml Aqua bidest., wurde jeweils neu hergestellt.

Loading dye für MSI/ LOH–Analyse (Sigma, B-3269) 9,5ml Formamid 98%

200µl 0.5M EDTA pH 8.0

300µl 1% Bromphenolblau/ Xylen Cyanol (1g BPB mit 1g XC auf 10ml Aqua bidest.)

Mischen

Loading dye wurde als Aliquots zu 1ml bei -20°C aufbewahrt.

Low TE Puffer, pH 7.4 5ml 1M Tris- HCl pH 7.4

100µl 0.5M EDTA pH 8.0

mit 400ml Aqua bidest. gemischt, Titrierung des pH auf 7.4, Auffüllung auf 500ml mit Aqua

bidest., anschließend wurde die Reaktionsmischung durch Stericup Filtereinheit gesaugt.

Low TE Puffer pH 7.4 /Proteinase K (24:1): Proteinase K(10mg/ml) wurde mit Low TE Puffer pH 7.4 im Verhältnis 1:24 verdünnt.

2M NaOH: 5.24ml NaOH (50 %) in 44.76ml Aqua bidest. verdünnt.

3M NaOH: 7.86ml NaOH (50%) in 42.214ml Aqua bidest. verdünnt.

10M NH4Ac: 38.54g in 50ml Aqua bidest. verdünnt.

21

Orange Dye: Für 25ml wurden benötigt:

12.5ml Glycerol

62.5mg Orange G Dye

12.5ml Aqua bidest.

3M Natrium Bisulfite: 1.88g Natrium-Bisulfit (Sigma S9000) pro 5ml Aqua bidest., auf pH 5.0 mit 1M NaOH titriert,

jeweils neu herzustellen.

50x TAE –Puffer

242g Trizma Base, 57.1ml Eisessigsäure und 100ml 0.5 EDTA pH 8.0 wurden mit Aqua bidest. auf

ein Volumen von 1l gebracht.

10x TBE –Puffer

109g Trizma Base (Endkonzentration 0.9M)

55.7g Borsäure (Endkonzentration 0.9M)

40ml 0.5M EDTA pH 8.0 (Endkonzentration 20 mM)

Diese Reagenzien wurden mit Aqua bidest. auf 1l aufgefüllt.

1M Tris-HCl pH 7.4 60.55g Trizma Base wurden in 400ml Aqua bidest. aufgelöst und der pH-Wert mit konzentrierter

HCl auf 7.4 titriert. Das Volumen wurde anschließend mit Aqua bidest auf insgesamt 500ml

gebracht und durch eine Stericup Filtereinheit gesaugt.

3.7 Herstellung einer Positiv–Kontrolle:

Zur Positivkontrolle wurde DNA aus venösem Blut extrahiert. Dies wurde mithilfe des QIAmp

DNA Mini Kit(50) nach Angaben des Herstellers bewerkstelligt. Die Konzentration der extrahierten

DNA wurde mit dem UV/Visible-Spektrophotometer bei 260nm OD bestimmt. Die Flüssigkeits-

menge, die demnach 2µg DNA enthielt, wurde nach folgender Formel berechnet und hergestellt:

abs.260nm * ext.coeff.(= 50 for DNA * 50 for dil factor)= x in µg/ml ; x/1000= µg/µl;

Beispiel: 260 O.D.= 0.018; DNA in µg/ml = 45; in µg/µl= 0.045; benötigte Fl.menge in µl: 2/

0.045= 44.4µl

Diese Menge wurde bis auf 50 µl mit Aqua. dest. aufgefüllt.

22

Methylierung der extrahierten DNA mit CpG-Methylase-Protokoll: Um eine Menge von 25µl methylierter DNA zu erhalten, wurden folgende Reagenzien

hinzupipettiert:

• 2µg genom. DNA 22.5 µl

• 4000U/ml Sss1 Methyltransferase 1.0µl (4U Endaktivität)

(CpG- Methylase)

• 10x NEB Puffer 2.5µl (1x)

• 200x SAM 0.125µl (160µM)

Anschließend wurde die Lösung für 1h bei 37°C und für 20 min bei 65°C inkubiert.

Die methylierte DNA konnte nun bis zu ihrer weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt werden.

3.8 Patienten

3.8.1 Kolon-NET

Das Untersuchungsgut bestand aus 34 niedrig differenzierten, kleinzelligen neuroendokrinen

Karzinomen des Hindgut, die 1984-2005 während der Operationen von 34 Patienten entnommen

wurden. Die Tumoren waren entsprechend ihrer Lokalisation nicht-funktionelle NET.

Die Tumoren wurden für die PCR in 10µm bzw. für die immunhistochemische Untersuchung in

4µm dicken Paraffinschnitten auf Objektträger fixiert. Zudem wurden, zur Unterscheidung von

Tumor- und Normalgewebe bei der Mikrodissektion, noch HE-(Hämatoxlin/Eosin),

ChromograninA- und Synaptophysin-Färbungen mitgeliefert (s. Tab.A und VII im Anhang).

3.8.2 Fore-und Midgut-NET

Diese wurden bereits zuvor in der Arbeitsgruppe (AG Arnold, Universitätsklinikum Freiburg)

molekularbiologisch analysiert und konnten so zum Vergleich herangezogen werden.

Die Fore-und Midgut-NET waren alle gut differenziert und traten sporadisch auf, wie eine

eingängige Prüfung der Familien- und Patientengeschichte, die familiäre Syndrome ausschloss,

feststellte. Sie wurden auch aus Pankreas und Metastasen in der Leber, in Lymphknoten und in der

Niere entnommen. Sie sind in Tab.B im Anhang mit Methylierungsprofil, LOH-und MSI-Analyse

aufgelistet.

23

3.8.3 CRC

Zum Vergleich mit den Kolon-NET wurden die molekularbiologischen Daten von 150 sporadischen

CRC aus dem Labor von Prof. Boland (Dallas, USA) zur Verfügung gestellt.

Diese waren aufgrund ihres MSI-Status ausgesucht worden und stellen somit eine nicht

randomisierte Gruppe dar. Sie werden in Tab.C im Anhang mit CIMP-und MSI-Status aufgeführt.

4 Methoden

4.1 Methylierungsspezifische PCR (MSP)-Methode

4.1.1 Prinzip der MSP

Die MSP ist eine spezifische PCR-Methode zur Detektion methylierter DNA. In den

Promotorregionen methylierter Gene liegen methylierte Cytosingruppen der CpG-Inseln vor (s.

Kap.1.8.6), die Promotorregionen unmethylierter Gene weisen Cytosine ohne Methylgruppe auf.

Letztere werden durch die Bisulfitbehandlung mittels Sulfonierung und Desaminierung in Uracil

umgewandelt. Methyliertes Cytosin wird durch eine Bisulfitbehandlung nicht verändert. Durch die

Konstruktion unterschiedlicher Primer (s. Abb.5) für dasselbe Gen können somit in PCR und

Gelelektrophorese methylierte Gene von unmethylierten spezifisch unterschieden werden.

Probe 1: nicht methylierte DNA Probe 2: methylierte DNA CH3 CH3 CH3

l l l 5’-...CGAATACGACGT-...3’ 5’-...CGAATACGACGT-...3’

Bisulfitbehandlung

CH3 CH3 CH3 l l l

5’-...UGAATAUGAUGT-... 3’ 5’-...CGAATACGACGT-...3’

PCR mit spezifischen Primern PCR mit spezifischen Primern spezifisches PCR-Produkt ▼ ▼

Abb.5: Prinzip der MSP *Quelle: A. Sosnowski: Inaugural-Dissertation (2005): Die Bedeutung genetischer und epigenetischer Mechanismen für die Patho-genese neuroendokriner Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems

24

4.1.2 Mikrodissektion:

Das in Paraffin eingebettete Gewebe, aus dem die DNA extrahiert wurde, wurde mittels sterilem

Skalpell unter dem Lichtmikroskop vom Objektträger mikrodisseziert. Hierzu wurden die 10µm

Schnitte des Tumors verwendet. Zur Unterscheidung von Tumor-und Normalgewebe bediente man

sich mitgelieferter HE-, ChromograninA- und Synaptophysin-gefärbter Schnitte.

Das mikrodissezierte Gewebe wurde für 15min in je 150µl Xylen bei Raumtemperatur inkubiert.

Danach wurden 350µl –20°C kaltes 100% Ethanol zu jeder Probe hinzugefügt und bei 4°C für

20min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und den Pellets erneut 50µl

Xylen und 500µl -20°C kaltes 100% Ethanol hinzugefügt. Es folgte eine weitere Zentrifugation

unter den gleichen Bedingungen. Anschließend wurde der Überstand abgenommen und die Pellets

bei Raumtemperatur oder im Heizblock bei 37°C getrocknet. Diese stehen nun zur Weiter-

verarbeitung, entweder für die MSP-Analyse oder die MSI-Analyse zur Verfügung.

4.1.3 DNA-Extraktion für MSP-Analyse:

Zu den unter 4.1.2 genannten Pellets wurde je 30µl TE/Proteinase K (24:1) hinzugefügt, mit einer

Mineralölschicht bedeckt und für 24 Stunden bei 55°C inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden

weitere 30µl TE/Proteinase K (24:1) hinzugefügt und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert.

Im Anschluss daran wurde die Mineralölschicht abpipettiert und die DNA mithilfe des Wizard

Clean Up System (Promega Extraction Kit) nach Angaben des Herstellers gereinigt und war nun für

die Bisulfitbehandlung gebrauchsfertig.

4.1.4 Bisulfitbehandlung

Für jede Behandlung mussten folgende Lösungen frisch zubereitet werden:

• 10mM Hydroquinon

• 3M Natriumbisulfitlösung, einzusehen im Abschnitt 3.6: „Puffer und Lösungen“.

Um Einzelstrang-DNA zu erhalten, wurden zu jeder DNA-Probe 5,5µl 2M NaOH hinzugefügt und

dies bei 37°C für 10min inkubiert. Anschließend wurden 30µl 10mM Hydroquinon und 520µl 3M

Natriumbisulfit hinzugefügt, um zuerst Cytosin zu Cytosinbisulfit zu sulfonieren und es dann in

Reaktion mit Wasser zu Uracilbisulfit zu desaminieren. Die Probe wurde mit Mineralöl bedeckt und

für maximal 16-18 Stunden bei 50°C inkubiert. Darauf wurden die Proben mithilfe des DNA-

Wizard Clean Up-Systems gereinigt, um danach die DNA (50µl) mit je 5,5µl 3M NaOH für 5min

bei Raumtemperatur zu desulfonieren. Als Träger wurde 1µl Glykogen hinzugegeben. Zur

Neutralisierung erfolgte eine Gabe von 33µl 10M Ammoniumacetat und zur DNA-Fällung eine

Gabe von 300µl 100% Ethanol.

25

Die Präzipitation der DNA erfolgte entweder über Nacht bei -20°C oder für 1.5h bei -80°C. Daran

schloss sich eine 30minütige Zentrifugation bei 4°C an mit Entfernung des Überstands. Wieder

wurden 300µl 100% Ethanol zum Waschen hinzugefügt und für 30min bei 4°C zentrifugiert. Der

Überstand wurde abgenommen und die Pellets bei Raumtemperatur getrocknet. Es folgte eine

Resuspension in, je nach DNA-Menge, 20-30µl 65°C heißem Aqua bidest.

4.1.5 PCR

4.1.5.1 MSP-PCR- Protokoll unter Verwendung von HotStarTaqPolymerase (Quiagen)

Jede DNA-Probe wurde mit spezifischen Primern einmal für das methylierte und einmal für das

unmethylierte Gen untersucht. Daher wurde ein zweifacher Mastermix angelegt, in folgender

Zusammenstellung, wie für das Kit empfohlen:

Mastermix: (unmethyliert/ methyliert)

für eine Probe:

2.5µl 10x PCR-Puffer (15mM MgCl2)

0.8µl Forward-Primer (10pmol/µl)

0.8µl Backward-Primer (10pmol/µl)

0.5µl dNTPs (10mM)

19µl Aqua bidest

0.25µl HotStarTaqPolymerase (5U/µl)

Je Well wurden 2.5µl DNA und 22.5µl Mastermix zusammenpipettiert und mit Mineralöl bedeckt.

Die Leerprobe war reiner Mastermix. Anschließend wurde das entsprechende Programm

durchlaufen, wie es die unten in Tabellen aufgeführten Bedingungen zeigen (Tab.2).

4.1.5.2 Primer

Die meisten Primersequenzen (p16, HIC 1, APC, hMLH1, RASSF1A, TIMP3, MGMT) für die MSP

waren bekannt oder wurden aus geeigneten Literaturstellen entnommen. Die MEN1-Primer

(Men1Exon, Men1 Promotor) wurden bereits zuvor von der Arbeitsgruppe entworfen (s. 4.3).

Die Primersequenzen für die MSI-und LOH-Marker sind in der NCBI-Datenbank erfasst

(„UniSTS“). Die Primer wurden von der Firma Hermann GbR, Freiburg, synthetisiert.

26

Tabelle 2: Gene, Primer und PCR-Bedingungen für die MSP- Analyse

GEN APC Promotor 1A

Unmethyliert Methyliert

PRIMER [38] sense 5'-AATTTGTTGGATGTGGATTAGGGT-3' 5'-CGTTGGATGCGGATTAGGGC-3'

antisense 5'-AACCTCATATCAATCACATACA-3' 5'-CCTCATATCGATCACGTACG-3'

Größe 89 bp 84 bp

PCR-Bedingungen Temperatur Inkubationsdauer Temperatur Inkubationsdauer

Initiale Denaturierung 95 °C 15 min 95 °C 15 min

Denaturierung 92 °C 30 s 92 °C 30 s

Annealing 56 °C 45 s 58 °C 45 s

Elongation 72 °C 45 s 72 °C 45 s

Anzahl der Zyklen 50 50

Abschließende Elongation 72 °C 10 min 72 °C 10 min

GEN p16

Unmethyliert methyliert

PRIMER [75] sense 5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3' 5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3'

antisense 5'-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3' 5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'

Größe 151 bp 150 bp








GEN RASSF1A

Unmethyliert methyliert

PRIMER [103] sense 5'-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3' 5'-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3'

antisense 5'-CAAACCCCACAAACTAAAAACAA-3' 5'-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3'



Initiale Denaturierung 94 °C 5 min wie unmethyliert

Denaturierung 94 °C 30 s wie unmethyliert

Annealing 60 °C 30 s wie unmethyliert

Elongation 72 °C 30 s wie unmethyliert

Anzahl der Zyklen 60 wie unmethyliert

Abschließende Elongation 72 °C 10 min wie unmethyliert

27

GEN hMLH1 Region A


PRIMER [10] sense 5'-TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT-3' 5'-ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3'

antisense 5'-ACCACCTCATCATAACTACCCACA-3' 5'-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3'









GEN HIC-1

unmethyliert Methyliert

PRIMER [10] sense 5'-TTGGGTTTGGTTTTTGTGTTTTG-3' 5'-TCGGTTTTCGCGTTTTGTTCGT-3'

antisense 5'-CACCCTAACACCACCCTAAC-3' 5'-AACCGAAAACTATCAACCCTCG-3'









GEN TIMP-3


PRIMER [17] sense 5'-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3' 5'-CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC-3'

antisense 5'-CCCCCAAAAACCCCACCTCA-3' 5'-CCGAAAACCCCGCCTCG-3'





Annealing 59 °C 1 min 58°C 45 s

Elongation 72 °C 1 min wie unmethyliert



GEN MEN1 Exon 2


PRIMER sense 5'-TTGGTTTGTTTTGTAGGTTGTTGT-3' 5'-GGTTTGTTTTGTAGGTCGTCGT-3'

antisense 5'-ACTCCTCTCAACCCAACTCAAC-3' 5'-ACTCCTCTCGACCCAACTCGAC-3'









28

GEN MEN1 Promotor


PRIMER sense 5'-AGAAGTTTGGTGATTTTTTATTTTG-3' 5'-GTTCGGCGATTTTTTATTTCGA-3'

antisense 5'-TAACCCTTCCCTTCAAACCAAC-3' 5'-TAACCCTTCCCTTCAAACCGAC-3'



Initiale Denaturierung 94 °C 5 min wie unmehtyliert

Denaturierung 94 °C 30 s wie unmehtyliert

Annealing 60 °C 30 s wie unmehtyliert

Elongation 72 °C 30 s wie unmehtyliert

Anzahl der Zyklen 70 wie unmehtyliert

Abschließende Elongation 72 °C 10 min wie unmehtyliert

GEN MGMT


PRIMER [43] sense 5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3' 5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'

antisense 5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3' 5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'

Größe 93 bp 81 bp



Denaturierung 94 °C 45 s 94 °C 30s

Annealing 57 °C 45 s 56 °C 30s

Elongation 72 °C 45 s 72 °C 30s



4.1.5.3 MEN1 Primerdesign

Die MEN1-Primer wurden bereits zuvor von der Arbeitsgruppe entworfen: Die Basensequenz von

MEN1 wurde der NCBI GenBank (Zugangsnummer U93237) auf der Internetseite

„www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=1945388“ entnommen. Die ersten

2.500 Basen wurden in ein Programm zum Entwerfen methylierungsspezifischer Primer eingegeben

(www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi). Von den auf diese Weise ermittelten

Primern wurde ein Set ausgewählt, das einen Abschnitt kurz vor Exon1 amplifiziert (1550 bis

1656), an dem der MEN1-Promotor vermutet wird [176]. Es wurde ein weiteres Set ausgesucht, das

eine Sequenz in Exon2 (2250 bis 2381), das reich an CpG-Dinukleotiden ist, amplifiziert, da Exon1

nicht transkribiert wird.

(www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/MEN1ID148.html).

4.1.6 Gelelektrophorese:

Zur Auftrennung der amplifizierten DNA wurde ein 2,5% Agarosegel, das mit dem unter UV-Licht

fluoreszierenden Farbstoff Ethidiumbromid vermischt war, gegossen. Ethidiumbromid besitzt die

Eigenschaft mit doppelsträngiger DNA zu interkalieren und kann unter UV-Transillumination

sichtbar gemacht werden.

29

4.2 MSI- und LOH-Analyse

4.2.1 DNA-Extraktion für die MSI- und LOH-Analyse:

Zu den unter 4.1.2 genannten Pellets wurden je 30µl GeneReleaser hinzugefügt, und unter

folgendem Programm im Thermocycler inkubiert:

Schritt Zeit Temperatur

1 30 s 65 ° C

2 30 s 8 ° C

3 90 s 65 ° C

4 3min 97 ° C

5 1min 8 ° C

6 3min 65 ° C

7 1min 97 ° C

8 1min 65 ° C

Im Anschluss daran wurden je 25µl TE/ Proteinase K (24:1) hinzupipettiert, mit Mineralöl bedeckt

und wie folgt inkubiert:

Schritt Zeit Temperatur

1 54 h 55 ° C

2 15min 95 ° C

Die DNA ist gebrauchsfertig und kann bis zu ihrer weiteren Verwendung bei -20°C gelagert

werden.

4.2.2 Endlabeln eines Primers

Anfänglich wurde jeweils ein Primer durch Phosphorylierung mit 32P radioaktiv markiert:

1µl 5x Forward Reaction Puffer

1µl Forward Primer (10pmol/µl)

1µl T4 Polynukleotid Kinase (10U/µl)

Nach Vortexen und Herunterzentrifugieren wurden 2µl [γ-32P] ATP (10µCi/ml) hinzugefügt und

die Mischung, nach Vortexen und Herunterzentrifugieren, für 1h bei 37°C inkubiert und

anschließend für 15min bei 95°C denaturiert.

4.2.3 Endlabeln des Elektrophoresemarkers

Als Elektrophoresemarker diente Φ X174 RF DNA/HAE III Fragments. Sein Endlabeling erfolgte

folgendermaßen:

1µl Forward Reaction Puffer

3µl Marker (Φ X174)

1µl T4 Polynukleotid Kinase (10U/µl)

30

Nach Vortexen und Zentrifugieren wurden 1µl [γ- 32 P] ATP (10mCi/ml) hinzupipettiert, vermischt

und für 1h bei 37°C inkubiert und für 15min bei 95°C denaturiert. Dann wurden 5µl Aqua bidest.

sowie 10µl MSI- Loading dye hinzugegeben.

4.2.4 PCR

Herstellung des Mastermixes (pro Marker)

Volumina Konzentration in der PCR

12µl MgCl2 (50mM) 1.5µM

40µl 10x PCR Puffer 1x

8µl 10mM dNTPs 200µM

94µl Aqua bidest.

