Aus dem Institut für Normale und Pathologische

Physiologie

Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. Dr. Jürgen Daut

Des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

Titel der Dissertation:

BETEILIGUNG VON TANDEM-KALIUM-

KANÄLEN IN DER DURCH

UNGESÄTTIGTE FETTSÄUREN

HERVORGERUFENEN KORONAREN

VASODILATATION

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Medizin

dem Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Marko Daniel Burmester

geboren am 29.11.1979 in Hamburg

erschienen in Marburg im Jahre 2007

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am 25. Januar 2007.

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.

Dekan: Prof. Dr. Bernhard Maisch

Referent: Prof. Dr. Dr. Jürgen Daut

Korreferent: Prof. Dr. Thomas Gudermann

ZUSAMMENFASSUNG

Der einfach ungesättigten Fettsäure Oleinsäure wird ebenso wie den mehrfach ungesättigten

Fettsäuren Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure ein protektiver Einfluss auf die

menschliche Gesundheit zugesprochen. Ein vasodilatatorischer Einfluss dieser Substanzen im

Koronarsystem ist zwar seit längerem bekannt, doch sind die zugrundeliegenden Mechanismen

noch Gegenstand intensiver Forschung. Die Beteiligung von Kaliumkanälen in der Regulation der

koronaren Perfusion ist zwar ebenfalls bekannt, während die genaue Rolle von doppelporigen (2P)

sogenannten Tandem-K+-Kanälen – der neuesten Subgruppe von Kaliumkanälen – in diesem

Zusammenhang weitestgehend ungeklärt ist; bei TREK und TASK handelt es sich um bestimmte

Formen dieser 2P-K+-Kanäle. Wir haben am Langendorffschen Modell des isoliert perfundierten

Meerschweinchenherzens im Rahmen von 88 Experimenten die Wirkungen dieser Lipide

quantifizieren und eine Beteiligung von doppelporigen Kaliumkanälen nahelegen können.

Aufgrund ähnlichem Metabolismus wurden die Effekte mit Arachidonsäure und seinem Amid,

dem Endocannabinoidrezeptor-Agonisten Anandamid, verglichen; Anandamid blockiert

bekannterweise selektiv TASK1-Kanäle. Das Lokalanästhetikum Bupivacain inhibiert unter

anderem TREK- und TASK-Kanäle. Die als Reduktion des koronaren Perfusionsdruckes

gemessene mittlere maximal erreichbare Vasodilatation der einzelnen Lipide nach Erreichen eines

konstanten Perfusionsdruckes betrug 51,55 % für Oleinsäure; 40,37 % für Arachidonsäure; 47,95

% für Docosahexaensäure; 47,40 % für Eicosapentaensäure; 55,80 % für Anandamid; 72,11 % für

R-Bupivacain; 39,85 % für S-Bupivacain und 70,65 % für razemisches Bupivacain. Bei Zusatz vom

NO-Synthase-Inhibitor Nitroarginin [10 µM] zu allen Perfusionslösungen zeigte sich eine

Reduktion der maximalen Dilatation um 18,07 % für Oleinsäure; 13,10 % für Docosahexaensäure

und 7,55 % für Eicosapentaensäure, wobei nur der Effekt für Oleinsäure signifikant war. Der KATP-

Kanal-Blocker Glibenclamid zeigte in einer Konzentration von 2 µM keinen messbaren Effekt auf

die durch Olein-, Arachidon-, Docosahexaen- und Eicosapentaensäure sowie R-Bupivacain

hervorgerufene Vasodilatation; hierdurch konnte ein wesentlicher Einfluss der ansonsten häufig an

der Regulation des Koronartonus beteiligten ATP-abhängigen Kaliumkanäle in diesem

Zusammenhang praktisch ausgeschlossen werden. Auch der COX-Inhibitor Indometacin [10 µM]

hatte keinen Einfluss auf den vasodilatativen Effekt von Arachidon-, Docosahexaen-,

Eicosapentaensäure oder Anandamid. Razemisches Bupivacain und S-Bupivacain zeigten zunächst

eine rasche Reduktion des koronaren Perfusionsdruckes gefolgt von einem langsamen Anstieg,

während das R-Isomer nur eine Reduktion zeigte. In einer Konzentration von 25 µM zeigte S-

Bupivacain seinen maximalen vasokonstriktorischen Effekt mit einer mittleren Erhöhung des

Perfusionsdruckes um 22,10 %. Bei dieser Konzentration war also ein Maximum de 2P-K+-

blockierenden Wirkung anzunehmen. Die durch 25 µM S-Bupivacain erreichte durchschnittliche

Reduktion der Dilatation betrug 86,4 % für Eicosapentaensäure [10 µM], 73,3 % für

Eicosapentaensäure [100 µM], 82,1 % für Docosahexaensäure [10 µM] und 76,1 % für

Docosahexaensäure [100 µM]. Wir haben hiermit einen mit hoher Wahrscheinlichkeit durch

Öffnung mechanosensitiver zweiporiger Kaliumkanäle hervorgerufenen vasodilatatorischen Effekt

von Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure auf des Koronarsystem des

Meerschweinchenherzens aufgedeckt, welcher stereoselektiv durch S-Bupivacain aufgehoben

werden kann.

INHALTSVERZEICHNIS

I INHALTSVERZEICHNIS II ABBILDUNGSVERZEICHNIS III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1-8 KAPITEL 1 EINLEITUNG

1 KAPITEL 1.1 Aufgabe des Herzens

2 KAPITEL 1.2 Regulation der menschlichen Koronarperfusion

3 KAPITEL 1.3 Aufgabe und Einteilung der Kaliumkanäle

5 KAPITEL 1.4 Die Rolle der Fettsäuren im gesunden Herzen

9 KAPITEL 1.5 Die Rolle der Fettsäuren im kranken Herzen

10-16 KAPITEL 2 METHODIK

9 KAPITEL 2.1 Herzpräparation und apparativer Aufbau

14 KAPITEL 2.2 Perfusionslösungen

15 KAPITEL 2.3 Kalibrierung der Apparatur

17-36 KAPITEL 3 DURCHFÜHRUNG / RESULTATE

17 KAPITEL 3.1 Vergleich hypoxischer mit Cromakalim-induzierter

Vasodilatation

19 KAPITEL 3.2 Die Wirkung von Oleat auf den koronaren Widerstand

24 KAPITEL 3.3 Effekte von DHA und EPA auf koronaren Vasotonus

28 KAPITEL 3.4 Anandamid und Arachidonsäure

32 KAPITEL 3.5 Bupivacain zeigt einen stereoselektiven Effekt auf den

koronaren Vasotonus

35 KAPITEL 3.6 S-Bupivacain inhibiert die PUFA-bedingte Vasodilatation

37-42 KAPITEL 4 DISKUSSION 43-56 LITERATURVERZEICHNIS A-B ANHANG

A Verzeichnis akademischer Lehrer

B Danksagungen / Widmungen

II

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Nummer Seite 1-1 Sprecher-Pathway 6

2-1 Versuchsaufbau 12

2-2 Kalibrierungsgerade 15

3-1 Induktion einer Cromakalim-induzierten Reduktion des KPD 17

3-2 Vergleich vasodilatativer Stimuli 18

3-3 Wirkung von Cyclodextrin 19

3-4 Wirkung von Ölsäure 20

3-5 Effekt von Oleat unter NArg 21

3-6 Quantifizierung der Oleat-vermittelten Vasodilatation mit und ohne NArg 22

3-7 Glibenclamid und Oleat 23

3-8 EPA-bedingte Vasodilatation 24

3-9 DHA-bedingte Vasodilatation 25

3-10 Konzentrations-Wirkungskurve von EPA und DHA mit und ohne NArg 26

3-11 Indometacin verringert nicht die DHA-vermittelte Vasodilatation 27

3-12 Anandamid-bedingte Vasodilatation 29

3-13 AA und Glibenclamid 30

3-14 Konzentrationen, die für 10 %ige Vasodilatation benötigt werden 31

3-15 Bupivacain-Razemat generiert einen biphasischen Effekt 32

3-16 R- und S-Bupivacain zeigen unterschiedliche Effekte auf den Vasotonus 33

3-17 Konzentrations-Wirkungs-Kurven von R- und S-Bupivacain 34

3-18 S-Bupivacain hebt die PUFA-induzierte

Vasodilatation zum größten Teil auf 35

3-19 Prozentuelle Reduktion der PUFA-vermittelten koronaren

Vasodilatation durch 25 µM S-Bupivacain 36

4-1 Postulierte Wirkung von PUFAs auf die koronare glatte Muskelzelle 40

III

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

4TMS/2P zweiporiger Tandem-Kaliumkanal mit vier Transmembransegmenten

AA Arachidonsäure

ALA α-Linolensäure

Anandamid Arachidonylethanolamid

COX Zyklooxygenase

EPA Eicosapentaensäure

DHA Docosahexaensäure

DPA Docosapentaensäure

KHK koronare Herzerkrankung

KPD koronarer Perfusionsdruck

L-NAME Methylester von NArg

mmHg Millimeter Quecksilbersäule

MUFA einfach ungesättigte Fettsäure

NArg Nω-Nitro-L-Arginin

OA Ölsäure, Oleinsäure

PGE Prostaglandin E

PUFA mehrfach ungesättigte Fettsäure

TALK alkalosensitive Hintergrund-2P-Kaliumkanäle

TASK pH-sensitiver auswärts-gleichrichtender Kaliumkanal vom TWIK-Typ

THIK Halothan-inhibierter 2P-Kaliumkanal

TRAAK durch Arachidonsäure aktivierbarer Kaliumkanal vom TWIK-1-Typ

TREK Kaliumkanal vom TWIK-1-Typ

TWIK einwärts-gleichrichtender Kaliumkanal mit zwei Porendomänen

TXA Thromboxan A

1

K a p i t e l 1

EINLEITUNG

1.1. Aufgabe des Herzens

Um die Einschränkungen der reinen Diffusion zu überwinden, bedienen sich die meisten

höheren Organismen eines geregelten Blutkreislaufes. Diese Flüssigkeit dient dem Transport

von Sauerstoff und Nährstoffen zu den verschiedenen Geweben sowie dem Abtransport von

diversen Metaboliten. Um diesen Prozess möglichst ökonomisch zu gestalten, ist es im Laufe

der Evolution zu der Entwicklung von geschlossenen Blutkreisläufen und einem zumeist

zentral lokalisierten Antriebssystem zur Aufrechterhaltung eines zuverlässigen und adaptiven

Blutflusses gekommen. Bei einem Großteil der Vertebraten teilt sich die Organisation dieses

Blutflusses in mindestens vier Stadien, wobei die Pumpfunktion von einem asymmetrischen

Herz durchgeführt wird. Zunächst kommt es zu einem Rückfluss des Blutes aus dem

systemischen Kreislauf in einen venösen Sinus; hieran schliesst sich ein typischerweise

kontraktionsfähiger und dünnwandiger Vorhof an; als nächstes fliesst das Blut in einen

Ventrikel mit dickerer Muskulatur, welcher für den eigentlichen Blutfluss zuständig ist; zuletzt

kommt es zu einem Auswurf des Blutes in einen muskulär umwandeten Bulbus cordis (z.B.

bei Lungenfischen) beziehungsweise in einen Bulbus arteriosus (z.B. beim Menschen). Das

Ausmaß der Septierung der unterschiedlichen Herzabschnitte zeigt im Laufe der Evolution

eine große Varianz und sollte daher am ehesten von einem funktionellen Gesichtspunkt aus

betrachtet werden. Zur Verhinderung eines systolischen Blutrückflusses haben sich die

Atrioventrikularklappen gebildet, während der diastolische Relflux durch die Taschenklappen

eingeschränkt wird. Das menschliche Herz zeigt eine komplette Trennung der beiden

Vorhöfe und der beiden Kammern, was durch den aufrechten Gang und die rein terrestrische

Lebensweise sinnvoll erscheint. Bei Amphibien kommt es dagegen häufig zu einem

ausgeprägten Rechts-Links-Shunt, der zur Umgehung der Lungenkreislaufes wichtig ist,

während sich bei Reptilien komplexere Systeme entwickelt haben. Bei diesen Lebewesen sieht

man eine mehr oder weniger inkomplette atrioventrikuläre Septierung sowie unterschiedlich

ausgeprägte Aorten und sogar interaortale Verbindungen. Während der rechte Aortenbogen

bei Menschen größtenteils obliteriert, ist dies zum Beispiel bei Vögeln umgekehrt. Diese

differenten Entwicklungen unter den jeweiligen Spezies können uns dazu dienen, das Herz als

ein hochdifferenziertes und phylogenetisch adaptives Organ aufzufassen, welches in höheren

2

Lebewesen generell einen zentralen Stellenwert einnimmt. Eine durchgehend stabile und

ontogenetisch frühe Funktionalität des Herzens sind kritische Voraussetzungen für das

Fortbestehen einer jeden höheren Spezies.

