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Aus der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik des

Universitätsklinikums Erlangen

Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Hohenberger

Durchgeführt in der

Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung

in der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik des

Universitätsklinikums Erlangen

Leiter der Abteilung: Prof. Dr. med. R. Eckstein

Untersuchung der Effizienz der Herstellung CD14- und CD16-positiver Monozyten mit den Zellseparatoren COBE Spectra und COM.TEC

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Janina Christine Brügel

aus

Nürnberg

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler

Referent: Prof. Dr. R. Eckstein

Korreferent: Prof. Dr. W. Hohenberger

Tag der mündlichen Prüfung: 07. Juli 2010

Inhaltsverzeichnis Seite

1. Zusammenfassung 1.1 Deutsch 1

1.2 English 3

2. Einleitung 2.1 Immunsystem und Tumoren 5

2.1.1 Die Rolle der dendritischen Zellen 5

2.2 Monozyten 7

2.2.1 Definition 7

2.2.2 Entwicklung und Funktion 8

2.2.3 Monozytenheterogenität 9

2.2.4 Dendritische Zellen als Monozytenderivate 10

2.2.5 Einfluss von Restzellen auf die Anzucht dendritischer Zellen 11

2.3 Tumor-Vakzination mit dendritischen Zellen 11

2.4 Apheresetechnik zur Zellsammlung 13

2.5 Fragestellung der Studie 15

3. Material und Methoden

3.1 Studienprofil 16

3.2 Die Zellseparatoren 19

3.2.1 Der COM.TEC Zellseparator 19

3.2.1.1 Das P1Y Leukozyten-Set 20

3.2.1.2 Die PL1-Kammer 21

3.2.1.3 Das MNC-Programm 22

3.2.1.4 Die COM.TEC Zentrifuge 23

3.2.1.5 Gewinnung CD14-positiver Zellen mit der COM.TEC 25

3.2.2 Der COBE Spectra Zellseparator 26

3.2.2.1 Das WBK-Blutschlauchset 27

3.2.2.2 Der Einphasen-WBK-Kanal 29

3.2.2.3 Die COBE Spectra Zentrifuge 29

3.2.2.4 Der WBK-Betrieb 31

3.2.2.5 Gewinnung CD14-positiver Zellen mit der COBE Spectra 32

3.3 Ablauf der Leukozytapherese 33

3.4 Monozyten 34

3.4.1 Probengewinnung und Probenvorbereitung 34

3.4.2 Durchflusszytometrische Zellanalyse 35

3.4.3 Monozytensubpopulationen und Monozyten-Thrombozyten-

Aggregate

36

3.5 Spenderkollektiv 37

3.6 Statistische Datenauswertung 38

3.7 Berechnungen und Formeln 39

4. Ergebnisse

4.1 Separationsergebnisse mit dem COBE Spectra-Zellseparator 41

4.1.1 Sammelergebnisse mit varianter Zentrifugendrehzahl 41

4.1.2 Sammelergebnisse im Hinblick auf das PBV-TBV-Verhältnis 47

4.2 Separationsergebnisse mit dem COM.TEC-Zellseparator 55

4.2.1 Sammelergebnisse mit varianter Zentrifugendrehzahl 55

4.2.2 Sammelergebnisse im Hinblick auf das PBV-TBV-Verhältnis 65

4.3 Vergleich der Sammelergebnisse von COM.TEC und COBE 71

4.3.1 COM.TEC (1500 rpm) und COBE (646 rpm) 71

4.3.2 COM.TEC (1500 rpm) und COBE (708 rpm) 79

5. Diskussion 5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse 87

5.2 Sammelergebnisse einzelner Zellpopulationen 89

5.2.1 Leukozyten und CD14-positive Monozyten 89

5.2.2 CD14- und CD16-positive Monozyten 92

5.2.3 Restzellen 95

5.2.4 Monozyten-Thrombozyten-Aggregate 97

5.3 Rekrutierung monozytärer Subpopulationen 99

6. Literaturverzeichnis 102

7. Abkürzungsverzeichnis 111

8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen 113

9. Danksagung 114

10. Lebenslauf 115

1

1. Zusammenfassung

1.1 Deutsch Hintergrund und Ziele

Inhalt dieser Arbeit war die Gewinnung CD14-positiver Monozyten und der

CD14+CD16+ sowie der CD14-CD16+ Zellen mittels Leukapherese mit dem

COM.TEC- und dem COBE Spectra-Zellseparator. Besonderes Augenmerk

wurde neben der Effizienz der Sammlung auf die erstmals gesondert

betrachtete Sammlung der CD14+CD16+ Subpopulation gelegt. Auch die Bil-

dung von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten (CD14+CD62+) in den

Apheresaten sowie das Rekrutierungsverhalten der CD14-positiven Zellen

waren von besonderem Interesse.

Methoden Bei 72 gesunden, nicht-zytokinstimulierten Blutspendern wurden 138 Leuk-

apheresen zur Sammlung CD14-positiver Zellen entweder mit dem

COM.TEC (MNC-Programm) oder dem COBE Spectra Zellseparator durch-

geführt und die Ergebnisse in einer gepaarten Analyse miteinander ver-

glichen. Zusätzlich wurde bei beiden Zellseparatoren mit modifizierten Zentri-

fugendrehzahlen gearbeitet (COM.TEC: 1000 U/min. vs. 1500 U/min.; COBE:

708 U/min. vs. 646 U/min.). Für alle betrachteten Zellpopulationen wurden

Sammeleffizienz und Rekrutierungsfaktor berechnet. Die Differenzierung der

Monozytensubpopulationen erfolgte mittels Durchflusszytometrie.

Ergebnisse und Beobachtungen

Der Vergleich von COBE und COM.TEC zeigte einen annähernd gleichen

CD14+ Gehalt in den Apheresaten. Mit der COM.TEC konnten aber für alle

Monozytenpopulationen signifikant höhere Sammeleffizienzen erzielt werden.

Der Thrombozytengehalt war in den Apheresaten der COM.TEC ebenfalls

deutlich höher, was eine ausgeprägte Monozyten-Thrombozyten-Aggregat-

bildung zur Folge hatte. Die Verwendung einer niedrigeren Zentrifugen-

geschwindigkeit führte bei beiden Zellseparatoren zu einem signifikant niedri-

geren Leukozytengewinn und zu durchweg geringeren Sammeleffizienzen für

2

alle Monozytensubpopulationen. Die Rekrutierungsfaktoren variierten in

Abhängigkeit von der jeweiligen Monozytensubpopulation und der jeweils

verwendeten Geräteeinstellung.

Praktische Schlussfolgerungen

Hinsichtlich des Vergleiches mit dem COBE Spectra Zellseparator zeigte das

Standard-MNC-Programm (1500 U/min.) des COM.TEC-Zellseparators die

signifikant höheren Sammelraten der Monozytenpopulationen. Wegen der

ausgezeichneten CD14+CD16+ Sammeleffizienz eignet sich der COM.TEC-

Zellseparator ebenfalls bestens zur Sammlung von CD14- und CD16-

positiven Monozyten, etwa im Rahmen einer therapeutischen Apherese. Das

Rekrutierungsverhalten der Monozyten scheint von der jeweiligen

Monozytenpopulation, dem Blutspender und dem verwendeten

Leukaphereseprogramm abhängig. Geräteeinstellungen, die auf einen sehr

hohen CD14+ Gehalt im Produkt ausgerichtet sind, gehen mit deutlich

höheren Rekrutierungsfaktoren einher.

3

1.2. English

Background and Purposes Leukapheresis procedures were performed with the COM.TEC and the

COBE Spectra cell separator to collect CD14-positive cells and the

CD14+CD16+ as well as the CD14-CD16+ cells. Especially the collection

efficiency of mononuclear cells and the collection of the CD14+CD16+

subpopulation were evaluated. Additionally, the aggregation of monocytes

and thrombocytes in products as well as the recruitment of mononuclear cells

were investigated.

Methods A total of 138 leukapheresis procedures were performed in 72 non-cytokine

stimulated blood donors by the use of either the COM.TEC (MNC program)

or the COBE Spectra (WBK program). In addition to the standard MNC

programs used, different centrifuge velocities were tested (COM.TEC: 1000

rpm vs. 1500 rpm, COBE: 708 rpm vs. 646 rpm). The collection efficiency of

monocyte subpopulations and the monocyte recruitment factors were

calculated. The differentiation of monocyte subpopulations (CD14+,

CD14+CD16+ and CD14-CD16+) was performed on a flow cytometer.

Results and Observations The comparison of the collection results of COBE and COM.TEC showed

nearly equal CD14+ yields in the products. By the use of the COM.TEC,

higher collection efficiencies of all monocyte subpopulations could be

obtained. Platelet counts were higher as well, which lead to enhanced

monocyte-thrombocyte-aggregation. By the use of a lower centrifuge speed

(COM.TEC and COBE), we found a significantly lower leukocyte content and

reduced collection efficiencies of all monocyte subpopulations. Recruitment

factors varied, depending on the monocyte subpopulation and the program

setting used.

4

Practical Conclusions

All monocyte subpopulations showed a trend to significant higher collection

efficiencies by use of the COM.TEC´s MNC-standard-program (1500 rpm)

compared to COBE Spectra´s WBC program. Due to the excellent

CD14+CD16+ collection efficiency, the COM.TEC cell separator is best

suited for the collection of the CD14+CD16+ subpopulation, for instance

within therapeutic leukapheresis. MNC recruitment seems to be higher by

use of high-yield MNC program settings. Additionally, there seems to be a

high variation of monocyte recruitment, depending on the individual blood

donor and the monocyte subpopulation.

5

2. Einleitung

2.1 Immunsystem und Tumoren

Die zweithäufigste Todesursache in den Ländern der westlichen Welt stellen

bösartige Tumoren dar. Die Bekämpfung und Heilung von Malignomen

gelingt bisher nur unzureichend, obwohl sie in der medizinischen Forschung

oberste Priorität einnimmt. In den letzten Jahren ist man angesichts man-

gelnder Erfolge mit den bisher verbreiteten Therapieverfahren, wie Ope-

ration, Chemo- oder Strahlentherapie, dazu übergegangen, neue Behand-

lungsverfahren zu entwickeln, die auf einem besseren Verständnis der Ver-

änderungen, die ein Tumor im Organismus bewirkt, gründen.

Tumorzellen sind transformierte körpereigene Zellen, deren Wachs-

tumskontrolle fehlreguliert ist (56) und die sich in vielen Punkten von einer

normalen Zelle unterscheiden. Das Genom von Tumorzellen ist instabil und

infolgedessen treten gehäuft Mutationen auf, wodurch ständig neue Anti-

gene, sogenannte Neo-Antigene oder auch TAAs (tumor associated anti-

genes) oder PAMP (pathogen associated molecular patterns) entstehen. Die-

se werden durch Moleküle des „Major Histocompatibility Complexes“ (MHC I)

von den Tumorzellen auf ihrer Zelloberfläche präsentiert und von den Zellen

des Immunsystems als „körperfremd“ erkannt. Hinzu kommen epigenetische

Veränderungen, Veränderungen der Anzahl der antigenen Epitope und damit

der Antigenität der Zelle. Kommt es im Laufe der Tumorprogression zu

Gewebeinfiltration und Metastasierung, werden vom geschädigten Gewebe

pro-inflammatorische Zytokine und Chemokine freigesetzt, die Teile des an-

geborenen und des adaptiven Immunsystems aktivieren und so eine Immun-

antwort auf den Tumor in Gang setzen (56).

2.1.1 Die Rolle der dendritischen Zellen

An der Antwort des Immunsystems auf Tumoren sind sowohl das angebo-

rene als auch das adaptive, erworbene Immunsystem beteiligt. Eine Schlüs-

selrolle nehmen hierbei die dendritischen Zellen ein, die wahrscheinlich als

6

Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem fungieren

(3, 28, 36). Dendritische Zellen (DCs) sind antigenpräsentierende Zellen und

können sowohl aus CD34+ Vorläufern im Knochenmark (3) als auch, bei

Anwesenheit bestimmter Wachstumsfaktoren, aus Monozyten, insbesondere

der CD14+CD16+ Subpopulation, hervorgehen (25, 81).

In jedem Entwicklungsstadium sind dendritische Zellen entscheidend

an der Reaktion des Immunsystems auf den Tumor beteiligt, wobei sie die

einzigartige Fähigkeit besitzen, eine primäre Immunantwort zu induzieren (3,

32). Den Ablauf dieser Reaktion stellt man sich heute in etwa so vor: Aus

unreifen DC-Vorläuferzellen im Knochenmark entwickeln sich weitere unreife

Vorläuferzellen, die in Blut, Lymphe und lymphatischen Organen zirkulieren.

Diese zirkulierenden DCs erkennen Tumor-PAMPs („pathogen associated

molecular patterns“) mithilfe ihres PRR („pattern recognition receptor“) und

werden dadurch zur Sekretion von Zytokinen (z.B. TNFα) angeregt, welche

Effektorzellen des unspezifischen Immunsystems (z.B. Makrophagen und na-

türliche Killerzellen) aktivieren, die die transformierten Zellen abtöten. Dabei

entstehen sogenannte „tumor cell bodies“, die von unreifen gewebsständigen

DCs phagozytiert werden.

Diese DCs durchlaufen daraufhin einen Reifungsprozess und wandern

zu den lymphatischen Organen. Dort präsentieren die nun fast ausgereiften

DCs das internalisierte Antigen als Antigen-MHC-Komplex an Antigen-

spezifische CD4- und CD8-positive T-Lymphozyten. Die nun selektierten und

aktivierten T-Lymphozyten wandern zum Ort des Tumorgeschehens,

erkennen antigene Strukturen auf den Tumorzellen und eliminieren im

Optimalfall die neoplastischen Zellen. Eine weitere einzigartige Funktion der

DCs besteht im „Priming“ naiver T-Helfer-Zellen und CTLs. Hierbei wird die

T-Zellantwort folgendermaßen initiiert: Die zunächst unreifen DCs nehmen

auf dem Weg zu den sekundären lymphatischen Organen ein Antigen auf,

das sie während des Zellreifungsprozesses prozessieren. In den

lymphatischen Organen präsentieren die DCs dieses Antigen den naiven T-

Zellen in Form von Peptiden, wobei kostimulatorische Moleküle die

Antigenpräsentation gegenüber diesen T-Zellen unterstützen („T-Zell-

Priming“).

7

2.2 Monozyten

2.2.1 Definition Monozyten stellen die größten mononukleären Zellen (∅ 12- 20 µm) im Blut

des Menschen dar und sind polymorphe Blutzellen. Sie besitzen einen gro-

ßen, meist nieren- oder bohnenförmig gebuchteten oder gelappten Kern. Der

Kernbau ist im Vergleich zu anderen Blutzellen lockerer und chromatinärmer.

Monozyten sind als immunkompetente Zellen zur Phagozytose und Migration

befähigt (58).

Abbildung 1: Monozyt im gefärbten Blutausstrich

Monozyten sind Teil des mononukleären Phagozyten-Systems („MPS“, frü-

her als retikuloendotheliales System bezeichnet). Der Anteil der Monozyten

an den Leukozyten im peripheren Blut beträgt ca. 5-10%. Betrachtet man

Monozyten im Lichtmikroskop, fallen einige morphologische Charakteristika

dieser Zellart auf. Morphologisch imponieren das typischerweise hellblaue

Zytoplasma, die irreguläre Form von Zelle und Zellkern und die hohe Zyto-

plasma-Kern-Ratio (89). Das Chromatin des eingebuchteten, gelappten

Kerns ist streifig angeordnet. Das Zytoplasma enthält feine Azurgranula so-

wie viele peroxidase-und hydrolasehaltige Lysosomen.

Die Identifikation von Monozyten sowie die Abgrenzung der einzelnen

Subpopulationen voneinander gelingt derzeit am besten durch die Kombina-

tion der Durchflusszytometrie mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Anti-

körpern, die gegen Moleküle auf der Zelloberfläche von Monozyten gerichtet

sind (89). Initial wurden Monozyten lediglich anhand einer starken Expres-

8

sion des Oberflächen-Antigens CD14 (Teil des Rezeptors für Lipopoly-

saccharide) als solche identifiziert und definiert. Nachfolgende Untersuchun-

gen zeigten aber nicht nur, dass die einzelnen Monozyten CD14 unterschied-

lich stark exprimieren, sondern auch, dass sie neben CD14 eine Vielzahl

anderer Antigene auf ihrer Oberfläche ausbilden, deren Ausprägung eben-

falls, abhängig vom Aktivierungszustand der Zelle und anderen Faktoren,

stark variiert (25). Unterschiede in der Expression von CD14 und CD16 er-

lauben es, Monozyten in zwei Hauptgruppen zu unterteilen. Es handelt sich

hierbei um die „klassischen“ CD14+CD16- Monozyten, die CD14 sehr stark

und CD16 nicht exprimieren, sowie um die kleinere Population der CD14+

CD16+ Monozyten. Letztere Monozytenpopulation ist CD16-positiv und ex-

primiert CD14 unterschiedlich stark. Da die Anzahl der CD14+CD16+ Mono-

zyten im Rahmen entzündlicher Prozesse im Blut ansteigt, werden diese

Zellen auch als „proinflammatorische“ Monozyten bezeichnet (25). Durch die

Verwendung zusätzlicher monoklonaler Antikörper können weitere Monozy-

tensubpopulationen nachgewiesen werden. Mithilfe der Durchflusszytometrie

gelingt es auch, Aggregate aus Monozyten und anderen Zellen, beispiels-

weise Thrombozyten, als sog. „Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+

CD62+)“ nachzuweisen.

2.2.2 Entwicklung und Funktion Mononukleäre Phagozyten stammen von myeloischen Vorläuferzellen im

Knochenmark ab. Aus diesen Zellen entstehen zunächst Monoblasten, die

sich über Promonozyten zu Monozyten weiterentwickeln. Die reifen Monozy-

ten gehen in die Blutbahn über und zirkulieren dort mit einer Halbwertszeit

von ungefähr 1-3 Tagen, bevor sie in die verschiedenen Gewebe wandern

und sich dort zu funktionell unterschiedlichen Zellen differenzieren, die in

ihrer Gesamtheit nun Makrophagen genannt werden. Schlüsselregulator die-

ser Differenzierungsprozesse ist der Wachstumsfaktor M-CSF (Makropha-

gen-Kolonie stimulierender Faktor). Makrophagen sind morphologisch und

funktionell sehr heterogene Zellen, die je nach Beschaffenheit des jeweiligen

Gewebes auf unterschiedliche Aufgaben spezialisiert sind (z.B. Osteoklasten

9

im Knochen, Langerhanszellen in der Haut, Alveolarmakrophagen in der

Lunge). In ihrer Gesamtheit spielen sie eine wichtige Rolle bei der Aufrecht-

erhaltung der Gewebehomöostase, indem sie alternde Zellen phagozytieren

und durch Entzündungsprozesse geschädigtes Gewebe reparieren (25).

Inzwischen ist bekannt, dass sich nicht nur Makrophagen aus der mo-

nozytoiden Leukozytenreihe entwickeln, sondern auch Zellen, die nicht zur

Phagozytose fähig sind und andere spezifische Funktionen im Organismus

innehaben, wie beispielsweise die dendritischen Zellen.

2.2.3 Monozytenheterogenität Trotz einiger morphologischer Gemeinsamkeiten sind die im peripheren Blut

zirkulierenden Monozyten morphologisch sehr heterogene Zellen, die sich in

Größe, Granulation und Kernmorphologie voneinander unterscheiden. Dass

diese Heterogenität nicht nur die Morphe, sondern auch die funktionellen Ei-

genschaften von Monozyten betrifft, lässt sich bereits anhand der Breite des

Spektrums an funktionell unterschiedlichen Gewebemakrophagen erahnen.

So haben neuere Studien gezeigt, dass die einzelnen Subpopulationen ver-

schiedene Entwicklungs- bzw. Aktivierungsstadien der Monozyten im Blut re-

präsentieren und jeweils eine spezifische Funktion haben (13, 25), welche al-

lerdings bei vielen Subpopulationen noch weitgehend unbekannt ist.

Die Hauptpopulation der CD14+ Monozyten und die CD14+CD16+

Monozyten wurden jedoch bereits in funktioneller Hinsicht analysiert. Bei den

CD14+CD16+ Monozyten handelt es sich um reifere Zellen im Vergleich zu

den „klassischen“ CD14+ Monozyten. Außerdem exprimiert diese Monozy-

tenpopulation die MHC Klasse II-Moleküle und den Oberflächenmarker CD32

(entspricht dem FcγRII-Rezeptor) in größerer Anzahl (25). Zudem besitzen

diese Zellen eine hohe phagozytische Aktivität und sind Hauptproduzent der

inflammatorischen Zytokine TNFα und IL-12p40 (34) sowie der einzige Pro-

duzent von IL-12p70, der biologisch aktiven Form von IL-12, einem potenten

anti-Tumor-Zytokin. Das antiinflammatorische IL-10 produziert diese Zellpo-

pulation im Gegensatz zur Hauptpopulation der klassischen Monozyten

(CD14+CD16-) hingegen kaum (34, 81). Die Anzahl dieser „proinflammatori-

10

schen“ Monozyten ist während eines entzündlichen Prozesses im Körper

deutlich erhöht (25, 81, 82). So zeigten Studien, dass der Anteil der CD14+

CD16+ Monozyten an den Gesamtmonozyten bei Stammzellseparationen

(PBPC: peripheral blood progenitor cell) von Patienten mit malignen oder

chronisch-entzündlichen Erkrankungen circa 20% beträgt, im peripheren Blut

von Gesunden dagegen weniger als 10% (34, 82).

2.2.4 Dendritische Zellen als Monozytenderivate

Monozyten, die im peripheren Blut zirkulieren, können sich sowohl zu Makro-

phagen als auch zu dendritischen Zellen entwickeln. Die Differenzierung zu

dendritischen Zellen erfolgt in Anwesenheit von GM-CSF (Granulozyten- und

Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) und IL-4 und wird von beiden

beschriebenen Monozytensubpopulationen, den CD14+ und den CD14+

CD16+ Monozyten, durchlaufen (13, 25). Eine Studie beschreibt diesen Dif-

ferenzierungsvorgang in dem sog. „Transendothelial-Migration Model“ (59).

Dieses Modell beschreibt, wie Monozyten aus dem Gefäßlumen durch das

Endothel migrieren und sich in der subendothelialen Matrix entweder zu Ma-

krophagen differenzieren, die in der subendothelialen Matrix bleiben, oder zu

dendritische Zellen, die durch das Endothel in das Ausgangsmedium zurück-

wandern (25, 59). Dieses Modell zeigt außerdem, dass sich die Population

der CD14+CD16+ Monozyten in deutlich größerem Ausmaß zu dendritischen

Zellen entwickelt als die CD14++CD16- Monozyten. Deshalb wird vermutet,

dass es sich bei den CD14+CD16+ Zellen um Vorläufer von dendritischen

Zellen handelt (81, 82).

Für den experimentellen und klinischen Umgang mit Monozyten ist

also entscheidend, dass das Ausmaß, in welchem sich diese heterogenen

Zellen zu Makrophagen oder zu dendritischen Zellen entwickeln, sowohl vom

Phänotyp der kultivierten Monozyten (also der Subpopulation) abhängig ist,

als auch von den Wachstumsfaktoren, die in der Kultur vorhanden sind (25).

Dies bedeutet auch, dass mittels Leukapherese sehr heterogene Monozyten-

produkte gewonnen werden, die sich in ihrer Zusammensetzung aus den ein-

zelnen Subpopulationen unterscheiden. Dies könnte folglich zu einem unter-

11

schiedlichen Verhalten der Ausreifung der einzelnen Monozytenpopulationen

zu DCs führen. Da auch in vitro CD14+CD16+ Monozyten deutlich besser zu

dendritischen Zellen ausreifen als andere Subpopulationen, entscheidet

deren Anteil an den Gesamt-Monozyten im Ausgangsprodukt wesentlich

über die Produktqualität hinsichtlich der zu erzielenden DC-Erträge.

2.2.5 Einfluss von Restzellen auf die Anzucht dendritischer Zellen

Es ist zwar möglich, reife dendritische Zellen für die Herstellung von Zellvak-

zinen zu isolieren. Dieses Vorgehen ist jedoch durch die geringe Menge und

die Inhomogenität der DC-Populationen im Blut wenig effektiv. Deshalb wer-

den DCs aus CD14+ Monozyten ex vivo generiert (sogenannte „Mo-DC“), in-

dem die CD14-positiven Zellen mittels Leukapherese gesammelt und in An-

wesenheit verschiedener Wachstumsfaktoren (z.B. GM- CSF, IL-4) für 5 bis

7 Tage kultiviert werden (je nach Herstellungsprotokoll) (32). Da im Aphe-

resat enthaltene Restzellen (Erythrozyten und Thrombozyten) den späteren

Gehalt an dendritischen Zellen in der Zellkultur (7, 8, 28, 36) beeinflussen,

gibt es, neben einem Mindestgehalt von 1,2 x 109 Monozyten pro Apheresat,

in Abhängigkeit der Nachbearbeitungsmethode ebenfalls Grenzwerte für Ery-

throzyten und Thrombozyten. Für die Aufreinigung der Monozyten mit Hilfe

der Elutra® liegt der Grenzwert für den Gehalt an Erythrozyten (Anteil des

Gesamtvolumens an Erythrozyten im Konzentrat) bei max. 7,5 mL. Für die

Thrombozyten gibt es bei dieser Methode keine Limitierung, denn diese Zel-

len werden durch das Elutra-Verfahren effizient entfernt.

