Aus der Abteilung für Immunologie
(Leiterin Univ.- Prof. Dr. Barbara M. Bröker)
des Instituts für Immunologie und Transfusionsmedizin
(Direktor: Univ.- Prof. Dr. Andreas Greinacher)
der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Staphylococcus aureus und der Zelltod von humanen neutrophilen Granulozyten
Inaugural - Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Medizin (Dr. med.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2013
vorgelegt von: Paula Döring geboren am: 26.04.1987 in: Berlin
Dekan: Univ.- Prof. Dr. Reiner Biffar
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Barbara M. Bröker
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Barbara C. Kahl
Tag der Disputation: 30.01.2014
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................ III
1 Einleitung ........................................................................................................................... 1
1.1 Neutrophile Granulozyten und ihre Rolle bei der Immunabwehr ............................... 1
1.2 Staphylococcus (S.) aureus .......................................................................................... 3
1.3 Ziele der Arbeit .......................................................................................................... 10
2 Material ............................................................................................................................ 11
2.1 Geräte ......................................................................................................................... 11
2.2 Verbrauchsmaterial .................................................................................................... 12
2.3 Zellbiologische Arbeiten ........................................................................................... 12
2.4 Immunologische Arbeiten ......................................................................................... 14
2.5 Mikrobiologische Arbeiten ........................................................................................ 13
2.6 Molekularbiologische Arbeiten ................................................................................. 13
2.7 Proteinbiochemische Arbeiten ................................................................................... 15
2.8 Kits ............................................................................................................................. 16
2.9 Bakterienstämme, -toxine und Blutprodukte ............................................................. 16
2.10 Datenbanken, Software .......................................................................................... 17
2.11 Medien, Puffer, Lösungen ...................................................................................... 18
3 Methoden .......................................................................................................................... 22
3.1 Zellbiologische Methoden ......................................................................................... 22
3.2 Mikrobiologische Methoden ...................................................................................... 23
3.3 Molekularbiologische Methoden ............................................................................... 24
3.4 Immunologische Methoden ....................................................................................... 27
3.5 Proteinbiochemische Methoden ................................................................................ 30
3.6 Statistische Auswertung ............................................................................................ 31
4 Ergebnisse ........................................................................................................................ 33
Inhaltsverzeichnis
II
4.1 Wirkung von S. aureus-Kulturüberständen auf den Zelltod von neutrophilen
Granulozyten ........................................................................................................................ 33
4.1.1 Unmittelbare Effekte der bakteriellen Kulturüberstände ................................... 34
4.1.2 Effekte von bakteriellen Überständen in der Langzeit-Untersuchung ............... 37
4.2 Vergleichende Untersuchung von S. aureus-Isolaten von gesunden Carriern und
Patienten mit Furunkulose .................................................................................................... 44
4.2.1 Effekte von rekombinantem PVL auf Neutrophile ............................................ 44
4.2.2 Vergleich der bakteriellen Überstände klinischer Isolate aus Besiedlung und Furunkulose ...................................................................................................................... 49
4.2.3 Abhängigkeit der PVL-Expression von den Wachstumsbedingungen für S. aureus ........................................................................................................................... 51
4.3 Zelltodinduktion bei Neutrophilen durch lebende S. aureus-Zellen ......................... 58
4.3.1 Vergleichende Untersuchung von S. aureus-Zellen von Carrier- und Furunkulose-Isolaten ........................................................................................................ 59
5 Diskussion ........................................................................................................................ 61
5.1 Methodik der Zelltodbestimmung: Wie aussagekräftig sind die hier genutzten
Assays? ................................................................................................................................. 61
5.2 Modulierung des Zelltods von neutrophilen Granulozyten durch S. aureus ............. 63
5.3 Die Rolle von PVL .................................................................................................... 68
6 Zusammenfassung ............................................................................................................ 73
7 Anhang ............................................................................................................................. 75
8 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 82
Publikationen ............................................................................................................................ 94
Eidesstattliche Erklärung .......................................................................................................... 95
Tabellarischer Lebenslauf ........................................................................................................ 96
Danksagung .............................................................................................................................. 98
Abkürzungsverzeichnis
III
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
A. bidest. Aqua bidestillata
A. dest. Aqua destillata
agr accessory gene regulator
AK Antikörper
APS Ammoniumperoxodisulfat
BHI Brain Heart Infusion
BSA bovines Serumalbumin
CA-MRSA community-associated MRSA
CBA cytometric bead array
CC clonal cluster
CCY casein hydrolysate and yeast extract-containing
CD cluster of differentiation
CFU colony forming units
DAPI 4'-6-Diamidino-2-Phenylindol
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate
ECM extrazelluläre Matrix
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
eta, etd exfoliatives Toxin a, d
FACS fluorescence activated cell sorting
FCS fetales Kälberserum
FITC Fluoresceinisothiocyanat
fMLP N-Formylmethionyl-Lencyl-Phenylalanin
Fnbp Fibronektin-bindendes Protein
g vielfaches der Erdbeschleunigung
(1g = 9,81 m/s2)
HA-MRSA health care-associated MRSA
HCl Chlorsäure
HLA α-Hämolysin, Synonym: α-Toxin
Abkürzungsverzeichnis
IV
IL Interleukin
Kap. Kapitel
kDa Kilodalton
LDH Laktatdehydrogenase
LPS Lipopolysaccharid
LTA lipoteichoic acid
mAK monoklonaler Antikörper
MGE mobile genetische Elemente
MLST multilocus-sequence-typing
MRSA Methicillin-resistenter S. aureus
MSCRAMMs microbial surface components recognizing
adhesive matrix molecules
n.d. nicht detektierbar
NE neutrophile Elastase
NETs neutrophil extracellular traps
OD optische Dichte
pAK polyklonaler Antikörper
PBMCs mononukleäre Zellen des peripheren Bluts
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PBS/T Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween®
PCR Polymerasekettenreaktion
pI isoelektrischer Punkt
PI Propidiumiodid
PICD Phagozytose-induzierter Zelltod
PMA Phorbolmyristatacetat
PS Phosphatidylserin
PSMs phenol-soluble modulins
PVDF Polyvinylidendiflourid
PVL Panton-Valentine-Leukocidin
RKI Robert-Koch-Institut
ROS reaktive Sauerstoffspezies
rpm Umdrehungen pro Minute, 1/60 s-1
RPMI Roswell Park Memorial Institute
RT Raumtemperatur
Abkürzungsverzeichnis
V
S. Seite
s. siehe
S. Staphylococcus
SAg Superantigen
SDS Natriumdodecylsulfat
SE staphylokokkales Enterotoxin
SEM Standardfehler des Mittelwerts
SpA, spa staphylokokkales Protein A
spp. Spezies
Tab. Tabelle
TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung
TBS/T Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween® 20
TEMED Tetramethylethylendiamin
TLR Toll-like-Rezeptor
TNFα Tumor-Nekrose-Faktor α
TRITC Tetramethylrhodaminisothiocyanat
TSB Tryptone Soy Broth
TSST-1 toxisches Schock Syndrom-Toxin
TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling
üN über Nacht
UV ultraviolett
VRSA Vancomycin-resistenter S. aureus
WT Wildtyp
7-AAD 7-Aminoactinomycin
1 Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Neutrophile Granulozyten und ihre Rolle bei der Immunabwehr
Das Immunsystem dient in erster Linie zur Abwehr von Infektionen. An fast allen Stellen des
Körpers finden sich Bestandteile des Immunsystems, denn dazu zählen verschiedene
Zelltypen, Effektormoleküle und physikalische Schutzmechanismen. Es wird unterteilt in das
angeborene und das erworbene Immunsystem.
Hauptakteure des erworbenen Immunsystems sind die T- und B-Lymphozyten, die durch ein
hochkomplexes Kombinationssystem aus vielen Rezeptorgenen und anschließende
Selektionsprozesse Antigen-spezifische Rezeptoren besitzen. Daher kann sich das erworbene
Immunsystem in seinem Rezeptorspektrum an die Erfordernisse durch verschiedene
Infektionserreger anpassen, es ist lernfähig und generiert im Laufe des Lebens ein
individuelles Immungedächtnis [1]. Weil im Infektionsprozess die entsprechend spezifischen
Zellen erst rekrutiert werden müssen, ist die Antwort des erworbenen Immunsystems
allerdings zeitlich verzögert.
Diese Lücke füllt das angeborene Immunsystem. Hierzu zählt man Phagozyten und NK-
Zellen, aber auch mechanische Barrieren und die Interleukine. Es erkennt konservierte
Strukturen der Infektionserreger und reagiert sofort, dafür aber eher unspezifisch [2].
Ein wichtiges verbindendes Glied beider Systeme stellt das Komplementsystem dar, ein
System mehrerer Plasmaproteine, die bei Entzündungsreizen kaskadenartig aktiviert werden.
Das Komplementsystem vermittelt über den Bestandteil C3b die Opsonierung von
Mikroorgansimen, über C5a die Chemotaxis der Immunzellen und kann an Zielzellen durch
Porenbildung den Zelltod auslösen [3].
Neutrophile Granulozyten sind Zellen des angeborenen Immunsystems. Sie machen den
größten Anteil der Leukozyten aus und sind als erste am Ort des Entzündungsgeschehens.
Dort kommt ihr reichhaltiges Waffenarsenal zur Anwendung, um Mikroorgansimen zu töten.
Sie phagozytieren, sezernieren verschiedene antimikrobielle Faktoren und können durch
Bildung von neutrophil extracellular traps (s.u.) selbst beim Sterben noch Eindringlinge
abfangen. Außerdem sind sie wichtige Initiatoren einer systematischen Immunantwort, denn
sie locken durch Chemoattraktanten weitere Immunzellen an [4].
1 Einleitung
2
1.1.1 Rekrutierung und Effektormechanismen von Neutrophilen
Nach Aktivierung durch frühe Entzündungsmarker wie TNFα, IL-8 oder C5a flachen sich
neutrophile Granulozyten ab, adhärieren an das Gefäßendothel und wandern hindurch, der
Fährte eines Chemokingradienten folgend, zum Entzündungsgeschehen [5].
Durch pattern recognition receptors, wie die Toll like-Rezeptoren, erkennen sie typische
Strukturen von Bakterien und Viren [6]. Eine weitere Möglichkeit, Mikroorganismen zu
erkennen, ist die Opsonierung: Die Erreger werden durch Antikörper oder C3b, einen
Bestandteil des Komplementsystems, markiert und diese binden wiederum an Fc-Rezeptoren
bzw. dem Komplement-Rezeptor CR-1 der Neutrophilen [7].
Die erkannten Eindringlinge werden phagozytiert und in Phagolysosomen abgebaut oder
durch Degranulation mit aggressiven Agenzien abgetötet. Die Granula der Neutrophilen
enthalten verschiedene antimikrobielle Peptide (α-Defensine, Lysozym, Lactoferrin) sowie
Enzyme, die die extrazelluläre Matrix abbauen (neutrophile Elastase,
Matrixmetalloproteinasen), um den Weg zum Entzündungsgeschehen frei zu machen [8].
Außerdem produzieren Neutrophile eine Vielzahl von bakterizid wirkenden reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS) [9]. Viele dieser Substanzen verursachen allerdings auch
Gewebsschäden [10].
Neutrophile sind sehr kurzlebige Zellen und wandern nach getaner Arbeit nicht zurück in den
Blutkreislauf, sondern gehen in Apoptose und werden dann von Makrophagen abgeräumt.
Durch entsprechende Signale leiten Neutrophile außerdem die Auflösung der
Entzündungsreaktion und die Initiation der Gewebsrekonstruktion ein [11].
1.1.2 Neutrophil Extracellular Traps (NETs)
Neben diesem Prinzip der Erregerabwehr bestehend aus Degranulation und Phagozytose
verfügen Neutrophile noch über eine weitere, einzigartige Strategie: die Bildung von NETs.
Dabei bilden die Zellen Fangnetze aus ihrer DNA, Histonen und Bestandteilen der Granula,
die ausgeworfen werden und so Mikroorganismen einfangen und abtöten sowie Exotoxine
neutralisieren [12]. Nach Aktivierung z.B. durch IL-8 oder LPS wird die Synthese ROS
angeregt, die wohl eine wichtige Rolle als second messenger spielen [13]. Die
Aktivierungswege sind noch nicht vollständig geklärt. Dann kann eine Veränderung der
Zellmorphologie beobachtet werden (Abb.1): Der Zellkern verliert seine Segmentierung und
rundet sich ab, das Chromatin dekondensiert, die Kernmembran löst sich auf und Zell- und
Plasmabestandteile vermischen sich. Schließlich werden NETs freigesetzt und die Zellen
1 Einleitung
3
sterben [14]. Von der Stimulation der Zellen bis zum Auftreten von NETs vergehen abhängig
von den experimentellen Bedingungen 45 bis 240 min [14].
Abb. 1: Schema zum Ablauf der NETs-Bildung: Nach bestimmten Aktivierungssignalen (1) und
abhängig von ROS löst sich die Kernmembran auf (2), der Kern verliert seine lobulierte Form und
Kern- und Zytoplasmabestandeile vermischen sich (3), dann werden NETs freigesetzt (4). Aus:
Brinkmann et al., 2007, Nature Reviews Microbiology [13]
Die Neutrophilen sind während der NETs-Freisetzung noch vital, es handelt sich also um
einen aktiven Vorgang und nicht eine unkontrollierte Membranruptur der toten Zellen. Weder
die Induktion von Apoptose noch von Nekrose führen zur NETs-Bildung. Man spricht daher
von einer neuartigen Form des Zelltods, genannt NETose [14].
Es ist für verschiedene Erreger [12, 15-18], darunter auch Staphylococcus aureus [12] gezeigt,
dass sie NETs induzieren können und dadurch abgetötet werden. NETs konnten in humanen
Proben in vitro [12, 18, 19], in verschiedenen Infektionsmodellen im Tier [12, 15, 20-22] und
auch in situ [23] nachgewiesen werden.
Wie entscheidend Neutrophile für die Immunabwehr sind, wird bei einem absoluten Mangel
der Neutrophilen (Neutropenie) [24] oder auch einer genetischen Störung der NADPH-
Oxidase (chronische Granulomatose) [25], dem zentralen Enzym der ROS-Synthese, deutlich:
Die Betroffenen sind sehr infektionsanfällig und schon durch unkomplizierte Erreger
lebensgefährdet.
1.2 Staphylococcus (S.) aureus
1.2.1 Kommensale und Pathogen – die Rolle von S. aureus für den Menschen
Staphylokokken kommen fast überall in unserer Umwelt vor, so auch auf unserem Körper:
Sie sind ein häufig anzutreffender Bestandteil unserer Hautflora und Besiedler des
Nasenvorhofs. Ist diese feine Balance zwischen Kommensale und Wirt allerdings gestört,
kann S. aureus auch zu einem ernst zu nehmenden Infektionserreger werden; für den
Menschen nimmt S. aureus daher eine ambivalente Rolle ein. Etwa 20 % der Bevölkerung
1 Einleitung
4
sind ständig symptomfrei mit Staphylokokken im Nasenvorhof besiedelt, man nennt sie
Carrier. Auch andere Körperregionen (Haut, Schleimhäute) können besiedelt sein. Dauerhaft
besiedelte Menschen tragen dabei meist den gleichen Stamm im Nasenvorhof [26]. Bisher
konnte der Carrierstatus noch nicht eindeutig mit bestimmten genetischen oder
umweltbedingten Determinanten des Wirts oder des Bakteriums korreliert werden.
S. aureus ist aber auch ein häufiger Auslöser vor allem nosokomialer Infektionen. Bei
geschwächtem Immunsystem oder wenn die natürliche Hautbarriere gestört ist, z.B. durch
Hautverletzungen, Verbrennungen, Operationswunden oder Katheter, kann S. aureus sich
leicht als Infektionserreger etablieren.
Verbreitet sind dabei lokale Infektionen im Haut- und Weichgewebe, aber auch systemische
Infektionen bis hin zur Sepsis sowie toxinvermittelte Erkrankungen.
Der kolonisierende Stamm kann bei den genannten disponierenden Faktoren für den Carrier
zur Gefahr werden, denn eine S. aureus-Sepsis entwickeln besonders oft Carrier durch eine
endogene Infektion. Die Prognose ist allerdings besser als bei Nicht-Carriern, die sich exogen
infizieren und eine Sepsis ausbilden. Dieses Phänomen wird das Carrier-Paradoxon genannt
[26]. Man begründet diese Beobachtung damit, dass während der Besiedlung eine
Immunreaktion auf den kolonisierenden Stamm stattfindet, ohne dass eine lokale Entzündung
entsteht, und der Carrier so besser bei einer Infektion mit seinem kolonisierenden Stamm
geschützt ist.
1.2.2 Genetik von S. aureus und Typisierungsmethoden
Das S. aureus-Genom setzt sich aus einem core genome (ca. 75 %), einem core variable
genome (ca. 10 %) und mobilen genetischen Elementen (MGE, ca. 15 %) zusammen [27].
Das core genome ist hochkonserviert, hier werden sog. housekeeping-Gene, die für Wachstum
und Überleben essentiell sind, kodiert. Sequenzbasierte Genotypisierungsmethoden, wie
multilocus-sequence-typing (MLST) und spa-Typisierung, nutzen allele Varianten im core
genome. Beim MLST werden S. aureus-Stämmen anhand ihrer verschiedenen
Allelkombinationen von sieben housekeeping-Genen Sequenz-Typ (ST)-Nummern
zugeordnet. Eng verwandete STs werden in klonalen Linien (clonal clusters, CC)
zusammengeführt. Eine einfachere Möglichkeit der Stammeinteilung ist die spa-Typisierung,
dabei werden Sequenzvariationen innerhalb des Protein A (spa)-Gens erfasst.
Resistenz- und Virulenzgene (z.B. Superantigene, Panton-Valentine-Leukocidin) werden auf
MGE, wie z.B. Bakteriophagen, Pathogenitätsinseln und Plasmiden kodiert. MGE können
zwischen verschiedenen Isolaten ausgetauscht werden, deshalb können sich einzelne
1 Einleitung
5
Staphylokokken-Stämme genetisch stark unterscheiden. Dennoch werden Superantigen-
kodierende MGE nicht zufällig verteilt, sondern sind stark an den genetischen Hintergrund
der Isolate geknüpft, d.h. jede klonale Linie ist durch ein typisches Superantigen-Gen-
Repertoire charakterisiert [28].
1.2.3 Antibiotikaresistenzen
Beinahe so schnell, wie im letzten Jahrhundert die Antibiotika-Entwicklung ihren Lauf nahm,
hielt S. aureus mit ihr durch die Ausbildung von Resistenzen Schritt. So waren mit dem
Aufkommen der ersten Antibiotika in den 1940er Jahren S. aureus-Stämme noch Penicillin-
sensitiv, inzwischen exprimieren über 80 % der Stämme eine Penicillinase und sind somit
resistent. Seit den 1960er Jahren traten zudem kurz nach Einführung des Methicillins erste
Methicillin-resistente S. aureus (MRSA)-Stämme auf, die gegen die ganze Breite der β-
Lactamantibiotika resistent sind (kodiert durch das mecA-Gen). Zunehmend muss daher auf
Reserveantibiotika wie Vancomycin, Linezolid oder Daptomycin [29] zurückgegriffen
werden. Seit einigen Jahrzehnten sind MRSA-Stämme, sei es als Besiedler oder
Infektionserreger, in Krankenhäusern und Pflegeeinrichtungen weit verbreitet (sogenannter
health care-associated, HA-MRSA). In Deutschland liegt die MRSA-Prävalenz bei 25 %.
Damit liegt Deutschland in Europa im Mittelfeld, in Skandinavien betragen die Raten 1 bis
5 %, in südeuropäischen Staaten 30 bis 50 %. In Ostasien (Sri Lanka, Südkorea, Vietnam)
wurden sogar MRSA-Raten von bis zu 86 % dokumentiert [30]. Die starken Unterschiede
sind am ehesten mit den unterschiedlichen Verordnungsstrategien bzw. der freiverkäuflichen
Verfügbarkeit von Antibiotika und den verschiedenen Screening- und Isolierungsmaßnahmen
von MRSA-positiven Patienten in Krankenhäusern und Pflegeeinrichtungen zu begründen.
Vor allem in den USA wurden seit 2002 auch schon Fälle von Vancomycin-resistenten
S. aureus (VRSA)-Stämmen bekannt [31], so dass die therapeutischen Möglichkeiten
zunehmend schrumpfen.
1.2.4 Community-associated-MRSA – eine neue Bedrohung
Für Gesunde spielt S. aureus als Krankheitserreger eher eine untergeordnete Rolle. In den
letzten Jahren kamen allerdings neue klonale Linien besonders virulenter Staphylokokken auf,
die eine Methicillin-Resistenz und meist auch das porenbildende Toxin Panton-Valentine-
Leukocidin (PVL) besitzen und bei völlig Gesunden schwere, oft nekrotisierende Haut- und
Weichteilinfektionen oder Pneumonien auslösen. Diese klonalen Linien werden in
Abgrenzung zu den bisher bekannten, auf nosokomiale Infektionen beschränkten HA-MRSA-
Stämmen CA (community-associated)-MRSA-Stämme genannt [32]. Infektionen treten vor
1 Einleitung
6
allem bei engem Körperkontakt, schlechten hygienischen Bedingungen und gemeinsamer
Benutzung von Hygieneutensilien auf [33]. Wichtige CA-MRSA-Stämme sind die Linien
USA300 und USA400, so benannt, weil Ausbrüche erstmals in den USA dokumentiert
wurden und sie dort stärker verbreitet sind als in Europa [32]. In den USA entwickelte sich
CA-MRSA zu dem häufigsten Erreger von schweren Hautinfektionen, die in der
Notaufnahme vorgestellt werden mussten [34]. In Deutschland ist CA-MRSA bisher nicht
endemisch [35].
1.2.5 Virulenzfaktoren
Um zum Pathogen zu werden, muss S. aureus invasiv werden. Die wichtigsten Gegner von
S. aureus sind die neutrophilen Granulozyten, daher verwundert es auch nicht, dass viele
Virulenzfaktoren der Staphylokokken speziell auf Abwehrmechanismen der Neutrophilen
abzielen. Durch Blockierung von Adhäsionsmolekülen am Endothel wird die Diapedese der
Neutrophilen erschwert [36]. Eine Polysaccharidkapsel schützt vor Phagozytose [37],
Immunglobulin-bindende Moleküle wie Protein A (SpA) vor Opsonierung [38]. Außerdem
hat S. aureus Strategien entwickelt, um das Komplementsystem [39] und die Chemotaxis der
Neutrophilen [40] zu unterwandern oder antimikrobielle Peptide der Neutrophilen, wie die α-
Defensine [41] zu inaktivieren. Antioxidative Moleküle schützen vor der Schädigung durch
ROS der Neutrophilen [42, 43].
Verschiedene Moleküle erleichtern dann die Etablierung im menschlichen Körper, indem sie
an Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) adhärieren (sog. microbial surface
components recognizing adhesive matrix molecules, MSCRAMMs): S. aureus hat spezifische
Rezeptoren für Fibrinogen (Clumping factor u.a.), Fibronektin (Fibronektin-bindendes Protein
(FnbpA und -B)) und viele andere ECM-Bestandteile [44].
Eine Reihe an Toxinen lysieren Blutzellen (α-Hämolysin [45], phenol-soluble modulins [46],
PVL [47]) oder schädigen enzymatisch Zell-Zell-Kontakte der Epidermis [48].
Außerdem produziert S. aureus Superantigene, das sind Antigene, die nicht über den
gewöhnlichen Weg prozessiert und präsentiert werden, sondern direkt den T-Zell-Rezeptor
einer T-Zell-Subpopulation und das MHCII-Molekül professioneller antigenpräsentierender
Zellen kreuzvernetzen und zur sofortigen polyklonalen Aktivierung der T-Zellen führen.
Dabei bindet das Superantigen außerhalb der Antigen-Bindungsstelle an die Vβ-Domäne des
Rezeptors. Diese Peptidvariante tragen 5 bis 20 % der T-Zellen, so dass es zu einer starken
proinflammatorischen Antwort mit massiver Zytokinausschüttung und daraus resultierend
zum Kreislaufschock kommt. Als Superantigene wirken das Toxische Schock-Syndrom-
1 Einleitung
7
Toxin, TSST-1, und die staphylokokkalen Enterotoxine (SE), u.a. verantwortlich für schwere
Lebensmittelvergiftungen [49].
Staphylokokken können intrazellulär, z.B. in Leukozyten und Endothelzellen, persistieren,
indem sie aus Phagosomen entkommen und sich in Vakuolen abkapseln [50]. So sind sie vor
dem Immunsystem versteckt. Intrazelluläre Persistenz ist ein Faktor für die Chronifizierung
von S. aureus-Infektionen [51].
Die Expression der verschiedenen Virulenzfaktoren wird abhängig von der Wachstumsphase
reguliert, am wichtigsten ist hier das accessory gene regulator (agr)-System: Über quorum
sensing, einer Kommunikationform zwischen Bakterienzellen, um die Populationsdichte zu
erfassen, werden bei steigender Bakteriendichte (Erreichen der stationären Wachstumsphase)
zahlreiche membrangebundene Moleküle, so z.B. die MSCRAMMs, vermindert exprimiert
und sezernierte Virulenzfaktoren, wie Toxine, verstärkt exprimiert [52].
Daher wurden in dieser Arbeit S. aureus-Sekretionsprodukte aus der frühen (logarithmischen)
und der späten (stationären) Wachstumsphase eingesetzt, um verschiedene Expressionsmuster
zu erfassen.
1.2.6 Panton-Valentine-Leukocidin: Das rätselhafte Toxin
Im Jahr 1932 publizierten Sir Philip Noel Panton und Francis Valentine einen Bericht über ein
Molekül von S. aureus, das humane Leukozyten lysiert und mit schweren Hautinfektionen
assoziiert ist [53]. Es wurde später nach den Entdeckern Panton-Valentine-Leukocidin (PVL)
genannt.