1.2. Regulation der menschlichen Koronarperfusion

Die arterielle Verorgung des menschlichen Myokards erfolgt über das koronare Gefäßsystem.

Unmittelbar oberhalb der Aortenklappe zweigen sich in der Regel zwei separate

Koronararterien ab, welche subepikardial verlaufen und durch multiple Aufzweigungen den

koronaren Gefäßbaum bilden. Typischerweise hat die linke Koronararterie ein größeres

Kaliber als die rechte und ist in 70 % der Fälle für die Versorgung sowohl des vorderen als

auch des hinteren Interventrikularseptums verantwortlich. Der venöse Abfluss findet

typischerweise über drei konfluierende Koronarvenen in den Sinus coronarius des rechten

Vorhofs statt.

Die Durchblutung der Koronararterien unterliegt verschiedenen Regulationsmechanismen

und kann sowohl physiologisch als auch krankheitsbedingt moduliert werden. Wichtigste

Voraussetzung für adaptive Änderung der Perfusion stellt die durchgehende Ummantelung

des gesamten arteriellen und venösen Schenkels mit glatter Muskulatur dar. Insbesondere die

Mikroarchitektur der terminalen Arteriolen trägt über diverse metabolische

Verschaltungsvorgänge zu dieser Feinregulation bei.

Glatte Muskelzellen kontrahieren ebenso wie quergeschreifte Muskelzellen unter anderem bei

einer Erhöhung des intrazellulären Kalzium-Spiegels [Ca2+]i. Diese Konzentration ist

einerseits abhängig vom Transport des Kalziums über die Plasmamembran mittels

spannungsabhängiger beziehungsweise ligandengesteuerter Kalziumkanäle und vom

Na+/Ca2+-Austauscher, andererseits von der intrazellulären Kalziumfreisetzung aus dem

sarkoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien (Poburko et al. 2004). Kaliumkanäle

spielen bei der Regulation Membranpotentials und damit des Öffnungszustands der

spannungsabhängigen Kalziumkanäle eine zentrale Rolle. Unter den Kalziumkanälen

unterscheidet man N-, P-, Q-, R-, L- und T-Typen, die alle eine gewisse

Spannungsabhängigkeit zeigen. Von besonderem Interesse sind die Kalziumkanäle vom L-

Typ, welche in allen erregbaren und selbst in vielen nicht erregbaren Geweben anzutreffen

sind. Kalziumkanäle vom L-Typ stellen den wichtigsten Transportmechanismus von Kalzium

3

durch die Zellmembran von allen Muskelzellen dar, wobei glatte Muskelzellen besonders

hohe Expressionsraten dieser Kanäle zeigen (Sandmann et al. 1999). Weiterhin sollte erwähnt

werden, dass die Membran glatter Muskelzellen eine verhältnismäßig hohe Permeabilität für

Natriumionen besitzt, welche dadurch ebenfalls maßgeblich an der Entstehung des

Ruhemembranpotenzials beteiligt sind.

Da die intrazelluläre Kaliumkonzentration physiologischerweise gegenüber der extrazellulären

um ungefähr das 30-fache erhöht ist, kommt es bei der Öffnung von Kaliumkanälen zu

einem Kaliumausstrom aus der Zelle und damit zu einer Hyperpolarisation; zusätzlich zum

Konzentrationsgradienten hängt die treibende Kraft des Ionenstroms auch wesentlich vom

Membranpotential ab. Durch den Kaliumausstrom wird die Öffnungswahrscheinlichkeit der

spannungsabhängigen Kalziumkanäle gesenkt und der intrazelluläre Kalziumspiegel

vermindert, es kommt also zur Relaxation der glatten Muskelzelle.

Zwischen dem Blutstrom und der glatten Muskelzelle liegt das Endothel, welches ebenfalls in

die Steuerung des Gefäßtonus eingreift. Durch die Freisetzung von vasoaktiven Substanzen

wie Stickstoffmonoxid (NO), Prostaglandin E2 (PGE2), Endothelin (ET), B- und C-

natriuretischem Peptid (BNP, CNP) sowie Adrenomedulin bildet die Endothelzelle eine

wichtige Regulationseinheit (Wiley et al. 2002).

1.3. Aufgabe und Einteilung der Kaliumkanäle

Kaliumkanäle sind in einer Vielzahl von tierischen und pflanzlichen Zellen für verschiedene

Aufgaben zuständig. Sie bestimmen einerseits in einem wesentlichen Maße das

Ruhemembranpotential, beteiligen sich aber andererseits auch wesentlich an der Ausbildung

von Aktionspotenzialen und regulieren sowohl Zellvolumen als auch Zytokinese.

Klassischerweise wurden bis vor einigen Jahren prinzipiell vier Kaliumkanaltypen

voneinander unterschieden: 1. ATP-abhängige Kaliumkanäle (KATP), 2. spannungsabhängige

Kaliumkanäle (KV), 3. Kalzium-abhängige Kaliumkanäle (KCa) und 4. einwärts-gleichrichtende

Kaliumkanäle (Kir). Neben diesen Kanälen sind in letzter Zeit zunehmend die Zwei-Poren-

Kalium-Kanäle (K2P) erforscht worden, wobei sich diverse Subtypen unterscheiden liessen.

Neben der funktionellen Einteilung der Kaliumkanäle lassen sich diese auch nach ihrer

molekularen Struktur ordnen. Das gemeinsame molekulare Motiv aller Kaliumkanäle ist die

4

Poren-Domäne, welche in Säugetierzellen hochkonserviert vorliegt (Doyle et al. 1998).

Daneben besitzen die Untereinheiten der Kanäle eine unterschiedliche Anzahl an

Transmembrandomänen, wonach eine grobe Einteilung in zwei, vier oder sechs solcher

Domänen zählende Kaliumkanaluntereinheiten vorgenommen werden kann. So weisen

beispielsweise die Untereinheiten der einwärts-gleichrichtenden Kir-Kanäle zwei, diejenigen

der auswärts-gleichrichtenden KV-Kanäle dagegen sechs Transmembrandomänen auf; die

K2P-Kanal-Untereinheiten zeigen eine Molekülstruktur mit vier Transmembransegmenten

(Lesage et al. 1996, Guillemare et al. 1996, Fink et al. 1996). Die fertigen Kanäle entstehen

durch eine Zusammenlagerung der Poren-Domänen der jeweiligen Untereinheiten. Bei den

Untereinheiten mit zwei oder sechs Transmembrandomänen werden die fertigen Kanäle

durch Tetramere gebildet, während die K2P-Kanäle wahrscheinlich Dimere darstellen (Lesage

et al., Reyes et al., Fink et al. 1996).

K2P-Kanäle lassen sich weiterhin in fünf funktionelle Subtypen unterteilen:

1. Lipid-sensitive mechanisch beeinflussbare Kaliumkanäle: TREK-1, TREK-2 und TRAAK (Fink et al. 1996 & 2000, Bang et al. 2000)

2. pH-sensitive Auswärts-Gleichrichter: TASK-1 bis TASK-5 (Duprat et al. 1997, Kim et al. 2000, Rajan et al. 2000, Leonoudakis et al. 1998, Reyes et al. 1998, Kim et al. 1998, Kim et al. 2001, Decher et al. 2001)

3. Schwache Einwärts-Gleichrichter: TWIK-1 und TWIK-2 (Lesage et al. 1996, Patel et al. 2000, Pountney et al. 1999, Chavez et al. 1999, Salinas et al. 1999)

4. Alkalisch-aktivierte Hintergrundkaliumkanäle: TALK-1 und TALK-2 (Kang et al. 2004, Duprat et al. 2005)

5. Die Halothan-inhibierten Kaliumkanäle THIK-1 und THIK-2 (Rajan et al. 2001)

6. Die “Rückenmarks“-Kaliumkanäle TRESK-1 und TRESK-2, welche besonders hohe

Sensitivität gegenüber Inhalationsanästhetika wie Halothan zeigen (Keshavaprasad et

al. 2005, Liu et al. 2004)

Es hat sich gezeigt, dass mehrere dieser Subtypen eine elementare Rolle bei der Genese des

Ruhepotenzials unterschiedlichster Körperzellen einnehmen. Unter anderem wird die

Öffnungswahrscheinlichkeit dieser Kanäle durch Hypoxie, intra- und extrazellulären pH-

Wert, Temperatur, Druck, Neurotransmitter sowie bioaktive Lipide moduliert (Girard et al.

2004).

5

Im Rahmen der vorliegenden Abhandlung soll bevorzugt auf die lipid-sensitiven

Kaliumkanäle eingegangen werden. Diese Lipidsensitivität ist bislang teils auf direkte Effekte

auf Kaliumkanäle, teils jedoch auch auf indirekte – das heißt membranvermittelte –

mechanische Stimulierbarkeit zurückgeführt worden (s. a. Kap. 4). Die genannten Kanäle sind

aufgrund ihrer hohen Expression im Hirngewebe insbesondere für die Anästhesie von großer

Bedeutung. Neuere Untersuchungen von Bryan et al. (2006) haben jedoch ergeben, dass

TREK-1- und TRAAK-Kanäle auch im Endothel nachweisbar sind. Die mechanische

Stimulierbarkeit der Kanäle macht sie unter anderem für solche Substanzen empfindlich,

welche sich in der Lipid-Doppelschicht lösen und damit die Membranspannung modulieren

können. Hierzu gehört neben diversen Fettsäuren auch das Inhalationsanästhetikum

Halothan. Das Lokalanästhetikum Bupivacain zeigte

in verschiedenen Untersuchungen auch einen

direkten inhibitorischen Effekt auf TREK-1 (Punke

et al. 2003), TASK-2 (Kindler et al. 2003) und

TASK-3 (Meadows et al. 2001). Das mit Bupivacain

verwandte Ropivacain zeigt in unserem Modell

ähnliche Effekte wie Bupivacain, worauf jedoch im

Rahmen dieser Arbeit nicht weiter eingegangen werden soll (vgl. Burmester et al. 2005).

Während das Endocannabinoid Anandamid unabhängig von CB-Rezeptoren TASK1-Kanäle

direkt und selektiv blockiert, zeigt der klassische Kaliumkanalblocker Glibenclamid keinen

Effekt auf Tandemkanäle (Maingret et al. 2001, Skatchkov 2006). Es konnte weiterhin ein

CB1-Rezeptor-unabhängiger Calcium-Ionen freisetzender Effekt von Anandamid auf

menschliche Endothelzellen nachgewiesen werden (Mombouli et al. 1999). Somit erscheint

eine Beteiligung von Tandem-Kaliumkanälen im menschlichen Koronarkreislauf zwar

wahrscheinlich, ist jedoch bislang unzureichend erforscht worden. Angesichts der weiten

Verbreitung von Inhalationsanästhetika und der häufig postulierten kardioprotektiven

Wirkung diverser Fettsäuren besteht diesbezüglich ein deutlicher Abklärungsbedarf, welchem

mit dieser Arbeit nachgegangen werden soll.

1.4. Die Rolle der Fettsäuren im gesunden Herzen

Bereits in den Jahren 1950-1974 analysierte das Krankenhaus von Upernavik im Nordwesten

Grönlands die Inzidenz unterschiedlicher chronischer Erkrankungen bei den einheimischen

Bupivacain

6

Eskimos und verglich diese Daten mit einer entsprechenden mitteleuropäischen Bevölkerung.

Hierbei fiel vor allem auf, dass die Inzidenz von koronarer Herzerkrankung bei den Eskimos

signifikant niedriger war, was bereits zu diesem Zeitpunkt mit dem hohen Anteil an ω-3-

Fettsäuren in der Nahrung der Eskimos in Zusammenhang gebracht wurde (Kromann et al.

1980). Auch in weiterführenden Studien konnte diese Theorie insbesondere als Senkung des

Myokardinfarktrisikos bestätigt werden (Kromhout et al. 1985 & 1995, Norell et al. 1986,

Gramenzi et al. 1990, Siscovick et al. 1995, Daviglus et al. 1997).