2.3 Tumor-Vakzination mit dendritischen Zellen Bereits seit einigen Jahren werden im Rahmen von Studien Impfungen ge-

gen maligne Tumoren durchgeführt. Ziel dieser Therapie ist es, tumorspezifi-

sche Antigene durch die Beladung von DCs effizient den Effektor-T-Zellen zu

präsentieren. Dadurch werden T-Zell-Populationen aktiviert, die spezifisch für

das jeweils verwendete Tumorantigen sind. Die induzierte Immunantwort soll

12

dabei möglichst tumorspezifisch sein und im Idealfall zur Regression des

Tumors führen. Verwendet werden hierfür verschiedene Antigen-Modalitäten.

Neben antigenen Peptiden, Proteinen (mit oder ohne Adjuvans) oder rekom-

binanten Viren, die TAA-codierende Sequenzen tragen, werden insbesonde-

re mit antigenen Peptiden beladene dendritische Zellen verwendet (9). Ne-

ben ihrer entscheidenden Rolle bei immunologischen Vorgängen im Körper

(3, 28, 32, 51) hat der Gebrauch dendritischer Zellen gegenüber anderen

Verfahren den Vorteil, dass die Monozyten als deren Vorläuferzellen relativ

einfach mittels Leukapherese in großen Mengen aus dem peripheren Blut

von Patienten gesammelt werden können (autologer Therapieansatz), ohne

dass eine vorausgehende Stimulation der Spender mit Zytokinen notwendig

ist, deren späte Auswirkungen auf den Spender noch wenig bekannt sind

(61, 84). Im Anschluss an ihre Anzucht aus CD14+ Monozyten sowie Rei-

fungs- und Differenzierungsprozessen werden die reifen DCs mit tumorspe-

zifischen Antigenen verschiedener Modalitäten beladen. Neben definierten

Peptiden aus dem autologen Tumor werden RNA, Tumor-Lysate oder Hy-

bride aus dendritischen Zellen und Tumorzellen verwendet (3, 51, 55, 69).

Das ideale Tumor-Antigen sollte eine möglichst breite, polyklonale T-Zell-

Antwort mit möglichst hoher Affinität zu dem jeweiligen Antigen induzieren.

Es empfiehlt sich außerdem, mehr als ein spezifisches Antigen (Ag) in den

Impfstoff zu integrieren, um einem Ag-Verlust des Tumors und einer infolge-

dessen ineffektiven Impfung entgegenzuwirken. Zusätzlich können sowohl

kostimulierende Moleküle mit eingebracht werden, welche die DC-Aktivität

weiter steigern, als auch sogenannte „Helfer- Proteine“, mit deren Hilfe man

die Immunogenität der injizierten dendritischen Zellen kontrollieren kann (56,

69).

Bisher wurden Impfungen mit DCs vor allem bei Krebspatienten in fort-

geschrittenen Stadien, insbesondere bei Melanom-Patienten, durchgeführt

(4, 54, 55, 70) und dabei bei einem Teil der Patienten ein objektives klini-

sches Ansprechen der Therapie in Form von Tumorregression oder Aktivie-

rung tumorspezifischer T-Zellen beobachtet, ohne dass ernsthafte Neben-

wirkungen auftraten (7, 9, 55, 69). Da die Studien mittlerweile an deutlich

größeren Patientenkollektiven durchgeführt werden, steigt das Interesse an

13

Verfahren, die es ermöglichen, mit geringem Arbeits- und Kostenaufwand

große Mengen an Zellen für therapeutische Zwecke zu gewinnen (9).

2.4 Apheresetechnik zur Zellsammlung

Die Apherese (von griechisch αϕαιρειν „wegnehmen“) ist ein Verfahren, das

dazu dient, einem Blutspender oder Patienten Blutzellen selektiv zu entneh-

men. Das Zellkonzentrat kann dann außerhalb des Körpers in seine Einzel-

zellfraktionen aufgetrennt werden, während alle anderen Blutbestandteile

dem Spender wieder zugeführt werden (44). Die Auftrennung des Vollblutes

in seine einzelnen Bestandteile kann dabei entweder durch Filtration, Zentri-

fugation oder durch die Kombination der beiden Verfahren erfolgen. Die Fil-

tration kann beispielsweise verwendet werden, um Blutplasma von korpus-

kulären Blutbestandteilen zu trennen, da sie sich die unterschiedliche Größe

von Blutbestandteilen zu Nutze macht. Die Zentrifugation ist ein Verfahren,

das die Blutbestandteile durch Zentrifugalkraft entsprechend ihrer unter-

schiedlichen Dichte in Schichten auftrennt. Erythrozyten weisen die größte

Dichte auf und befinden sich daher nach der Zentrifugation auf der Außensei-

te der Zentrifugenkammer. Plasma hingegen hat eine geringere Dichte und

befindet sich dementsprechend auf der Innenseite der Zentrifugenkammer. In

der Mitte, zwischen Plasma und Erythrozytenschicht, liegt die leukozytenrei-

che Buffy Coat-Schicht (44).

Die Apherese wird eingesetzt, um pathologische Blutbestandteile von

Patienten zu entfernen (therapeutische Apherese) oder, wie im Rahmen die-

ser Dissertation beschrieben, um von einem gesunden Spender eine ge-

wünschte Zellfraktion zu sammeln. Im Gegensatz zur Vollblutspende ermög-

licht es die Apheresetechik, einzelne Blutbestandteile zu gewinnen. So kön-

nen Blutplasma oder zelluläre Blutbestandteile wie Thrombozyten, Erythrozy-

ten oder periphere Stammzellen angereichert und gewonnen werden, ohne

den Spender unnötig durch den Verlust von Blutbestandteilen zu belasten,

die für den geplanten Verwendungszweck nicht benötigt werden. Apherese-

verfahren verlaufen wie folgt. Dem Spender wird Blut über eine Armvene ent-

nommen und nach Passage durch das Apheresegerät über die kontralaterale

14

Armvene zurückgegeben (Zwei-Arm-Verfahren). Das entnommene Blut wird

durch ein geschlossenes, steriles Schlauchsystem (Apherese-Set) geleitet,

wobei eine geringe Menge Antikoagulans (Zitronensäure) zugesetzt wird, um

die Gerinnung des Blutes im Apherese-System zu verhindern. Das antikoa-

gulierte Vollblut wird in die Zentrifuge des Zellseparators geleitet, in deren

künstlichem Schwerefeld sich die Blutbestandteile entsprechend ihrer Dichte

in Schichten auftrennen. Partikel mit höherer Dichte wandern dabei aufgrund

der im Vergleich zur Erdbeschleunigung höheren Zentrifugalbeschleunigung

in der Zentrifugenkammer nach außen (Erythrozyten), leichtere Bestandteile

gelangen durch den dadurch erhöhten Auftrieb in Richtung der Innenseite

bzw. Mitte der Zentrifuge. Von dort aus erfolgt die Absammlung der gewün-

schten Zellfraktion via Sammelleitung in den Produktbeutel. Im Anschluss an

die Apherese werden dem Spender alle nicht benötigten Blutbestandteile

wieder zurückgegeben. Das Antikoagulanz Zitrat (Zitronensäure) wird im Or-

ganismus des Spenders von der Leber abgebaut. Aufgrund der insgesamt

niedrigen Zitratkonzentration im Blut bleibt die Blutgerinnung des Spenders

unbeeinträchtigt.

15

2.5 Fragestellung der Studie

Für die Weiterverarbeitung der durch Apherese gewonnenen Zellkonzentrate

spielt die Produktqualität eine wichtige Rolle. Vor diesem Hintergrund werden

in der vorliegenden Studie 138 Leukapheresen, die von gesunden Blutspen-

dern gewonnen wurden, analysiert. Gegenstand dieser Untersuchung war

die Analyse der Monozyten mit Subpopulationen, der Thrombozyten, der Mo-

nozyten-Thrombozyten-Aggregate und der Erythrozyten im Leukozytenkon-

zentrat. Dabei wurden unterschiedliche Zellseparatoren, die COBE Spectra

und das COM.TEC-Apheresegerät, hinsichtlich der oben genannten Zellen

und Zellaggregate untersucht. Im Einzelnen handelte es sich dabei um fol-

gende Fragestellungen.

1. Untersuchung der CD14-positiven Monozyten und der beiden Monozyten-

populationen (CD14+CD16+ und CD14-CD16+ Zellen).

2. Vergleich der Ergebnisse der Leukozytenkonzentrate, die mit dem

COM.TEC- und dem COBE Spectra-Zellseparator hergestellt wurden.

3. Analyse der Rohdaten und Berechnung der Sammeleffizienzen dieser

Zellpopulationen bei beiden Zellseparatoren.

4. Untersuchung der Sammelergebnisse, die mit einer modifizierten Geräte-

einstellung bei beiden Apheresegeräten erzielt wurden.

5. Analyse des Restzellgehaltes und der Ausbildung von Monozyten-Throm-

bozyten-Aggregaten in den Leukozytenprodukten beider Zellseparatoren.

6. Untersuchung der Rekrutierung von Monozyten-Populationen beim Spen-

der durch den Vergleich der Zellzahl vor und nach der Leukozytenspende.

16

3. Material und Methoden

3.1 Studienprofil An der Studie nahmen 72 gesunde, nicht-zytokinstimulierte Spender teil, wo-

von 15 weiblich und 57 männlich waren. Diese Spender spendeten nach Ein-

willigung in das Studienprotokoll insgesamt 138 Leukapheresate. 75 der

Leukapheresen wurden mit dem COM.TEC-Zellseparator (Fresenius Hemo

Care GmbH) und 63 Apheresen mit dem COBE Spectra Apheresesystem™

(Firma Caridian BCT, Inc., Blood Component Technology) hergestellt. Neben

der Untersuchung dieser zwei Zellseparatoren wurden zusätzlich unter-

schiedliche Geräteeinstellungen analysiert. Im Anschluss an die Leukaphe-

resen verglichen wir die Sammelergebnisse hinsichtlich der im Apheresat

enthaltenen Leukozyten, CD14-positiven Zellen, Monozytensubpopulationen

und Restzellen miteinander. In besonderem Maße interessierten uns hierbei

die erzielten Sammeleffizienzen für Monozyten und ihre Subpopulationen.

Die Zuteilung der Blutspender zu einem Zellseparator ergab sich aus

der Verfügbarkeit des jeweiligen Gerätes zum vereinbarten Spendezeitpunkt.

Die Wahl der Geräteeinstellung, mit der gearbeitet wurde, erfolgte ebenfalls

randomisiert.

Die erste Gruppe (n=75) der Leukapheresen wurde mit dem MNC-Programm

des COM.TEC-Zellseparators durchgeführt, wobei zwei unterschiedliche

Zentrifugengeschwindigkeiten verwendet wurden. 50 Apheresen wurden mit

der standardmäßig eingestellten Zentrifugengeschwindigkeit von 1500 Um-

drehungen pro Minute zentrifugiert. Bei einer deutlich kleineren Spendergrup-

pe (n=8) erfolgte die Leukapherese mit einer modifizierten Zentrifugenge-

schwindigkeit von 1000 Umdrehungen pro Minute. Der Blutfluss betrug dabei

jeweils 50 mL pro Minute. 5 Spender wurden sowohl mit 1500 U/min. als

auch mit 1000 U/min. leukapheresiert. Diese Spender (n=5) wurden einer ge-

paarten Analyse unterzogen. Weiterhin bestimmten wir bei allen Spendern

das Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen und untersuchten

diesbezüglich die Separationsergebnisse. Alle Spender, deren PBV-TBV-

Verhältnis zwischen 0,5 und 0,8 lag, wurden in eine erste Gruppe (n=43)

17

zusammengefasst und all diejenigen Spender, deren PBV-TBV-Verhältnis

zwischen 0,81 und 1,25 lag, bildeten die zweite Untersuchungsgruppe

(n=15).

Die zweite Gruppe der Leukozytapheresen (n=63) bildeten Spender, die am

COBE Spectra-Zellseparator mit dem WBK-Programm apheresiert wurden.

Dabei wurde in 20 Fällen eine Zentrifugendrehzahl von 646 U/min. bei einem

Blutfluss von 50 mL pro Minute verwendet. In 17 Fällen wurde der Blutfluss

auf 60 mL pro Minute erhöht, was eine Erhöhung der Zentrifugendrehzahl auf

708 U/min. bewirkte. Die jeweils erzielten Sammelergebnisse wurden eben-

falls verglichen (ungepaart). Desweiteren wurde auch hier das Verhältnis von

prozessiertem zu totalem Blutvolumen der Spender bestimmt und die Spen-

der nach der Größe ihres PBV-TBV-Verhältnisses in zwei Gruppen eingeteilt.

Alle Spender, bei denen das PBV-TBV-Verhältnis zwischen 0,8 und 1,2 lag,

bildeten die Gruppe 1 (n= 29) und alle Spender mit einem PBV-TBV-Verhält-

nis zwischen 1,21 und 1,6 die Gruppe 2 (n=20). Die Produktergebnisse der

beiden Gruppen wurden analysiert und miteinander verglichen.

Als eine der wesentlichen Fragestellungen dieser Arbeit verglichen wir die

Sammelergebnisse von 15 Spendern, die jeweils sowohl mit dem COM.TEC-

als auch mit dem COBE Spectra-Zellseparator leukapheresiert wurden. Alle

15 Leukapheresen wurden dabei mit dem MNC-Standardprogramm der

COM.TEC (Zentrifugendrehzahl von 1500 U/min. und Blutfluss von 50

mL/min.) durchgeführt. Bei Verwendung der COBE Spectra wurden zwei ver-

schiedene Geräteeinstellungen verwendet. 6 der insgesamt 15 Leukaphere-

sen erfolgten mit der Zentrifugendrehzahl von 646 U/min. (Blutfluss von 50

mL/min.) und die restlichen 9 mit einem Blutfluss von 60 mL/min., der zu

einer Zentrifugendrehzahl von 708 U/min. führte. Sammelergebnisse und

Produktivität von COBE und COM.TEC wurden in zwei einzelnen gepaarten

Analysen verglichen.

Das Grundprinzip der Leukapherese ist bei beiden Zellseparatoren das glei-

che. Mit Hilfe der Zentrifugation erfolgt die Auftrennung des Vollblutes des

Spenders in einzelne zellreiche Schichten. Der dabei entstehende Buffy Coat

18

(zellreiche Schicht aus Leukozyten und Thrombozyten), der zwischen Plas-

ma und Erythrozytenschicht liegt, wird abgesammelt. Die Erythrozyten und

das Plasma werden dem Spender wieder zurückgeführt. Aus dem Buffy

Coat, der den Großteil der Leukozyten enthält, werden die Monozyten als ge-

wünschte Zellpopulation angereichert. Um sowohl die Quantität (Gehalt an

Monozyten im Apheresat) als auch die Qualität des Apherese-Produktes

(Gehalt an verunreinigenden Restzellen) zu ermitteln, wurden unmittelbar

nach der Leukapherese die Konzentrationen der einzelnen Zellfraktionen,

also der Leukozyten (WBZ) und Leukozyten-Populationen sowie der Restzel-

len (Erythrozyten und Thrombozyten) im Produkt gemessen. Zusätzlich wur-

de der prozentuale Anteil der Monozyten an den Gesamtleukozyten be-

stimmt. Schließlich berechneten wir den absoluten Monozytengehalt im Leu-

kozytenkonzentrat (sog. Zell-Yield), den Gehalt pro Liter prozessiertes Blut-

volumen, die Sammelrate (CR=Yield pro Minute), die Sammeleffizienz (CE)

und den Recruitment Factor (RF). Alle für die Berechnungen verwendeten

Formeln sind im Kapitel „Berechnungen und Formeln“ aufgeführt. Die Analy-

se der Monozyten-Subpopulationen erfolgte mit dem FACS-Calibur-Durch-

flusszytometer (BD Becton Dickinson, Franklin Lakers, NY, USA). Dabei wur-

den folgende Zellpopulationen gemessen: CD14+CD16-, CD14+CD16+ und

CD14-CD16+ Monozyten sowie die Aggregate aus Monozyten und Thrombo-

zyten (CD14+CD62+ Zellen).

Alle in der Studie eingeschlossenen Spender wurden vor der Leukapherese

den Blutspende-Richtlinien entsprechend aufgeklärt und gaben ihr schriftli-

ches Einverständnis zur Durchführung der im Rahmen der Studie erforderli-

chen Blutuntersuchungen.

19

3.2 Die Zellseparatoren

3.2.1 Der COM.TEC Zellseparator Der Blutzellseparator COM.TEC der Firma Fresenius HemoCare ermöglicht

neben der Sammlung anderer Blutbestandteile die Gewinnung von Buffy

Coat aus Vollblut, der die gewünschten CD14-positiven Zellen enthält. Die

Auftrennung des Blutes erfolgt in einer Separationskammer nach dem Prinzip

der Differential-Zentrifugation.

Zur Sammlung von Leukozyten bietet der COM.TEC Zellseparator

zwei Separationsprogramme an, die mit unterschiedlichen Separationskam-

mern arbeiten. Das PBSC-Lymphozyten-Programm benötigt das C4Y Aphe-

rese-Set, das mit der zweistufigen C4-Kammer arbeitet, das MNC-Pro-

gramm benötigt das P1Y Apherese-Set (PL1-Separationskammer), welches

die einstufige PL1-Kammer verwendet. Alle in dieser Studie enthaltenen

Leukapheresen wurden mit dem MNC-Programm der COM.TEC ausgeführt,

das PBSC-Lymphozyten-Programm kam nicht zum Einsatz.

Abbildung 2: COM.TEC Frontplatte

1 Beutelaufhängvorrichtung

2 Frontplatte

3 Schlauchpumpen

4 Zentrifugentür

5 Serviceblende

6 Feststellbremse

7 Lenkrollen vorne

20

3.2.1.1 Das P1Y Leukozyten-Set

Das Apherese-Set P1Y dient der Gewinnung von Leukozyten und von spe-

ziellen Leukozytenpopulationen, wie den Granulozyten und den CD14-positi-

ven Monozyten. Die Auftrennung des Vollblutes erfolgt in einer einstufigen

Kammer, aus der die gesammelten Zellen zyklisch in einen Konzentrat-beu-

tel gesammelt werden. Um die Kontamination des Konzentrats zu minimie-

ren, sind Sterilfilter in alle Leitungen integriert, an denen Lösungen ange-

schlossen werden. Ein Plasma-Transferbeutel, der fest mit dem Set verbun-

den ist, ermöglicht es, während der Separation zusätzlich eine bestimmte

Menge Plasma zu sammeln.

Abbildung 3: P1Y Leukozyten-Set

21

3.2.1.2 Die PL1-Kammer

Die Separationskammer PL1 ist eine einstufige Kammer aus farblosem

Kunststoffmaterial. Das zu separierende Vollblut wird der Kammer über den

Vollblut-Port zugeführt. In dieser Kammerstufe bewirkt die Zentrifugalkraft

eine Trennung in Erythrozyten und zellreiches Plasma, welches am inneren

Rand der Kammer (Plasma-Port) entnommen werden kann. Die Erythrozyten

werden über den EK-Port, der sich am äußeren Rand der Kammer befindet,

abgeführt.

Abbildung 4: PL1-Kammer

PLS Plasma

EK Erythrozyten

VB Vollblut

22

3.2.1.3 Das MNC-Programm

Das Programm MNC arbeitet mit der einstufigen PL1-Kammer und ist ein

zyklisches Sammelverfahren. Jeder Zyklus besteht aus folgenden vier Pha-

sen.

- Sammelphase

- Verdichtungsphase

- Spilloverphase

- Buffy Coat-Phase

Die ersten beiden Phasen (Sammel- und Verdichtungsphase) laufen mit

automatischer Trenngrenzenregelung, d.h. die Plasmapumpe wird durch die

Software geregelt und hält die Grenze zwischen Zellen und plättchenreichem

Plasma konstant auf einer bestimmten Position (7.1). Die beiden sich an-

schließenden Sammelphasen (Spillover- und Buffy Coat-Phase) laufen mit

unterschiedlicher Flussrate, wobei die automatische Trenngrenzenregelung

ausgeschaltet ist. Unter Standardbedingungen werden vom Gerät pro Minute

50 mL antikoaguliertes Vollblut separiert. Die innere Schicht bildet das

thrombozytenreiche Plasma. Das Plasma wird von der Plasmapumpe über

den Plasmaausgang zur Tropfkammer gepumpt, dort mit den Erythrozyten

gemischt und dem Patienten wieder zurückgegeben. Währenddessen baut

sich in der Mitte der Kammer, zwischen Erythrozyten- und Plasmaschicht die

Buffy Coat-Schicht auf. Diese Schicht enthält die gewünschte Zellfraktion der

CD14-positiven Zellen. Am Ende der Sammelphase wird die Buffy Coat-

Schicht in der Separationskammer verdichtet. Dazu werden 5 mL Vollblut

sehr langsam in die Kammer gefördert, während die automatische Trenn-

grenzenregelung aktiv bleibt. Nach dem Verdichten zieht die Plasmapumpe

den Buffy Coat aus der Separationskammer bis vor das Y-Stück, welches

sowohl die Zellen- als auch die Plasmapumpe mit dem Plasmaausgang der

Kammer verbindet. Jetzt übernimmt die Zellenpumpe die Zellfraktion und för-

dert sie in den Konzentratbeutel. Die Plasmapumpe steht während dieses

Vorgangs still. Nach Beendigung des Zellentransports schließt sich eine

neue Sammelphase an, in der wieder Buffy Coat angereichert wird.

23

Im MNC-Programm können zusätzliche 50 - 500 mL Plasma gesammelt wer-

den. Die Plasma-Sammlung beginnt nach Ende des 3. Zyklus. Folgende

Parameter lassen sich im Spillover-Menü beeinflussen:

Das Zyklus-Volumen entspricht dem Volumen, das während eines

Sammelzyklus für die Anreicherung der Buffy Coat-Schicht prozessiert wird.

Bei Spendern mit hohen Leukozytenvorwerten baut sich die Buffy Coat-

Schicht schnell auf, so dass es sinnvoll ist, niedrigere Volumina pro Zyklus zu

wählen als bei Spendern mit niedrigen Leukozytenvorwerten. Durch das

Zyklusvolumen kann die Anzahl der Zyklen pro Spende variiert werden. Das

Volumen, welches die Plasmapumpe benötigt, um den Buffy Coat aus der

Separationskammer zum Y-Stück zu befördern, wird Spillover-Volumen ge-

nannt. Die Größe dieses Volumens hängt auch von der Schichtdicke des

Buffy Coats ab. Wenn beobachtet wird, dass sich die ersten Zellen bereits

über das Y-Stück hinaus zur Plasmapumpe bewegen, kann der Spillover ge-

stoppt werden. Dann wird das bis dahin geförderte Volumen automatisch als

neues Spillover-Volumen festgelegt. Als Buffy Coat-Volumen wird das Volu-

men bezeichnet, das durch die Zellpumpe in den Konzentratbeutel befördert

wird. Das Buffy Coat-Volumen ist umso höher einzustellen, je tiefer in die

Erythrozytenschicht des Buffy Coats hinein gesammelt werden soll. Wenn zu

tief gesammelt wird, also zu viele Erythrozyten in das Zellkonzentrat ge-

langen, kann der Transport des Buffy Coat-Volumens mit Hilfe der optischen

Kontrolle durch den Operator gestoppt werden. Dann wird das Buffy Coat-

Volumen, das bis dahin transportiert wurde, automatisch als neuer Wert in

der Software übernommen und auf dem Ausdruck dokumentiert.

3.2.1.4 Die COM.TEC Zentrifuge Die rotierende Separationskammer ist gleitdichtungsfrei über den Zentrifu-

genschlauch (3 bis 4 Einzelschläuche) mit dem Pumpenadapter des

Schlauchsystems verbunden. Um das Funktionsprinzip der gleitdichtungs-

freien Zentrifuge zu gewährleisten, muss der Zentrifugenschlauch von unten

um die Separationskammer herum, tangential von den beiden Schlauchfüh-

rungen des Zentrifugenrotors zum oben liegenden Zentrifugenadapter ge-

24

führt werden. Bei laufender Zentrifuge dreht sich der Zentrifugenschlauch um

die Separationskammer herum und wird hierbei von einer Schlauchführung

des Zentrifugenrotors geführt. Dadurch dass sich der Zentrifugenschlauch

genau halb so schnell wie die Separationskammer um diese dreht, wird ein

Verdrillen des Schlauches verhindert. Der Zentrifugenrotor, der den Zentri-

fugenschlauch um die Separationskammer führt, dreht sich ebenfalls mit der

halben Separationskammerdrehzahl. Die Drehzahl der Separationskammer

beträgt maximal 2.200 U/min., die des Zentrifugenrotors demnach maximal

1.100 U/min.. Die Drehung erfolgt jeweils gegen den Uhrzeigersinn.

Abbildung 5: COM.TEC Zentrifuge

1 Zentrifugeninnenraum

2 Zentrifugenrotor

3 Kammerverriegelung

4 Kammeraufnahme

5 Antrieb

6 Stroboskoplampe unten

7 Schlauchführung

8 Stroboskoplampe oben

9 Beleuchtungsfenster/Trenngrenzenempfänger

25

3.2.1.5 Gewinnung CD14-positiver Zellen mit der COM.TEC

Die Gewinnung CD14-positiver Zellen mit dem COM.TEC Zellseparator ist

ein zyklisches, halbautomatisches Verfahren. In der Sammelphase erfolgt in

der Separationskammer die Auftrennung des Blutes in thrombozytenreiches

Plasma, das dem Spender zurückgegeben wird, und zelluläre Bestandteile.