PVL besteht aus zwei Komponenten, den Polypeptiden LukF-PV und LukS-PV, die jeweils
allein keine zytolytische Wirkung haben. Dimerisieren die beiden Komponenten allerdings,
bilden sie eine oktamere β-Faltblatt-Struktur, die in Zellmembranen eine Pore bildet [45].
PVL ist dabei hochspezifisch und wirkt in geringen Konzentrationen nur an neutrophilen
Granulozyten vom Mensch und vom Kaninchen porenformend [47]. Ein Rezeptor an den
Zielzellen ist bisher jedoch nicht bekannt [54].
Je höher die PVL-Konzentration und damit die porenbildende Wirkung, desto verheerender
der Effekt: In niedrigen Konzentrationen bewirkt PVL zunächst eine proinflammatorische
Aktivierung der Zielzellen [47, 55], bei entsprechender Membranschädigung gehen die Zellen
dann in Apoptose bzw. werden bei völligem Verlust der Membranintegrität nekrotisch [55].
Die Gene lukF-PV, lukS-PV sind im lukPV-operon auf einem Prophagen [56]codiert. Ca. 2 %
aller S. aureus-Isolate tragen die Gene für das Toxin [57]. Neben PVL sind noch weitere
1 Einleitung
8
Zwei-Komponenten-Leukotoxine bei S. aureus bekannt, für die bisher keine klinische
Relevanz nachgewiesen wurde [58].
Im klinischen Kontext fiel wiederholt auf, dass PVL epidemiologisch mit schweren Haut- und
Weichteilinfektionen (Furunkulose) und nekrotisierenden Pneumonien assoziiert ist [59-63].
Bei den betroffenen Patienten mit Hautinfektionen sind besonders die Haarbälge betroffen:
Bei einer oberflächlichen Entzündung derselben spricht man von einer Follikulitis; diese kann
sich jedoch bis zur Entstehung von Furunkeln, einer eitrigen Entzündung der tiefen
Haarbalganteile, ausweiten. Konfluieren mehrere Furunkel, bildet sich ein Karbunkel. Oft
entstehen in Folge dessen entzündliche Gewebseinschmelzungen mit einer Eiterabkapselung,
man spricht dann von einem Abszess [64]. Abszesse sind für die antibiotische Therapie
schwer zugänglich, sie rezidivieren bzw. chronifizieren häufig [65].
Besonders die seit einigen Jahren aufkommenden Infektionen mit CA-MRSA-Stämmen, die
überproportional häufig die Gene für PVL (lukPV) exprimieren, verursachen schlimme
Krankheitsverläufe [32].
In in vitro-Arbeiten mit humanen neutrophilen Granulozyten konnte bestätigt werden, dass
lukPV-positive Isolate eine stärkere Zelllyse auslösten [47]. Auch im Pneumonie-Modell im
Kaninchen zeigte sich bei Infektion mit lukPV-positiven Isolaten eine stärkere
Gewebsschädigung, Neutrophilen-Infiltration und letztendlich Mortalität der Tiere [66].
Ein starker Effekt von PVL auf murine Neutrophile ist in vitro nicht nachgewiesen [47],
trotzdem belegen einige Studien ein schwereres Krankheitsbild bei Infektion mit lukPV-
positiven Stämmen im Mausmodell [67-69]; die Datenlage hierzu ist allerdings
widersprüchlich [70, 71].
Ob PVL entscheidend zur Pathogenese von nekrotisierenden Infektionen und den zunehmend
aufkommenden CA-MRSA-Infektionen beiträgt, ist noch nicht eindeutig geklärt [72-77].
1.2.7 Zelltod von neutrophilen Granulozyten durch S. aureus
Wie bereits erläutert, verfügt S. aureus über zahlreiche Strategien, um Abwehrmechanismen
der neutrophilen Granulozyten zu inaktivieren oder auch die Zellen zu schädigen bis hin zur
Zelltodinduktion. Gleichzeitig ist der rasche, programmierte Zelltod der Neutrophilen nach
Erfüllung der Abwehrfunktionen auch ein physiologisches Prinzip des Immunsystems.
Da in dieser Arbeit besonders die Zelltodinduktion von neutrophilen Granulozyten durch
S. aureus beleuchtet werden soll, wird im Folgenden ein Überblick über die bisher
untersuchten Zelltodphänomene von Neutrophilen in Interaktion mit S. aureus dargestellt.
1 Einleitung
Die Phagozytose von S. aureus
Aktivierungsprozessen induziert die Apoptose bei Neutrophilen
charakterisiert durch Caspase-
Auch Autophagie der Neutrophilen, also der Abbau der eigenen Zellorganellen mit Bildung
kleiner Vakuolen, wurde nach Phagozytose beobachtet
programmierte Nekrose der Neutrophilen beschrieben, eine Caspase
Autophagie-ähnliche Vakuolisierung der Zellen
Neutrophilen wie ROS oder destruierende Enzyme
vitale Infektionserreger sind so sicher verpackt und werden von Makrophagen abgeräumt.
Neben diesen Zelltodformen der Neutrophilen ist in der Interaktion mit
NETose [14] bekannt, also die Freisetzung des Zellinhalts, um Mikroorganismen einzufangen
und abzutöten.
Bei starker Schädigung der Neutrophilen, wenn z.B. durch Membranschäden die osmotische
Balance nicht mehr reguliert werden kann oder schwere DNA
Nekrose induziert.
Die Morphologie der drei wichtigsten Zelltodformen, Apoptose, Nekrose und NETose, die
auch in dieser Arbeit untersucht werden, ist in Abb. 2 dargestellt.
Abb. 2: Zelltodmorphologie von neutrophilen GrTransmissionselektronenmikroskopie:und löst sich in apoptotische Körperchen auf (a). Bei der Nekrose dagegen schwillt die Zelle an, die
DNA bleibt dekondensiert, die Membranen lös
Während der NETose löst sich die Kernmembran auf, DNA und Zytoplasmabestandteile vermischen
sich und werden anschließend in Form von NETs freigesetzt (c). Aus: Fuchs
Cell Biology [14]
9
aureus bzw. die ROS-Freisetzung in Folge von
Aktivierungsprozessen induziert die Apoptose bei Neutrophilen [78, 79]. Die Apoptose ist
-Aktivierung und Abschnürung apoptotischer Körperchen
Auch Autophagie der Neutrophilen, also der Abbau der eigenen Zellorganellen mit Bildung
kleiner Vakuolen, wurde nach Phagozytose beobachtet [81]. Zudem wurde eine
programmierte Nekrose der Neutrophilen beschrieben, eine Caspase-unabhängige,
ähnliche Vakuolisierung der Zellen [82]. Aggressive Substanzen der
Neutrophilen wie ROS oder destruierende Enzyme sowie phagozytierte, möglicherweise noch
vitale Infektionserreger sind so sicher verpackt und werden von Makrophagen abgeräumt.
Neben diesen Zelltodformen der Neutrophilen ist in der Interaktion mit S. aureus
bekannt, also die Freisetzung des Zellinhalts, um Mikroorganismen einzufangen
Bei starker Schädigung der Neutrophilen, wenn z.B. durch Membranschäden die osmotische
Balance nicht mehr reguliert werden kann oder schwere DNA-Schäden vorliegen
Die Morphologie der drei wichtigsten Zelltodformen, Apoptose, Nekrose und NETose, die
auch in dieser Arbeit untersucht werden, ist in Abb. 2 dargestellt.
Zelltodmorphologie von neutrophilen Granulozyten in der Transmissionselektronenmikroskopie: Bei der Apoptose kondensiert die DNA, die Zelle schrumpft
und löst sich in apoptotische Körperchen auf (a). Bei der Nekrose dagegen schwillt die Zelle an, die
DNA bleibt dekondensiert, die Membranen lösen sich auf, so dass der Zellinhalt freigesetzt wird (b).
Während der NETose löst sich die Kernmembran auf, DNA und Zytoplasmabestandteile vermischen
sich und werden anschließend in Form von NETs freigesetzt (c). Aus: Fuchs et al.
. Die Apoptose ist
Aktivierung und Abschnürung apoptotischer Körperchen [80].
Auch Autophagie der Neutrophilen, also der Abbau der eigenen Zellorganellen mit Bildung
. Zudem wurde eine
unabhängige,
. Aggressive Substanzen der
sowie phagozytierte, möglicherweise noch
vitale Infektionserreger sind so sicher verpackt und werden von Makrophagen abgeräumt.
aureus auch die
bekannt, also die Freisetzung des Zellinhalts, um Mikroorganismen einzufangen
Bei starker Schädigung der Neutrophilen, wenn z.B. durch Membranschäden die osmotische
Schäden vorliegen, wird die
Die Morphologie der drei wichtigsten Zelltodformen, Apoptose, Nekrose und NETose, die
Bei der Apoptose kondensiert die DNA, die Zelle schrumpft
und löst sich in apoptotische Körperchen auf (a). Bei der Nekrose dagegen schwillt die Zelle an, die
en sich auf, so dass der Zellinhalt freigesetzt wird (b).
Während der NETose löst sich die Kernmembran auf, DNA und Zytoplasmabestandteile vermischen
et al., 2007, Journal of
1 Einleitung
10
1.3 Ziele der Arbeit
Gegenstand dieser Arbeit ist die Charakterisierung des Zelltodverhaltens von neutrophilen
Granulozyten in Interaktion mit Staphylococcus (S.) aureus. Dabei sollen besonders klinische
S. aureus-Isolate von Patienten mit einer Furunkulose-Infektion hinsichtlich ihrer Fähigkeit,
bei Neutrophilen Apoptose, Nekrose bzw. NETose zu induzieren, untersucht werden; als
Vergleich sollen klinische Isolate aus nasaler Besiedlung in die Studie miteinbezogen werden.
Ziele dieser Arbeit sind es daher,
(1) Effekte von S. aureus-Sekretionsprodukten (Kulturüberstände, rekombinantes PVL),
klinischen S. aureus-Isolaten und ganzer Bakterienzellen auf das Zelltodverhalten von
humanen neutrophilen Granulozyten zu analysieren
(2) klinische Isolate aus nasaler Besiedlung und aus Furunkuloseinfektion hinsichtlich
ihrer Zelltodinduktion bei Neutrophilen zu vergleichen.
Damit soll diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Rolle des Zelltods von
Neutrophilen in der S. aureus-Infektion im Allgemeinen und speziell in der
Furunkuloseinfektion leisten.
2 Material
11
2 Material
2.1 Geräte
Agarose-Gelelektrophoresekammer OWL Separation Systems, Portsmouth,
USA
Bakterienschüttler New Brunswick Scientific, Edison, NJ,
USA und Sartorius, Göttingen
Bürker-Zählkammer Laboroptik, Friedrichsdorf
Digitalkamera Visitron Systems, Puchheim
Durchflusszytometer FACS Canto II Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ,
USA
Fluorometer Varioskan Flash Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA
Laufkammer Mini-PROTEAN Dodeca Cell BioRad, München
LumiImager Roche applied science, Mannheim
Mikroskope
Lichtmikroskop Carl Zeiss, Jena
inverses Lichtmikroskop Hund, Wetzlar
Fluoreszenzmikroskop Imager.A1 Carl Zeiss, Jena
Multi Gel Gießkammer BioRad, München
Nanodrop 2000 Spektrophotometer Thermo Scientific, Waltham, MA, USA
Neubauer improved Petroff-Zählkammer Marienfeld, Lauda-Königshofen
PCR-Gradientencycler Biometra, Göttingen
Short Plates, Mini Protean 3 BioRad, München
Spacer Plates, Mini Protean 3, 1,0 mm BioRad, München
Stromversorgungsgerät Power Pac 200 und 300 BioRad, München
UV-Lampe mit Digitalkamera MWG-Biotech, Ebersberg
UV-Photometer Biometra, Göttingen
UV-Tisch Fluolink, Cambridge, EnglandZentrifugen
Megafuge 1.0 / 1.0R Haereus Instruments, Hanau
Biofuge fresco Haereus Instruments, Hanau
2 Material
12
2.2 Verbrauchsmaterial
Columbia-Blutagarplatten BD, Heidelberg
Deckgläschen R. Langenbrinck, Teningen
Einmalküvetten Roth, Karlsruhe
FACS-Röhrchen BD, Heidelberg
Glasflaschen 500 ml Schott AG, Mainz
Glaskolben 200 ml und 500 ml Schott AG, Mainz
Kimtech-Papier Kimberly-Clark, Koblenz-Rheinhafen
Kryo-Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht
Lab-Tek® chamber slides Nunc, Roskilde, Dänemark
Mikrotiterplatten 96 Well Flachboden Greiner, Frickenhausen
Mikrotiterplatten 96 Well Maxisorp Nunc, Roskilde, Dänemark
Mikrotiterplatten 96 Well Optical Bottom, Nunc, Roskilde, Dänemark
schwarz
PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml Sarstedt, Nümbrecht
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg und
Sarstedt, Nümbrecht
Pipettenspitzen, aerosol-resistent Biozym, Hessisch Oldendorf
Reaktionsgefäße 0,5, 1,5 und 2 ml Eppendorf, Hamburg und
Sarstedt, Nümbrecht
Sterilfilter, Porengröße 0,2 und 0,45 µm Sarstedt, Nümbrecht
Sterilpipetten 10 und 25 ml Sarstedt, Nümbrecht
Vacutainer® K2EDTA BD, Plymouth, England
Whatman-Papier Roth, Karlsruhe
Zentrifugenröhrchen 15 und 50 ml BD, Heidelberg, Greiner, Frickenhausen
und Sarstedt, Nümbrecht
2.3 Zellbiologische Arbeiten
Dextran Amersham / GE Healthcare, München
Dulbecco´s PBS PAA Laboratories, Pasching, Österreich
Humanes Serumalbumin 20% (HSA) Grifols, Langen
L-Glutamin PAA Laboratories, Pasching, Österreich
2 Material
13
LSM 1077 Lymphocyte Separation PAA Laboratories, Pasching, Österreich
Medium
Penicillin-Streptomycin PAA Laboratories, Pasching, Österreich
Phorbolmyristatacetat Calbiochem, La Jolla, CA, USA
RPMI-1640 Gibco, Eggenstein
steriles A. bidest., endotoxinfrei Charles River Laboratories, Charleston,
SC, USA
Sytox® Green Invitrogen, Karlsruhe
Triton X-100 Ferak, Berlin
Trypanblau-Lösung Biochrom, Berlin
2.4 Mikrobiologische Arbeiten
BHI-Medium Oxoid, Hampshire, England
Caseinhydrolysat Roth, Karlsruhe
Glyzerol AppliChem, Darmstadt
Hefeextrakt Roth, Karlsruhe
Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck, Darmstadt
Lysostaphin Genmedics, Reutlingen
Lysozym Sigma, Deisenhofen
Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Roth, Karlsruhe
Natriumpyruvat Roth, Karlsruhe
TSB-Medium Oxoid, Hampshire, England
2.5 Molekularbiologische Arbeiten
A. dest., DNAse- und RNAse-frei Gibco, Eggenstein
Agarose Biozym, Hessisch Oldendorf
DMSO Sigma, Deisenhofen
DNA-Größenmarker (100 bp ladder) Roth, Karlsruhe
dNTPs Roche Diagnostics, Mannheim
Ethanol Roth, Karlsruhe
GoTaq Polymerase Promega, Mannheim
Magnesiumchlorid (MgCl2) Promega, Mannheim
2 Material
14
Natrium-EDTA Sigma, Deisenhofen
Random-Primer Invitrogen, Karlsruhe und
Eurofins mwg operon, Ebersberg
RedSafe® DNA-Farbstoff iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do,
Korea
Tris-HCl Sigma, Deisenhofen
5x Green GoTaq Flexi Buffer Promega, Mannheim
2.6 Immunologische Arbeiten
Annexin V-Bindungspuffer Southern Biotech
Annexin V-FITC BD, Heidelberg
Anti-FITC-Kaninchen-IgG-Fraktion-Alexa 488 Invitrogen, Karlsruhe
Anti-neutrophile-Elastase-Kaninchen-pAK Calbiochem, La Jolla, CA, USA
Bovines Serumalbumin (BSA) ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA
CD3-FITC/CD19-PE Simultest® BD, Heidelberg
CD45-PerCP BD, Heidelberg
FACS Clean BD, Heidelberg
FACS Flow BD, Heidelberg
Fetales Kälberserum (FCS) Gibco, Eggenstein
Fischgelatine Sigma, Deisenhofen
Fluoroprep® bio Mérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich
Formaldehyd 16% Polysciences, Warrington, PA, USA
Humane γ-Globuline (Cohn II-Fraktion) Sigma, Deisenhofen
Kaninchen IgG Isotyp Calbiochem, La Jolla, CA, USA
Katalase Sigma, Deisenhofen
Natriumazid Sigma, Deisenhofen
PBS Biochrom, Berlin
Propidiumiodid Sigma, Deisenhofen
Schwefelsäure (2 N H2SO4) Roth, Karlsruhe
Tween® 20 Sigma, Deisenhofen
Via-Probe® (7‘AAD) BD, Heidelberg
Ziege-anti-Kaninchen-AK-FITC BD Biosciences, Heidelberg
Ziegenserum Invitrogen, Karlsruhe
2 Material
15
4'-6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) Thermo Scientific, Dreieich
2.7 Proteinbiochemische Arbeiten
Acrylamide 4K solution (40 %) Mix 37,5:1 AppliChem, Darmstadt
Ammoniumperoxodisulfat (APS) Amersham Biosciences, Uppsala,
Schweden
Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) Merck, Darmstadt
Β-Mercaptoethanol Sigma, Deisenhofen
Bromphenol-Blau Sigma, Deisenhofen
Coomassie brilliant blue G-250 Merck, Darmstadt
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Sigma, Deisenhofen
Essigsäure Roth, Karlsruhe
Ethanol Merck, Darmstadt
Glyzerol Merck, Darmstadt
Glyzin Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Roth, Karlsruhe
Immobilon Polyvinylidene fluoride (PVDF) Millipore, Bedford, USA
Transfermembran
Isopropanol Merck, Darmstadt
Methanol Merck, Darmstadt
Milchpulver (blotting grade) Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe
Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck, Darmstadt
Natriumhydoxid (NaOH) Roth, Karlsruhe
Pelikan Tinte 4001 Pelikan, Hannover
Phosphorsäure (H3PO4) Roth, Karlsruhe
Protein MW Marker Fermentas, St. Leon-Rot
Salzsäure (HCl) Roth, Karlsruhe
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Thermo Scientific, Rockford, USA
Substrate Kit
Tetramethylethylendiamin (TEMED) Amersham Biosciences, Uppsala,
Schweden
2 Material
16
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS-Base) Merck, Darmstadt
Tween® 20 Sigma, Deisenhofen
3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]- Sigma, Deisenhofen
1-propansulfonat (CHAPS)
2.8 Kits
DNeasy® Blood & Tissue Kit Qiagen, Hilden
Human Th1/ Th2 Cytokine Kit BD, Heidelberg
Phagoburst®-Test Orpegen Pharma, Heidelberg
2.9 Bakterienstämme, -toxine und Blutprodukte
SH1-2, SH10-1, SH15-1, SH27-1, SH39-1, S. aureus-Stämme, isoliert aus dem
SH42-1 Nasenvorhof gesunder Probanden, Institut
für Immunologie und Transfusions-
medizin, Universität Greifswald [28]
H5313, H678, H3163, H6110, H7176, H4764, S. aureus-Stämme, isoliert aus Wunden
H6754 von Furunkulose-Patienten, Institut für
Mikrobiologie und Immunologie,
pommersche medizinische Universität
(PMU) Stettin, Polen [83]
SZ275, SZ255 S. aureus-Stämme, isoliert aus dem
Nasenvorhof gesunder Probanden, Institut
für Mikrobiologie und Immunologie,
PMU Stettin, Polen [83]
LAC (USA300), TM300 WT, TM300+lukPV Bettina Löffler, Institut für medizinische
Mikrobiologie, Universität Münster [47]
USA300∆lukPV Michael Otto, Abteilung für humane
bakterielle Pathogenese, National
Institutes of Health, Hamilton, MT, USA
[47]
2 Material
17
8325-4 WT Institut für medizinische Mikrobiologie
und Infektiologie, Erasmus-Universität
Rotterdam, Niederlande
CMRSA80, CMRSA8, CMSSA1, CMRSA1 Nationales Referenzzentrum für
Staphylokokken, Robert-Koch-Institut
Wernigerode
E. coli DM5α Institut für Immunologie und
Transfusionsmedizin, Universität
Greifswald
LukF, LukS, Anti-PVL-IgG, Anti-PVL-Serum Bettina Löffler, Institut für medizinische
Mikrobiologie, Universität Münster
Humanes venöses Vollblut, Serum gesunde freiwillige SpenderInnen, Institut
für Immunologie und Transfusions-
medizin, Universität Greifswald
2.10 Datenbanken, Software
FCAP Array v1.01 (Soft Flow) Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ,
USA
FlowJo Tree Star Inc., Ashland, OR, USA
Graph Pad Prism 5.0 Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA
ImageJ open source, entwickelt von Wayne
Rasband, National Institutes of Health
NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Skan It RE for Varioskan Flash Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA
Spot Advanced SPOT Imaging Solutions, Sterling
Heights, MI, USA
2 Material
18
2.11 Medien, Puffer, Lösungen
Kulturmedien
optimiertes RPMI-Medium 10 ml L-Glutamin (200 mM)
50 ml HSA 20 %
ad 500 ml RPMI-Medium
bei Experimenten ohne lebende Bakterien:
10 ml Penicillin-Streptomycin
BHI-Medium 37 g
ad 1 l A. dest., 15 min autoklaviert
CCY-Medium, pH 6,7 [84] 15 g Hefeextrakt
10 g Caseinhydrolysat
11,5 g Natriumpyruvat
3,15 g Na2HPO4
0,205 g KH2PO4
ad 500 ml A. dest., 15 min autoklaviert
TSB-Medium 30 g
ad 1 l A. dest., 15 min autoklaviert
Immunologische, zellbiologische Arbeiten
Blockpuffer für Immunfluoreszenz 10 ml Ziegenserum
5 g Fischgelatine
1 g BSA
50 µl Tween® 20
200 µl Natriumazid 10 %
ad 100 ml 1x PBS
Dextranlösung 2,5 g Dextran
ad 50 ml Dulbecco´s PBS, sterilfiltriert
FACS-Puffer 20 ml FCS
200 µl Natriumazid 10 %
ad 1 l FACS Flow
2 Material
19
Trypanblau-Lösung 50 ml Trypanblau-Stammlösung
50 ml PBS
Proteinbiochemische Arbeiten
SDS-Probenpuffer, reduzierend, 5x 0,6 ml Tris-HCl 0,5 mM (pH6,8)
2 ml SDS 10 %
5 ml Glyzerol
1 ml Bromphenolblau
0,9 ml A. bidest.
500 µl β-Mercaptoethanol
SDS-Elektrophorese-Laufpuffer (10x) 30 g Tris-HCl
240 g Glyzin
83 ml SDS 20 %
ad 1 l A. dest.
Sammelgel 5% (für 1 Gel) 258 µl Acrylamid 40 %
525 µl Tris 0,5 M, pH 6,8 (0,4 % SDS)
1,3 ml A. dest.
30 µl APS 10 %
2,5 µl TEMED
Trenngel 12,5% (für 13 Gele) 37,5 ml Acrylamid 40 %
30 ml Tris 1,5 M, pH 8,8 (0,4 % SDS)
52 ml A. dest.
600 µl APS 10 %
30 µl TEMED
Coomassie brilliant blue solution 50 g Coomassie brilliant blue G-250
(CBB stock) ad 1 l A.dest.
Colloidal coomassie staining solution 83 g (NH4)2SO4
(CCD stock) 9,6 ml H3PO4 (80 %)
17 ml CBB stock
ad 1 l A.dest.
2 Material
20
Colloidal coomassie solution 250 ml Methanol (100 %)
750 ml CCD stock
Coomassie-Fixierungslösung 400 ml Ethanol
100 ml Essigsäure
ad 1 l A. dest.
PBS pH 7,4 (1x) 8 g NaCl
0,2 g KCl
1,44 g Na2HPO4
0,24 g KH2PO4
ad 1 l A.dest.
PBS/T (1x) 1 ml Tween® 20
ad 1 l 1x PBS
TBS pH 7,6 (10 x) 24,2 g Tris
80 g NaCl
ad 1 l A.dest.
TBS/T (1x) 1 ml Tween® 20
ad 1 l 1x TBS
Blockpuffer für Western Blot 50 g Milchpulver
ad 1 l TBS/T
Transfer-Puffer pH 8,5 (1x) 3,025 g Tris
15 g Glyzin
200 ml Methanol
ad 1 l A.dest.
pH 8,5 mit HCl einstellen
Tintenfärbelösung 10 µl Pelikan Tinte
10 ml Essigsäure
90 ml PBS/T
2 Material
21
Substratlösung 15 ml Super Signal West Femto Luminol /
Enhancer Solution
15 ml Super Signal West Femto Stable
Peroxide Buffer
Tab. 1: Bestandteile und deren molekulare Masse und isoelektrischer Punkt des Protein-MW-Markers. Der Größenmarker wurde in den Proteingelen (SDS-PAGE) benutzt.
kDa Bestandteil pI-Wert
116 β – Galactosidase (E. coli) 5,28
66,2 BSA 5,60
45 Ovalbumin 5,19
35 LDH (Schweinemuskel) 8,22
25 REase Bsp98I (E. coli) 6,08
18,4 β - Lactoglobulin 4,83
14,4 Lysozym (Hühnereiweiß) 9,2
Tab. 2: Übersicht über die verwendeten DNA-Primer in der multiplex-PCR. Angegeben sind
zudem die Nukleotidsequenz, Größe und Literaturvermerk.