Diese insgesamt 154µl sowie 1µl Backwardprimer (0.025µM) wurden zu dem bereits radioaktiv

markierten Primer pipettiert. Nach abschließendem Vortexen und Zentrifugieren konnte der

Mastermix bei -20°C ca. eine Woche gelagert werden.

Für die PCR wurden pro 2µl DNA-Probe 2.4µl Mastermix und 0.06µl Taq DNA-Polymerase

(5U/µl) geladen.

4.2.4.1 PCR-Bedingungen

Es wurden folgende Marker verwendet:

Marker Lokalisation im Bereich von

BAT25 Intron von c-kit [Chr. 4q12]

BAT26 Intron5 von hMSH2 [Chr. 2p16]

D2S123 hMSH2 [Chr. 2p16]

D5S346 APC

D11S913 MEN1

D17S250 p53 [Chr. 17p13]

RH94067 APC

BAT25 und BAT26 sind Mononukleotidmarker, d.h. sie sind in der Regel monomorph. Sie setzen

sich aus Poly(A)- Sequenzen zusammen, die nur geringen Längenvariationen unterliegen

[77,90,178].

Alle anderen Marker sind polymorph, so dass pro Tumor auch immer die korrespondierende

Normal-DNA zum Vergleich untersucht werden musste. D2S123 setzt sich aus einer Wiederholung

der Basen (AC)13AT(AC)15 zusammen und D17S250 aus (AC)25.

31

Um den MSI-Status von Tumoren entsprechend der Richtlinien des National Cancer Institutes zu

bestimmen, wurden folgende 5 Marker verwendet [25]: BAT25, BAT26, D2S123, D5S346,

D17S250. An allen Markern, außer BAT25 und BAT26, ließen sich zudem auch Allelverluste

(LOH) untersuchen.

Tab.3: MSI Marker BAT 25[119]

Primer sense antisense

5’- TCG CCT CCA AGA ATG TAA GT -3’ 5’- TCT GCA TTT TAA CTA TGG CTC- 3’

Größe des PCR-Produktes 90 bp PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation

Temperatur Inkubationsdauer 95 ° C 3 min

95 ° C 30 s

50 ° C 1 min

72 ° C 1 min

35 *

72 ° C 10 min

Marker BAT 26[119]


5’ - TGA CTA CTT TTG ACT TCA GCC- 3’ 5’ - AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC C-3’

Größe des PCR-Produktes 86 – 100 bp

PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation

Temperatur Inkubationsdauer wie BAT 25

wie BAT 25

wie BAT25

wie BAT 25

wie BAT25*

wie BAT25

* am 9.11.06 wurde die Zyklenzahl auf 50 erhöht, dies betrifft nur Tumore 8cc, 20- 26cc

Marker D2S123( UniSTS-Nr.888)


5’ – AAACAGGATGCCTGCCTTTA- 3’ 5’- GGACTTTCCACCTATGGGAC-3’

Größe des PCR-Produktes 197- 227 bp PCR-Bedingungen Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Anzahl der Zyklen Abschließende Elongation

Temperatur Inkubationsdauer 94 ° C 3 min 94 ° C 40 s 50 ° C 2 min 72 ° C 2 min 40 72 ° C 10 min

32

Marker D5S346(UniSTS-Nr.146926)


5’ – ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG-3’ 5’ – AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT- 3’

Größe des PCR-Produktes 96 bp


Temperatur Inkubationsdauer 94 °C 3 min 94 ° C 1 min 55 ° C 2 min 72 ° C 2 min 35 72 ° C 10 min

Marker D17S250[abgewandeltes Primerset]


5’ – AAGAGCTGAGACTCCATCTC- 3’ 5’ –ACAGCTCCTTTAATGGCAGG- 3’



Temperatur Inkubationsdauer 94 ° C 3 min 94 ° C 30 s 50 ° C 1 min 72 ° C 1 min 40 72 ° C 10 min

Tab.4: LOH

Marker D11S913( UniSTS-Nr. 2112)


5’- AAATGGAAGAAACAAAAGCC-3’ 5’- CCTGGTTAATCTCTCATTAATCC-3'



Temperatur Inkubationsdauer 94 ° C 3 min 94 ° C 30s 50 ° C 30s 72 ° C 30s 50 72 ° C 10 min

Marker RH94067(UniSTS-Nr.85831)


5’- ATGCATGTATCATCAGTCACCC-3’ 5’- GTCCCCTTATACAGTGGAGGG-3’



Temperatur Inkubationsdauer 94 ° C 3 min 95 ° C 45s 52 ° C 45s 72 ° C 45s 50 72 ° C 10 min

33

4.2.5 Polyacrylamid-Gelelektrophorese:

Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte auf einem denaturierendem 8% Polyacrylamidgel, das

aus 25ml 8% Acrylamidgellösung, 19µl TEMED zur Quervernetzung und 125µl APS zum Starten

der Reaktion hergestellt wurde. Im Anschluss an die PCR wurden die DNA-Proben zur Spaltung

der Doppelstränge mit jeweils 3µl LOH/MSI-Loading Dye für 10min bei 95°C erhitzt und dann auf

Eis gekühlt, um die Denaturierung aufrechtzuerhalten. Es erfolgte die Auftragung von je 2µl PCR-

Produkt und 4µl des Elektrophoresemarkers Φ X174 RF DNA/HAE III Fragments als Größenleiter

auf das Gel mithilfe der Spezialpipetten MµlTIFlex Flat.4mm Tips.

Die Elektrophorese wurde bei 30W je Glasplatte bei maximaler Spannung von 1000V und

maximaler Stromstärke von 100mA im BaseRunner200 durchgeführt. Je nach Größe der PCR-

Produkte wurde sie beendet. Nach der Trocknung wurde das Gel mit einem unbelichteten Film in

einer Röntgenkassette für mehrere Stunden autoradiografiert.

MSI wurde bestätigt, wenn sich eine Bandenverschiebung gegenüber der Normalgewebe- DNA

zeigte. LOH wurde bestätigt, wenn die Intensität eines Tumorallels um 50% reduziert war im

Vergleich zu Normalgewebe- DNA.

4.3 Ki-67 Färbung

Zur Ermittlung des Proliferationsgrades der GEP-NET wurde der Proliferationsmarker Ki-67

mittels Immunhistochemie (IHC) bestimmt. Dazu wurde der monoklonale Antikörper MIB-1 zur

Erkennung des im Nukleus lokalisierten Proteins Ki-67 verwendet (s. 1.9). Es wurde das DAKO

M7240 Kit und das DAKO K5005 Detektionssystem für Autostainer angewandt:

Die Paraffinschnitte wurden entsprechend Herstellerangaben für die hitzeinduzierte

Epitopdemaskierung (HIER) bei pH 6 im Dampfgarer vorbereitet. Durch die Demaskierung sollten

die durch die Fixierung für den primären Antikörper unkenntlich gemachten Epitope offengelegt

werden. Nun wurde der MIB-1-Antikörper in 2000facher Verdünnung dazugegeben. Es kam ein

indirektes Streptavidin-Biotin-Verfahren zur Anwendung, bei dem der sekundäre Antikörper über

Streptavidin mit zugegebener alkalischer Phosphatase in Verbindung tritt. Diese löst bei

Anwesenheit von Chromogen RED eine rote Farbreaktion der betroffenen Zellkerne aus.

Zur Gegenfärbung der normalen Zellkerne wurde eine HE-Färbung (Hämalaun nach Mayer)

durchgeführt (blaues Endprodukt). Die Zahl der für Ki-67 angefärbten Zellkerne wurde unter dem

Lichtmikroskop in mehreren Gesichtsfeldern mit 25facher Vergrößerung betrachtet und

ausgewertet.

34

4.4 Statistische Methoden

Wurden zwei Gruppen bezüglich eines Merkmals verglichen, kam der χ2-Vierfeldertest mit

Stetigkeitskorrektur zur Anwendung. Wurden drei Gruppen bezüglich eines Merkmals verglichen,

wurde der χ2-Test für Kontingenztafeln verwendet.

Der Fisher`s Exact Test wurde zur Kontrolle der ermittelten p-Werte angewendet, wenn die

Gesamtzahl der verglichenen Tumoren kleiner als 40 bzw. wenn die erwartete Häufigkeit innerhalb

einer Vierfeldertafel kleiner als 5 war.

Für die Berechnung des Zusammenhangs zwischen der Methylierung bestimmter Gene und dem

Status des Tumors wurde der ‚Binary logit–Test’ und der ‚Cumulative logit-Test’ angewandt (s.

5.7.5.2). Der Mantel-Haenszel-Test diente der Berechnung von Signifikanzen bezüglich linearer

Trends (s. 5.7.6). Bei allen Tests wurde ein p-Wert <0.05 als statistisch signifikant betrachtet.

Als ‚Nachbeobachtungszeit’ war in dieser Studie die Zeit definiert, die zwischen Erstdiagnose des

Tumors und Tod bzw. Ausscheiden des Patienten aus der Beobachtung verstrich. Als definitives

Ende der Nachbeobachtung wurde bei den Kolon-NET der Zeitpunkt August 2006 gesetzt.

Entsprechend wurde der Status der Patienten zu diesem Zeitpunkt in die Berechnungen

aufgenommen (lebend oder verstorben). Als ‚Überlebenszeit’ wurde die Zeit definiert, die zwischen

Erstdiagnose und Tod des Patienten verstrich.

Zur Berechnung der Überlebenszeiten wurde die Kaplan-Meier-Methode angewandt. Der

anschließende Logranktest verglich zwei oder mehr nach der Kaplan-Meier-Methode berechnete

Überlebenskurven auf signifikante Unterschiede. Die berechneten Überlebenszeiten wurden durch

untere und, wenn vorhanden, obere Grenzen des 95% Konfidenzintervalls (KI) umgeben.

Manchmal konnte keine obere Grenze des 95% KI gebildet werden, da einige Patienten über den

Beobachtungszeitraum hinaus überlebten. Auch konnte insgesamt keine mittlere Überlebenszeit

gebildet werden, wenn mehr als 50% der Patienten über den Beobachtungszeitraum hinaus lebten.

Nicht berechenbare oder nicht erhobene Daten werden nicht nochmals explizit als fehlend im

Ergebnisteil erwähnt. Die mediane Überlebenszeit zeigt die Zeit auf, innerhalb der die Hälfte der

Patienten (in absoluten Zahlen) verstorben ist. Diese Angabe ist natürlich nicht möglich bei

Gruppen, deren Patienten zu mehr als die Hälfte über den Beobachtungszeitraum überleben.

Die Überlebenszeit-Analysen waren univariat (Cox-Regression), wenn zwei Überlebenskurven

bezüglich eines Merkmals, z.B. CIMP-Status, Tumorgruppe oder Ki-67-Index, im Logranktest

verglichen wurden (z.B. 5.8.3). Eine multivariate Analyse wurde zur Feststellung eines

prognostischen Faktors für das Überleben durchgeführt. Hierbei wurden alle vier möglichen

Prädiktoren (Tumorgruppe, LOH-Status, CIMP-Status, Ki-67-Index) verglichen. Durch

schrittweises Ausschließen (logistische-Regression) einzelner Faktoren konnte ein statistisch

35

signifikanter (p<0.05 likelihood ratio) prognostischer Faktor für das Überleben ermittelt werden (s.

5.8.5).

Als Datenanalyseprogramm diente SAS 9.1. Alle statistischen Auswertungen dieser Studie wurden

freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Schulte-Mönting vom Institut für Biometrie und

Medizinische Informatik, Freiburg, durchgeführt.

36

37

5 Ergebnisse

5.1 MSI-Analyse

Von 34 Tumoren konnten 25 auf MSI untersucht werden. Es werden mikrosatellitenstabile (MSS),

geringgradig mikrosatelliteninstabile (MSI-L) und hochgradig mikrosatelliteninstabile (MSI-H)

Tumoren unterschieden. Tumoren mit einem instabilen Marker werden als MSI-L eingestuft,

Tumoren mit zwei oder mehr instabilen Markern als MSI-H [25]. Bei den untersuchten Tumoren

war einer MSI-H (4%, 1/25) und 5 MSI-L (20%, 5/25). MSS waren 76% der Tumoren (19/25). Eine

Übersicht über MSI gibt Abb.6:

76%

20%

4%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Pro

zent

MSS MSI-L MSI-H

MSI bei Kolon-NET

Abb.6 Eine MSI war mindestens einmal an jedem der genannten fünf Marker des NCI vorhanden.

5.2 LOH- Analyse

Von allen Kolon-NET ließen sich 27 auf Allelverluste untersuchen. Davon konnte bei 10 Tumoren

LOH mindestens an einem Marker festgestellt werden (10/27, 37%). Ein Tumor (Nr.12cc) wies 3

Allelverluste an D2S123, PYGM und RH94067 auf. Ein weiterer Tumor (Nr.13cc) wies LOH an

D17S250 und PYGM auf, ein anderer (14T) zeigte Allelverluste an D5S346 und D11S913.

Die Häufigkeit der einzelnen Allelverluste ist in Tab.5 und 6 wiedergegeben.

Marker LOH In Prozent

D2S123 1/27 4%

D5S346 1/27 4%

D17S250 3/27 11%

D11S913 5/27 19%

PYGM 2/27 7%

RH94067 2/27 7%

Gen LOH In Prozent

hMSH2 1/27 4%

APC 3/27 11%

p53 3/27 11%

MEN1 7/27 26%

38

Am häufigsten wurden Allelverluste am oder in der Nähe des MEN-1-Lokus gefunden (26%,

D11S913 und PYGM), gefolgt von p53 und APC (jeweils 11%) und hMSH2 (4%).

Eine graphische Übersicht geben Abb.7 und Abb.8:

0%5%

10%15%20%25%

30%35%40%

Häu

figke

it vo

n LO

H

D2S123D5S346D17S250D11S913PYGMRH94067 alleMarker

Marker

LOH

Abb.7 Allelverluste pro Marker

4%

11% 11%

26%

37%

0%5%

10%15%20%25%30%35%40%

Häu

figke

it vo

n LO

H

hMSH2 APC p53 MEN1 alleMarker

Markerlokalisation

LOH

Abb.8 Allelverluste je Genlokalisation N T

7cc

D17S250

Abb.9 zeigt ein Beispiel eines LOH-Ergebnisses. Der Pfeil zeigt die fehlende Bande im Tumorgewebe (T) an und markiert damit den Allelverlust gegenüber dem Normalgewebe (N) am Marker D17S250.

39

5.3 MSP-Analyse

Bei der MSP ließen sich alle 34 untersuchten Tumoren amplifizieren. Keines der 8 untersuchten

Gene war ausschließlich unmethyliert. Am häufigsten waren die Promotoren von HIC1, MEN1 und

APC mit 59% (16/27), 48% (15/31) und 46% (15/33) methyliert, wobei der MEN1-Promotor zu

50% (14/28), Exon2 des MEN1-Gens zu 7% (2/29) methyliert war. Die geringste

Methylierungshäufigkeit fand sich bei TIMP3 mit 9% (3/32). Tab.7 weist die

Methylierungshäufigkeit aller 8 Gene auf:

Gen Methyliert In Prozent

TIMP3 3/32 9%

hMLH1 4/32 13%

p16 8/30 27%

MGMT 13/31 42%

RASSF1A 13/29 45%

APC 15/33 46%

MEN-1 15/31 48%

HIC-1 16/27 59%

Tab.7

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

3/32 4/32 8/30 13/31 13/29 15/33 15/31 16/27

TIMP3 hMLH1 p16 MGMTRASSF1A APC MEN 1 HIC 1

Häufigkeit der Genmethylierung

Methylierungsprofil der Kolon-NET

Abb.10 zeigt die Methylierungshäufigkeit der verschiedenen Gene.

40

U M U M U

12 cc 13cc 14cc

Abb.6.1 APC-Gen

M

Abb.6.2 Positivkontrolle Nr.2

U M U M

6T 7T

Abb.6.3 HIC1-Gen

U M


U M U M

8cc 10cc

Abb.6.5 hMLH1-Gen

U M U M

Nr.1 Nr.2

Abb.6.6 Positivkontrolle

U U U M

7T 8T Nr 1

Abb.6.7 MEN1 Exon2 und

Positivkontrolle Nr.1

s. Abb.6.7

U M U

5cc 6cc

Abb.6.9 MEN1 Promotor

U M

Nr.1

Abb.6.10 Positivkontrolle

41

U M U M M

18cc 19cc Nr.2

Abb.6.11 MGMT-Gen und

Positivkontrolle Nr.2

s.Abb.6.11

U U M

9cc 10cc

Abb.6.13 p16 -Gen

M


U U M

20cc 25cc

Abb.6.15 RASSF1A-Gen

U M


U U M

1cc 2cc

Abb.6.17 TIMP3-Gen

U M


Abb.11 zeigt Beispiele von PCR-Produkten der MSP-Analyse. Die Größen der PCR-Produkte sind in Kap.4, Tab.2 aufgelistet. Als Positivkontrolle diente nach dem Sss1-Protokoll methylierte DNA aus venösem Blut, als Negativprobe wurde H2O verwendet (Kap.3.7).

5.4 CIMP

Da die Mindestzahl methylierter Gene für CIMP nicht einheitlich definiert ist, galt in dieser

Untersuchung ein Tumor als CIMP-positiv, wenn ≥3 von 8 Genen methyliert waren. Beim CRC

bestand CIMP, wenn 2 von 6 untersuchten Genen methyliert waren [62].

Diesen Phänotyp wiesen 65% (20/31) der Kolon-NET auf. Bei 3 von 34 untersuchten Tumoren

gelang die Analyse des CIMP-Status nicht (s. Anhang Tab.A1: Tumoren 18T, 23cc, 24cc).

42

5.5 Genmethylierung

Es zeigte sich, dass jeweils 29% (9/31) der Tumoren an 3 oder 4 Genen methyliert waren und in 2

Fällen (6.5%) eine aberrante Genmethylierung, bei der 6 oder mehr Gene betroffen waren, bestand.

Bei 13% (4/31) bestand keine Methylierung. Zur Übersicht Tab. 8:

Anzahl der

methylierten

Gene

n

%

0 4/31 13%

1 4/31 13%

2 3/31 10%

3 9/31 29%

4 9/31 29%

5 0/31 0%

6 1/31 3%

7 1/31 3%

Tab.8

5.6 Ki-67-Analyse

Nach Auswertung der Ki-67-Färbungen, konnten die Tumoren entsprechend der WHO-

Klassifikation von 2000 [93,144] den 3 Kategorien des Ki-67-Indexes zugeordnet werden: Tumoren

mit Ki-67-Anfärbung der Zellkerne < 2%, 2-29% und >29%. Bei den Kolon-NET hatten 6% (2/34)

der Tumoren einen Ki-67-Index von <2%, 9% (3/34) einen Ki-67-Index von 2-29% und 85%

(29/34) waren zu >29% Ki-67-positiv (Tab.9):

Ki-67-Index Ki-67 <2% Ki-67 2- 29 % Ki-67 <29%

% der Kolon-NET 6% (2/34) 9% (3/34) 85% (29/34)

Tab.9

6% 9%

85%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Häu

figke

it de

r K

i67-

Kat

egor

ie

Ki67<2% Ki67>2-29% Ki67> 29%

Ki67-Kategorie

Ki67-Proliferationsindex

Abb.12 Ki-67-Index-Verteilung bei Kolon-NET

43

5.7 Vergleich der Tumorgruppen

5.7.1.1 Fore- und Midgut-NET

Alle 38 Tumoren waren auswertbar. Sämtliche Fore-und Midgut-NET (34/38) waren MSS. 12.5%

(3/24) der Tumoren zeigten LOH an denselben Markern wie bei den Kolon-NET. Es wurden

dieselben Gene auf Methylierung wie bei den Kolon-NET untersucht: p16, hMLH1, APC,

RASSF1A, MGMT, TIMP3, HIC1, MEN1 (Exon2 und Promotor). Es galten die gleichen

Bedingungen zur Festlegung von CIMP wie bei den Kolon-NET (s.5.4). Es zeigte sich, dass 47%

(18/38) CIMP-positiv waren.