Die Zellschicht wird durch Reduktion des Blutflusses verdichtet und anschlie-

ßend in der sogenannten Spilloverphase bis vor den Kammerausgang ge-

pumpt. Von dort werden die Leukozyten schließlich in den Konzentratbeutel

gefördert (Buffy Coat-Phase). Sowohl das Sammelvolumen als auch die Vo-

lumina, die in der Spillover- und Buffy Coat-Phase in Richtung Sammelbeutel

befördert werden, können manuell eingestellt und das Sammelergebnis so

verändert werden. Eine optimale Einstellung der Volumina während des

Sammelprozesses führt zur Gewinnung eines Apheresekonzentrates, in dem

der Anteil an Leukozyten hoch, der an verunreinigenden Erythrozyten und

Thrombozyten dagegen niedrig ist.

Die Standardeinstellung des MNC-Programmes arbeitet mit einem Blutfluss

von 50 mL/min. und einer Zentrifugendrehzahl von 1500 U/min.. Das Zyklus-

volumen beträgt 400 mL, das Buffy Coat-Volumen liegt durchschnittlich bei

10 mL. Die Anpassung des Spillover-Volumens erfolgt durch den Operator

manuell. Durch Betätigen der Taste „Stop Phase“ am Gerät wird das Spill-

over-Volumen adjustiert und die Absammlung von Buffy Coat eingeleitet. Der

Absammelprozess wird hierbei vom Operator durch Betrachten der Sammel-

leitung überwacht. Auch das Buffy Coat-Volumen wird innerhalb der ersten

drei Sammelzyklen manuell eingestellt, wobei darauf geachtet wird, im Aphe-

resekonzentrat einen hohen Leukozyten- und einen niedrigen Erythrozyten-

anteil zu erhalten. Die vorliegenden Untersuchungen vergleichen die bei Ver-

wendung unterschiedlicher Geräteeinstellungen erzielten Sammelergebnis-

se. Die gewonnenen Resultate werden im Ergebnisteil beschrieben.

26

3.2.2 Der COBE Spectra Zellseparator

Das COBE Spectra Apheresesystem™ der Firma Caridian BCT, Inc., Blood

Component Technology ist ein automatischer Blutkomponenten-Separator

und dient der Sammlung von Blutkomponenten. Das System eignet sich

auch zur Anreicherung von Buffy Coat, aus dem mononukleäre Zellen ge-

wonnen werden können. Die Auftrennung des Vollblutes basiert auf dem

Zentrifugenprinzip.

Abbildung 6: COBE Spectra

Das Spectra System besteht aus Einwegteilen (vorbefestigter Trennkanal

und Blutschläuche) und dem eigentlichen Spectra Apheresesystem. Das

System umfasst folgende Bauteile:

- Spectra Blutschlauchsets - bestehend aus einem sich in der Zentrifuge

drehenden Trennkanal, der Blut in seine Bestandteile trennt, und aus

27

Blutschläuchen, in denen Blut und Ersatzflüssigkeiten durch das

System geführt werden.

- Spectra Apheresesystem, ein auf dem Zentrifugenprinzip basierender

automatischer Blutseparator, der die Steuerung und Überwachung

des extrakorporalen Kreislaufs bei der Apherese übernimmt.

Die Gewinnung von Monozyten erfolgt unter Verwendung des Einphasen-

WBK-Kanals und eines WBK-Blutschlauchsets.

3.2.2.1 Das WBK-Blutschlauchset Das WBK-Blutschlauchset wurde in der vorliegenden Arbeit zur Gewinnung

CD14-positiver Monozyten verwendet. Das Set besteht aus einem einphasi-

gen Trennkanal (Einphasen-WBK-Kanal) und einem WBK-Blutschlauch-

system. Der Einphasen-WBK-Kanal trennt mononukleäre weiße Blutkörper-

chen von Erythrozyten, Thrombozyten und Plasma. Der WBK-Schlauch

transportiert das Blut zum Entzug weißer Blutkörperchen. Die gesammelten

Zellen werden kontinuierlich in einen sich außerhalb der Zentrifuge befindli-

chen Sammelbeutel gefördert. Neben dem WBK-Beutel verfügt das Set über

einen Plasma-Beutel, in den während der Separation zusätzlich eine be-

stimmte Menge Plasma gesammelt wird.

28

Abbildung 7: WBK-Blutschlauchset

1 Spender-/Patientenzufluss

2 Zuflussverteiler 15 Plasma-/RBK-Leitung

3 NaCl-Zuflussleitung 17 Plasma-/RBK-Verwurfbeutel

4 Antikoagulans-Leitung 18 Rückflusspumpenkassette

6 Einlassleitung 19 Rückflussdrucksensor

7 Zuflussdrucksensor 20 Rückflussluftkammer

8 Zuflusspumpen-Kassette 21 Verwurfableitungen

9 Einlassluftkammer 22 Fülllösungs-Verwurfbeutel

10 Zentrifugenschleife 23 Rückflussleitung

11 WBK-Anschluss 24 NaCl-Rückflussverteiler

13 Sammel-/Ersatzflüssigkeitsleitung 25 NaCl-Rückflussleitung

14 Sammelbeutel 26 Spender-/Patientenrückfluss

29

3.2.2.2 Der Einphasen-WBK-Kanal

Der Einphasen-WBK-Kanal dient der Sammlung von mononuklären Zellen

(MNZ). Das antikoagulierte Vollblut tritt durch den Einlassschlauch in die Ein-

lasskammer ein. Dort wird das Blut durch die Zentrifugalkraft und die unter-

schiedlichen spezifischen Gewichte der Blutbestandteile in Erythrozyten

(RBK), die gewünschten weißen Blutkörperchen (WBK) und thrombozytenrei-

ches Plasma getrennt.

Abbildung 8: Einphasen-WBK-Kanal

3.2.2.3 Die COBE Spectra Zentrifuge

Die Zentrifuge befindet sich in der Zentrifugenkammer und ist mit den sich

außerhalb der Zentrifugenkammer befindenden Pumpen des Schlauch-

systems gleitdichtungsfrei verbunden. Die Zentrifugenkammer wird beim

COBE Spectra Apheresesystem als Einphasen-WBK-Kanal bezeichnet und

in die Füllvorrichtung der Zentrifuge eingelegt. Bei sich drehender Zentrifuge

30

wird die rotierende Schleife des WBK-Kanals vom Zentrifugenarm und über

die obere und untere Lagerhalterung am Zentrifugenarm festgehalten. Die

maximale Zentrifugengeschwindigkeit beträgt 2400 U/min., die daraus resul-

tierende maximale Schwerkraft, die im Einphasen-WBK-Kanal entwickelt

wird, beträgt 930 g.

Abbildung 9: Zentrifugenkammer

1 Netzschalter 9 Zentrifugenarm

2 Zentrifugendeckel und -tür 10 Untere Lagerhalterung

3 Füllvorrichtung 11 Obere Lagerhalterung

4 Verschlussstift der Füllvorrichtung 12 Obere Kragenhalterung

5 Verriegelungsstift der Füllvorrichtung 13 Strobe

6 Verschlussriegel der Füllvorrichtung 14 Leckanzeiger

7 Zentrifugenkragenhalterung 15 Getriebeabdeckung

8 Ladeöffnung der Zentrifuge

31

3.2.2.4 Der WBK-Betrieb

Der WBK-Betrieb ist ein kontinuierliches Aphereseverfahren, bei dem Spen-

dern mit Hilfe eines WBK-Blutschlauchsets mononukleäre Zellen (MNZ) ent-

nommen werden. Im WBK-Betrieb werden zwei Modi unterschieden, die

nacheinander ausgeführt werden. Im Durchflussmodus wird antikoaguliertes

Vollblut zunächst mit der Zentrifugalmethode in seine Hauptbestandteile zer-

legt und die Fraktion der Leukozyten gesammelt. Im darauffolgenden Rück-

führmodus werden dem Spender anschließend die restlichen Blutkomponen-

ten zurückgegeben.

Zunächst wird der Durchlaufmodus gestartet. Das Vollblut des Spen-

ders wird im Verhältnis 12:1 (Einlass:ACD-A) antikoaguliert. Das Verhältnis

Vollblut zu Antikoagulans kann entsprechend des Hämatokrits und der

Thrombozytenzahl des Spenders verändert werden. Das antikoagulierte Blut

wird in den Einphasen-WBK-Kanal gepumpt, während sich dieser in der Zen-

trifuge im Uhrzeigersinn dreht. Dadurch wird die Zellfraktion mit der höchsten

Dichte (Erythrozyten) an der äußeren Kanalwand abgeordnet, während sich

die Zellfraktionen geringerer Dichte schichtenweise zur inneren Kammer-

wand hin anordnen. Das Plasma ist aufgrund seiner geringen Dichte der

Kammerinnenseite am nächsten. Im Kanal befinden sich mehrere Auslass-

schläuche. Die Einlass- und Sammelkammern sind im Kanal voneinander

getrennt. Die Einlassleitung liefert das antikoagulierte Vollblut in den WBK-

Kanal. Am Eingang dieses Kanals gibt es vier Schläuche, die in die entspre-

chenden Kanalbereiche führen. Der Schlauch für Erythrozyten reicht bis zur

äußersten Wand des Kanals, der Plasmaschlauch befindet sich an der am

wietesten innen liegenden Wand und die Sammel- und Schnittstellen-Kon-

trollschläuche liegen dazwischen, dort wo sich die RBK-Plasma-Schnittstelle

befindet. Als Schnittstelle bezeichnet man die dünne Schicht zwischen den

Erythrozyten und dem Plasma. Darin befinden sich die Leukozyten, die ge-

sammelt werden sollen. Die RBK-Plasma-Schnittstelle wird durch das Ver-

hältnis der Flussraten der roten Blutkörperchen und des Plasmas festgelegt.

So können die Leukozyten nach korrekter Einstellung der Plasmasammelrate

an der Schnittstelle gesammelt werden. Erythrozyten und plättchenreiches

Plasma werden direkt aus den jeweiligen Schläuchen gesammelt. Die RBK-

32

Plasmaschnittstelle kann jederzeit durch den Bediener manuell verändert

werden, wenn das Absammeln der Leukozyten nicht optimal verläuft. Im

Idealfall sollten ein Minimum an Erythrozyten und ein Maximum an WBK ge-

sammelt werden.

Ist der Durchlaufmodus beendet, wird der Rückführmodus gestartet,

um dem Spender Erythrozyten und den überwiegenden Teil des plättchenrei-

chen Plasmas wieder zurückzugeben. Dabei wird physiologische Kochsalz-

lösung (NaCl-Zuflussleitung) in das Aphereseset geleitet. Das COBE Spectra

Apheresesystem spült das erythrozytenreiche Plasma durch Zuführung der

NaCl-Lösung aus dem Aphereseset. Schließlich wird das Rückflussventil des

Spectra Systems geöffnet, um dem Spender das erythrozytenreiche Plasma

zurückzuführen.

3.2.2.5 Gewinnung CD14-positiver Zellen mit der COBE Spectra Im Durchlaufmodus des Spectra Systems bildet sich in der Mitte des Ein-

phasen-WBK-Kanals eine Leukozytenschicht aus, die CD14-positive Zellen

enthält. Diese Leukozyten werden anschließend über den WBK-Sammel-

schlauch in den WBK-Sammelbeutel geleitet. Die äußere Schicht des Trenn-

kanals bilden die Erythrozyten, die innere Schicht das thrombozytenreiche

Plasma. Die Schnittstelle zwischen Erythrozyten und Plasma wird durch das

Spectra System zunächst automatisch eingestellt, kann jedoch vom Bediener

manuell verändert werden, wenn entweder zu viele Erythrozyten oder zu we-

nige Leukozyten gesammelt werden. Eine optimale Einstellung der Schnitt-

stelle zwischen Plasma und Zellen gewährleistet einen möglichst hohen Leu-

kozytenanteil im Apheresekonzentrat bei niedrigem Gehalt an verunreinigen-

den Erythrozyten. Die Kontrolle erfolgt hierbei durch ein Colorgramm, mit

dessen Hilfe der Hämatokritwert im Sammelschlauch geprüft wird. Bei dun-

kelroter Farbe des gesammelten Buffy Coats ist die Beimischung von Ery-

throzyten hoch, bei rosaroter Farbe gering, wobei bei niedrigem Hämato-

kritwert im Produkt auch der Anteil an mononukleären Zellen zunimmt.

33

3.3 Ablauf der Leukozytapherese

Alle Blutspender, die an dieser Studie teilnahmen, wurden vor der Leukozyt-

apherese sorgfältig aufgeklärt und willigten schriftlich in das Verfahren ein.

Sie erfüllten allesamt die Vorgaben der aktuellen Hämotherapie-Richtlinien

zur Blutspendeeignung und waren HIV-, HBV- und HCV-negativ getestet.

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Friedrich-Alexan-

der-Universität Erlangen-Nürnberg genehmigt und befindet sich zudem im

Einklang mit den oben genannten Richtlinien (71).

Die Buffy Coat-Sammlung erfolgte mit dem COM.TEC Zellseparator

unter Verwendung des MNC-Programmes, das mit der einstufigen PL1-Kam-

mer arbeitet. Die Zentrifugengeschwindigkeit betrug hierbei 1500 U/min.

(Zentrifugalkraft: 297 x g; Kopplungsparameter [CP]: 212). Die zu verglei-

chende Einstellungsoption arbeitete mit einer Zentrifugengeschwindigkeit von

1000 U/min.. Der Blutfluss betrug bei allen Leukapheresen 50 ml/min., das

Verhältnis ACD-A zu Vollblut war initial auf 1:10 und das Zyklusvolumen auf

400 mL eingestellt. Alle übrigen Geräteeinstellungen orientierten sich an den

Empfehlungen des Herstellers.

Die Gewinnung von Buffy Coat mit dem Spectra System erfolgte im

WBK-Programm. Während des sogenannten Durchlaufmodus wurde zu-

nächst im Einphasen-WBK-Kanal Vollblut der Spender in seine Bestandteile

aufgetrennt (Prinzip: Differentialzentrifugation). Leukozyten (Buffy Coat), Ery-

throzyten und plättchenreiches Plasma wurden anschließend aus dem

Trennkanal jeweils in einen extra Sammelbeutel geleitet. Der die gewünsch-

ten CD14-positiven Zellen enthaltende Leukozyten-Sammelbeutel wurde zur

Wieterverarbeitung aufbewahrt, während Erythrozyten und Plasma dem

Spender nach der Sammlung im sogenannten Rückführmodus wieder zu-

rückgegeben wurden.

Die Leukapherese mit dem Spectra Apheresesystem erfolgte unter

Verwendung zweier verschiedener Zentrifugendrehzahlen und Blutflussraten.

Bei einer Einlass-Blutflussrate von 50 mL/min. ergab sich eine Zentrifugenge-

schwindigkeit von 646 U/min., bei einer Blutflussrate von 60 mL/min. eine

Zentrifugengeschwindigkeit von 708 U/min.. Das Verhältnis von Antikoagu-

lans zu Vollblut war initial auf 1:12 (ACD-A:Vollblut) eingestellt und die Spen-

34

dezeit auf 120 Minuten festgelegt. Die Sammelrate von Buffy Coat betrug 1

mL/min.. Diese Einstellungen konnten im Laufe des Verfahrens vom Bedie-

ner modifiziert werden, um die Sammlung zu optimieren. Die Plasmapumpe

wurde hierzu via Plasmaflussrate unter Kontrolle der Farbe des Sammel-

schlauches mithilfe des Colorgramms eingestellt, wobei der Ziel-Hämato-

kritwert im Apheresat zwischen 2% und 5 % liegen sollte. Die übrigen Durch-

laufparameter wurden vom Spectra System anhand der Spenderdaten Ge-

schlecht, Größe, Gewicht und Hämatokrit berechnet.

3.4 Monozyten 3.4.1 Probengewinnung und Probenvorbereitung

Bei allen Spendern wurden vor Beginn und nach Ende der Leukozytapherese

sowie aus dem gewonnenen Zellkonzentrat Blutproben entnommen (2 mL

peripheres Vollblut mit EDTA antikoaguliert). In den meisten Fällen wurde zu-

sätzlich Plasma gesammelt und daraus ebenfalls Blutproben entnommen.

Der Zellgehalt dieser Blutproben wurde an einem Blutbildautomaten (K1000,

Sysmex, TOA Medicals, Kobe, Japan) ermittelt und folgende Parameter ge-

messen: Erythro-, Thrombo- und Leukozytenkonzentration (sowie Leukozy-

tenpopulationen), Hämoglobingehalt, Hämatokrit und mittleres korpuskuläres

Volumen (MCV). Um die Monozytenfraktion der Leukozyten zu bestimmen,

wurde unter Verwendung der May-Grünwald-Färbung ein Leukozyten-Dif-

ferential-Blutbild angefertigt. Alle Blutproben wurden mit dem FACS Calibur-

Durchflusszytometer hinsichtlich des Anteils der CD45+14+ Monozyten

untersucht.

Das Verfahren der Durchflusszytometrie wurde angewendet, um die in

den Blutproben enthaltenen Monozyten und deren Subpopulationen zu be-

stimmen. Vor Beginn der Durchflusszytometrie wurden die Blutproben zu-

nächst mit der „Lyse-no-wash“-Methode für die indirekte Immunfluoreszenz

vorbereitet. Je 50 µL jeder EDTA-Blutprobe wurden mit den fluorochrom-

markierten monoklonalen Antikörpern CD45-Fluorescein und CD14-Phyco-

erythrin (beide Becton Dickinson) versetzt und 15 Minuten unter Zugabe von

35

1 mL FACS „Lysing Solution“-Lösung (Becton Dickinson) in dunkler Umge-

bung bei Raumtemperatur inkubiert. Die monoklonalen Antikörper CD14 und

CD16 wurden zur weiteren Differenzierung der Monozyten und Analyse der

Zellpulationen CD14+CD16-, CD14+CD16+ und CD14-CD16+ im Apheresat

verwendet. Der monoklonale Antikörper CD62 wurde dazu verwendet, Mono-

zyten-Thrombozyten-Aggregate zu bestimmen, die sich nach der Leukaphe-

rese regelmäßig im Konzentrat bilden. Nach Ablauf der Inkubationszeit wur-

den die gefärbten Blutproben mit dem FACS Calibur Durchflusszytometer

analysiert. Die Identifikation der Monozytenpopulationen erfolgte anhand

ihrer Position im Vorwärts- und Seitwärts-Scatter, welche von den morpholo-

gischen Charakteristika der jeweiligen Zelle abhängt. Die Monozyten wurden

anhand der Expression des CD14-Antigens als Anteil der CD45-positiven

Leukozyten definiert.

3.4.2 Durchflusszytometrische Zellanalyse

Die Durchflusszytometrie dient der Unterscheidung von Zellen anhand von

Antigenexpression und Morphologie (Größe und Granularität). Das Verfahren

basiert darauf, dass Einzelzellen in Suspension unterschiedliche Fluores-

zenz- und Streulichteigenschaften haben, anhand derer sie voneinander ab-

gegrenzt und analysiert werden können. Zusätzlich können die Zellen mit Hil-

fe von Antikörpern, die an Fluoreszenz-Farbstoffe gekoppelte wurden, mar-

kiert werden, um spezielle intra- und extrazelluläre Antigene darzustellen.

Meist werden hierfür monoklonale Antikörper verwendet. Im Durchflusszyto-

meter können die so markierten Zellen durch Laserlicht erfasst werden. Hier-

zu werden die Zellen von einem mikroskopisch kleinen Flüssigkeitsstrahl auf-

genommen und durch dünne Kapillaren geleitet, so dass sie in einer Reihe

hintereinander angeordnet liegen, wie Perlen an einer Kette. Anschließend

werden sie durch einen gebündelten Laserstrahl geleitet, dessen Fokus im

Messbereich der Kammer des Durchflusszytometers liegt. Durch Verwen-

dung eines Argon Lasers (488 nm) werden die mit Farbstoff markierten Anti-

körper, die zuvor an Zellrezeptoren gebunden wurden, zur Fluoreszenz an-

geregt. Das Durchflusszytometer analysiert die Fluoreszenz der Farbstoffe,

36

die jeweils ein charakteristisches Anregungs- und Emissionsspektrum auf-

wiesen und so voneinander unterschieden werden können. Häufig einge-

setzte Farbstoffe sind beispielsweise Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und

Phycoerythrin (PE).

Die Zelle selbst streut das Licht zusätzlich, abhängig von ihrer Größe,

Form, Struktur und Granularität. Diese Lichtstreuung registriert das Durch-

flusszytometer über separate Detektoren als Durchlicht und Streulicht. Alle

entstehenden Lichtsignale werden durch Linsen gebündelt und nach Um-

wandlung in elektrische Signale von sensitiven Detektoren registriert. Die aus

der Lichtstreuung und der emittierten Wellenlänge der fluoreszierenden Farb-

stoffe gebildeten elektronischen Signale werden für jede einzelne Zelle regi-

striert. Die Durchflusszytometrie ist also ein Verfahren, das eine große An-

zahl einzelner Zellen in kurzer Zeit sehr genau misst und analysiert.

Untersucht man Leukozyten mit dem Durchflusszytometer, lassen sich

Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten bereits ohne Verwendung fluo-

reszierender Antikörper anhand der physikalischen Eigenschaften unter-

scheiden, da sie aufgrund unterschiedlicher Form, Größe und Granularität

ein ganz spezifisches „Scatterbild“ der Lichtstreuung erzeugen. Anhand des

Scatterbildes können die Populationen auf dem Bildschirm klar voneinander

abgegrenzt werden (Vorwärts- und Seitwärts-Scatter-Ansicht der Leukozy-

tenpopulationen). Zudem liegen die Zellpopulationen bei richtiger Geräteein-

stellung an typischer Position und können mit fluoreszierenden Antikörpern

weiter differenziert und charakterisiert werden.

3.4.3 Monozytensubpopulationen und Monozyten-Thrombozyten-

Aggregate

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurden die einzelnen Monozytensubpopu-

lationen CD14+CD16-, CD14+CD16+ und die CD14-CD16+ Zellen in den A-

pheresaten analysiert. Neben ihrer Konzentration wurde ihr Gehalt (Yield) im

Konzentrat bestimmt. Der Zellgehalt pro Liter prozessiertes Blutvolumen, der

Zellgehalt pro Minute (Collection Rate), die Sammeleffizienz (Collection Effi-

ciency) und der Rekrutierungsfaktor (Recruitment Factor) wurden berechnet.

37

In gleicher Weise wurden die Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+

CD62+) analysiert, die sich nach der Leukapherese regelmäßig im Konzen-

trat ausbilden.

3.5 Spenderkollektiv Alle Blutspender, die an der Studie teilnahmen, waren gesund und entspra-

chen sowohl den Spendereignungskriterien der Hämotherapie-Richtlinien

(71) als auch den Empfehlungen des Council of Europe in der jeweils gülti-

gen Fassung. Alle wurden schriftlich über den Verwendungszweck der Spen-

de und den wissenschaftlichen Hintergrund der Studie aufgeklärt und gaben

ihre schriftliche Einwilligung. Die Spender wurden über den Studieninhalt da-

hingehend informiert, dass diese Untersuchungen der technischen Optimie-

rung der verwendeten Sammelverfahren dienen. Alle Aufklärungs- und

Fragebögen, sowie die Einverständniserklärung der Spender wurden zusam-

men mit dem Studienprofil der Ethikkommission der medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt und ange-

nommen (Ethikvoten Nr. 2247 und 2555).

Spender, die alle Spendereignungskriterien erfüllten, bei denen sich

aber aufgrund gehäufter Infekte oder niedriger Leukozytenzahlen (< 3000/µL

Blut) eine Störung der zellulären Immunabwehr vermuten ließ, wurden nicht

in die Studie aufgenommen. Eine Spende dauerte zwischen 60 und 185 Mi-

nuten. Nach jeder Spende wurden die Spender anhand eines Fragebogens

nach möglichen aufgetretenen Beschwerden gefragt, wobei darauf hinge-

wiesen wurde, nicht nur während oder kurz nach der Spende, sondern auch

längerfristig bestehende Befindlichkeitsstörungen anzugeben. Hierzu gehör-

ten Fragen nach einer möglichen Zitrat-Unverträglichkeit, welche durch ACD-

A, ein Zitronensäure-haltiges Antikoagulans, ausgelöst werden und sich in

Kribbelparästhesien der Extremitäten oder in Muskelkrämpfen äußern kann.

Desweiteren wurde nach Hinweisen auf verminderte körperliche Be-

lastbarkeit, ungewöhnliche Müdigkeit oder erhöhte Infektanfälligkeit gefragt.

38

3.6 Statistische Datenauswertung

Die gesammelten Daten wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm

SPSS® (SPSS® für Windows®, Version 15.1, SPSS Inc., Chicago, Illinois,

USA) eingegeben und ausgewertet. Dabei wurde die Normalverteilung der

Daten mittels Shapiro-Wilks-Test überprüft. Waren Ergebnisse normalver-teilt, wurde der T-Test für ungepaarte oder gepaarte Stichproben durchge-

führt. Bei nicht-normalverteilten Ergebnissen erfolgte die statistische Analy-

se der Daten mit dem U-Test (Mann-Whitney-Wilcoxon). Unterschiede wur-

den in dieser Arbeit dann als signifikant eingestuft, wenn sich die Mittelwerte

der Daten signifikant (p ≤ 0,05) oder hoch signifikant (p ≤ 0,01) unterschieden

und die Irrtumswahrscheinlichkeit unter 5% lag.