Die als bedingt essentiell geltenden Fettsäuren Eicosapentaensäure (EPA) und

Docosahexaensäure (DHA) zählen zu den mehfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) und

sind Abkömmlinge der α-Linolensäure (ALA). Durch mehrere enzymatische Reaktionen

kann ALA über EPA in DHA umgewandelt werden (Neddleman et al. 1979, Sprecher et al.

1999) (s. Abb. 1-1). Diese Fettsäuren werden als ω-3-Fettsäuren bezeichnet, da die erste

Doppelbindung vom höchstoxidierten Kohlenstoffatom (=Carboxygruppe) aus gezählt am

drittletzten Kohlenstoffatom anzutreffen ist. Häufig wird die Anzahl der C-Atome gefolgt

von einem Doppelpunkt und der Anzahl der Doppelbindungen angegeben: so zum Beispiel

“20:5“ für EPA oder “22:6“ für DHA. EPA und DHA werden ähnlich wie der klassische

Metabolit Arachidonsäure über die Zyklooxygenase (COX) abgebaut. Im Endothel wird so

aus EPA Prostazyklin I3 (PGI3) gebildet, aus Arachidonsäure entsteht dagegen PGI2; beide

Stoffe wirken vasodilatatorisch (Nishikawa et al. 1997, Lagarde et al. 1993, Hamazaki et al.

1988). Ein physiologischer Unterschied im Gegensatz zur Wirkung von AA zeigt sich

dagegen beim Umbau von EPA und DHA innerhalb der Thrombozyten: hier wird AA zum

stark vasokonstriktorisch wirksamen Thromboxan A2 (TXA2), während EPA und DHA in

das wesentlich schwächer vasokonstriktorische TXA3 umgewandelt werden (Das et al. 2005,

Papanicolaou et al. 1987).

ALA EPA DPA DHA 18:3 18:4 20:4 20:5 22:5 22:6

∆-6-Desaturase ∆-5-Desaturase 24:5 24:6

Peroxisom

Abb. 1-1, Sprecher-Pathway: Schematische Darstellung der metabolischen Umwandlung von

α-Linolensäure (ALA) in die höhergradig ungesättigten Fettsäuren. Der größte Teil dieses

Prozesses findet im endoplasmatischen Retikulum statt, wobei ein wechselhafter Anteil in den

7

Peroxisomen einen wichtigen regulatorischen Einfluss auf den PUFA-Gehalt der Lipidmembran

haben könnte (Sprecher et al. 1995).

Weitere bekannte Effekte der PUFAs beinhalten vor allem die Inhibiton der Bildung von

VLDL und LDL in der Leber, weswegen ein antiatherogener Effekt postuliert worden ist.

Ein positiver therapeutischer Effekt in der Behandlung der rheumatoiden Arthritis ist

ebenfalls in Verbindung mit einer vermehrten PUFA-Aufnahme assoziiert worden (Kojima et

al. 2005, Kraemer et al. 2005). Interessant ist auch der Effekt von Fischölen auf die

Insulinsekretion: nachdem nachgewiesen werden konnte, dass PUFAs die Glukoseverwertung

in Ratten verbessern können, wurden intensivierte Untersuchungen im Bereich der

Diabetesforschung durchgeführt. Hierbei wurde die Theorie aufgestellt, dass der vermehrte

Einbau von PUFAs in die Plasmamembran des Skelettmuskels dort die AA kompetitiv

verdrängt und somit weniger PGE2 gebildet wird (Arkhipova et al. 2005, Barnett et al. 1987,

Wu et al. 1988). Da PGE2 ein potenter Inhibitor der cAMP-Bildung und damit auch der

Insulinsekretion ist, wird diese durch PUFAs gesteigert.

αααα-Linolensäure (ALA)

Eicosapentaensäure (EPA)

Docosahexaensäure (DHA)

Arachidonsäure (AA)

Anandamid

8

Die essentielle Fettsäure Linolensäure findet sich physiologischerweise in besonders hoher

Konzentration in der Wand von Koronararterien. Weiterhin ist Linolensäure eine wichtige

Vorstufe von Arachidonsäure, welche ihrerseits als Substrat für die Synthese von

Prostaglandinen und Thromboxan A2 fungiert. Hiermit ist Linolensäure intensiv in die

Regulation des koronaren Gefäßtonus und der Hämostase involviert. Es konnte gezeigt

werden, dass diese Fettsäure eine endothel-unabhängige Relaxation von

Koronararterienringen induziert, die durch den Na+/K+-ATPase-Inhibitor Ouabain blockiert

wurde (Pomposiello et al. 1998). Somit ist ein Effekt von Linolensäure auf die Na+/K+-

ATPase von koronaren glatten Muskelzellen nahegelegt worden.

Membranständige Arachidonsäure kann physiologisch in den Endocannabinoid-Rezeptor-

Agonisten Anandamid umgebaut werden (Arreaza et al. 1997). Während die Wirkungen auf

das ZNS bereits seit längerem intensiv erforscht werden, sind die systemischen Auswirkungen

von Endocannabinoiden bislang nur sehr schlecht bekannt. In Studien konnten Grainger et

al. 2001 nachweisen, dass Anandamid in Koronararterien eine Vasodilatation bewirkt. Dieser

Effekt ließ sich nicht durch Cannabinoid-Rezeptor-Antagonisten blockieren, dafür aber durch

einen NO-Synthase-Inhibitor (L-NAME) und einen COX-Hemmer (Indometacin)

verringern. In dieser Studie wurde postuliert, dass die Konversion des Fettsäureamids

Anandamid in ein vasoaktives Prostanoid hierbei eine wichtige Rolle spiele, wodurch unter

anderem Kaliumkanäle geöffnet würden.

Ölsäure ist die häufigste in der Natur vorkommende Fettsäure und spielt damit auch eine

wesentliche Rolle in der menschlichen Ernährung. Oleinsäure ruft bekannterweise eine vom

Endothel abhängige Vasodilatation hervor (Ryan et al. 2000). Andererseits handelt es sich im

Gegensatz zu den bisher genannten um eine einfach ungesättigte Fettsäure, die ebenso wie

ALA, AA, EPA und DHA 2P-Kaliumkanäle vom TRAAK-Typ zu öffnen vermag. Obwohl

der Effekt von vielen Fettsäuren insbesondere auf TREK-1-, TREK-2- und TRAAK-Kanäle

nachgewiesen worden ist, ist anzunehmen dass auch andere 2P-Kaliumkanäle mechanisch

durch PUFAs aktiviert werden können (Patel et al. 2001).

Oleinsäure

9

1.5. Die Rolle der Fettsäuren im kranken Herzen

Pathologische Prozesse greifen über vielerlei direkte und indirekte Mechanismen in das

molekulare und elektrische Gleichgewicht einer Zelle ein. Das Säugetierherz ist durch seine

konstante Belastung und seine zentrale Rolle im Kreislauf einer enormen Vielfalt an solchen

Einflüssen ausgesetzt. Beim Menschen werden Schäden am Myokard in erster Linie durch

erhöhten arteriellen Blutdruck, Nikotinabusus oder ein metabolisches Ungleichgewicht zum

Beispiel im Rahmen eines Diabetes mellitus oder einer Hypercholesterinämie ursächlich

ausgelöst. Diese Störungen bewirken über unterschiedlichste Mechanismen (direkte Effekte

auf Ionenkanäle, Atherosklerose, toxische Metaboliten) in aller Regel eine Alteration des

koronaren Blutflusses, wodurch eine Myokardischämie und -nekrose provoziert werden

können. Im ischämischen Myokard kommt es zur Akkumulation zahlreicher Metabolite,

welche selbst nach erfolgreicher Reperfusion einen arrhythmogenen Einfluss auszuüben

vermögen. Es ist bereits seit längerem bekannt, dass während der Reperfusion sehr hohe

Konzentrationen an Fettsäuren im menschlichen Myokard anzutreffen sind (Hutter et al.

1992; Van der Vusse et al. 1997). Vor allem die einfach-ungesättigte Fettsäure Oleinsäure ist

hierbei mehrfach nachgewiesen worden (Svensson et al. 1990; Charnock et al. 1994;

Lopaschuk et al. 1994; al Makdessi et al. 1995). Weiterführende Experimente mit Oleat haben

gezeigt, dass diese Fettsäure den transienten Auswärtsstrom in menschlichen Myozyten

blockiert (Crumb et al. 1999), was mit den bereits in Kapitel 1.4 genannten Effekten von

Oleinsäure in Einklang gebracht werden kann.

Durch Medikamente können die endogenen Wege des PUFA-Katabolismus erheblich

modifiziert werden. So haben Serhan et al. 2002 nachweisen können, dass DHA unter dem

Einfluss des COX-Inhibitors Acetylsalicylsäure zu einer zuvor unbekannten Substanzgruppe

von 17R-Hydroxy-Docosanoiden konvertiert wird. Diesen später als Resolvine bezeichneten

Substanzen wird ein wichtiger antiinflammatorischer Effekt durch Unterbindung der

Genexpression von Zytokinen zugesprochen. Auch die anderen PUFAs können in Resolvine

umgewandelt werden und beteiligen sich hierdurch modulatorisch an unterschiedlichen

inflammatorischen Prozessen (Arita et al. 2005). Auf diesem Gebiet wird in den nächsten

Jahren hoffentlich sehr viel mehr Information zur Aufklärung der genaueren

Zusammenhänge zwischen PUFAs, Resolvinen, Herzinfarktrisiko und anderen teils

autoimmunologisch und teils infektiös bedingten pathogenetischen Prozessen erscheinen.

10

K a p i t e l 2

METHODIK

2.1 Herzpräparation und apparativer Aufbau

Die Meerschweinchen wurden von der Firma Charles River (Sulzfeld) geliefert. Es handelte

sich hierbei um weibliche Meerschweinchen des Stammes BFA bunt mit einem

Körpergewicht von 280-350 g welche mit dem Tierfutter Altromin 1320 und Wasser ernährt

worden waren. Die Tiere wurden nach ihrer Lieferung zwischenzeitlich in großen

Plastikwannen mit Pressspanflocken gehalten, wo sie stets Zugang zu Trinkwasser hatten.

Vor Versuchsbeginn wurde ein einzelnes Tier in einen kleineren Plastikbehälter von ca. 9

Liter Volumen umgelagert. Auf den Boden dieses Behälters wurde eine dünne Lage

saugfähigen Zellstoffs gelegt, auf die unmittelbar vor Versuchsbeginn das

Inhalationsanästhetikum appliziert werden konnte. Vor der Anästhesie wurde der Behälter

mindestens drei Minuten lang mit 100%igem Sauerstoff begast, um eine möglichst gute

Sauerstoffversorgung des Herzens zu gewährleisten. Als Inhalationsanästhetikum wurden 4

ml Sevofluran verwendet, welche mit einer Spritze auf den Zellstoff appliziert wurden.

Hiernach wurde der Behälter luftdicht verschlossen, bis der Muskeltonus der Tiere deutlich

erschlafft war und es zu einer spontanen Blasenentleerung kam.