Die Ki-67-Analyse ergab folgende Verteilung:

Ki-67- Index <2% 2-29% >29%

% der Fore- und Midgut-NET 63.2% (24/38) 36.8% (14/38) 0% (0/38)

Tab.10

63%

37%

0%

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

Häu

figke

it

Ki67<2% Ki67 2-29% Ki67 > 29%

Ki67-Index

Ki67-Index bei Fore- und Midgut NET

Abb.13 Ki-67-Index-Verteilung bei Fore- und Midgut-NET

5.7.1.2 Kolorektale Karzinome (CRC)

Von den Tumoren waren 63% (94/150) MSS, 29% (43/150) MSI-L und 9% (13/150) MSI-H. Die

CRC waren zuvor nach ihrem MSI-Status ausgewählt worden, insofern handelt es sich hier nicht

um eine repräsentative Darstellung des MSI-Status. In dieser Gruppe wurden die Gene p14, p16,

MLH1, MINT1, MINT2, MINT31 auf Methylierung untersucht. Hierbei galt ein Tumor als CIMP-

positiv bei Methylierung von 2 von 6 Genen. Dies kam in 29% (44/150) der Fälle vor.

44

5.7.2 MSI

Die Häufigkeiten des MSI-Status waren je nach Tumorlokalisation folgendermaßen verteilt:

MSS/ MSI-L MSI- H

Kolon- NET 96% (24/25) 4% (1/25)

Fore- und Midgut-NET 100% 0%

Tab.11

96%

4%

100%

0%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Häu

figke

it in

%

Kolon-NET Fore- und Midgut-NET

Tumorlokalisation

MSI Status nach Tumorlokalisation

MSS/MSI-L

MSI-H

Abb.14

Im Vergleich unterscheiden sich Fore-und Midgut-NET und Kolon-NET nicht signifikant bezüglich

MSI (p=0.8317). Die CRC waren nicht repräsentativ, da es sich um eine Vorauswahl nach MSI-

Status handelte.

5.7.3 LOH

Bei den Kolon-NET fanden bei 37% (10/27) der Tumoren, bei Fore-und Midgut-NET bei 12.5%

(3/24) Allelverluste statt. Dabei konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den

Tumorlokalisationen für die Häufigkeit von Allelverlusten festgestellt werden (p=0.1669).

0,37

0,13

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

Pro

zent

Kolon-NET Fore- und Midgut-NET

Tumorlokalisation

LOH-Status

LOH

Abb.15

45

5.7.4 CIMP

Die Häufigkeiten des CIMP-Status waren in Bezug auf den MSI-Status in den verschiedenen

Tumorlokalisationen folgendermaßen verteilt (mit Berücksichtigung der Grundgesamtheit):

CIMP-positive

Tumoren

CIMP- negative

Tumoren

Kolon- NET/ MSS 52% (13/25) 16% (4*/25)

Kolon- NET/ MSI-L 12% (3/25) 8% (2/25)

Kolon- NET/ MSI-H 0% 4% (1/25)

CRC/ MSS 16% (24/150) 47% (70/150)

CRC/MSI-L 7% (10/150) 22% (33/150)

CRC/MSI-H 7% (10/150) 2% (3/150)

Fore- und Midgut-NET/ MSS 47% (18/38) 53% (20/38)

Tab.12 * 2 Tumoren konnten bezüglich ihres CIMP-Status nicht gewertet werden (18T,23cc), wohl aber bzgl. der MSI-

Auswertung

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

Häu

figke

it in

%

Kolon-NET/M SS

Ko lon-NET/ M SI-L

Ko lon-NET/ M SI-H

CRC/M SS

CRC/ M SI-L

CRC/ M SI-H

Fore-undM idgut-

NET/M SS

Tumorlokalisation/MSI-Status

Zusammenhang CIMP und MSI-Status verschiedener Tumo rlokalisationen

CIMP pos

CIMPneg

Abb.16 Im direkten Vergleich zwischen CRC und Kolon-NET war die Häufigkeit des CIMP-positiven

Status in Bezug auf den MSI-Status folgendermaßen verteilt:

CIMP-positiv Kolon-NET CRC

MSS 76% (13/17) 26% (24/94)

MSI-L 60% (3/5) 23% (10/43)

MSI-H 0% (0/1) 77% (10/13)

Tab. 13 MSS und MSI-L Kolon-NET waren signifikant öfter CIMP-positiv als sporadische CRC

(p=0.0272). Der einzige MSI-H-NET des Kolon war CIMP-negativ.

46

Die Häufigkeiten des CIMP-Status waren in den verschiedenen Tumorlokalisationen

folgendermaßen verteilt:

CIMP positiv CIMP negativ

CRC 29% (44/150) 71% (106/150)

Kolon- NET 64.5% (20/31) 35.5% (11/31)

Fore- und Midgut- NET 47% (18/38) 53% (20/38)

Tab.14

71%

29% 35%

65%53% 47%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%

Häu

figke

it in

%

CRC KolonNET Fore undMidgutNET

TumorlokalisationCIMPneg CIMP pos

Abb.17

Bei Betrachtung aller 3 Tumorentitäten war die Anzahl der CIMP-positiven Tumoren für Kolon-

NET signifikant erhöht (p=0.0004).

Im Einzelvergleich zwischen den Kolon-NET und den Fore-und Midgut-NET konnte kein

signifikanter Unterschied bezüglich des CIMP-Status gefunden werden (p=0.2376).

Beim Einzelvergleich von Kolon-NET und CRC konnte jedoch ein für Kolon-NET signifikanter

Unterschied bezüglich des CIMP-Status gefunden werden (p=0.0004).

47

5.7.5 Genmethylierung

5.7.5.1 Vergleich der Genmethylierung der verschiedenen NET

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Haü

figke

it in

%

HIC1 MEN1 APC RASSF1A MGMT p16 hMLH1 TIMP3

Gen

Methylierungsprofil der Kolon-NET und Fore-und Midg ut-NET

Fore-und Midgut-NET Kolon-NET

Abb.18 Für die Kolon-NET waren folgende Gene signifikant häufiger methyliert als für Fore-und Midgut-

NET: p16 (p=0.0090) und MEN1 (p=0.0430).

Die Gene MGMT und TIMP3 waren zwar häufiger methyliert als bei Fore-und Midgut-NET, es

bestand jedoch kein signifikanter Unterschied.

HIC1, APC, hMLH1, RASSF1A waren in dieser Untersuchung häufiger bei den Fore-und Midgut-

NET methyliert, wobei sich nur für hMLH1 ein signifikanter Unterschied ergab (p=0.046).

Methylierung

Gene Fore und MidgutNET Kolon-NET

p-Werte

χ2-Vierfeldertest mit

Stetigkeitskorrektur

HIC1 21/25 84% 16/27 59.3% 0.0967 n.s./grenzwertig

MEN1 7/33 21.2% 15/31 48.4% 0.0430 signifikant

APC 23/36 63.9% 15/33 45.5% 0.1951 n.s.

RASSF1A 20/30 66.6% 13/29 44.8% 0.1536 n.s.

MGMT 8/30 26.7% 13/31 41.9% 0.3245 n.s.*

p16 0/29 0% 8/30 26.7% 0.0090 signifikant

hMLH1 17/36 47.2% 4/32 12.5% 0.0046 signifikant

TIMP3 0/33 0% 3/32 9.4% 0.2264 n.s.

Tab.15 5.7.5.2 Aussagekraft der Methylierung bestimmter Gene

Die Methylierung der Gene APC und hMLH1 machte eine Voraussage der Tumorgruppe möglich.

Sie waren vor allem bei Fore-und Midgut-NET methyliert (APC: p=0.0377; hMLH1: p=0.0014).

Ebenso zeigte sich, dass die Methylierung von MEN1 (p=0.0056) und RASSF1A (p=0.0159) mit

CIMP-positiven Tumoren korreliert war. Zuletzt ergab sich, dass bei Methylierung von hMLH1 ein

signifikant niedrigerer Ki-67-Index bestand (p=0.0084).

48

5.7.6 Ki-67

Bei Kolon-NET gab es signifikant häufiger einen erhöhten Proliferationsindex (>29% bei n=29/34)

im Gegensatz zu den Fore-und Midgut-NET (>29% bei n= 0/38) (p<0.0001) (s.Abb.12 und 13). Bei

den Kolon-NET lag für das ordinale Merkmal Ki-67 (<2%, 2-29%,<29%) ein linearer Trend für die

höheren Ki-67-Werte (>29%) vor (p<0.0001). Fore-und Midgut-NET wiesen eher niedrige Ki-67-

Werte auf.

5.8 Überleben

Überlebenszeiten lagen für Fore-und Midgut-NET und Kolon-NET vor.

5.8.1 Überleben nach Tumorgruppen

5.8.1.1 Kolon-NET

Kolon- NET

Vorhandene Überlebensdaten 23 (34)

Mediane Überlebenszeit 19 Monate

Untere Grenze des 95% KI 8 Monate

Mittlere Nachbeobachtungszeit 25 Monate

Überlebende am Ende der Beobachtung 39.1% (9/23)

Tab.16

Aus den Daten ging hervor, dass ca. 45% (11/23) der Patienten noch innerhalb eines 2-Jahres-

Zeitraums nach Diagnosestellung lebten.

5.8.1.2 Fore- und Midgut-NET

Fore-und Midgut- NET

Vorhandene Überlebensdaten 38 (38)

Mediane Überlebenszeit Nicht bestimmbar (nb)

Untere Grenze des 95% KI 36 Monate

Mittlere Nachbeobachtungszeit 67 Monate

Überlebende am Ende der Beobachtung 60.5% (23/38)

Tab.17

5.8.1.3 Vergleich

In der Kaplan-Meier Kurve (Abb.19) wurden die Überlebenszeiten von Kolon-NET und Fore-und

Midgut-NET gegenübergestellt. Kolon-NET zeigten ein signifikant schlechteres Überleben

(p=0.0061).

49

Abb.19 Kaplan-Meier-Kurve

5.8.2 Überleben nach LOH-Status

Abb.20 Kaplan- Meier-Kurve Ein Patient verstarb nach 57 Monaten in der LOH-positiven Gruppe.

LOH- positiv LOH- negativ

34 (43) 9 (34) 25 (34)

Mediane Überlebenszeit 46 Monate nb

95% KI 19-57 Monate 13 Monate- x

Mittlere Nachbeobachtungszeit 27 Monate 56 Monate

Überlebende am Ende der Beobachtung 33.3% (3/9) 54.9% (~14/25)

Tab.18

Es zeigte sich, dass das Überleben vom LOH-Status nicht abhängig ist (p=0.2773).

50

5.8.3 Überleben nach CIMP-Status

Abb.21 Kaplan- Meier-Kurve CIMP-positiv CIMP- negativ

58 (72) 32 (58) 26 (58)

Mediane Überlebenszeit 36 Monate nb

95% KI 14 Monate-x 36 Monate- x

Mittlere Nachbeobachtungszeit 45 Monate 59 Monate

Überlebende am Ende der Beobachtung 39.9% (~14/32) 60.9%(~16/26)

Tab.19

Im Logranktest bestand kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen für das Überleben

(univariate Analyse p=0.1839).

5.8.4 Überleben nach Ki-67-Index

5.8.4.1

Abb.22 Kaplan-Meier-Kurve: Überleben nach Ki-67-Status

51

Der Ki-67-Index wurde bei insgesamt 72 NET erhoben.

Ki-67<2 % Ki-67 =2-29% Ki-67>29%

72 25 (26) 16 (17) 20 (29)

Mediane Überlebenszeit nb 36 Monate 16.5 Monate

95% KI nb 12 Monate - x 8-57 Monate

Mittl. Nachbeobachtungszeit 82 Monate 33 Monate 26.5 Monate

Überlebende am Ende der Beobachtung 76% (19/25) 30 % (~6/16) 35 % (7/20)

Tab.20

Im Logrank-Test (p=0.0024) konnte gezeigt werden, dass zwischen o.g. 3 Gruppen ein signifikanter

Unterschied bezüglich des Überlebens bestand. Dies zeigte sich z.B. an unterschiedlich langen

Nachbeobachtungszeiten.

5.8.4.2

Abb.23 Kaplan-Meier-Kurve

Tab.21

Die Gruppen Ki-67=2-29% und Ki-67> 29% mit ähnlichen Nachbeobachtungszeiten wurden in

einer Gruppe (36 Patienten) zusammengefasst und gegen die verbleibende Gruppe mit Ki-67 <2%

(25 Patienten) verglichen. Im Logrank-Test konnte gezeigt werden, dass zwischen diesen beiden

Ki-67<2 % Ki-67> 2%

72 25 (26) 36 (46)

Mediane Überlebenszeit nb 36 Monate

95% KI nb 13-57 Monate

Mittl. Nachbeobachtungszeit 82 Monate 29 Monate

Überlebende am Ende der Beobachtung 76% (19/25) 36% (13/36)

52

Gruppen ein signifikanter Unterschied bestand (p=0.0008). Dies bedeutet ein signifikant

schlechteres Überleben für Patienten mit Tumoren mit einem Ki-67-Index von > 2%.

5.8.4.3

Ob das schlechte Überleben von Patienten mit Kolon-NET mit ihrem erhöhten Ki-67-Index in

Zusammenhang gebracht werden kann, ließ sich statistisch nicht bestätigen, da Kolon-NET

hauptsächlich Tumoren in Gruppe 3 (Ki-67 >29%) aufwiesen (p=0.1500).

5.8.5 Prognose (multivariate Analyse)

Die unter 5.8.1 bis 5.8.4 untersuchten Faktoren für das Überleben von Patienten mit NET wurden

nun unter der Fragestellung verglichen, welcher von ihnen mit dem Überleben der Patienten

signifikant korrelierte. Es zeigte sich, dass der Ki-67-Index am zuverlässigsten das Überleben bei

NET voraussagen konnte (Cox- Regression, Likelihood ratio: p=0.0004). Die Hazard Ratio mit 2.3

für den Ki-67-Index zeigte zusätzlich, dass Patienten mit Tumoren aus der höheren Ki-67-Index-

Gruppe (>29%) nach 1 Jahr Überleben eine deutlich schlechtere Prognose haben.

5.9 Korrelation CIMP-positiver Status und Ki-67-Ind ex bei Kolon-NET und Fore- und

Midgut-NET

0,00

0,50

1,00

0,43

0,65

0,00

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

CIM

P+

in P

roze

nt

Ki67<2% 2%<Ki67< 29% Ki67> 29 %

Ki67 Kategorie

Korrelation CIMP/Ki67

Kolon NET CIMP+ Fore/Midgut NET CIMP+

Abb.24 CIMP positiv bei: Ki-67<2% Ki-67=2-29% Ki-67>29%

Kolon-NET 0% (0/2) 100% (3/3) 65% (17/26)

F/MidgutNET 50% (12/24) 43% (6/14) 0% (0/0)

Tab.22 Es zeigte sich, dass in der zusammengefassten Gruppe der NET keine signifikante Korrelation

zwischen CIMP-und Ki-67-Status bestand (Mantel-Haenszel-Test p=0.1664 und Cochran-Mantel-

Haenszel-Test p=0.6764). Einzeln betrachtet ergab sich weder für die Kolon-NET noch für die

53

Fore-und Midgut-NET eine Korrelation zwischen dem CIMP-Status und Ki-67-Index. Bei den

Fore-und Midgut-NET bestand ein Trend dahingehend, dass bei niedrigerem Ki-67-Index vermehrt

CIMP-positive Tumoren vorhanden waren (s.Tab.22). Dies konnte aber aufgrund des Fehlens von

Fore-und Midgut-NET mit einem Ki-67-Index >29% nicht auf Signifikanz untersucht werden.

Betrachtete man nur die Gruppe der CIMP-positiven Kolon-NET, so ließ sich ein Trend

beschreiben, der vor allem CIMP-positive Tumoren bei Ki-67-Index >29% aufwies (85%, 17/20):

Ki-67 <2% Ki-67=2-29% Ki-67>29% Gesamt

CIMP-positiv 0% (0/20) 15% (3/20) 85% (17/20) 100%(20)

Tab.23

54

55

6 Diskussion

In einer vorangegangenen Studie wurde an gut differenzierten Fore-und Midgut-NET die

Beteiligung von genetischen und epigenetischen Veränderungen an der molekularen Pathogenese

untersucht [13]. Dort wurde gezeigt, dass die Promotormethylierung ein häufiges Ereignis ist, und

für GEP-NET wurde ein bestimmtes Methylierungsprofil beschrieben. Bemerkenswert war, dass es

keine signifikanten Unterschiede zwischen den Methylierungsprofilen verschiedener

Tumorsubgruppen gab. Neben genetischen Veränderungen schien CIMP eine wichtige Rolle in der

Tumorpathogenese dieser Fore-und Midgut-NET zu spielen. Dies führte zu der Annahme, dass

CIMP auch bei der Pathogenese der Kolon-NET beteiligt ist, so wie es bereits für sporadische CRC

gezeigt wurde.

In dieser Untersuchung wurden charakteristische molekulare Veränderungen von gut und schlecht

differenzierten NET in unterschiedlicher anatomischer Lage direkt miteinander verglichen. Es

konnten bezüglich der molekularen Veränderungen Unterschiede zwischen sporadischen CRC, gut

differenzierten NET des Fore-und Midgut und schlecht differenzierten NET des Kolon gezeigt

werden, die die Wachstumscharakteristika und Proliferationsraten in beiden Tumorarten (CRC und

NET) beeinflussen könnten. Außerdem wurde der Einfluss von verschiedenen Prädiktoren auf das

Überleben von gut und schlecht differenzierten Tumoren gezeigt.

Das histologische Grading hat nur eine begrenzte Aussagekraft für das Metastasierungsverhalten

eines Tumors und das Überleben der Patienten [112]. Der Ki-67-Index ist schon seit längerem

bekannt dafür, dies als zuverlässiger Prädiktor für das Überleben bei verschiedenen malignen

Neoplasien zu ergänzen [26,112,123,142,143], wobei er bei aggressiven, proliferierenden und

metastasierenden Tumoren erhöht ist. Bisher sind nur wenige Überlebens-Studien für NET

durchgeführt worden. Die meisten fanden den Ki-67-Proliferationsindex als den vorrangigen

Prädiktor für das Überleben [4,14,137,145]. Verschiedene molekulare Ereignisse sind in NET

beschrieben worden, dazu gehören die genetischen und epigenetischen Veränderungen von p53,

BAX, p16INK4a/CDKN2A, BRAF, bcl-2, PTEN, DPC4/Smad4, p27 [4,13,67,69,105,112,124,144,

153,154,160,125-127,172], Allelverluste [56] oder die unterschiedliche Expression von Nuclear

Survivin und anderen Proteinen [66,68]. Die meisten dieser Ereignisse standen nicht im

Zusammenhang mit dem Überleben der Patienten oder der Aggressivität der Tumoren. Die

Survival-Analyse dieser Studie ergab, dass Patienten mit NET mit einem Ki-67-Index > 2% ein

signifikant schlechteres Überleben zeigten (p=0.0008). Bei den hier untersuchten Kolon-NET war

ein eindeutiger Trend zu den höheren Ki-67-Werten (Ki-67>29%) zu verzeichnen, wobei

umgekehrt die gut differenzierten Fore-und Midgut-NET eher niedrige Ki-67-Werte aufwiesen (Ki-

67<2%) (p<0.0001; 5.7.6). Abschließend zeigte sich in der multivariaten Analyse (5.8.5), dass sich

56

der Ki-67-Index als prognostischer Faktor für NET hervorheben konnte. Hingegen ließ sich das

schlechte Überleben von Patienten mit Kolon-NET nicht direkt mit ihrem erhöhten Ki-67-Index in

Zusammenhang bringen, aber die Anzahl schlecht differenzierter Hindgut-Tumoren mit einem

niedrigen Ki-67-Index war gering. Dies müsste an einer größeren Anzahl von Kolon-NET nochmals

überprüft werden.

Eine aktuelle Studie belegte [Grabowski 2008, zur Publikation eingereicht], dass auch die

Aufrechterhaltung einer p27-Expression ein Prädiktor für längeres Überleben bei manchen

Patienten [78] war. Hier spielte der Verlust des Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitors p27 eine

entscheidende Rolle für die Aggressivität von GEP-NET. Das wird dadurch erklärt, dass in diesen

Tumoren durch den Mangel an Inhibition des Cyclin E eine erhöhte Progression des Zellzyklus und

eine verstärkte Proliferation stattfindet. Patienten, bei denen weiterhin p27 exprimiert wurde, hatten

ein signifikant besseres Überleben in dieser Studie. Weitere Prädiktoren für das Überleben sind die

histologische Differenzierung und das Vorliegen von Malignität (Infiltration des Tumors in das

umliegende Gewebe) [92]. Die Aggressivität der Kolon-NET könnte mit der schlechten

Differenzierung der Tumoren aufgrund des Verlusts der p27-Expression und des häufigen

Allelverlusts [137,124,56,78] zusammenhängen.