Für die graphische Darstellung der Daten wurde der Box-and-

Whiskers-Plot (kurz als Boxplot bezeichnet) verwendet. Die in den Blutpro-

ben (vor der Spende, nach der Spende, im Apheresat) enthaltenen Zellpopu-

lationen konnten dadurch in einer deskriptiven Statisitk anschaulich darge-

stellt werden. Dabei wurden alle Boxplots, die die Ergebnisse eines Zellsepa-

rators bzw. einer Geräteeinstellung widerspiegeln, jeweils in anderer Farbe

gekennzeichnet als die Kästchen der Vergleichsgruppe, um eine Unterschei-

dung zu erleichtern. Fünf wichtige Kenngrößen werden im Boxplot darge-

stellt: Die Querlinie unterhalb bzw. oberhalb des Kästchens bildet das 25%-

bzw. das 75%-Quantil ab. Der Balken zwischen diesen Quantilen stellt den

Median (50%-Quantil) dar, der Bereich zwischen dem 75%- und dem 25%-

Quantil wird als Interquartilbereich bezeichnet und in Form des Kästchens

dargestellt. Das Kästchen zeigt also die Verteilung der mittleren 50% der

Werte an. Liegt der Median genau in der Mitte des Kästchens, ist die Vertei-

lung der Werte symmetrisch. Dann entspricht der Median dem Mittelwert. Be-

findet sich der Median nicht in der Mitte, sondern ist zu einem Rand des

Kästchens hin verschoben, ist die Verteilung um den Median schief und Me-

dian und Mittelwert entsprechen sich nicht.

39

3.7 Berechnungen und Formeln

Die Konzentration der CD14-positiven Zellen vor der Spende, nach der

Spende, sowie im Konzentrat wurde folgendermaßen berechnet:

(1) Zellkonzentration [Zellen/µL] = CD14+ [%] × WBC [Zellen/µL] / 100

Die Anzahl CD14-positiven Zellen pro Liter Vollblut wurde auf folgende Wei-

se berechnet:

(2) CD14+ im Vollblut = Zellkonzentration [Zellen/µL] × TBV [mL]

Der Gewinn („yield“, Y) einer Zellpopulation im Apheresat wurde wie folgt be-

rechnet:

(3) Zellgehalt (Yield) = Zellkonzentration im Produkt [Zellen/µL] x Konzentratvolumen [mL]

Der Zellgewinn pro Liter prozessiertes Blutvolumen wurde so berechnet:

(4) Zellgehalt pro Liter PBV* [Zellen/L] = Yield / PBV [L]

*PBV (prozessiertes Blutvolumen [mL] ) = totales Blutvolumen [mL] – ACD-

A-Volumen [mL]

Die Sammelrate (SR), d.h. der pro Minute erzielte Zellgewinn, wurde folgen-

dermaßen berechnet:

(5) SR [Zellen/ min.] = Yield / Separationszeit [min.]

40

Die Berechnung der Sammeleffizienz („collection efficiency“, CE) erfolgte fol-

gendermaßen:

(6) CE [%] = (Yield x 100) / [PBV [mL] x 0,5 x (ZK vor der Spende [Zellen

/µL]+ ZK nach der Spende [Zellen/µL])]

Berechnung des Rekrutierungsfaktors („recruitment factor“, RF):

(8) RF = (absolute Zellzahl nach der Spende + absolute Zellzahl im

Apheresat) / absolute Zellzahl vor der Spende

41

4. Ergebnisse

Insgesamt nahmen 72 Blutspender an der Studie teil (n = 72). Davon waren

15 Personen weiblichen und 57 Personen männlichen Geschlechts.

4.1 Separationsergebnisse mit dem COBE Spectra Zellseparator

4.1.1 Sammelergebnisse mit varianter Zentrifugendrehzahl

In einem ungepaarten Vergleich wurden die Sammelergebnisse der COBE

Spectra hinsichtlich der Verwendung unterschiedlicher Zentrifugendrehzah-

len miteinander verglichen. Spender, die mit der Zentrifugengeschwindigkeit

von 646 U/min. des Standard-WBK-Programmes (Blutfluss: 50 mL pro Minu-

te) leukapheresiert wurden, werden im Folgenden als Gruppe A bezeichnet

und Spender, bei denen mit der modifizierten Zentrifugendrehzahl von 708

U/min. (Blutfluss: 60 mL pro Minute) zentrifugiert wurde, als Gruppe B. Alle

relevanten Spenderdaten und Geräteeinstellungen sind in Tabelle 1 zusam-

mengefasst.

Tabelle 1: Spender- und Gerätedaten

Messung (MW ± SA) 646/50 708/60 p-Wert

Anzahl der Spender 29 20

Männlich/weiblich 20/9 20/0

Gewicht (kg) 74,9 ± 10,5 81,6 ± 13,3 0,06*

Separationszeit (min.) 115 ± 17 118 ± 13 0,62*

PBV (mL) 5791 ± 849 6948 ± 789 0,00*

TBV (mL) 5015 ± 767 5530 ± 822 0,03*

Konzentrat-Volumen (mL) 109 ± 17 111 ± 14 0,57*

* T-Test, ♦ U-Test

Die Leukapheresen mit der COBE Spectra dauerten durchschnittlich 115 Mi-

nuten (646 U/min.) bzw. 118 Minuten (708 U/min.). Die totalen Blutvolumina

(TBV) der Spender beider Gruppen differierten signifikant (p = 0,03). Bei

42

Verwendung einer höheren Blutflussrate von 60 mL/min., die mit einer höhe-

ren Zentrifugendrehzahl verbunden war, wurde ein signifikant größeres Blut-

volumen (Mittelwert: 6948 mL) prozessiert als bei Leukapheresen, die mit

niedrigerer Blutflussrate (50 mL/min.) separiert wurden (Zentrifugendrehzahl:

646 Umdrehungen pro Minute, Mittelwert: 5791 mL). Die gewonnenen Kon-

zentratvolumina der beiden Gruppen unterschieden sich nicht signifikant.

Tabelle 2 zeigt die Blutwerte der Spender vor und nach der Leukaphe-

rese. Dabei fanden sich beim Vergleich der beiden Gruppen keine signifi-

kanten Unterschiede für die einzelnen analysierten Zellpopulationen mit Aus-

nahme der Erythrozyten (RBC). Deren Konzentration war in den vor und

nach Ablauf der Leukapherese entnommenen Blutproben von Spendern der

Gruppe B hinsichtlich des Mittelwertes signifikant höher als in den Blutproben

der Vergleichsgruppe.

Tabelle 2: Ergebnisse der Blutproben vor und nach der Spende


WBCs (x109/L)

Vor der Spende

5,74 ± 1,45

5,82 ± 1,01

0,64♦

Nach der Spende 5,68 ± 1,41 5,35 ± 1,42 0,21♦

CD14+ Zellen (%)

Vor der Spende 7,71 ± 1,90 7,09 ± 1,56 0,24*

Nach der Spende 7,26 ± 1,67 6,98 ± 1,76 0,57*

CD14+ Zellen (x106/L)

Vor der Spende 436 ± 136 398 ± 158 0,38*

Nach der Spende 406 ± 116 360 ± 164 0,26*

RBCs (x1012/L)

Vor der Spende 4,73 ± 0,39 5,06 ± 0,36 0,00*

Nach der Spende 4,57 ± 0,40 4,81 ± 0,36 0,04*

PLTs (x109/L)

Vor der Spende 228 ± 37 217 ± 43 0,23♦

Nach der Spende 204 ± 37 206 ± 89 0,18♦


43

Tabelle 3 gibt einen Überblick über die Produktdaten der beiden Gruppen.

Die Leukozytenkonzentration im Apheresat lag zwischen 24,7 x 109 und 84,2

x 109 pro Liter (646 U/min.) bzw. zwischen 16,5 x 109 und 55,2 x 109 Leuko-

zyten pro Liter (708 U/min.). Die Mittelwerte der Leukozyten-konzentrationen

unterschieden sich bei beiden Geräteeinstellungen nicht signifikant. Ebenso

war der durchschnittliche Prozentsatz an CD14-positiven Zellen in den Kon-

zentraten der Gruppe A (Spannbreite: 9,0% bis 34,4%) und denen der Grup-

pe B (Spannbreite: 12,8% bis 31,7%) fast gleich. Auch die Erythrozyten- und

Thrombozytenzahlen im Konzentrat zeigten keine signifikanten Unterschiede

zwischen den beiden Gruppen. In den Leukapheresaten der Gruppe A waren

im Durchschnitt höhere Erythrozyten- und minimal höhere Thrombozyten-

konzentrationen enthalten als in denen der Vergleichsgruppe.

Tabelle 3: Produktdaten der Leukozyten und der Restzellen


WBCs (x109/L) 40,1 ± 11,9 42,1 ± 12,2 0,29♦

CD14+ Zellen (%) 19,3 ± 5,52 21,2 ± 5,85 0,30♦

RBCs (x1012/L) 0,88 ± 0,39 0,76 ± 0,25 0,22*

PLTs (x109/L) 875 ± 297 857 ± 340 0,74♦


Die absolute Monozytenanzahl (CD14+CD16-) im Apheresat variierte zwi-

schen 0,27 x 109 und 1,19 x 109 (646 U/min.) bzw. zwischen 3,56 x 109 und

15,5 x 109 (708 U/min.) Zellen. Zwar wurden bei höherem Blutfluss und hö-

herer Zentrifugengeschwindigkeit (708 U/min.) durchschnittlich höhere Mono-

zytenwerte bei Zellkonzentration, Zellgehalt, Yield pro Liter PBV und Yield

pro Minute erzielt, die Unterschiede zur Vergleichsgruppe waren aber nicht

statistisch signifikant (Tabelle 4). Die Absammlung von CD14+CD16- Mono-

zyten gelang im Durchschnitt bei höherem Blutfluss mit 708 U/min. effizienter

(Spannbreite: 22,6% bis 61,3%) als bei Verwendung eines Blutflusses von 50

mL/min. bei niedrigerer Zentrifugendrehzahl (Spannbreite: 16,8% bis 58,2%).

Der errechnete Rekrutmentfaktor war für Monozyten bei beiden Gruppen fast

identisch (p = 0,99).

44

Tabelle 4: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (Monozyten)


CD14+CD16- (x109/L) 7,61 ± 2,52 9,00 ± 3,82 0,13*

CD14+CD16- Yield (x109) 0,82 ± 0,28 1,01 ± 0,49 0,10*

CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 1,57 ± 0,53 1,59 ± 0,69 0,90*

CD14+CD16- CR (x107/min.) 0,71 ± 0,23 0,85 ± 0,37 0,12*

CD14+CD16- CE (%) 37,7 ± 10,2 40,1 ± 12,7 0,50*

CD14+CD16- RF 1,35 ± 0,21 1,35 ± 0,24 0,99*


Wie Tabelle 5 zeigt, waren Konzentration, Yield, Yield pro Liter PBV, Yield

pro Minute (Collection Rate) und Sammeleffizienz der CD14+CD16+ Subpo-

pulation in den Konzentraten der Gruppe B im Durchschnitt höher. Zudem

waren die Gewinne an CD14+CD16+ Monozyten in den Apheresaten der

Gruppe A deutlich variabler (Spannbreite: 0,04 x 107 bis 16,7 x 107 CD14+

CD16+ Zellen) als in den Produkten der Gruppe B (Spannbreite: 1,97 x 107

bis 10,5 x 107 Zellen). Alleine der Rekrutmentfaktor erreichte bei Spen-dern

der Gruppe A (50 mL/min.) höhere Werte. Alle beschriebenen Unterschiede

zwischen den Gruppen waren jedoch aufgrund der Streubreite der einzelnen

Werte und der kleinen Fallzahlen nicht statistisch signifikant.

Tabelle 5: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen


CD14+CD16+ (x106/L) 350 ± 318 419 ± 208 0,08♦

CD14+CD16+ Yield (x107) 3,82 ± 3,36 4,68 ± 2,57 0,07♦

CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 7,33 ± 7,23 7,37 ± 3,75 0,38♦

CD14+CD16+ CR (x105/min.) 3,28 ± 2,94 3,95 ± 2,01 0,09♦

CD14+CD16+ CE (%) 46,5 ± 17,6 51,9 ± 17,1 0,30*

CD14+CD16+ RF 1,47 ± 0,46 1,33 ± 0,42 0,20♦


Im Hinblick auf die CD14-CD16+ Zellpopulation gab es dagegen signifikante

Unterschiede zwischen beiden Gruppen (Tabelle 6). Die Zellkonzentration

45

und der Zell-Yield der CD14-CD16+ Zellen erreichten bei Leukapheresen mit

höherer Blutflussrate im Produkt signifikant höhere Werte (Spannbreite: 2,20

x 107 bis 16,2 x 107 Zellen) bei gleichzeitig etwas geringerem Restzellgehalt

als bei Leukapheresen mit der Standardeinstellung bei einem Separations-

faktor von 250 (Zentrifugendrehzahl: 646 U/min.). Die Spannbrei-te lag hier-

bei zwischen 0,18 x 107 und 12,9 x 107 Zellen.

Grafik 1: CD14-CD16+ Zellen im Konzentrat (pro Mikroliter)

Auch die Sammelrate, welche als prozessiertes Blutvolumen pro Minute defi-

niert ist, lag bei Apheresen mit höherem Blutfluss (60 mL pro Minute) mit

einem Durchschnittswert von 7,40 x 105 pro Minute signifikant höher als bei

Apheresen der Vergleichsgruppe (Mittelwert: 4,89 x 105; p = 0,02). Der Zell-

gehalt (Yield) pro Liter PBV und die Sammeleffizienz differierten dagegen

nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen, wobei bei Leukapheresen

der Gruppe A gelegentlich CD14-CD16+ Sammeleffizienzen von über 100%

erreicht wurden (Spannbreite: 3,0% bis 120%). Bei Leukapheresen der Grup-

46

pe B reichte die Sammeleffizienz von 15,2% bis zu 76,8% und die Spann-

breite zwischen den einzelnen Messungen war damit deutlich geringer als

bei der Vergleichsgruppe.

Tabelle 6: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen


CD14-CD16+ (x106/L) 522 ± 287 785 ± 390 0,04♦

CD14-CD16+ Yield (x107) 5,69 ± 3,31 8,90 ± 4,77 0,04♦

CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 10,8 ± 5,98 13,7 ± 6,82 0,21♦

CD14-CD16+ CR (x105/min.) 4,89 ± 2,66 7,40 ± 3,72 0,02*

CD14-CD16+ CE (%) 41,1 ± 24,7 47,6 ± 18,3 0,33*

CD14-CD16+ RF 1,49 ± 0,53 1,63 ± 1,07 0,94♦


Die in den Aphereseprodukten gemessenen Konzentrationen an Monozyten-

Thrombozyten-Aggregaten unterschieden sich nicht signifikant voneinander.

Gleiches galt für die berechneten Werte Yield, Yield pro Liter PBV, Collection

Rate, Sammeleffizienz und Rekrutmentfaktor. Alle Werte waren im Test auf

Normalverteilung nach Shapiro-Wilk nicht normalverteilt. Die Signifikanz wur-

de deshalb mit dem Wilcoxon-Test für (un-)verbundene Stichproben berech-

net.

Tabelle 7: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) im Produkt


CD14+CD62+ (x106/L) 419 ± 646 465 ± 669 0,49♦

CD14+CD62+ Yield (x106) 49,7 ± 90,9 49,7 ± 67,8 0,44♦

CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 8,60 ± 13,2 8,09 ± 11,4 0,87♦

CD14+CD62+ CR (x105/min.) 3,91 ± 6,03 4,35 ± 6,12 0,51♦

CD14+CD62+ CE (%) 157 ± 243 297 ± 426 0,49♦

CD14+CD62+ RF 2,27 ± 5,89 2,70 ± 4,21 0,61♦


Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit Erhöhung der Blutflussrate von

50 mL pro Minute auf 60 mL pro Minute und damit der Zentrifugendrehzahl

47

(von 646 U/min. auf 708 U/min.) die Sammelergebnisse der COBE Spectra

sowohl quantitativ als auch qualitativ verbessert werden konnten. In ver-

gleichbarer Spendezeit wurden bei Leukapheresen mit einer Blutflussrate

von 60 mL/min. durchschnittlich größere Blutvolumina prozessiert und daher

größere Mengen an Leukozyten gesammelt. Auch die gewünschte Zellfrak-

tion der CD14-positiven Zellen sowie die analysierten Subpopulationen, ins-

besondere die CD14-CD16+ Zellen, waren bei Verwendung der höheren

Blutflussrate in größerer Zahl in den Apheresaten enthalten. Gleichzeitig war

der Restzellgehalt hier niedriger.

4.1.2 Sammelergebnisse im Hinblick auf das Verhältnis von

prozessiertem zu totalem Blutvolumen

In einem zweiten ungepaarten Vergleich wurden die Sammelergebnisse der

COBE Spectra mit Blick auf das Verhältnis von prozessiertem zu totalem

Blutvolumen analysiert. Spender, deren PBV-TBV-Verhältnis zwischen 0,8

und 1,2 betrug, wurden zur Gruppe A zusammengefasst und Spender, deren

PBV-TBV-Verhältnis zwischen 1,2 und 1,6 lag, zur Gruppe B. Alle Daten der

Spender und der Produkte sind in Tabelle 8 zusammengefasst.

Tabelle 8: Spender- und Gerätedaten

Messung (MW ± SA) 0,8 – 1,2 (Gr. A) 1,2 – 1,6 (Gr. B) p-Wert



Gewicht (kg) 80,6 ± 11,8 71,7 ± 11,3 0,005*

Separationszeit (min.) 116 ± 9,92 127 ± 19,2 0,01*

PBV (mL) 6047 ± 776 6958 ± 1088 0,001*

TBV (mL) 5472 ± 739 4722 ± 742 0,00*

Konzentrat-Volumen (mL) 111 ± 10,4 118 ± 22,5 0,43♦


Die Separationszeit unterschied sich zwischen beiden Gruppen signifikant

(p = 0,01). In dieser Zeit wurden im Schnitt 111 mL (Gruppe A) bzw. 118 mL

48

(Gruppe B) Apheresat gewonnen. Die Leuko- und Thrombozytenzahlen vor

der Spende sowie der Anteil der CD14+ Zellen an den Gesamtleukozyten

waren bei beiden Gruppen nicht signifikant verschieden. Die Erythrozyten-

zahl vor der Spende unterschied sich signifikant (Tabelle 9). Gleiches galt für

die nach der Spende entnommenen Blutproben.


Messung (MW ± SA) 0,8 – 1,2 1,2 – 1,6 p-Wert

WBCs (x109/L)

Vor der Spende 6,03 ± 1,29 5,71 ± 1,4 0,09♦

Nach der Spende 5,75 ± 1,40 5,41 ± 1,50 0,25♦

CD14+ Zellen (%)

Vor der Spende 7,24 ± 1,69 7,92 ± 2,11 0,18*

Nach der Spende 7,08 ± 1,58 7,07 ± 1,91 0,995*


Vor der Spende 442 ± 149 431 ± 170 0,79*

Nach der Spende 406 ± 129 362 ± 131 0,19*

RBCs (x1012/L)

Vor der Spende 4,94 ± 0,36 4,72 ± 0,40 0,03*

Nach der Spende 4,76 ± 0,32 4,51 ± 0,41 0,01*

PLTs (x109/L)

Vor der Spende 223 ± 39 231 ± 50 0,61♦

Nach der Spende 206 ± 72 194 ± 38 0,82♦


Die Produktdaten der Leukapheresen sind in Tabelle 10 zusammengefasst.

Die Leukozytenkonzentration im Apheresat variierte zwischen 16,5 x 109 und

84,2 x 109 (PBV/TBV 0,8 – 1,2) bzw. zwischen 32,3 x 109 und 55,5 x109 pro

Liter (PBV/TBV 1,2 – 1,6). Die T- und U-Teste differierten hinsichtlich der mit-

tleren Leukozytenkonzentration in den Apheresaten. Im Gegensatz zum nicht

statistisch signifikanten Ergebnis des U-Tests unterschied sich die mittlere

Leukozytenkonzentration in den Produkten der Vergleichsgruppen nach Aus-

sage des T-Tests signifikant voneinander. Da die Werte aber nicht normal-

verteilt waren, gilt der im U-Test berechnete p-Wert. Der Anteil der CD14-

49

positiven Zellen an den Gesamtleukozyten lag bei Spendern der Gruppe A

zwischen 9,0% und 34,4% (Spender der Gruppe B: 14,5% - 31,7%).



WBCs (x109/L) 40,5 ± 12,2 51,6 ± 24,8 0,06♦

CD14+ Zellen (%) 20,2 ± 6,94 21,7 ± 5,66 0,39*

RBCs (x1012/L) 0,92 ± 0,39 0,69 ± 0,21 0,007*

PLTs (x109/L) 1016± 518 1655±2071 0,74♦


Die Thrombozytenkonzentration im Produkt war bei den Spendern mit höhe-

rem PBV-TBV-Verhältnis (Spannbreite: 486 x 109 bis 3297 x 109 pro Liter)

deutlich, wenn auch wegen der großen Streubreite der Einzelwerte nicht sig-

nifikant höher als bei den Spendern mit niedrigem PBV-TBV-Verhältnis

(Spannbreite: 363 x 109 bis 1632 x 109 pro Liter). Anders verhielt es sich mit

der Erythrozytenkonzentration im Apheresat, welche bei Spendern mit ho-

hem PBV-TBV-Verhältnis (1,2 – 1,6) deutlich (p = 0,007) niedriger (Mittel-

wert: 0,69 x 1012/L) war als bei Spendern mit niedrigem PBV-TBV-Verhältnis

(Mittelwert: 0,92 x 1012/L).



CD14+CD16- (x109/L) 8,03 ± 3,10 11,9 ± 9,10 0,047*

CD14+CD16- Yield (x109) 0,89 ± 0,34 1,38 ± 1,03 0,03*

CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 1,64 ± 0,68 2,08 ± 1,19 0,08*

CD14+CD16- CR (x107/min.) 0,77 ± 0,29 1,06 ± 0,67 0,03*

CD14+CD16- CE (%) 38,7 ± 11,4 49,8 ± 16,8 0,004*

CD14+CD16- RF 1,31 ± 0,21 1,47 ± 0,20 0,003♦


Tabelle 11 gibt einen Überblick über die Produktdaten der CD14+CD16- Mo-

nozyten. Sie zeigt, dass ein hohes PBV-TBV-Verhältnis (1,2 - 1,6) der Spen-

der zu signifikant höheren Erträgen an CD14+CD16- Zellen (Spannbreite:

50

0,58 x 109 bis 1,81 x 109 Zellen) im Produkt führte als ein niedriges PBV-

TBV-Verhältnis (Spannbreite: 0,27 x 109 bis 1,24 x 109 Zellen).

Grafik 2: CD14+CD16- Gehalt im Konzentrat (x 109)

Gleiches galt für die CD14+CD16- Konzentration (p = 0,047), den pro Minute

erzielten Zellgehalt (p = 0,03) sowie für Sammeleffizienz (p = 0,004) und

Rekruitment Factor (p = 0,003). Lediglich die Sammelrate zeigte keine signifi-

kanten Unterschiede zwischen den Vergleichsgruppen.



CD14+CD16+ (x106/L) 380 ± 317 582 ± 564 0,08♦

CD14+CD16+ Yield (x107) 4,13 ± 3,20 6,81 ± 6,40 0,04♦

CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 7,87 ± 7,36 10,1 ± 7,88 0,13♦

CD14+CD16+ CR (x105/min.) 3,62 ± 2,97 5,16 ± 4,34 0,10♦

CD14+CD16+ CE (%) 46,6 ± 17,8 68,5 ± 26,8 0,001♦

CD14+CD16+ RF 1,33 ± 0,48 1,72 ± 0,51 0,001♦


51

Wie Tabelle 12 zeigt, enthielten die Apheresate der Gruppe B im Schnitt

CD14+CD16+ Zellen in deutlich höheren Konzentrationen (Spannbreite: 180

x 106 bis 802 x 106 pro Liter) als die Apheresate der Gruppe A (Spannbreite:

4 x 106 bis 1724 x 106 pro Liter). Gleiches galt in geringerem Maße auch für

den Gehalt der CD14+CD16+ Zellen pro Liter PBV sowie für die Sammelrate.

Grafik 3: CD14+CD16+ Gehalt im Konzentrat (x 107)

Im Hinblick auf den Zellertrag waren die Mittelwerte der CD14+CD16+ Mono-

zytenpopulation in den Apheresaten der beiden Gruppen statistisch signifi-

kant (p = 0,04) verschieden. Ebenso verhielt es sich mit der Sammeleffizienz

(p = 0,001) und dem Rekrutierungsfaktor (p = 0,001). Die im Durchschnitt hö-

heren Zellerträge fanden sich dabei in den Apheresaten der Spender mit

hohem Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen.

52

Grafik 4: CD14+CD16+ Sammeleffizienz (in Prozent)

Die CD14-CD16+ Zellkonzentration erreichte in den Produkten Werte zwi-

schen 239 x 106 und 1430 x 106 (Gruppe B) bzw. zwischen 17 x 106 und

1175 x 106 (Gruppe A) pro Liter und unterschied sich bei den beiden Grup-

pen deutlich, aber nicht signifikant. Tabelle 13 gibt einen Überblick über die

relevanten Daten.