Mit der Herzpräparation wurde unmittelbar nach eingetretener Sedation begonnen. Die Tiere

wurden decapitiert und das Abdomen wurde mit einer einzigen subxiphoidalen transversalen

Inzision eröffnet. Nach Durchtrennung des Diaphragmas wurde die vordere Thoraxhälfte

durch zwei parallel zum Sternum von kaudal nach kranial durchgeführte Schnitte mobilisiert

und das Perikard vorsichtig von der Thoraxwand getrennt. Auf diese Weise konnte eine

optimale Sicht auf das Herz und die Lungen innerhalb weniger Sekunden gewährleistet

werden. Daraufhin wurde der Aortenbogen vom umgebenden Fett- und Bindegewebe

freipräpariert und auf Höhe des Truncus brachiocephalicus mit einer kleinen anatomischen

Pinzette gefasst. Distal dieser Stelle wurde die Aorta durchtrennt und das Herz mit der

Pinzette nach ventro-kaudal gezogen, wobei die Pulmonalgefäße und Hohlvenen

nacheinander abgeschnitten wurden um so das Herz völlig abzupräparieren. Das Herz wurde

daraufhin sofort in ein kleines Gefäß mit der späteren Perfusionslösung komplett eingetaucht,

um Luftembolisationen zu vermeiden. Durch mehrere Kontrollexperimente konnte gezeigt

11

werden, dass die spätere Ansprechrate des Herzens auf vasomotorische Stimuli ebenso wie

die maximale Dauer der Experimente erheblich vor allem von zwei Faktoren abhängt;

nämlich erstens von der Vermeidung von Luftembolisationen und Minimierung der Zeit, in

der das Herz tatsächlich schlägt; und zweitens von der gesamten Präparationszeit, welche die

spezifische Hämostasezeit von 29 Sekunden nicht wesentlich überschreiten sollte (Hwang

und Wosilait, 1970). Bei der als erstes verwendeten physiologischen Salzlösung handelte es

sich um die gekühlte (8 °C) und oxygenierte spätere Perfusionslösung. Bei dieser ersten

Spülung wurde durch die Eigenaktivität des noch schlagenden Herzens bereits ein Großteil

des Blutes entfernt. Hiernach wurde eine T-förmige Kunststoffkanüle in den Aortenstumpf

vorgeschoben und mit zwei Fäden fest fixiert. Das zweite Ende dieser Kanüle wurde danach

am Rand der Präparationsschale befestigt, um eine sichere bimanuelle Präparation zu

ermöglichen. Das dritte Ende der Kanüle wurde an einen Schlauch angeschlossen, aus dem

die oxygenierte Perfusionslösung bei einer Temperatur von 22 °C und einem konstanten

Druck von 65 mmHg strömte. Unter diesen Bedingungen wurde es den Koronararterien

ermöglicht, die Flussrate entsprechend der metabolischen Bedürfnisse des Herzens durch ihre

Autoregulation anzupassen. Relativ hohe Pyruvatkonzentrationen wurden angewandt, um die

Regenerationszeit bis zum Erreichen eines konstanten Gefäßtonus zu verkürzen. Während

die Koronargefäße nun druckkonstant perfundiert wurden und das Myokard aufgrund der

hohen Kaliumkonzentration (15 mM) seine Kontraktionen einstellte, konnte die Präparation

sorgfältig zu Ende geführt werden. Hierbei wurde möglicherweise noch vorhandenes

Fremdgewebe wie Lunge und Haare entfernt und das Perikard abpräpariert, um eine spätere

Tamponade zu vermeiden.

Nach 15-minütiger druckkonstanter Perfusion wurde das Herz mitsamt der Kanüle aus der

Präparationsschale entfernt und an eine vierkanälige Peristaltikpumpe (“Perimax 16“, Spetec)

mit einem konstanten Fluss von 8,5 ml/min wie in Abb. 2-1 dargestellt angeschlossen. Um

optimale Versuchskonditionen zu generieren, wurden zwei abwechselnd pulsierende

Pumpenkanäle jeweils zu einem weitestgehend pulsationsfreien Kanal zusammengeschlossen.

Erst nach Sicherung dieser Perfusion wurde dann der Schlauch mit der druckkonstanten

Perfusion entfernt und durch ein Druckmessgerät (siehe unten) ersetzt. Die an die Pumpe

angeschlossenen Perfusionslösungen wurden innerhalb eines Wasserbades bei einer

konstanten Temperatur von 37,0 °C gehalten. Ein der Pumpe nachgeschalteter

Wärmeaustauscher wurde verwendet, um eventuelle während des Pumpendurchtritts

aufretende Wärmeverluste zu kompensieren. Hinter dem Wärmeaustauscher traten die

12

Lösungen durch eine kurze Glasröhre mit einem Luftfangsystem, um Luftembolisationen und

darauf folgende Perfusionsdefizite während des Experiments auszuschließen. Zwischen

verschiedenen Perfusaten konnte mittels eines 1 cm vor dem Herzen angebrachten Ventils

gewechselt werden. Das Herz selbst wurde in einen 10 ml fassenden doppelwandigen

Glasbehälter gehängt.

Abb. 2-1 Versuchsaufbau: An das System konnten stets zwei unterschiedlich begaste

Perfusionslösungen gleichzeitig angeschlossen werden. Die Flussregulation erfolgte über eine 4-

kanälige Peristaltikpumpe (1); Umschaltung zwischen den Lösungen mittels Drehventil (2); die

nicht in das Koronarsystem geleitete Lösung wurde verworfen (3); Übertragung der Daten zum

Computer durch einen Druckwandler (4); Meerschweinchenherz-Präparat (5); das im Wasserbad

(6) auf 37°C erwärmte Wasser wurde durch ein Schlauchsystem zum doppelwandigen

Organbehälter (7) und von dort zum Wärmetauscher (8) geleitet.

Der Raum zwischen den Glaswänden wurde ständig mit Wasser der Temperatur 37,0 °C

durchspült und so ein Abkühlen des Organs verhindert. Das aus den Koronargefäßen über

den rechten Vorhof und die offenen Hohlvenenstümpfe abfließende Perfusat füllte somit den

das Herz umgebenden Raum und floss letztendlich über die Ränder des Glasgefäßes ab.

Nun konnte der Druck innerhalb der Aorta über einen angeschlossenen A/D-Wandler

("Digidata 1200", Axon Instruments) und damit verbundenen Computer in Echtzeit gemessen

37 °C

Gas 2 Gas 1

1 2

3

4 5

6 7

8

13

werden. Die Daten wurden durch ein Computerprogramm von Axon Instruments ("Clampex"

7.0.0.86) aufgenommen und gespeichert. Dieser intraaortale Druck war dem koronaren

Gesamtwiderstand direkt proportional, da ein Abfließen des Perfusats bei geschlossener

Aortenklappe nur über die Herzkranzgefäße möglich war und die Flussgeschwindigkeit

während des Experimentes konstant gehalten wurde. Nun konnte also mit der Messung des

koronaren Gefäßwiderstandes in Abhängigkeit von den applizierten Substanzen begonnen

werden.

Wenn die Herzpräparation sorgfältig genug durchgeführt worden war, konnte man zu Beginn

eines jeden Experimentes eine rasche Zunahme des Perfusionsdruckes beobachten. Ein Steady

state wurde in der Regel in 4 bis 10 Minuten erreicht; bei länger dauernder Regenerationszeit

musste entweder von einem Leckstrom oder von einer ischämischen Schädigung des

Myokards ausgegangen und das Experiment abgebrochen werden. Ein Abbruch erfolgte

ebenso wenn der Perfusionsdruck im Steady state unter der Flussgeschwindigkeit von 8,5

ml/min nicht zwischen 70 und 120 mmHg lag. Nach dem Erreichen eines konstanten

Druckes im genannten Bereich wurde die Flussgeschwindigkeit so lange reduziert, bis ein

Wert zwischen 60 und 65 mmHg erreicht war. In diesem niedrigen Druckbereich konnte

einerseits noch von einer ausreichenden Versorgung des kontraktil inaktiven Myokards

ausgegangen werden, andererseit wurde aber auch die Neigung zur interstitiellen

Ödembildung minimiert.

Um das Reaktionsvermögen des Herzens zu überprüfen, wurde vor jeder Versuchsreihe ein

positiver Kotrollversuch mit dem KATP-Kanal-öffner Cromakalim (1,0 µM) durchgeführt und

ein Druckabfall von mindestens 50 % innerhalb von 5 Minuten zur Fortsetzung des

Versuches vorausgesetzt. Nach dieser Zeit oder nach Erreichen eines konstanten

Minimaldruckes wurde das Herz erneut mit Cromakalim-freier

Lösung perfundiert, bis wieder der Steady state –Druck vorlag.

Häufig kam es nach der ersten Cromakalim-Applikation zu einem

Ansteigen des Perfusionsdruckes über das ursprüngliche Niveau

hinaus. Dies kann jedoch durch den zusätzlichen regenerativen

Effekt der maximalen Vasodilatation erklärt werden und wird

durch die Beobachtung unterstützt, dass mehrmalige Cromakalim-

Administrationen den Steady state –Druck nicht noch weiter

steigern konnten. Aus diesem Grunde erfolgte nach einer einmaligen Cromakalim-induzierten

Vasodilatation eine nochmalige Korrektur der Perfusionsgeschwindigkeit, so dass der

Cromakalim

14

Perfusionsdruck wieder im Bereich 60 bis 65 mmHg lag. Für alle Experimente wurden somit

Flussgeschwindigkeiten von 3,5 bis 7,0 ml/min verwendet.

Eine Erhöhung der Cromakalim-Dosis hatte weder einen Effekt auf das Ausmaß der

Vasodilatation, noch wurde die Auswaschphase dadurch verlängert. Alternativ zur

Verwendung von Cromakalim beschreiben manche Autoren die Perfusion mit hypoxischen

Lösungen als gleichwertige oder gar überlegene Qualitätskontrolle. In den folgenden

Experimenten wurde der Effekt zwischen diesen beiden Methoden verglichen.

2.2 Perfusionlösungen

Die Stammlösung für jede Versuchsreihe wurde jeweils am Versuchstag aus durch reverse

Osmose ultrahochgereinigtem Wasser frisch hergestellt und enthielt folgende

Salzkonzentrationen:

NaCl 105 mM Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

NaHCO3 24 mM Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

KCl 15 mM Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Glucose 10 mM Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Na-Pyruvat 5 mM Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

NaH2PO4 1 mM Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

CaCl2 1 mM Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

MgCl2 800 µM Merck AG, Darmstadt

Die als oxygeniert bezeichneten Lösungen wurden mit Carbogen (95% O2, 5% CO2)

mindestens 10 Minuten vor Perfusionsbeginn begast; bei den als hypoxisch bezeichneten

Lösungen wurde analog eine Gasmischung aus 95% N2 und 5% CO2 verwendet. Der pH-

Wert wurde unter Begasung regelmäßig (jeweils vor Versuchsbeginn) gemessen und betrug

stets 7,41 ± 0,04.

Des weiteren wurden folgende Stoffe für einzelne Versuchsreihen verwendet: Anandamid,

Cyclodextrin, Glibenclamid, Indometacin, Levocromakalim, Natrium-Docosahexaenoat,

Natrium-Eicosapentaenoat, Natrium-Oleat und Nω-Nitro-L-Arginin (Sigma-Aldrich Chemie,

Steinheim). Die jeweiligen Konzentrationen werden im Zusammenhang mit den

15

entsprechenden Versuchsreihen genannt. Die Stoffe wurden sorgfältig mittels langsamer

Verdünnung in Lösung gebracht, wobei auf löslichkeitsfördernde Stoffe wie DMSO

verzichtet werden konnte. Lediglich bei Oleat wurde bei den entsprechend bezeichneten

Versuchen die vom Hersteller an das Makromolekül Cyclodextrin gekoppelte Variante

gewählt, um bei längerer Perfusionsdauer eine vorzeitige Fettembolisation zu vermeiden. Bei

DHA, EPA und AA wurden die Lösungen zusätzlich 15 Minuten im Ultraschallbad

behandelt, um eine möglichst gute Löslichkeit zu erreichen. Die R- und S-Isomere von

Bupivacain wurden uns freundlicherweise von AstraZeneca (Södertälje, Schweden) zur

Verfügung gestellt.

2.3 Kalibrierung der Apparatur

Abb. 2-2 Kalibrierungsgerade: Abhängigkeit der mittels A/D-Konverter gemessenen

Spannung vom tatsächlich vorliegenden durch eine Wassersäule produzierten Druck.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 20 40 60 80 100 120

Druck [mmHg]

Spannung [mV]

16

Um die Umwandlung der gemessenen Druckwerte in elektrische Spannung und somit in

verwertbare Computerdaten zu kalibrieren, wurde eine 135,95 cm hohe Wassersäule (WS) mit

einem Glasröhrensystem hergestellt. Da 1 Meter WS in etwa 73,556 mm Quecksilbersäule

(mmHg) entspricht, konnte durch stufenweise Reduktion der Wassersäulenhöhe eine

Kalibrierung bis zu einem Äquivalentdruck von 100 mmHg erfolgen.

Bei der Kalibrierung zeigte sich eine ab einem Druck von circa 5 mmHg zuverlässig lineare

Proportionalität der Messwerte in Abhängigkeit vom tatsächlich vorliegenden Druck.