Tumoren mit häufigen Allelverlusten weisen ein aggressiveres Wachstum auf, sind schlechter

differenziert [56,100,160], korrelieren mit einem höheren Proliferationsindex und schlechterem

Überleben [160,137,56,109]. LOH kommt oft bei GEP-NET vor [99,154,160]. Die im Vergleich

recht häufigen (nicht signifikanten) Allelverluste bei Kolon-NET (37%, 10/27) gegenüber den gut

differenzierten Fore-und Midgut-NET (12.5%, 3/24) deuten auf das instabile Genom und das

aggressivere Verhalten dieser Tumorgruppe hin [56,150]. Jedoch wiesen die Kolon-NET keine

hohen LOH-Raten wie andere Tumoren des Hindgut (CRC) auf (50% [99]), und LOH war kein

Prädiktor für schlechteres Überleben trotz kürzerer Nachbeobachtungszeiten (27 Monate vs. 56

Monate) für Patienten mit LOH-positiven Tumoren. Bei Kolon-NET kamen vor allem hohe

Allelverluste am MEN1-Gen vor.

Die noch relativ häufigen Allelverluste am APC und p53-Lokus mit jeweils 11% (3/27) wiesen auf

die Herkunft der Kolon-NET aus dem Hindgut hin, da diese Gene auch beim CRC durch

Allelverlust ausgeschaltet sind [9]. Der Allelverlust von hMSH2 mit 4% (1/27) bestätigt den

geringen Einfluss, den die MSI auf die Pathogenese von Kolon-NET hat. Auch war kein LOH-

Tumor MSI-H.

Die Bedeutung der Inaktivierung des MEN1-Gens ist ungeklärt. Früher wurden Alterationen an

MEN1 vor allem im Foregut [124,135,136] und vorzugsweise durch Mutation beschrieben [64,158].

Bei den Kolon-NET wies der MEN1-Lokus die häufigsten Allelverluste auf (26%, 7/27) und war

signifikant häufiger als in den Fore-und Midgut-NET methyliert (48%, 15/31 vs. 21%, 7/33;

57

p= 0.0430). Auch korrelierte eine MEN1-Methylierung mit CIMP-positiven NET (p=0.0056). In

vorangegangenen Studien an gut differenzierten Fore-und Midgut-NET war eine MEN1-

Methylierung kaum [13] oder gar nicht [30] aufgefallen, zudem zeigte sich kein Zusammenhang

zwischen Promotormethylierung und Expressionsverlust [13]. Das bedeutet zum einen, dass die

Stilllegung des MEN1-Gens allgemein für die Pathogenese von GEP-NET wichtig ist, wie in [64]

bereits berichtet, zum anderen, dass seine genaue Funktion in der Pathogenese von NET

unterschiedlicher Lokalisation noch erforscht werden muss.

Trotz unterschiedlicher Methylierungsraten der untersuchten Gene beeinflussten diese nicht das

Überleben in den zugehörigen Tumorgruppen:

Das Tumorsuppressorgen HIC1 ist dem Tumorsuppressor p53 direkt vorgeschaltet, der für die

Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität der Zelle verantwortlich ist, und erhöht dessen

Aktivität [33]. Entsprechend geht eine Inaktivierung von HIC1 mit maligner Progression eines

Tumors [71] und einem schlechteren Überleben [33] einher. HIC1 wird in verschiedenen Tumoren

häufig methyliert vorgefunden [129] wie auch in Fore-und Midgut-NET ([13] und in dieser Arbeit:

84%, 21/25) und den hier untersuchten Kolon-NET (59%, 16/27). Das methylierte HIC1-Gen

scheint eine zentrale Rolle bei den schlecht differenzierten Kolon-NET einzunehmen.

TIMP3, ein Tumorsuppressorgen, das im Rahmen von Tumorausbreitung und Metastasierung

[2,18,29,172] methyliert vorliegt, war bei den bisher untersuchten gut differenzierten GEP-NET

nicht inaktiviert ([13], hier untersuchte Fore-und Midgut-NET 0/33). Bei den Kolon-NET zeigte

sich erstmals eine geringfügige Methylierung (9%, 3/32), die sich in das Bild der schlecht

differenzierten Kolon-NET einfügt, die meist schon metastasiert sind.

Der cyclinabhängige Kinase-Inhibitor p16 ist ein bedeutendes Tumorsuppressorgen in GEP-NET,

von dem eine hohe Inaktivierung bekannt ist, sei es durch Methylierung in NET (30%[30],

52%[159], PET: 10%[30], 40%[80]), sei es durch Allelverlust [105,113,147]. Die hier gefundene

Methylierung bei den Kolon-NET von 27% (8/30) wiederum zeugt von einer Ausschaltung von p16

gerade in schlechter differenzierten Tumoren [147], die gegenüber den hier untersuchten Fore-und

Midgut-NET signifikant war (0%; p=0.0090). Zudem ist von der p16-Methylierung bekannt, dass

sie mit schlechteren Patientenüberleben korreliert [80] und vor allem in CIMP-positiven CRC

auftritt [161], ähnlich wie hier bei den Kolon-NET, so dass größere Studien nötig sind, um die Rolle

von p16 in NET gründlich aufzuklären.

Eine so häufige Methylierung des DNA-Reparaturgens MGMT, das mutagene oder zytotoxische

Alkyl-Gruppen von der O6- Position des Guanins entfernt [121], wie bei den Kolon-NET (42%,

13/31) war bisher nicht in GEP-NET bekannt ([13], hier untersuchte Fore-und Midgut-NET: 27%),

sondern schien eher bei Kolonkarzinomen, Lungen-und Hirntumoren von Bedeutung zu sein

[13,43]. Dass es in Geweben mit MGMT-Methylierung häufig zu p53- und k-ras-Mutationen (G:C

58

zu A:T-Transitionen) [45,46,118,177] kommt und dass Tumoren mit MGMT-Methylierung eine

schlechtere Prognose haben, da sie häufig Chemotherapeutika-resistent sind [106,122], passt zum

malignen Verhalten der Kolon-NET.

Dass das APC-Gen als dritthäufigstes in Kolon-NET methyliert war (46%, 15/33), bestätigt seine

Rolle bei der Entstehung gastrointestinaler Tumoren [11,47] und GEP-NET [13,55]. Unter der

Annahme, dass die Methylierung von APC gerade im Hindgut höher ausfallen müsste, bedingt

durch eine zentrale Inaktivierung von APC wie bei den CRC [48,135], bleibt es unklar, warum die

Methylierung des APC-Gens bei den Fore-und Midgut-NET häufiger auftrat (64%, 23/36), und

müsste weiter erforscht werden.

Das RASSF1A-Gen, das häufig in verschiedenen Neoplasien [37] wie auch in Fore-und Midgut-

NET [13,80,102,36] durch epigenetische Inaktivierung ausgeschaltet ist, zeigte eine relativ häufige

Methylierung bei den Kolon-NET (45%, 13/29) und korrelierte mit einem CIMP-positiven Status

des Tumors (p=0.0159). Bisher war das Vorkommen einer RASSF1A-Methylierung im Hindgut

[130] fraglich. Da auch die Fore-und Midgut-NET dieser Arbeit (67%, 20/30, p=0.1536) eine hohe

Methylierung aufwiesen, konnte die Bedeutung des Ras-Signalwegs in der Pathogenese von GEP-

NET wiederum gezeigt werden,

MSI und hMLH1-Methylierung sind kaum in NET bekannt [13,89,58]. Dies bestätigten die

geringen Funde von MSI (4% bzw. 0%) und hMLH1-Methylierung (12.5% bzw. 47%, p= 0.0046)

sowohl bei den Kolon-NET als auch bei den Fore-und Midgut-NET. Die hohe hMLH1-

Methylierung bei Fore-und Midgut-NET scheint jedoch keine MSI zu verursachen. Patienten mit

MSI–Tumoren weisen ein besseres Überleben auf, beide Eigenschaften treffen nicht für Kolon-NET

zu [88,132,166,167,170]. Inwieweit die hohen Methylierungsraten von hMLH1 bei den gut

differenzierten Fore-und Midgut-NET mit einer besseren Prognose zusammenhängen, wie in [79]

und 5.7.5.2 gefunden, konnte nicht eindeutig geklärt werden, zumal die Fore-und Midgut-NET

keine MSI aufwiesen. Die hMLH1-Methylierung ohne darauffolgende MSI bei Kolon-NET könnte

im Zuge der höheren allgemeinen Methylierung bei schlechterer Differenzierung erklärt werden

[117]. Es bleibt weiter zu erforschen, wie alle diese Gene das Tumorwachstum und/oder die

Tumorprogression in sporadischen NET beeinflussen.

Kürzlich wurde eine neue TNM-Klassifikation für GEP-NET vorgeschlagen [138,139]. Weitere

Studien werden klären, ob diese Klassifikation einen neuen Überlebens-Prädiktor präsentiert, und

werden die bekannten Prädiktoren ergänzen.

Die hohe Anzahl CIMP-positiver Tumoren bei den Kolon-NET (64.5%, 20/31) zeigte, dass CIMP

auch bei GEP-NET des Hindgut von Bedeutung für die Pathogenese ist, wie dies in einer

vorangegangenen Studie für gut differenzierte GEP-NET des Fore-und Midgut gefunden wurde

(73% [13]). Die hohe Anzahl CIMP-positiver Kolon-NET mag auch Ausdruck der schlechteren

59

Differenzierung sein, da mit Tumorprogression auch die Methylierung von Genen zunimmt (z.B.

bei Magen-Karzinom)[117].

In der vorangegangenen Studie an gut differenzierten Fore-und Midgut hatten CIMP-negative

Tumoren ein besseres Überleben als CIMP-positive Tumoren [13]. Es wurde dort kein anderer

prognostischer Marker gefunden. In der aktuellen Untersuchung beeinflusste CIMP trotz längerer

Nachbeobachtungszeiten für CIMP-negative Tumoren (59 Monate vs. 45 Monate) und mehr

überlebenden Patienten am Ende der Nachbeobachtungszeit (61% vs. 40%) das Überleben weder in

gut noch in schlecht differenzierten NET. Diese gegensätzlichen Aussagen müssen in Zukunft

geklärt werden und könnten aufgrund der geringen Anzahl der untersuchten Tumoren zustande

gekommen sein. Jedoch bestand der Trend CIMP-positiver Kolon-NET zu hohen Ki-67-Werten

(>29%), aber es zeigte sich keine signifikante Korrelation zwischen CIMP-positiven NET und

höheren Ki-67-Werten, wie in [13] (Ki-67>10%) festgestellt.

Abgesehen von dem seltenen Vorkommen schlecht differenzierter Kolon-NET gegenüber

sporadischen CRC, scheint die molekulare Pathogenese beider Tumorarten unterschiedlich zu sein,

obwohl sie bezüglich ihres Wachstums einige Ähnlichkeiten zeigen. Anders als bei den CRC

kommt MSI bei schlecht differenzierten Kolon-NET selten vor. MSI war auch ein seltenes Ereignis

bei den NET unterschiedlicher Lokalisationen [13,59,89].

Kolon-NET, die MSS waren, waren am häufigsten CIMP-positiv (76%, 13/17) und unterschieden

sich zusammen mit den MSI-L-Kolon-NET signifikant von den MSS-CRC (26%, 24/94) bezüglich

des CIMP-Status (p=0.0272). Umgekehrt waren hochgradig mikrosatelliteninstabile CRC sehr stark

CIMP-positiv (77%, 10/13). Schlecht differenzierte GEP-NET des Hindgut werden also,wenn

überhaupt, nicht durch einen Methylierungsphänotyp mikrosatelliteninstabil, wie dies bei den CRC

durch die Methylierung von hMLH1 bekannt ist [62,161,162].

CIMP kam häufig vor, sowohl bei sporadischen CRC als auch bei schlecht differenzierten Kolon-

NET, aber entsprechend der unterschiedlichen molekularen Pathogenese sind entscheidende Gene

unterschiedlich methyliert [13,30,61,62,81]. Diese Arbeit zeigte erstmals den Methylierungsstatus

von tumorassoziierten Genen an einer relevanten Anzahl von schlecht differenzierten Kolon-NET.

Sporadische CRC und schlecht differenzierte NET des Kolon und Rektum unterscheiden sich also

in ihrer Tumorpathogenese trotz des Auftretens von CIMP bei beiden. Bis nicht weitere Studien

durchgeführt werden, die direkt die Methylierungsmuster von Kolon-NET mit denen des

sporadischen CRC vergleichen, bleibt es unsicher, ob CIMP ein erworbener Defekt mit primärer

Ätiologie ist oder ob dieses abnormale Muster der Promotormethylierung ein zufälliger Prozess ist,

nach dem Tumorzellen selektiert werden. MSI kommt normalerweise nur in sporadischen CRC vor

und zeigte sich nicht in GEP-NET unterschiedlicher Lokalisation und Differenzierung.

Entsprechend ihrer schlechten Differenzierung hatten Kolon-NET ein schlechteres Überleben als

60

gut differenzierte Fore-und Midgut-NET. Prädiktor eines schlechten Überlebens war in dieser

Arbeit ein hoher Ki-67-Proliferationsindex.

61

7 Zusammenfassung

Kolon-NET sind seltene und bisher wenig erforschte Neoplasien, die sich durch schnelles

Tumorwachstum und schlechte Differenzierung auszeichnen. Hier wurden sie erstmals in einer

relevanten Anzahl auf ihre genetischen und epigenetischen Charakteristika untersucht und mit

vorliegenden Daten aus CRC und gut differenzierten Fore-und Midgut-NET verglichen. Zudem

wurde eine Survival-Analyse für NET erstellt. MSI schien trotz der Lokalisation im Kolon und

einer relativ häufigen hMLH1-Methylierung nur eine geringfügige Rolle in der Pathogenese von

Kolon-NET zu spielen. Die LOH-Analyse an MEN1, APC, p53 und hMSH2 ergab, dass LOH in der

Pathogenese von Kolon-NET von größerer Bedeutung ist als in Fore-und Midgut- NET, was

entweder mit ihrer schlechten Differenzierung oder der Lokalisation im Hindgut zusammenhing.

Vor allem das MEN1-Gen hob sich durch häufige Allelverluste hervor (26%). Alle mittels MSP

untersuchten Gene waren methyliert und zeigten im Fall von MEN1 und p16 eine signifikant

häufigere Methylierung bei Kolon-NET, so wie HIC1 und hMLH1 eine signifikant häufigere

Methylierung bei Fore-und Midgut-NET aufwiesen. Insgesamt waren HIC1, MEN1 und APC am

häufigsten bei Kolon-NET methyliert, bei Fore-und Midgut-NET waren es HIC1, RASSF1A und

APC. Über die p16-Inaktivierung bestehen uneinheitliche Voruntersuchungen: das in Kolon-NET

gehäufte Auftreten spiegelte sich in dem schlechten Überleben der Tumorgruppe wieder. Der

häufige Ausfall des MEN1-Gens gerade im Hindgut, sowohl durch LOH als auch durch

Methylierung, zeigte dessen allgemeine Bedeutung für die Pathogenese von GEP-NET. Zudem gab

es eine Korrelation zwischen MEN1-Methylierung und CIMP. CIMP wurde insgesamt zu 65% bei

Kolon-NET festgestellt und trat besonders bei den MSS-Kolon-NET (76%) auf, worin sie sich von

den MSS-CRC (26%) signifikant unterschieden. MSI-CRC (77%) wiesen häufig CIMP auf, was

den bereits bekannten Zusammenhang zwischen Methylierung von hMLH1 und MSI bestätigte.

Diesen gab es anscheinend für Kolon-NET nicht in einer relevanten Größe. Letztlich konnte CIMP

doch nicht als prognostischer Faktor für NET dienen, wie früher erwiesen. Diese Position nahm der

hier ebenfalls untersuchte Proliferationsindex Ki-67 ein: ein Wert >2% korrelierte signifikant mit

schlechterem Überleben in der Gesamtgruppe der NET, für Kolon-NET konnte aufgrund der

geringen Tumorzahl nur ein Trend beschrieben werden, der bei Tumoren mit hohen Ki-67-Werten

ein schlechteres Überleben vermuten ließ. Kolon-NET sind also durch schwerwiegende

Pathomechanismen wie häufige LOH-Ereignisse und Methylierungen (CIMP), hohe Ki-67-Werte

und eine schlechte Prognose charakterisiert. Sie unterscheiden sich deutlich von den CRC trotz des

Auftretens von CIMP in beiden Entitäten. In Bezug auf die Fore-und Midgut-NET unterscheiden sie

sich durch hohe Ki-67-Werte und unterschiedliche Methylierungsmuster. Letztere müssten in

weiteren Studien für Kolon-NET untersucht werden, um systematische Veränderungen zu erkennen.

62

63

8 Literaturverzeichnis

1. Ahnert-Hilger G, Grube K, Kvols L et al. (1993). Gastroenteropancreatic neuroendocrine

tumors contain a common set of synaptic vesicle proteins and amino acid transmitters. Eur J Cancer 29A (14) :1982–4

2. Ahonen M, Baker AH, Kahari VM (1998). Adenovirus-mediated gene delivery of tissue

inhibitor of metalloproteinases-3 inhibits invasion and induces apoptosis in melanoma cells. Cancer Res 58:2310-15

3. Ahuja N, Li Q, Mohan AL, Baylin SB, Issa JP (1998). Aging and DNA methylation in

colorectal mucosa and cancer. Cancer Res 58:5489-94

4. Amarapurkar AD, Davies A, Ramage JK, Stangou AJ, Wight DG, Portmann BC (2003). Proliferation of antigen MIB-1 in metastatic carcinoid tumours removed at liver transplantation: relevance to prognosis. Eur J Gastroenterol Hepatol 15 (2): 139-43

5. Andrew A, Kramer B, Rawdon BB (1998). The origin of gut and pancreatic neuroendocrine

(APUD) cells- the last word? J Pathol 186 (2): 117-8

6. Arnold CN, Usadel H, Blum HE (2002). Epigenetik: Bedeutung für Tumorentstehung und Klinik. Dtsch Med Wochenschr 127:1701-03

7. Arnold CN, Blum HE (2005). Kolonkarzinom: Molekulare Marker. Dtsch Med Wochenschr

130 (14): 880-82

8. Arnold CN, Blum HE (2005). Kolonkarzinom: Molekulare Pathogenese und klinische Relevanz. Dtsch Med Wochenschr 130(13): 809 -11

9. Arnold CN, Goel A, Blum HE, Boland CR (2005). Molecular Pathogenesis of Colorectal

Cancer: implications for molecular diagnosis. Cancer 104 (10), 2035-47

10. Arnold CN, Goel A, Boland CR (2003). Role of hMLH1 promoter hypermethylation in drug resistance to 5–fluorouracil in colorectal cancer cell lines. Int J Cancer 106: 66-73

11. Arnold CN, Goel A, Niedzwiecki D, Dowell JM, Wasserman L, Compton C, Mayer RJ,

Bertagnolli MM, Boland CR (2004). APC promoter hypermethylation contributes to the loss of APC expression in colorectal cancers with allelic loss on 5q. Cancer Biol Ther 3: 960-4.

12. Arnold CN, Sosnowski A, Blum HE (2004). Analysis of molecular pathways in

Neuroendocrine Cancers of the gastroenteropancreatic System. Ann NY Acad Sci; 1014: 218-19

13. Arnold CN, Sosnowski A, Schmitt-Gräff A, Arnold R, Blum HE (2007). Analysis of

molecular pathways in sporadic neuroendocrine tumors of the gastro-entero-pancreatic system. Int J Cancer 120 (10): 2157-64

14. Arnold R, Rinke A, Klose KJ, Muller HH, Wied M, Zamzow K, Schmidt C, Schade-

Brittinger C, Barth P, Moll R, Koller M, Unterhalt M, et al (2005). Octreotide versus octreotide plus interferon-alpha in endocrine gastroenteropancreatic tumors: a randomized trial. Clin Gastroenterol Hepatol 3(8): 761-71

64

15. Arnold R (2005). Introduction: Definition, historical aspects, classification, staging, prognosis and therapeutic options. Best Practice and Research Clinical Gastroenterology Vol. 19, (4): 491-505

16. Ashley DJ (1969).The two “hit” and the multiple “hit” theories of carcinogenesis. Br J Cancer

23(2): 313-28

17. Bachman KE, Herman JG, Corn PG, Merlo A, Costello JF, Cavenee WK, Baylin SB, Graff JR (1999). Methylation-associated silencing of the tissue inhibitor of metalloproteinase-3 gene suggests a suppressor role in kidney, brain and other human cancers. Cancer Res 59: 798- 802

18. Baker AH, George SJ, Zaltsman AB, Murphy G, Newby AC (1999). Inhibition of invasion

and induction of apoptotic cell death of cancer cell lines by overexpression of TIMP3. Br J Cancer 79: 1347-55

19. Bartz C, Ziske C, Wiedenmann B, Moelling K (1996). p53 tumour suppressor gene expression

in pancreatic neuroendocrine tumour cells. Gut 38:403-9

20. Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP (1998). Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv Cancer Res 72: 141–196.