Name Gen Sequenz Größe (bp) Referenz
SmecA-1 mecA GTG AAG ATA TAC CAA GTG ATT 21 [85]
SmecA-2 ATG CGC TAT AGA TTG AAA GGA T 22
smw1409-1 MW1409 CAA ATT TTG AAA ACT TTA CGC 21 [86]
smw1409-2 TCC AGG ATT AAA AGA AGC G 19
Snuc-1 nuc GCG ATT GAT GGT GAT ACG GTT 21 [87]
Snuc-2 AGC CAA GCC TTG ACG AAC TAA AGC 24
Smw756-1 MW765 TGG TTA GCT ATG AAT GTA GTT GC 23 [86]
Smw756-2 GTC CAT CCT CTG TAA ATT TTG C 22
SarcA-1 arcA GCA GCA GAA TCT ATT ACT GAG CC 23 [86]
SarcA-2 TGC TAA CTT TTC TAT TGC TTG AGC 24
16SrRNA-1 16SrRNA AAC TCT GTT ATT AGG GAA GAA CA 23 [87]
16SrRNA-1 CCA CCT TCC TCC GGT TTG TCA CC 23
Sseh-1 seh CAA CTG CTG ATT TAG CTC AG 20 [88]
Sseh-2 GTC GAA TGA GTA ATC TCT AGG 21
Setd-1 etd CCC GTT GAT TAG TCA TGC AG 20 [88]
Setd-2 TCC AGA ATT TCC CGA CTC AG 20
Spvl-1 lukPV ATC ATT AGG TAA AAT GTC TGG ACA TGA TCC A 31 [88]
Spvl-2 GCA TCA A(G/C=S)T GTA TTG GAT AGC AAA AGC 27
Sgyr-1 gyr AGT ACA TCG TCG TAT ACT ATA TGG 24 [28]
Sgyr-2 ATC ACG TAA CAG TTC AAG TGT G 22
3 Methoden
22
3 Methoden
3.1 Zellbiologische Methoden
3.1.1 Isolation von Neutrophilen
Frisches mit EDTA antikoaguliertes Blut wurde mit 0,25 ml Dextranlösung je ml Blut
versetzt, mehrmals invertiert und 30 min bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurde das Dextranplasma mit den enthaltenden Leukozyten von den
sedimentierten Erythrozyten abgenommen und vorsichtig auf das gleiche Volumen Ficoll
überschichtet. Die Zellen wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation 20 min bei 300 g
ohne Bremse separiert.
Der Überstand und der PBMC-Ring wurden abgenommen, das Pellet enthält die Neutrophilen
und restliche Erythrozyten. Diese wurden mit A. bidest. lysiert und das Pellet wurde dreimal
mit PBS gewaschen (Zentrifugation für 5 min bei 410 g).
Die Zellen wurden in Medium aufgenommen und ein kleines Volumen wurde zur Vitalitäts-
und Zellzahlbestimmung mit Trypanblau verwendet. Anschließend wurden die Zellen in
Medium auf die gewünschte Konzentration eingestellt.
3.1.2 Vitalitäts- und Zellzahlbestimmung der Neutrophilen
Trypanblau färbt Proteine an, ist jedoch nicht membrangängig. Vitale Zellen bleiben daher
ungefärbt, während durch den Verlust der Membranintegrität tote Zellen blau angefärbt
werden. Die Zellvitalität wird über das Verhältnis lebender zu toter Zellen ermittelt.
Die Zellen wurden 1:10 in Trypanblau-Lösung verdünnt und in der Bürker-Kammer gezählt.
Für die Zellkonzentration gilt folgende Rechnung:
gezählte Zellzahl in 25 Kleinquadraten x 104 x Verdünnungsfaktor = Zellzahl/ml
3.1.3 Sytox-Assay
Der Sytox®-Farbstoff interkaliert in DNA, ist aber nicht membrangängig. Daher wird nur
extrazelluläre DNA detektiert. So kann der Zelltod über den Zeitverlauf erfasst werden. Die
Messung erfolgte an einem fluorometrischen Mikrotiterplatten-Lesegerät. Es wurden
schwarze 96-Well-Mikrotiterplatten verwendet, da diese eine niedrige Eigenfluoreszenz
aufweisen. Die Einführung in diese Methode wurde freundlicherweise durch Volker
Brinkmann vom Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ermöglicht [89].
3 Methoden
23
Je Well wurden 105 Neutrophile in 100 µl Kulturvolumen (optimiertes RPMI) eingesät und
mit den entsprechenden bakteriellen Stimulanzien bei 37°C inkubiert. PMA als NETose-
Kontrolle wurde mit einer Endkonzentration von 50 nM je Well eingesetzt, Triton als
Nekrose-Kontrolle mit 0,1 % (v/v). Als Negativkontrolle dienten unstimulierte Neutrophile,
um den natürlichen Apoptoseverlauf zu erfassen. Alle Stimulanzien wurden in optimiertem
RPMI verdünnt und mit einem Volumen von 80 µl eingesetzt. Es wurden
Triplettbestimmungen durchgeführt.
Vor der ersten Messung wurden 20 µl Sytox® Green in einer Endkonzentration von 1,25 µM
zugegeben. Das Endvolumen betrug 200 µl pro Well.
Am Fluorometer wurde mit Hilfe der Skan It RE-Software die Fluoreszenz bei einer
Extinktion von 485 nm und einer Emission von 538 nm gemessen.
Die detektierte relative DNA-Menge wurde in relative fluorescence units (RFU) angegeben.
3.2 Mikrobiologische Methoden
3.2.1 Kultivierung von S. aureus
Staphylokokken wurden auf Blutagar-Platten ausgestrichen und 12-24 h bei 37°C kultiviert.
Mit einer Einzelkolonie wurde eine 3 ml-TSB-Kultur in einem 15 ml-Falcon angeimpft und
ca. 2 h bei 37°C, 200 rpm und ausreichender Sauerstoffversorgung bis zum Erreichen der
logarithmischen Wachstumsphase (OD595 nm = 0,5) zirkulär geschüttelt. Diese Bakterienkultur
wurde für die folgenden Methoden weiterverwendet.
3.2.2 Gewinnung von S. aureus-Kulturüberstand
Aus einer 3 ml-Vorkultur wurde die Hauptkultur mit OD595 nm = 0,1-0,5 angeimpft. Die
Kolben wurden mit einem Zehntel bis einem Fünftel des Kolbenvolumens befüllt, um eine
optimale Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Innerhalb eines Versuchs wurden immer die
gleichen Kolbengrößen und Volumina eingesetzt. Die Bakterienkulturen wurden bis zu den
gewünschten ODs geschüttelt, welche UV-photometrisch bei 595 nm überprüft wurden. Das
Bakterienwachstum und dementsprechend die OD-Werte, die in der logarithmischen bzw.
stationären Phase erreicht wurden, hängen vom Nährstoffgehalt des eingesetzten
Kultivierungsmediums ab.
Zur Gewinnung der Überstände wurden 3-4 ml der Kultur 3 min bei 16.060 g zentrifugiert,
der Überstand abgenommen, sterilfiltriert und bei -20°C gelagert.
3 Methoden
24
3.2.3 Vorbereitung von S. aureus für Neutrophilen-Versuche
Eine 3 ml-TSB-Kultur wurde bis zum Erreichen der logarithmischen Phase geschüttelt und
die OD UV-photometrisch bei 595 nm bestimmt. 1 ml der Kultur wurde abgenommen und 3
min bei 16.060 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet zweimal mit
sterilem PBS gewaschen. Die Bakterien wurden durch Korrelation mit der OD auf die
gewünschte Zellzahl in Zellkulturmedium (optimiertes RPMI) eingestellt, dabei gilt für TSB-
Kulturen: OD = 1 entspricht 6,5 x 108 Bakterien/ml Kultur. Dieser Zusammenhang wurde in
Vorversuchen, in denen Bakterien verschiedener Kultur-ODs mikroskopisch in einer
Neubauer improved Petroff-Zählkammer gezählt wurden, festgestellt.
3.2.4 Anlegen von Glyzerolstocks
Die Bakterien wurden in einer 3 ml-TSB-Kultur bis zum Erreichen der stationären Phase
geschüttelt. 800 µl Kultur und 200 µl steril filtriertes 70 % Glyzerol wurden in ein
Kryoröhrchen überführt, gut gemischt und bei -80°C gelagert.
3.2.5 Gewinnung von Bakterienpellets
Die Bakterien wurden in einer 3 ml-TSB-Kultur bis zum Erreichen der stationären Phase
geschüttelt. 2 ml Kultur wurden abgenommen und 3 min bei 16.060 g zentrifugiert. Der
Überstand wurde dekantiert und das Pellet bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
3.3 Molekularbiologische Methoden
Alle Arbeiten mit DNA wurden mit Aerosol-resistenten Filterspitzen durchgeführt.
3.3.1 DNA-Isolation aus S. aureus
Zu Isolation der genomischen DNA aus S. aureus wurde das DNeasy® Blood & Tissue-Kit
von Qiagen verwendet. Um die Staphylokokken zu lysieren, wurde das Zellpellet mit 180 µl
enzymatischen Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM Natrium-EDTA, 1,2 % Triton, 20
mg/ml Lysozym, 220 µg/ml Lysostaphin) resuspendiert und 30 min bei 37°C inkubiert. Alle
weiteren Schritte wurden entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt.
Mit Hilfe des Nanodrop-Geräts (Peqlab) wurde bei 260 und 280 nm die OD der DNA-Lösung
und die DNA-Konzentration gemessen. Der Quotient OD260 nm/OD280 nm gibt eine Aussage
über die Reinheit der DNA-Probe. Liegt das Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0 handelt es sich
3 Methoden
25
um reine DNA. Bei Werten unter 1,8 bzw. über 2,0 handelt es sich Kontaminationen mit
Proteinen bzw. mit organischen Lösungsmitteln.
3.3.2 Multiplex-Polymerasekettenreaktion
Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) können in vitro bestimmte Gene oder
Genabschnitte selektiv amplifiziert werden. Einzelsträngige DNA dient dabei als Matrize für
die Synthese neuer komplementärer DNA-Stränge durch die bakterielle hitzestabile Taq-
Polymerase. Die benötigten freien 3´-Hydroxylgruppen werden von Primern geliefert, die als
komplementäre Oligonukleotide an flankierende Sequenzen des gewünschten DNA-
Abschnitts binden. Bei der Multiplex-PCR werden durch Kombination geeigneter Primer
mehrere DNA-Abschnitte in einem Ansatz nachgewiesen (Primersequenzen s. Tab. 2).
Hier wurden verschiedene Virulenzgene und stammspezifische Marker von S. aureus in zwei
Multiplex-PCRs detektiert.
Genomische DNA der zu untersuchenden S. aureus-Stämme wurde auf eine Konzentration
zwischen 10-20 ng/µl eingestellt. Von diesen Verdünnungen wurde pro Ansatz 1 µl zu 24 µl
Mastermix gegeben.
Als Positivkontrolle wurde eine DNA-Mischung verschiedener S. aureus-Referenzstämme
des nationalen Referenzzentrums für Staphylokokken (Wernigerode) verwendet (s. Tab. 4),
als Negativkontrolle DNA des S. aureus-Stammes 8325-4 und von E. coli. Um DNA-
Kontaminationen auszuschließen, wurde außerdem ein Mastermix-Ansatz ohne DNA
mitgeführt.
Tab. 3: Zusammensetzung der PCR-Ansätze Angegeben sind µl. Außer seh mit 10µM wurden alle
Primer 5 µM eingesetzt.
I II
A. bidest 3,30 0,30
5x Green GoTaq Flexi Buffer
5,00
5,00
dNTPs (1mM) 2,50 2,50
MgCl2 5,00
5,00
Primer mecA 1/2 1,00 MW1409 1/2 0,75
gyr 1/2 1,00 seh 1/2 2,00
MW756 1/2 0,75 aecA 1/2 0,75
PVL 1/2 0,75 etd 1/2 1,00
16srRNA 1/2 0,50 nuc 1/2 1,00
Taq-Polymerase (5 U/ml) 0,20 0,20
3 Methoden
26
Folgende PCR-Bedingungen wurden für die Amplifikation verwendet:
1. Initiale Denaturierung: 95°C 5 min
2. Denaturierung: 95°C 30 s
3. Hybridisierung: 60°C 30 s
4. Elongation: 72°C 1 min
5. Finale Elongation: 72°C 7 min
6. Lagerung 4°C ∞
26 Zyklen (2. – 4.)
Tab. 4: Übersicht über die Referenzstämme der Positivkontrolle der Multiplex-PCR. Angegeben
sind zudem die Stamm-Nr. des Robert-Koch-Instituts (RKI) und das Vorkommen der PCR-relevanten
Gene.
interne Stamm-Nr. RKI-Stamm-Nr. PCR-relevante Gene
CMRSA80 06-00300 lukPV, etd, mecA
CMRSA8 06-01127 lukPV, arcA, mecA, MW1409
CMSSA1 05-01290 lukPV, seh
CMRSA1 07-00814 MW756, mecA
3.3.3 Agarosegelelektrophorese
Die Auswertung der PCR-Ergebnisse erfolgte durch die Agarosegelelektrophorese. Durch
Anlegen einer äußeren Spannung können DNA-Moleküle im Agarosegel aufgetrennt werden,
da sie in Abhängigkeit von ihrer molekularen Masse unterschiedlich schnell durch das
Netzwerk der polymerisierten Agarose wandern.
In dieser Arbeit wurden 1,5 %ige Gele verwendet. Die Agarose wurde in TBE-Puffer durch
Aufkochen gelöst, nach kurzem Abkühlen mit RedSafe® (1:10.000), einem fluoreszierenden
DNA-Farbstoff versetzt und in eine Gelkammer zum Aushärten gegossen. Pro Tasche wurden
anschließend 10 µl des PCR-Produkts geladen.
Die Detektion der DNA-Banden erfolgte nach der Auftrennung unter UV-Licht, das
RedSafe® zur Fluoreszenz anregt.
3 Methoden
27
3.4 Immunologische Methoden
3.4.1 Immunfluoreszenzfärbung zur Darstellung von NETs
NETs bestehen größtenteils aus DNA und Bestandteilen der Granula der Neutrophilen. Diese
Komponenten werden zur Anfärbung der NETs genutzt. Hier wird DNA und neutrophile
Elastase (NE), ein Granulabestandteil, in der Immunfluoreszenzfärbung dargestellt. Die
Einführung in diese Methode wurde freundlicherweise durch Volker Brinkmann vom Max-
Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ermöglicht [89].
105 Neutrophilen pro Well wurden in chamber slides® eingesät, die Zellstimulation und die
eingesetzten Volumina entsprachen dem Vorgehen für den Sytox-Assay. Statt Sytox® Green
wurden 20 µl Zellkulturmedium (optimiertes RPMI) zugegeben.
Zum Abstoppen der Inkubation wurden die Zellen mit 2 % Formaldehyd fixiert.
Anschließend wurde vorsichtig die Flüssigkeit abgenommen und die Kammer abgehoben.
Der Objektträger wurde dreimal mit 1x PBS in Glasküvetten gewaschen.
Zur Permeabilisierung wurden die Zellen für 1 min mit 0,5 % Triton behandelt und danach
wieder gewaschen.
Nun wurde zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen 40 µl Blockpuffer je Well
aufgetragen und 30 min in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert.
Der Blockpuffer wurde entfernt und anschließend wurden als Primärantikörper (-AK) der
Anti-neutrophile-Elastase-Kaninchen-AK bzw. Kaninchen IgG Isotyp (je 10 µg/ml)
zugegeben und üN bei 4°C inkubiert. Alle Färbereagenzien wurden in Blockpuffer verdünnt
und es wurden immer 40 µl/Well aufgetragen.
Danach wurde gewaschen, als Sekundär-AK der Ziege-anti-Kaninchen-AK-FITC (5 µg/ml)
aufgetragen und 30 min bei 37°C im Dunkeln inkubiert.
Nach erneutem Waschen wurden anschließend die Tertiärreagenzien zugegeben. Zur DNA-
Färbung wurde Propidiumiodid (50 ng/ml) verwendet, zur Farbverstärkung des FITC-
markierten Sekundär-AK der α-FITC-Alexa 488-AK (10 µg/ml). Bei diesem Färbeschritt
wurde 1 h bei 37°C im Dunkeln inkubiert.
Anschließend wurde mit A. bidest. gewaschen, die Gummiabgrenzungen vom Objektträger
entfernt, das Präparat mit Fluoroprep® konserviert und mit einem Deckgläschen abgedeckt.
Das Präparat wurde am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet und fotografiert.
Die Belichtungszeiten innerhalb einer Färbungsreihe wurden beibehalten, um die
Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Die Bilder wurden eingefärbt, überlagert und ggf.
3 Methoden
28
bearbeitet mit dem Programm ImageJ. DNA wurde immer rot eingefärbt, neutrophile Elastase
grün.
3.4.2 Durchflusszytometrische Analyse der Burst-Fähigkeit von Neutrophilen
Mit Hilfe des Phagoburst®-Kits von Orpegen Pharma werden reaktive Sauerstoffspezies
(ROS), die von aktivierten Neutrophilen produziert werden, gemessen. ROS oxidieren das
fluorogene Substrat Dihydrorhodamin 123 und diese Reaktion kann durchflusszytometrisch
quantifiziert werden, so dass die Burst-Fähigkeit der aktivierten Neutrophilen bestimmt
werden kann.
In eine 96-Well-Flachbodenplatte wurden 105 Neutrophile je Well eingesät und mit den
jeweiligen Stimulanzien bei 37°C inkubiert. Außerdem wurden als Kontrollen Neutrophile
mit PMA stimuliert oder blieben unstimuliert. Die eingesetzten Konzentrationen und
Volumina entsprachen dem Vorgehen für den Sytox-Assay. Statt Sytox® Green wurden 20 µl
Zellkulturmedium (optimiertes RPMI) zugegeben.
Nach festgelegten Inkubationszeiten wurden mehrere Wells gepoolt und in ein FACS-
Röhrchen überführt. Ein Färbeansatz sollte ca. 3x105 Neutrophile enthalten. Bei längeren
Inkubationszeiten und bei zelltodfördernden Stimulanzien muss eine höhere Zelltodrate
berücksichtigt werden und es sollten dementsprechend mehr Wells gepoolt werden.
Die Zellen wurden 5 min bei 350 g zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die Zellen
mit 100 µl Medium resuspendiert. Um die Burst-Reaktion auszulösen, wurden die Zellen mit
50 nM PMA als starken Stimulus oder 5 µM fMLP als schwachen Stimulus stimuliert oder
blieben unstimuliert. Bei der Substratzugabe wurden zusätzlich 50 µg/ml Katalase zugegeben,
um Artefakte durch eine Kettenaktivierung durch extrazelluläre ROS zu reduzieren.
Zur DNA-Färbung wurden 25 ng/ml DAPI verwendet.
Ansonsten wurde nach Herstellerprotokoll verfahren. Die Proben wurden
durchflusszytometrisch analysiert, dabei wurde die Burst-Messung auf die lebenden, also
DAPI-negativen Zellen bezogen.
3.4.3 Durchflusszytometrische Untersuchung der Reinheit der Neutrophilen-
Suspension
Um kontaminierende PBMCs zu identifizieren, wurde die Zellsuspension mit CD3 und CD19
angefärbt, außerdem wurde zur Färbung aller Leukozyten CD45 als Pan-Leukozyten-Marker
eingesetzt.
Pro Färbeansatz wurden 106 Neutrophile eingesetzt. Die Zellen wurden mit FACS-Puffer
gewaschen (Zentrifugation für 6 min bei 300 g und 4°C, der Überstand wurde verworfen und
3 Methoden
29
die Zellen resuspendiert) und anschließend 10 min bei RT mit 1 mg/ml Cohn II inkubiert, um
Fc-Rezeptoren auf den Neutrophilen zu blockieren, die sonst unspezifisch AK binden würden.
Dann wurden 10 µl der CD3-/CD19-AK-Mischung und 25 µl des CD45-AK zugegeben und
15 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen in 100 µl
FACS-Puffer resuspendiert und durchflusszytometrisch analysiert.
3.4.4 Cytometric Bead Array (CBA)
Mit Hilfe des „Human Th1/ Th2 Cytokine Kits“ von BD werden typische pro- und
antiinflammatorische T-Zell-Zytokine detektiert. Das Kit beinhaltet sechs Bead-Populationen,
die sich in ihrer Fluoreszenzintensität (FL-3) unterscheiden und mit für IL-2-, IL-4-, IL-5-,
IL-10-, TNF-α- bzw. IFN-γ-spezifischen AK beschichtet sind. Diese Beads werden mit PE-
konjugierten Detektions-AK und den Standards bzw. Proben inkubiert und bilden dabei
sogenannte „Sandwich-Komplexe“. Die Auswertung erfolgte mit der FCAP Array-Software.
Es wurden nur 40 µl Bead/PE-Reagenz und 20 µl Kulturüberstand verwendet, für alle
weiteren Schritte wurde das Herstellerprotokoll befolgt. Die Nachweisgrenzen lagen für IL-5
bei 2,4 pg/ml, für IL-2 und IL-4 bei 2,6 pg/ml, für IL-10 und TNF-α bei 2,8 pg/ml und für
IFN-γ bei 7,1 pg/ml.
3.4.5 Durchflusszytometrische Quantifizierung apoptotischer Zellen
Annexin V detektiert Phosphatidylserin, einen Zellmembranbestandteil, der während der
frühen Phase des Zelltods an die Membranaußenseite gelangt und so von Annexin V
gebunden werden kann. 7’AAD färbt DNA an, ist jedoch nicht membrangängig, so dass nur
die von toten Zellen freigesetzte DNA erfasst wird.
In eine 96-Well-Flachbodenplatte wurden 105 Neutrophile je Well eingesät und mit den
jeweiligen Stimulanzien bei 37°C inkubiert. Außerdem wurden als Kontrollen Neutrophile
mit PMA stimuliert oder blieben unstimuliert. Die eingesetzten Konzentrationen und
Volumina entsprachen dem Vorgehen für den Sytox-Assay. Statt Sytox® Green wurden 20 µl
Zellkulturmedium (optimiertes RPMI) zugegeben.
Nach festgelegten Inkubationszeiten wurden mehrere Wells gepoolt und in ein FACS-
Röhrchen überführt. Ein Färbeansatz sollte ca. 3x105 Neutrophile enthalten. Bei längeren
Inkubationszeiten und bei zelltodfördernden Stimulanzien muss eine höhere Zelltodrate
berücksichtigt werden und es sollten dementsprechend mehr Wells gepoolt werden.
Wurde eine Stimulation mit lebenden Bakterien durchgeführt, wurden die Proben nach dem
Poolen mit 70 µg/ml Lysostaphin bei 37°C für 30 min inkubiert, um eine Kontamination des
Durchflusszytometers zu vermeiden. Lysostaphin beeinträchtigt nicht die Vitalität der
3 Methoden
30
Neutrophilen, was lichtmikroskopisch und in Kontrollansätzen in dieser Apoptosefärbung
überprüft wurde.
Die Zellen wurden mit FACS-Puffer gewaschen (Zentrifugation für 6 min bei 300 g und 4°C,
der Überstand wurde verworfen und die Zellen resuspendiert).
Nun wurden 95 µl Annexin V-Bindungspuffer und 5 µl Annexin V-FITC zugegeben und 20
min bei RT im Dunkeln inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen mit 1 ml Annexin V-Bindungspuffer wie oben beschrieben
gewaschen.
Zum Schluss wurden 10 µl 7’AAD und 150 µl Annexin V-Bindungspuffer zugegeben und die
Proben durchflusszytometrisch analysiert. Anhand der Population unstimulierter Zellen wurde
3.5 Proteinbiochemische Methoden
3.5.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Proteine werden hitzedenaturiert und mit Hilfe von Natriumdodecylsulfat (SDS)
einheitlich negativ geladen. Im elektrischen Feld wandern sie somit zur Anode. Dabei werden
sie in einem Polyacrylamid-Netzwerk nach ihrer molekularen Masse aufgetrennt. Zur
Erhöhung der Trennschärfe werden sie erst in einem grobmaschigen Sammelgel konzentriert
und wandern dann in einem engmaschigen Trenngel.
Zunächst wurde das Trenngel vorbereitet, in die Gelapparaturen gegossen und zum Schutz vor
Austrocknung mit Isopropanol überschichtet. Auf das polymerisierte Trenngel wurde nach
Entfernung des Isopropanols das Sammelgel gegossen und sofort luftblasenfrei ein Kamm
eingesetzt, der nach dem Aushärten des Gels vorsichtig wieder entfernt wurde. Die fertigen
Gele wurden in die Laufkammer gestellt und diese mit Laufpuffer gefüllt. Die Proteinproben
wurden mit dem 5x Ladepuffer versetzt und 5 min bei 95°C denaturiert. 10 µl der Proben
wurden dann in die Geltaschen geladen. Ein Proteinmarker (s. Tab. 1) zur Einschätzung des
Molekulargewichts der Proteinbanden wurde auf jedem Gel mitgeführt. Die ersten 30 min
wurde eine Spannung von 10 mA pro Gel angelegt, dann wurde auf 15 mA pro Gel erhöht.
3.5.2 Coomassie-Färbung
Um die Proteine im SDS-Gel sichtbar zu machen, wurden sie nach der Elektrophorese mit
Coomassie gefärbt. Dazu wurden die Gele zuerst in der Coomassie Fixierungslösung für 1 h
fixiert und zweimal 10 min in A. dest. gewaschen. Die Färbung der Gele in der Coomassie-
Färbe-Lösung erfolgte üN. Die gefärbten Gele können dann gescannt werden.
3 Methoden
31
20 % Methanol-Lösung diente zum Entfärben der Gele. Bei allen Schritten wurden die Gele
bei RT geschüttelt.
3.5.3 Western Blot
Die Proteine im Gel werden durch Anlegen eines elektrischen Felds auf eine Membran
transferiert. Die Membran kann dann für weitere Färbeschritte benutzt werden, so dass
bestimmte Proteine durch spezifische AK und daran gekoppelte Detektionsreagenzien
nachgewiesen werden können.