17

K a p i t e l 3

DURCHFÜHRUNG / RESULTATE

3.1 Vergleich hypoxischer mit Cromakalim-induzierter Vasodilatation

Zum Beginn einer jeden Versuchsreihe wurde durch Applikation von 1 µM Cromakalim eine

maximale Vasodilatation ausgelöst. Der typische Versuchsbeginn einer Messung mit der

Justierung des koronaren Perfusionsdrucks auf einen Wert von ca. 60 mmHg ist in Abb. 3-1

dargestellt. Da Cromakalim in diesem Konzentrationsbereich ein selektiver Öffner von ATP-

sensitiven Kaliumkanälen (KATP Kanälen) ist, war die Vasodilatation mit großer

Wahrscheinlichkeit auf die Öffnung der KATP-Kanäle, die daraus resultierende

Hyperpolarisation und den nachfolgenden Abfall der freien intrazellulären Ca2+

Konzentration in den glatten Muskelzellen der Koronargefäße zurückzuführen (Daut et al.

1990; von Beckerath et al. 1991). Zusätzlich wurde auch durch Perfusion des Herzens mit

Stickstoffbegaster Lösung eine hypoxische Vasodilatation durchgeführt, deren Amplitude sich

nicht signifikant von der der Cromakalim-induzierten Vasodilatation unterschied (Abb. 3.2).

Abb. 3-1, Induktion einer Cromakalim-induzierten (durch die Öffnung von KATP-

Kanälen vermittelten) Reduktion des KPD: Zunächst sind Druckschwankungen während

der späten Herzpräparation (Entfernung des Perikards) zu registrieren, danach erfolgt die

Einstellung eines konstanten Perfusionsdrucks von zunächst 61 mmHg. Unter Perfusion mit einer

2500 0

70 -

Zeit [s]

KPD [mmHg]

Cromakalim 1 µM

18

1 µM Cromakalim-Lösung kommt es zu einem Druckabfall bis zu einem Minimum von 20 mmHg.

Unter Reperfusion mit cromakalimfreier Lösung steigt der Druck erneut bis auf ein geringfügig

höheres Niveau als zuvor an (Regenerativer Effekt der maximalen Vasodilatation). Nach erneuter

Einstellung der Perfusionsrate konnte mit den eigentlichen Experimenten begonnen werden.

Um eine durch einen anderen Mechanismus vermittelte Vasodilatation hiermit zu vergleichen,

wurden zusätzlich fünf Experimente mit ATP-haltiger Lösung durchgeführt. Die ATP-

induzierte Gefäßerweitung wird durch P2X- und P2Y-Purinorezeptoren vermittelt

(Harrington et al. 2005). Alle drei Formen der Vasodilatation zeigten einen raschen, in etwa

exponentiellen Druckabfall, gefolgt von einem sigmoiden Druckanstieg während der

Reperfusionsphase mit oxygenierter Lösung (siehe Abb. 3-1). Um die Rolle von

Stickstoffmonoxid (NO) bei der hypoxischen Vasodilatation zu eruieren, wurde bei acht

Experimenten zur Blockade der endothelialen NO-Synthase Nω-Nitro-L-Arginin (NArg) in

einer Konzentration von 10 µM zu allen Lösungen hinzugefügt. Auf diese Weise konnte der

dilatative Effekt der verschiedenen Qualitätskontrollen verglichen werden, wobei sich das in

Abb. 3-2 dargestellte Ergebnis zeigte.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

ATP [10 µM], n = 5

Cromakalim [1 µM],

n = 42 Hypoxie, n = 14

Hypoxie mit NArg

[10 µM], n = 8

Mittlerer KPD-Abfall [%]

Abb. 3-2, Vergleich vasodilatativer Stimuli: Nach Erreichen eines Steady state wurde der

Druck unter dem jeweiligen Stimulus mit dem Ausgangsdruck in Relation gesetzt (± eine

Standardabweichung).

Hiermit konnte gezeigt werden, dass NO die Vasodilatation nicht beeinflusst. Während ATP

den stärksten Effekt zeigte, konnte kein signifikanter Unterschied zwischen

cromakalimvermittelter und hypoxisch bedingter Vasodilatation nachgewiesen werden. Somit

19

wurde bei den folgenden Experimenten eine Qualitätskontrolle durch Cromakalim als

suffizientes Maß für die Reagibilität des Herzens gewertet.

3.2 Die Wirkung von Oleat auf den koronaren Widerstand

Um die Löslichkeit der Fettsäure Oleat zu verbessern, wurde sie zu sammen mit dem

Makromolekyl 2-Hydroxyethyl-β-Zyklodextrin appliziert. Zyklodextrine sind eine Gruppe

natürlich vorkommender Oligosaccharide welche aus mindestens sechs über 1,4-

Verbindungen verknüpften α-D-Glucopyranosyl-Einheiten bestehen; diese Einheiten werden

industriell aus Stärke gewonnen. Um einen selbständigen Einfluss von Zyklodextrin auf den

Koronartonus auszuschließen, wurde es Versuchsweise in verhältnismäßig hoher Dosierung

(8,7 mg/l) mit und ohne Cromakalim (2 µM) appliziert (Abb. 3-3).

Abb. 3-3, Wirkung von Cyclodextrin: Nach Cromakalim-vermittelter Vasodilatation und

darauffolgender Druckregeneration wurde Cyclodextrin hochdosiert mit und ohne Cromakalim

hinzugeführt. In vier aufeinanderfolgenden Experimenten zeigte sich kein signifikanter Einfluss

von Zyklodextrin auf den KPD oder die Reagibilität des Herzens.

Hiermit konnte eine Beeinflussung der Experimente durch Cyclodextrin weitestgehend

ausgeschlossen werden. In einer nachfolgenden Serie von Experimenten wurde orientierend

KPD [mmHg]

80

20

Zeit [s] 1000 2000

Cromakalim 2 µM Cromakalim 2 µM

2-Hydroxyethyl-β-Zyklodextrin 8,7 mg/l

0

20

untersucht, welchen Einfluss an Zyklodextrin gebundenes Oleat auf den koronaren

Widerstand hat und in welchem Konzentrationsbereich sich dieser Effekt beobachten lässt.

Hierzu wurde das Koronarsystem mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ölsäure

hintereinander perfundiert (Abb. 3-4). Diese Daten wurden aufgrund der niedrigen

Perfusionszeit nicht in die endgültige Auswertung der maximal erreichbaren Vasodilatation

einbezogen.

Abb. 3-4, Wirkung von Ölsäure: Aufstegende Konzentrationen von Oleat bewirken eine

submaximale Vasodilatation.

In einer folgenden Versuchsreihe sollte nochmals demonstriert werden, dass selbst höhere

Dosen von Zyklodextrin keinen Effekt auf den Koronartonus ausüben, während an Oleat

gebundenes Zyklodextrin einen eindeutigen vasodilatativen Einfluss hat. Zusätzlich wurde

untersucht, ob der dilatative Effekt von Oleat durch Stickstoffmonoxid (NO) vermittelt wird.

Hierzu wurden vier Versuche mit hochdosiertem Zyklodextrin und Oleat nach dem in Abb.

3-5 dargestellten Schema durchgeführt, wobei allen Lösungen der NO-Synthase-Inhibitor

Nω-Nitro-L-Arginin (NArg) hinzugefügt wurde. Die maximale hypoxische Vasodilatation

wird ebenso wie die Cromakalim-vermittelte durch NArg nicht beeinflusst (siehe Abb. 3-2).

Durch die Versuche konnte nun gezeigt werden, dass der Oleat-vermittelte Effekt zwar unter

KPD [mmHg]

Zeit [s]

80

10

1000 5000

Hypoxie Hypoxie Oleat (Zyklodextrin)

750 nM 1,5 µM 3 µM 6 µM

0

21

NArg eine Abschwächung erfährt, jedoch auch bei hoher NArg-Dosierung nicht komplett

blockiert wird.

Um das Ausmaß der Oleat-bedingten Vasodilatation zu erfassen wurde eine weitere Reihe

von 21 Experimenten durchgeführt, bei denen Oleat in einer bestimmten Konzentration bis

zum Erreichen eines Steady state appliziert und danach mit Standardlösung bis zum Erreichen

des konstanten Ausgangsdruckes ausgewaschen wurde (nicht abgebildet, Prinzip wie in Abb.

3-8 und 3-9). Somit konnte die Vasodilatation mit (n=7) und ohne (n=14) NArg quantifiziert

und eine Konzentrations-Wirkungskurve erstellt werden (Abb. 3-6). Die durch OA

erreichbare maximale Vasodilatation betrug 51,55 ± 6,28 %, während dieser Wert unter

Zusatz von NArg [10 µM] im Durchschnitt 33,48 ± 6,94 % betrug.

Abb. 3-5, Effekt von Oleat unter NArg: Auch nach Blockade der NO-Synthase durch NArg

reagiert das Koronarsystem sowohl auf eine Hypoxie als auch auf eine Oleat-Applikation mit

Vasodilatation. Dennoch ist das Ausmaß dieser Dilatation geringer als ohne NArg. Zyklodextrin

alleine zeigte keinen Effekt.

2-Hydroxyethyl-β-Zyklodextrin 25,9 mg/l Hypoxie

Oleat 6 µM

Hypoxie

70

1000 4000

KPD [mmHg]

Zeit [s] 0

22

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5000 10000 15000 20000

Konzentration [nM]

Vasodilatation [%]

OA + Zyklodextrin OA + Zyklodextrin + NArg

Die Oleat-bedingte Vasodilatation zeigte in allen Experimenten einen deutlich langsameren

Effekt als die durch maximale KATP-Kanal-Öffnung mit Cromakalim hervorgerufene.

Dennoch könnte die restliche (d.h. nicht NO-vermittelte) Vasodilatation durch KATP-Kanäle

vermittelt werden, da diese in einer Vielzahl von Effekten beteiligt sind. Um dies zu

überprüfen, wurden Versuche unter Zusatz von Glibenclamid, einem klassischen KATP-Kanal-

Blocker durchgeführt (Abb. 3-7).

Abb. 3-6, Quantifi-zierung der Oleat-vermittelten Vasodilatation mit (n=7) und ohne (n=14) NArg: Die Blockade der NO-Synthase bewirkt insbesondere im mittleren Konzentra-tionsbereich eine signifikante aber subtotale Verringe-rung der vasodilata-tiven Wirkung von Oleat. (± eine Stan-dardabweichung)

Glibenclamid

23

Abb. 3-7, Glibenclamid und Oleat: Während Glibenclamid die Cromakalim-induzierte

Vasodilatation aufhebt, zeigt es keinen signifikanten Effekt auf Oleat-bedingte Vasodilatation.

Der Sulfonylharnstoff Glibenclamid zeigt eine komplette Aufhebung der durch Cromakalim

hervorgerufenen starken Vasodilatation, hat aber keinen wesentlichen Einfluss auf die selbst

durch niedrige Dosen (vgl. Abb. 3-6) von Zyklodextrin-Oleat hervorgerufene

Gefäßerweiterung. Ein dominierender Effekt von ATP-abhängigen Kaliumkanälen ist damit

bei dem letztgenannten Effekt praktisch ausgeschlossen.

Die NO-Synthase kann Ca++-unabhängig sowohl durch Tyrosin-Phosphatase-Inhibitoren als

auch mechanische Schubspannung aktiviert werden (Fleming et al. 1998). Eine mechanische

Beeinflussung der Wandspannung kann andererseits nicht nur durch die Schubspannung

einer Flüssigkeit (in der Regel Blut) sondern auch durch die Einlagerung von ungesättigten

und damit abgewinkelten Fettsäuren verursacht werden. Es wäre daher denkbar, dass durch

den Einfluss der Fettsäuren auf die Wandspannung einerseits die NO-Synthase aktiviert wird,

Glibenclamid 2 µM

Zyclodextrin 12,9 mg/l

Oleat 1,5 µM

Glibenclamid 2 µM

Cromakalim 1 µM

Zeit [s]

KPD [mmHg]

10

70

1000 4000 0

Cromakalim 1 µM

24

andererseits aber auch andere Signaltransduktionswege eine wichtige Rolle spielen. Sollte

dieses Modell stimmen, müsste die Vasodilatation bei mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie

DHA und EPA stärker ausgeprägt sein als bei der einfach ungesättigten Fettsäure OA.

3.3 Effekte von DHA und EPA auf koronaren Vasotonus

EPA und DHA wurden nicht an Zyklodextrin gebunden, sondern mittels Ultraschallbad in

Lösung gebracht. Um die Vergleichbarkeit mit Oleat zu gewährleisten, wurden sechs

Versuche mit nicht Zyklodextrin-gebundenem Oleat durchgeführt. Hierbei zeigte sich im

Konzentrationsbereich von 2 bis 20 µM kein signifikanter Druckunterschied zum

Zyklodextrin-gebundenen Oleat.