CD14-CD16+ (x106/L) 606 ± 331 839 ± 524 0,06*

CD14-CD16+ Yield (x107) 6,66 ± 3,60 9,96 ± 6,41 0,02*

CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,2 ± 6,75 15,0 ± 8,12 0,16*

CD14-CD16+ CR (x105/min.) 5,78 ± 3,10 7,65 ± 4,49 0,08*

CD14-CD16+ CE (%) 38,4 ± 18,4 61,5 ± 32,0 0,001*

CD14-CD16+ RF 1,38 ± 0,86 1,85 ± 0,73 0,00♦


53

Auch im Hinblick auf die Population der CD14-CD16+ Zellen gab es sig-

nifikante Unterschiede zwischen den beiden Spenderkollektiven. Der Gehalt

an CD14-CD16+ Zellen war in den Apheresaten von Spendern mit hohem

Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen deutlich größer

(Spannbreite: 2,4 x 107 bis 16,2 x 107) als in den Apheresaten der Ver-

gleichsgruppe (Spannbreite: 0,2 x 107 bis 12,9 x 107). Gleiches galt für die

Sammeleffizienz, die bei Spendern der Gruppe B Werte zwischen 23,4% und

135% annahm, während sie bei Spendern der Gruppe A lediglich zwischen

3% und 78% lag. Eine Sammeleffizienz von mehr als 100% kann durch die

Rekrutierung von Leukozytensubpopulationen während der Apherese erklärt

werden (80). Dazu passt der im Gegensatz zur Vergleichsgruppe signifikant

höhere Rekrutmentfaktor bei Spendern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis.

Grafik 5: CD14-CD16+ Gehalt im Konzentrat (x 107)

Die durchschnittliche Konzentration der Monozyten-Thrombozyten-Aggregate

(CD14+CD62+) war in den Produkten von Spendern mit hohem Verhältnis

54

von prozessiertem zu totalem Blutvolumen um den Faktor 2, der CD14+

CD62+ Yield sogar fast um den Faktor 3 höher (Spannbreite: 0,4 x 106 bis

726 x 106) als in den Produkten der Vergleichsgruppe (Spannbreite: 0,7 x 106

bis 91,9 x 106). Aufgrund der ausgeprägten Streubreite der einzelnen Mess-

werte erreichte dieser Unterschied aber keine statistische Rele-vanz.

Gleiches galt in geringerem Ausmaß für alle anderen in Tabelle 14 aufgeführ-

ten Werte. Alle Werte waren im Test auf Normalverteilung nach Shapiro-Wilk

nicht normalverteilt und die Signifikanz wurde deshalb mit dem Willcoxon-

Test für (un-)verbundene Stichproben berechnet.



CD14+CD62+ (x106/L) 516 ± 957 1210±1615 0,08♦

CD14+CD62+ Yield (x106) 59,9 ± 119 152 ± 224 0,06♦

CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 10,9 ± 21,6 22,3 ± 30,6 0,11♦

CD14+CD62+ CR (x105/min.) 5,06 ± 9,84 10,9 ± 14,4 0,10♦

CD14+CD62+ CE (%) 277 ± 452 383 ± 780 0,84♦

CD14+CD62+ RF 2,71 ± 5,91 3,72 ± 6,52 0,42♦


Ein günstiges, also hohes Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolu-

men fand sich bei Spendern mit geringem Körpergewicht. Hierbei wurde das

TBV im Mittel mehr als einmal prozessiert und dies führte zu einer höheren

Leukozytenkonzentration in den Zellapheresaten. Im Vergleich zur Kontroll-

gruppe war die Verunreinigung des Apheresates mit Thrombozyten größer

und mit Erythrozyten geringer. Die einzelnen Monozytensubpopulationen

konnten bei Spendern mit hohem Verhältnis von prozessiertem zu totalem

Blutvolumen ebenfalls in höherer Zellkonzentration und mit besserer Sam-

meleffizienz gesammelt werden.

55

4.2 Separationsergebnisse mit dem COM.TEC Zellseparator

4.2.1 Sammelergebnisse mit varianter Zentrifugendrehzahl

Bei Leukapheresen mit dem COM.TEC Zellseparator wurden bei Gebrauch

des MNC-Programmes zwei verschiedene Zentrifugendrehzahlen, 1500

U/min. (Standard) und 1000 U/min. (modifiziert), verwendet und die jeweils

erzielten Ergebnisse in einem gepaarten Vergleich analysiert. Im Gegensatz

zur Untersuchung mit der COBE Spectra wurde hier die Blutflussrate

konstant bei 50 mL/min. gehalten. Zusätzlich wurde in einem ungepaarten

Vergleich eine weitaus größere Stichprobe von 79 Leukapheresen auf

Unterschiede hinsichtlich der Sammelergebnisse bei Einsatz dieser beiden

Zentrifugengeschwindigkeiten untersucht. Ein Mittelwertvergleich erfolgte in

diesem Fall aufgrund der Inhomogenität der beiden Gruppen nicht.

Tabelle 15: Spender- und Gerätedaten (gepaarte Analyse)

Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000 p-Wert

Anzahl der Spenden 5 5


Gewicht (kg) 87,8 ± 7,73 87,4 ± 7,3 0,94*

Separationszeit (min.) 89,0 ± 1,23 96,4 ± 7,40 0,09*

Spillovervolumen (mL) 11,0 ± 1,90 9,04 ± 1,25 0,09*

PBV (mL) 4058 ± 77,9 4396 ± 508 0,21*

TBV (mL) 5856 ± 532 5668 ± 679 0,64*



Spender, die mit einer Zentrifugengeschwindigkeit von 1500 U/min. leuk-

apheresiert wurden, wurden zur Gruppe A zusammengefasst und Spender,

bei denen mit 1000 U/min. apheresiert wurde, zur Gruppe B. Alle Leukaphe-

resen erfolgten mit dem MNC-Programm der COM.TEC. Der Blutfluss betrug

jeweils 50 mL pro Minute. Tabelle 15 gibt eine Übersicht über alle Daten zu

den Spendern und den Geräteeinstellungen.

56

Die Leukozyten-, Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen der Spender vor

und nach der Spende unterschieden sich nicht signifikant voneinander (Ta-

belle 16). Die Separationszeit betrug durchschnittlich 89 Minuten (1500

U/min.) bzw. 96 Minuten (1000 U/min.). Während dieser Zeit wurde im

Durchschnitt 103 mL (1500 U/min.) bzw. 117 mL (1000 U/min.) Apheresat

gewonnen.

Tabelle 16: Blutproben vor und nach der Spende (gepaarte Analyse)


WBCs (x109/L) Vor der Spende 5,31 ± 1,00 5,15 ± 0,61 0,76*

Nach der Spende 5,03 ± 0,97 4,85 ± 1,43 0,83*

CD14+ Zellen (%) Vor der Spende 9,13 ± 2,42 7,54 ± 2,14 0,30*

Nach der Spende 8,64 ± 2,36 6,91 ± 1,85 0,23*

CD14+ (x106/L)

Vor der Spende 490 ± 187 393 ± 142 0,39*

Nach der Spende 428 ± 137 337 ± 150 0,35*

RBCs (x1012/L)

Vor der Spende 4,70 ± 0,27 4,82 ± 0,46 0,62*

Nach der Spende 4,76 ± 0,23 4,68 ± 0,55 0,77*

PLTs (x109/L)

Vor der Spende 233 ± 60,1 234 ± 58,3 0,98*

Nach der Spende 192 ± 43,3 199 ± 57,8 0,84*


Die Analyse der Sammelergebnisse der großen Stichprobe der ungepaarten

Leukapheresen zeigte, dass bei fast gleicher Spendezeit bei beiden Gruppen

eine vergleichbare Menge Blutvolumen prozessiert und ein beinahe gleiches

Konzentratvolumen gewonnen wurde (Tabelle 17).

57

Tabelle 17: Spender- und Gerätedaten (ungepaarte Analyse)

Messung (MW ± SA) U/min.=1500 U/min.=1000



Gewicht (kg) 77,4 ± 10,7 85,8 ± 10,6 Separationszeit (min.) 95,2 ± 11,3 94,0 ± 6,9 Spillovervolumen (mL) 10,7 ± 2,34 9,36 ± 1,13

PBV (mL) 4274 ± 503 4265 ± 425 TBV (mL) 5086 ± 738 5558 ± 729 Konzentrat-Volumen (mL) 111 ± 11,7 113 ± 15,4

Die Leukozytenkonzentration im Apheresat war bei Verwendung der Zentrifu-

gengeschwindigkeit von 1500 Umdrehungen pro Minute mit durchschnittlich

52,3 x 109 Zellen pro Liter signifikant höher als bei Zentrifugation mit 1000

Umdrehungen pro Minute (23,0 x 109 pro Liter). Die gemessenen Leukozy-

tenkonzentrationen im Produkt reichten von 25,2 x 109 bis 71,5 x 109 Zellen

pro Liter (1500 U/min.) bzw. von 8,1 x 109 bis 39,1 x 109 (1000 U/min.) Zellen

pro Liter.

Tabelle 18: Produktdaten der Leukozyten und Restzellen (gepaarte Analyse)


WBCs (x109/L) 52,3 ± 18,9 23,0 ± 13,7 0,02*

CD14+ Zellen (%) 23,1 ± 6,26 18,2 ± 2,54 0,15*

RBCs (x1012/L) 0,68 ± 0,24 0,99 ± 0,41 0,19*

PLTs (x109/L) 3619± 827 2008± 1780 0,12*


58

Grafik 6: Leukozytenkonzentration im Konzentrat (x 109 pro Liter)

Auch der prozentuale Anteil der CD14-positiven Zellen an den Gesamt-

leukozyten war in den Konzentraten der Gruppe A (1500 U/min.) größer als

in denen der Gruppe B und betrug zwischen 18,0% und 33,6 %, während er

in den Apheresaten der Gruppe B (1000 U/min.) Werte zwischen 14,3% und

20,6% annahm.

Wie Grafik 7 verdeutlicht, war die Thrombozytenkonzentration in den

Apheresaten der Gruppe A im Durchschnitt deutlich höher als in Leukaphere-

saten der Gruppe B (Spannbreite: 333 x 109 bis 4115 x 109 pro Liter) und be-

trug zwischen 2958 x 109 und 4777 x 109 pro Liter. Anders verhielt es sich

mit den Erythrozyten im Konzentrat. Hier fanden sich die höheren Konzentra-

tionen in den Apheresaten, bei denen mit der niedrigeren Geschwindigkeit

von 1000 U/min. zentrifugiert worden war. Wegen der großen Streubreite der

Einzelwerte erreichten beide beschriebenen Unterschiede zwischen den Ver-

gleichsgruppen keine statistische Signifikanz.

59

Grafik 7: Thrombozytenkonzentration im Konzentrat (x 109 pro Liter)

Auch bei Betrachtung der großen Gruppe der ungepaarten Leukapheresen

konnte bei annähernd gleichen Ausgangswerten für Leukozyten, Erythrozy-

ten und Thrombozyten (in den Blutproben vor der Spende gemessen) mit der

höheren Zentrifugengeschwindigkeit (1500 U/min.) deutlich mehr Buffy Coat

gesammelt und ein höherer prozentualer Anteil an CD14-positiven Leu-

kozyten erzielt werden. Auch hinsichtlich der Restzellen im Konzentrat ent-

sprachen sich die Ergebnisse der gepaarten und der ungepaarten Analyse

weitgehend. Die Kontamination des Apheresates mit Erythrozyten war bei

der Gruppe B deutlich höher als in Apheresaten der Gruppe A. Die mittlere

Thrombozyten-Kontamination der Apheresate war hier in etwa gleich groß.

Tabelle 19: Produktdaten der Leukozyten und Restzellen (ungepaarte Analyse)


WBCs (x109/L) 43,1 ± 17,8 29,9 ± 15,2 CD14+ Zellen (%) 23,5 ± 6,74 19,5 ± 3,57 RBCs (x1012/L) 0,65 ± 0,26 0,91 ± 0,34 PLTs (x109/L) 2506±1628 2403±1739

60

Die Konzentration an CD14+CD16- Monozyten im Apheresat differierte signi-

fikant zwischen den Leukapheresen der Gruppen A und B. Bei 1500 U/min.

errechnete sich eine Spannbreite zwischen 4,5 x 109 und 24,0 x 109 Zellen

pro Liter. Bei 1000 U/min. lag die Spannbreite zwischen 1,2 x 109 und 7,6 x

109 Zellen pro Liter. Wie aus Tabelle 20 hervorgeht, gab es keine weiteren

signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die absolute

CD14+CD16- Monozytenzahl im Apheresat lag zwischen 0,48 x 109 und 2,67

x 109 (1500 U/min.) bzw. zwischen 0,14 x 109 und 0,80 x 109 (1000 U/min.).

Mit der höheren Zentrifugengeschwindigkeit (1500 U/min.) war die Ausbeute

an CD14+CD16- Zellen deutlich größer und die Sammeleffizienz (Spannbrei-

te: 42,4% bis 104%) besser als bei Zentrifugation mit 1000 U/min. (Spann-

breite: 8,6% bis 83,7%).

Tabelle 20: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (gepaarte Analyse)


CD14+CD16- (x109/L) 12,7 ± 7,21 4,33 ± 2,78 0,04*

CD14+CD16- Yield (x109) 1,33 ± 0,83 0,49 ± 0,29 0,07*

CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 3,71 ± 2,37 1,28 ± 0,81 0,06*

CD14+CD16- CR (x107/min.) 1,49 ± 0,94 0,53 ± 0,33 0,06*

CD14+CD16- CE (%) 75,3 ± 25,4 45,0 ± 36,4 0,17*

CD14+CD16- RF 1,34 ± 0,17 1,13 ± 0,29 0,22♦


Ähnlich verhielt es sich mit der großen Gruppe der ungepaart betrachteten

Leukapheresen. Mit der Kammerdrehzahl von 1500 U/min. konnte im Schnitt

eine deutlich höhere Konzentration an CD14+CD16- Zellen im Konzentrat er-

reicht werden als mit der niedrigeren Zentrifugengeschwindigkeit. Gleiches

galt für die übrigen Parameter (siehe Tabelle 21).

61

Tabelle 21: Produktdaten der CD14+CD16- Zellen (ungepaarte Analyse)


CD14+CD16- (x109/L) 10,1 ± 5,28 6,09 ± 3,63 CD14+CD16- Yield (x109) 1,11 ± 0,57 0,67 ± 0,37 CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 2,94 ± 1,49 1,79 ± 1,03 CD14+CD16- CR (x107/min.) 1,18 ± 0,60 0,73 ± 0,43 CD14+CD16- CE (%) 72,6 ± 30,5 51,3 ± 29,4 CD14+CD16- RF 1,39 ± 0,31 1,18 ± 0,25

Tabelle 22 gibt einen Überblick über die CD14+CD16+ Zellen im Apheresat.

Die gemessenen CD14+CD16+ Zellzahlen im Produkt lagen zwischen 1,82 x

107 und 6,40 x 107 (Gruppe A) bzw. zwischen 1,09 x 107 und 7,55 x 107

(Gruppe B). Wenn auch alle Produktdaten der Spender der Gruppe A zum

Teil deutlich höhere Werte erreichten als die Produktdaten der Vergleichs-

gruppe, zeigten sich doch keine signifikanten Unterschiede zwischen den

Gruppen.

Tabelle 22: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen (gepaarte Analyse)


CD14+CD16+ (x106/L) 421 ± 201 289 ± 255 0,39*

CD14+CD16+ Yield (x107) 4,42 ± 2,21 3,34 ± 2,74 0,52*

CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,2 ± 6,10 8,63 ± 4,47 0,43*

CD14+CD16+ CR (x105/min.) 4,95 ± 2,46 3,55 ± 3,09 0,45*

CD14+CD16+ CE (%) 96,8 ± 47,9 57,8 ± 42,3 0,21*

CD14+CD16+ RF 1,31 ± 0,41 1,11 ± 0,41 0,47*


Tabelle 23 fasst die Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen zusammen (un-

gepaarte Analyse). Wie bereits für den gepaarten Vergleich beschrieben,

wurde auch die CD14+CD16+ Subpopulation der Monozyten bei höherer

Zentrifugendrehzahl von 1500 U/min. in größerer Menge und effektiver abge-

sammelt als mit 1000 U/min..

62

Tabelle 23: Produktdaten der CD14+CD16+ Zellen (ungepaarte Analyse)


CD14+CD16+ (x106/L) 439 ± 264 378 ± 296 CD14+CD16+ Yield (x107) 4,87 ± 3,06 4,19 ± 3,07 CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,8 ± 7,36 11,1 ± 8,43 CD14+CD16+ CR (x105/min.) 5,12 ± 2,90 4,57 ± 3,55 CD14+CD16+ CE (%) 94,8 ± 47,3 64,2 ± 37,1 CD14+CD16+ RF 1,49 ± 0,57 1,08 ± 0,32

Die CD14-CD16+ Zellen erreichten im Apheresat Konzentrationen zwischen

802 x 106 und 1692 x 106 (1500 U/min.) bzw. zwischen 105 x 106 und 1028 x

106 (1000 U/min.) Zellen pro Liter, die mittlere CD14-CD16+ Zellkonzentra-

tion lag in den Apheresaten der Gruppe A um mehr als das Doppelte höher

als in den Apheresaten der Gruppe B und unterschied sich damit signifikant

zwischen den beiden Gruppen.

Tabelle 24: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen (gepaarte Analyse)


CD14-CD16+ (x106/L) 1171± 417 457 ± 369 0,047♦

CD14-CD16+ Yield (x107) 12,1 ± 4,47 5,30 ± 4,03 0,047♦

CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 33,4 ± 12,1 13,8 ± 10,8 0,047♦

CD14-CD16+ CR (x105/min.) 13,6 ± 4,95 5,63 ± 4,49 0,03*

CD14-CD16+ CE (%) 68,4 ± 35,4 51,1 ± 32,8 0,45*

CD14-CD16+ RF 1,32 ± 0,23 1,04 ± 0,44 0,23*


Gleiches galt für den CD14-CD16+ Yield, der zwischen 8,44 x 107 und 17,1 x

107 (1500 U/min.) bzw. zwischen 1,15 x 107 und 10,8 x 107 (1000 U/min.) lag,

sowie für den pro Liter PBV und den pro Minute erzielten Zellgehalt. Die be-

stehenden Unterschiede der beiden Gruppen hinsichtlich der Sammeleffi-

zienz und des Rekrutmentfaktors der CD14-CD16+ Zellen waren dagegen

nicht signifikant (Tabelle 24).

63

Auch die Betrachtung der großen Gruppe der ungepaarten Leukapheresen

zeigt, dass die CD14-CD16+ Zellen in den Apheresaten, die mit 1500 U/min.

gewonnen wurden, in größerer Anzahl und Konzentration vorhanden waren

als in den Apheresaten der Vergleichsgruppe. Die Unterschiede zwischen

den Gruppen erscheinen erneut sehr deutlich, wenn auch hier der Beleg die-

ser Beobachtung durch eine signifikante statistische Testaussage fehlt.

Tabelle 25: Produktdaten der CD14-CD16+ Zellen (ungepaarte Analyse)


CD14-CD16+ (x106/L) 740 ± 367 526 ± 364

CD14-CD16+ Yield (x107) 8,19 ± 4,11 5,90 ± 3,93 CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 21,7 ± 10,7 15,7 ± 10,8 CD14-CD16+ CR (x105/min.) 8,70 ± 4,34 6,35 ± 4,33 CD14-CD16+ CE (%) 79,2 ± 39,1 50,3 ± 26,6 CD14-CD16+ RF 1,44 ± 0,48 1,01 ± 0,35

Mit Blick auf das Vorkommen von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten im

Produkt zeigten die Vergleichsgruppen deutliche Unterschiede (Tabelle 26).

So war beispielsweise der mittlere CD14+CD62+ Gehalt in den mit 1500

U/min. erzielten Apheresaten beinahe um den Faktor 3 höher (Spannbreite:

6,54 x 106 bis 303 x 106 Aggregate) als in den Apheresaten der Vergleichs-

gruppe (Spannbreite: 0,89 x 106 bis 107 x 106 Aggregate). Ähnlich verhielt es

sich mit den anderen von Tabelle 26 gezeigten Produktdaten.

Tabelle 26: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) (gepaart)


CD14+CD62+ (x106/L) 917 ± 1075 336 ± 448 0,30*

CD14+CD62+ Yield (x106) 98,0 ± 119 36,0 ± 46,6 0,31*

CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 27,3 ± 33,5 9,80 ± 12,9 0,31*

CD14+CD62+ CR (x105/min.) 11,1 ± 13,4 3,99 ± 5,22 0,30*

CD14+CD62+ CE (%) 507 ± 481 35,0 ± 39,7 0,09*

CD14+CD62+ RF 2,03 ± 1,57 0,55 ± 0,53 0,08*


64

Aufgrund der sehr großen Streubreite der Messwerte in den einzelnen Pro-

dukten war die Aussagekraft der statistischen Testung eingeschränkt und die

deutlichen Unterschiede zwischen den Vergleichsgruppen erreichten keine

statistische Signifikanz.


Hinsichtlich der Monozyten-Thrombozyten-Aggregate im Apheresat stimmte

das Ergebnis der gepaarten Analyse mit dem Resultat der ungepaarten Da-

tenanalyse weitgehend überein. Wie Tabelle 27 zeigt, waren CD14+CD62+

Konzentration, Yield, Yield pro Liter PBV und Yield pro Minute in den

Apheresaten der Gruppe A im Durchschnitt um ein Vielfaches höher (Faktor

5) als in den Produkten der Gruppe B. Die Streubreite der einzelnen Mess-

werte und die Standardabweichung der Mittelwerte waren hierbei sehr hoch.

Daher erreichten auch diese Unterschiede statistisch keine Signifikanz.

65

Tabelle 27: Monozyten-Thrombozyten-Aggregate (CD14+CD62+) (ungepaart)


CD14+CD62+ (x106/L) 1433±2075 299 ± 377 CD14+CD62+ Yield (x106) 155 ± 222 31,8 ± 39,3 CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 40,0 ± 55,1 8,69 ± 10,9 CD14+CD62+ CR (x105/min.) 16,1 ± 21,8 3,56 ± 4,41 CD14+CD62+ CE (%) 477 ± 1051 57,4 ± 55,5

CD14+CD62+ RF 2,99 ± 5,94 0,53 ± 0,45

Die Ergebnisse der gepaarten und ungepaarten Analyse zeigen, dass mit Er-

höhung der Zentrifugendrehzahl von 1000 auf 1500 U/min. insgesamt bes-

sere Sammelergebnisse erzielt werden konnten. In kürzerer Zeit wurden leu-

kozytenreichere Apheresate gesammelt, welche die gewünschten CD14-po-

sitiven Zellen in höherer Konzentration enthielten. Zwar wurden auch die ver-

unreinigenden Thrombozyten in größerer Zahl mit abgesammelt, die Ery-

throzytenzahlen waren in den Produkten, die mit der Zentrifugengeschwin-

digkeit von 1500 U/min. gewonnen wurden, aber niedriger.

4.2.2 Sammelergebnisse im Hinblick auf das Verhältnis von

prozessiertem zu totalem Blutvolumen

Ausgehend von Unterschieden im Verhältnis von prozessiertem zu totalem

Blutvolumen der Spender wurden zwei Spenderkollektive gebildet und die

Sammelergebnisse der beiden Gruppen in einem ungepaarten Vergleich

einander gegenübergestellt. Alle Spender, deren PBV-TBV-Verhältnis zwi-

schen 0,5 und 0,8 betrug, wurden zu einer Gruppe zusammengefasst und

alle, deren PBV-TBV-Verhältnis zwischen 0,8 und 1,25 lag, zu einer zweiten.

Alle Daten, die Spender und COM.TEC-Einstellungen betreffen, sind in Ta-

belle 28 zusammengefasst.

66

Tabelle 28: Spender- und Gerätedaten zum PBV-TBV-Verhältnis

Messung (MW ± SA) 0,5 – 0,8 (Gr. A) 0,8 – 1,25 (Gr. B) p-Wert



Gewicht (kg) 82,9 ± 8,62 67,0 ± 7,05 0,001♦

Separationszeit (min.)

Spillover-Volumen (mL)

92,5 ± 6,48

10,5 ± 2,17 101 ± 16,2

10,7 ± 2,58 0,02♦

0,94♦

PBV (mL) 4132 ± 246 4616 ± 733 0,008♦

TBV (mL) 5481 ± 495 4288 ± 553 0,001♦



Ein niedriges Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen fand sich

bei Spendern mit hohem totalem Blutvolumen. Ein signifikant höheres Ver-

hältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen wiesen die weiblichen

Spender in der Gruppe mit hohem PBV-TBV-Verhältnis auf, da sie insgesamt

ein niedrigeres totales Blutvolumen haben. Bei etwas längerer Spendezeit

(ebenfalls signifikant) in der weiblichen Spendergruppe wurde deshalb in bei-

den Gruppen eine vergleichbare Menge an Zellkonzentrat gewonnen. In die-

sem Zusammenhang muss noch darauf hingewiesen werden, dass die Men-

ge des Zellkonzentrats von der Voreinstellung des Buffy Coat-Volumens am

Zellseparator abhängt.

Tabelle 29 gibt einen Überblick über die Ergebnisse aus den Untersu-

chungen der Blutproben der Spender vor und nach Ablauf der Leukapherese.

Zwischen beiden Spenderkollektiven unterschieden sich die Leukozytenwer-

te sowohl hinsichtlich des prozentualen als auch des absoluten Zellanteils

signifikant, bei nahezu identischem Anteil der CD14-positiven Zellen in den

Blutproben vor und nach der Spende. Die Erythrozytenwerte nach der

Spende waren bei Spendern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis signifikant nie-

driger (Mittelwert: 4,49 x 1012 pro Liter) als bei Spendern mit niedrigem PBV-

TBV-Verhältnis (Mittelwert: 4,71 x 1012 pro Liter). Alle übrigen Messwerte

unterschieden sich bei den Spendern beider Gruppen nicht signifikant.