21. Baylin SB, Ohm JE (2006). Epigenetic silencing in cancer- a mechanism for early oncogenic

pathway addiction? Nature Reviews Cancer 6 (2), 107-16

22. Bestor TH (1998). The host defence function of genomic methylation patterns. Novartis Found Symp; 214: 187-99; 228-32

23. Bestor TH (1990). DNA methylation: evolution of a bacterial immune function into a

regulator of gene expression and genome structure in higher eukaryotes. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci; 326: 179-87

24. Bird AP, Wolffe AP (1999). Methylation-induced repression- belts, braces, and chromatin.

Cell 99; 451-4

25. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW, Meltzer SJ, Rodriguez- Bigas MA, Fodde R, Ranzani GN, Srivastava S (1998). A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 58 (22): 5248-57

26. Brown DC, Gatter KC (2002). Ki67 protein: the immaculate deception? Histopathology 40

(1), 2-11

27. Capella C, Heitz PU, Höfler H, Solcia E, Klöppel G (1995). Revised classification of neuroendocrine tumours of the lung, pancreas and gut. Virchows Arch 425 (6): 547- 560

28. Capella C, Solcia E, Sobin LH & Arnold A (2000). Endocrine tumours of the colon and

rectum. In: Hamilton SR & Aaltonen LA (eds). Pathology and Genetics. Tumours of the Digestive System. WHO classification of Tumours. IARC Press, Lyon, pp.137-139

65

29. Chambers AF, Matrisian LM (1997). Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis. J Natl Cancer Inst 89: 1260-70

30. Chan AO, Kim SG, Bedeir A, Issa JP, Hamilton SR, Rashid A (2003). CpG island

methylation in carcinoid and pancreatic endocrine tumors. Oncogene 22: 924-34

31. Chapelle A de la (2003). Microsatellite instability. N Engl J Med 349 (3): 209-10

32. Chen RZ, Pettersson U, Beard C et al (1998). DNA Hypomethylation leads to elevated mutation rates. Nature 395 (6697): 89-93

33. Chen WY, Wang DH, Yen RC, Luo J, Gu W, Baylin SB (2005). Tumor suppressor HIC1

directly regulates SIRT1 to modulate p53-dependent DNA-damage responses. Cell 123:437-48

34. Chung DC, Smith AP, Louis DN, Graeme-Cook F, Warshaw AL, Arnold A (1997). Analysis

of the retinoblastoma tumour suppressor gene in pancreatic endocrine tumours. Clin Endocrinol 47: 523-528

35. Ciaccio C (1906). Sur une nouvelle espèce cellulaire dans les glandes de Lieberkühn. CR Soc

Biol 1906; I: 76-78

36. Dammann R, Schagdarsurengin U, Liu L, Otto N, Gimm O, Dralle H, Boehm BO, Pfeifer GP, Hoang-Vu C (2003). Frequent RASSF1A promoter hypermethylation and K-ras mutations in pancreatic carcinoma. Oncogene 22:3806 -12

37. Dammann R, Schagdarsurengin U, Strunnikova M, Rastetter M, Seidel C, Liu L, Tommasi S,

Pfeiffer GP (2003). Epigenetic inactivation of the Ras-association domain family I (RASSF1A) gene and its function in human carcinogenesis. Histol Histopathol 18: 665-77

38. Dong SM, Kim HS, Rha SH, Sidransky D (2001). Promoter hypermethylation of multiple

genes in carcinoma of the uterine cervix. Clin Cancer Res 7: 1982-86

39. Eriksson B, Öberg K, Stridsberg M (2000). Tumor markers in neuroendocrine tumours. Digestion 62 Suppl 1: 33-8

40. Esteller M (2002). CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming

present, a brighter future. Oncogene 21: 5427-40

41. Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG (2001). A Gene Hypermethylation Profile of Human Cancer. Cancer Res 61, 3225-29

42. Esteller M, Fraga MF, Guo M, Garcia-Foncillas J, Hedenfalk I, Godwin AK, Trojan J, Vaurs-

Barrière C, Bignon YJ, Ramus S, Benitez J, Caldes T, Akiyama Y, Yuasa Y, Launonen V, Canal MJ, Rodriguez R, Capella G, Peinado MA, Borg A, Aaltonen LA, Ponder BA, Baylin SB, Herman JG (2001). DNA-Methylation patterns in hereditary human cancers mimic sporadic tumorigenesis. Hum Mol Genet 10(26): 3001-3007

43. Esteller M, Hamilton SR, Burger PC, Baylin SB, Herman JG (1999). Inactivation of the DNA

repair gene O6- methylguanine- DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia. Cancer Res 59: 793 –97

66

44. Esteller M, Levine R, Baylin SB, Ellenson LH, Herman JG (1998). MLH1 promoter hypermethylation is associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas. Oncogene 17: 2413 –17

45. Esteller M, Risques RA, Toyota M, Capella G, Moreno V, Peinado MA, Baylin SB, Herman

JG (2001). Promoter hypermethylation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase is associated with the presence of G:C to A:T transition mutations in p53 in human colorectal tumorigenesis. Cancer Res 61: 4689-92

46. Esteller M, Toyota M, Sanchez-Cespedes M, Capella G, Peinado MA, Watkins DN, Issa JP,

Sidransky D, Baylin SB, Herman JG (2000). Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is associated with G to A mutations in K-ras in colorectal tumorigenesis. Cancer Res 60: 2368-71

47. Fearnhead NS, Britton MP, Bodmer WF (2001). The ABC of APC. Hum Mol Genet 10:721-4

48. Fearon ER, Vogelstein B (1990). A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61:759-

67

49. Feinberg AP & Tycko B (2004). The history of cancer epigenetics. Nat Rev. Cancer 4, 143-53

50. Feinberg AP, Vogelstein B (1983). Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 301 (5895): 89-92

51. Feinberg AP, Vogelstein B (1987). Alterations in DNA methylation in human colon

neoplasia. Semin Surg Oncol 3; 149-51

52. Fenoglio-Preiser CM, Noffsinger AE, Lantz PE, Stemmermann GM, Listrom MB, Rilke FO (1998). Gastrointestinal pathology, an atlas and text, 2nd edn. Lippincott-Raven, Philadelphia

53. Feyrter F (1938). Über diffuse endokrine epitheliale Organe. Barth: Leipzig; 1938

54. Fishel R, Kolodner RD (1995). Identification of mismatch repair genes and their role in the

development of cancer. Curr Opin Genet 5(3): 382 – 395

55. Fujimori M, Ikeda S, Shimizu Y, Okajima M, Asahara T (2001). Accumulation of ß-Catenin protein and mutations in exon 3 of ß-Catenin gene in gastrointestinal carcinoid tumor. Cancer Res ; 61:6656-9

56. Furlan D, Cerutti R, Uccella S, La Rosa S, Rigoli E, Genasetti A, Capella C (2004). Different

molecular profiles characterize well-differentiated endocrine tumors and poorly differentiated endocrine carcinomas of the gastroenteropancreatic tract. Clin Cancer Res 10: 947-57

57. Gerstle JT, Kauffman Jr GL, Koltun WA (1995). The incidence, management, and outcome of

patients with gastrointestinal carcinoids and second primary malignancies. J Am Coll Surg 180 (4): 427-32

58. Ghimenti C, Lonobile A, Campani D, Bevilacqua G, Caligo MA (1999). Microsatellite

instability and allelic losses in neuroendocrine tumors of the GEP system. Int J Oncol 15: 361-66

67

59. Ghimenti C, Tannergard P, Wahlberg S, Liu T, Giulianotti PG, Mosca F, Fornaciari G, Bevilacqua G, Lindblom A, Caligo MA (1999). Microsatellite instability and mismatch repair gene inactivation in sporadic pancreatic and colon tumors. Br J Cancer 80 (1-2): 11-6

60. Goel A, Arnold CN, Boland CR (2001). Multistep progression of colorectal cancer in the

setting of microsatellite instability: new details and novel insights. Gastroenterology 121(6): 1497-1502

61. Goel A, Arnold CN, Niedzwiecki D, Chang DK, Ricciardiello L, Carethers JM, Dowell JM,

Wasserman L, Compton C, Mayer RJ, Bertagnolli MM, Boland CR (2003). Characterization of sporadic colon cancer by patterns of genomic instability. Cancer Res 63: 1608–1614

62. Goel A, Nagasaka T, Arnold CN, Inoue T, Hamilton C, Niedzwiecki D, Compton C, Mayer

RJ, Goldberg R, Bertagnolli MM, Boland RC (2007). The CpG Island Methylator Phenotype and Chromosomal Instability Are Inversely Correlated in Sporadic Colorectal Cancer. Gastroenterology 132 (1):127–138

63. Goelz SE, Vogelstein B, Hamilton SR, Feinberg AP (1985). Hypomethylation of DNA from

benign and malignant human colon neoplasms. Science 228: 187-90

64. Gortz B, Roth J, Krahenmann A, de Krijger RR, Muletta-Feurer S, Rutimann K, Saremaslani P, Speel EJ, Heitz PU, Komminoth P (1999). Mutations and allelic deletions of the MEN1 gene are associated with a subset of sporadic endocrine pancreatic and neuroendocrine tumors and not restricted to foregut neoplasms. Am J Pathol 154:429 -36

65. Gosset A & Masson P (1914). Tumeurs endocrines de l’appendice. Presse Méd 22: 237-40

66. Grabowski P, Griss S, Arnold CN, Hörsch D, Göke R, Arnold R, Heine B, Stein H, Zeitz M,

Scherübl H (2005). Nuclear survivin is a powerful novel prognostic marker in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor disease. Neuroendocrinology 81 (1): 1-9

67. Grabowski P, Schindler I, Anagnostopoulos I, Foss HD, Riecken EO, Mansmann U, Stein H,

Berger G, Buhr HJ, Scherübl H (2001). Neuroendocrine differentiation is a relevant prognostic factor in stage III-IV colorectal cancer. Eur J Gastroenterol Hepatol 13 (4): 405-11

68. Grabowski P, Schönfelder J, Ahnert- Hilger G et al (2002). Expression of neuroendocrine

markers: a signature of human undifferentiated carcinoma of the colon and rectum. Virchows Arch 441 (3):256-63

69. Grabowski P, Sturm I, Schelwies K, Maaser K, Buhr HJ, Dorken B, Zeitz M, Daniel PT,

Scherübl H (2006). Analysis of neuroendocrine differentiation and the p53/BAX pathway in UICC stage III colorectal carcinoma identifies patients with good prognosis. Int J Colorectal Dis 21 (3): 221-30

70. Hawkins N, Norrie M, Cheong K, Mokany E, Ku SL, Meagher A, O’Connor T, Ward R

(2002). CpG island methylation in sporadic colorectal cancers and its relationship to microsatellite instability. Gastroenterology 122:1376–1387

71. Hayashi M, Tokuchi Y, Hashimoto T, Hayashi S, Nishida K, Ishikawa Y, Nakagawa K,

Tsuchiya S, Okumura S, Tsuchiya E (2001). Reduced HIC1 gene expression in non-small cell lung cancer and its clinical significance. Anticancer Res 21 (1B): 535-40

68

72. Herman JG, Latif F, Weng Y et al (1994). Silencing of the VHL tumor suppressor gene by DNA-methylation in renal carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA; 91: 9700-4

73. Herman JG (1999). Hypermethylation of tumor suppressor genes in cancer. Semin Cancer

Biol 9: 359-67

74. Herman JG, Baylin SB (2003). Gene Silencing in Cancer in Association with Promoter Hypermethylation. N Engl J Med 349 (21); 2042-2054

75. Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (1996). Methylation-specific PCR:

A novel PCR- assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA 93: 9821 –26

76. Herman JG, Umar A, Polyak K, Graff JR, Ahuja N, Issa JP, Markowitz S, Willson JK,

Hamilton SR, Kinzler KW, Kane MF, Kolodner RD, Vogelstein B, Kunkel TA, Baylin SB (1998). Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylation in colorectal carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 95(12): 6870- 6875

77. Hoang JM, Cottu PH, Thuille B, Salmon RJ, Thomas G, Hamelin R (1997). BAT-26, an

indicator of the replication error phenotype in colorectal cancers and cell lines. Cancer Res 57: 300-303

78. Hommura F, aka-Akita H, Mishina T, Nishi M, Kojima T, Hiroumi H, Ogura S, Shimizu M,

Katoh H, Kawakami Y (2000). Prognostic significance of p27KIP1 protein and ki-67 growth fraction in non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res 6 (10): 4073-81

79. House MG, Herman JG, Guo MZ, Hooker CM, Schulick RD, Cameron JL, Hruban RH,

Maitra A, Yeo CJ (2003). Prognostic value of hMLH1 methylation and microsatellite instability in pancreatic neuroendocrine neoplasms. Surgery 134: 902-8

80. House MG, Herman JG, Guo MZ, Hooker CM, Schulick RD, Lillemoe KD, Cameron JL,

Hruban RH, Maitra A, Yeo CJ (2003). Aberrant hypermethylation of tumor suppressor genes in pancreatic endocrine neoplasms. Ann Surg 238: 423-31

81. Issa JP (2004). CpG island methylator phenotype in cancer. Nature Rev Cancer 4 (12): 988-93

82. Jain PK (2003). Epigenetics: the role of methylation in the mechanism of action of tumor

suppressor genes. Ann NY Acad Sci 983: 71-83

83. Jansson D, Gould VE, Gooch GT et al (1988). Immunohistochemical analysis of colon carcinomas applying exocrine and neuroendocrine markers. APMIS 96 (12):1129-39

84. Jones PA, Baylin SB (2002). The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev

Genet 3: 415-28

85. Jones PA, Laird PW (1999). Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet 21:163-7

86. Kane MF, Loda M, Gaida GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, Jessup JM, Kolodner R (1997). Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines. Cancer Res 57: 808–811

69

87. Kass SU, Pruss D, Wolffe AP (1997). How does DNA methylation repress transcription? Trends Genet; 13: 444-9

88. Kazama Y, Watanabe T, Kanazawa T, Tanaka J, Tanaka T, Nagawa H (2007). Microsatellite

instability in poorly differentiated adenocarcinomas of the colon and rectum: relationship to clinicopathological features. J Clin Pathol 60 (6):701-4

89. Kidd M, Eick G, Shapiro MD, Camp RL, Mane SM, Modlin IM (2005). Microsatellite

instability and gene mutations in transforming growth factor-β type II receptor are absent in small bowel carcinoid tumors. Cancer 103: 229-36

90. Kim KM, Salovaara R, Mecklin JP, Järvinen HJ, Aaltonen LA, Shibata D (2002). PolyA

deletions in hereditary nonpolyposis colorectal cancer: mutations before a gatekeeper. Am J Pathol 160: 1503 -1506

91. Klöppel G, Anlauf M (2005). Epidemiology, tumour biology and histopathological

classification of neuroendocrine tumours of the gastrointestinal tract. Best Pract and Res Clin Gastroenterol Vol 19 (4):507-17

92. Klöppel G, Perren A, Heitz PU (2004). The gastroenteropancreatic neuroendocrine cell

system and its tumors. The WHO classification. Ann NY Acad Sci 1014:13-27

93. Klöppel G (2003). Neuroendokrine Tumoren des Gastrointestinaltrakts. Der Pathologe 24: 287-96

94. Klöppel H & Heitz PU (1981). Die disseminierten (diffusen) endokrinen Zellen. In: Dörr W &

Seiffert G (Hrsg.) Spezielle pathologische Anatomie Bd. 14. Berlin: Springer, 1981, S. 1097-1135

95. Knudson AG Jr (1971). Mutation and Cancer: A statistical study of Retinoblastoma. Proc Natl

Acad Sci USA 68 (4): 820-23

96. Künzler P, Matsuo K, Schaffner W (1995). Pathological, physiological, and evolutionary aspects of short unstable DNA repeats in the human genome. Biol Chem Hoppe Seyler; 376 (4): 201-211

97. Le Douarin N (1995). From the APUD to the neuroendocrine systems: a developmental

perspective. In: Scherübl H, Hescheler J (eds). The electrophysiology of neuroendocrine cells. CRC Press Boca Raton, New York London Tokyo, pp. 3–10

98. Lee S, Cho NY, Choi M, Yoo EJ, Kim JH, Kang GH (2008). Clinicopathological features of

CpG island methylator phenotype positive colorectal cancer and its adverse prognosis in relation to KRAS/BRAF mutation. Pathol Int 58(2): 104-113

99. Lengauer C, Kinzler KW & Vogelstein B (1997). Genetic instability in colorectal cancers.

Nature; 386 (6625): 623-27

100. Lengauer C, Kinzler KW & Vogelstein B (1998). Genetic instabilities in human cancers. Nature 396 (6712): 643-49

101. Leotlela PD, Jauch A, Holtgreve-Grez H, Thakker RV (2003). Genetics of neuroendocrine

and carcinoid tumours. Endocr Related Cancer 10: 437-50

70

102. Liu L, Broaddus RR, Yao JC, Xie S, White JA, Wu TT, Hamilton SR, Rashid A (2005). Epigenetic alterations in neuroendocrine tumors: methylation of RAS-association domain family 1, isoform A and p16 genes are associated with metastasis. Mod Pathol 18: 1632 -40

103. Lo KW, Kwong J, Hui AB, Chan SY, To KF, Chan AS, Chow LS, Teo PM, Johnson PJ,

Huang DP (2001). High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res 61: 3877-81

104. Lubarsch O (1888). Über den primären Krebs des Ileum nebst Bemerkungen über das

gleichzeitige Vorkommen von Krebs und Tuberkulose. Virchow Arch 3: 280 -317

105. Lubomierski N, Kersting M, Bert T, Muench K, Wulbrand U, Schuermann M, Bartsch D, Simon B (2001). Tumor suppressor genes in the 9p21 gene cluster are selective targets of inactivation in neuroendocrine gastroenteropancreatic tumors. Cancer Res 61: 5905 -5910

106. Ludlum DB (1990). DNA alkylation by the haloethylnitrosureas: nature of modifications

produced and their enzymatic repair or removal. Mutat Res 233:117-126

107. Merlo A, Herman JG, Mao L et al (1995). 5’CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumour suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancers. Nat Med 1: 686- 92

108. Mitelman F, Johansson B & Mertens F (1994). Catalog of Chromosome Aberrations in

Cancer Vol.2 (Wiley-Liss, New York, 1994)

109. Modlin IM, Kidd M, Latich I, Zikusoka MN, Shapiro MD (2005). Current status of gastrointestinal carcinoids. Gastroenterology 128 (6): 1717-51

110. Modlin IM & Sandor A (1997). An analysis of 8305 cases of carcinoid tumors. Cancer 79

(4): 813-29

111. Modlin IM, Lye KD & Kidd M (2003). A 5-decade analysis of 13,715 carcinoid tumors. Cancer 97 (4): 934-959

112. Moyana TN, Xiang J, Senthilselvan A, Kulaga A (2000). The Spectrum of Neuroendocrine

Differentiation Among Gastrointestinal Carcinoids: Importance of Histologic Grading, MIB-1, p53, and bcl-2 Immunoreactivity. Arch Pathol Lab Med 124 (4): 570-6

113. Muscarella P, Melvin WS, Fisher WE, Foor J, Ellison EC, Herman JG, Schirmer WJ,

Hitchcock CL, DeYoung BR, Weghorst CM (1998). Genetic alterations in Gastrinomas and Non-functioning Pancreatic Neuroendocrine Tumors: An Analysis of p16/MTS1 Tumor Suppressor Gene Inactivation. Cancer Res; 58(2): 237-40

114. Nishikura K, Watanabe H, Iwafuchi M, Fujiwara T, Kojima K, Ajioka Y (2003).

Carcinogenesis of gastric endocrine cell carcinoma: analysis of histopathology and p53 gene alteration. Gastric cancer 6: 203 -209

115. Oberg K (2002). Carcinoid tumors: molecular genetics, tumor biology and update of

diagnosis and treatment. Curr Opin Oncol 14 (1): 38- 45

116. Oberndorfer S (1907). Karzinoide Tumouren des Dünndarms. Frankf Z Pathol I: 426-29

71

117. Oue N, Mitani Y, Motoshita J, Matsumura S, Yoshida K, Kuniyasu H, Nakayama H, Yasui W (2006). Accumulation of DNA methylation is associated with tumor stage in gastric cancer. Cancer 106 (6): 1250-9