EPA und DHA wurden im Konzentrationsbereich von 125 nM bis 10 µM appliziert und der

jeweilige Perfusionsdruck nach 1-minütiger Druckkonstanz registriert. Für beide Substanzen

wurden fünf Versuchsreihen durchgeführt.

Abb. 3-8, EPA: Vasodilatation bei unterschiedlichen Konzentrationen.

EPA 10 µM EPA 5 µM

0

60 -

KPD [mmHg]

Zeit [s] 1000 3000

25

Abb. 3-9, DHA: Vasodilatation bei unterschiedlichen Konzentrationen.

Beide Fettsäuren produzierten eine deutliche Vasodilatation. Auffällig war, dass dieser Effekt

einerseits schon bei sehr geringen Konzentrationen der Fettsäuren zu beobachten war und

andererseits auch stärker ausgeprägt zu sein schien als bei der einfach ungesättigten Fettsäure

Oleinsäure. Um dies zu bestätigen, wurden jeweils fünf Versuche für beide Fettsäuren

durchgeführt, wobei verschiedene Konzentrationen getestet wurden. Maximal wurde mit

DHA [10 µM] eine KPD-Reduktion um 47,95 ± 4,17 % und mit EPA [10 µM] um 47,40 ±

2,83 % beobachtet. Während die Werte insbesondere im niedrigeren Konzentrationsbereich

einer stärkeren Schwankung unterlagen, erzeugten höhere Fettsäurekonzentrationen einen

konstanteren Effekt.

Im Konzentrationsbereich 500 nM bis 4 µM für EPA und DHA wurde in jeweils vier

zusätzlichen Versuchen der Einfluss von NArg auf den vasodilatativen Effekt untersucht (s.

Abb. 3-10); am Ende jeder Versuchsreihe wurde zur Erfassung der maximalen unter NArg

erreichbaren Dilatation nochmals DHA/EPA in einer Konzentration von 10 µM

hinzugegeben. Hierbei war die Vasodilatation unter Zusatz von NArg mit 47,95 % für DHA

Cromakalim 1 µM DHA 10 µM DHA 5 µM DHA 2,5 µM DHA 1 µM

0

60

50

40

30

20

10

Zeit [s] 1000 2000 3000 4000

KPD [mmHg]

26

und 47,40 % für EPA zwar geringer (Erhöhung des mittleren KPD um 13,10 ± 10,61 % für

DHA und 7,55 ± 6,08 % für EPA), doch war der Unterschied in beiden Fällen nicht

signifikant. Die durch die mehrfach ungesättigten Fettsäuren hervorgerufene Vasodilatation

ist also höchstens zu einem kleinen Teil durch NO vermittelt.

0

10

20

30

40

50

60

0 1000 2000 3000 4000 5000

EPA

EPA + NArg

0

10

20

30

40

50

0 1000 2000 3000 4000 5000

DHA

DHA + NArg

Abb. 3-10: Konzentrations-Wirkungskurve von EPA und DHA mit (n=4) und ohne (n=5) NArg

(100 % = Vasodilatation durch 1 µM Cromakalim).

Vasodilatation [%]

Konzentration [nM]

Konzentration [nM]

Vasodilatation [%]

27

Es wurde bereits erwähnt, dass die Bildung von vasoaktiven Prostanoiden aus PUFAs einen

wichtigen vasorelaxatorischen Mechanismus darstellen könnte. Da sowohl EPA und DHA

genauso wie AA durch Zyklooxygenasen umgebaut werden, müsste der Effekt durch COX-

Hemmer beeinflussbar sein. Um dies zu überprüfen wurde der COX-Inhibitor Indometacin

zu den Lösungen hinzugegeben (Abb. 3-11).

Abb. 3-11: Indometacin verringert nicht die DHA-vermittelte Vasodilatation.

Interessanterweise konnte keine Beeinflussung der vasodilatativen Wirkung von DHA

beobachtet werden. Dasselbe galt für eine Kontrolluntersuchung, bei der eine Vasodilatation

mit 9 µM AA hervorgerufen wurde und anschließend 10 µM Indometacin hinzugegeben

wurde. Bei dem akuten vasorelaxatorischen Effekt von AA und DHA scheint also auch die

COX nicht beteiligt zu sein. Auch dies erscheint angesichts der Annahme nicht überraschend,

dass die Fettsäulen zunächst mit membranständigen Strukturen in Wechselwirkung treten,

bevor sie im Zytosol weiterer Konversion unterliegen (vgl. Kap. 4). Letztendlich ließ sich

auch bei EPA und DHA (je 10 µM) ein KATP-Kanal-vermittelter Effekt ausschließen, indem

Glibenclamid (2 µM) hinzugegeben und keine Reduktion der Relaxation festgestellt wurde.

DHA 10 µM

DHA 10 µM +

Indometacin 10 µM DHA 5 µM

60 -

KPD [mmHg]

Zeit [s] 5000

Indometacin 10 µM

4000 6000 0 -

28

3.4 Anandamid und Arachidonsäure

Wie bereits erwähnt konnte von Grainger et al. 2001 ein relaxatorischer Effekt des

Endocannabinoids Anandamid auf durch U46619 (TXA2-Analogon) präkontrahierte

Koronararterienringe von Schafen nachgewiesen werden. Auch in früheren Versuchen war

eine Vasodilatation beschrieben worden. Die von Grainger et al. beobachtete Relaxation

zeigte jedoch eine starke Reduktion unter Indometacin-Zusatz: bei Anandamid-

Konzentrationen bis zu 5 µM wurde die Vasodilatation durch 10 µM Indometacin praktisch

komplett aufgehoben. Falls sich dies an unserem Modell des isoliert perfundierten

Meerschweinchenherzens bestätigen ließe, würde dies einen wesentlichen Unterschied zu den

anderen getesteten Lipiden darstellen, deren Effekt nicht unmittelbar von der

Prostanoidsynthese abhängig zu sein scheint. Vor allem der fehlende Effekt von Indometacin

auf AA-induzierte Gefäßerweiterung lässt an einer direkten COX-vermittelten

Anandamidreaktion zweifeln.

Anandamid (n=4) und AA (n=5) wurden analog zu den anderen Testsubstanzen in

unterschiedlichen Konzentrationen appliziert, bis ein Steady state erreicht wurde. Es zeigte sich

eine maximale Vasodilatation von 55,80 ± 2,57 % für Anandamid und 40,37 ± 12,51 % für

AA in einer Konzentration von je 10 µM, während Konzentrationen von 20 µM keine weitere

Verstärkung der KPD-Reduktion zeigten. Ausserdem wurden einzelne Lösungen mit Zusatz

von 10 µM Indometacin getestet und die mittlere Druckdifferenz ausgewertet (Abb.3-12).

29

Abb. 3-12: Anandamid 5 µM erzeugt unabhängig von Indometacin 10 µM eine ausgeprägte

Vasodilatation.

Auch in diesem Falle ließ sich bestätigen, dass Indometacin keinen Einfluss auf den von

Anandamid hervorgerufenen Effekt hatte. Glibenclamid [2 µM] wurde ebenfalls in jeweils

einem Experiment zu Anandamid und AA hinzugegeben und bewirkte keine Änderung des

KPD (Abb. 3-13).

Anandamid 5 µM

Anandamid 5 µM +

Indometacin 10 µM

0 -

60 -

1000 2000 3000 Zeit [s]

KPD [mmHg]

30

Abb. 3-13: Während 2 µM Glibenclamid den Cromakalim-Effekt blockiert, wird die durch 10 µM

AA hervorgerufene Dilatation nicht beeinflusst.

Es kann angenommen werden, dass mechanosensitive Kaliumkanäle der TREK/TRAAK

Familie hierbei beteiligt waren (s. Kap. 4). Da vor allem die TREK-Kanäle durch das

Lokalanästhetikum Bupivacain blockiert werden, sollte dies in den folgenden Versuchen

überprüft werden. Zuvor soll jedoch eine zusammenfassende Evaluation der bislang

gesammelten Messdaten der vasodilatatorischen Wirkung der getesteten Lipide durch

nachfolgende Tabelle geliefert werden (Abb. 3-14).

Zeit [s]

KPD [mmHg]

10

60

1000 2000 3000

Cromakalim 1 µM

Glibenclamid 2 µM Glibenclamid 2 µM

AA 10 µM

0

31

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

OA (cyclo)

OA (cyclo) + NArg

EPA

EPA + NArg

DHA

DHA + NArg AA

Anandamid

c [nM]

Abb. 3-14: Mittlere Konzentrationen, die für 10 %ige Vasodilatation benötigt werden. (NArg =

Zusatz von 10 µM Nitroarginin; weitere Erläuterungen siehe Text)

In der Statistik sind die jeweils benötigten Konzentrationen der einzelnen Lipide angegeben,

um eine 10 %ige Vasodilatation zu erreichen. Es handelt sich hierbei um theoretisch

errechnete Konzentrationen, welche durch Interpolation der gemessenen Mittelwerte durch

logarithmische Funktionen errechnet wurden. Die Korrelationkoeffizienten (R²) dieser

logarithmischen Funktionen betrugen 0,93 für OA+Zyklodextrin; 0,72 für

OA+Zyklodextrin+NArg; 0,97 für EPA; 0,98 für EPA+NArg; 0,96 für DHA; 0,98 für

DHA+NArg (vgl. auch Abb. 3-10); 0,87 für Arachidonat und 0,93 für Anandamid. Die

niedrigeren Korrelationskoeffizienten haben nichts mit den Konfidenzintervallen zu tun,

welche beispielsweise bei DHA+Narg trotz besserem R² größer waren als bei OA+Narg (vgl.

Abb. 3-10 mit Abb. 3-6); vielmehr ist die Kurve für OA+NArg so flach, dass sie

bedauerlicherweise nicht gut mit einer logarithmischen Funktion abzubilden ist. Der

Vergleichbarkeit halber wurde dies dennoch einer polynomischen Darstellung bevorzugt. Zu

beachten ist weiterhin, dass in der Abbildung die kleineren Balken einen stärkeren Effekt

darstellen!

32

3.5 Bupivacain zeigt einen stereoselektiven Effekt auf den koronaren Vasotonus

Bupivacain ist ein weit verbreitetes Lokalanästhetikum vom Amid-Typ; im Gegensatz zu

Lidocain hält die anästhetische Wirkung jedoch länger an (ca. 6 statt 3 Stunden). Graf et al.

(1997, 2001 & 2002) gelang es, bei der Messung der AV-Überleitungszeit eine deutliche

stereoselektive Reduktion durch Bupivacain-Isomere im Bereich klinischer Konzentrationen

(5 bis 10 µM) nachzuweisen. Des weiteren wurden ein negativ inotroper Effekt und eine

Reduktion des Koronarflusses beobachtet. Iida et al. (2001) haben beschrieben, dass R-

Bupivacain und razemisches Bupivacain cerebrale piale Arteriolen von Hunden dilatierten, S-

Bupivacaine diese jedoch verengten. Eine mögliche stereoselektive Blockade von TREK- und

TASK-Kanälen könnte hierbei eine wichtige Rolle spielen.

In unseren Experimenten verwendeten wir einerseits Bupivacain-Razemat (n=6) und

andererseits die reinen R- und S-Isomere (jeweils n=5) von Bupivacain. Da das Razemat

einen deutlichen biphasischen Effekt mit einer Vasodilatation gefolgt von einer Konstriktion

zeigte, sollte dieser Effekt durch die verschiedenen Isomere weiter unterschieden werden

(Abb. 3-15 und 3-16).

Abb. 3-15: Bupivacain-Razemat (200 µM) generiert einen biphasischen Effekt.

Bupivacain 200 µM

10 -

60 -

KPD [mmHg]

Zeit [s] 1500 2000

33

Abb. 3-16: R- und S-Bupivacain [100 µM] zeigen unterschiedliche Effekte auf den Vasotonus.

