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Aus dem Institut für Hygiene und Umweltmedizin (Direktor ... · reihenförmig angeordneten...

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Aus dem Institut für Hygiene und Umweltmedizin (Direktor Univ.-Prof. Dr. med. Axel Kramer) der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald Prävalenz von MRSA und ESBL-bildenden E. coli bei landwirtschaftlichen Mitarbeitern und Nutztieren in Mecklenburg-Vorpommern Inaugural Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin in den Medizinwissenschaften (Dr. rer. med.) der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald 2016 vorgelegt von: Carmen Dahms geb. am: 18.02.1986 in: Kirn
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Aus dem Institut für Hygiene und Umweltmedizin

(Direktor Univ.-Prof. Dr. med. Axel Kramer)

der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Prävalenz von MRSA und ESBL-bildenden E. coli bei

landwirtschaftlichen Mitarbeitern und Nutztieren in

Mecklenburg-Vorpommern

Inaugural – Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktorin in den Medizinwissenschaften

(Dr. rer. med.)

der

Universitätsmedizin

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2016

vorgelegt von: Carmen Dahms

geb. am: 18.02.1986

in: Kirn

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Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Max P. Baur

1. Gutachter: Prof. Dr. med. Axel Kramer

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Christa Ewers

Ort, Raum: Greifswald, Institut für Immunologie und Transfusionsmedizin,

Seminarraum J 04.33/34

Tag der Disputation: 03.04.2017

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„Es gibt keine wissenschaftliche Barriere zwischen Veterinär- und Humanmedizin,

noch sollte es eine geben; die Erfahrung der einen muss gebraucht werden für die

Entwicklung der anderen.“

Rudolf Ludwig Karl Virchow (1821–1902)

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Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................

1. Einleitung und Problemstellung .......................................................................... 1

1.1 Problemstellung .............................................................................................. 1

1.2 Angaben zur Tierhaltung in Mecklenburg-Vorpommern.............................. 3

1.3 Staphylococcus aureus und Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) ....... 4

1.3.1 Staphylococcus aureus.......................................................................................... 4

1.3.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) ........................................... 5

1.3.3 Epidemiologie von MRSA beim Menschen ............................................................ 6

1.3.4 Epidemiologie von MRSA bei Tieren ....................................................................10

1.4 Escherichia coli und Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL) ............. 13

1.4.1 Escherichia coli ....................................................................................................13

1.4.2 Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL) ...........................................................14

1.4.3 Epidemiologie von ESBL-bildenden E. coli beim Menschen..................................18

1.4.4 Epidemiologie von ESBL-bildenden E. coli bei Tieren ...........................................20

1.4.5 Zoonotische Bedeutung von ESBL-bildenden E. coli ............................................23

1.5 Nachweismethoden von MRSA und ESBL-bildenden E. coli .................... 25

1.5.1 Screening mittels kultureller Anzucht ....................................................................25

1.5.1.1 S. aureus und MRSA ......................................................................................25

1.5.1.2 E. coli und ESBL ............................................................................................27

1.5.2 Molekularbiologische Methoden zur Typisierung von MRSA und ESBL-

bildenden E. coli ............................................................................................................29

1.5.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) ...................................................................29

1.5.2.2 Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) ..........................................................30

1.5.2.3 spa-Typisierung von S. aureus .......................................................................31

1.5.2.4 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) .................................................................31

1.5.2.5 Ganzgenomsequenzierung ............................................................................32

1.5.2.6 DNA-Sequenzierung nach Sanger .................................................................32

2. Eigene Untersuchungen .................................................................................... 33

2.1 Material ........................................................................................................... 33

2.1.1 Geräte und Materialien .........................................................................................33

2.1.2 Software und Internetseiten ..................................................................................35

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2.2. Methoden ...................................................................................................... 37

2.2.1 Studientyp, -region und -umfang, Kooperationspartner und Datenschutz .............37

2.2.2 Probennahme und -transport ................................................................................38

2.2.2.1 Probennahme ................................................................................................38

2.2.2.2 Probentransport .............................................................................................39

2.2.3 Bakteriologische Untersuchungen ........................................................................40

2.2.3.1 MRSA ............................................................................................................40