Die Gele wurden auf PVDF-Membranen geblottet, welche vorher in Methanol aktiviert
wurden. Gele, Membranen und Whatman-Papier wurden in Transferpuffer hydratisiert. Gel
und Membran wurden zwischen jeweils drei Lagen Whatman-Papier eingebettet. Pro
Membran wurde eine Stromstärke von 104 mA (1,75 mA/cm2) für 80 min angelegt. Um den
Erfolg des Proteintransfers zu prüfen, wurden die Proteine auf den Membranen 20 min mit
Tintenlösung angefärbt und können gescannt werden.
Nach dem Entfärben mit TBS/T wurden unspezifische Bindungsstellen für 1 h mit 30 ml
Milchpulver-Lösung je Membran geblockt. Anschließend wurden die Membranen üN bei 4°C
mit dem Primär-AK (Kaninchen-α-PVL-Serum, 1:100.000, 20 ml/Membran) inkubiert.
Nach fünfmaligem Waschen in TBS/T folgte die Inkubation mit dem Sekundär-AK (4 ng/ml)
für 1 h.
Es folgte wieder ein Waschschritt, dann wurde die Substratlösung nach Herstellerangaben
angesetzt (Thermo Scientific, SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Kit)
und die Membranen wurden mit je 3 ml Substratlösung 5 min im Dunkeln inkubiert. Die
Analyse erfolgte mit einem Chemilumineszenz-Scanner (LumiImager).
Wenn nicht anders angegeben, wurden die Membranen bei allen Block-, Wasch- und
Inkubationsschritten bei RT geschüttelt.
3.6 Statistische Auswertung
Bei Dreifachbestimmungen ist der Mittelwert angegeben, sofern der Standardfehler des
Mittelwerts (SEM) weniger als 20 % betrug. War der Standardfehler größer, wurde der am
stärksten abweichende Wert des Triplikats ausgeschlossen.
Bei den Balkendiagrammen mit Fehlerbalken ist der SEM des technischen Triplikats
angegeben.
3 Methoden
32
Die relative DNA-Menge, die im Sytox-Assay detektiert wurde, ist in relative fluorescence
units (RFU) angegeben.
Zur statistischen Auswertung wurden der ungepaarte zweiseitige t-Test mit Welch-Korrektur
bzw. die one-way analysis of variance (ANOVA) eingesetzt.
4 Ergebnisse
33
4 Ergebnisse
4.1 Wirkung von S. aureus-Kulturüberständen auf den Zelltod von
neutrophilen Granulozyten
Die Virulenz von S. aureus wird vor allem durch dessen Sekretionsprodukte vermittelt.
S. aureus sezerniert eine Vielzahl von Faktoren, die auf das Immunsystem stimulierend,
inhibierend oder toxisch wirken können. Dabei bilden neutrophile Granulozyten im
Immunsystem die erste Linie der Abwehr gegen Staphylokokken und werden mit deren
Sekretionsprodukten konfrontiert.
Als erstes sollten daher die Effekte der bakteriellen Sekretionsprodukte auf die
Zelltodinduktion bei Neutrophilen untersucht werden.
Dazu wurden sechs klinische S. aureus-Stämme analysiert, die aus dem Nasenvorhof
gesunder Probanden gewonnen wurden (sogenannte Carrier-Isolate) und aus
unterschiedlichen genetischen Linien stammen, so dass ein breites Bild erfasst wurde. Eine
Übersicht der genutzten Stämme findet sich in Tab. 5. Die Isolate sind publiziert [28].
Tab. 5: Übersicht über die sechs verwendeten Carrier-Isolate und ihre Superantigen-Gene. Aus
einer klinischen Studie (SH-Studie) wurden sechs Isolate aus nasaler Besiedlung ausgewählt, die aus
verschiedenen klonalen Linien stammen und sich in ihrem Superantigen-Genmuster unterscheiden.
S. aureus-Isolat
Superantigene
SE, tst egc eta, etd pvl
SH1-2 c l g i m n o - -
SH10-1 d j r - - -
SH15-1 - - - -
SH27-1 - - - -
SH39-1 tst g i m n o u - -
SH42-1 p g i m n o - -
Von diesen Isolaten wurden Kulturüberstände, also die Sekretionsprodukte, im Standard-
Medium TSB gewonnen. Da die Sekretion einzelner Faktoren wachstumsphasenabhängig
reguliert wird, wurden sowohl Überstände aus der logarithmischen (OD595 nm = 0,5) als auch
aus der stationären Wachstumsphase (ca. 3,5 h nach Abknicken des exponentiellen
Wachstums, dies entsprach OD595 nm ≈ 6) für die folgenden Versuche verwendet.
4 Ergebnisse
34
4.1.1 Unmittelbare Effekte der bakteriellen Kulturüberstände
Neutrophile Granulozyten sind kurzlebige Zellen und ihre Hauptaufgabe ist es, schnell – das
bedeutet im menschlichen Körper innerhalb von Stunden – auf schädigende Noxen zu
reagieren. Danach gehen sie in aktivitätsinduzierte Apoptose. Eine weitere schnelle Form des
Zelltods ist die durch PMA-Stimulation induzierte NETose. In vitro wurde NETose 3 bis 5 h
nach PMA-Stimulation beobachtet [14].
Wegen dieser Überlegungen wurde zunächst ein kurzer Zeitraum von ca. 8 h
Stimulationsdauer im Sytox-Assay untersucht.
Der Sytox-Assay dient zur Quantifizierung der DNA-Freisetzung, also Zellschädigung, von
Neutrophilen. Dies funktioniert mit Hilfe eines fluoreszierenden DNA-Farbstoffs, Sytox®
Green, der nicht membrangängig ist, also nur extrazelluläre DNA detektieren kann. Die
Fluoreszenzintensität wird quantifiziert und die DNA-Freisetzung somit als relative
fluorescence units (RFU) angegeben. In diesem Assay können verschiedene
Stimulationsbedingungen und -zeiträume getestet werden.
Abb. 3 zeigt die DNA-Freisetzung nach Stimulation mit S. aureus-Kulturüberständen, PMA,
Triton sowie ohne Behandlung. Stimulation mit PMA diente als Positivkontrolle für NETose.
NETose ist eine Zelltodform mit Freisetzung von Fangnetzen aus DNA und anderen
Zellbestandteilen der Neutrophilen zur Abwehr von Infektionserregern. Bereits 2 h nach
PMA-Zugabe wurde eine DNA-Freisetzung beobachtet, die über einen 4 bis 5-stündigen
Zeitverlauf weiter anstieg. Bei Tritonbehandlung wird durch eine Membranschädigung die
Zelllyse, also Nekrose induziert. Hier wurden innerhalb 1 h stark erhöhte Werte
extrazellulärer DNA detektiert, danach gab es nur noch einen schwachen Anstieg der Werte.
Bei unstimulierten Neutrophilen änderte sich das niedrige Niveau extrazellulärer DNA über
den beobachteten Zeitraum nicht.
Neben diesen Zelltodkontrollen wurden Neutrophile mit bakteriellen Überständen von sechs
Carrier-Isolaten aus der logarithmischen und stationären Wachstumsphase stimuliert.
Überstände der stationären Phase enthalten eine höhere Dichte und andere Zusammensetzung
der Sekretionsprodukte von S. aureus.
Abb. 3 zeigt die Ergebnisse mit den Überständen der stationären Phase des klinischen Isolats
SH10-1. Höhere Konzentrationen der Überstände (hier auf OD595 nm = 1 normalisiert) lösten
eine rasche DNA-Freisetzung der Neutrophilen aus: Innerhalb 1 h konnte ein Anstieg der
Werte extrazellulärer DNA beobachtet werden und dieser Anstieg setzte sich über die
nächsten Stunden fort, so dass nach 7 h sogar höhere Werte als nach PMA-Stimulation
4 Ergebnisse
35
erreicht wurden. Mit dem Sytox-Assay kann zwar keine definitive Aussage über die
Zelltodform der Neutrophilen erfolgen, doch im Vergleich zu den Kontrollen lässt die hier
beobachtete Kinetik der DNA-Freisetzung vermuten, dass es sich eher nicht um NETose
handeln kann. Dies soll anschließend in der Immunfluoreszenzfärbung aufgeklärt werden.
Niedrigere Konzentrationen der stationären Überstände erzielten keine detektierbare DNA-
Freisetzung der Neutrophilen.
Abb. 3: Zelltodinduktion bei Neutrophilen durch bakterielle Überstände der stationären Phase in hoher Konzentration (OD595 nm = 1). Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit verschiedenen
Verdünnungsstufen des Kulturüberstands des klinischen Isolats SH10-1 aus der stationären Phase
stimuliert. Zur Kontrolle wurden außerdem Neutrophile mit Triton oder PMA behandelt oder blieben
unstimuliert. Extrazelluläre DNA wurde als relative fluorescence units (RFU) detektiert.
Während Triton eine rasche DNA-Freisetzung innerhalb 1 h auslöste, war die DNA-Freisetzung unter
PMA-Behandlung um 2 h verzögert und nahm über 4-5 h zu. Unstimulierte Neutrophile verblieben
über den beobachteten Zeitraum auf einem niedrigen Niveau extrazellulärer DNA. Mit dem auf OD595
nm = 1 normalisierten Kulturüberstand der stationären Phase erfolgte eine rasche DNA-Freisetzung
innerhalb 1 h, ansteigend über die nächsten Stunden. Niedrigere Konzentrationen des Überstands
erzielten keine Effekte über den beobachteten Zeitraum.
Überstände der logarithmischen Wachstumsphase enthalten eine geringere Dichte an
bakteriellen Sekretionsprodukten, die maximal einsetzbare Konzentration entsprach daher
OD595 nm = 0,2. Diese Überstände lösten keine DNA-Freisetzung der Neutrophilen im
beobachteten Zeitfenster aus (s. Anhang Abb. A1).
Mit den Überständen der anderen fünf Carrier-Isolate wurden ähnliche Ergebnisse erzielt wie
mit dem Isolat SH10-1 (s. Anhang Abb. A2). Allerdings induzierten die Isolate eine
unterschiedlich starke DNA-Freisetzung.
Die Morphologie der Neutrophilen unter verschiedenen Stimulationsbedingungen kann in der
Immunfluoreszenzfärbung dargestellt werden. Angefärbt wurden DNA und neutrophile
4 Ergebnisse
Elastase (NE), ein Bestandteil der Granula. Beide Färbekomponenten lokalisieren sich auch in
NETs, so dass mit dieser Färbung NETose von anderen Zelltodformen abgegrenzt werden
kann.
Um die Zelltodform durch stationäre Überstän
wurden Neutrophile unter den oben erläuterten Stimulationsbedingungen 5 h inkubiert und
dann in der Immunfluoreszenzfärbung dargestellt (Abb. 4
Abb. 4: Aktivierung und leichte Zelllyse der Neutrophilen durch baktstationären Wachstumsphase. Neutrophile wurden mit stationären Überständen des klinischen
Isolats SH10-1 in zwei Verdünnungsstufen stimuliert sowie zur Kontrolle mit PMA und Triton
behandelt bzw. blieben unstimuliert. Nach 5 h Inkuba
dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
Unstimulierte Neutrophile behielten ihre ursprüngliche runde Zellform und lobulierte Kernstruktur
(Bild 1), PMA-stimulierte bildeten
Verdünnungen auf OD595 nm = 1 und 0,4 des Kulturüberstands der stationären Phase bewirkten eine
Zellabflachung und schwache Lyse der Neutrophilen, es wurden keine NETs beobachtet.
Unstimulierte Neutrophile zeigten eine erhaltene Zellmorphologie mit runder Zellform und
lobulierten Kernen (Abb. 4, Bild 1). PMA
lange DNA-Fäden dargestellt werden, in die neutrophile Elastase eingelagert war (Bild
Mit Triton behandelte Neutrophile waren nach 5 h vollständig lysiert, so dass nur noch
Zelltrümmer anfärbbar waren (Bild 3).
36
Elastase (NE), ein Bestandteil der Granula. Beide Färbekomponenten lokalisieren sich auch in
NETs, so dass mit dieser Färbung NETose von anderen Zelltodformen abgegrenzt werden
Um die Zelltodform durch stationäre Überstände in höherer Konzentration abzuklären,
wurden Neutrophile unter den oben erläuterten Stimulationsbedingungen 5 h inkubiert und
szenzfärbung dargestellt (Abb. 4).
Aktivierung und leichte Zelllyse der Neutrophilen durch bakterielle Überstände der Neutrophile wurden mit stationären Überständen des klinischen
1 in zwei Verdünnungsstufen stimuliert sowie zur Kontrolle mit PMA und Triton
behandelt bzw. blieben unstimuliert. Nach 5 h Inkubation wurden die Zellen fixiert, gefärbt und mit
dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. DNA wurde rot, NE grün eingefärbt.
Unstimulierte Neutrophile behielten ihre ursprüngliche runde Zellform und lobulierte Kernstruktur
stimulierte bildeten NETs (Bild 2), Triton behandelte wurden lysiert (Bild 3). Die
= 1 und 0,4 des Kulturüberstands der stationären Phase bewirkten eine
Zellabflachung und schwache Lyse der Neutrophilen, es wurden keine NETs beobachtet.
Neutrophile zeigten eine erhaltene Zellmorphologie mit runder Zellform und
, Bild 1). PMA-stimulierte Neutrophile bildeten NETs: Es konnten
Fäden dargestellt werden, in die neutrophile Elastase eingelagert war (Bild
Mit Triton behandelte Neutrophile waren nach 5 h vollständig lysiert, so dass nur noch
Zelltrümmer anfärbbar waren (Bild 3).
Elastase (NE), ein Bestandteil der Granula. Beide Färbekomponenten lokalisieren sich auch in
NETs, so dass mit dieser Färbung NETose von anderen Zelltodformen abgegrenzt werden
de in höherer Konzentration abzuklären,
wurden Neutrophile unter den oben erläuterten Stimulationsbedingungen 5 h inkubiert und
erielle Überstände der Neutrophile wurden mit stationären Überständen des klinischen
1 in zwei Verdünnungsstufen stimuliert sowie zur Kontrolle mit PMA und Triton
tion wurden die Zellen fixiert, gefärbt und mit
Unstimulierte Neutrophile behielten ihre ursprüngliche runde Zellform und lobulierte Kernstruktur
NETs (Bild 2), Triton behandelte wurden lysiert (Bild 3). Die
= 1 und 0,4 des Kulturüberstands der stationären Phase bewirkten eine
Zellabflachung und schwache Lyse der Neutrophilen, es wurden keine NETs beobachtet.
Neutrophile zeigten eine erhaltene Zellmorphologie mit runder Zellform und
stimulierte Neutrophile bildeten NETs: Es konnten
Fäden dargestellt werden, in die neutrophile Elastase eingelagert war (Bild 2).
Mit Triton behandelte Neutrophile waren nach 5 h vollständig lysiert, so dass nur noch
4 Ergebnisse
37
Nach 5 h Stimulation mit stationären Überständen des klinischen Isolats SH10-1 in den
Verdünnungen OD595 nm = 1 und 0,4 (Bild 4 und 5) zeigten die Neutrophilen
Aktivierungszeichen: Die Zellen waren abgeflacht und bildeten einige Ausläufer, die
Kernlobulierung war meist noch erhalten. Es wurden einige Zelltrümmer angefärbt, NETose
war allerdings nicht zu beobachten.
Die Überstände lösten also eine leichte Zelllyse aus, aber keine NETose.
4.1.2 Effekte von bakteriellen Überständen in der Langzeit-Untersuchung
Es ist möglich, dass schwächere, bakterielle Stimuli im Vergleich zu dem potenten PKC-
Aktivator PMA verzögert NETose induzieren. Daher soll neben der Betrachtung
unmittelbarer Effekte der S. aureus-Überstände nun ein längerer Stimulationszeitraum bis
zum natürlichen Zelltod der Neutrophilen in Kultur analysiert werden.
Bei Kultivierung im hier genutzten optimierten RPMI-Medium haben unbehandelte
Neutrophile eine Lebensspanne von 20-30 h. Ab 10 h Kulturdauer kann ein leichter Anstieg
der extrazellulären DNA-Werte unstimulierter Neutrophiler im Sytox-Assay beobachtet
werden, bis nach 20-30 h das Niveau der Zelltodkontrollen (PMA, Triton) erreicht ist, also
davon auszugehen ist, dass der Großteil der Zellen tot ist.
Bei Vorarbeiten mit bakteriellen Überständen in TSB wie auch mit TSB-Medium allein
konnte eine Verzögerung der DNA-Freisetzung der Neutrophilen beobachtet werden. TSB
selbst verlängerte also das Langzeitüberleben der Neutrophilen in Kultur (s. Anhang Abb.
A3). Ob bakterielle Sekretionsprodukte die DNA-Freisetzung durch Neutrophile ebenfalls
beeinflussen, ließ sich vor diesem Hintergrund nicht feststellen. Als Ursache für die TSB-
Wirkung wurde die reichhaltige Nährstoffzusammensetzung des TSB-Mediums
angenommen, die ein verlängertes Überleben der Neutrophilen in vitro ermöglichen könnte.
Um den TSB-Effekt zu vermeiden, wurden die bakteriellen Überstände für
Langzeituntersuchungen im Kulturmedium der Neutrophilen, optimiertem RPMI, gewonnen.
S. aureus zeigte in diesem Medium aufgrund der für Bakterien ungünstigeren
Nährstoffzusammensetzung ein geringeres Wachstum, die Sekretionsprodukte von S. aureus
liegen daher in diesen Überständen wahrscheinlich in deutlich geringeren Konzentrationen als
in typischen Prokaryoten-Medien vor.
Zelltodverzögerung durch bakterielle Zellkulturüberstände
Die in optimiertem RPMI gewonnenen bakteriellen Überstände wurden für die
Langzeituntersuchungen in sublytischen Konzentrationen (OD595nm = 0,1 und kleiner)
4 Ergebnisse
38
eingesetzt. Vor allem Überstände aus der stationären Wachstumsphase bewirkten in diesen
Konzentrationen eine Verzögerung des spontanen Zelltods der Neutrophilen in Kultur
(Abb. 5a), ähnlich wie es zuvor mit TSB-Medium beobachtet wurde. Ein Effekt durch das
Bakterienmedium kann hier allerdings ausgeschlossen werden.
Beginnend ab 12 h Kulturdauer konnte eine gegenüber unstimulierten Neutrophilen reduzierte
DNA-Freisetzung der mit stationären Überständen stimulierten Neutrophilen beobachtet
werden (Abb. 5a). Dieser Effekt war nach 24 h Inkubation am deutlichsten; hier war die
Menge extrazellulärer DNA von Neutrophilen stimuliert mit Überständen der stationären
Phase signifikant gegenüber den Werten unstimulierter Neutrophiler reduziert (Abb. 5b).
Bei stärkerer Verdünnung der Überstände war dieser Unterschied abgeschwächt, der
beobachtete Effekt war also konzentrationsabhängig (Abb. 5a).
Mit Überständen der logarithmischen Wachstumsphase konnte diese Zelltodverzögerung
nicht festgestellt werden (Abb. 5a).
Abb. 5a: Reduzierte DNA-Freisetzung der Neutrophilen durch S. aureus-Kulturüberstände der stationären Phase. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit verschiedenen Verdünnungsstufen des
Kulturüberstands des klinischen Isolats SH10-1 aus der logarithmischen bzw. stationären Phase,
gewonnen in optimiertem RPMI-Medium, stimuliert.
Überstände der stationären Phase bewirkten in hohen Konzentrationen (normalisiert auf OD595 nm = 0,1
bis 0,025) nach ca. 24 h Kulturdauer eine reduzierte DNA-Freisetzung der Neutrophilen verglichen
mit unstimulierten Neutrophilen.
4 Ergebnisse
39
Abb. 5b verdeutlicht die Unterschiede in der DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach 24 h
Kulturdauer und Stimulation mit Überständen der stationären Phase verglichen mit
unstimulierten Neutrophilen.
Abb. 5b: Reduzierte DNA-Freisetzung der Neutrophilen durch S. aureus-Kulturüberstände der stationären Phase. DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach 24 h Kulturdauer und Inkubation mit Überständen der stationären Phase (normalisiert auf OD595 nm = 0,1) der bakteriellen Isolate SH10-1, SH27-1 und SH39-1 verglichen mit unstimulierten Neutrophilen. Überstände der stationären Phase bewirkten eine signifikant (p < 0,01) geringere DNA-Freisetzung der
Neutrophilen verglichen mit unstimulierten Neutrophilen.
Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung (Abb. 6) verdeutlichen den Effekt der
Zelltodverzögerung: Nach 24 h Inkubation war die Zellzahl von Neutrophilen, die mit
stationären Überständen (Isolat SH10-1, Verdünnung auf OD595nm = 0,1) stimuliert wurden,
gegenüber der von unstimulierten Neutrophilen deutlich erhöht. Außerdem gab es in der
ersten Gruppe morphologische Anzeichen einer verbesserten Vitalität; die Zellform und die
lobulierte Kernstruktur waren besser erhalten. Unstimulierte Neutrophile zeigten dagegen
vermehrt runde, verdämmernde Zellkerne. Es konnten keine Anzeichen einer Zellaktivierung
durch die Überstände und keine NETose beobachtet werden.
4 Ergebnisse
Abb. 6: Verbesserte Vitalität der Neutrophilen nach langer Kulturdauer bei Stimulation mit Überständen der stationären Phase. des klinischen Isolats SH10-1, normalisiert auf OD
fluoreszenzmikroskopisch analysiert.
Bei den Neutrophilen, die mit dem Kulturüberstand stimuliert wurden, war die lobulierte
Kernmorphologie besser erhalten und die Zellzahl erhöht verglichen mit unstimulierten Neutrophilen.
Aktivierbarkeit der überlebenden Neutrophilen
Um dieses Phänomen der Zelltodverzögerung durch bakterielle Überstände der stationären
Wachstumsphase weiter aufzuklären, wurden
durchgeführt. Es sollte geprüft werden, ob die Neutrophilen durch Behandlung mit den
Überständen in einen anergischen Zustand versetzt werden oder aber länger funktionsfähig
bleiben als unbehandelte Neutrophile.
Dazu wurde nach 24 h Kulturdauer die proinflammatorische Aktivierbarkeit der Zellen,
nämlich die Fähigkeit, bei Aktivierung NETs oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu
bilden, untersucht. ROS werden bei Aktivierung der Neutrophilen
Reize freigesetzt und dienen der Abtötung und dem Abbau von Infektionserregern.
Neutrophile wurden mit verschiedenen Konzentrationen des stationären Überstands vom
Isolat SH10-1 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach 24 h wurden alle Ansätze zusätzlich
für 4 h mit PMA behandelt und in der Immunfluoreszenzfärbung analysiert (Abb.
Dabei zeigte sich, dass die Neutrophilen
dieser langen Kulturdauer bei PMA
verdämmerten die Zellen und die Zellzahl reduzierte sich zusätzlich. Dies geschah allerdings
in einem geringeren Ausmaß bei den Neutrophilen, die mit Überständen stimuliert wurden.
40
Verbesserte Vitalität der Neutrophilen nach langer Kulturdauer bei Stimulation mit Überständen der stationären Phase. Neutrophile wurden mit dem Überstand der stationären Phase
normalisiert auf OD595 nm = 0,1, stimuliert und nach 20 h Inkubation
fluoreszenzmikroskopisch analysiert. DNA wurde rot, NE grün eingefärbt.
Bei den Neutrophilen, die mit dem Kulturüberstand stimuliert wurden, war die lobulierte
lten und die Zellzahl erhöht verglichen mit unstimulierten Neutrophilen.
Aktivierbarkeit der überlebenden Neutrophilen
Um dieses Phänomen der Zelltodverzögerung durch bakterielle Überstände der stationären
Wachstumsphase weiter aufzuklären, wurden Funktionsversuche mit den Neutrophilen
durchgeführt. Es sollte geprüft werden, ob die Neutrophilen durch Behandlung mit den
Überständen in einen anergischen Zustand versetzt werden oder aber länger funktionsfähig
bleiben als unbehandelte Neutrophile.
wurde nach 24 h Kulturdauer die proinflammatorische Aktivierbarkeit der Zellen,
nämlich die Fähigkeit, bei Aktivierung NETs oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu
bilden, untersucht. ROS werden bei Aktivierung der Neutrophilen durch inflammatorische
freigesetzt und dienen der Abtötung und dem Abbau von Infektionserregern.
Neutrophile wurden mit verschiedenen Konzentrationen des stationären Überstands vom
1 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach 24 h wurden alle Ansätze zusätzlich
4 h mit PMA behandelt und in der Immunfluoreszenzfärbung analysiert (Abb.
Dabei zeigte sich, dass die Neutrophilen – mit oder ohne Behandlung mit Überständen
dieser langen Kulturdauer bei PMA-Stimulation keine NETs mehr bilden können. E
verdämmerten die Zellen und die Zellzahl reduzierte sich zusätzlich. Dies geschah allerdings
in einem geringeren Ausmaß bei den Neutrophilen, die mit Überständen stimuliert wurden.
Verbesserte Vitalität der Neutrophilen nach langer Kulturdauer bei Stimulation mit Neutrophile wurden mit dem Überstand der stationären Phase
= 0,1, stimuliert und nach 20 h Inkubation
Bei den Neutrophilen, die mit dem Kulturüberstand stimuliert wurden, war die lobulierte
lten und die Zellzahl erhöht verglichen mit unstimulierten Neutrophilen.
Um dieses Phänomen der Zelltodverzögerung durch bakterielle Überstände der stationären
Funktionsversuche mit den Neutrophilen
durchgeführt. Es sollte geprüft werden, ob die Neutrophilen durch Behandlung mit den
Überständen in einen anergischen Zustand versetzt werden oder aber länger funktionsfähig
wurde nach 24 h Kulturdauer die proinflammatorische Aktivierbarkeit der Zellen,
nämlich die Fähigkeit, bei Aktivierung NETs oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu
durch inflammatorische
freigesetzt und dienen der Abtötung und dem Abbau von Infektionserregern.