67



WBCs (x109/L)

Vor der Spende 5,54 ± 1,24 5,55 ± 1,04 0,99*

Nach der Spende 5,09 ± 1,27 5,33 ± 1,26 0,46*

CD14+ Zellen (%)

Vor der Spende 8,28 ± 1,84 7,24 ± 1,65 0,02♦

Nach der Spende 7,84 ± 1,79 6,41 ± 1,46 0,005♦


Vor der Spende 435 ± 166 328 ± 183 0,03♦

Nach der Spende 384 ± 148 279 ± 161 0,01♦

RBCs (x1012/L)

Vor der Spende 4,81 ± 0,29 4,72 ± 0,41 0,37*

Nach der Spende 4,71 ± 0,29 4,49 ± 0,34 0,01♦

PLTs (x109/L)

Vor der Spende 245 ± 60 232 ± 36 0,35*

Nach der Spende 201 ± 48 179 ± 22 0,12♦


Tabelle 30 zeigt die Zellkonzentrationen der Leukozyten, Erythrozyten und

Thrombozyten im Konzentrat. Die Leukozytenkonzentration lag in den Aphe-

resaten der Spender mit hohem Verhältnis von prozessiertem zu totalem

Blutvolumen zwischen 17,7 x 109 und 69,0 x 109 pro Liter, während bei

Spendern mit niedrigem PBV-TBV-Verhältnis Leukozytenkonzentrationen

zwischen 8,1 x 109 und 82,5 x 109 pro Liter gemessen wurden. Der Prozent-

satz an CD14-positiven Zellen war bei den Vergleichsgruppen annähernd

gleich. In den Apheresaten der Spender mit hohem PBV-TBV-Verhältnis fan-

den sich durchschnittlich etwas höhere Konzentrationen an verunreinigenden

Erythrozyten und Thrombozyten.

68



WBCs (x109/L) 40,3 ± 17,8 45,3 ± 18,2 0,26*

CD14+ Zellen (%) 23,4 ± 6,27 22,0 ± 7,44 0,29♦

RBCs (x1012/L) 0,65 ± 0,27 0,72 ± 0,32 0,29♦

PLTs (x109/L) 2373± 1583 2784± 1742 0,26♦


Der Gehalt an CD14+CD16- Zellen im Apheresat lag zwischen 1,2 x 109 und

24,0 x 109 (Gruppe A) bzw. zwischen 3,0 x 109 und 27,0 x 109 (Gruppe B) pro

Liter. Der Vergleich der Ergebnisse beider Untersuchungsgruppen erbrachte

keinen signifikanten Unterschied. Nur der Rekrutierungs-faktor war bei Spen-

dern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis im T-Test signifikant höher als bei der

Vergleichsgruppe. Hier differieren T- und U-Test in ihrer statistischen Aus-

sage. Da entsprechend dem Shapiro-Wilk-Test keine Normalverteilung der

Werte vorlag, wurde der U-Test zum Mittelwertvergleich herangezogen (p =

0,05).



CD14+CD16- (x109/L) 9,72 ± 5,10 9,51 ± 5,81 0,70♦

CD14+CD16- Yield (x109) 1,06 ± 0,56 1,07 ± 0,61 0,88♦

CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 2,89 ± 1,55 2,62 ± 1,30 0,57♦

CD14+CD16- CR (x107/min.) 1,16 ± 0,62 1,07 ± 0,53 0,69♦

CD14+CD16- CE (%) 70,5 ± 32,3 69,6 ± 27,4 0,91*

CD14+CD16- RF 1,32 ± 0,28 1,50 ± 0,34 0,05♦


Tabelle 32 gibt einen Überblick über die Daten der CD14+CD16+ Mo-no-

zytensubpopulation. Zwar waren Zellkonzentration, Zellgehalt, Gehalt pro

Liter PBV und Gehalt pro Minute bei Spendern mit hohem PBV-TBV-Verhält-

nis im Durchschnitt deutlich höher als beim Vergleichskollektiv, aufgrund der

ausgeprägten Streubreite der einzelnen Messwerte erreichte dieser Unter-

schied aber keine statistische Signifikanz.

69



CD14+CD16+ (x106/L) 403 ± 218 514 ± 366 0,49♦

CD14+CD16+ Yield (x107) 4,43 ± 2,41 5,85 ± 4,29 0,41♦

CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,0 ± 6,46 14,3 ± 9,71 0,62♦

CD14+CD16+ CR (x105/min.) 4,82 ± 2,64 5,75 ± 3,70 0,61♦

CD14+CD16+ CE (%) 89,3 ± 48,3 97,0 ± 44,1 0,49♦

CD14+CD16+ RF 1,31 ± 0,53 1,82 ± 0,48 0,001♦


Die Konzentration der CD14+CD16+ Monozyten in Apheresaten von Spen-

dern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis lag zwischen 125 x 106 und 1390 x 106

Zellen pro Liter, während sie bei Spendern mit niedrigem PBV-TBV-Ver-

hältnis zwischen 92 x 106 und 918 x 106 Zellen pro Liter betrug. Nur der Re-

krutmentfaktor erreichte bei Spendern mit einem PBV-TBV-Verhältnis zwi-

schen 0,8 und 1,25 signifikant höhere Werte als bei Spendern der Ver-

gleichsgruppe.



CD14-CD16+ (x106/L) 713 ± 350 728 ± 432 0,88*

CD14-CD16+ Yield (x107) 7,80 ± 3,80 8,33 ± 5,03 0,63*

CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 21,1 ± 10,1 20,7 ± 13,0 0,89*

CD14-CD16+ CR (x105/min.) 8,44 ± 4,03 8,47 ± 5,36 0,98*

CD14-CD16+ CE (%) 73,3 ± 41,9 83,4 ± 28,6 0,08♦

CD14-CD16+ RF 1,28 ± 0,43 1,70 ± 0,52 0,001♦


Betrachtet man die Population der CD14-CD16+ Zellen, so waren Konzen-

tration und Zellgehalt in den Konzentraten der Spender beider Gruppen nicht

signifikant verschieden (Tabelle 33). Unterschiede zeigten sich jedoch in der

mittleren CD14-CD16+ Sammeleffizienz, die bei Spendern mit hohem Ver-

hältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen zwischen 31,7% und

136% streute, wobei sich diese Streuung bei Spendern mit niedrigem PBV-

70

TBV-Verhältnis noch deutlicher darstellte (Spannbreite: 12,2% bis 192%). Bei

beiden Spenderkollektiven wurden teilweise Sammeleffizienzen von mehr als

100% erreicht, wobei sich der Rekrutierungsfaktor zwischen den Vergleichs-

gruppen signifikant unterschied.

Die Konzentration von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten im Pro-

dukt von Spendern mit hohem PBV-TBV-Verhältnis (0,8 – 1,25) lag um den

Faktor 3 höher (Spannbreite: 3 x 106 bis 9883 x 106 pro Liter) als die Mittel-

werte der Vergleichsgruppe (Spannbreite: 4 x 106 bis 4179 x 106 pro Liter).

Aufgrund der Streubreite der Werte in beiden Gruppen war dieser Unter-

schied aber nicht statistisch signifikant. Gleiches galt für den Gehalt an

CD14+CD62+ Zellaggregaten, sowie deren Yield pro Liter. Einen Überblick

hierzu gewährt Tabelle 34.



CD14+CD62+ (x106/L) 966 ± 1404 2283± 2950 0,17♦

CD14+CD62+ Yield (x106) 102 ± 143 253 ± 321 0,14♦

CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 27,7 ± 39,0 61,8 ± 76,5 0,18♦

CD14+CD62+ CR (x105/min.) 11,3 ± 15,9 24,5 ± 29,6 0,16♦

CD14+CD62+ CE (%) 447 ± 1074 386 ± 776 0,82♦

CD14+CD62+ RF 2,64 ± 5,54 2,93 ± 6,09 0,91♦


Insgesamt ließ sich erkennen, dass bei Spendern mit hohem Verhältnis von

prozessiertem zu totalem Blutvolumen zwar alle Zellpopulationen in den

Apheresaten in höherer Konzentration vorhanden waren. Aufgrund der deutli-

chen Streubreite der einzelnen Ergebnisse zeigte sich jedoch nur selten ein

statistisch signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen.

71

4.3 Vergleich der Sammelergebnisse von COM.TEC und COBE

4.3.1 COM.TEC (1500 U/min.) und COBE Spectra (646 U/min.) Die Sammelergebnisse der beiden Zellseparatoren wurden in einem gepaar-

ten Vergleich analysiert. Beim COM.TEC-Zellseparator war die Zentrifugen-

drehzahl auf 1500 U/min. eingestellt (Standard), bei der COBE Spectra auf

646 U/min. (reduzierter Separationsfaktor von 250). Der Blutfluss wurde bei

beiden Geräten auf 50 mL/min. eingestellt.

Tabelle 35: Spender- und Gerätedaten der beiden Zellseparatoren

Messung (MW ± SA) COM.TEC

1500 U/min.

COBE

646 U/min.

p-Wert



Gewicht (kg) 75,8 ± 14,0 75,8 ± 14,0 1,00♦

Separationszeit (min.) 98,3 ± 14,7 127 ± 27,1 0,041♦

PBV (mL) 4332 ± 640 6375 ± 1345 0,004♦

TBV (mL) 4996 ± 972 5022 ± 1007 0,96*



Leukapheresen am COBE Spectra-Gerät erforderten mit 127 Minuten eine

signifikant längere Separationszeit als Apheresen mit der COM.TEC (98 Mi-

nuten). Folglich wurde bei vergleichbarem totalen Blutvolumen in beiden

Untersuchungsgruppen mit der COBE Spectra ein signifikant größeres Blut-

volumen prozessiert (p = 0,004). Die Konzentratvolumina waren hingegen

vergleichbar (siehe Tabelle 35). Die Leukozyten-, Erythrozyten- und Throm-

bozytenkonzentrationen in den Blutproben der Spender vor und nach der

Leukapherese zeigten keine signifikanten Unterschiede (Tabelle 36).

72


Messung (MW ± SA) COM.TEC COBE p-Wert


Nach der Spende 5,45 ± 1,24 5,40 ± 0,99 0,94*

CD14+ Zellen (%)

Vor der Spende 7,51 ± 0,94 8,19 ± 1,82 0,43*

Nach der Spende 7,70 ± 1,42 8,08 ± 1,73 0,68*

CD14+ (x 106/L) Vor der Spende 434 ± 166 456 ± 131 0,81*

Nach der Spende 429 ± 175 434 ± 116 0,82♦

RBCs (x1012/L)

Vor der Spende 4,55 ± 0,40 4,52 ± 0,33 0,91*

Nach der Spende 4,52 ± 0,38 4,40 ± 0,38 0,59*

PLTs (x109/L)

Vor der Spende 221 ± 68,2 222 ± 35,0 0,98*

Nach der Spende 194 ± 68,2 204 ± 48,2 0,49♦


Tabelle 37 gibt einen Überblick über die Produktdaten der Leukapheresen

beider Gruppen. Die Leukozytenkonzentration lag in den Produkten zwischen

17,7 x 109 und 67,7 x 109 Zellen pro Liter (COM.TEC) bzw. zwischen 34,5 x

109 und 48,2 x 109 Zellen pro Liter (COBE). Somit war, wie Grafik 11 veran-

schaulicht, die Streubreite der einzelnen Leukozyten-Messwerte bei der

COBE Spectra deutlich geringer als bei der COM.TEC. Die COBE Spectra

lieferte folglich, was die Sammlung des Buffy Coat betrifft, wesentlich kon-

stantere Ergebnisse als der COM.TEC Zellseparator. Die mittlere Leukozy-

tenkonzentration im Apheresat war hingegen bei beiden Zellseparatoren fast

identisch.

73

Grafik 9: Leukozyten im Konzentrat (x 109 pro Liter)

Auch der mittlere Anteil der CD14-positiven Monozyten an den Ge-samtleu-

kozyten war bei beiden Zellseparatoren fast gleich und erreichte Werte

zwischen 16,9% und 20,6% (COM.TEC) bzw. zwischen 15,3% und 25,2%

(COBE).



WBCs (x109/L) 39,0 ± 26,0 39,7 ± 5,66 0,39♦

CD14+ Zellen (%) 18,4 ± 1,54 19,3 ± 4,31 0,63*

RBCs (x1012/L) 0,51 ± 0,35 0,59 ± 0,14 0,31♦

PLTs (x109/L) 1238± 1051 917 ± 403 0,79♦


Die Kontamination des Apheresates mit Erythrozyten war bei Verwendung

der COBE Spectra etwas größer als bei der COM.TEC. Die Thrombo-zyten-

kontamination lag hingegen in den COM.TEC-Produkten höher (Spannbreite:

558 x 109 bis 3096 x 109 pro Liter) als in den Apheresaten der COBE Spectra

74

(Spannbreite: 487 x 109 bis 1426 x 109 pro Liter). Aufgrund der ausgeprägten

Streubreite der einzelnen Werte war dieser Unterschied zwischen den Zellse-

paratoren nicht statistisch signifikant.

Die mit der COM.TEC gewonnenen Apheresate enthielten zwischen

0,40 x 109 und 1,42 x 109 CD14+CD16- Monozyten, bei Leukapheresen mit

der COBE Spectra lag die Monozytenkonzentration etwas niedriger, bei Zell-

zahlen zwischen 0,58 x 109 und 1,32 x 109 pro Apheresat. Die Unterschiede

zwischen beiden Zellseparatoren waren statistisch nicht signifikant. Die restli-

chen Produktdaten hinsichtlich der CD14+CD16- Zellen sind in Tabelle 38

zusammengefasst.



CD14+CD16- (x109/L) 7,33 ± 5,18 7,85 ± 2,87 0,42♦

CD14+CD16- Yield (x109) 0,82 ± 0,56 0,90 ± 0,27 0,42♦

CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 2,92 ± 3,03 1,58 ± 0,55 1,00♦

CD14+CD16- CR (x107/min.) 0,87 ± 0,62 0,73 ± 0,26 0,87♦

CD14+CD16- CE (%) 66,6 ± 63,6 36,2 ± 9,91 0,30*

CD14+CD16- RF 1,38 ± 0,18 1,39 ± 0,22 0,92*


Wie Grafik 10 verdeutlicht, sammelte der COM.TEC Zellseparator die CD14+

CD16- Monozyten im Schnitt zwar deutlich effektiver (Spannbreite: 22,8% bis

82,5%) als die COBE Spectra (Spannbreite: 25,9% bis 48,7%), aufgrund der

wiederum sehr großen Streubreite der einzelnen berechneten Sammeleffi-

zienzen ließ sich aber kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den

beiden Zellseparatoren feststellen.

75

Grafik 10: CD14+CD16- Sammeleffizienz (in Prozent)

In den Apheresaten der COBE Spectra wurden Konzentrationen an CD14+

CD16+ Monozyten zwischen 2,6 x 106 und 9,6 x 106 Zellen pro Liter ge-

messen. Im Vergleich zu den Ergebnissen des COM.TEC Zellseparators, die

zwischen 3,2 x 106 und 7,2 x 106 Monozyten pro Liter lagen, zeigte die

COBE Spectra bei dieser Zellpopulation ein besseres Sammelergebnis.

Dementsprechend war auch der Gehalt (Yield) an CD14+CD16+ Monozyten

in den Produkten der COBE Spectra höher als bei der COM.TEC. Der Zellge-

halt reichte dabei von 1,88 x 107 bis 10,1 x 107 Zellen pro Apheresat. Die

Spannbreite dieser Zellen war in den Produkten der COM.TEC ebenfalls ge-

ringer ausgeprägt (1,37 x 107 und 5,18 x 107 Zellen pro Apheresat). Grafik 11

dient der graphischen Veranschaulichung der Unterschiede in der Sammlung

von CD14+CD16+ Monozyten zwischen den Zellseparatoren.

76

Grafik 11: CD14+CD16+ Gehalt im Konzentrat (* 107)

Mit dem COBE Spectra Zellseparator konnten zwar größere Mengen an

CD14+CD16+ Zellen gesammelt werden, die COM.TEC sammelte diese Zel-

len aber deutlich effektiver, wobei die Spannbreite der Sammeleffizienzen

der einzelnen Leukapheresen von 42,4% bis 136% reichte. Leukapheresen

mit der COBE Spectra zeigten lediglich Sammeleffizienzen zwischen 30,5%

und 64,2%.



CD14+CD16+ (x106/L) 266 ± 131 435 ± 274 0,20*

CD14+CD16+ Yield (x107) 3,02 ± 1,43 5,28 ± 3,70 0,21*

CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 9,61 ± 6,35 8,78 ± 5,50 0,81*

CD14+CD16+ CR (x105/min.) 3,13 ± 1,65 4,06 ± 2,60 0,48*

CD14+CD16+ CE (%) 95,6 ± 78,4 49,7 ± 14,4 0,26♦

CD14+CD16+ RF 1,66 ± 0,42 1,45 ± 0,34 0,36*


77

Aufgrund der teilweise erneut recht großen Streubreite der einzelnen Mess-

werte war keiner der beschriebenen Unterschiede zwischen den Zellsepara-

toren statistisch signifikant (Tabelle 39).

Wie Tabelle 40 zeigt, waren die Produktdaten der beiden Zellseparato-

ren hinsichtlich der CD14-CD16+ Zellen fast gleich. Ihr Gehalt variierte in den

einzelnen Apheresaten zwischen 2,65 x 107 und 17,1 x 107 (COM.TEC) bzw.

zwischen 5,09 x 107 und 13,7 x 107 CD14-CD16+ Zellen (COBE). Deutliche,

wenn auch aufgrund der hohen Standardabweichung nicht signifikante,

Unterschiede zwischen den beiden Zellseparatoren gab es bei Analyse der

Mittelwerte der CD14-CD16+ Sammeleffizienz. So war die COM.TEC

hinsichtlich der Sammlung jener Zellpopulation im Durchschnitt beinahe

doppelt so effektiv (Spannbreite: 31,7% bis 82,7 %) wie die COBE Spectra

(Spannbreite: 23,4% bis 92,3 %).



CD14-CD16+ (x106/L) 629 ± 507 654 ± 283 0,42♦

CD14-CD16+ Yield (x107) 7,01 ± 5,50 7,79 ± 3,68 0,42♦

CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 23,2 ± 20,2 13,2 ± 5,64 0,63♦

CD14-CD16+ CR (x105/min.) 7,49 ± 6,33 6,11 ± 2,71 0,87♦

CD14-CD16+ CE (%) 72,4 ± 36,5 48,7 ± 23,7 0,21*

CD14-CD16+ RF 1,72 ± 0,42 1,62 ± 0,53 0,71*


In den Produkten, die mit dem COM.TEC Zellseparator gewonnenen wurden,

befanden sich doppelt so hohe Konzentrationen an Monozyten-Thrombozy-

ten-Aggregaten (Spannbreite: 35 x 106 bis 2715 x 106 pro Liter) als in den

COBE Spectra-Apheresaten (Spannbreite: 4 x 106 bis 1215 x 106 pro Liter).

Wegen der hohen Streubreite der gemessenen Werte war dieser Unter-

schied aber nicht statistisch signifikant (Tabelle 41). Ähnlich verhielt es sich

mit dem Gehalt, der Sammelrate und der Sammeleffizienz dieser Zellaggre-

gate. Sie erreichten in den Produkten der COM.TEC deutlich, aber nicht sta-

tistisch signifikant höhere Werte. Der Rekrutmentfaktor dagegen lag bei

Apheresen mit der COBE Spectra höher.

78



CD14+CD62+ (x106/L) 1360±2167 644 ± 954 0,75♦

CD14+CD62+ Yield (x106) 150 ± 238 95,0 ± 167 0,63♦

CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 65,4 ± 120 13,3 ± 20,0 0,87♦

CD14+CD62+ CR (x105/min.) 16,1 ± 25,4 6,08 ± 9,07 0,75♦

CD14+CD62+ CE (%) 366 ± 422 200 ± 204 0,52♦

CD14+CD62+ RF 1,38 ± 0,80 1,94 ± 1,53 0,63♦


Als Quintessenz dieses ersten Vergleichs der Zellseparatoren COM.TEC und

COBE Spectra lässt sich sagen, dass keiner der beiden Zellseparatoren dem

anderen in seiner Eignung, CD14-positive Zellen zu sammeln, deutlich über-

legen war. Dadurch, dass bei Leukapheresen mit der COBE Spectra auf-

grund der signifikant längeren Spendedauer durchschnittlich ein signifikant

höheres Blutvolumen prozessiert wurde, konnten hier in den meisten Fällen

marginal höhere Leukozyten- und CD14+ Konzentrationen sowie größere

Mengen an den untersuchten Monozytensubpopulationen im Apheresat er-

zielt werden. Der COM.TEC-Zellseparator sammelte dagegen in wesentlich

kürzerer Zeit kaum weniger CD14-positive Zellen und andere leukozytäre

Subpopulationen und arbeitete folglich deutlich effizienter. Dabei konnten mit

dem COM.TEC Gerät in Einzelfällen Sammeleffizienzen von über 100 % er-

zielt werden.

79

4.3.2 COM.TEC (1500 U/min.) und COBE Spectra (708 U/min.)

In einem weiteren gepaarten Vergleich wurden die Sammelergebnisse der

COM.TEC (MNC-Programm mit 1500 U/min., Blutfluss mit 50 mL pro Minute)

und der COBE Spectra (WBK-Betrieb mit 708 U/min., Blutfluss mit 60 mL pro

Minute) einander gegenübergestellt. In dieser Versuchsreihe wurde der Blut-

fluss und infolgedessen die Zentrifugendrehzahl bei der COBE Spectra ver-

ändert.

Tabelle 42: Spender- und Gerätedaten der beiden Zellseparatoren

Messung (MW ± SA) COM.TEC

1500 U/min.

COBE

708 U/min.

p-Wert



Alter zum Zeitpkt. d. Spende ± ±

Gewicht (kg) 80,0 ± 10,3 79,1 ± 10,9 0,86*

Separationszeit (min.) 95,2 ± 10,4 122 ± 6,6 0,001♦

PBV (mL) 4351 ± 479 7293 ± 444 0,00♦

TBV (mL) 5398 ± 748 5385 ± 741 0,97*

Konzentrat-Volumen (mL) 109 ± 10,4 117 ± 11,3 0,14*


In der Separationsdauer unterschieden sich die beiden Zellseparatoren sehr

deutlich. Die Blutspende dauerte bei Verwendung der COM.TEC durch-

schnittlich 95 Minuten, mit der COBE 122 Minuten (p = 0,001). Aufgrund der

längeren Separationszeit wurde mit der COBE bei fast identischem totalem

Blutvolumen der Spender ein im Mittel deutlich größeres Blutvolumen pro-

zessiert und mehr Konzentrat gesammelt. Tabelle 43 zeigt die Blutwerte der

Spender vor und nach der Leukapherese. Dabei fanden sich im Vergleich der

beiden Zellseparatoren keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zell-

populationen.

80




Nach der Spende 5,18 ± 1,48 5,27 ± 1,62 0,91*

CD14+ Zellen (%)

Vor der Spende 8,13 ± 1,15 7,50 ± 0,99 0,24*

Nach der Spende 8,05 ± 1,50 7,42 ± 1,18 0,34*

CD14+ (x 106/L) Vor der Spende 436 ± 88,8 447 ± 120 0,84*

Nach der Spende 410 ± 112 388 ± 121 0,70*

RBCs (x1012/L)

Vor der Spende 4,92 ± 0,32 4,95 ± 0,36 0,87*

Nach der Spende 4,81 ± 0,33 4,66 ± 0,38 0,39*

PLTs (x109/L)

Vor der Spende 234 ± 44,4 216 ± 24,8 0,31*

Nach der Spende 200 ± 35,4 188 ± 21,9 0,38*


Die Sammelergebnisse des COM.TEC- und des COBE Spectra-Zellsepara-

tors sind in Tabelle 44 aufgeführt. Aus ihr wird ersichtlich, dass sich die Pro-

dukte der beiden Zellseparatoren hinsichtlich der Zusammensetzung der Zel-

len kaum unterscheiden. Die Leukozytenkonzentration der Produkte lag zwi-

schen 24,6 x 109 und 59,6 x 109 pro Liter (COM.TEC) bzw. zwischen 16,5 x

109 und 71,9 x 109 pro Liter (COBE Spectra).



WBCs (x109/L) 42,5 ± 13,4 42,6 ± 15,4 0,99*

CD14+ Zellen (%) 23,3 ± 3,33 23,1 ± 5,18 0,79*

RBCs (x1012/L) 0,66 ± 0,17 0,79 ± 0,26 0,23*

PLTs (x109/L) 2433± 1456 827 ± 263 0,04*


81

Auch der mittlere prozentuale Anteil der CD14-positiven Zellen an den Ge-

samtleukozyten war nahezu identisch und betrug bei der COM.TEC zwi-

schen 18,0% und 29,4% und bei der COBE Spectra zwischen 13,2% und

31,7%. Deutliche Unterschiede zwischen den Separationsergebnissen der

beiden Zellseparatoren bestanden allerdings im Restzellgehalt der Konzen-

trate.

Grafik 12: Erythrozyten im Konzentrat (x 1012 pro Liter)

Die Verunreinigung der Aphereseprodukte mit Erythrozyten war bei Verwen-

dung der COBE Spectra im Durchschnitt höher als bei der COM.TEC (Grafik

15). Die Apheresate der COM.TEC dagegen wiesen einen um den Faktor 3

und damit signifikant höheren Gehalt an Thrombozyten auf (Spannbreite: 864

x 109 und 4777 x 109 pro Liter). Produkte der COBE Spectra enthielten eine

geringere mittlere Thrombozytenkonzentration (Spannbreite: 494 x 109 und

1271 x 109 pro Liter). Grafik 13 verdeutlicht diesen Sachverhalt.