2.2.3.2 ESBL-bildende E. coli .....................................................................................41

2.2.4 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung ..............................43

2.2.4.1 MRSA ............................................................................................................43

2.2.4.2 ESBL-bildende E. coli .....................................................................................44

2.2.5 Statistische Analyse .............................................................................................44

2.3 Ergebnisse ..................................................................................................... 46

2.3.1 Studienpopulation .................................................................................................46

2.3.1.1 Untersuchte Landwirte ...................................................................................46

2.3.1.2 Untersuchte landwirtschaftliche Betriebe ........................................................47

2.3.2 Vorkommen von MRSA ........................................................................................50

2.3.2.1 Mitarbeiter ......................................................................................................50

2.3.2.2 Staubproben landwirtschaftlicher Betriebe .....................................................53

2.3.2.3 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung ........................55

2.3.3 Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli ...............................................................59

2.3.3.1 Mitarbeiter ......................................................................................................59

2.3.3.2 Kot-/ Sockenproben landwirtschaftlicher Betriebe ..........................................61

2.3.3.3 Molekularbiologische Untersuchungen ...........................................................64

2.3.4 MRSA- und ESBL-Status der Mitarbeiter und Betriebe .........................................69

3. Diskussion .......................................................................................................... 70

3.1 Material und Methoden ................................................................................. 70

3.1.1 Studienpopulation, Betriebsfragebögen und statistische Auswertung ...................70

3.1.2 MRSA ...................................................................................................................71

3.1.3 ESBL-bildende E. coli ...........................................................................................73

3.2 Vorkommen von MRSA ................................................................................. 76

3.2.1 Mitarbeiter ............................................................................................................76

3.2.2 Schweinebetriebe .................................................................................................78

3.2.3 Rinder- und Geflügelbetriebe ................................................................................80

3.2.4 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung ..............................80

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3.2.5 Zoonotisches Potential .........................................................................................84

3.3 Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli .................................................... 86

3.3.1 Mitarbeiter ............................................................................................................86

3.3.2 Schweinebetriebe .................................................................................................88

3.3.3 Rinderbetriebe ......................................................................................................90

3.3.4 Geflügelbetriebe ...................................................................................................91

3.3.5 Zoonotisches Potential .........................................................................................94

3.4 Co-Kolonisation MRSA und ESBL-bildende E. coli .................................... 98

3.5 Ausblick ......................................................................................................... 99

4. Zusammenfassung ........................................................................................... 102

5. Summary ........................................................................................................... 105

Literaturverzeichnis.............................................................................................. 108

Tabellenverzeichnis.............................................................................................. 128

Abbildungsverzeichnis ........................................................................................ 129

Anhang .................................................................................................................. 130

Anlage 1: Probandeninformation für das MRE-Screening bei Mitarbeitern in der

Tierhaltung .......................................................................................................... 130

Anlage 2: Merkblätter zur Probenentnahme ........................................................ 133

Anlage 3: Beprobungsbögen mit Kennzahlen zu den Betrieben ......................... 136

Zusätzliche Tabellen ........................................................................................... 138

Publikationen ....................................................................................................... 142

Eidesstattliche Erklärung ..................................................................................... 143

Danksagung ........................................................................................................ 144

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Abkürzungsverzeichnis

aacA-aphD Gen für Gentamicinresistenz

A. baumanii Acinetobacter baumanii

Abb. Abbildung

adk Gen für Adenylatkinase

AmpC β-Laktamasen, nicht durch β-Laktamase-Inhibitoren hemmbar

APEC Avian pathogenic E. coli

bla Gen für ESBL-Resistenz

bspw. beispielsweise

BORSA Borderline Oxacillin-resistente S. aureus

BURP Based Upon Repeat Pattern

° C Grad Celsius

ca. circa

CA-MRSA Community-associated Methicillin-resistente Staphylococcus

aureus

CC Klonaler Komplex

cfr Gen für Resistenzen gegen Phenicole, Oxazolidinone u.a.