Neutrophile wurden mit verschiedenen Konzentrationen des stationären Überstands vom
1 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach 24 h wurden alle Ansätze zusätzlich
4 h mit PMA behandelt und in der Immunfluoreszenzfärbung analysiert (Abb. 7, Teil A).
mit oder ohne Behandlung mit Überständen – nach
Stimulation keine NETs mehr bilden können. Eher
verdämmerten die Zellen und die Zellzahl reduzierte sich zusätzlich. Dies geschah allerdings
in einem geringeren Ausmaß bei den Neutrophilen, die mit Überständen stimuliert wurden.
4 Ergebnisse
Gegenüber unstimulierten, PMA
behandelt mit dem Überstand in OD
erhöht und die Zellmorphologie besser erhalten. Der Unterschied war, wenn auch schwächer,
auch noch bei Behandlung mit der niedrigeren Konzentration
sichtbar.
Abb. 7: Verbesserte Vitalität nach PMANeutrophilen stimuliert mit dem Kulturdauer. Neutrophile wurden mit d
stationären Phase normalisiert auf OD
24 Kulturdauer wurden die Zellen zusätzlich für 4 h mit PMA behandelt (
zu bilden, zu untersuchen. Oder es wurde eine oxidative Burst
Synthese der verschieden vorstimulierten Neutrophilen quantifiziert.
Neutrophile bildeten nach 24 h Kulturdauer und zusätzlicher PMA
sondern reagierten eher mit erhöhter Sterblichkeit; doch Zellen stimuliert mit dem Überstand der
stationären Phase normalisiert auf OD
eine verbesserte Vitalität (A). Auch die Burst
h Kultur noch stärker ausgeprägt verglichen mit den unstimulierten Neutrophilen (
waren abgeschwächt auch mit der höheren Verdünnung des Überstands (normalisiert auf
OD595 nm = 0,02) sichtbar.
Nach langer Kulturdauer können bei Neutrophilen also nicht mehr NETs induziert werden,
doch die Behandlung mit bakteriellen Überständen vermindert den PMA
41
Gegenüber unstimulierten, PMA-restimulierten Neutrophilen (Bild 2) war bei Neutrophilen
behandelt mit dem Überstand in OD595 nm = 0,1 nach PMA-Restimulation (Bild 3) die Zellzahl
erhöht und die Zellmorphologie besser erhalten. Der Unterschied war, wenn auch schwächer,
auch noch bei Behandlung mit der niedrigeren Konzentration des Überstands (Bild 4)
Verbesserte Vitalität nach PMA-Behandlung (A) und stärkere Burst-Neutrophilen stimuliert mit dem S. aureus-Kulturüberstand der stationären Phase nach 24 h
Neutrophile wurden mit dem Kulturüberstand des klinischen Isolats SH10
stationären Phase normalisiert auf OD595 nm = 0,1und 0,02 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach
24 Kulturdauer wurden die Zellen zusätzlich für 4 h mit PMA behandelt (A), um die Fähigkeit, NETs
zu bilden, zu untersuchen. Oder es wurde eine oxidative Burst-Reaktion ausgelöst (
Synthese der verschieden vorstimulierten Neutrophilen quantifiziert.
Neutrophile bildeten nach 24 h Kulturdauer und zusätzlicher PMA-Stimulation keine NETs meh
sondern reagierten eher mit erhöhter Sterblichkeit; doch Zellen stimuliert mit dem Überstand der
stationären Phase normalisiert auf OD595 nm = 0,1 zeigten gegenüber unstimulierten Neutrophilen hier
). Auch die Burst-Reaktion war bei den stimulierten Neutrophilen nach 24
h Kultur noch stärker ausgeprägt verglichen mit den unstimulierten Neutrophilen (
waren abgeschwächt auch mit der höheren Verdünnung des Überstands (normalisiert auf
Nach langer Kulturdauer können bei Neutrophilen also nicht mehr NETs induziert werden,
doch die Behandlung mit bakteriellen Überständen vermindert den PMA-induzierten Zelltod.
bei Neutrophilen
Restimulation (Bild 3) die Zellzahl
erhöht und die Zellmorphologie besser erhalten. Der Unterschied war, wenn auch schwächer,
des Überstands (Bild 4)
-Reaktion (B) von Kulturüberstand der stationären Phase nach 24 h
em Kulturüberstand des klinischen Isolats SH10-1 aus der
= 0,1und 0,02 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach
), um die Fähigkeit, NETs
Reaktion ausgelöst (B) und die ROS-
Stimulation keine NETs mehr aus,
sondern reagierten eher mit erhöhter Sterblichkeit; doch Zellen stimuliert mit dem Überstand der
0,1 zeigten gegenüber unstimulierten Neutrophilen hier
tion war bei den stimulierten Neutrophilen nach 24
h Kultur noch stärker ausgeprägt verglichen mit den unstimulierten Neutrophilen (B). Beide Effekte
waren abgeschwächt auch mit der höheren Verdünnung des Überstands (normalisiert auf
Nach langer Kulturdauer können bei Neutrophilen also nicht mehr NETs induziert werden,
induzierten Zelltod.
4 Ergebnisse
42
Um dieses Ergebnis zu präzisieren, wurde außerdem die Fähigkeit zur ROS-Synthese bei
Aktivierung der Neutrophilen nach 24 h Kulturdauer ermittelt. Dieser Versuch wurde mit dem
Phagoburst®-Test von Orpegen Pharma durchgeführt. Neutrophile wurden direkt nach der
Isolation oder nach 24-stündiger Kultur mit den oben beschriebenen Überständen bzw. ohne
Stimulation mit PMA restimuliert. Die Zahl der Zellen, die ROS bilden, also mit einer
oxidative burst-Reaktion auf die Aktivierung antworten, wurde durchflusszytometrisch
quantifiziert. Dabei wurde der Anteil der burst-positiven Zellen auf die Gesamtzahl der
vitalen Zellen bezogen, damit Zellzahlverluste nach langer Kulturdauer nicht falsch-niedrige
Werte bedingen.
In Teil B von Abb. 7 sind die Ergebnisse dazu dargestellt. Frisch isolierte Neutrophile zeigten
nach PMA-Stimulation eine starke burst-Reaktion: 86,9 % der Zellen bildeten als Reaktion
auf den proinflammatorischen Stimulus ROS (Histogramm 1). Nach 24-stündiger Kulturdauer
sank dieser Anteil bei unstimulierten Neutrophilen auf 12,9 % (Histogramm 2). Die Fähigkeit
zur burst-Reaktion war aber deutlich besser erhalten, wenn die Neutrophilen über die lange
Kulturdauer mit bakteriellen Überständen stimuliert wurden; bei Behandlung mit dem
stationären Überstand des Isolats SH10-1 in der OD595 nm = 0,1 bildeten nach PMA-
Restimulation noch 72,8 % der Neutrophilen ROS (Histogramm 3). Bei Behandlung mit dem
niedriger konzentrierten Überstand (OD595 nm = 0,002) waren es immerhin noch 18,2 %
(Histogramm 4). Neben der Verzögerung der spontanen Apoptose war bei Stimulation mit
bakteriellen Überständen der stationären Phase also auch die proinflammatorische
Aktivierbarkeit der Neutrophilen konserviert.
Die Langzeit-Effekte der bakteriellen Überstände sind nicht durch PBMCs
vermittelt
Auch Moulding et al. konnten zeigen, dass bei Zusatz von S. aureus-Überständen die
Neutrophilen in Kultur länger überlebten als die unstimulierten Kontrollen [90]. Die Autoren
führten dies zurück auf den Einfluss kontaminierender PBMCs. Insbesondere die
Superantigene in den bakteriellen Überständen bewirkten eine polyklonale T-Zell-
Aktivierung, so dass auch eine geringe T-Zellzahl ausreichen würde, um Zytokin-vermittelt
die Effektorfunktionen und das Überleben der Neutrophilen zu beeinflussen. Hier ist
besonders das Zytokin Interferon-γ (IFN-γ) zu nennen, das bewiesenermaßen [90-92] die
Lebensspanne der Neutrophilen verlängert.
Um zu überprüfen, ob der Effekt der Zelltodverzögerung der Neutrophilen direkt durch die
bakteriellen Überstände oder durch PBMCs vermittelt wird, wurde die T- und B-
Zellkontamination nach Isolation der Neutrophilen durchflusszytometrisch analysiert. Dazu
4 Ergebnisse
wurde zur Darstellung aller enthaltenden Leukozyten CD 45 als Panleukozytenmarker
nachgewiesen; außerdem wurden der T
eingesetzt, um diese Populationen abzugrenzen. Abb.
abhängig von Zellgröße (FSC) und Granularität (SSC). Die größte Population bilden die
Neutrophilen (A). Lymphozyten (B) können schon anhand ihrer geringeren Größe und
Granularität von den Neutrophilen abgegrenzt werden. Sie mach
analysierten Zellen aus. Davon waren 34,7
(CD 19-positiv). Die restlichen Zellen müssen anderen Zelltypen zugeordnet werden, z.B.
Monozyten oder NK-Zellen, die hier nicht weiter analysiert w
Der Anteil kontaminierender T
Neutrophilen auszugehen ist.
Abb. 8: Nach Isolation befand sich in der NeutrophilenKontamination mit Lymphozyten. analysiert, um Kontaminationen durch andere Zelltypen festzustellen. Lymphozyten (
ihre geringere Größe (FSC) und Granularität (SSC) von der Neutrophilen
Der Anteil kontaminierender Lymphozyten (
Zur weiteren Klärung wurden mit dem
Konzentrationen der T-Zell-Zytokine IL
Neutrophilen-Kultur nach 24-stündiger Kult
mit dem bakteriellen Überstand der stationären Phase des Isolats SH10
oder 0,002, mit PMA oder mit rekombinanten TSST
unstimuliert. PMA diente als NETose
eine T- und B-Zell-Aktivierung
43
wurde zur Darstellung aller enthaltenden Leukozyten CD 45 als Panleukozytenmarker
nachgewiesen; außerdem wurden der T-Zell-Marker CD 3 und der B-Zell-Marker CD 19
opulationen abzugrenzen. Abb. 8 zeigt die Verteilung der Zelltypen
abhängig von Zellgröße (FSC) und Granularität (SSC). Die größte Population bilden die
Neutrophilen (A). Lymphozyten (B) können schon anhand ihrer geringeren Größe und
Granularität von den Neutrophilen abgegrenzt werden. Sie machten nur 0,2
analysierten Zellen aus. Davon waren 34,7 % T-Zellen (CD 3-positiv) und 9,18
positiv). Die restlichen Zellen müssen anderen Zelltypen zugeordnet werden, z.B.
Zellen, die hier nicht weiter analysiert wurden.
Der Anteil kontaminierender T-Zellen ist so gering, dass nicht von einer Beeinflussung der
Nach Isolation befand sich in der Neutrophilen-Suspension nur eine minimale Kontamination mit Lymphozyten. Neutrophile wurden nach der Isolation durchflusszytometrisch
analysiert, um Kontaminationen durch andere Zelltypen festzustellen. Lymphozyten (
ihre geringere Größe (FSC) und Granularität (SSC) von der Neutrophilen-Population (
ontaminierender Lymphozyten (B) machte ca. 0,2 % aus.
Zur weiteren Klärung wurden mit dem Human Th1/ Th2 Cytokine Kit von BD
Zytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α und IFN
stündiger Kulturdauer ermittelt. Dabei wurden die Neutrophilen
mit dem bakteriellen Überstand der stationären Phase des Isolats SH10-1 in OD
oder 0,002, mit PMA oder mit rekombinanten TSST-1 stimuliert oder sie blieben
unstimuliert. PMA diente als NETose-Kontrolle und verursacht außerdem als PKC
Aktivierung [93]. TSST-1 ist ein S. aureus-Superantigen; falls die
wurde zur Darstellung aller enthaltenden Leukozyten CD 45 als Panleukozytenmarker
Marker CD 19
ie Verteilung der Zelltypen
abhängig von Zellgröße (FSC) und Granularität (SSC). Die größte Population bilden die
Neutrophilen (A). Lymphozyten (B) können schon anhand ihrer geringeren Größe und
ten nur 0,2 % aller
positiv) und 9,18 % B-Zellen
positiv). Die restlichen Zellen müssen anderen Zelltypen zugeordnet werden, z.B.
Zellen ist so gering, dass nicht von einer Beeinflussung der
Suspension nur eine minimale wurden nach der Isolation durchflusszytometrisch
analysiert, um Kontaminationen durch andere Zelltypen festzustellen. Lymphozyten (B) wurden durch
Population (A) separiert.
BD die
α und IFN-γ in der
urdauer ermittelt. Dabei wurden die Neutrophilen
1 in OD595 nm = 0,1
1 stimuliert oder sie blieben
trolle und verursacht außerdem als PKC-Aktivator
Superantigen; falls die
4 Ergebnisse
44
Hypothese von Moulding et al. [90] hier zutrifft, müsste TSST-1 eine IFN-γ-Sekretion bei
möglicherweise enthaltenden T-Zellen auslösen. Im Sytox-Assay konnte allerdings bei TSST-
1-behandelten Neutrophilen keine Zelltodverzögerung festgestellt werden (s. Anhang Abb.
A4).
Unter allen Stimulationsbedingungen lagen die Konzentrationen aller getesteten Zytokine bei
max. 5 pg/ml oder lagen unter den Nachweisgrenzen (vgl. Kap. 3.4.4). Da keine Unterschiede
zwischen den Zytokin-Konzentrationen bei stimulierten und bei unstimulierten Neutrophilen
bestanden und alle detektierbaren Werte extrem niedrig waren, ist davon auszugehen, dass
diese Zytokin-Konzentrationen keinen biologischen Effekt auf die Neutrophilen hatten.
Bakterielle Überstände von klinischen Carrier-Isolaten verursachten also in hohen
Konzentrationen den Zelltod der Neutrophilen, sublytische Konzentrationen der stationären
Phase bewirkten dagegen bei langer Inkubationsdauer ein verlängertes Überleben und einen
Erhalt der proinflammatorischen Aktivierbarkeit der Neutrophilen.
4.2 Vergleichende Untersuchung von S. aureus-Isolaten von gesunden
Carriern und Patienten mit Furunkulose
Furunkulose ist eine schwere, oft chronifizierende Hautinfektion mit Beteiligung tiefer
Hautschichten und Gewebsnekrosen, die meist durch S. aureus ausgelöst wird. Die
infizierenden Isolate tragen besonders häufig das Toxin Panton-Valentin-Leukozidin (PVL)
[59]. PVL induziert bei humanen neutrophilen Granulozyten eine Zellaktivierung und den
Zelltod.
Das Toxin ist jedoch nicht krankheitsdeterminierend, denn es sind auch Fälle bekannt, bei
denen PVL-negative S. aureus-Isolate eine Furunkulose-Infektion auslösten [83].
Vor den Studien mit den klinischen Isolaten sollen zunächst die Effekte von rekombinantem
PVL selbst in den hier genutzten Assays erläutert werden.
4.2.1 Effekte von rekombinantem PVL auf Neutrophile
Das porenbildende Toxin PVL setzt sich aus zwei Einzelkomponenten, LukF-PV und LukS-
PV, zusammen, die jeweils allein keine Zelltod-induzierende Wirkung haben [55]. Im
Folgenden wurde rekombinantes PVL verwendet, das freundlicherweise von Bettina Löffler
(Universität Münster) bereitgestellt wurde. Löffler et al. zeigten, dass es ab Konzentrationen
von 200 ng/ml innerhalb 1 h den Zelltod der Neutrophilen auslöste [47].
4 Ergebnisse
45
Im Sytox-Assay wurde zunächst der Einfluss der beiden Einzelkomponenten und des PVL auf
die DNA-Freisetzung von Neutrophilen analysiert.
Abb. 9 zeigt, dass beide Einzelkomponenten keine Veränderung der DNA-Freisetzung
gegenüber unstimulierten Neutrophilen verursachten. Eine Kombination beider Komponenten
(PVL) aber löste einen Anstieg der extrazellulären DNA-Werte innerhalb 1 h aus. Die Werte
stiegen während der nächsten 3 Stunden weiter und blieben dann konstant. Sie lagen
unterhalb der Werte bei PMA-induziertem Zelltod. Die Kurvenverläufe der verschiedenen
PVL-Konzentrationen wichen nur geringfügig voneinander ab. Lichtmikroskopisch konnte
ein weitreichender Zelltod bei PVL-Behandlung festgestellt werden (Daten nicht gezeigt).
Abb. 9: Das Toxin PVL, nicht aber die Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV, bewirkte eine DNA-Freisetzung der Neutrophilen. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit verschiedenen
Konzentrationen LukF-PV, LukS-PV oder PVL stimuliert.
Eine DNA-Freisetzung der Neutrophilen konnte nur mit PVL beobachtet werden; der Effekt war
dosisabhängig und konnte ab ca. 1 h Inkubation beobachtet werden.
Es ist bekannt, das PVL eine proinflammatorische Aktivierung der Neutrophilen bewirkt. Ob
PVL auch NETs induziert, soll im Folgenden in der Immunfluoreszenzfärbung geklärt
werden.
Neutrophile wurden unter gleichen Stimulationsbedingungen wie oben beschrieben zu
verschiedenen Zeitpunkten (30 min, 1h, 4 h, 12 h) fluoreszenzmikroskopisch analysiert (Abb.
10). Bereits nach 30 min Inkubation konnte beginnend bei der höchsten PVL-Konzentration
4 Ergebnisse
(200 ng/ml) eine Zelllyse beobachtet werden: Die Kerne wurden rund und waren stark
vergrößert, die Zellmembranintegrität war geschädigt, so dass Zellinhalt (angefär
den Granula) austrat (Abb. 10, Bild 7). Bei den niedrigeren PVL
Bild 8 und10 ng/ml, Bild 9) trat der Zelltod etwas verzögert nach 1 bzw. 4 h auf, neben
Zelllyse konnten auch verdämmernde Zellkerne (12 h) beobachtet w
A5). Es wurden keine NETs detektiert. Mit den Einzelkomponenten (Abb.
konnte in allen eingesetzten Konzentrationen zu allen Zeitpunkten keine Zellschädigung
festgestellt werden, allenfalls eine geringfügige Aktivierung
Abb. 10: Nach 30 min Inkubation konnte mit PVL, nichtLukF- und LukS-PV, eine Zelllyse der Neutrophilen beobachtet werden. verschiedenen Konzentrationen LukF
Zeitpunkten fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Dargestellt ist der 30 min
rot, NE grün eingefärbt.
Unter PVL-Stimulation konnte besonders bei hohen PVL
Schädigung bis hin zur Lyse der Neutrophilen festgestellt werden. NETs wurden nicht beobachtet. Mit
den Einzelkomponenten LukF- und LukS
46
(200 ng/ml) eine Zelllyse beobachtet werden: Die Kerne wurden rund und waren stark
vergrößert, die Zellmembranintegrität war geschädigt, so dass Zellinhalt (angefär
, Bild 7). Bei den niedrigeren PVL-Konzentrationen (40 ng/ml,
Bild 8 und10 ng/ml, Bild 9) trat der Zelltod etwas verzögert nach 1 bzw. 4 h auf, neben
Zelllyse konnten auch verdämmernde Zellkerne (12 h) beobachtet werden (s. Anhang Abb.
). Es wurden keine NETs detektiert. Mit den Einzelkomponenten (Abb.
konnte in allen eingesetzten Konzentrationen zu allen Zeitpunkten keine Zellschädigung
, allenfalls eine geringfügige Aktivierung der Zellen.
Nach 30 min Inkubation konnte mit PVL, nicht aber mit den Einzelkomponenten PV, eine Zelllyse der Neutrophilen beobachtet werden. Neutrophile wurden mit
verschiedenen Konzentrationen LukF-PV, LukS-PV oder PVL stimuliert und zu verschiedenen
Zeitpunkten fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Dargestellt ist der 30 min-Zeitpunkt.
onnte besonders bei hohen PVL-Konzentrationen (200 und 40
Schädigung bis hin zur Lyse der Neutrophilen festgestellt werden. NETs wurden nicht beobachtet. Mit
und LukS-PV traten keine Veränderungen der Zellmorphologie
(200 ng/ml) eine Zelllyse beobachtet werden: Die Kerne wurden rund und waren stark
vergrößert, die Zellmembranintegrität war geschädigt, so dass Zellinhalt (angefärbt war NE in
Konzentrationen (40 ng/ml,
Bild 8 und10 ng/ml, Bild 9) trat der Zelltod etwas verzögert nach 1 bzw. 4 h auf, neben
erden (s. Anhang Abb.
). Es wurden keine NETs detektiert. Mit den Einzelkomponenten (Abb. 10, Bild 1-6)
konnte in allen eingesetzten Konzentrationen zu allen Zeitpunkten keine Zellschädigung
aber mit den Einzelkomponenten Neutrophile wurden mit
PV oder PVL stimuliert und zu verschiedenen
Zeitpunkt. DNA wurde
Konzentrationen (200 und 40 ng/ml) die
Schädigung bis hin zur Lyse der Neutrophilen festgestellt werden. NETs wurden nicht beobachtet. Mit
PV traten keine Veränderungen der Zellmorphologie auf.
4 Ergebnisse
47
Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte also, dass PVL in hohen Konzentrationen
(200 ng/ml) innerhalb 1 h Nekrose bei Neutrophilen auslöste; in mittleren Konzentrationen
(10-40 ng/ml) kam es aber zu einem verzögerten Zelltod, der morphologisch Anzeichen einer
Apoptose trägt.
Diese Vermutung wurde in einem Apoptose-Assay adressiert. Hierbei wird
durchflusszytometrisch die Lokalisation von Phosphatidylserin untersucht. Im Laufe des
frühen Apoptoseprozesses wird dieser Membranbestandteil an die Extrazellulärseite der
Zellmembran gebracht und kann so durch spezifische Bindung des Farbstoff-markierten
Annexin V detektiert werden. Außerdem wird DNA mit 7-Aminoactinomycin (7’AAD)
angefärbt. Sobald die Membranintegrität zerstört ist, kann DNA detektiert werden. Es können
folgende Stadien unterschieden werden: (1) Doppelt-negative Zellen sind vital. (2) Annexin
V-positive, 7’AAD-negative Zellen sind frühapoptotisch. (3) Doppelt-positive Zellen
befinden sich in der späten Apoptose oder Nekrose.
Neutrophile wurden unter den gleichen Stimulationsbedingungen wie oben beschrieben zu
drei Zeitpunkten (1 h, 4 h, 12 h) mit diesem Assay analysiert. In Abb. 11 ist der Anteil der
Zellen, der sich zu dem jeweiligen Zeitpunkt in der frühen Apoptose (Annexin V-positiv,
7’AAD-negativ) oder in der späten Apoptose bzw. Nekrose (Annexin V-positiv, 7’AAD-
positiv) befindet, dargestellt. Die Werte der unstimulierten Zellen wurden bei allen Gruppen
abgezogen, um den natürlichen Zelltodverlauf zu berücksichtigen. Bei Stimulation mit den
Einzelkomponenten wurden in allen Konzentrationen und zu allen Zeitpunkten keine
nennenswert erhöhten Anteile früh- oder spätapoptotischer Zellen festgestellt. Bei PVL-
Behandlung war bereits nach 1 h der Anteil frühapoptotischer Zellen erhöht. In der höchsten
PVL-Konzentration (200 ng/ml) stieg der Anteil doppelt-positiver, also schon
spätapoptotischer Zellen nach 4 h auf ca. 13 %, nach 12 h auf ca. 33 %. In den niedrigeren
PVL-Konzentrationen (40 und 10 ng/ml) fand die Apoptose verzögerter statt; nach 4 h war
der Anteil Annexin V-positiver, also frühapoptotischer Zellen um ca. 11-13 % erhöht, nach
12 h wurden die Neutrophilen zunehmend spätapoptotisch, die Anteile doppelt-positiver
Zellen stiegen auf ca. 20 % (40 ng/ml PVL) bzw. 4 % (10 ng/ml PVL).
PMA löste wie bereits bekannt nach einigen Stunden den Zelltod der Neutrophilen aus.
Neben der in der Immunfluoreszenzfärbung beobachteten Nekrose induziert rekombinantes
PVL also auch Apoptose; die Geschwindigkeit des Zelltods ist konzentrationsabhängig.
4 Ergebnisse
48
Abb. 11: PVL induzierte den Zelltod der Neutrophilen. Neutrophile wurden mit verschiedenen
Konzentrationen LukF-PV, LukS-PV oder PVL stimuliert und nach 1, 4 und 12 h
durchflusszytometrisch auf Zelltodmerkmale (Phosphatidylserin, detektiert durch Annexin V, und
DNA-Freisetzung, quantifiziert mit 7’AAD) analysiert. Weitere Erläuterungen s. Text. Die Werte der
unstimulierten Zellen wurden bei allen Gruppen abgezogen.
Bereits nach 1 h Stimulation konnte ein Anstieg der frühapoptotischen und zu späteren Zeitpunkten
auch spätapoptotischen bzw. nekrotischen Zellen unter PVL-Stimulation beobachtet werden. Dieser
Effekt war dosisabhängig. Mit den Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV konnte keine erhöhte
Zelltodrate beobachtet werden.
4 Ergebnisse
49
4.2.2 Vergleich der bakteriellen Überstände klinischer Isolate aus Besiedlung
und Furunkulose
Unter Berücksichtigung der Ergebnisse mit rekombinantem PVL wurden nun Untersuchungen
mit bakteriellen Überständen von Carrier- und Furunkulose-Isolaten angeschlossen. Es sollte
untersucht werden, ob sich Furunkulose-induzierende S. aureus-Isolate in ihrer Fähigkeit, den
Zelltod von Neutrophilen zu induzieren, von symptomfrei besiedelnden S. aureus-Isolaten
unterscheiden.