118. Park TJ, Han SU, Cho YK, Paik WK, Kim YB, Lim IK (2001). Methylation of O6-

methylguanine-DNA methyltransferase gene is associated significantly with K-ras mutation, lymph node invasion, tumor staging, and disease free survival in patients with gastric carcinoma. Cancer 92: 2760-68

119. Parsons R, Myeroff LL, Liu B, Willson JK, Markowitz SD, Kinzler KW, Vogelstein B

(1995). Microsatellite instability and mutations of the transforming growth factor beta type II receptor gene in colorectal cancer. Cancer Res 55: 5548-50

120. Pearse AGE (1969). The cytochemistry and ultrastructure of polypeptide hormone

producing cells of the APUD series and the embryologic, physiologic and pathologic implications of the concept. J Histochem Cytochem 17: 303-13

121. Pegg AE (1990). Mammalian O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase: regulation and

importance in response to alkylating carcinogenic and therapeutic agents. Cancer Res 50: 6119-29

122. Pegg AE, Dolan ME, Moschel RC (1995). Structure, function, and inhibition of O6

alkylguanine-DNA alkyltransferase. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51: 167-223

123. Pelosi G, Bresaola E, Bogina G et al (1996). Endocrine tumors of the pancreas: Ki67 immunoreactivity on paraffin sections is an independent predictor for malignancy: a comparative study with proliferating cell nuclear antigen and progesterone receptor protein immunostaining, mitotic index and other clinicopathologic variables. Hum Pathol 27 (11): 1124-34

124. Perren A, Komminoth P, Heitz PU (2004). Molecular genetics of gastroenteropancreatic

endocrine tumors. Ann NY Acad Sci; 1014:199-208

125. Perren A, Komminoth P, Saremaslani P, Matter C, Feurer S, Lees JA, Heitz PU, Eng C (2000). Mutation and expression analyses reveal differential subcellular compartmentalization of PTEN in endocrine pancreatic tumors compared to normal islet cells. Am J Pathol; 157 (4): 1097-103

126. Perren A, Saremaslani P, Schmid S, Bonvin C, Locher T, Roth J, Heitz PU, Komminoth P

(2003). DPC4/Smad4: no mutations, rare allelic imbalances, and retained protein expression in pancreatic endocrine tumors. Diagn Mol Pathol 12 (4): 181-6

127. Perren A, Schmid S, Locher T, Saremaslani P, Bonvin C, Heitz PU, Komminoth P (2004).

BRAF and endocrine tumors: mutations are frequent in papillary thyreoid carcinomas, rare in endocrine tumors of the gastrointestinal tract and not detected in other endocrine tumors. Endocr Relat Cancer 11 (4): 855-60

128. Perucho M (1996). Cancer of the microsatellite mutator phenotype. Biol Chem 377: 675-84

129. Pinte S, Stankovic-Valentin N, Deltour S, Rood BR, Guerardel C, Leprince D (2004). The

tumor suppressor gene HIC1 (hypermethylated in cancer1) is a sequence-specific

72

transcriptional repressor: definition of its consensus binding sequence and analysis of its DNA binding and repressive properties. J Biol Chem 279: 38313- 24

130. Pizzi S Azzoni C, Bottarelli L, Campanini N, DÁdda T, Pasquali C, Rossi G, Rindi G,

Bordi C (2005). RASSF1A promoter methylation and 3p21.3 loss of heterozygosity are features of foregut, but not midgut and hindgut, malignant endocrine tumours. J Pathol 206 (4): 409-16

131. Pizzi S, Azzoni C, Bassi D, Bottarelli L, Milione M, Bordi C (2003). Genetic alterations in

poorly differentiated endocrine carcinomas of the gastrointestinal tract. Cancer 98: 1273-82

132. Popat S, Hubner R, Houlston RS (2005). Systematic review of MSI and colorectal cancer prognosis. J Clin Oncol 23(3): 609-18

133. Quaedvlieg PF, Visser O, Lamers CB, Janssen-Heijen ML, Taal BG (2001). Epidemiology

and survival in patients with carcinoid disease in The Netherlands. An epidemiological study with 2,391 patients. Ann Oncol 12 (9): 1295-1300

134. Ranson WB (1890). A case of primary carcinoma of the ileum. Lancet 1890; ii: 1020-22

135. Rindi G & Bordi C (2005). Aetiology, molecular pathogenesis and genetics. Best Pract and

ResClin Gastroenterol Vol 19 (4): 519-34

136. Rindi G, Azzoni C, La Rosa S, Klersy C, Paolotti D, Rappel S, Stolte M, Capella C, Bordi C, Solcia E (1999). ECL cell tumor and poorly differentiated endocrine carcinoma of the stomach: prognostic evaluation by pathological analysis. Gastroenterology 116 (3): 532-42

137. Rindi G, DÁdda T, Froio E, Fellegara G, Bordi C (2007). Prognostic factors in

gastrointestinal endocrine tumors. Endocr Pathol 18 (3): 145-9

138. Rindi G, Klöppel G, Alhman H, Caplin M, Couvelard A, de Herder WW, Eriksson B, Falchetti A, Falconi M, Komminoth P, Korner M, Lopes JM, et al (2006). TNM staging of foregut (neuro)endocrine tumors: a consensus proposal including a grading system. Virchows Arch 449 (4): 395-401

139. Rindi G, Klöppel G, Couvelard A, Komminoth P, Korner M, Lopes JM, McNicol AM,

Nilsson O, Perren A, Scarpa A, Scoazec JY, Wiedenmann B (2007). TNM staging of midgut and hindgut (neuro)endocrine tumors: a consensus proposal including a grading system. Virchows Arch 451 (4): 757-62

140. Samowitz WS, Albertsen H, Herrick J, Levin TR, Sweeney C, Murtaugh MA, Wolff RK,

Slattery ML (2005). Evaluation of a large, population based sample supports a CpG island methylator phenotype in colon cancer. Gastroenterology 129: 837–45

141. Samowitz WS, Holden JA, Curtin K, Edwards SL, Walker AR, Lin HA, Robertson MA,

Nichols MF, Gruenthal KM, Lynch BJ, Leppert MF, Slattery ML (2001). Inverse relationship between microsatellite instability and K-ras and p53 gene alterations in colon cancer. Am J Pathol 158: 1517–24

142. Schmitt-Gräff A, Nitschke R, Wiedenmann B (2001). Gastroenteropankreatische

neuroendokrine/ endokrine Tumoren. Der Pathologe 22 (2): 105-13

73

143. Scholzen T, Gerdes J (2000). The Ki67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol 182 (3): 311-22.

144. Serrano J, Goebel SU, Peghini PL, Lubensky IA, Gibril F, Jensen RT (2000). Alterations in

the p16INK4a/CDKN 2A tumor suppressor gene in gastrinomas. J Clin Endocrinol Metab 85: 4146-56

145. Shimizu T, Tanaka S, Haruma K, Kitadai Y, Yoshihara M, Sumii K, Kajiyama G,

Shimamoto F (2000). Growth characteristics of rectal carcinoid tumors. Oncology; 59 (3): 229-37

146. Silverman LR, Demakos EP, Peterson BL et al (2002). Randomized controlled trial of

azacitidine in patients with myelodysplastic syndrome: a study of the cancer and leukaemia group B. J Clin Oncol 20 (10): 2429-40

147. Simon B, Lubomierski N (2004). Implication of the INK4a/ARF locus in

gastroenteropancreatic neuroendocrine tumorigenesis. Ann NY Acad Sci 1014: 284-99

148. Simpkins SB, Bocker T, Swisher EM, Mutch DG, Gersell DJ, Kovatich AJ, Palazzo JP, Fishel R, Goodfellow PJ (1999). MLH1 promoter methylation and gene silencing is the primary cause of microsatellite instability in sporadic endometrial cancers. Hum Mol Genet 8: 661-666

149. Solcia E, Klöppel G, Sobin LH (2000). Histological typing of endocrine tumours. In: 2nd

Ed. WHO International Histological Classification of Tumours. Springer. Berlin

150. Stelow EB, Moskaluk CA, Mills SE (2006). The mismatch repair protein status of colorectal small cell neuroendocrine carcinomas. Am J Surg Pathol 30 (11):1401-04

151. Suzuki H, Itoh F, Toyota M, Kikuchi T, Kakiuchi H, Hinoda Y, Imai K (1999). Distinct

methylation pattern and microsatellite instability in sporadic gastric cancer. Int J Cancer 83: 309-13

152. Taal BG & Visser O (2004). Epidemiology of Neuroendocrine tumours.

Neuroendocrinology 80 suppl1: 3-7

153. Tannapfel A, Vomschloss S, Karhoff D, Markwarth A, Hengge UR, Wittekind C, Arnold R, Horsch (2005). BRAF gene mutations are rare events in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Am J Clin Pathol 123 (2): 256-60

154. Terris B, Meddeb M, Marchio A, Danglot G, Fléjou JF, Belghiti J, Ruszniewski P,

Bernheim A (1998). Comparative genomic hybridization analysis of sporadic neuroendocrine tumors of the digestive system. Genes Chromosomes Cancer 22:50-56

155. Thompson EA, Fleming KA, Evans DJ et al (1990). Gastric endocrine cells share a clonal

origin with other gut cell lineages. Development 110 (2): 477-81

156. Tichansky DS, Cagir B, Borrazzo E et al (2002). Risk of second cancers in patients with colorectal carcinoids. Dis Colon Rectum 45 (1): 91-97

157. Tiling N, Ricke J, Wiedenmann B (2002). Neuroendokrine Tumoren des

gastroenteropankreatischen Systems (GEP-NET). Internist (Berl) 43 (2): 210-18

74

158. Toliat MR, Berger W, Ropers HH, Neuhaus P, Wiedenmann B (1997). Mutations in the MEN1 gene in sporadic neuroendocrine tumours of gastroenteropancreatic system. Lancet 350 (9086): 1223

159. Tönnies H, Stumm M, Wegner RD, Chudoba I, Kalscheuer V, Neitzel H (2001).

Comparative genomic hybridization based strategy for the analysis of different chromosome imbalances detected in conventional cytogenetic diagnostics. Cytogenet Cell Genet 93:188-94

160. Tönnies H, Toliat MR, Ramel C et al (2001). Analysis of sporadic neuroendocrine tumours

of the enteropancreatic system by comparative genomic hybridization. Gut 48 (4): 536-41

161. Toyota M, Ahuja N, Ohe-Toyota M, Herman JG, Baylin SB, Issa JP (1999). CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Procl Natl Acad Sci USA 96 (15): 8681-86

162. Toyota M, Issa JP (1999). CpG island methylator phenotypes in aging and cancer. Semin

Cancer Biol 9(5):349-357

163. Toyota M, Ohe-Toyota M, Ahuja N, Issa JP (2000). Distinct genetic profiles in colorectal tumors with or without the CpG island methylator phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A 97:710–15

164. Vogelsang H. & Siewert JR (2005). Endocrine tumours of the hindgut. Best Pract and Res

Clin Gastroenterol Vol 19 (5): 739-51

165. Waki T, Tamura G, Sato M, Motoyama T (2003). Age-related methylation of tumor suppressor and tumor-related genes: an analysis of autopsy samples. Oncogene 22: 4128-33

166. Watanabe T, Kobunai T, Toda E, Yamamoto Y, Kanazawa T, Kazama Y, Tanaka J, Tanaka

T, Konishi T, Okayama Y, Sugimoto Y, Oka T, Sasaki S, Muto T, Nagawa H (2006). Distal colorectal cancers with microsatellite instability (MSI) display distinct gene expression profiles that are different from proximal MSI cancers. Cancer Res 66(20): 9804-8

167. Watanabe T, Wu TT, Catalano PJ, et al (2001). Molecular predictors of survival after

adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med 344:1196–206

168. Weckstrom P, Hedrum A, Makridis C et al (1996). Midgut carcinoids and solid carcinomas of the intestine: differences in endocrine markers and p53 mutations. Endocrine Pathol 7: 273 -79

169. Weinstein IB (2002). Cancer. Addiction to oncogenes –the Achilles heel of cancer. Science

297: 63-64

170. Westra JL, Plukker JT, Buys CH, Hofstra RM (2004). Genetic alterations in locally advanced stage II/III colon cancer: a search for prognostic markers. Clin Colorectal Cancer 4(4): 252-9.

171. Wick MR (2000). Neuroendocrine neoplasia. Current concepts. Am J Clin Pathol 113

(3):331–5

172. Wild A, Ramaswamy A, Langer P, Celik I, Fendrich V, Chaloupka B, Simon B, Bartsch DK (2003). Frequent methylation-associated silencing of the tissue inhibitor of metalloproteinase 3 gene in pancreatic endocrine tumors. J Clin Endocrinol Metab 88: 1367-73

75

173. Williams ED & Sandler M (1963). The classification of carcinoid tumours. Lancet. 2;1 (7275): 238-9

174. Williams ED (1980). Histological Typing of Endocrine Tumours. International Histological

Classification of Tumours. Geneva: World Health Organization; 1980

175. Yoshimoto K, Iwahana H, Fukuda A, Sano T, Katsuragi K, Kinoshita M, Saito S, Itakura M (1992). Ras mutations in endocrine tumors: mutation detection by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism. Cancer Res 83:1057-62

176. Zablewska B, Bylund L, Mandic SA, Fromaget M, Gaudray P, Weber G (2003).

Transkription regulation of the multiple endocrine neoplasia type 1 gene in human and mouse. J Clin Endocrinol Metab 88: 3845-51

177. Zhang YJ, Chen Y, Ahsan H, Lunn RM, Lee PH, Chen CJ, Santella RM (2003). Inactivation

of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation and its relationship to aflatoxin B1-DNA adducts and p53 mutation in hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 103:440-44

178. Zhou XP, Hoang JM, Cottu P, Thomas G, Hamelin R (1997). Allelic profiles of

mononucleotide repeat microsatellites in control individuals and in colorectal tumors with and without replication errors. Oncogene 15: 1713-18

76

77

9 Anhang

Tab. A Kolon-NET A1

Nummer Jr.Nummer p16 HIC 1 APC hMLH1 RASSF1A MEN 1 TIMP3 MGMT CIMP No of Met.Loc 1 cc 1 1 0 0 0 1 0 0 1 CIMP 3 2 cc 2 - 1 1 0 1 0 1 0 CIMP 4 3 cc 3 0 0 0 0 0 0 0 0 N 0 4 cc 4 0 - 1 0 - 0 0 - low 1 5 cc 5 0 1 0 0 0 1 0 1 CIMP 3 6 cc 6 0 0 0 0 0 0 0 0 N 0 7 cc 7 - - 0 0 0 0 0 0 N 0 8 cc SG 6954 - 1 1 1 0 0 0 0 CIMP 3 9 cc K 130/05 0 1 1 0 1 0 0 0 CIMP 3

10 cc K 13/05 1 0 1 0 0 0 0 1 CIMP 3

11 cc K 8/05 0 0 1 0 1 0 0 0 low 2

12 cc K 47/04 0 1 1 0 0 1 0 1 CIMP 4

13 cc K 46/04 1 1 1 0 0 1 0 0 CIMP 4

14 cc K 135/03 0 1 0 0 1 1 0 0 CIMP 3

15 cc K 121/03 0 0 0 0 1 1 0 1 CIMP 3

16 cc K 19/02 0 1 0 0 0 1 0 1 CIMP 3

18 cc K 168/85 0 - 0 0 - 1 0 0 low 1

19 cc K 135/84 1 1 0 0 0 1 0 1 CIMP 4 20 cc 03 16982 A-C 0 0 0 0 0 1 0 0 low 1 12T 6079/88 0 1 0 0 1 0 0 0 low 2 13T 6800/91 0 1 1 0 1 1 0 0 CIMP 4 14T 7012/85 0 0 1 0 1 1 0 1 CIMP 4 15T 10793/88 0 0 1 0 0 1 0 1 CIMP 3 16T 12596/94 0 1 1 0 1 1 1 1 CIMP 6

78

Nummer Jr.Nummer p16 HIC 1 APC hMLH1 RASSF1A MEN 1 TIMP3 MGMT CIMP No of Met.Loc 17T S 298/86 1 1 0 1 1 0 0 0 CIMP 4 18T 8000/95 0 - 1 0 - - - - na 1 19T 11197/93 1 1 0 0 1 1 0 0 CIMP 4 20T 5389/96 undiff 1 0 0 0 0 0 0 0 low 1 21 cc SG 10292/96 1 1 1 0 0 0 0 1 CIMP 4 22 cc SG 1338/98 0 - 0 0 0 - 0 0 N 0 23 cc SG 28624/00 - - 0 - - - 0 0 na 0 24 cc SG 18231/01 0 - - - - 0 - - na 0 25 cc SG 23036/01 0 1 1 1 1 1 1 1 CIMP 7 26 cc SG 29098/03 0 0 0 1 0 0 0 1 low 2

Tab. A1: MSP-Analyse der Kolon-NET

79

A2

Nummer Jr.Nummer MSI LOH Ki-67 (%) follow-up (months) Gender Age Location Histologie 1 cc 1 low 0 65 - - - - schlecht differenziert 2 cc 2 stable 0 70 - - - - schlecht differenziert 3 cc 3 - - 85 - - - - schlecht differenziert 4 cc 4 - - 90 - - - - schlecht differenziert 5 cc 5 - 0 50 - - - - schlecht differenziert 6 cc 6 - 0 60 - - - - schlecht differenziert 7 cc 7 low LOH 80 - - - - schlecht differenziert 8 cc SG 6954 stable 0 60 99 m 74 C.asc. schlecht differenziert 9 cc K 130/05 - LOH 50 - - - - schlecht differenziert

10 cc K 13/05 - 0 50 15 m 71 - schlecht differenziert

11 cc K 8/05 low 0 40 18 m 67 - schlecht differenziert

12 cc K 47/04 stable LOH 5 27 w 77 - schlecht differenziert

13 cc K 46/04 low LOH 50 8 w 54 - schlecht differenziert

14 cc K 135/03 low LOH 3 8 w 62 - schlecht differenziert

15 cc K 121/03 stable MSI 80 2 m 53 - schlecht differenziert

16 cc K 19/02 stable 0 50 - w 57 - schlecht differenziert

18 cc K 168/85 high 0 <2 - w 70 - schlecht differenziert

19 cc K 135/84 stable LOH 20 - m 70 - schlecht differenziert 20 cc 03 16982 A-C stable 0 50 40 w 60 - schlecht differenziert 12T 6079/88 stable LOH 90 8 w 81 - schlecht differenziert 13T 6800/91 stable 0 50 13 m 69 - schlecht differenziert 14T 7012/85 stable LOH 90 57 m 49 - schlecht differenziert 15T 10793/88 stable LOH 30 19 m 32 - schlecht differenziert 16T 12596/94 stable 0 50 13 m 29 - schlecht differenziert 17T S 298/86 stable 0 60 0 w 63 - schlecht differenziert 18T 8000/95 stable 0 50 7 m 57 - schlecht differenziert 19T 11197/93 stable 0 50 14 m 32 - schlecht differenziert 20T 5389/96 undiff stable 0 <2 6 m 55 - schlecht differenziert

80

Nummer Jr.Nummer MSI LOH Ki-67 (%) follow-up (months) Gender Age Location Histologie 21 cc SG 10292/96 stable - 75 2 m 64 Colon schlecht differenziert 22 cc SG 1338/98 stable - 75 1 w 92 Colon schlecht differenziert 23 cc SG 28624/00 stable - 85 68 w 58 Colon schlecht differenziert 24 cc SG 18231/01 - - 45 62 m 54 Colon schlecht differenziert 25 cc SG 23036/01 - LOH 45 46 w 85 Colon schlecht differenziert 26 cc SG 29098/03 - - 65 38 m 56 Rektumpolyp schlecht differenziert

Tab. A2: MSI- und LOH-Analyse, Ki67-Marker und Patientendaten Tab. B Fore- und Midgut-NET B1

Jr. Nummer Organ diagnosis CIMP behavior ki-67 follow up (years) cause of death BAT25 BAT26 D2S123 D5S346