Zugabe von R-Bupivacain in verschiedenen Konzentrationen bewirkte eine eindeutige

Vasodilatation mit einem Maximum von 72,11 ± 3,61 % bei 1 mM, während Razemat und S-

Bupivacain einen zweiphasigen Verlauf zeigten. Bei hochdosierter Applikation von S-

Bupivacain kam es zunächst zu einer schnellen Dilatation, gefolgt von einer länger

anhaltenden Konstriktion. In der Auswaschphase kam es zu einer Umkehrung dieses

Effektes, d.h. es kam zunächst zu einer starken Vasokonstriktion und der ursprüngliche

Perfusionsdruck wurde erst nach einer länger anhaltenden Reperfusion mit Bupivacain-freier

Lösung erreicht (862 ± 187 Sekunden bei S-Bupivacain). Bei niedrigeren Konzentrationen

von S-Bupivacain verringerte sich die schnelle Vasodilatation, während die langsamere

Vasokontriktion erhalten blieb (s. Abb. 3-17). Die für die Konzentrations-Wirkungs-Kurve

verwendeten Werte wurden registriert, nachdem sich auch die Vasokonstriktion voll entfaltet

hatte und ein Steady state erreicht wurde. Wegen der begrenzten Verfügbarkeit der Bupivacain-

Isomere wurde die Kurve nur für niedrige Dosisbereiche erstellt und die maximale Dilatation

separat durch Gabe von 1 mM R- bzw. S-Bupivacain gemessen. Diese Maximaldosis konnte

aus der Dosis-Effekt-Kurve von razemischem Bupivacain (siehe Abb. 3-17) abgelesen werden

und der Effekt entsprach bei R-Bupivacain und razemischem Bupivacain der durch

Zeit [s]

KPD [mmHg]

1000 2000 3000

10 -

60 -

R-Bupivacain 100 µM S-Bupivacain 100 µM Cromakalim 1 µM

0

34

-40

-20

0

20

40

60

80

1 10 100

R-Bupivacaine S-Bupivacaine

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 10 100 1000

Bupivacain (Razemat)

Cromakalim oder Hypoxie hervorgerufenen maximalen Vasodilatation (siehe Abb. 3-2).

Dennoch wurden selbstverständlich auch hier bei jedem Experiment alle vasodilatativen

Einflüsse in Bezug auf die Cromakalim-vermittelte Vasodilatation gesetzt. Die so gemessene

maximale Vasodilatation betrug 39,85 ± 8,12 % für S-Bupivacain [1 mM] im Vergleich zu

70,65 ± 1,48 % für razemisches Bupivacain [1 mM].

Abb. 3-17: Konzentrations-Wirkungs-Kurven von R- und S-Bupivacain: Während bei R-

Bupivacain ebenso wie bei razemischem Bupivacain die schnelle Vasodilatation bei allen

Konzentrationen im Vordergrund steht, führen niedrigere Dosen von S-Bupivacain zur langsamen

Vasokonstriktion (100 % = Vasodilatation durch 1 µM Cromakalim).

Die durch S-Bupivacain hervorgerufene Vasokonstriktion zeigte ihr maximales Ausmaß bei

einer Konzentration von 25 µM, während der dilatatorische Effekt bei 50 µM genau

ausgeglichen wurde.

Konzentration [µM] Konzentration [µM]

Vasodilatation [%]

Vasodilatation [%]

35

3.6 S-Bupivacain inhibiert die PUFA-bedingte Vasodilatation

Falls die durch Fettsäuren hervorgerufene Vasodilatation über den gleichen Mechanismus

ihre Wirkung entfaltet wie S-Bupivacain, könnten die Effekte bei gleichzeitiger Applikation

teilweise aufgehoben werden. Es wurden deshalb Versuche mit EPA oder DHA und S-

Bupivacain durchgeführt, wobei für S-Bupivacain die maximal Wirksame Konzentration von

25 µM gewählt wurde.

Abb. 3-18: S-Bupivacain (25 µM) hebt die PUFA-induzierte Vasodilatation selbst bei

verhältnismäßig hohen Konzentrationen zum größten Teil auf.

Es wurden jeweils vier Versuche mit EPA und DHA in Konzentrationen von 10 und 100 µM

durchgeführt.

In Gegenwart von 25 µM S-Bupivacain war die durch EPA oder DHA induzierte

Vasodilatation fast vollständig unterdrückt: In Konzentrationen von 10 bzw. 100 µM betrug

die durch EPA ausgelöste Vasodilatation nur noch nur noch 86,4 ± 8,8 % bzw. 73,3 ± 5,0 %;

die durch DHA ausgelöste Vasodiatation betrug nur noch 82,1 ± 9,8 % bzw. 76,1 ± 5,5 %.

Zeit [s]

KPD [mmHg]

10 -

60 -

2000 3000

S-Bupivacain 25 µM

DHA 10 µM

36

0

10

20

30

40

50

60

7 0

80

90

100

EPA DHA

10 µM

100 µM

Abb. 3-19: Prozentuelle Reduktion der PUFA-vermittelten koronaren Vasodilatation durch 25 µM

S-Bupivacain.

Es zeigte sich also, dass DHA und EPA eine Vasodilatation über einen Mechanismus

bewirken, der größtenteils durch S-Bupivacain blockiert werden kann.

Effekteduktion [%]

37

K a p i t e l 4

DISKUSSION

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass Lipide mit ein oder mehr Doppelbindungen in der

Lage sind, konzentrationsabhängig dilatatorischen Einfluss auf das koronare Gefäßsystem

auszuüben. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren übten einen stärkeren Effekt aus als die einfach

ungesättigte Ölsäure. Wie wir bereits in Kapitel 1 angesprochen haben, gelten TREK- und

TRAAK-Kanäle klassischerweise als mechanosensitive Kanäle; neuerdings ist auch für andere

2P-Kaliumkanäle wie TASK-2 eine solche Sensitivität nachgewiesen worden (Niemeyer et al.

2001). Die Idee dass die Dehnung der Zellmembran eine wichtige Rolle in der Aktivierung

dieser Kanäle spielen könnte, wurde durch die Beobachtung gestützt, dass die

Kanalaktivierung abhängig vom Zellvolumen ist (Han et al. 2003). Durch die strukturelle

Asymmetrie der PUFAs wird im Gegensatz zu gesättigten Fetten eine mechanische Alteration

der Zellmembran hervorgerufen, deren Effekte z.B. mit einer osmotischen Zellschwellung

vergleichbar sind (Patel et al. 2001, Pannicke et al. 2004 und 2006). Somit besteht ein direkter

Zusammenhang mit Lipidkonzentration und mechanischer und der Aktivierung von

Kaliumkanälen sowie von nicht-selektiven Kationenkanälen.

Unveresterte Fettsäuren stellen häufig vorkommende und damit wichtige Metaboliten im

menschlichen Organismus dar, insbesondere in Organen mit hohem Energieverbrauch wie

dem Herzen. Um in die Zielzelle zu gelangen muss die Fettsäure als erstes in die äußere

Lipidschicht der Plasmamembran aufgenommen werden; dies kann nur geschehen, wenn die

Fettsäure von dem jeweiligen Transportprotein (Albumin, Zyklodextrin etc.) losgelöst wird.

Da freie Fettsäuren eine polare Carboxylgruppe besitzen, stellt als zweites die Überwindung

der Lipid-Doppelschicht eine wichtige Barriere dar, bevor die Fettsäure in den zytosolischen

Teil der Membran gelangen kann. Schließlich muss die Fettsäure noch aus der

Innenmembran in das Zytosol gelöst (d.h. desorbiert) werden. Keiner dieser drei Schritte ist

bislang zufriedenstellend erforscht worden, wobei jedoch angenommen wird dass

unterschiedlichste Proteinsysteme für den Transfer verantwortlich sind (Sousa et al. 2001,

Spector 1986). Während diese Proteinsysteme und zum Beispiel Albuminrezeptoren in

mehreren Jahrzehnten zunehmend besser erforscht worden sind, schienen die meistens

Unklarheiten bis vor kurzem noch im zweiten Schritt, nämlich der Transmembranpassage, zu

bestehen. Unter anderem am Beispiel von Oleinsäure gelang es Kamp et al. (1992, 1993 &

38

1995) nachzuweisen, dass diese Fettsäure sehr schnell passiv durch die Lipid-Doppelschicht

gelangen konnte. Dieser passive Mechanismus wird auch als flip flop bezeichnet und kann

leicht durch pH-Messungen nachgewiesen werden: da eine Fettsäure nur mit protoniertem

Carboxylterminus spontan durch die lipophile Schicht zu wandern vermag, kommt es

extrazellulär zu einem Protonenverlust und intrazellulär zu einem entsprechenden pH-Abfall,

welcher in vielen Versuchen innerhalb von Millisekunden registriert worden ist. Hiermit lässt

sich auch eine mögliche Verknüpfung zu pH-sensitiven Kanälen wie beispielsweise den

TASK-Kanälen herstellen, welche unter anderem durch Bupivacain blockiert werden und im

Herzen nachgewiesen worden sind; dieser Zusammenhang sollte andererseits angesichts der

Tatsache, dass auch der extrazelluläre pH-Wert bei der Regulation von TASK-Kanälen eine

wichtige Rolle spielt, nicht überbewertet werden. In Rattenherzen wurde eine höhere

Expression von TASK-1 in den Vorhöfen festgestellt, während TREK-1 in den Ventrikeln

stärker exprimiert wurde (Liu et al. 2004); andererseits haben Untersuchungen von Lesage et

al. ergeben, dass TREK-1-, TREK-2- und TRAAK-Kanäle zwar häufig im menschlichen

ZNS zu finden sind, im Herzgewebe jedoch fehlen. In welchem Ausmaß diese Kanäle in

menschlichen Koronarien anzutreffen sind, ist noch Gegenstand der Diskussion. Interessant

ist auch die mögliche Aktivierung von TASK-1-Kanälen, deren Existenz im Mäuseherzen

durch Graham et al. (2006) belegt worden ist und die sowohl durch extra- wie auch durch

intrazellulären pH-Abfall blockiert werden können (Kim et al. 1999)

Das Lokalanästhetikum Bupivacain findet in der modernen Medizin eine weite Verbreitung.

Die Substanz existiert in zwei verschiedenen stereoisomeren Formen, nämlich R(+)- und S(-)-

Bupivacain, deren spezifischer Einfluss auf Kaliumkanäle bereits seit über zehn Jahren

erforscht wird (Valenzuela et al. 1995). Aufgrund der angeblich geringeren Toxizität von S-

Bupivacain auf Herz und ZNS im Falle einer versehentlichen intravenösen Injektion sind in

den letzten Jahren mehrere Studien zu den stereoselektiven Mechanismen von Bupivacain

veröffentlicht worden. Bereits in frühen Studien wurde nachgewiesen, dass der durch

Bupivacain produzierte und klassischerweise für den Wirkungsmechanismus von

Lokalanästhetika verantwortlich gemachte Effekt einer Na+-Kanal-Blockade keinerlei

Stereoselektivität zeigt (Nau et al. 1999). Die Auswirkungen der bereits seit langem

nachgewiesenen Kaliumkanalblockade sind ebenso wie ihre Bedeutung im Bereich der

Lokalanästhesie trotz intensivierter Forschung im Vergleich zu den lang etablierten Modellen

im Bereich der Natriumkanalforschung eher schleierhaft geblieben. Durch die

richtungsweisende Forschung von C. Kindler und Kollegen (1999 und 2003) konnte erstmals

39

ein spezifischer Effekt von S-Bupivacain auf den Tandem-Kaliumkanal TASK-2

nachgewiesen werden; in diesen Versuchen ließen sich schwächere Effekte auch auf andere

Kanäle und Membranproteine feststellen (TASK, TREK-1, TOK1, ORK1 und TWIK-1).

Biphasische – das heisst kombiniert vasokonstriktorisch und dilatatorisch wirkende – Effekte

von Bupivacain wurden parallel zu unserer Arbeitsgruppe auch von Newton et al. (2005)

berichtet, wobei jedoch nicht auf die Stereoselektivität eingegangen wurde. Des weiteren

sahen wir uns in unserer Arbeit durch die Ergebnisse von Punke et al. (2003) bestätigt, bei der

eine Inhibition von TREK-1-Kanälen durch Bupivacain nachgewiesen wurde; auch hier

fehlten jedoch ergänzende Untersuchungen zur Stereoselektivität. Die vorliegende Arbeit soll

dazu dienen, ein weiteres Kapitel im Bezug auf den stereoselektiven Einfluss von Bupivacain

auf Tandemporen-Kaliumkanäle und deren Modulation durch mehrfach ungesättigte

Fettsäuren aufzuschlagen.