Dafür wurden aus der Studie von Masiuk et al. [83] Furunkulose-Isolate ausgewählt, die einen
möglichst ähnlichen genetischen Hintergrund zu den bereits analyierten sechs Carrier-Isolaten
aufweisen, also aus der gleichen klonalen Linie (clonal cluster, CC) stammen und möglichst
übereinstimmende Superantigen-Genmuster besitzen (Tab. 6). Zu dem Carrier-Isolat SH15-1
(CC 25) lag kein Furunkulose-Isolat mit entsprechendem CC vor. Zwei der insgesamt sieben
ausgewählten Furunkulose-Isolate trugen nicht die PVL kodierenden Gene (lukPV ); alle vier
gesammelten Furunkulose-Isolate des CC 45 (entsprechend zu SH1-2) waren lukPV-negativ
und für den CC 15 (entsprechend zu SH27-1) lag in der Furunkulose-Studie nur ein Vertreter
vor (H6110), der lukPV-negativ war.
Zusätzlich wurden Furunkulose- und Carrier-Isolate aus den CCs 121 und 22 eingeschlossen,
da Stämme dieser klonalen Linien in der Studie von Masiuk et al. ca. 70 % der Furunkulose-
Isolate ausmachten. Das Carrier-Isolat des CC 22 zeigte allerdings ein äußerst schlechtes
Wachstumsverhalten in den genutzten Standardmedien, so dass es ausgeschlossen wurde. Alle
im Folgenden genutzten Isolate sind in Tab. 6 zusammengestellt.
4 Ergebnisse
50
Tab. 6: Übersicht über die genutzten Carrier- und Furunkulose-Isolate, sortiert nach clonal clusters (CC). Zu den bereits eingesetzten sechs Carrier-Isolaten (SH-Stämme) wurden S. aureus-
Stämme isoliert aus Wundabstrichen von Furunkulose-Infektionen (H-Stämme) ausgewählt, die dem
gleichen CC angehören und ein möglichst gleiches Superantigen-Genmuster aufweisen. Außerdem
wurden Pärchen aus den CCs 121 und 22 ausgewählt (Erläuterungen s. Text). Zu den Isolaten SH15-1
(CC 25) und H4764 (CC 22) konnte kein entsprechendes Isolat der jeweils anderen Gruppe
miteinbezogen werden (Erläuterungen s. Text).
S. aureus-Isolat
spa-Typ MLST CC SE, tst egc eta, etd pvl agr
SH1-2 t015 CC45 c l g i m n o - - I
H4764 t015 CC45 c l g i m n o - - I
SH10-1 t008 CC8 d j r - - - I
H3163 t068 CC8 k q - - + III
SH15-1 t056 CC25 - - - - I
SH27-1 t084 CC15 - - - - II
H6110 t084 CC15 - - - - II
SH39-1 t012 CC30 tst g i m n o u - - III
H678 t037 CC30 a tst g i m n o u - + III
SH42-1 t002 CC5 p g i m n o - - II
H7176 t002 CC5 j r p g i m n o - + II
SZ275 t4495 CC121 - g i m n o u - - IV
H5313 t159 CC121 b g i m n o u - + IV
H6754 t005 CC22 - g i m n o - + I
Zunächst wurden die Überstände wie in Kap. 4.1.2 eingeführt in optimiertem RPMI
gewonnen und zur Stimulation der Neutrophilen im Sytox-Assay eingesetzt.
Hier zeigten sich keine Unterschiede zwischen beiden Gruppen. Beispielhaft sind die
Ergebnisse mit einem Isolat jeder Gruppe in Abb. 12 dargestellt. Bakterielle Überstände von
Furunkulose-Isolaten lösten keine vermehrte DNA-Freisetzung bei Neutrophilen aus. Auch
der Langzeit-Effekt der Zelltodverzögerung der Neutrophilen, der in Kap. 4.1.2 anhand der
Carrier-Isolate erläutert wurde, trat bei Stimulation mit Überständen der stationären Phase von
Furunkulose-Isolaten auf (Abb. 12).
4 Ergebnisse
51
Abb. 12: Keine Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose-Isolaten in der DNA-
Freisetzung der Neutrophilen nach Stimulation mit Kulturüberständen der stationären Phase. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit S. aureus-Überständen der stationären Phase des Carrier-
Isolats SH10-1 (links) und des Furunkulose-Isolates H678 (rechts) in verschiedenen
Verdünnungsstufen stimuliert.
Es konnte keine veränderte DNA-Freisetzung durch den Kulturüberstand des Furunkulose-Isolats
festgestellt werden. Der Überstand des Furunkulose-Isolats bewirkte die gleichen Effekte wie schon
für die Carrier-Isolate in Kap. 4.1.2 beschrieben.
Das optimierte RPMI ist kein bakterielles Nährmedium, S. aureus erreicht in diesem Medium
auch nur eine niedrige Bakteriendichte. Für relevante PVL-Konzentrationen sind aber
wahrscheinlich sehr hohe Bakteriendichten entscheidend, wie sie in nährstoffreichen
Wachstumsmedien in der stationären Phase erreicht werden [84].
4.2.3 Abhängigkeit der PVL-Expression von den Wachstumsbedingungen für
S. aureus
Die eben genannte Vermutung soll im Folgenden überprüft werden, indem S. aureus-
Überstände gewonnen in unterschiedlich reichhaltigen Medien analysiert werden. Für
Langzeit-Untersuchungen wären diese Medien ungeeignet, da sie wahrscheinlich wie schon
für TSB-Medium in Kap. 4.1.2 erläutert das Langzeit-Überleben der Neutrophilen in Kultur
beeinflussen würden. Für PVL wird aber ein rascher Effekt innerhalb der ersten 4 h erwartet,
wie es schon für rekombinantes PVL in diesem Kapitel (4.2.1) beobachtet werden konnte.
Ausgewählte Isolate der am Beginn dieses Kapitels vorgestellten Stammkollektion (Tab. 6)
sowie vier Referenzstämme wurden zur Gewinnung der Überstände in verschiedenen Medien
genutzt. Zu den Referenzstämmen zählten ein klinisches USA300-Isolat, also ein lukPV-
positivr CA-MRSA-Stamm (im Folgenden abgekürzt mit USA300 WT), sowie eine lukPV-
defiziente USA300-Mutante (USA300∆lukPV). Außerdem wurden ein lukPV-transfizierter
Staphylococcus carnosus-Stamm (TM+lukPV) und dessen lukPV-negativer Wildtyp-Stamm
4 Ergebnisse
52
(TM WT) genutzt. Die Ergebnisse der Standard-Multiplex-PCRs zum Screening auf wichtige
Genmarker und Virulenzgene sind im Anhang (Tab. A1) dargestellt.
Die eingesetzten Kultivierungsmedien waren neben optimiertem RPMI-Medium das TSB-
Medium, BHI-Medium und CCY-Medium. TSB-Medium ist ein Standard-Bakterienmedium,
das häufig zur Kultivierung von S. aureus benutzt wird. BHI-Medium ist ein reichhaltigeres
Medium zur Anzucht anspruchsvoller Mikroorganismen. CCY-Medium wurde in der
Literatur erstmals von Gladstone und van Heyningen [94] vorgestellt; später wurde
festgestellt, dass bei Kultivierung von lukPV-positivem S. aureus eine besonders hohe PVL-
Konzentration in diesem Medium erreicht werden kann [95].
Die Überstände wurden in der logarithmischen, der stationären und der poststationären
Wachstumsphase gewonnen, um die über den Kulturverlauf variierende
Genexpressionsregulation zu berücksichtigen.
Untersuchung der PVL-Expression von klinischen S. aureus-Isolate auf
Proteinebene
Das Vorhandensein der lukPV-Gene wurde für die betreffenden Furunkulose-Isolate (s. Tab.
6) und Referenzstämme (s. Anhang Tab. A1) in der PCR bestätigt. Mit den bakteriellen
Überständen der Furunkulose-Isolate in RPMI konnten bisher aber keine PVL-typischen
Effekte beobachtet werden; daher sollte der PVL-Gehalt der bakteriellen Überstände
seminquantitativ im Western Blot ermittelt werden.
Zunächst wurde der Färbeschritt mit dem Primärantikörper optimiert. Antiserum von PVL-
immunisierten Kaninchen bzw. die IgG-Fraktion hieraus wurden jeweils in den
Verdünnungsstufen 1:1.000, 1:10.000 und 1:100.000 eingesetzt. Das restliche Färbeverfahren
im Western Blot war bereits etabliert. Für die Optimierung wurden die Einzelkomponenten
LukF-PV, LukS-PV, beide Komponenten zusammen und die bakteriellen Überstände der vier
Referenzstämme in CCY-Medium in der poststationären Phase benutzt, um die PVL-
Bindungsstärke und -Spezifität der beiden Primärantikörper und der Titrationen zu
vergleichen.
Abb. 13 zeigt, dass die PVL-Bindung sowohl mit dem Antiserum als auch mit der IgG-
Fraktion erfolgreich war. Die LukF-PV- und LukS-PV-Banden waren bei den rekombinanten
PVL-Proben wie auch beim USA300-Wildtyp-Stamm und PVL-transfizierten S. carnosus
(TM+PVL) sichtbar. In CCY-Medium exprimieren diese Stämme also PVL. In den 1:1.000-
und 1:10.000-Verdünnungen waren jedoch auch andere Proteine der bakteriellen Überstände,
v.a. der S. aureus-Stämme, deutlich angefärbt. Dieser Hintergrund war in den 1:100.000-
4 Ergebnisse
Verdünnungen reduziert. Hier wies die Färbung mit Antiserum einen schwächeren
Hintergrund und schärfere PVL
Wahl des Primärantikörpers auf das Antiserum in der 1:100.000
Abb. 13: PVL-Antiserum vom Kanichen in der Verdünnung 1:10.000 bewirkte im Vorversuch die ausgewogenste Anfärbung zur LukFgeeignete Primärreagenz zur Anfärbung der Proteine LukF und LukS in
auszuwählen, wurden die IgG-Fraktion und das Antiserum von mit PVL immunisierten Kaninchen in
verschiedenen Verdünnungsstufen getestet. Aufgetragen wurden die Ein
LukS, das Toxin PVL und vier Referenzstämme, von denen USA300 WT und TM+PVL PVL
sind.
Mit der 1:10.000-Verdünnung des Antiserums wurde eine kräftige Anfärbung der LukF
Banden erreicht, ohne zu starke unspezifische
weiteren Versuche eingesetzt werden soll.
Nachfolgend wurden die bakteriellen Überstände der genannten Isolate und Referenzstämme
im Western Blot analysiert. Dafür wurden die Überstände aller Furunk
BHI- und CCY-Medium sowie die Überstände der vier Referenzstämme in optimiertem
53
Verdünnungen reduziert. Hier wies die Färbung mit Antiserum einen schwächeren
Hintergrund und schärfere PVL-Banden als die Färbung mit der IgG-Fraktion auf, so dass
Wahl des Primärantikörpers auf das Antiserum in der 1:100.000-Verdünnung fiel.
Antiserum vom Kanichen in der Verdünnung 1:10.000 bewirkte im Vorversuch die ausgewogenste Anfärbung zur LukF- und LukS-Detektion im Western Blot
eignete Primärreagenz zur Anfärbung der Proteine LukF und LukS in S. aureus
Fraktion und das Antiserum von mit PVL immunisierten Kaninchen in
verschiedenen Verdünnungsstufen getestet. Aufgetragen wurden die Einzelkomponenten LukF und
LukS, das Toxin PVL und vier Referenzstämme, von denen USA300 WT und TM+PVL PVL
Verdünnung des Antiserums wurde eine kräftige Anfärbung der LukF
Banden erreicht, ohne zu starke unspezifische Signale zu erhalten, so dass diese Konstellation für die
weiteren Versuche eingesetzt werden soll.
Nachfolgend wurden die bakteriellen Überstände der genannten Isolate und Referenzstämme
analysiert. Dafür wurden die Überstände aller Furunkulose
Medium sowie die Überstände der vier Referenzstämme in optimiertem
Verdünnungen reduziert. Hier wies die Färbung mit Antiserum einen schwächeren
Fraktion auf, so dass die
Verdünnung fiel.
Antiserum vom Kanichen in der Verdünnung 1:10.000 bewirkte im Vorversuch Western Blot. Um eine
-Kulturüberständen
Fraktion und das Antiserum von mit PVL immunisierten Kaninchen in
zelkomponenten LukF und
LukS, das Toxin PVL und vier Referenzstämme, von denen USA300 WT und TM+PVL PVL-positiv
Verdünnung des Antiserums wurde eine kräftige Anfärbung der LukF- und LukS-
Signale zu erhalten, so dass diese Konstellation für die
Nachfolgend wurden die bakteriellen Überstände der genannten Isolate und Referenzstämme
ulose-Isolate in TSB-,
Medium sowie die Überstände der vier Referenzstämme in optimiertem
4 Ergebnisse
54
RPMI-, TSB-, BHI- und CCY-Medium ausgewählt; alle Überstände stammten aus der
poststationären Wachstumsphase, weil in dieser am ehesten eine hohe PVL-Konzentration
erwartet wurde. Für die beiden lukPV-positiven Referenzstämme USA300WT und TM+PVL
wurden auch Überstände der logarithmischen Phase in CCY-Medium untersucht, falls PVL
auch schon in dieser Phase sezerniert wird. Außerdem wurde beispielhaft der bakterielle
Überstand eines lukPV-negativen Carrier-Isolats (SH10-1) der poststationären Phase in CCY-
Medium analysiert, um die spezifische PVL-Bindung des Antiserums zu überprüfen.
Die Überstände der Furunkulose-Isolate sind in der oberen Reihe von Abb. 14 dargestellt. Die
verschiedenen Medien der Überstände sind buchstabencodiert: (a) TSB-, (b) BHI- und (c)
CCY-Medium. Die LukF-PV- und LukS-PV-Banden traten am deutlichsten bei den
Überständen in CCY-Medium auf. Eine sehr schwache LukS-PV-Bande war auch bei den
Überständen der Isolate H678, H3163 und H7176 in BHI sichtbar. Überstände in TSB zeigten
keine PVL-Banden. Die beiden lukPV-negativen Isolate H6110 und H4764 waren auch im
Western Blot PVL-negativ. Auffälligerweise waren für das lukPV-positive Isolat H6754 keine
PVL-Banden sichtbar; möglicherweise sind die Gene für die Einzelkomponenten beschädigt,
so dass das Protein nicht exprimiert werden kann.
Oberhalb der Banden der PVL-Komponenten wurde bei fast allen Isolaten ein weiteres
Protein stark angefärbt. Die Intensität der Banden ist nicht Medium-abhängig.
Möglicherweise handelt es sich hierbei um Protein A oder ein anderes Adhärenzprotein von
S. aureus, das unspezifisch Immunglobuline bindet.
In der unteren Reihe von Abb. 14 sind die Ergebnisse mit den Referenzstämmen dargestellt,
die hier durchnummeriert wurden: (1) USA300 WT, (2) USA300∆lukPV, (3) TM WT,
(4) TM+lukPV. PVL-Banden waren nur bei dem USA300 WT-Stamm in CCY-Medium
deutlich sichtbar, außerdem sehr schwach ausgeprägt für den TM+lukPV-Stamm in BHI-
Medium. Die Überstände der beiden lukPV-positiven Referenzstämme aus der
logarithmischen Phase sowie das Carrier-Isolat SH10-1 blieben PVL-negativ. Wie bei den
Furunkulose-Isolaten in der oberen Reihe fiel auch hier bei den beiden S. aureus-Stämmen (1
und 2) eine zusätzliche Bande oberhalb der PVL-Komponenten auf.
4 Ergebnisse
Abb. 14: PVL-Nachweis in Kulturüberständen von FurunkuloseNährmedium. Bakterielle Überstände der Furunkulose
den Medien TSB (a), BHI (b) und CCY (c) gewonnen und im
Einzelkomponenten LukF und LukS untersucht. Außerdem wurden die Überstände de
Phase von den Referenzstämmen USA300 WT (1), USA300
verschiedenen Medien und einzelne Proben der logarithmischen Phase (USA300 WT CCY log,
TM+PVL CCY log) sowie ein Carrier
Bei den Überständen der in der PCR auf
Medium, geringfügig auch in BHI
Überstände der PVL-positiven Referenzstämme USA300 und TM+
positiv. Allerdings war das in der PCR positiv getestete Furunkulose
PVL-negativ. Die Überstände der beiden ausgewählten Referenzstämme aus der logarithmischen
Wachstumsphase und des Carrier
Diese Ergebnisse zeigen, dass die PVL
am stärksten in dem reichhaltigsten der hier genutzten Medien, dem CCY
Überstände wurden im Western Blot
PVL-Banden der CCY-Überstände nicht nur durch die etwas höheren Bakteriendichten und
damit höhere Konzentration der Sekretionsprodukte in den reichhaltigeren Medien erklärbar,
sondern müssen ein selektiver Effe
55
Nachweis in Kulturüberständen von Furunkulose-Isolaten in Abhängigkeit vom Bakterielle Überstände der Furunkulose-Isolate wurden in der poststationären Phase in
den Medien TSB (a), BHI (b) und CCY (c) gewonnen und im Western Blot auf ihren Gehalt an den
Einzelkomponenten LukF und LukS untersucht. Außerdem wurden die Überstände de
Phase von den Referenzstämmen USA300 WT (1), USA300∆PVL (2), TM WT (3), TM+PVL (4) in
verschiedenen Medien und einzelne Proben der logarithmischen Phase (USA300 WT CCY log,
TM+PVL CCY log) sowie ein Carrier-Isolat (SH10-1 CCY poststat) analysiert.
Bei den Überständen der in der PCR auf lukPV positiv getesteten Furunkulose-Isolate konnte in CCY
Medium, geringfügig auch in BHI-Medium, eine PVL-Expression festgestellt werden. Auch die
positiven Referenzstämme USA300 und TM+PVL waren in diesen Medien PVL
positiv. Allerdings war das in der PCR positiv getestete Furunkulose-Isolat H6754 im
negativ. Die Überstände der beiden ausgewählten Referenzstämme aus der logarithmischen
Wachstumsphase und des Carrier-Isolats zeigten keine PVL-Expression.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die PVL-Expression also vom Kulturmedium abhängig ist und
am stärksten in dem reichhaltigsten der hier genutzten Medien, dem CCY-Medium, ist. Die
Western Blot zwar unverdünnt eingesetzt; trotzdem sind die deutlichen
Überstände nicht nur durch die etwas höheren Bakteriendichten und
damit höhere Konzentration der Sekretionsprodukte in den reichhaltigeren Medien erklärbar,
sondern müssen ein selektiver Effekt des CCY-Mediums sein.
Isolaten in Abhängigkeit vom Isolate wurden in der poststationären Phase in
auf ihren Gehalt an den
Einzelkomponenten LukF und LukS untersucht. Außerdem wurden die Überstände der poststationären
∆PVL (2), TM WT (3), TM+PVL (4) in
verschiedenen Medien und einzelne Proben der logarithmischen Phase (USA300 WT CCY log,
Isolate konnte in CCY-
Expression festgestellt werden. Auch die
PVL waren in diesen Medien PVL-
Isolat H6754 im Western Blot
negativ. Die Überstände der beiden ausgewählten Referenzstämme aus der logarithmischen
Expression also vom Kulturmedium abhängig ist und
Medium, ist. Die
ünnt eingesetzt; trotzdem sind die deutlichen
Überstände nicht nur durch die etwas höheren Bakteriendichten und
damit höhere Konzentration der Sekretionsprodukte in den reichhaltigeren Medien erklärbar,
4 Ergebnisse
56
Medium-abhängige Effekte der bakteriellen Überstände auf Neutrophile
Die bereits beschriebenen bakteriellen Überstände klinischer Isolate in verschiedenen
Nährmedien wurden nun zur Stimulation von Neutrophilen im Sytox-Assay eingesetzt. Dazu
wurden die Überstände immer auf die gleichen Bakteriendichten normalisiert, also die
jeweilige OD595 nm der Kultur bei Überstandsabnahme. Die bakteriellen Überstände der
stationären und poststationären Phase aller Medien lösten in hohen Konzentrationen (auf
OD595 nm = 0,2 bis 1 verdünnt) die DNA-Freisetzung der Neutrophilen innerhalb der ersten
Stunden aus (s. Anhang Tab. A2). In einer stärkeren Verdünnung (OD595 nm = 0,04) fielen
Unterschiede zwischen den Überständen eines Isolats in verschiedenen Medien auf: Bei
Furunkulose-Isolaten lösten die Überstände in CCY eine stärkere DNA-Freisetzung der
Neutrophilen aus als die Überstände in BHI oder TSB (Abb. 15). Mit Überständen von
Carrier-Isolaten fiel dieser Unterschied deutlich geringer aus oder trat gar nicht auf.
Abb. 15: Stärkere DNA-Freisetzung der Neutrophilen bei Stimulation mit Überständen eines Furunkulose-Isolats gewonnen in reichhaltigen Nährmedien. Neutrophile wurden im Sytox-Assay
mit Überständen des Carrier-Isolats SH10-1 oder des Furunkulose-Isolats H678 gewonnen aus der
stationären Phase und normalisiert auf OD595 nm = 0,04 in verschiedenen Nährmedien stimuliert.
Überstände des Furunkulose-Isolats in reichhaltigen Medien (BHI, CCY) lösten eine stärkere DNA-
Freisetzung der Neutrophilen aus als Überstände des Carrier-Isolats in den gleichen Medien.
Die Ergebnisse mit allen eingesetzten Überständen der potstationären Wachstumsphase sind
farbkodiert in Tab. A2 (s. Anhang) dargestellt.
4 Ergebnisse
Die Daten zu den Überständen
im CCY-Medium verdünnt auf OD
Hier ist die DNA-Freisetzung nach 4 h Inkubation mit den genannten Überständen dargestellt.
Es wird deutlich, dass die Isolate, die im
eine stärkere DNA-Freisetzung bei Neutrophilen hervorriefen als PVL
Unterschied war hochsignifikant (p = 0,0002).
Abb. 16: Stärkere DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach Stimulation mit Kulturüberständen PVL-positiver S. aureus-Isolate gewonnen in CCYder Neutrophilen im Sytox-Assay
normalisiert auf OD595 nm = 0,04 in CCY
Die Überstände PVL-positiver Isolate verursachte eine
Freisetzung als die PVL-negativer Isolate. Lediglich bei dem Stamm TM+PVL fiel kein Unterschied
zum PVL-negativen Wildtyp-Stamm auf.
Eine stärkere Zelltodinduktion durch bakterielle Überstände von Furunkulose
primär PVL-vermittelt. PVL verursacht konzentrationsabhängig die Nekrose bzw. Apoptose
der Neutrophilen; S. aureus synthetisiert PVL in relevanten Konzentrationen aber nur unter
speziellen Wachstumsbedingungen und bei hohen Bakteriendichten, was für das Verständnis
des Infektionsverlaufs in vivo
57
Die Daten zu den Überständen der stationären Phase lukPV-positiver und -negativer Isolate
Medium verdünnt auf OD595 nm = 0,04 sind nochmals in Abb. 16 zusammengefasst.
Freisetzung nach 4 h Inkubation mit den genannten Überständen dargestellt.
late, die im Western Blot PVL-positiv getestet wurden (Abb. 1
Freisetzung bei Neutrophilen hervorriefen als PVL-negative Isolate, dieser
Unterschied war hochsignifikant (p = 0,0002).
Freisetzung der Neutrophilen nach Stimulation mit Kulturüberständen Isolate gewonnen in CCY-Medium. Übersicht über die DNA
Assay 4 h nach Stimulation mit Überständen aus der station
= 0,04 in CCY-Medium.
positiver Isolate verursachte eine signifikant (p = 0,0002) stärkere DNA
negativer Isolate. Lediglich bei dem Stamm TM+PVL fiel kein Unterschied
Stamm auf.
Eine stärkere Zelltodinduktion durch bakterielle Überstände von Furunkulose
vermittelt. PVL verursacht konzentrationsabhängig die Nekrose bzw. Apoptose
synthetisiert PVL in relevanten Konzentrationen aber nur unter
speziellen Wachstumsbedingungen und bei hohen Bakteriendichten, was für das Verständnis
berücksichtigt werden sollte.
negativer Isolate
zusammengefasst.
Freisetzung nach 4 h Inkubation mit den genannten Überständen dargestellt.
positiv getestet wurden (Abb. 14),
negative Isolate, dieser
Freisetzung der Neutrophilen nach Stimulation mit Kulturüberständen Übersicht über die DNA-Freisetzung
4 h nach Stimulation mit Überständen aus der stationären Phase
stärkere DNA-
negativer Isolate. Lediglich bei dem Stamm TM+PVL fiel kein Unterschied
Eine stärkere Zelltodinduktion durch bakterielle Überstände von Furunkulose-Isolaten ist also
vermittelt. PVL verursacht konzentrationsabhängig die Nekrose bzw. Apoptose
synthetisiert PVL in relevanten Konzentrationen aber nur unter
speziellen Wachstumsbedingungen und bei hohen Bakteriendichten, was für das Verständnis
4 Ergebnisse
58
4.3 Zelltodinduktion bei Neutrophilen durch lebende S. aureus-Zellen
Neben der Untersuchung der Sekretionsprodukte von S. aureus sollen auch die Wirkungen
der Bakterienzellen auf Neutrophile untersucht werden. Mögliche Interaktionen sind hier
vielfältiger, da sich Bakterien in Kokultur mit Neutrophilen weiter vermehren,
Sekretionsprodukte bilden, aber auch über zellständige Moleküle mit Neutrophilen
interagieren; außerdem können Neutrophile die Bakterien phagozytieren oder durch NETs
inaktivieren.