82

Grafik 13: Thrombozyten im Konzentrat (x 109 pro Liter)

Tabelle 45 gibt einen Überblick über die Sammelergebnisse der CD14+

CD16- Monozyten in den Apheresaten der beiden Zellseparatoren. Die Sepa-

rationszeit der COBE Spectra war zwar deutlich länger und infolge dessen

das prozessierte Blutvolumen deutlich größer (Tabelle 42), dennoch unter-

schieden sich Konzentration und Gehalt an CD14+CD16- Monozyten in den

Aphereseprodukten der beiden Zellseparatoren kaum voneinander.



CD14+CD16- (x109/L) 10,1 ± 3,61 9,82 ± 4,19 0,87*

CD14+CD16- Yield (x109) 1,11 ± 0,43 1,16 ± 0,54 0,84*

CD14+CD16- Yield/L PBV (x108) 2,85 ± 1,05 1,73 ± 0,75 0,02*

CD14+CD16- CR (x107/min.) 1,17 ± 0,46 0,94 ± 0,40 0,28*

CD14+CD16- CE (%) 68,4 ± 23,6 40,4 ± 11,2 0,008*

CD14+CD16- RF 1,43 ± 0,22 1,35 ± 0,20 0,44*


83

Dies ist damit zu erklären, dass der COM.TEC Zellseparator eine bessere

Sammeleffizienz der CD14+CD16- Zellen aufweist (Spannbreite: 37,1% bis

98,1%) als die COBE Spectra (Spannbreite: 21,7% bis 52,2%). Das

COM.TEC Gerät kann daher in kürzerer Zeit und nach Verarbeitung eines

geringeren Blutvolumens ein vergleichbares Sammelergebnis erzielen.

Grafik 14: CD14+CD16- Sammeleffizienz (in Prozent)

Gleiches zeigte sich bei Analyse der CD14+CD16+ Monozytenpopulation

(Tabelle 46). Trotz deutlich längerer Separationszeiten und größerer prozes-

sierter Blutvolumina bei Leukapheresen mit der COBE, waren CD14+CD16+

Konzentration und -Yield in den Konzentraten von COBE (Yield: 2,07 x 107

bis 10,5 x 107 Zellen) und COM.TEC (Yield: 1,82 x 107 bis 9,67 x 107 Zellen)

vergleichbar.

84


Dies kann wiederum dadurch erklärt werden, dass die Sammeleffizienz und

folglich der pro Liter PBV erzielte Zellgehalt bei Verwendung des COM.TEC

Zellseparators deutlich höhere Werte erreichten (Spannbreite der CD14+

CD16+ Sammeleffizienz: 41,4% bis 125%) als die Ergebnisse, die mit der

COBE Spectra erzielt werden konnten (Spannbreite der CD14+CD16+ Sam-

meleffizienz: 24,1% bis 70,3%).



CD14+CD16+ (x106/L) 432 ± 244 457 ± 228 0,82*

CD14+CD16+ Yield (x107) 4,75 ± 2,78 5,43 ± 2,94 0,62*

CD14+CD16+ Yield/L PBV (x106) 12,3 ± 7,35 8,07 ± 4,25 0,15*

CD14+CD16+ CR (x105/min.) 5,07 ± 2,99 4,42 ± 2,29 0,61*

CD14+CD16+ CE (%) 77,5 ± 31,3 50,8 ± 15,8 0,04*

CD14+CD16+ RF 1,39 ± 0,49 1,35 ± 0,31 0,84*


85

Auch bei Untersuchung der CD14-CD16+ Zellen fanden sich vergleichbare

Ergebnisse. Der Zellgehalt wies bei Verwendung der COM.TEC (Streubreite:

5,75 x 107 bis 17,4 x 107 Zellen) ähnliche Ergebnisse auf wie in den Produk-

ten der COBE Spectra (Streubreite: 2,20 x 107 bis 16,2 x 107 Zellen). Wie

aus Tabelle 47 ersichtlich, sammelte die COM.TEC pro Liter PBV gerechnet

signifikant mehr CD14-CD16+ Zellen und erreichte eine deut-lich höhere,

wenn auch nicht statistisch signifikant bessere, Sammeleffizienz

(Spannbreite: 30,7% bis 133%) als die COBE Spectra (Spannbreite: 15,2%

bis 68,8%). Der Rekrutierungsfaktor der CD14-CD16+ Zellen war in beiden

Untersuchungsgruppen im Mittel gleich.



CD14-CD16+ (x106/L) 1002± 393 927 ± 430 0,71*

CD14-CD16+ Yield (x107) 10,9 ± 4,35 11,0 ± 5,24 0,96*

CD14-CD16+ Yield/L PBV (x106) 27,9 ± 10,2 16,2 ± 7,63 0,01*

CD14-CD16+ CR (x105/min.) 11,4 ± 4,32 8,96 ± 4,17 0,23*

CD14-CD16+ CE (%) 75,4 ± 34,8 49,9 ± 15,3 0,07*

CD14-CD16+ RF 1,49 ± 0,36 1,49 ± 0,46 1,00*


Die Ergebnisse der Berechnung der Monozyten-Thrombozyten-Aggregate

fasst Tabelle 48 zusammen. In den Produkten der COM.TEC wurden 0,37 x

106 bis 353 x 106 Monozyten-Thrombozyten-Aggregate gemessen, in den

Apheresaten der COBE Spectra lag der Gehalt an Zellaggregaten zwischen

2,98 x 106 und 174 x 106. Bei Verwendung des COM.TEC Zellseparators lag

die mittlere Konzentration der CD14+CD62+ Zellaggregate im Apheresat im

Durchschnitt jeweils um den Faktor 2 höher als in den Apheresaten der

COBE Spectra. Aufgrund der großen Streubreite der Werte waren diese

Unterschiede aber nicht statistisch signifikant.

86



CD14+CD62+ (x106/L) 838 ± 1039 464 ± 539 0,90♦

CD14+CD62+ Yield (x106) 97,4 ± 126 52,4 ± 55,9 0,90♦

CD14+CD62+ Yield/L PBV (x106) 24,2 ± 31,6 8,16 ± 9,49 0,76♦

CD14+CD62+ CR (x105/min.) 9,65 ± 12,0 4,40 ± 4,99 0,90♦

CD14+CD62+ CE (%) 270 ± 368 207 ± 324 0,90♦

CD14+CD62+ RF 1,84 ± 2,83 1,67 ± 2,38 0,90♦


Insgesamt entsprechen die Ergebnisse der zweiten gepaarten Analyse von

COM.TEC und COBE denjenigen der ersten Gegenüberstellung weitgehend.

Der Leukozyten- und Monozytengehalt der Produkte der beiden Zellsepa-

ratoren war annähernd gleich. Wobei die COM.TEC auch dem modifizierten

Leukozytenprogramm der COBE Spectra hinsichtlich der Sammeleffizienz

der CD14-positiven und der CD14- und CD16-positiven Zellen deutlich über-

legen war. Unterschiede zwischen den beiden Zellseparatoren bestanden

auch im Restzellgehalt der Apheresate. Die Produkte der COM.TEC enthiel-

ten durchschnittlich höhere Thrombozytenkonzentrationen als die Produkte

der COBE Spectra. Die Erythrozytenkontamination war dagegen erneut in

den Apheresaten der COBE Spectra höher.

87

5. Diskussion

5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse

In dieser Arbeit wurden die Zellseparatoren COBE Spectra und COM.TEC

hinsichtlich ihrer Eignung untersucht, CD14-positive Monozyten und deren

Subpopulationen bei gesunden nicht-zytokinstimulierten Spendern zu sam-

meln. Dabei wurden die Sammelrate, die Sammeleffizienz und der Gehalt

dieser Zellen in den Leukozytenprodukten untersucht. Da der gesammelte

Buffy Coat in Abhängigkeit von verwendetem Zellseparator und gewählter

Geräteeinstellung eine unterschiedliche Zusammensetzung aufweist, wurde

auch der Restzellgehalt, die Erythrozyten, Thrombozyten und Monozyten-

Thrombozyten-Aggregate in diesen Zellkonzentraten analysiert. Zu diesem

Zweck verglichen wir nicht nur die Standardeinstellungen beider Zellsepara-

toren miteinander, sondern verwendeten auch modifizierte Einstellungen der

Leukozytenprogramme dieser Zellseparatoren.

Eine Änderung der verwendeten Zentrifugendrehzahl der Leukozyten-

programme führte zu deutlichen Unterschieden in den Sammelergebnissen

bei Verwendung des COM.TEC- (1500 U/min. vs. 1000 U/min.) und des

COBE Spectra-Zellseparators (646 U/min. vs. 708 U/min.). Bei Einstellung

der höheren Zentrifugendrehzahl konnte bei beiden Zellseparatoren ein hö-

herer Leukozytengehalt erzielt werden. Daraus resultierten auch bessere

Sammeleffizienzen für die CD14-positiven Zellen bei dem COBE Spectra-

(40,1% vs. 37,7%) und dem COM.TEC-Gerät (75,3% vs. 45,0%). Die Ergeb-

nisse der monozytären Subpopulationen verhielten sich entsprechend. Der

Restzellgehalt der Leukapheresate zeigte ebenfalls deutliche Unterschiede in

Abhängigkeit von der jeweils verwendeten Programmeinstellung.

Bei der COBE Spectra konnten der Erythrozyten- und Thrombozyten-

gehalt bei einem niedrigeren Trennfaktor von 250 (Standard: 500) und einem

höheren Blutfluss von 60 mL pro Minute (Standard: 50 mL pro Minute) und

einer resultierenden Zentrifugendrehzahl von 708 U/min. reduziert werden.

Bei Verwendung der COM.TEC führte der Gebrauch des modifizierten MNC-

Programmes mit einer Zentrifugendrehzahl von 1000 U/min. gegenüber 1500

88

U/min. (Standardeinstellung) ebenfalls zu einer niedrigeren Thrombozyten-

konzentration im Leukapheresat, der Erythrozytengehalt hingegen lag höher.

Da in Abhängigkeit von Körpergröße, Körpergewicht und Geschlecht

bei Blutspendern ein unterschiedliches totales Blutvolumen vorliegt, wurde in

einer weiteren ungepaarten Analyse die Abhängigkeit der Sammelergebnisse

vom Verhältnis des prozessierten zum totalen Blutvolumen untersucht. Dabei

zeigte sich, dass in den Apheresaten von Spendern, bei denen die Leuk-

apherese relativ lange dauerte und infolgedessen ein großes Blutvolumen

prozessiert wurde, Leukozyten, die gewünschte Fraktion der CD14-positiven

Monozyten und die analysierten Monozytensubpopulationen in höheren Kon-

zentrationen vorlagen. Der Restzellgehalt war in den Produkten des

COM.TEC Gerätes ebenfalls höher. Bei der COBE Spectra galt dies nur für

die Thrombozyten, der Erythrozytengehalt war niedriger als in den Apheresa-

ten der Vergleichsgruppe.

In einer gepaarten Analyse verglichen wir die Sammelergebnisse bei-

der Zellseparatoren unter Verwendung der Standardeinstellungen. Dabei fan-

den wir in den Apheresaten der beiden Zellseparatoren annähernd gleiche

Leukozyten- und Monozytenkonzentrationen. Obwohl in der Gruppe der

COBE Spectra eine signifikant längere Separationszeit ermittelt wurde (127

Minuten vs. 98 Minuten; p=0,04), sammelte der COM.TEC Zellseparator

CD14-positive Monozyten (66,6% vs. 36,2%) und die CD14- und CD16-posi-

tive Subpopulation (95,6% vs. 49,7%) deutlich effizienter als die COBE und

erreichte dabei teilweise Sammeleffizienzen von über 100 %. Hinsichtlich der

Kontamination der Leukapheresate mit Restzellen war die Thrombozyten-

konzentration in den Konzentraten der COM.TEC signifikant höher als bei

der COBE Spectra. Hinsichtlich des Erythrozytengehaltes in den Produkten

verhielt es sich hingegen umgekehrt.

In einer zweiten gepaarten Studie wurde die Produktivität des MNC-

Standardprogrammes der COM.TEC mit einem modifizierten WBK-Pro-

gramm der COBE Spectra verglichen. Der Trennfaktor war in diesem Fall bei

der COBE auf 250 reduziert und die Blutflussrate auf 60 mL pro Minute er-

höht worden (Zentrifugendrehzahl: 708 U/min.). Wie in der ersten gepaarten

Analyse waren auch hier der Leukozyten- und Monozytengehalt der Produkte

der beiden Zellseparatoren annähernd gleich und die COM.TEC war der

89

COBE Spectra, infolge der erneut deutlich kürzeren Separationsdauer, in der

Sammeleffizienz der CD14-positiven (68,4% vs. 40,4%) und der CD14- und

CD16-positiven Zellen (77,5% vs. 50,8%) deutlich überlegen. Unterschiede

zeigten sich auch im Restzellgehalt. Produkte der COM.TEC enthielten

durchschnittlich eine um den Faktor 3 höhere Thrombozytenkonzentration als

Produkte der COBE Spectra. Die Apheresate der COBE Spectra zeigten da-

gegen erneut eine höhere Erythrozytenkontamination.

5.2 Sammelergebnisse einzelner Zellpopulationen 5.2.1 Leukozyten und CD14-positive Monozyten

In den letzten Jahren besteht ein zunehmendes Interesse, monozytäre Zell-

konzentrate für die experimentelle Immuntherapie herzustellen. Durch Aphe-

rese gelingt es, mit geringem Arbeits- und Kostenaufwand große Mengen an

CD14-positiven Monozyten für experimentelle und therapeutische Zwecke zu

gewinnen (7). Durch einen zunehmenden Qualitätsanspruch an die

Zellkonzentrate hinsichtlich Reinheit und Zellgehalt steigen auch die Anforde-

rungen an die Zellseparatoren bezüglich Zellertrag, Sammeleffektivität und

Anteil der unerwünschten Restzellen im Produkt (84).

Zahlreiche Studien belegen, dass die Sammlung CD14-positiver Zellen mit

der COM.TEC sehr gut und effektiv gelingt (24, 77, 79). Zur Gewinnung

CD14-positiver Monozyten arbeitet der COM.TEC Zellseparator mit zwei

unterschiedlichen Leukaphereseprogrammen, dem MNC-Programm mit der

einstufigen Separationskammer und dem PBSC-Lym-Programm mit der

zweistufigen Kammer. Ein Vergleich dieser beiden Aphereseprogramme mit

Blick auf die Sammlung CD14-positiver Monozyten zeigte in vorangegange-

nen Studien, dass mit dem MNC-Programm eine im Vergleich zum PBSC-

Lym-Programm signifikant höhere Sammeleffizienz von mehr als 80% erzielt

werden konnte (77). Daher kam in dieser Studie ausschließlich das MNC-

Programm zum Einsatz.

90

Zur Reduktion der unerwünschten Thrombozyten im Apheresat wurde

bei dem COM.TEC Zellseparator eine niedrigere Zentrifugendrehzahl (1000

U/min.) verwendet. Anschließend wurden die Leukozyten- und Monozyten-

erträge in den so gewonnenen Apheresaten analysiert und die Ergebnisse

dieser Modifikation mit den Ergebnissen der Standardeinstellung des Pro-

gramms (1500 U/min.) verglichen. Glaser und Mitarbeiter testeten bereits

2001 beim Vorgängermodell AS.TEC 204 die Verwendung einer niedrigeren

Zentrifugengeschwindigkeit und fanden keine signifikanten Unterschiede im

Leukozyten- und CD14+ Gehalt der Produkte beider Vergleichsgruppen. Bei

dem COM.TEC Gerät führte eine Reduktion der Zentrifugendrehzahl von

1500 U/min. auf 1000 U/min. zu einer Reduktion der Leukozytenkonzentra-

tion um 50% (23,0 x 109 vs. 52,3 x 109 pro Liter) und zu einem deutlich nied-

rigeren CD14+ Gehalt im Konzentrat (0,49 x 109 vs. 1,33 x 109).

Zur Gewinnung dendritischer Zellen für die Herstellung von Impfstoff

ist eine Mindestmenge von 1,2 x 109 CD14-positiven Monozyten erforderlich,

die mit dem Standard-MNC-Programm in einem Zeitraum von 2 Stunden ge-

wonnen werden kann. Die mit dem Standardprogramm gewonnenen Aphere-

sate enthielten zwischen 0,48 x 109 und 2,67 x 109 CD14-positive Zellen. Bei

Verwendung der niedrigeren Zentrifugendrehzahl (1000 U/min.) war der mitt-

lere CD14+ Gehalt im Apheresat niedriger und lag zwischen 0,14 x 109 und

0,80 x 109 Zellen. Folglich gelang die Sammlung der CD14-positiven Zellen

mit der Standardeinstellung von 1500 U/min. wesentlich besser als mit 1000

U/min. (Sammeleffizienz: 75% vs. 45%).

Vorangegangene Studien zeigten, dass mit der COBE Spectra die für die

Gewinnung einer ausreichenden Menge dendritischer Zellen erforderliche

Mindestzellzahl von 1,2 x 109 CD14-positiven Monozyten innerhalb einer

Leukapherese nur dann erreicht wurde, wenn mit einem hohen Separations-

faktor und folglich mit hoher Zentrifugengeschwindigkeit sowie mit längerer

Spendezeit (mindestens 180 Minuten) leukapheresiert wurde (52, 76).

Nguyen berichtet in seiner Studie über die Ergebnisse mit dieser Geräteein-

stellung. Er gewann in durchschnittlich 197 Minuten ein mittleres Konzentrat-

volumen von 191 mL mit einem durchschnittlichen Monozytengehalt von 3,2

x 109 CD14-positiven Zellen. Strasser und Mitarbeiter untersuchten 10 Liter-

91

Leukapheresen und verglichen die Produktdaten der Leukozyten und CD14-

positiven Zellen, die sie in einer durchschnittlichen Spendedauer von 180

Minuten bei gesunden Spendern erzielten. Bei Zentrifugation mit 1001 U/min.

lag der mittlere CD14+ Gehalt im Apheresat bei 2,2 x 109 Zellen, bei Leuk-

apheresen mit 708 U/min. bei 1,4 x 109 Zellen und war damit bei Verwen-

dung der höheren Zentrifugengeschwindigkeit um den Faktor 2 höher. Die

CD14+ Sammeleffizienz war ebenfalls deutlich größer, wenn mit höherer

Drehzahl zentrifugiert wurde.

In der vorliegenden Studie wurden die Sammelergebnisse der COBE

Spectra bei Verwendung eines niedrigeren Trennfaktors von 250 und der da-

raus resultierenden Zentrifugendrehzahl von 646 U/min. bei einem Blutfluss

von 50 mL pro Minute mit einem höheren Blutfluss von 60 mL pro Minute ver-

glichen, der eine höhere Zentrifugengeschwindigkeit von 708 U/min. zur Fol-

ge hatte. Bei gleichem Separationsfaktor (hier 250) wird durch die Erhöhung

des Blutflusses (von 50 auf 60 mL pro Minute) die Zentrifugendrehzahl auto-

matisch angepasst. Die Spendedauer war mit durchschnittlich 115 Minuten

(646 U/min.) bzw. 118 Minuten (708 U/min.) deutlich kürzer als in den oben

genannten Studien. Mit einer mittleren Leukozytenkonzentration von 40,1 x

109 pro Liter, einem CD14+ Gehalt von 0,82 x 109 Zellen und einer CD14+

Sammeleffizienz von 37,7% lagen die mit 646 U/min. erzielten Ergebnisse im

Bereich vorheriger Studien (75). Der zur Anzucht von dendritischen Zellen er-

forderliche Mindestwert von 1,2 x 109 CD14-positiven Zellen wurde dabei bei

keiner der Leukapheresen mit niedrigem Trennfaktor von 250 und Blutfluss

von 50 mL pro Minute erreicht. Mittels Erhöhung des Blutflusses auf 60 mL

pro Minute, konnten zwischen 0,41 x 109 und 1,81 x 109 CD 14+ Zellen ge-

sammelt werden und dadurch der Mindestgehalt an CD14-positiven Zellen

zur Anzucht dendritischer Zellen zumindest bei einem Teil der Leukaphere-

sen erfüllt werden. Auch die Effizienz der Sammlung CD14-positiver Zellen

konnte durch den höheren Blutfluss verbessert werden (40,1% vs. 37,3%).

In einer früheren Studie von Strasser und Mitarbeitern wurde bereits der

COM.TEC-Vorgänger AS.TEC 204 mit der COBE Spectra hinsichtlich der

Sammeleffizienz der CD14-positiven Zellen verglichen (75). Dabei zeigte sich

die AS.TEC 204 bei Kurzzeitleukapheresen (5-Liter-Leukapheresen) der

92

COBE Spectra im Hinblick auf Leukozyten- und Monozytengehalt (1,16 x 109

vs. 0,84 x 109 CD14+ Zellen) der Apheresate und der Sammeleffizienz

CD14-positiver Monozyten (51,9% vs. 31,9%) überlegen. Auch in dieser Stu-

die dauerten die Separationen mit der COBE Spectra länger, die Separa-

tionszeit lag durchschnittlich bei 114 Minuten und es wurde ein signifikant

größeres Blutvolumen prozessiert. In der vorliegenden Studie fanden sich im

Vergleich der COBE Spectra mit dem AS.TEC-Nachfolger COM.TEC bei

Verwendung der Standardeinstellungen beider Geräte keine Unterschiede im

Leukozyten- und CD14+ Gehalt der Leukapheresate. Infolge der deutlich

besseren Sammeleffizienz CD14-positiver Zellen des COM.TEC Gerätes

(66,6% vs. 36,2%) waren die Leukozytenkonzentration und der CD14+ Zell-

gehalt trotz der längeren Spendedauer mit der COBE Spectra (127 vs. 98 Mi-

nuten) in den Produkten beider Zellseparatoren fast gleich. Mit beiden Gerä-

ten konnten die für die Anzucht dendritischer Zellen erforderlichen 1,2 x 109

CD14-positiven Zellen nur bei einem Teil der Leukapheresen erreicht wer-

den. Unter Berücksichtigung der vorliegenden Ergebnisse empfehlen wir für

die Sammlung CD14-positiver Zellen das MNC-Programm des COM.TEC

Zellseparators. Die bessere Sammeleffizienz erlaubt die Gewinnung der ge-

wünschten Zellpopulation in kurzer Spendedauer und ist für den Blutspender

angenehm sowie ökonomisch günstig.

5.2.2 CD14- und CD16-positive Monozyten Die auch als „proinflammatorische Monozyten“ bezeichneten CD14- und

CD16-positiven Monozyten spielen eine wichtige Rolle bei Infektionen und

Entzündungen. Diese Zellpopulation ist beispielsweise im Blut von Patienten

mit chronisch-entzündlichen oder rheumatoiden Erkrankungen und Sepsis

erhöht (20, 27, 30, 38, 90). Die Reduktion dieser Monozytensubpopulation im

Rahmen einer therapeutischen Apherese könnte bei chronisch-entzündlichen

Darmerkrankungen eine nicht-pharmakologische Therapieoption darstellen

(34, 40, 47, 66) und eine Einsparung von Steroiden und anderen nebenwir-

kungsreichen Medikamenten ermöglichen. Eines der Ziele dieser Arbeit war

es, die Sammeleffizienz von COBE und COM.TEC in Bezug auf diese CD14-

93

und CD16-positive Zellpopulation zu prüfen. Da zur Sammlung dieser Mono-

zytenpopulation mittels Leukapherese bisher noch keine Daten veröffentlicht

wurden, werden die Ergebnisse dieser Arbeit mit anderen Studien hinsicht-

lich der Sammlung der Gesamtpopulation der CD14-positiven Zellen vergli-

chen und diskutiert.

In einem Teil der Studie (gepaarte Analyse) wurde die Sammlung der CD14-

und CD16-positiven Monozyten mit der COM.TEC analysiert, wobei zwei Ein-

stellungen mit verschiedenen Zentrifugendrehzahlen untersucht wurden

(1000 U/min. vs. 1500 U/min.). Bei Verwendung der niedrigeren Zentrifugen-

geschwindigkeit (1000 U/min.) fanden wir neben dem bereits beschriebenen

deutlich niedrigeren Gehalt der Gesamtpopulation an CD14-positiven Zellen

einen geringeren Gehalt an CD14- und CD16-positiven Monozyten. Zwar

wurde mit der Zentrifugengeschwindigkeit von 1000 U/min. der insgesamt

höchste Gehalt dieser Monozytenpopulation erzielt, mit 1500 U/min. war die

Streubreite der einzelnen Messwerte aber deutlich geringer und die erzielten

Sammelergebnisse waren folglich konstanter. Die Sammeleffizienz der

COM.TEC war mit beiden Geräteeinstellungen für diese Monozytensubpopu-

lation um einiges besser als für die Gesamtpopulation der CD14-positiven

Zellen. Mit der Zentrifugendrehzahl von 1500 U/min. betrug die mittlere Sam-

meleffizienz für die CD14-positiven Zellen 75,3% und für die Population der

CD14- und CD16-positiven Monozyten 96,8%. Bei Zentrifugation mit 1000

U/min. lag die Sammeleffizienz für CD14-positive Zellen nur noch bei 45,0%

und für die CD14- und CD16-positiven Monozyten bei 57,8%.

Desweiteren wurde in einer ungepaarten Studie die Sammeleffizienz der

CD14- und CD16-positiven Monozyten mit der COBE Spectra untersucht.

Dabei wurde das Gerät auf einen reduzierten Separationsfaktor von 250 ein-

gestellt und zwei verschiedene Blutflussraten, 50 mL pro Minute gegenüber

60 mL pro Minute, geprüft. Aus dieser Einstellung resultierten zwei Zentrifu-

gengeschwindigkeiten, 646 U/min. (bei einem Blutfluss von 50 mL/min.) bzw.