26/2001 Pankreas glucagonoma + malignant >20 <1 tu - - - -

9020/2000 Lebermetastase Vipoma - malignant 2-10 >4 survived - - - -

7078/1998 Magen gastrinoma - benign 2-10 >4 survived - - LOH -

7008/1998 Pankreas non functional + benign 2-10 >6 survived - na

6107/1997 Niere non functional + benign <2 >7 survived - -

6015/1997 Leber gastrinoma + malignant <2 <1 tu MSI -

5084/1996 Papille non functional - malignant >20 <1 tu - - - -

7029/1998 LK, Lebermet. insulinoma + malignant <2 1 tu - - - -

1088/1992 Pankreas non functional - malignant >10 1 tu - -

348/1991 Duodenum non functional - malignant <2 1 tu MSI na

10132/1990 Dünndarm non functional - malignant >20 1 tu na -

10079/1990 Pankreas gastrinoma - benign 2-10 3 tu - -

10072/1990 Dünndarm non functional + benign <2 3 tu - - - -

16939/88 Pankreas-schwanz insulinoma - benign <2 16 survived - - - -

2761/88 Lig hepduod Gastrinom Met. - benign <2 16 survived - - - -

9056/95 Pankreas insulinoma + benign <2 >5 survived - - - -

3976/96 Pankreas-schwanz Vipoma + benign 10-20 >8 survived - - - -

894/97 Leber gastrinoma - benign <2 >5 survived - - - -

2899/98 Pankreas insulinoma + malignant 2-10 1 tu - - - -

7069/1998 LK non functional + malignant <10% 3 tu - - - LOH

81

Jr. Nummer Organ diagnosis CIMP behavior ki-67 follow up (years) cause of death BAT25 BAT26 D2S123 D5S346 6128/1997 Ileum non functional - benign <2% 7 survived - - 6135/1997 LK non functional + benign <2% 7 survived - na 6109/1997 Ileum carcinoid syndrome - benign <2% 7 survived - - - - 5008/1996 Ileum carcinoid syndrome + benign <2% 6 survived - - - - 2105/1993 Duodenum carcinoid syndrome - benign <2% 6 survived - na - - 2047/1993 Duodenum non functional - benign <2% 7 survived - - - - 1153/1992 Appendix non functional + benign <2% 10 survived - - na - 348/1991 Duodenum non functional + benign <2% 8 survived - - - -

10132/1990 Dünndarm non functional - malignant 2-30% 3 tu MSI na 10083/1990 Dünndarm non functional - malignant 2-30% 3 tu na - 10082/1990 Dünndarm non functional + malignant 2-30% 2 tu - - - - 10076/1990 Ileum carcinoid syndrome + benign <2% 10 survived - - - - 10075/1990 Ileum carcinoid syndrome + benign <2% 10 survived - - - - 10072/1990 Dünndarm non functional - benign <2% 9 survived - MSI 9988/1990 Lebermet. carcinoid syndrome + benign <2% 3 tu - - - - 9534/1990 Lebermet. carcinoid syndrome - benign <2% 5 survived - - 9525/1990 Lebermet. non functional - benign <2% 8 survived - - na - 9479/1990 Ileum carcinoid syndrome - benign <2% 12 survived - -

Tab. B1: Fore-und Midgut-NET Überlebensdaten, Ki67-Marker, MSI-Marker

82

B2 Jr. Nummer Organ diagnosis D17S250 MSS MSI-L MSI-H D11S956 D11S913 PYGM

26/2001 Pankreas glucagonoma - + na na N

9020/2000 Lebermetastase Vipoma - + N N N

7078/1998 Magen gastrinoma - + N N N

7008/1998 Pankreas non functional +

6107/1997 Niere non functional +

6015/1997 Leber gastrinoma +

5084/1996 Papille non functional + na N N

7029/1998 LK, Lebermet. insulinoma - +

1088/1992 Pankreas non functional +

348/1991 Duodenum non functional +

10132/1990 Dünndarm non functional +

10079/1990 Pankreas gastrinoma +

10072/1990 Dünndarm non functional - + N N N

16939/88 Pankreasschwanz insulinoma - + N N N

2761/88 Lig hepduod Gastrinom Met. - + N N N

9056/95 Pankreas insulinoma - + N N N

3976/96 Pankreasschwanz Vipoma - + N N N

894/97 Leber gastrinoma - + N N N

2899/98 Pankreas insulinoma - + N N N

7069/1998 LK non functional LOH + na na na

6128/1997 Ileum non functional + 6135/1997 LK non functional + 6109/1997 Ileum carcinoid syndrome - + na na na

5008/1996 Ileum carcinoid syndrome - + na na na

2105/1993 Duodenum carcinoid syndrome + na na na

2047/1993 Duodenum non functional - + N N N 1153/1992 Appendix non functional - + na N N 348/1991 Duodenum non functional - + N N N

10132/1990 Dünndarm non functional + 10083/1990 Dünndarm non functional +

83

Jr. Nummer Organ diagnosis D17S250 MSS MSI-L MSI-H D11S956 D11S913 PYGM

10082/1990 Dünndarm non functional LOH + na na na

10076/1990 Ileum carcinoid syndrome - + na N na

10075/1990 Ileum carcinoid syndrome - + N N na

10072/1990 Dünndarm non functional + 9988/1990 Lebermet. carcinoid syndrome - + N N N 9534/1990 Lebermet. carcinoid syndrome + 9525/1990 Lebermet. non functional _ + na na

9479/1990 Ileum carcinoid syndrome + Tab.B2: Fore-und Midgut-NET MSI- und LOH-Marker

84

B3 Jr. Nummer Organ diagnosis hMLH1 Region C p16 APC MGMT MEN1 Prom. MEN1 Exon2 HIC1 RASSF1a TIMP3 CIMP

26/2001 Pankreas glucagonoma u u m u u u u/m u/m u 3

9020/2000 Lebermetastase Vipoma u u m u u u na na u 1

7078/1998 Magen gastrinoma u u m u u u na u u 1

7008/1998 Pankreas non functional m u m u na u m u u 3

6107/1997 Niere non functional u u m u u u m u/m u 3

6015/1997 Leber gastrinoma m u u na u u m m u 3

5084/1996 Papille non functional u u m u na u na m na 2

7029/1998 LK,Lebermet. insulinoma m u u m u u na m u 3

1088/1992 Pankreas non functional u u u u u u m u/m u 2

348/1991 Duodenum non functional m u u u u u m u u 2

10132/1990 Dünndarm non functional u na 2x m na na na m na u 2

10079/1990 Pankreas gastrinoma m na 2x u u u na na m u 2

10072/1990 Dünndarm non functional m u m m m u m u/m u 6

16939/88 Pankreas-schwanz insulinoma u na 2x m na na na na u u 1

2761/88 Lig hepduod Gastrinom Met. u na na 2x na na na na na na 0

9056/95 Pankreas insulinoma m u m m u u u/m u/m u 5

3976/96 Pankreas-schwanz Vipoma m u m m u m m m u 6

894/97 Leber gastrinoma na 2x u u na u na na na na 0

2899/98 Pankreas insulinoma m na u m u u u u/m u 3

7069/1998 LK non functional u u m m u u m m u 4 6128/1997 Ileum non functional u u u u u u m u/m u 2 6135/1997 LK non functional u u m u m m u u/m u 4 6109/1997 Ileum carcinoid syndrome u u m u u u u u u 1 5008/1996 Ileum carcinoid syndrome u u m m u u m u/m u 4 2105/1993 Duodenum carcinoid syndrome u u u u u u m m u 2 2047/1993 Duodenum non functional u u m u u u u/m na u 2 1153/1992 Appendix non functional u u m u u m na m u 3 348/1991 Duodenum non functional m u m u u u m u/m u 4

10132/1990 Dünndarm non functional m u u u u u m u u 2 10083/1990 Dünndarm non functional u na 2x m na na na m na u 2

85

Jr. Nummer Organ diagnosis hMLH1 region C p16 APC MGMT MEN1 Prom. MEN1 Exon2 HIC1 RASSF1a TIMP3 CIMP

10082/1990 Dünndarm non functional m u m u u u m u u 3 10076/1990 Ileum carcinoid syndrome m u m na u m u u u 3 10075/1990 Ileum carcinoid syndr m u u u u u m m u 3 10072/1990 Dünndarm non functional m u u u u u na na u 1 9988/1990 Lebermet. carcinoid syndrome m u m m m u m u/m u 6 9534/1990 Lebermet. carcinoid syndrome m na 2x u u u u na u u 1 9525/1990 Lebermet. non functional u na m u u m na u na 2 9479/1990 Ileum carcinoid syndrome na 2x na m na 2x na na na na na 1

Tab.B3: Fore- und Midgut-NET : MSP-Analyse und Häufigkeit der Methylierung (CIMP)

86

Tab. C: CRC

ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 1 1 1 1 1 1 1 CIMP 6 H F 76 P muc or poor B 2 1 1 1 1 1 1 CIMP 6 H . 3 0 1 1 1 1 1 CIMP 5 L F 67 P wel B 4 1 1 0 1 1 1 CIMP 5 H . 5 1 1 0 1 1 1 CIMP 5 H . 6 0 1 1 1 0 1 CIMP 4 S M 35 7 0 1 1 1 1 0 CIMP 4 L M 78 D mod C 8 0 1 1 0 1 1 CIMP 4 L F 65 P mod A 9 1 1 0 0 1 1 CIMP 4 H . 10 0 1 0 1 1 1 CIMP 4 L M 67 D mod B 11 0 0 1 1 1 1 CIMP 4 S F 45 P mod A 12 0 1 0 1 1 1 CIMP 4 H . 13 0 0 1 1 1 0 CIMP 3 S F 63 P mod C 14 0 0 1 1 0 1 CIMP 3 H M 65 D mod B 15 0 1 0 1 1 0 CIMP 3 L M 70 P wel A 16 0 1 0 1 1 0 CIMP 3 S M 81 P wel D 17 0 1 0 0 1 1 CIMP 3 S M 59 D muc or poor C 18 0 1 0 0 1 1 CIMP 3 S M 64 P mod B 19 0 0 1 1 1 0 CIMP 3 L F 61 D mod C 20 0 1 0 1 1 0 CIMP 3 S F 69 D mod C 21 0 0 0 1 1 1 CIMP 3 S M 74 P wel B 22 1 0 1 0 1 0 CIMP 3 H . 23 0 1 0 1 1 0 CIMP 3 S F 59 D muc or poor D 24 0 0 1 0 1 0 CIMP 2 L F 60 D wel D 25 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 S M 23 D mod B 26 0 0 1 0 1 0 CIMP 2 S F 52 D mod C 27 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S M 60 D mod B 28 0 1 0 1 0 0 CIMP 2 S F 75 P muc or poor D 29 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S F 74 D muc or poor D

87

ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 30 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 S M 68 P mod D 31 0 1 0 0 0 1 CIMP 2 S M 64 D mod D 32 0 1 0 1 0 0 CIMP 2 S M 79 P mod D 33 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 L F 74 D wel C 34 0 1 1 0 0 0 CIMP 2 S F 60 P mod C 35 0 0 1 1 0 0 CIMP 2 L F 65 P wel A 36 0 0 0 1 1 0 CIMP 2 S M 69 P wel C 37 0 0 0 1 1 0 CIMP 2 L M 75 D wel C 38 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 S F 88 P muc or poor C 39 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S . 40 0 1 0 0 1 0 CIMP 2 S . 41 1 1 0 0 0 0 CIMP 2 H . 42 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S . 43 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 S M 64 D wel C 44 0 0 0 0 1 1 CIMP 2 H . 45 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 54 D muc or poor D 46 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 69 D mod C 47 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 58 D mod D 48 0 0 0 0 0 1 N 1 S F 63 D mod C 49 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 64 D mod C 50 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 48 D mod D 51 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 65 P mod B 52 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 65 P mod B 53 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 53 D mod C 54 0 0 0 0 0 1 N 1 L F 58 D mod D 55 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 63 D mod B 56 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 65 D mod A 57 0 0 0 0 0 1 N 1 L F 73 D mod B 58 0 0 0 1 0 0 N 1 S M 55 D mod B 59 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 25 D mod B

88

ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 60 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 53 D mod B 61 0 0 0 0 0 1 N 1 S F 45 D mod D 62 0 0 0 0 0 1 N 1 H M 47 P mod D 63 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 64 P mod C 64 0 0 0 0 1 0 N 1 S M 63 D mod B 65 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 69 D mod C 66 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 51 D mod C 67 0 0 0 0 1 0 N 1 S F 48 D mod D 68 0 0 0 0 1 0 N 1 L M 74 D mod D 69 0 0 0 0 1 0 N 1 S F 75 D mod C 70 0 0 0 1 0 0 N 1 L F 74 P mod A 71 0 0 1 0 0 0 N 1 S F 75 D wel A 72 0 1 0 0 0 0 N 1 S F 86 P mod C 73 0 0 0 0 1 0 N 1 S M 67 D mod B 74 0 0 0 0 0 1 N 1 S F 58 P mod D 75 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 59 P mod D 76 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 72 D mod A 77 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 73 P mod A 78 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 54 D mod B 79 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 64 D mod C 80 0 0 0 1 0 0 N 1 L F 81 D muc or poor C 81 0 0 1 0 0 0 N 1 L F 76 P mod C 82 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 57 D mod A 83 0 1 0 0 0 0 N 1 S F 74 P mod C 84 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 45 D mod C 85 0 0 0 0 0 1 N 1 S M 64 P mod B 86 0 0 0 0 1 0 N 1 S M 77 D wel C 87 0 0 0 0 0 1 N 1 L F 82 P wel A 88 0 0 0 0 0 1 N 1 H M 37 P mod B 89 0 0 0 0 0 1 N 1 H M 56 D mod A

89

ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 90 0 0 1 0 0 0 N 1 L F 76 P mod D 91 0 0 0 0 1 0 N 1 S F 79 D mod B 92 0 0 1 0 0 0 N 1 S M 69 P mod C 93 0 0 1 0 0 0 N 1 L F 56 P wel A 94 0 0 0 0 1 0 N 1 S M 85 D mod C 95 0 1 0 0 0 0 N 1 S M 70 P mod B 96 0 0 0 0 0 1 N 1 L M 67 D wel D 97 0 1 0 0 0 0 N 1 S F 57 D wel C 98 0 0 0 0 0 1 N 1 L F 60 P mod D 99 0 0 0 0 1 0 N 1 L M 67 P mod A

100 0 1 0 0 0 0 N 1 S F 69 D wel B 101 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 61 D mod D 102 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 60 D wel B 103 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 46 D mod B 104 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 70 D mod C 105 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 73 D wel A 106 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 57 D mod D 107 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 67 P muc or poor D 108 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 70 D mod B 109 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 63 P mod C 110 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 56 D mod C 111 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 62 P mod A 112 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 62 D mod D 113 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 34 D wel A 114 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 47 D mod D 115 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 52 P mod B 116 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 59 D mod D 117 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 63 D mod B 118 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 69 P mod D 119 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 81 D mod A

90

ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 120 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 65 D wel A 121 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 41 D mod D 122 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 67 D mod B 123 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 73 P mod D 124 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 73 D mod C 125 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 55 D mod B 126 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 59 D mod B 127 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 77 D mod B 128 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 42 D mod C 129 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 44 D wel A 130 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 82 D mod C 131 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 53 D mod D 132 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 42 D mod C 133 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 44 P mod C 134 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 45 D mod C 135 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 65 D mod A

Tab. C: Kolorektale Karzinome: MSP-Analyse, CIMP-Status, MSI-Status, Patientendaten,Histologie und Dukes Stage

91

ID No MLH1 P16 P14 MINT1 MINT2 MINT31 CIMP or N No of Met Loci MSI Gender Age Location Histology Dukes Stage 136 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 62 D mod D 137 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 56 D mod B 138 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 60 D mod C 139 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 68 D mod B 140 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 71 D mod C 141 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 70 P mod C 142 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 66 D wel A 143 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 61 D mod C 144 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 85 D mod C 145 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 43 P muc or poor C 146 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 72 D mod B 147 0 0 0 0 0 0 N 0 L M 55 D mod C 148 0 0 0 0 0 0 N 0 L F 54 P muc or poor C 149 0 0 0 0 0 0 N 0 S F 63 D mod C 150 0 0 0 0 0 0 N 0 S M 73 D mod B

Tab. C: Kolorektale Karzinome: MSP-Analyse, CIMP-Status, MSI-Status, Patientendaten,Histologie und Dukes Stage

92

Tab.I Kolon-NET

Überlebensmonate

(surv)

% der Überlebenden

(survival)

% der Verstorbenen

(failure)

Survival Standard Error Number Failed Number Left

0.000 1.0000 0 0 0 23

0.000 0.9565 0.0435 0.0425 1 22

1.000 0.9130 0.0870 0.0588 2 21

2.000 * * * 3 20

2.000 0.8261 0.1739 0.0790 4 19

6.000 0.7826 0.2174 0.0860 5 18

7.000 0.7391 0.2609 0.0916 6 17

8.000 * * * 7 16

8.000 0.6522 0.3478 0.0993 8 15

8.000 * * * 8 14

13.000 * * * 9 13

13.000 0.5590 0.4410 0.1047 10 12

14.000 0.5124 0.4876 0.1058 11 11

15.000 * * * 11 10

18.000 * * * 11 9

19.000 0.4555 0.5445 0.1083 12 8

27.000 * * * 12 7

38.000 * * * 12 6

40.000 * * * 12 5

46.000 0.3644 0.6356 0.1189 13 4

57.000 0.2733 0.7267 0.1191 14 3

62.000 * * * 14 2

68.000 * * * 14 1

99.000 * * * 14 0

93

Fore- und Midgut-NET Überlebensmonate (surv) % der Überlebenden (survival) % der Verstorbenen (failure) Survival Standard Error Number failed Number left

0.000 1.000 0 0 0 38

12.000 * * * 1 37

12.000 * * * 2 36

12.000 * * * 3 35

12.000 * * * 4 34

12.000 * * * 5 33

12.000 * * * 6 32

12.000 * * * 7 31

12.000 0.7895 0.2105 0.0661 8 30

24.000 0.7632 0.2368 0.0690 9 29

36.000 * * * 10 28

36.000 * * * 11 27

36.000 * * * 12 26

36.000 * * * 13 25

36.000 * * * 14 24

36.000 0.6053 0.3947 0.0793 15 23

48.000 * * * 15 22

48.000 * * * 15 21

60.000 * * * 15 20

60.000 * * * 15 19

60.000 * * * 15 18

72.000 * * * 15 17

72.000 * * * 15 16

72.000 * * * 15 15

84.000 * * * 15 14

84.000 * * * 15 13

84.000 * * * 15 12

94

Überlebensmonate

(surv)

% der Überlebenden

(survival)

% der Verstorbenen

(failure)

Survival Standard Error Number failed Number left

84.000 * * * 15 11

84.000 * * * 15 10

96.000 * * * 15 9

96.000 * * * 15 8

96.000 * * * 15 7

108.000 * * * 15 6

120.000 * * * 15 5

120.000 * * * 15 4

120.000 * * * 15 3

144.000 * * * 15 2

192.000 * * * 15 1

192.000 * * * 15 0

Tab.I Fore- und Midgut-NET Tab.II LOH-negative Tumoren

Überlebensmonate

(surv)

% der Überlebenden (survival) % der Verstorbenen

(failure)


0.000 1.0000 0 0 0 25

0.000 0.9600 0.0400 0.0392 1 24

2.000 0.9200 0.0800 0.0543 2 23

6.000 0.8800 0.1200 0.0650 3 22

7.000 0.8400 0.1600 0.0733 4 21

12.000 * * * 5 20

12.000 0.7600 0.2400 0.0854 6 19

13.000 * * * 7 18

13.000 0.6800 0.3200 0.0933 8 17

95

Überlebensmonate

(surv)

% der Überlebenden (survival) % der Verstorbenen

(failure)


14.000 0.6400 0.3600 0.0960 9 16

15.000 * * * 9 15

18.000 * * * 9 14

36.000 * * * 10 13

36.000 0.5486 0.4514 0.1018 11 12

40.000 * * * 11 11

48.000 * * * 11 10

60.000 * * * 11 9

60.000 * * * 11 8

84.000 * * * 11 7

96.000 * * * 11 6

96.000 * * * 11 5

99.000 * * * 11 4

120.000 * * * 11 3

120.000 * * * 11 2

192.000 * * * 11 1

192.000 * * * 11 0

Tab.II LOH-negative Tumoren

96

Tab.II LOH-positive Tumoren

Überlebensmonate (surv) % der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number failed Number left

0.000 1.0000 0 0 0 9

8.000 * * * 1 8

8.000 0.7778 0.2222 0.1386 2 7

8.000 * * * 2 6

19.000 0.6481 0.3519 0.1653 3 5

24.000 0.5185 0.4815 0.1759 4 4

27.000 * * * 4 3

46.000 0.3457 0.6543 0.1835 5 2

48.000 * * * 5 1

57.000 0 1.0000 0 6 0

Tab. III CIMP- negative Tumoren

Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen

(Failure)