Lebende S. aureus-Zellen bewirkten einen Anstieg der extrazellulären DNA-Werte der
Neutrophilen im Sytox-Assay (Abb. 17). Je größer das eingesetzte Verhältnis der
Bakterienzahl zur Neutrophilen-Zahl (multiplicity of infection, MOI) war, desto rascher wurde
die DNA-Freisetzung beobachtet. Bei MOI 10 begann der Anstieg der DNA-Werte nach 3-4 h
Kokultur, die Werte stiegen über 4 h weiter an und blieben dann stabil. Lichtmikroskopisch
konnte in der Zeit eine Vermehrung der Bakterienzahl und ein zunehmender Zelluntergang
der Neutrophilen beobachtet werden. Bei niedrigeren MOIs setzte die DNA-Freisetzung
verzögerter ein, der sigmoidale Kurvenverlauf war jedoch ähnlich. Die Kurven aller MOIs
erreichten im Plateau-Bereich ein ähnliches Niveau extrazellulärer DNA-Werte.
Abb. 17: Keine Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose-Isolaten in der Zelltodinduktion durch lebende Bakterien. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit lebenden
Bakterien des Carrier-Isolats SH27-1 und des Furunkulose-Isolat H6110 in verschiedenen MOIs
stimuliert.
Lebende Bakterien sowohl des Carrier- als auch des Furunkulose-Isolats lösten eine DNA-Freisetzung
der Neutrophilen aus. Die Geschwindigkeit der DNA-Freisetzung war abhängig von der eingesetzten
Bakterienzahl. Carrier- und Furunkulose-Isolate unterschieden sich nicht im Ausmaß der induzierten
DNA-Freisetzung.
Nach 6 h Kokultur der Bakterien und Neutrophilen wurde eine Immunfluoreszenzfärbung
durchgeführt (Abb. 18). Bei Stimulation mit Bakterien der MOI 0,1 konnten Zeichen der
4 Ergebnisse
Apoptose, wie ein Verlust der Kernlobulierung
werden, einige Zellen bildeten
erhebliche Nekrose der Neutrophilen (Bilder 4 und 5)
Abb. 18: Das Zelltodverhalten der Neutrophilen war abhängig von der eingesetzten MOI der lebenden S. aureus-Zellen. Neutrophile wurden mit
verschiedenen MOIs stimuliert und nach 6 h Kokultur fluoreszenzmikroskopisch analysiert.
wurde rot, NE grün eingefärbt.
Abhängig von der eingesetzten MOI zeigten die Neutrophilen Zeichen der Zellaktivierung, Apoptose
und NETose (MOI 0,1) bis hin zur Nekrose (MOI 1
4.3.1 Vergleichende Untersuchung von
Furunkulose-Isolaten
Bakterien der gesamten in Kap. 4.2.2
Sytox-Assay analysiert; es konnten keine Unterschiede zwischen Carrier
Isolaten festgestellt werden. Exemplarisch ist je ein Isolat jeder Gruppe in Abb.
In Abb. 19 sind die Ergebnisse der gesamten Stammkollektion zusammengestellt, di
sind nach CCs sortiert. Abgebildet ist die DNA
Kokultur mit Bakterien der verschiedenen Isolate in Start
59
ein Verlust der Kernlobulierung und ein Schrumpfen der Zelle, beobachtet
, einige Zellen bildeten auch NETs (Bild 6). Mit höheren MOIs (1-10) zeigte sich ein
der Neutrophilen (Bilder 4 und 5).
Das Zelltodverhalten der Neutrophilen war abhängig von der eingesetzten MOI der Neutrophile wurden mit vitalen Bakterien des Isolats SH10
verschiedenen MOIs stimuliert und nach 6 h Kokultur fluoreszenzmikroskopisch analysiert.
Abhängig von der eingesetzten MOI zeigten die Neutrophilen Zeichen der Zellaktivierung, Apoptose
) bis hin zur Nekrose (MOI 1-10).
Vergleichende Untersuchung von S. aureus-Zellen von Carrier
Isolaten
Kap. 4.2.2 (Tab. 6) beschriebenen Stammkollektion wurden im
analysiert; es konnten keine Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose
Isolaten festgestellt werden. Exemplarisch ist je ein Isolat jeder Gruppe in Abb.
sind die Ergebnisse der gesamten Stammkollektion zusammengestellt, di
sind nach CCs sortiert. Abgebildet ist die DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach 7 h
Kokultur mit Bakterien der verschiedenen Isolate in Start-MOI 1. Es traten Isolat
und ein Schrumpfen der Zelle, beobachtet
10) zeigte sich eine
Das Zelltodverhalten der Neutrophilen war abhängig von der eingesetzten MOI der olats SH10-1 in
verschiedenen MOIs stimuliert und nach 6 h Kokultur fluoreszenzmikroskopisch analysiert. DNA
Abhängig von der eingesetzten MOI zeigten die Neutrophilen Zeichen der Zellaktivierung, Apoptose
Zellen von Carrier- und
(Tab. 6) beschriebenen Stammkollektion wurden im
und Furunkulose-
Isolaten festgestellt werden. Exemplarisch ist je ein Isolat jeder Gruppe in Abb. 17 dargestellt.
sind die Ergebnisse der gesamten Stammkollektion zusammengestellt, die Isolate
Freisetzung der Neutrophilen nach 7 h
MOI 1. Es traten Isolat-spezifische
4 Ergebnisse
60
Unterschiede bei den Werten der extrazellulären DNA auf, jedoch keine Unterschiede
zwischen den beiden untersuchten Gruppen. Die Isolat-spezifischen Schwankungen waren
nicht durch die Zugehörigkeit zu unterschiedlichen CCs bedingt.
Abb. 19: Keine Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose-Isolaten in der Zelltodinduktion durch lebende Bakterien. Übersicht über alle eingesetzten Carrier- und
Furunkulose-Isolate. Abgebildet ist die DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach 7 h Kokultur mit
lebenden Bakterien der MOI 1 (s. Abb. 19).
Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose-Isolaten hinsichtlich
der DNA-Freisetzung von Neutrophilen festgestellt werden. Es traten jedoch Isolat-spezifische
Unterschiede auf.
5 Diskussion
61
5 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde die Zelltodinduktion durch S. aureus bei neutrophilen
Granulozyten analysiert. Da die Bestimmung des Zelltods einige technische Störfaktoren
birgt, sollen zuerst die hier genutzten Methoden zur Zelltoddetektion kritisch beleuchtet und
verglichen werden.
Im Folgenden werden allgemeine Effekte der Interaktion von Neutrophilen mit bakteriellen
Sekretionsprodukten von S. aureus eingeordnet, um dann auf den Isolate-Vergleich aus
nasaler Besiedlung und Furunkulose-Infektion und die Rolle von Panton-Valentin-Leukocidin
einzugehen.
5.1 Methodik der Zelltodbestimmung: Wie aussagekräftig sind die
hier genutzten Assays?
Die einfachste und direkteste Bestimmung von Zelltod besteht in der Messung der DNA-
Freisetzung. Dazu werden DNA-Farbstoffe genutzt, die nicht membrangängig sind und so nur
extrazelluläre DNA detektieren. Damit kann aber nicht zwischen verschiedenen
Zelltodformen differenziert werden.
Zur longitudinalen Erfassung der DNA-Freisetzung wurde der Sytox-Assay verwendet. Durch
die erfasste Kinetik kann orientierend zwischen rascher Lyse oder induzierter Apoptose/
NETose unterschieden werden. Die Konzentration der quantifizierten DNA entspricht aber
nicht unbedingt der Zellzahl, die untergegangen ist: Bei der Nekrose liegt die DNA
dekondensiert vor und ist so besser erreichbar für den Farbstoff, dies könnte höhere
Messwerte der Nekrose-Kontrolle erklären.
Die bislang beste Methode, um NETs sicher nachzuweisen, ist die Immunfluoreszenzfärbung.
Durch die mikroskopische Beurteilung der Zellmorphologie können die Zelltodformen
unterschieden werden. Da die fixierten Zellen vor der Färbung permeabilisiert wurden, wird
auch die DNA vormals vitaler Zellen angefärbt, so dass die Kernmorphologie während
verschiedener Stimulationsbedingungen und in frühen Zelltodphasen ausgewertet werden
kann. Die Apoptose-Morphologie ist allerdings nicht immer ganz einfach festzustellen.
Außerdem werden bei Nekrose z.T. auch lange DNA-Fäden freigesetzt, die nicht mit NETs
verwechselt werden dürfen. Beim Färbevorgang müssen die Zellen mit Sorgfalt behandelt
werden, um während der Waschschritte die fragilen NETs nicht zu zerstören. Wurden die
5 Diskussion
62
Neutrophilen vorher, v.a. während der Isolation stärker gestresst, so können auch bei der
Anfärbung unstimulierter Zellen NETs beobachtet werden.
Als dritte Methode der Zelltodbestimmung wurde ein Apoptose-Assay genutzt, hier die
Detektion von Phosphatidylserin (PS) mittels Annexin V [96] und von extrazellulärer DNA
mittels 7’AAD. Durch diese Doppelfärbung kann die Apoptose (in frühen Stadien Annexin V-
positiv, 7’AAD -negativ) von Nekrose (Annexin V-positiv, 7’AAD -positiv) differenziert
werden.
Die Annexin V-Färbung ist wohl die am weitesten verbreitete Methode zur Apoptose-
Detektion, weil sie folgende Vorteile hat: Die PS-Verschiebung an die Außenmembran
geschieht innerhalb weniger Stunden nach dem apoptotischen Stimulus, durch die hohe PS-
Dichte und die hohe Affinintät von Annexin V zu PS ist sie besonders sensitiv [97] und
zudem verhältnismäßig preiswert. Zur Unterscheidung von nekrotischen Zellen, die ebenfalls
Annexin V-positiv anfärbbar sind, sollte zusätzlich eine Färbung extrazellulärer DNA
erfolgen, wie in dieser Arbeit durchgeführt. Zu beachten ist bei dieser Methode, dass auch
während der NETose die Detektion von PS beschrieben wurde [14], außerdem können ggf.
auch nekrotische Zellen Annexin V-positiv, aber noch negativ für den DNA-Farbstoff sein
[98, 99]. Zur Apoptose-Detektion und -Quantifizierung ist die Annexin V-Färbung also sehr
gut geeignet, sie garantiert allerdings keine absolut sichere Abgrenzung von anderen
Zelltodformen.
Andere Methoden zum Apoptose-Nachweis sind die TUNEL-Methode, dabei wird die DNA-
Fragmentierung quantifiziert [100, 101]: Diese Methode ist eher teuer, weniger sensitiv als
die Annexin V-Färbung und es sind falsch-positive Ergebnisse bei Nekrose, DNA-
Reparaturen und Gentranskriptionsvorgängen möglich [102].
Auch der Nachweis der Caspase-Aktivierung [103, 104] durch spezifische Antikörper wird
häufig genutzt; es wurde aber berichtet, dass die Caspase-Aktiverung kein sicheres Zeichen
für Apoptose ist, zudem sind für diese Methode relativ hohe Zellzahlen nötig [102].
Dies sind allesamt Eigenschaften der Apoptose, die somit spezifisch nachgewiesen werden
kann. Für Nekrose und NETose sind bisher keine spezifischen Marker bekannt. Die
Unterscheidung gelingt am ehesten durch die variierende Morphologie: Bei der Apoptose
schrumpfen die Zellen, die DNA kondensiert und die Zelle löst sich in kleine apoptotische
Körperchen auf; bei der Nekrose schwillt die Zelle an und zerplatzt; bei der NETose löst sich
der Kern auf und DNA-Fäden (NETs) werden freigesetzt.
5 Diskussion
63
Die morphologische Beurteilung ist daher die genaueste Methode, besonders die
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gilt als Goldstandard zur Apoptosedetektion
[102]. Dieses Verfahren ist aber sehr teuer und aufwändig; meist ist eine lichtmikroskopische
Auswertung der Zellmorphologie mit histologischer oder immunfluoreszenter Färbung
ausreichend.
Da jede Methode Lücken beinhaltet, sollten verschiedene Prinzipien kombiniert werden. Im
Umgang mit Neutrophilen sollte bei der Auswahl zudem berücksichtigt werden, dass
Neutrophile leicht reagible Zellen sind, die möglicherweise schon auf Stimuli der technischen
Behandlung mit einer Aktivierung und Zelltodinduktion antworten und so einen hohen
Hintergrund verursachen können.
Aus diesen Gründen wurde hier der Sytox-Assay als Verfahren, bei dem die Neutrophilen in
der Zellkultur kaum beeinträchtigt werden, genutzt, weil er einen raschen Überblick über die
Kinetik und das Ausmaß des Zelltods unter verschiedenen Stimulationsbedingungen bietet.
Dies wurde kombiniert mit der Quantifizierung von Apoptose in der Annexin V-Färbung und
der qualitativen Beurteilung der Zellmorphologie in der Immunfluoreszenzmikroskopie.
5.2 Modulierung des Zelltods von neutrophilen Granulozyten durch
S. aureus
Zelltodinduktion durch Sekretionsprodukte von S. aureus
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Kulturüberstände von S. aureus aus der
logarithmischen und der stationären Phase konzentrationsabhängig den Zelltod der
Neutrophilen auslösten. Bekanntermaßen schädigen zahlreiche sezernierte Faktoren von
S. aureus wie z.B. α-Hämolysin [45] oder die phenol-soluble modulins [46] Neutrophile.
Überraschend war jedoch die Beobachtung im Langzeitversuch: Bei Kultivierung über ca.
24 h war der natürliche Zelltod der Neutrophilen, die mit sublytischen Konzentrationen der
bakteriellen Überstände stimuliert wurden, zeitlich verzögert. Zudem war die
proinflammatorische Aktivierbarkeit der Neutrophilen, also die Fähigkeit, auf entsprechende
Stimuli mit einer oxidative burst-Reaktion zu antworten, besser erhalten.
Diese Effekte waren nur mit Überständen aus der stationären Wachstumsphase zu
beobachten, sie scheinen also von der Zusammensetzung der Kulturüberstände abzuhängen;
die Genexpression bei S. aureus wird abhängig von der Zelldichte, also Wachstumsphase
5 Diskussion
64
reguliert. In der logarithmischen Phase werden vor allem Adhärenzfaktoren gebildet, in der
stationären Phase eher Toxine. Dieses Phänomen der Zelltodverzögerung ist bisher wenig
untersucht, da es kaum Studien gibt, die die Effekte von S. aureus-Überständen in
sublytischen Konzentrationen auf Neutrophile über einen längeren Stimulationszeitraum
analysieren.
Ist die Zelltodverzögerung ein Artefakt durch Zellkontaminationen?
Die Gruppe um Moulding et al. hatte den Effekt der Zelltodverzögerung durch S. aureus-
Überstände auch schon beobachtet und konnten zeigen, dass dies indirekt durch Zytokine von
kontaminierenden Lymphozyten bedingt ist [90]. Dass zahlreiche Zytokine, wie IFNγ [90,
92], IL-6 [92, 105, 106], IL-1β [92], IL-2 [107], IL-15 [108], GM-CSF [92, 109, 110] oder in
niedrigen Konzentrationen TNFα [91, 92] den Zelltod der Neutrophilen verzögern und die
Fähigkeit zur burst-Reaktion erhalten können, ist bekannt.
Moulding et al. begründeten die Zytokinfreisetzung mit der Stimulation der Lymphozyten
durch S. aureus-Superantigene [90]. Superantigene bewirken eine polyklonale T-Zell-
Aktivierung, so dass in der Tat geringe Zellzahlen ausreichend für eine Produktion von
relevanten Zytokinmengen wären.
Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit geprüft, konnte jedoch nicht bestätigt
werden: Die Kontamination durch Lymphozyten nach Neutrophilen-Isolation war in dieser
Arbeit um den Faktor 10 geringer als von Moulding et al. berichtet (hier 0,2 %, vgl. Moulding
et al.: < 3 %). Auch löste das Superantigen TSST-1, das kontaminierende T-Zellen zur
starken Zytokinsekretion stimuliert hätte, keine Zelltodverzögerung der Neutrophilen aus.
Zudem lagen die Konzentrationen der Zytokine (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α und IFN-γ) in
der Neutrophilenkultur, stimuliert durch S. aureus-Überstände unter der Detektionsgrenze.
Damit wird auch sehr unwahrscheinlich, dass andere möglicherweise kontaminierende
Zelltypen, wie Makrophagen mittels Zytokinproduktion den Zelltod der Neutrophilen
verzögern.
In Frage käme weiterhin eine Autoregulation der Neutrophilen, publiziert von Ocaña et al.:
Während der in vitro-Infektion mit S. aureus-Zellen wurden die Zytokine IL-6, TNFα und IL-
1β detektiert [78]. Diese Daten konnten wir für TNFα (s.o.) in der vorliegenden Arbeit nicht
bestätigen, IL-6 und IL-1β wurden hier nicht gemessen. In der Studie von Ocaña et al. wurde
allerdings der Anteil der kontaminierenden Lymphozyten nach der Neutrophilen-Isolation
nicht ermittelt, es ist also nicht gesichert, dass die gemessenen Zytokine von Neutrophilen
produziert wurden.
5 Diskussion
65
In der Literatur finden sich weitere Hinweise auf Faktoren, die eine Apoptoseverzögerung der
Neutrophilen bewirken: Dazu zählen Hypoxie [111], ein Faktor, der unter den
experimentellen in vitro-Bedingungen dieser Arbeit keine Rolle spielt, sowie die Aktivierung
von Leptin-Rezeptoren der Neutrophilen [112]. Leptin ist ein Hormon, das v.a. von
Adipozyten synthetisiert wird und den Fettstoffwechsel, das Hungergefühl, aber auch
neuroendokrine und immunologische Funktionen reguliert [113]. Eine Synthesequelle für
Leptin fehlt im experimentellen Design dieser Arbeit und eine Leptin-Produktion durch
Neutrophile selbst ist nicht belegt; dieser Faktor scheidet also ebenfalls aus.
Daher ist davon auszugehen, dass die in dieser Arbeit beobachtete Zelltodverzögerung der
Neutrophilen ein direkter Effekt der S. aureus-Überstände ist und kein Artefakt durch
Zellkontaminationen.
Apoptoseverzögerung im Zuge von intrazellulären Aktivierungsprozessen
Eine weitere Möglichkeit zur Erklärung der Apoptoseverzögerung könnte die Veränderung
von Ionenströmen sein: Bei erhöhtem Calcium-Einstrom [114] und der Verhinderung von
Kalium-Ausstrom, in der Studie von El Kebir et al. durch eine erhöhte extrazelluläre
Kaliumkonzentration erzeugt [115], wird die natürliche Apoptose von Neutrophilen verzögert.
Ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration lässt sich bei zahlreichen
Aktivierungsprozessen der Neutrophilen feststellen [116]. Calcium-aktivierbare Kaliumkanäle
wiederum fördern den Einstrom von Kalium in die Zelle [117]. Für andere Zelltypen ist
gezeigt, dass Kalium-Verlust ein Auslöser für Apoptose ist [118, 119]. Somit ist denkbar, dass
bakterielle Faktoren im Rahmen der Neutrophilen-Aktivierung einen Anstieg der
intrazellulären Calciumkonzentration auslösen, damit indirekt auch die Kaliumkonzentration
in der Zelle erhöhen und so vor Apoptose schützen.
Die Zelltodverzögerung könnte auch ein direkter Effekt bakterieller Produkte sein: Es ist für
Lipoteichonsäure (LTA) [120], einen Bestandteil der Zellwand von Staphylokokken, und
CpG-Motive bakterieller DNA (Cytosin-Phosphat-Guanin-Abfolge, besonders häufig in der
DNA von Bakterien und Viren) [121] gezeigt, dass sie die Apoptose von Neutrophilen
verzögern. Beide Substanzen werden allerdings nicht sezerniert, so dass sie sich nicht in den
Kulturüberständen wiederfinden dürften. In der stationären Wachstumsphase sterben
allerdings durch die Knappheit der Nährstoffe auch einige Bakterien ab und setzen diese
Substanzen frei, so dass Überstände der stationären Phase durchaus LTA und bakterielle DNA
enthalten können.
5 Diskussion
66
fMLP, ein chemotaktisches Peptid [122], bewirkt ebenfalls eine Apoptoseverzögerung der
Neutrophilen [92, 123], ebenso die phenol-soluble modulins (PSMs) in sublytischen
Konzentrationen [124].
Für all diese genannten bakteriellen Substanzen ist bekannt, dass sie auch eine
proinflammatorische Aktivierung von Neutrophilen bewirken, z.B. LTA und CpG-Motive
über Toll-like-Rezeptoren. Darüber wird ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration
vermittelt und die Substanzen könnten somit eine Verlängerung der Lebensspanne wie oben
beschrieben bewirken.
Apoptose durch Sauerstoffradikale
Denkbar ist auch der Schutz vor Apoptose durch die Reduktion von oxidativem Stress durch
bakterielle Faktoren: Die Superoxiddismutase, Katalase [42] und das Pigment
Staphyloxanthin [43, 125] von S. aureus wirken antioxidativ und schützen die Bakterien
somit vor den reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) der Neutrophilen. ROS sind aber auch für
Neutrophile selbst schädlich und induzieren Apoptose [126]. Durch die bakteriellen
antioxidativen Mechanismen wären sie also vor ihren eigenen Waffen geschützt. Die Gruppe
um Oishi et al. konnte bestätigen, dass Antioxidantien im Kulturmedium die natürliche
Apoptose der Neutrophilen verzögern [127].
Bringt es für S. aureus einen Überlebensvorteil, wenn der wichtigste Gegner
länger am Leben erhalten wird?
Bisher wurde eher die Apoptoseinduktion der Neutrophilen als Strategie verschiedener
Infektionserreger, dem Immunsystem zu entkommen und eine Persistenz im menschlichen
Körper zu ermöglichen [128, 129], angenommen. Man sollte daher annehmen: je geringer die
Apoptose der Neutrophilen, desto effektiver die Immunabwehr, wie auch im Peritonitis-
Modell gezeigt [130].
Gresham et al. zeigten allerdings, dass S. aureus innerhalb der Neutrophilen vital bleibt und
zur Etablierung einer Infektion führen kann [50]. Für mehrere intrazelluläre Erreger wie
Mykobacterium bovis [131], Anaplasma phagocytophilum [132, 133] und Leishmania major
[134] konnte gezeigt werden, dass sie die Apoptose von Neutrophilen verzögern und sich so
einen Ort für ihre intrazelluläre Vermehrung sichern. Die Neutrophilen dienen dabei als
trojanisches Pferd, denn wenn sie dann in Apoptose gehen, werden sie von Makrophagen, die
auf typische Erkennungszeichen der Apoptose wie die extrazelluläre Lokalisation von
Phosphatidylserin reagieren, phagozytiert. Die Makrophagen leiten dann mit entsprechenden
5 Diskussion
67
antiinflammatorischen Signalen die Resolution der Entzündung ein [135], obwohl die
Infektion weiterhin innerhalb der Makrophagen schwelt [134].
In den letzten Jahren wurde eine Rolle als intrazellulärer Erreger auch für S. aureus
zunehmend anerkannt; es gibt Studien, die die intrazelluläre Persistenz [136] und Vermehrung
[137] von S. aureus zeigen.
Auch für überwiegend extrazelluläre Erreger wurde belegt, dass sie mit bakteriellen Faktoren
die Apoptose der Neutrophilen verzögern können (Verotoxin-2 von E. coli [138], water-
soluble surface proteins von Helicobacter pylori [139], YopJ/P von Yersinia spp. [140]) und
dadurch die Entzündung verstärken [141] und dem Immunsystem entkommen können [140].
Die Regulation der Apoptose von Neutrophilen ist also entscheidend für den Ausgang der
Infektion. Da die Einleitung der Apoptose mit der extrazellulären Lokalisierung von
Phosphatidylserin von der NADPH-Oxidase reguliert wird, ist dieser Vorgang bei der
chronischen Granulomatose (CGD), einem genetischen Defekt der NADPH-Oxidase, gestört.
Im CGD-Modell ist folglich die Apoptose der Neutrophilen verzögert. Außerdem fehlt das
Apoptose-Erkennungszeichen für Makrophagen, die Phosphatidylserin-Aufdeckung, daher ist
das sichere Abräumen der sterbenden Neutrophilen beeinträchtigt; frei werdende aggressive
Substanzen der Neutrophilen verursachen eine stärkere und länger anhaltende Entzündung
[142]. Ähnliches ist gezeigt für Caspase-1-defiziente Mäuse: Die Apoptose der Neutrophilen
ist durch den genetischen Defekt dysreguliert, bei pulmonaler Entzündung durch LPS macht
sich dies mit einer längeren Inflammationsphase bemerkbar [143].
Die Apoptoseverzögerung der Neutrophilen bringt für S. aureus also durchaus einen
Überlebensvorteil, denn die Konzentrierung des Immunsystems auf die starke Inflammation
an der Eintrittspforte der Bakterien könnte S. aureus nutzen, um unterdessen unbemerkt zu
entkommen, über andere Zellen als Vehikel oder über den extrazellulären Weg.
Welches Agens von S. aureus nun für die Apoptoseverzögerung veranwortlich ist, ist noch
nicht vollständig geklärt. Da der Effekt der Apoptoseverzögerung mit allen in dieser Arbeit
genutzten Isolaten beobachtet wurde, scheint es ein unter den S. aureus-Linien weit
verbreiteter Faktor zu sein. Die Analyse des Sekretoms von S. aureus mit Hilfe der
Fraktionierung der Kulturüberstände kann hier weiterhelfen (persönliche Mitteilung von S.
Roiijakkers), auch das Spektrum der Oberflächenmoleküle von S. aureus sollte in die Analyse
miteinbezogen werden, die Arbeit von Dreisbach et al. zur Etablierung der surfaceomics
bietet hier einen vielversprechenden Ansatzpunkt [144].