708 U/min. (bei einem Blutfluss von 60 mL/min.). Dabei wurde mit der hö-

heren Zentrifugengeschwindigkeit nicht nur eine größere Menge an CD14-

positiven Zellen gesammelt, sondern auch ein deutlich größerer Gehalt an

94

CD14- und CD16-positiven Monozyten erzielt. Dies ist darauf zurückzufüh-

ren, dass die höhere Blutflussrate zu einem höheren prozessierten Blutvolu-

men führt. Pro Zeiteinheit werden also mehr Blutzellen prozessiert. Die

Spannbreite der Einzelwerte für die CD14- und CD16-positiven Monozyten

war bei dieser Einstellung deutlich kleiner und der erzielte Zellgehalt somit

konstanter. Auch die Sammeleffizienz (51,9% vs. 46,5%; p=0,30) konnte da-

durch im Vergleich zur Sammeleffizienz der gesamten Monozytenpopulation

(37,7% vs. 40,1%; p=0,50) deutlich verbessert werden.

Durch eine längere Separationszeit (127 Minuten vs. 116 Minuten)

und die Verarbeitung eines größeren Blutvolumens konnte die Ausbeute an

CD14- und CD16-positiven Monozyten im Apheresat weiter gesteigert (6,81 x

107 vs. 4,13 x 107 Zellen) und die Sammeleffizienz (68,5% vs. 46,6%) deut-

lich verbessert werden.

In der zweiten gepaarten Studie verglichen wir die Zellseparatoren COM.TEC

und COBE Spectra hinsichtlich der Sammlung der CD14-positiven Zellen und

der Monozytensubpopulationen. Bei Verwendung der Standardeinstellungen

beider Geräte wurde mit der COBE Spectra in signifikant längerer Separa-

tionszeit (127 Minuten vs. 98 Minuten) ein größerer Gehalt an Monozyten

und der CD14- und CD16-positiven Subpopulation erzielt als mit der

COM.TEC. Der höchste mit der COBE gewonnene Absolutwert der CD14-

und CD16-positiven Monozyten war bei vergleichbaren Minimalwerten dabei

um den Faktor 2 größer, als der mit der COM.TEC erzielte Maximalwert.

Dennoch sammelte der COM.TEC Zellseparator neben der Gesamtheit der

CD14-positiven Monozyten (66,6% vs. 36,2%; p=0,30) auch die CD14- und

CD16-positiven Zellen deutlich effektiver als die COBE Spectra (95,6% vs.

49,7%; p=0,26). Beide Zellseparatoren sammelten die CD14- und CD16-po-

sitiven Monozyten deutlich effizienter als die Hauptpopulation der CD14-posi-

tiven Monozyten.

Bei Betrachtung aller Ergebnisse ist der COM.TEC Zellseparator zur Samm-

lung der CD14- und CD16-positiven Monozyten bestens geeignet. Mit ihm

ließen sich sogar deutlich bessere Sammeleffizienzen für diese Subpopu-

lation erzielen als für die Gesamtheit der CD14-positiven Zellen. Aufgrund

95

der im Vergleich zur COBE Spectra wesentlich kürzeren Separationszeit und

der folglich signifikant besseren Sammeleffizienz empfehlen wir das MNC-

Programm des COM.TEC Zellseparators mit der Standardeinstellung (1500

U/min.) zur Sammlung CD14- und CD16-positiver Monozyten, beispielsweise

im Rahmen einer therapeutischen Apherese.

5.2.3 Restzellen

Da Monozyten nur eine Zellpopulation im gesammelten Buffy Coat sind, spie-

len Restzellen, Erythrozyten und Thrombozyten auch für die Kultur dendriti-

scher Zellen aus CD14-positiven Monozyten eine Rolle und nehmen Einfluss

auf die Ausbeute an DCs für die Impfstoffgewinnung (7, 8, 28). Ein hoher

Thrombozytengehalt im Apheresat führt nicht nur, wie zahlreiche Studien be-

legen, zu einer Beeinträchtigung von Reifung und Differenzierung der den-

dritischen Zellen (23, 24, 36, 75), sondern auch zu einem Thrombozytenver-

lust bei dem Leukozytenspender. Leukaphereseprodukte enthalten anteils-

mäßig die Ausbeute von bis zu zwei Thrombozytapherese-Konzentraten, die

zunächst gespendet und anschließend als Abfall verworfen werden. Die hohe Thrombozytenkontamination erfordert Nachbearbeitungs-

schritte vor Kultivierung und Ausreifung der Monozyten zu DCs. Es besteht

die Möglichkeit, Leukozytenkonzentrate mit hohem Thrombozytenanteil (> 1

x 1012 Thrombozyten pro Liter) vor der Zellkultur mit dem Elutra-Zellseparator

(Caridian BCT) zu bearbeiten, um die Monozyten anzureichern und Throm-

bozyten zu entfernen (8, 12, 32, 35, 41). Dabei gehen aber auch Monozyten

verloren, was letztendlich die spätere Ausbeute an dendritischen Zellen ver-

ringert (7, 8, 35, 63, 75, 76). Hohe Erythrozytenkonzentrationen im Apheresat

wiederum vermindern die Effektivität des Elutriation-Verfahrens. Überschrei-

tet der Anteil des Gesamtvolumens an Erythrozyten im Konzentrat 7,5 mL

überschreitet, wird vom Elutra-System ein sog. „Verdichtungsschritt“ ausge-

führt (18). Dieser führt wiederum zu einem weiteren Monozytenverlust, der

bis zu 40% betragen kann. Liegt die Erythrozytenzahl im Apheresat jedoch

unterhalb dieses Grenzwertes, können bis zu 90% der Monozyten, die im

Apheresat enthalten waren, durch Elutriation angereichert werden.

96

In vorangegangenen Studien konnte eine signifikante Reduktion des

Thrombozytengehaltes der Apheresate beim COM.TEC Zellseparator durch

eine Erhöhung des Zyklusvolumens (CV 300 mL vs. CV 450 mL) erreicht und

infolgedessen der relative Gewinn an dendritischen Zellen deutlich erhöht

werden (79). Glaser und Mitarbeiter zeigten bereits 2001, dass eine Vermin-

derung der Zentrifugendrehzahl sowohl beim COM.TEC-Vorgänger AS.TEC

204 als auch beim COBE Spectra Zellseparator ebenfalls zu niedrigeren

Thrombozytenzahlen im Konzentrat führte (23, 24).

Unseren Ergebnissen zufolge führt eine Reduktion der Zentrifugenge-

schwindigkeit auf 1000 U/min. (Standard: 1500 U/min.) auch beim

COM.TEC-Zellseparator zu deutlich niedrigeren Thrombozyten- (3619 x

109/L vs. 2008 x 109/L, p-Wert: 0,12) und Erythrozytenzahlen (0,68 x 1012/L

vs. 0,99 x 1012/L, p-Wert: 0,19) im Produkt. Allerdings war bei Zentrifugation

mit 1000 U/min. auch die Leukozytenausbeute um mehr als den Faktor 2

kleiner. Bei der COBE Spectra fanden wir dagegen bei Verwendung der nie-

drigeren Zentrifugengeschwindigkeit (646 U/min.) nicht nur geringere Leuko-

zytenerträge, sondern auch einen höheren Restzellgehalt im Apheresat

(Thrombozyten: 875 x 109/L vs. 857 x 109/L; Erythrozyten: 0,88 x 1012/L vs.

0,76 x 1012/L) als bei Gebrauch der höheren Kammerbeschleunigung (708

U/min.). Insgesamt scheint die Verwendung einer niedrigeren Zentrifugenge-

schwindigkeit mit dem Ziel der Reduktion des Restzellgehaltes bei COBE

und COM.TEC aufgrund der hohen Einbußen an Leukozyten und Monozyten

nicht gut geeignet zu sein. Vielmehr führte eine Erhöhung der Zentrifugen-

drehzahl von 646 U/min. auf 708 U/min. bei der COBE Spectra in jeder Hin-

sicht zu einer Verbesserung der Separationsergebnisse.

Die vergleichende Analyse der beiden Zellseparatoren zeigte, dass bei fast

identischem Leukozyten- und Monozytengehalt der Apheresate die mittlere

Thrombozytenkonzentration bei der COM.TEC um den Faktor 1,5 (Standard-

programm der COBE) bis 3 (modifizierte Version der COBE) höher war als

bei der COBE Spectra. Bei früheren Studien, die mit der AS.TEC 204 durch-

geführt wurden, wiesen die Produkte der COBE Spectra, verglichen mit dem

COM.TEC-Vorgänger AS.TEC 204, deutlich niedrigere Erythrozytenzahlen

97

auf (75). Bei der COM.TEC lag nun die mittlere Erythrozytenkonzentration in

den Produkten niedriger als bei der COBE Spectra.

Die Bedeutung des Restzellgehaltes der Apheresate für die Anzucht dendriti-

scher Zellen aus Monozyten wird durchaus kontrovers diskutiert. So zeigten

einige Studien (28, 43, 53), dass eine definierte Thrombozytenkontamination

des Monozytenapheresates, etwa im Verhältnis 5 zu 1 (53), bzw. eine Co-

Kultivierung von Monozyten und Thrombozyten zur Generation von reifen

dendritischen Zellen mit sehr starker immunologischer Aktivität führen kann.

Die reifen dendritischen Zellen exprimierten daraufhin costimulierende Mole-

küle wie CD80 und CD86 in größerer Menge und setzten mehr Interleukin 12

frei, was sich schließlich in einer starken T-Zell-Antwort niederschlug. Eine

kontrollierte Thrombozytenkontamination der Monozytenapheresate könnte

also für die Generierung von reifen und immunologisch sehr aktiven dendriti-

schen Zellen von großem Nutzen sein.

5.2.4 Monozyten-Thrombozyten-Aggregate Monozyten und Thrombozyten kommunizieren und interagieren miteinander,

insbesondere im Rahmen immunologischer Abwehrreaktionen und hämosta-

siologischer Ereignisse. Dabei kommt es zur Bindung aktivierter Thrombo-

zyten an Monozyten (2, 10, 33, 62, 68) und zur Ausbildung heterotyper

Monozyten-Thrombozyten-Aggregate, an welcher vor allem der thrombozytä-

re Glykoproteinkomplex IIb/IIIa (CD41a) und der CD62-Rezeptor (P-Selektin)

beteiligt sind (11). P-Selektin ist ein Glykoprotein und wird in den α-Granula

im Zytoplasma von Thrombozyten gespeichert. Bei Aktivierung von Thrombo-

zyten kommt es innerhalb von Sekunden zur Degranulation und zum Einbau

des P-Selektins in die Plasmamembran. Das P-Selektin vermittelt die Interak-

tion der aktivierten Thrombozyten mit geschädigtem Endothel oder Leukozy-

ten, wobei es insbesondere mit dem monozytären P-Selektin-Glykoprotein-

Liganden-1 reagiert, was zur Bildung von Monozyten-Thrombozyten-Aggre-

gaten führt (5, 10, 50, 73, 74).

Dieser Anstieg der P-Selektin-Expression (CD62) auf der Thrombozy-

98

ten-Oberfläche ist in vitro irreversibel und eignet sich somit sehr gut zur Iden-

tifikation aktivierter Thrombozyten. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie

eine Kombination des monozytären Oberflächenmarkers CD14 und des

thrombozytären Aktivierungsmarkers CD62 für den Nachweis des Vorkom-

mens von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten in den Leukapheresaten

von Spendern verwendet. CD14- und CD62-positive Ereignisse wurden da-

her als Monozyten-Thrombozyten-Aggregate gewertet.

In den Apheresaten zweier Spendergruppen, die unter Verwendung

verschiedener Einstellungen des Leukozytensammelprogrammes (Blutfluss:

50 mL/min. vs. 60 mL/min., Zentrifugendrehzahl: 646 U/min. vs. 708 U/min.)

mit der COBE Spectra gewonnen wurden, war die mittlere Thrombozyten-

konzentration vergleichbar groß (875 x 109 vs. 857 x 109 pro Liter) und der

mittlere Gehalt an Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten sogar identisch

(49,7 x 106). Der Monozytengehalt war jedoch bei den Vergleichsgruppen

unterschiedlich (0,82 x 109 vs. 1,01 x 109, p=0,10). Bei der Gegenüberstel-

lung der Leukaphereseprodukte von COBE und COM.TEC fanden wir in den

Apheresaten der COM.TEC erwartungsgemäß deutlich höhere Thrombozy-

tenkonzentrationen. Folglich war der Gehalt an Zellaggregaten um den Fak-

tor 2 höher, wobei dies mit einem geringeren Gehalt an CD14-positiven

Monozyten einherging. Demzufolge scheint ein hoher Thrombozytengehalt

im Apheresat die Bildung von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten zu be-

günstigen.

Aufgrund der großen Standardabweichungen im Mittelwertsvergleich sind die

Ergebnisse der Monozyten-Thrombozyten-Aggregate schwierig zu beurtei-

len. Dies führte dazu, dass trotz stark divergierender Mittelwerte im Gruppen-

vergleich kein signifikanter Unterschied resultierte. Die hohe Standardabwei-

chung ergab sich aus der großen Variabilität der sich in den Konzentraten

gebildeten Zellaggregate. Zusätzlich ist das verwendete Testverfahren

schwierig zu standardisieren, da keine Positivkontrollen verfügbar sind und

diese Zellaggregate nur anhand der Antigenexpression für Monozyten und

Thrombozyten identifiziert werden können.

Desweiteren bleibt zu klären, welche Faktoren begünstigend bzw.

hemmend auf die Bildung von Monozyten-Thrombozyten-Aggregaten einwir-

99

ken. Eine exakte Kenntnis der zur Aggregatbildung führenden Prozesse

könnte eine Reduktion der Aggregate im Apheresat und infolgedessen höhe-

re Erträge an CD14-positiven Monozyten ermöglichen. Weiterhin bleibt zu

klären, inwieweit die einzelnen Monozytensubpopulationen an der Aggregat-

bildung beteiligt sind. So wurde in vivo bereits von der Arbeitsgruppe um

Boudjeltia beobachtet, dass der Anteil der CD14- und CD16-positiven Sub-

population an den gemessenen Aggregaten größer war als der Anteil der

CD14-positiven monozytären Gesamtpopulation (22,3% vs. 18%) (11).

5.3 Rekrutierung monozytärer Subpopulationen

Ein weiterer Inhalt dieser Dissertation war die Untersuchung des Rekrutie-

rungsverhaltens der analysierten Monozytensubpopulationen. Das Phäno-

men der Zellrekrutierung während der Apherese wurde in der Literatur be-

reits vor Jahren für CD34-positiven Stammzellen beschrieben (14, 31, 37).

Maß für eine stattgefundene Zellrekrutierung ist der Rekrutierungsfaktor

(RF), der sich wie in Kapitel 3.8. beschrieben, berechnen lässt. Ein Rekrutie-

rungsfaktor von 1 bedeutet, dass während der Leukapherese keine Zellen

mobilisiert wurden, ein Rekrutmentfaktor von größer als 1 spricht für eine bis

zum Ende der Leukapherese stattgehabte Zellmobilisierung. Das Rekrutie-

rungsverhalten von einzelnen Monozytensubpopulationen ist nicht nur inter-

individuell sehr verschieden, sondern auch von der jeweiligen Monozyten-

subpopulation abhängig. So beschrieben Hendelmeier und Mitarbeiter signifi-

kante Unterschiede zwischen den Rekrutierungsfaktoren der Monozyten-

hauptpopulation, der CD14+CD16+ sowie der CD33dimCD16+ Subpopulatio-

nen (30). Dies könnte zum einen Ausdruck dafür sein, dass die Apherese als

Eingriff in das Immunsystem für die Rekrutierung und Neubildung der einzel-

nen Monozytenuntergruppen einen unterschiedlichen Stimulus darstellt. Zum

anderen könnten die Unterschiede im Rekrutierungsverhalten mit einer Ver-

schiebung innerhalb der Monozytenpopulationen während der Apherese er-

klärt werden (77, 30).

Wir berechneten die Rekrutierungsfaktoren für die Monozytenhauptpo-

pulation (CD14+CD16-), sowie für die CD14+CD16+ und CD14-CD16+ Zell-

100

populationen und verglichen diese miteinander. Die Ergebnisse reichen da-

bei von keinen detektierbaren Unterschieden bis hin zu sehr deutlichen Diffe-

renzen zwischen den Rekrutmentfaktoren der analysierten Subpopulationen,

unabhängig von dem verwendeten Zellseparator und der verwendeten Gerä-

teeinstellung. Diese Tatsache und die ausgeprägte Spannbreite der einzel-

nen Rekrutierungsfaktoren sowie die hohe Standardabweichung der Mittel-

werte sprechen für große inter- und intraindividuelle Unterschiede im Rekru-

tierungsverhalten der analysierten Zellpopulationen, welche in der Literatur

bereits häufiger vermutet wurden (77, 80).

Spezifische Aussagen lassen sich anhand unserer Ergebnisse bezüglich

möglicher Faktoren treffen, die auf das Rekrutierungsverhalten von Monozy-

ten Einfluss nehmen. In der Literatur wurden bereits die Bedeutung des ver-

wendeten Leukaphereseprogrammes, die damit verbundene Höhe des Mo-

nozytengehaltes im Apheresat sowie die in den Blutproben vor der Spende

gemessene Monozytenkonzentration des Blutspenders als Einflussfaktoren

auf das Rekrutierungsverhalten diskutiert. Strasser und Mitarbeiter beschrie-

ben einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Rekrutmentfaktor für

mononukleäre Zellen und der verwendeten MNC-Programmeinstellung. Da-

bei schien der Rekrutmentfaktor bei Geräteeinstellungen, die auf einen ho-

hen MNC-Gewinn zielen, höher zu sein als bei anderen Geräteeinstellungen

(80). Unsere Ergebnisse stützen diese These. War bei COBE und COM.TEC

entweder mit einer hohen Zentrifugendrehzahl gearbeitet oder waren die

Spender über lange Zeit leukapheresiert worden, so dass sie ein hohes

Verhältnis von prozessiertem zu totalem Blutvolumen aufwiesen, waren die

Rekrutierungsfaktoren aller drei analysierten Zellpopulationen höher als in

den Vergleichsgruppen. Nicht selten waren diese Differenzen auch statistisch

signifikant. Aufgrund dieser Beobachtungen gehen wir davon aus, dass

durch Verwendung von Leukaphereseprogrammen, die zu einem hohen Ge-

winn an Monozyten und deren Untergruppen führen, das Ausmaß der Rekru-

tierung dieser Zellen gesteigert werden kann.

Ein anderer vieldiskutierter Punkt ist eine mögliche Auswirkung der vor

der Leukapherese im Blut der Spender gemessenen Monozytenkonzentratio-

nen auf deren Rekrutierungsverhalten während der Spende. Einige Autoren

101

vermuteten in der Vergangenheit aufgrund einer negativen Korrelation zwi-

schen Präwerten der Monozyten und deren Rekrutmentfaktoren die Existenz

einer Art negativen „Feedback“ – Mechanismus. Folglich würden niedrige

Monozytenzahlen zu einer besseren Freisetzung von Zellen und dadurch zu

einem erhöhten Rekrutierungsfaktor führen (37, 72, 80). Unsere Ergebnisse

können diese Hypothese nicht bestätigen, da kein Zusammenhang zwischen

den Monozytenkonzentrationen vor der Spende und dem Rekrutierungsfaktor

der Monozyten gefunden wurde.

Zusammenfassend kann die Leukapherese als Eingriff in die Homöostase

des menschlichen Immunsystems und damit als „Immunintervention“ gese-

hen werden. Sie führt zu Verlusten an Blutzellen, die jedoch schon im Laufe

der Blutspende durch das Phänomen der Zellrekrutierung zu einem Teil aus-

geglichen werden. Das Ausmaß der Zellrekrutierung wiederum ist von ver-

schiedenen Faktoren abhängig, deren detaillierte Kenntnis für die Gewinnung

konstanter Zellzahlen mittels Leukapherese wichtig sein könnte. Ein starker

Einfluss auf das Rekrutierungsverhalten von Monozyten und ihren Subpopu-

lationen wurde bereits der zur Leukapherese verwendeten Geräteeinstellung

zugeschrieben und anhand unserer Ergebnisse bestätigt. Der exakte Mecha-

nismus derartiger Rekrutierungsprozesse im menschlichen Körper und die

Bedeutung der Zellrekrutierung für den Blutspender sind noch nicht im Detail

bekannt und bedürfen weiterer Untersuchungen.

102

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7. Abkürzungsverzeichnis

AABB American Association of Blood Banks

ACD-A

Ag

Acid Citrate Dextrose-Adenine

Antigen

Ak Antikörper

ASH American Society of Hematology

BC

Blfl

Buffy Coat (leukozytenreiche Zellschicht)

Blutfluss

CE Collection Efficiency (Sammeleffizienz)

CP Kopplungsfaktor

CR Collection Rate (Sammelrate)

CTL Zytotoxische T-Lymphozyten

CV Zyklusvolumen

°C Grad Celsius

DC Dendritic Cell (Dendritische Zelle)

DGTI Deutsche Gesellschaft für Transfusionsmedizin

und Immunhämatologie e.V.

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FACS Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

Fc Konstantes Ende von Antikörpern

FITC Fluorescein-Isocyanat

FSC Vorwärtsstreuung (Forward Scatter)

F(VB) Fluss (Vollblut)

G Gramm

G-CSF Granulozyten-Kolonien Stimulierender Faktor

GMP Good Manufacturing Practise

g*min Aufenthaltsdauer im Schwerkraftfeld

Hb Hämoglobin

Hkt Hämatokrit

HLA Humanes Leukozyten Antigen

L Liter

M-CSF Makrophagen-Kolonien Stimulierender Faktor

min. Minuten

112

mL Milliliter

MNC Mononuclear Cells (Mononukleäre Zellen)

n Anzahl

NK-Zellen Natürliche Killerzellen

PBMC Mononuclear cells in peripheral blood

PBSC Peripheral blood stem cells

PBSZ Stammzellen im peripheren Blut

PBV Prozessiertes Blutvolumen

PE Phycoerythrin

PLT Platelets (Thrombozyten)

Thr Thrombozyten

PRP Plättchenreiches Plasma

PPP Plättchenarmes Plasma

RBC Red blood cells (Erythrozyten)

RF Rekrutment Faktor

U/min. Umdrehungen pro Minute

RNA Ribonukleinsäure

SPSS Statistical Package for the Social Sciences

(Statistik-Softwarepaket)

SSC Seitwärtsstreuung

TAA Tumorassoziiertes Antigen

TBV Totales Blutvolumen

TF Trennfaktor

UPM Umdrehungen pro Minute

VB Vollblut

vs. versus, im Vergleich zu

WB whole blood (Vollblut)

WBC white blood cells (Leukozyten)

ZFG Zentrifugengeschwindigkeit

µL Mikroliter

113

8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

1. Brügel J, Hendelmeier M, Strasser EF, Zimmermann R, Eckstein R,

(2008), Recruitment of Monocyte Subpopulations by Leukocytapheresis

with the COM.TEC® And The COBE Spectra® Cell Separator,

Haematologica, 93 (suppl 1), 555 (1470)

European Hematology Association 13th Congress, 12. - 15.06.2008,

Copenhagen, Dänemark

2. Strasser E, Brügel J, Achenbach S, Weiss D, Eckstein R, (2009),

Collection Efficiency of CD14+CD16+ Monocyte Populations Collected by

the COBE Spectra and the COM.TEC Cell Separator, Transfus Med

Hemother 2009, 36 (suppl 1), 17 (V.7.6)

42. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Transfusionsmedizin

und Immunhämatologie e.V. (DGTI), Karger, Rostock, Deutschland

114

10. Danksagung

Mein Dank gilt dem Leiter der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseo-

logischen Abteilung der Friedrich-Alexander-Universität in Erlangen, Herrn

Prof. Dr. med. Reinhold Eckstein.

Ganz besonders herzlich möchte ich mich bei meinem Betreuer PD Dr. med.

Erwin Strasser bedanken, der jederzeit für mich erreichbar war und mir

immer mit wertvollen Anregungen, konstruktiver Kritik und sehr viel Engage-

ment zur Seite stand. Er begleitete mich bestens durch den Entstehungs-

prozess dieser Arbeit und trug somit ganz wesentlich zum Gelingen der Ar-

beit bei.

Danke für die wunderbare Zusammenarbeit!

Desweiteren danke ich Dr. Martin Hendelmeier, der mich zu Beginn der Ar-

beit mit viel Eifer, Engagement und unter großem Zeitaufwand betreute.

115

11. Lebenslauf

Name: Janina Christine Brügel

Geburtstag: 30. August 1983

Geburtsort: Nürnberg

Eltern: Dr. Martin Brügel,

Facharzt für Orthopädie

Sabine Brügel,

Germanistik- und Geschichte-Studium, Stilberaterin

Geschwister: Jacob Brügel, Student der Humanmedizin

Julie-Marie Brügel, Studentin der Humanmedizin

Joscha Brügel, Gymnasiast

Schulbildung: 1989 – 1993 Grundschule Neunhof (Nürnberg)

1993 – 2002 Melanchthon-Gymnasium Nürnberg

(humanistisches Gymnasium)

2002 Abitur

Außerschulische Weiterbildung: Sept. 2002 –

Dez. 2002

Sprachschule in Cambridge, England

Erwerb des Cambridge Certificate of Proficiency

in English

Jan. 2003 – Juni 2003 Sprachschule in Barcelona, Spanien

Studium:

Seit Okt. 2003

(WS 03/04)

Studium der Humanmedizin an der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Sept. 2005 1. Staatsexamen (Physikum)

Aug. 2008 - Juli 2009

Okt./Nov. 2009

Praktisches Jahr am Universitätsklinikum Erlangen-

Nürnberg (Wahlfach: Anästhesiologie)

2. Staatsexamen Humanmedizin

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