Die von uns gemessenen Daten zur Quantifizierung der Vasodilatation der jeweiligen Lipide

stimmen erstaunlich gut mit der von Fink et al. 1998 gemessenen Aktivierung der TRAAK-

Ströme überein. Es konnte daher sein, dass neben TREK Kanälen auch TRAAK-Kanäle eine

Rolle in der vasodilatatorischen Wirkung von PUFAs spielten. Obwohl die Expression von

TRAAK-Kanälen im Gefäßsystem bereits in mehreren Arbeiten belegt worden ist, scheinen

diese Kanäle nicht direkt in der glatten Muskulatur exprimiert zu werden (Bryan et al. 2006).

Da eine TRAAK-Kanal-Blockade durch Bupivacain bislang nicht beschrieben worden ist,

bleibt die Rolle dieser Kanäle auch für uns zunächst schleierhaft. Dennoch ist – wie schon

mehrfach erwähnt – bekannt, dass TREK- und TASK-Kanäle durch Bupivacain blockiert

werden. Eine direkte Aktivierung von TREK- und TASK-Kanälen durch PUFAs ist damit

ebenso möglich wie eine von den Fettsäuren hervorgerufene intrazelluläre pH-Senkung mit

nachfolgender TASK-Kanal-Blockade. Auch ein weiterer Effekt kommt hier ins Spiel: wegen

der typischerweise hohen Konzentration von negativ geladenem Phosphatidylserin in der

inneren Membranlipidschicht werden sich die ebenfalls negativ geladenen Fettsäuren in einer

pH-neutralen Perfusionslösung bevorzugt in der äußeren Schicht ansammeln, was gerade

einen wichtigen Aspekt der mechanischen Stimulation bewirkt (Bergmann et al. 1984, Sheetz

et al. 1974 & 1976). Die nachfolgende Abbildung soll einen Überblick über die von uns

postulierten Wirkmechanismen von PUFAs auf die koronare Endothelzelle schaffen, wobei

als Beispielsubstanz DHA gewählt wurde.

40

Abb. 4-1, Postulierte Wirkung von PUFAs auf die koronare glatte Muskelzelle: Die

PUFA (hier DHA) gelangt über auf dem Blutweg sowohl zu den Endothelzellen als auch zu den

glatten Muskelzellen und lagert sich in beiden Fällen aufgrund ihrer negativen Ladung bevorzugt

in die äussere Zellmembran ein. Dort kommt es zu einer konvexen Verformung und zum

mechanischen Stimulus, wie in gewissem Maße auch bei osmotischer Zellschwellung (Panicke et

al. 2004 und 2006). Hierbei ist das Ausmaß des Stimulus antiproportional zum Grad der Sättigung

und proportional zur Kettenlänge der PUFA. Hierdurch werden mechanosensitive 4TMS/2P-

Kalium-Kanäle wie TREK und TASK aktiviert und führen über einen Kaliumausstrom zur

Hyperpolarisation der jeweiligen Zelle. Bei glatten Muskelzellen werden hierdurch

spannungsabhängige Calciumkanäle gehemmt, wodurch es zu einer Relaxation der glatten

Muskelzelle kommt. Im Falle der Endothelzelle verhält es sich umgekehrt: die Hyperpolarisation

bewirkt einen verstärkten Calciumeinstrom, der am ehesten durch sogenannte leak-Calciumkanäle

41

verursacht wird (von Beckerath et al. 1991 & 1996, Suzuki et al. 2001). Hierdurch kommt es zu

einer Aktivierung der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS), wodurch NO aus L-

Arginin gebildet und parakrin freigesetzt wird. In den glatten Muskelzellen aktiviert NO eine

Guanylatzyklase (GC), welche aus Guanosintriphosphat (GTP) zyklisches Guanosinmonophosphat

(cGMP) bildet. cGMP aktiviert seinerseits Proteinkinase G, welche zelluläre Proteine

phosphoryliert und so ebenfalls der Tonus der glatten Muskelzellen gesenkt wird.

Durch die in Abb.4-1 beschriebenen zwei Mechanismen könnte erklärt werden, weswegen ein

Teil der vasodilatatorischen Wirkung von PUFAs durch NO-Synthase-Inhibitoren

antagonisiert werden kann, während ein weiterer deutlich größerer Anteil durch den

Tandemkanalblocker S-Bupivacain aufgehoben wird.

Die durch Oleat und PUFAs sowie die durch Arachidonsäure und Anandamid bewirkte

Vasodilatation könnte auf eine Aktivierung von K2P Kanälen zurückzuführen sein. Die

Hemmung dieser Wirkungen durch S-Bupivacain könnte dann durch eine Blockade der K2P

Kanäle erklärt werden.

Außerdem haben R-Bupivacain und S-Bupivacain noch dilatatorische Wirkungen, die auf

einen anderen Mechanismus zurückzuführen sind. Es kommen dafür verschiedene

Möglichkeiten in Frage: direkte Wirkung auf die kontraktilen Proteine wie Verringerung der

Ca2+-Sensitivität (Ibarra et al. 2005; Mio et al. 2002), oder Wirkungen auf andere Zielproteine

(Oh et al. 2001; Lee et al. 1997).

Es ist anzunehmen, dass S-Bupivacain die Tandemkanäle sowohl im koronaren Endothel als

auch in der glatten Muskelzelle direkt blockiert, während der PUFA-bedingte Effekt

größtenteils indirekt über mechanische Stimulation stattfindet. Eine komplette Erklärung des

gesamten Phänomens kann jedoch auch durch dieses Modell noch nicht gewährleistet

werden, da es sich auf die selektive Einlagerung von negativ geladenen Carboxygruppen in

der äusseren Zellmembran stützt. Konsequenterweise müsste in unseren Experimenten das

weitestgehend unpolare Fettsäureamid Anandamid keinen wesentlichen vasodilatativen

Einfluss ausüben. Wie in Abbildung 3-14 unschwer zu erkennen ist, führt Anandamid

dennoch zu einer stärkeren Vasodilatation als das polarere Arachidonat. Auch konnte die

maximale PUFA-induzierte Vasodilatation nie durch selbst hohe Konzentrationen von S-

Bupivacain komplett aufgehoben werden. Es muss daher angenommen werden dass noch

weitere Mechanismen der Vasodilatation insbesondere bei Anandamid eine wichtige Rolle

spielen müssen. Die wichtige Rolle der Cannabinoidrezeptoren in diesem Zusammenhang

42

darf dabei selbstverständlich auch nicht unterschätzt werden; die klassischen CB1- und CB2-

Rezeptoren scheinen dabei im Endothel einen eher untergeordneten Effekt zu zeigen,

während die neuerdings häufig diskutierten non-CB1-/non-CB2-Rezeptoren und Vanilloid-

Rezeptoren bei der Cannabinoid-induzierten Vasodilatation im Vordergrund zu stehen

scheinen (Lamontage et al. 2006, Dannert et al. 2006). Bei PUFAs scheinen nicht durch S-

Bupivacain blockierbare vasodilatatorische Effekte einen zwar geringeren aber dennoch nicht

von der Hand zu weisenden Stellenwert zu haben.

Wir haben zeigen können, dass mehrfach ungesättigte Fettsäuren eine stärkere Aktivierung

der Vasodilatation bewirken als die einfach ungesättigte Oleinsäure. Dieser Effekt zeigte eine

mäßige Abschwächung durch den NO-Synthase-Inhibitor Nitroarginin, wodurch eine

Beteiligung von Stickstoffmonoxid an der Vasodilatation postuliert werden kann. Im

Gegensatz zur Cromakalim-induzierten Vasodilatation, welche wir als Qualitätstest für die

Experimente benutzten, konnte bei den getesteten Fettsäuren ebenso wie bei ihrem Amid

Anandamid sowie beim Lokalanästhetikum Bupivacain die Beteiligung von ATP-abhängigen

Kaliumkanälen ausgeschlossen werden. Eine wegen der Verwendung von Arachidonsäure

und ihrer Derivate nahegelegte Beteiligung von COX-Enzymen wurde ebenfalls nicht

bestätigt. Anstatt dessen zeigte der nach heutigem Kenntnisstand selektive TASK-2-Kanal-

Blocker S-Bupivacain eine starke Reduktion der durch EPA und DHA hervorgerufenen

Vasodilatation (Kindler et al. 2003). Während es aufgrund mangelnder Forschungsergebnisse

durchaus möglich ist, dass durch S-Bupivacain auch andere Tandemkanäle blockiert werden

können, ist eine Beteiligung von Natriumkanälen wegen der fehlenden Stereoselektivität

praktisch ausgeschlossen. Wir gehen somit davon aus, dass die 2P-Kaliumkanäle essentiell an

der durch PUFAs verursachten Vasodilatation beteiligt sind. Weitere Forschungen müssen

noch ergeben, ob noch andere Kanäle zu diesem Effekt beitragen bzw. durch S-Bupivacain

blockiert werden. Angesichts der hohen Erwartungen bezüglich der gesundheitsfördernden

Wirkung von Fischölen werden diese Forschungen mit Sicherheit nicht lange auf sich warten

lassen. Unserer Ansicht nach ist mit der vorliegenden Arbeit ein wichtiger Schritt auf dem

Weg zur Aufschlüsselung der hierbei zugrunde liegenden Phänomene gelungen.

43

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consequences. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 1997 Jul;57(1):85-93.

122. Wiley KE, Davenport AP: Comparison of vasodilators in human internal

mammary artery: ghrelin is a potent physiological antagonist of

endothelin-1. Br J Pharmacol. 2002 Aug;136(8):1146-52.

123. Wray S, Smith RD: Mechanisms of action of pH-induced effects on vascular

smooth muscle. Mol Cell Biochem. 2004 Aug;263(1-2):163-72.

124. Wu G, Thompson JR: Arachidonic acid, prostaglandin E2 and F2 alpha inhibit

leucine degradation in chick skeletal muscle. Biochem Int. 1988 Feb;16(2):227-

34.

A

VERZEICHNIS AKADEMISCHER LEHRER

Meine Akademischen Lehrer waren folgende Damen/Herren in Marburg:

Herr Prof. Dr. Peter Barth

Herr Prof. Dr. Dr. Heinz-Dieter Basler

Herr Prof. Dr. Thomas Behr

Herr Dr. Michael Bieker

Herr Prof. Dr. Yalcin Cetin

Herr Prof. Dr. Dr. Jürgen Daut

Frau Prof. Dr. Rita Engenhart-Cabillic

Herr PD Dr. Marcus Groß

Herr Prof. Dr. Andrej Hasilik

Herr PD Dr. Marc Kalinowski

Herr Prof. Dr. Klaus Jochen Klose

Herr Prof. Dr. Jan Koolman

Herr Prof. Dr. Ernst Lang

Herr Prof. Dr. Roland Lill

Herr Dr. Ulrich Rausch

Herr Prof. Dr. Klaus-Heinrich Röhm

Frau Prof. Dr. Birte Steiniger

Herr Prof. Dr. Gerhard Sturm

Herr Dr. Eduard Walthers

Herr Prof. Dr. Eberhard Weihe

Herr Prof. Dr. Jochen Alfred Werner

B

DANKSAGUNGEN/WIDMUNGEN

Der Autor bedankt sich bei seinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Dr. Jürgen Daut und bei allen

seinen Kollegen vom Institut für Normale und Pathologische Physiologie für die freundliche

Hilfsbereitschaft, die sie ihm während seiner Forschungen entgegenbrachten. Besonders zu

erwähnen sind Herr Dr. Peter John Hanley für seine stetige Assistenz und Beratung ihm Rahmen

der einzelnen Versuche sowie Herr Dr. Boris Musset für seine kollegiale Zusammenarbeit im

gleichen Labor. Meinen anderen Labor- und Arbeitspartnern einschließlich Frau Susanne Bamerny,

Herrn Martin Bremke, Frau Brigitte Burk, Frau Andrea Hetzel, Frau Prof. Dr. Birgit Liss, Frau Dr.

Regina Preisig-Müller, Frau Dr. Caroline Putzke, Herrn Vijayaram Kumar Renigunta, Herrn Prof.

Dr. Jochen Röper und Herrn Dr. Günter Schlichthörl möchte ich ebenfalls herzlich für Ihre

freundliche Kooperation danken. Für die Bereitstellung von Koronarendothelzellen gebührt der

Dank der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Klaus-Dieter Schlüter vom Physiologischen Institut Gießen.

Meiner Lebensgefährtin Mechthild Schmitt möchte ich für ihre seelische Unterstützung und ihrer

Hilfe bei der Erstellung der abgebildeten chemischen Formeln danken.