5 Diskussion
68
5.3 Die Rolle von PVL
PVL-Effekte in vitro
Panton-Valentin-Leukocidin (PVL) ist ein porenbildendes Toxin von S. aureus, das
hochspezifisch neutrophile Granulozyten aktiviert und lysiert [55]. Es fiel in der
Vergangenheit auf, dass nekrotisierende Infektionen überrepräsentativ häufig durch PVL-
positive Isolate ausgelöst werden [59]. In Tiermodellen ist die Rolle von PVL in der
Pathogenese dieser Erkrankungen allerdings umstritten [67, 71]. Ein Ziel dieser Arbeit war es
daher, die Effekte auf die Zelltodinduktion von Neutrophilen durch klinische S. aureus-Isolate
aus Furunkulose-Infektion verglichen mit Isolaten aus nasaler Besiedlung zu beleuchten.
Um die Effekte von PVL selbst einzuschätzen, wurden zunächst rekombinantes PVL bzw.
dessen Einzelkomponenten zur Stimulation von Neutrophilen eingesetzt.
In allen verwendeten Assays zur Zelltodbeurteilung (Sytox-Assay, Apoptose-Assay,
Immunfluoreszenzfärbung) konnte gezeigt werden, dass PVL, nicht aber die
Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV, bei Neutrophilen Nekrose bzw. in geringeren
Konzentrationen Apoptose induziert. Diese Daten finden Bestätigung in der Literatur: In
verschiedenen Arbeiten wurde berichtet, dass PVL konzentrationsabhängig zunächst die
proinflammatorische Aktivierung der Neutrophilen bewirkt [47, 145-148], in höheren
Konzentrationen die Zellen dann apoptotisch werden bzw. durch den porenformenden Effekt
von PVL lysiert werden [47, 55, 146].
NETs-Bildung konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nach Stimulation mit PVL beobachtet
werden. Pilsczek et al., die erstmals über einen NETs-Mechanismus berichteten, bei dem
Neutrophile vital bleiben und der sich bereits nach zehnminütiger Stimulation beobachten
ließ, konnten dieses Phänomen auch nach PVL-Stimulation beobachten [149]. Zu so frühen
Zeitpunkten nach Stimulationsbeginn wurde in der vorliegenden Arbeit die
Zelltodmorphologie der Neutrophilen jedoch nicht untersucht. Für die Fragestellung dieser
Arbeit ist dieser NETs-Mechanismus aber auch nicht relevant.
Effekte von Furunkulose-Isolaten
Die PVL-Expression in den Kulturüberständen der Isolate bei denen die PVL-kodierenden
Gene (luk-PV) nachgewiesen wurden, und die beobachtete Lyse der Neutrophilen durch diese
Überstände waren abhängig vom genutzten Nährmedium zur Bakterienkultivierung: Nur in
besonders reichhaltigen Nährmedien wie BHI und CCY konnte eine PVL-Sekretion detektiert
werden; für das CCY-Medium ist bekannt, dass es selektiv eine hohe PVL-Expression fördert
5 Diskussion
69
[150], die Ursachen hierfür sind nicht geklärt. Die Kulturüberstände der lukPV-positiven
Kulturüberstände, die in CCY-Medium gewonnen wurden, verursachten selbst in niedrigen
Konzentrationen eine stärkere Lyse der Neutrophilen.
Die Abhängigkeit der zytolytischen Wirkung der Kulturüberstände vom Kulturmedium wurde
bereits durch Graves et al. beobachtet [84].
Mit ganzen Bakterienzellen konnten in der vorliegenden Arbeit keine Unterschiede zwischen
Furunkulose- und Carrier-Isolaten bezüglich der Zelltodinduktion von Neutrophilen
festgestellt werden. Damit konnten die Daten von Löffler et al. [47], die eine stärkere
Zelltodinduktion durch PVL-positive Isolate aus nekrotisierenden Infektionen belegt hatten,
nicht reproduziert werden. Selbst mit den Referenzstämmen, die mit den von Löffler et al.
genutzten identisch sind, gab es diese Abweichung in den Ergebnissen. Als Ursache für diese
Unterschiede können nur kleine Abweichungen in der technischen Durchführung
angenommen werden; Löffler et al. kultivierten die Bakterien für Versuche mit lebenden
S. aureus-Zellen in Müller-Hinton-Medium, einem ähnlich reichhaltigen Medium wie BHI,
über Nacht ohne Schütteln. In der vorliegenden Arbeit wurden die Bakterien dagegen bis zum
Erreichen der logarithmischen Phase im weniger reichhaltigen TSB-Medium kultiviert.
Allerdings konnten auch mit der alternativen Verwendung von BHI- oder CCY-Medium und
dem Kultivieren bis in die stationäre Phase keine Unterschiede in der Zelltodinduktion durch
die Bakterien festgestellt werden. Bei Löffler et al. fielen zudem die Unterschiede zwischen
PVL-positiven und -negativen Isolaten am stärksten bei sehr hohen multiplicities of infection
(MOIs), nämlich 50-200 Bakterien pro neutrophilem Granulozyt, auf. Mit MOI 10 dagegen,
einer Bakterienkonzentration, die auch in der vorliegenden Arbeit eingesetzt wurde, gab es
bei Löffler et al. keine Unterschiede in der Zelltodinduktion. Entweder sind also eine andere
Kultivierungsform und sehr hohe Bakteriendichten nötig, um einen Effekt von PVL bei der
Zelltodinduktion von Neutrophilen durch lebende Bakterien zu beobachten, oder aber andere
Virulenzfaktoren der PVL-positiven Isolate überdecken bei diesen hohen Bakteriendichten
den PVL-Effekt.
Wann wird PVL gebildet im Entzündungsgeschehen?
Wenn für die Bildung von PVL besondere Nährstoffbedingungen und möglicherweise eine
hohe Bakteriendichte benötigt werden, stellt sich die Frage, ob diese Bedingungen während
einer Infektion erfüllt sind und PVL tatsächlich in vivo gebildet wird. Mögliche Unterschiede
des in vitro-Sekretoms von S. aureus verglichen mit dem in vivo-Sekretom stellen eine nicht
zu vernachlässigende Limitation bei der Beurteilung von in vitro-Studien mit Staphylokokken
5 Diskussion
70
dar. PVL wird in vitro post-exponentiell exprimiert [151, 152] und dabei positiv agr-reguliert
[152, 153]. Eine hohe Bakteriendichte, wie sie sich auch in Abszessen finden lässt, ist also ein
begünstigender Faktor für die PVL-Expression. Zusätzlich verstärken einige Antibiotika die
PVL-Expression [154, 155], daher ist eine kritische Auswahl des Antibiotikums und
ausreichend hoch dosierte und lange antibiotische Therapie bei S. aureus-Infektionen wichtig.
Dass PVL tatsächlich in vivo gebildet wird, konnten mehrere Studien bestätigen: Der PVL-
Nachweis gelang in Eiterproben aus Abszessen [156] und Lungen-Nekropsien von Patienten,
die an einer nekrotisierenden Pneumonie verstorben waren [55]. Ein indirekter Nachweis ist
zudem die Existenz von PVL-Antikörpern im Menschen [157, 158].
Von PVL zur Gewebsnekrose
Warum treten nun bei Schädigung der Neutrophilen bei S. aureus-Infektionen mit PVL-
Beteiligung Gewebsnekrosen am Infektionsherd auf? Hierfür sieht man die neutrophilen
Granulozyten als Verursacher: Während ihrer starken proinflammatorischen Aktivierung und
vor allem durch ihre Nekrose setzen sie Sauerstoffradikale und destruierende Enzyme frei, die
das umliegende Gewebe schädigen. Möglicherweise bewirkt PVL in sublytischen
Konzentrationen auch eine Zelltodverzögerung der Neutrophilen im Zuge der
Aktivierungsprozesse wie in Kap. 5.2 erläutert und stört damit die Beendigung der
Inflammation durch das Immunsystem. Es konnte bereits beobachtet werden, dass
Neutrophile in der Abszessumgebung, also einem typischen Krankheitsbild mit PVL-
positiven Staphylokokken, eine verlängerte Lebensspanne aufweisen [159]. Zugleich zeigten
neutropene Kaninchen bei Behandlung mit PVL mildere Entzündungszeichen als Kaninchen
mit normalen Neutrophilen-Zahlen [148]. Ist der Beitrag von Neutrophilen zur Infektion mit
PVL-positiven Isolaten also nur als nachteilig anzusehen? Nein, denn wenn man Patienten,
die unter rezidivierender Furunkulose leiden, immunologisch untersucht, fällt auf, dass viele
von ihnen Beeinträchtigungen in den Abwehrfunktionen der Neutrophilen, wie Chemotaxis
[160] oder Stickoxid-Synthese [161], aufweisen; Neutrophile sind also durchaus relevant für
eine effektive Immunabwehr von PVL-positiven Staphylokokken.
Die umstrittene Rolle von PVL im Mausmodell
Es liegt am nächsten, von den in vitro-Versuchen zunächst den Schritt in das Mausmodell zu
gehen, in dem schon viele Virulenzfaktoren von S. aureus untersucht wurden [46, 162].
Für PVL sind die Effekte in der Maus jedoch umstritten. Löffler et al. zeigten, dass nur
neutrophile Granulozyten vom Menschen und Kaninchen, nicht aber von der Maus oder auch
5 Diskussion
71
von Primaten PVL-suszeptibel sind [47]. Dementsprechend wurde mehrfach gezeigt, dass
PVL keinen Effekt in Infektionsmodellen in der Maus hat [71, 77].
Dennoch gibt es auch mehrere Studien, die ein signifikant schlechteres Krankheitsbild in
Mäusen bei Infektionen mit lukPV-positiven S. aureus-Stämmen [67-69, 163] belegen. Für
eine dieser Studien [67], die gezeigt hatte, dass eine nekrotisierende Pneumonie bei der Maus
nur durch einen lukPV-positiven S. aureus-Stamm verursacht wurde, konnte später
nachgewiesen werden, dass eine Punktmutation im agr-Gen ursächlich für die höhere
Virulenz dieses Stamms war und sich bei Reparatur des Gendefekts keine Unterschiede im
Krankheitsverlauf mehr feststellen ließen [70].
Weitere Hinweise auf die abweichenden Ergebnisse könnten technische Unterschiede sein: In
den Studien, die einen Effekt von PVL im Mausmodell zeigten, wurde der gleiche
Mausstamm, nämlich BALB/c-Mäuse, verwendet [67-69, 163]. Tseng et al. beobachteten,
dass mit BALB/c- und CD1-Mäusen, nicht jedoch mit C57/BL6- oder SKH1-Mäusen ein
schwereres Krankheitsbild durch lukPV-positive Staphylokokken auftrat [69]. Der eingesetzte
Mausstamm scheint also eine wichtige Rolle zu spielen. Eine Lösung des Problems zeichnet
sich hier jedoch nicht ab, denn auch Bubeck-Wardenburg et al., die keinen Effekt mit lukPV-
positiven Stämmen feststellten, benutzten BALB/c-Mäuse [71].
Ein anderer technischer Unterschied ist die Wahl des bakteriellen Nährmediums: In den
Studien, die einen Effekt durch PVL belegen, wurden eher reichhaltige Medien wie CCY
[67], [163] oder Müller-Hinton [68] verwendet, in denen mit einem Negativergebnis dagegen
TSB-Medium [71, 77].
Del Giudice et al. sehen dagegen die Ursache für die Unterschiede in den Ergebnissen in der
Art der Infektion [60]: In den Studien, in denen eine Hautinfektion gesetzt wurde, wurde diese
sekundär verursacht, d.h. die Bakterien wurden auf die verletzte Haut oder subkutan appliziert
[71, 77]. PVL ist aber vor allem mit primären Hautabszessen assoziiert, also einer Infektion
auf vormals intakter Haut.
Solange keine eindeutige Ursache für die abweichenden Ergebnisse im Mausmodell gefunden
ist, sollte zur Charakterisierung von PVL auf ein anderes Modell zurückgegriffen werden, hier
brachte bisher das Kaninchen-Modell eindeutige Ergebnisse [47, 66, 148].
Trägt PVL zur hohen CA-MRSA-Virulenz bei?
PVL ist zwar epidemiologisch stark mit nekrotisierenden Infektionen, überwiegend verursacht
durch CA-MRSA-Stämme, assoziiert [62, 63, 74, 83], doch es konnte mehrfach belegt
werden, dass die Anwesenheit der PVL-kodierenden Gene nicht entscheidend für den
Krankheitsverlauf [74, 75] oder den Ausgang [164-166] der Infektionen ist; auch korrelierte
5 Diskussion
72
die Höhe der PVL-Produktion klinischer Isolate in vitro nicht mit der Schwere der Infektion
durch dasselbe Isolat in der Patientenstudie [74, 167].
Mitunter wurde sogar ein besserer Ausgang der Erkrankung beobachtet, wenn sie durch
lukPV-positive Isolate hervorgerufen wurde, verglichen mit lukPV-negativen Infektionen. Hay
et al. postulieren für dieses überraschende Ergebnis einen statistischen confounder-Effekt: Da
vor allem junge Patienten ohne Grunderkrankungen von lukPV-positiven Infektionen
betroffen sind[61, 62, 72, 73], sind durch die besseren gesundheitlichen Voraussetzungen der
Patientengruppe Parameter wie die Mortalität verzerrt.
Ein weiterer erschwerender Faktor bei der Beurteilung der Datenlage ist außerdem, dass
mindestens acht verschiedene Definitionen von CA-MRSA in der Literatur existieren [168].
Es wird daher mehrheitlich vermutet, dass eher der genetische Stammhintergrund der CA-
MRSA-Stämme verantwortlich ist für die besondere Virulenz [66, 77, 169] und nicht PVL
allein. Kobayashi et al. konnten beobachten, dass CA-MRSA-Stämme in vitro eine
programmierte Nekrose bei humanen neutrophilen Granulozyten auslösen [170]. Demnach
waren in der vorliegenden Arbeit möglicherweise keine Effekte mit Bakterien lukPV-positiver
Isolate sichtbar, weil es keine CA-MRSA-Stämme waren und die Anwesenheit von PVL
allein nicht krankheitsdeterminierend ist. Allerdings waren mehrere klinische lukPV-positive
Isolate, die in der Studie von Löffler et al. eine stärkere Lyse der Neutrophilen verursachten,
ebenfalls keine CA-MRSA-Stämme [47].
Trotz der Ergebnisse in in vitro-Studien kann PVL in vivo bisher keine klare Rolle in der
Pathogenese von nekrotisierenden Infektionen wie der Furunkulose zugewiesen werden. Es
gilt daher, nach weiteren Hinweisen zu suchen, die den Zusammenhang zwischen den lukPV-
Genen und der Furunkuloseinfektion erklären.
6 Zusammenfassung
73
6 Zusammenfassung
Staphylococcus (S.) aureus nimmt dem Menschen gegenüber eine ambivalente Rolle ein, da
er zum einen häufiger Kommensale ist, aber auch zum Pathogen werden kann. Zu den
bedeutendsten Gegnern von S. aureus zählen die neutrophilen Granulozyten. Sie haben eine
kurze Lebensspanne und weisen hochspezialisierte Zelltodstrategien, wie Apoptose oder
NETose auf. Auffälligerweise besitzen S. aureus-Isolate, die Furunkulose auslösen,
überproportional häufig das Gen für das Panton-Valentine-Leukozidin (PVL), welches
hochspezifisch humane neutrophile Granulozyten lysiert. Zu den Interaktionen zwischen
S. aureus und Neutrophilen sind noch viele Fragen ungeklärt.
Die Ziele dieser Arbeit waren deshalb (1) die Charakterisierung der Wirkung von S. aureus
auf das Zelltodverhalten von Neutrophilen und (2) der Vergleich dieser Mechanismen bei
kommensalen S. aureus-Isolaten und Isolaten von Patienten mit chronisch rekurrenter
Furunkulose. Dazu wurde der Zelltod von Neutrophilen mit einem DNA-Freisetzungstest
(Sytox-Assay) und mitttels Immunfluoreszenzfärbung analysiert.
Auffällig waren dabei folgende Beobachtungen:
(1) Hohe Konzentrationen der S. aureus-Kulturüberstände führten zur Nekrose der
Neutrophilen. In sublytischen Konzentrationen bewirkten Überstände der stationären
Wachstumsphase dagegen eine Verzögerung der natürlichen Apoptose der Neutrophilen in
Kultur, deren Fähigkeit zur proinflammatorischen Aktivierung dabei erhalten blieb. Es ist
vorstellbar, dass sich S. aureus, von dem inzwischen bekannt wurde, dass er auch intrazellulär
persistieren kann, auf diese Weise in den Neutrophilen eine Überlebensnische schafft.
Bei Stimulation mit lebenden Bakterienzellen konnten konzentrationsabhängig Nekrose,
Apoptose und geringfügig NETose der Neutrophilen beobachtet werden.
(2) Der Vergleich von S. aureus-Isolaten aus nasaler Besiedlung und Furunkuloseinfektion
zeigte, dass bakterielle Überstände von Furunkulose- Isolaten, die die PVL-kodierenden Gene
besaßen, eine deutlich stärkere Lyse der Neutrophilen verursachten. Dieser Effekt war nur
dann zu beobachten, wenn die Bakterien tatsächlich PVL bildeten, wozu sie nur in besonders
reichhaltigen Medien in der Lage waren. Dies ist ein starker Hinweis, darauf, dass der Zelltod
durch PVL verursacht wurde. Mit lebenden Bakterien konnten zwischen beiden Gruppen
keine Unterschiede in der Zelltodinduktion der Neutrophilen festgestellt werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass S. aureus neutrophile Granulozyten auf
verschiedene Weise beeinflussen kann: Neben der Induktion von Zelltod können die
Bakterien auch Substanzen freisetzen, die die Lebensspanne der Abwehrzellen verlängern.
6 Zusammenfassung
74
Außerdem stützen die Befunde das Konzept einer zentralen Rolle für PVL bei Haut- und
Weichteilinfektionen durch S. aureus, das bisher vor allem auf epidemiologischen Befunden
basierte.
7 Anhang
75
7 Anhang
Abb. A1: Keine Zelltodinduktion der Neutrophilen durch bakterielle Überstände der logarithmischen Wachstumsphase. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit Kulturüberständen des
Isolats SH1-2 aus der logarithmischen Wachstumsphase, normalisiert auf verschiedene ODs,
stimuliert.
Die eingesetzten Verdünnungen der Überstände aus der logarithmischen Phase lösten keine erhöhte
DNA-Freisetzung der Neutrophilen aus verglichen mit unstimulierten Zellen.
7 Anhang
76
Abb. A2: S. aureus-Kulturüberstände der stationären Phase bewirkten in hoher Konzentration (OD595 nm = 0,24) den Zelltod der Neutrophilen, in sublytischen Konzentrationen (OD595 nm = 0,1 bis 0,05) die Verzögerung des Zelltods der Neutrophilen. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit
Kulturüberständen der sechs Carrier-Isolate aus der stationären Wachstumsphase gewonnen in TSB
stimuliert. Dies ist ein anderes Experiment als in Abb. 6 dargestellt.
Hohe Konzentrationen (normalisiert auf OD595 nm = 0,24) der Überstände einiger Isolate (SH1-2,
SH10-1, SH27-1) verursachten eine erhöhte DNA-Freisetzung der Neutrophilen, in sublytischen
Konzentrationen (normalisiert auf OD595 nm = 0,1 bis 0,05) wurde dagegen nach ca. 20 h Kulturdauer
eine verzögerte DNA-Freisetzung verglichen mit unstimulierten Neutrophilen beobachtet.
7 Anhang
77
Abb. A3: Reduzierte DNA-Freisetzung der Neutrophilen durch TSB-Medium. Neutrophile
wurden im Sytox-Assay mit verschiedenen Verdünnungsstufen des Kulturüberstands des klinischen
Isolats SH10-1 aus der stationären Phase, gewonnen in TSB-Medium, oder nur mit TSB-Medium in
gleichen Anteilen wie im Überstand inkubiert.
Bei Zugabe von TSB-Medium – ob in Form vom Kulturüberstand oder dem Medium selbst – wurde
nach 19 h Kultur signifikant (p < 0,0001 für Verdünnungen 1:10) weniger freigesetzte DNA detektiert
als bei unstimulierten Neutrophilen.
Abb. A4: Keine veränderte DNA-Freisetzung der Neutrophilen durch Stimulation mit dem Superantigen TSST-1. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit 1 µg/ml TSST-1, einer
Konzentration, die bei Lymphozyten eine starke polyklonale Aktivierung und Zytokinfreisetzung
bewirkt [171], stimuliert.
TSST-1 hatte keinen Effekt auf die DNA-Freisetzung der Neutrophilen verglichen mit unstimulierten
Neutrophilen, ein verzögerter Zelltod nach langer Kulturdauer (24 h) konnte nicht festgestellt werden.
7 Anhang
78
7 Anhang
79
Abb. A5: PVL, nicht aber die Einzelkomponenten LukFbewirkte den Zelltod der Neutrophilen. verschiedenen Konzentrationen LukF-PV, LukS
und zu verschiedenen Zeitpunkten fluoreszenzmikroskopisch analysiert.
Dargestellt sind die Ergebnisse nach 1, 4 und 12 h.
eingefärbt.
Unter PVL-Stimulation konnte besonders bei hohen PVL
(200 und 40 ng/ml) die Schädigung bis hin zur Lyse der Neutr
festgestellt werden. Bei niedriger PVL-Konzentration (5 ng/ml) wurde eine
Zellschädigung erst verzögert (nach 12 h) beobachtet.
beobachtet werden. Die Einzelkomponenten LukF
verursachten keine Zellschäden, allenfalls
Neutrophilen. Zum 12 h-Zeitpunkt war auch ein Großteil der unstimulierten
Neutrophilen verdämmert.
Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV, der Neutrophilen. Neutrophile wurden mit
PV, LukS-PV oder PVL stimuliert
en fluoreszenzmikroskopisch analysiert.
sind die Ergebnisse nach 1, 4 und 12 h. DNA wurde rot, NE grün
Stimulation konnte besonders bei hohen PVL-Konzentrationen
ng/ml) die Schädigung bis hin zur Lyse der Neutrophilen
Konzentration (5 ng/ml) wurde eine
Zellschädigung erst verzögert (nach 12 h) beobachtet. NETs konnten nicht
Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV
verursachten keine Zellschäden, allenfalls eine leichte Aktivierung der
Zeitpunkt war auch ein Großteil der unstimulierten
7 Anhang
80
Tab. A1: Übersicht über die Ergebnisse der Multiplex-PCR mit den vier Referenzstämmen. Es fiel auf, dass das USA300 WT-Isolat mecA-negativ ist, also keine Methicillin-Resistenz trägt.
Möglicherweise ist diese im Zuge des fehlenden Selektionsdrucks unter Laborbedingungen verloren
gegangen; da dieser Eigenschaft für die nachfolgenden Versuche nicht von Bedeutung ist, wurde
dennoch mit diesem Isolat weiter gearbeitet.
S. aureus-Isolat
mecA MW1409 nuc MW756 arcA 16SrRNA seh etd PVL gyr
USA300 WT - + + - + + - - + +
USA300∆PVL + + + - + + - - - +
TM WT - - - - - + - - - -
TM+PVL - - - - - + - - + -
7 Anhang
81
Tabelle A2: Stärkere DNA-Freisetzung der Neutrophilen bei Stimulation mit Überständen der Furunkulose-Isolate gewonnen in reichhaltigen
Nährmedien. Übersicht über das Ausmaß der lichtmikroskopisch beobachteten Zelllyse nach Stimulation mit den Überständen eines Carrier-Isolats, den
Furunkulose-Isolaten bzw. den Referenzstämmen. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit Überständen des Carrier-Isolats SH10-1, der sieben Furunkulose-
Isolate bzw. der vier Referenzstämme stimuliert. Alle Überstände sind aus der poststationären Wachstumsphase und wurden auf die OD595 nm 1, 0,2 und 0,04
normalisiert eingesetzt. Dabei wurden Überstände aus den Medien TSB, BHI und CCY verglichen. Nach 4 h Stimulation wurde die Morphologie der stimulierten
Neutrophilen lichtmikroskopisch beurteilt und nach verschiedenen Schädigungsgraden farblich codiert.
Bakterielle Überstände, die in den reichhaltigeren Medien CCY und BHI gewonnen wurden, lösten bei gleicher Konzentration einen stärkeren Zelltod der
Neutrophilen aus. Besonders in niedrigen Konzentrationen (normalisiert auf OD595 nm = 0,04) fällt das stärkere zellschädigende Potential der PVL-positiven
Isolate auf.
pvl - - - + + + + +
SH10-1 H6110 H4764 H5313 H678 H3163 H7176 H6 754
OD: 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04
TSB
BHI
CCY
pvl + - - +
nahezu vollständige Zelllyse
USA300 WT USA300∆PVL TM WT TM+PVL
starke Zelllyse
OD: 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04
mittlere Zelllyse
TSB leichte Zelllyse
BHI Zellcluster
CCY abgeflachte Zellen
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Publikationen
94
Publikationen
1. P. Döring, D. Grumann, J. Kolata, C. Goosmann, U. Völker, V. Brinkmann, B. M. Bröker,
„Neutrophil cell death induction by S. aureus from nasal colonization and chronic
furunculosis”, Tagung „host-pathogen-interactions in bacterial infections”, 31.05.-03.06.2010
in Greifswald (Poster)
2. P. Döring, D. Grumann, J. Kolata, C. Goosmann, B. Löffler, U. Völker, V. Brinkmann, B.
M. Bröker, „Neutrophil cell death induction by Staphylococcus aureus from nasal
colonization and chronic furunculosis”, 63. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für
Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), 25-28.09.2011 in Essen (Poster)
Eidesstattliche Erklärung
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Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen
Einrichtung vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine
Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Greifswald, den 18.06.2013
Tabellarischer Lebenslauf
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Tabellarischer Lebenslauf
Tabellarischer Lebenslauf
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Danksagung
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Danksagung