0.000 1.0000 0 0 0 26

1.000 0.9615 0.0385 0.0377 1 25

6.000 0.9231 0.0769 0.0523 2 24

8.000 0.8846 0.1154 0.0627 3 23

12.000 * * * 4 22

12.000 * * * 5 21

12.000 * * * 6 20

12.000 0.7308 0.2692 0.0870 7 19

18.000 * * * 7 18

36.000 * * * 8 17

36.000 * * * 9 16

36.000 0.6090 0.3910 0.0968 10 15

97


(Failure)


38.000 * * * 10 14

40.000 * * * 10 13

48.000 * * * 10 12

48.000 * * * 10 11

60.000 * * * 10 10

60.000 * * * 10 9

72.000 * * * 10 8

84.000 * * * 10 7

84.000 * * * 10 6

84.000 * * * 10 5

96.000 * * * 10 4

108.000 * * * 10 3

144.000 * * * 10 2

192.000 * * * 10 1

192.000 * * * 10 0

CIMP-negative Tumoren Tab.III CIMP-positive Tumoren

Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left

0.000 1.000 0 0 0 32

0.000 0.9688 0.0313 0.0308 1 31

2.000 * * * 2 30

2.000 0.9063 0.0938 0.0515 3 29

8.000 0.8750 0.1250 0.0585 4 28

8.000 * * * 4 27

12.000 * * * 5 26

12.000 * * * 6 25

98


(Failure)


12.000 * * * 7 24

12.000 0.7454 0.2546 0.0778 8 23

13.000 * * * 9 22

13.000 0.6806 0.3194 0.0835 10 21

14.000 0.6481 0.3519 0.0856 11 20

15.000 * * * 11 19

19.000 0.6140 0.3860 0.0876 12 18

24.000 0.5799 0.4201 0.0891 13 17

27.000 * * * 13 16

36.000 * * * 14 15

36.000 * * * 15 14

36.000 0.4712 0.5288 0.0919 16 13

46.000 0.4349 0.5651 0.0917 17 12

57.000 0.3987 0.6013 0.0909 18 11

60.000 * * * 18 10

72.000 * * * 18 9

72.000 * * * 18 8

84.000 * * * 18 7

84.000 * * * 18 6

96.000 * * * 18 5

96.000 * * * 18 4

99.000 * * * 18 3

120.000 * * * 18 2

120.000 * * * 18 1

120.000 * * * 18 0

Tab.III CIMP-positive Tumoren

99

Tab IV: Überleben nach Ki-67-Index (3 Gruppen) Ki-67<2%


0.000 1.0000 0 0 0 25

6.000 0.9600 0.0400 0.0392 1 24

12.000 * * * 2 23

12.000 * * * 3 22

12.000 0.8400 0.1600 0.0733 4 21

36.000 * * * 5 20

36.000 0.7600 0.2400 0.0854 6 19

60.000 * * * 6 18

60.000 * * * 6 17

60.000 * * * 6 16

72.000 * * * 6 15

72.000 * * * 6 14

84.000 * * * 6 13

84.000 * * * 6 12

84.000 * * * 6 11

84.000 * * * 6 10

84.000 * * * 6 9

96.000 * * * 6 8

96.000 * * * 6 7

108.000 * * * 6 6

120.000 * * * 6 5

120.000 * * * 6 4

120.000 * * * 6 3

144.000 * * * 6 2

192.000 * * * 6 1

192.000 * * * 6 0

100

Ki-67=2-29 % Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen

(Failure)


0.000 1.000 0 0 0 16

8.000 * * * 0 15

12.000 * * * 1 14

12.000 * * * 2 13

12.000 * * * 3 12

12.000 * * * 4 11

12.000 0.6667 0.3333 0.1217 5 10

24.000 0.6000 0.4000 0.1265 6 9

27.000 * * * 6 8

36.000 * * * 7 7

36.000 * * * 8 6

36.000 * * * 9 5

36.000 0.3000 0.7000 0.1235 10 4

48.000 * * * 10 3

48.000 * * * 10 2

72.000 * * * 10 1

96.000 * * * 10 0

101

Ki-67 >29% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen

(Failure)


0.000 1.000 0 0 0 20

0.000 0.9500 0.0500 0.0487 1 19

1.000 0.9000 0.1000 0.0671 2 18

2.000 * * * 3 17

2.000 0.8000 0.2000 0.0894 4 16

7.000 0.7500 0.2500 0.0968 5 15

8.000 * * * 6 14

8.000 0.6500 0.3500 0.1067 7 13

13.000 * * * 8 12

13.000 0.5500 0.4500 0.1112 9 11

14.000 0.5000 0.5000 0.1118 10 10

15.000 * * * 10 9

18.000 * * * 10 8

19.000 0.4375 0.5625 0.1140 11 7

38.000 * * * 11 6

40.000 * * * 11 5

46.000 0.3500 0.6500 0.1202 12 4

57.000 0.2625 0.7375 0.1177 13 3

62.000 * * * 13 2

68.000 * * * 13 1

99.000 * * * 13 0

102

Tab.V Überleben Kolon-NET und Ki-67<2%


(Failure)


0.000 1.000 0 0 0 1

6.000 0 1.0000 0 1 0

Überleben Kolon-NET und Ki-67=2-29%


(Failure)


0.000 1.000 0 0 0 2

8.000 * * * 0 1

27.000 * * * 0 0

Überleben Kolon-NET und Ki-67>29%


(Failure)


0.000 1.000 0 0 0 20

0.000 0.9500 0.0500 0.0487 1 19

1.000 0.9000 0.1000 0.0671 2 18

2.000 * * * 3 17

2.000 0.8000 0.2000 0.0894 4 16

7.000 0.7500 0.2500 0.0968 5 15

8.000 * * * 6 14

8.000 0.6500 0.3500 0.1067 7 13

13.000 * * * 8 12

13.000 0.5500 0.4500 0.1112 9 11

14.000 0.5000 0.5000 0.1118 10 10

15.000 * * * 10 9

18.000 * * * 10 8

103


(Failure)


19.000 0.4375 0.5625 0.1140 11 7

38.000 * * * 11 6

40.000 * * * 11 5

46.000 0.3500 0.6500 0.1202 12 4

57.000 0.2625 0.7375 0.1177 13 3

62.000 * * * 13 2

68.000 * * * 13 1

99.000 * * * 13 0

Überleben Kolon-NET und Ki-67>29% Überleben Fore-und Midgut-NET und Ki-67<2%


0.000 1.000 0 0 0 24

12.000 * * * 1 23

12.000 * * * 2 22

12.000 0.8750 0.1250 0.0675 3 21

36.000 * * * 4 20

36.000 0.7917 0.2083 0.0829 5 19

60.000 * * * 5 18

60.000 * * * 5 17

60.000 * * * 5 16

72.000 * * * 5 15

72.000 * * * 5 14

84.000 * * * 5 13

84.000 * * * 5 12

84.000 * * * 5 11

84.000 * * * 5 10

104


(Failure)


84.000 * * * 5 9

96.000 * * * 5 8

96.000 * * * 5 7

108.000 * * * 5 6

120.000 * * * 5 5

120.000 * * * 5 4

120.000 * * * 5 3

144.000 * * * 5 2

192.000 * * * 5 1

192.000 * * * 5 0

Überleben Fore-und Midgut-NET und Ki-67<2%

105

Überleben Fore-und Midgut-NET und Ki-67=2-29% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen

(Failure)


0.000 1.0000 0 0 0 14

12.000 * * * 1 13

12.000 * * * 2 12

12.000 * * * 3 11

12.000 * * * 4 10

12.000 0.6429 0.3571 0.1281 5 9

24.000 0.5714 0.4286 0.1323 6 8

36.000 * * * 7 7

36.000 * * * 8 6

36.000 * * * 9 5

36.000 0.2857 0.7143 0.1207 10 4

48.000 * * * 10 3

48.000 * * * 10 2

72.000 * * * 10 1

96.000 * * * 10 0

Es gab keine Fore-und Midgut-Tumoren mit Ki67-Index >29%.

106

Tab.VI: Überleben nach Ki-67-Index (2 Gruppen) Ki-67<2%


0.000 1.0000 0 0 0 25

6.000 0.9600 0.0400 0.0392 1 24

12.000 * * * 2 23

12.000 * * * 3 22

12.000 0.8400 0.1600 0.0733 4 21

36.000 * * * 5 20

36.000 0.7600 0.2400 0.0854 6 19

60.000 * * * 6 18

60.000 * * * 6 17

60.000 * * * 6 16

72.000 * * * 6 15

72.000 * * * 6 14

84.000 * * * 6 13

84.000 * * * 6 12

84.000 * * * 6 11

84.000 * * * 6 10

84.000 * * * 6 9

96.000 * * * 6 8

96.000 * * * 6 7

108.000 * * * 6 6

120.000 * * * 6 5

120.000 * * * 6 4

120.000 * * * 6 3

144.000 * * * 6 2

192.000 * * * 6 1

192.000 * * * 6 0

107

Ki-67>2% Überlebensmonate (surv) %der Überlebenden (Survival) % der Verstorbenen (Failure) Survival Standard Error Number Failed Number Left

0.000 1.000 0 0 0 36

0.000 0.9722 0.0278 0.0274 1 35

1.000 0.9444 0.0556 0.0382 2 34

2.000 * * * 3 33

2.000 0.8889 0.1111 0.0524 4 32

7.000 0.8611 0.1389 0.0576 5 31

8.000 * * * 6 30

8.000 0.8056 0.1944 0.0660 7 29

8.000 * * * 7 28

12.000 * * * 8 27

12.000 * * * 9 26

12.000 * * * 10 25

12.000 * * * 11 24

12.000 0.6617 0.3383 0.0796 12 23

13.000 * * * 13 22

13.000 0.6042 0.3958 0.0824 14 21

14.000 0.5754 0.4246 0.0834 15 20

15.000 * * * 15 19

18.000 * * * 15 18

19.000 0.5434 0.4566 0.0846 16 17

24.000 0.5115 0.4885 0.0855 17 16

27.000 * * * 17 15

36.000 * * * 18 14

36.000 * * * 19 13

36.000 * * * 20 12

36.000 0.3751 0.6249 0.0857 21 11

38.000 * * * 21 10

108


(Failure)


40.000 * * * 21 9

46.000 0.3334 0.6666 0.0857 22 8

48.000 * * * 22 7

48.000 * * * 22 6

57.000 0.2778 0.7222 0.0876 23 5

62.000 * * * 23 4

68.000 * * * 23 3

72.000 * * * 23 2

96.000 * * * 23 1

99.000 * * * 23 0

Ki-67 >2%

109

Tab.VII: Klinische Daten der Hindgut- NET Lauf-

nummer Geschlecht Alter

Überlebens

Zeit (m)

Status

Lokalisation Histologie Metastasen

Tumor-

größe CIMP

Todes-

ursache

Sekretion/

Marker

Ki 67-

Index

Tumor-

grading

1cc - - - - Kolon kleinzellig - - + - - 65% Schlecht diff.


3cc - - - Kolon kleinzellig - - - - - 85% Schlecht diff.

4cc - - - - Kolon kleinzellig - - - - - 90% Schlecht diff.




8cc m 74 99 lebt Kolon

ascendens kleinzellig

Leber, LK

retroperitoneal faustgroß + - Syn+ 60% Schlecht diff.

9cc -- - - - Kolon kleinzellig --- -- + -- -- 50% Schlecht diff.

10cc m 71 15 lebt Rektum kleinzellig -- 1.6cm + - Syn+,CG+ 50% Schlecht diff.

11cc m 67 18 lebt

Jun06

Sigmoid

Kolon kleinzellig

Knochen,

Leber,

Milz,

Oberbauch,

axillär, iliacal,

paraaortale LK

3cm - - Syn+, Sero+, 40% Schlecht diff.,

G2

12cc w 77 27 lebt Kolon kleinzellig --- 0.6x

0.5cm + -

Syn+, CG+,

Sero+ 2-5%

Schlecht diff.;

wdNEC

13cc w 54 8 tot Kolon kleinzellig Leber, LK --- + Tumortoxischer

Kollaps Syn+, CG+, >50%

Schlecht diff.,

G3

14cc w 62 8 lebt

Kolon(

terminales

Ileum)

kleinzellig LK 1.3x0.8cm + -- CG+,

Sero++ 3%

Schlecht diff.

wdNEC,G1

15cc m 53 2 tot Kolon kleinzellig Leber -- + Tumor Syn+, 80%

Schlecht diff.,low

grade anaplastic

large cell NEC

110

Lauf-

nummer Geschlecht Alter

Überlebens

Zeit (m)

Status


Tumor-

größe CIMP

Todes-

ursache

Sekretion/

Marker

Ki 67-

Index

Tumor-

grading

16cc w 57 - -- Kolon

(Caecum) kleinzellig LK 1.2cm + --

Syn+,

CG+,Sero+ 50%

Schlecht diff.,

wdNEC

18cc w 70 - -- Kolon kleinzellig -- -- - - NSE+, Glu+,

PPfocal++ <2%

Schlecht

diff.,trabecular

growth pattern

19cc m 70 - -- Kolon kleinzellig - -- + -- NSE+, 20% Schlecht diff.

20cc w 60 40 lebt Kolon kleinzellig -- -- - -- -- 50% Schlecht diff.

Legende: CIMP Sonstiges:

- = keine Daten verfügbar Sero+= Serotonin + = 3/ 8 Gene waren methyliert Syn+= Tumor anfärbbar für Synaptophysin NSE+= Neuronenspezifische Enolase - = <3/8 Gene waren methyliert CG+ = Tumor anffärbbar für Chromogranin A Glu+ = Glukagon; na: nicht (genügend) Tumoren für CIMP-Status- PP+ = pankreatisches Polypeptid Bestimmung amplifiziert Status: Stand August 2006

111

Lauf-nummer Geschlecht Alter Überlebens

Zeit(m)

Status


Tumor-

größe CIMP

Todes-

ursache

Sekretion/

Marker Ki 67- Index

Tumor-

grading

12T w 81 8 Tot Rektum

Undifferen

ziertes CA Leber -- - -- -- 90% Schlecht diff.

13T m 69 13 tot Kolon transversum Undifferen

ziertes CA Leber (solitär) -- + -- -- 50% Schlecht diff.

14T m 49 57 tot Sigma Undifferen

ziertes CA Leber (diffus) -- + -- -- 90% Schlecht diff.

15T m 32 19 tot Kolon ascendens Undifferen

ziertes CA 0 -- + -- -- 30% Schlecht diff.

16T m 29 13 tot Rektum Undifferen

ziertes CA Leber, Peritoneum -- + -- -- 50% Schlecht diff.

17T w 63 0 tot Kolonflexur

rechts

Undifferen

ziertes CA Lunge, Leber, -- + k.A. -- 60% Schlecht diff.

18T m 57 7 tot Rektum Undifferen

ziertes CA Leber (diffus) -- na -- -- 50% Schlecht diff.

19T m 32 14 tot Sigma Undifferen

ziertes CA Leber, Hirn -- + -- -- 50% Schlecht diff.

20T m 55 6 tot Rectum Undifferen

ziertes CA LK A. mesenterica inferior -- - -- -- <2% Schlecht diff.

21cc m 64 2 tot Kolon kleinzellig Leber, M an 11 meso-kolischenLK 6,5cm + Tumor Syn+ 75% Schlecht diff.

22cc w 92 1 tot Kolon kleinzellig - -- - Tumor -- 75% Schlecht diff.

23cc w 58 68 lebt Kolon kleinzellig Leber-M. -- na -- -- 85% Schlecht diff.

24cc m 54 62 lebt Kolon kleinzellig - -- na -- -- 45% Schlecht diff.

25cc w 85 46 tot Kolon kleinzellig - -- + k.A. -- 45% Schlecht diff.

26cc m 56 38 lebt Rektumpolyp kleinzellig - -- - -- -- 65% Schlecht diff.

112

10 Publikation

Arnold CN, Nagasaka T, Goel A, Scharf I, Grabowski P, Sosnowski A, Schmitt-Gräff A, Boland

CR, Arnold R, Blum HE (2008). Molecular characteristics and predictors of survival in patients

with malignant neuroendocrine tumors. Int J Cancer 2008 Oct 1; 123 (7): 1556-64.

113

11 Danksagung

Herrn Prof. Dr. Drs. h.c. H.E. Blum möchte ich sehr für die Möglichkeit danken, in seiner

Abteilung meine Dissertation über dieses interessante Thema schreiben zu dürfen, sowie Frau

Prof. Dr. Annette Schmitt-Gräff für ihr Interesse an dieser Arbeit und die Bereitstellung einiger

Tumorpräparate.

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater und Betreuer PD Dr. med. Christian Arnold für die

Überlassung des Themas, die sorgfältige Einarbeitung in die Methodik, sowie seine geduldige und

kontinuierliche Unterstützung während der Durchführung und Niederschrift der Arbeit. Auch danke

ich ihm für seine konstruktive Kritik und seinen Rat in schwierigen Phasen der Dissertation. Ebenso

verdanke ich ihm die Möglichkeit, an einer Publikation beteiligt zu sein. Ohne ihn wäre diese

Arbeit nicht zu Stande gekommen.

Herrn Prof. Dr. Oliver Opitz danke ich herzlich für seine Bereitschaft das Zweitgutachten zu

erstellen.

Des weiteren möchte ich auch meiner Vorgängerin in derselben Arbeitsgruppe, Dr. med. Andrea

Sosnowski gerne danken: zum einen für die Überlassung einiger Abbildungen im Einleitungsteil

und Tabellen im Methodenteil, zum anderen auch für hilfreiche Tipps während der experimentellen

Phase, sowie für ihre allgemeine Bereitschaft, mich zu unterstützen.

Den Mitarbeitern des B5-Labors der Medizinischen Klinik Freiburg, insbesondere Wolfgang

Mössner, Angela Queisser und Eva Egenter danke ich sehr für alle technische Unterstützung, die

herzliche Arbeitsatmosphäre und die freundschaftliche Verbundenheit.

Außerdem möchte ich mich auch bei allen Mitarbeitern der B-Labore bedanken, die mir gerne mit

ihrer Erfahrung und Hilfsbereitschaft zur Seite gestanden sind.

Ebenso danke ich den Mitarbeitern des Pathologischen Institutes, insbesondere Frau Bärbel

Weinhold, für die Durchführung der Ki-67-Färbungen.

Herrn Prof. Dr. Schulte-Mönting vom Institut für Biometrie und Medizinische Informatik Freiburg

danke ich für die Beratung in statistischen Fragen und die Durchführung großer Teile der

statistischen Auswertung.

114

Abschließend möchte ich mich bei all denen bedanken, die mich in den letzten Jahren auf diesem

Weg begleitet und unterstützt haben. Da sind besonders Freunde von „Studenten für Christus“

Freiburg, Studienkollegen und vor allem meine Familie zu nennen, ohne deren Ermutigung ich

sicherlich nicht so weit gekommen wäre.

115

12 Lebenslauf

PERSÖNLICHE DATEN Name Iris Christine Scharf

Geburtsdatum 06.06.1982

Geburtsort Berlin

Familienstand ledig

Staatsangehörigkeit deutsch

Eltern Hanns-Peter Scharf, Doktorand der Theologie,

verstorben 1987

Sabine Scharf, geb. Zimmer, Diplom-Theologin

Geschwister Andreas (1984)

SCHULBILDUNG 1988-1992 Grundschule Masseldorn, Mosbach

1992- 2001 Nikolaus- Kistner- Gymnasium, Mosbach

2001 Abitur

HOCHSCHULBILDUNG Seit 10/2001 Medizinstudium an der Albert-Ludwigs-

Universität Freiburg

9/2003 Physikum

Seit 10/2005 Dissertation bei PD Dr. med. Arnold und

Prof. Dr. Drs. h. c. H.E.Blum

FAMULATUREN 2/2004- 4/2004 Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe,

Kreiskrankenhaus Mosbach

8/2004- 10/2004 Dawe Langano Rural Clinic, Äthiopien

9/2005– 10/2005 Abteilung Innere Medizin, Lorettokrankenhaus

Freiburg

PRAKTISCHES JAHR 02/2007- 12/2007 Ev. Diakonissenkrankenhaus Karlsruhe- Rüppurr

STUDIENABSCHLUSS

5/2008- 12/2008 Kolloquium und Abschluss des Promotionsverfahrens

10/2008- 11/2008 Staatsexamen- 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

116

Date post:	24-May-2018
Category:	Documents
Upload:	hoangnhi
View:	228 times
Download:	3 times

Aus der Medizinischen Universitätsklinik, Abteilung Innere …€¦ · · 2015-06-01Aus der...

Documents