CI Konfidenzintervall

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

cm Centimeter

CMY aktiv gegen Cephamycin

CTX-M Cefotaximase

DART Deutsche Antibiotikaresistenzstrategie

d. h. das heißt

DNA Desoxyribonukleinsäure

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EFSA European Food Safety Authority

EHEC Enterohämorrhagische E. coli

erm Gen für MLSB-Resistenz (erythromycin-resistant methylase)

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ESBL Extended-spectrum β-Laktamase

et al. et alii

E-Test Epsilometer Test

EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

FG Fachgebiet

fumC Gen für Fumerathydratase

g Gravitationsbeschleunigung

ggf. gegebenenfalls

h Stunde(n)

HA-MRSA Hospital-associated Methicillin-resistente Staphylococcus aureus

HUS Hämorrhagisch-urämisches Syndrom

icd Gen für Isocitrat-/Isopropylmalat-Dehydrogenase

Ig Immunglobulin

IHU Institut für Hygiene und Umweltmedizin

K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae

KRINKO Kommission für Krankenhaushygiene und Infektionsprävention

am Robert Koch-Institut

l Liter

LALLF Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und

Fischerei

LA-MRSA Livestock-associated Methicillin-resistente Staphylococcus

aureus

LRO Landkreis Rostock

LU Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und Verbraucherschutz

luk-PV Gen für Panton-Valentin-Leukozidin

m Meter

MALDI-TOF MS Matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass

spectrometry

max. maximal

mcr Gen für Linezolidresistenz

mdh Gen für Malatdehydrogenase

mecA Gen für PBP2a, vermittelt Methicillinresistenz

mecC mecA-Homolog (70 %), vermittelt Methicillinresistenz

mg Milligramm

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MHK Minimale Hemmkonzentration

min Minuten

ml Milliliter

µl Mikroliter

MLS Makrolid-Lincosamid-Streptogramin

MLSB-Resistenz Makrolid-Lincosamid-Streptogramn B-Resistenz

MLST Multilocus-Sequenztypisierung

µm Mikrometer

mm Millimeter

MMA-Syndrom Mastits-Metritis-Agalaktie-Syndrom

mph(C) Gen für Makrolid-Resistenz

MRE Multiresistente Erreger

MRGN Multiresistente Gram-negative Erreger

MRSA Methicillin-resistente Staphylococcus aureus

MSE Landkreis Mecklenburgische Seenplatte

MSSA Methicillin-sensible Staphyloccocus aureus

MSTree Minimum Spanning Tree

MV Mecklenburg-Vorpommern

n Gesamtzahl

Nr. Nummer

nuc Gen für thermostabile Nuklease

n. z. nicht zuzuordnen

ORSA Oxacillin-resistente Staphylococcus aureus

OXA Oxacillinase

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

PBP/ PBP2a Penicillinbindendes Protein/ Penicillinbindendes Protein 2a

PCR Polymerasekettenreaktion

PFGE Pulsfeldgelelektrophorese

PMQR plasmid-mediated quinolone resistance

purA Gen für Adenylsuccinatdehydrogenase

PVL Panton-Valentin-Leukozidin

p-Wert Signifikanzwert

recA Gen für ATP/ GTP binding motif

RKI Robert Koch-Institut

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rRNA ribosomale Ribonukleinsäure

s Sekunden

S. aureus Staphylococcus aureus

SCCmec Staphylocoocal cassette chromosome mec

SHV sulfhydryl variable

spa Gen für Protein A

spp. Species pluralis

ST Sequenztyp in der MLST

STEC Shigatoxin-produzierende E. coli

u. a. unter anderem

t Tonnen

Tab. Tabelle

TEM Temoniera

TM Trade Mark, unregistrierte Warenmarke

tpi Gen für Triosephoshat Isomaerase

TSK Tierseuchenkasse

unveröff. unveröffentlicht

v. a. vor allem

VG Landkreis Vorpommern-Greifswald

vga(A) Gen für Resistenzen gegen Lincosamide, Pleuromutiline u.a.

vgl. vergleiche

VR Landkreis Vorpommern-Rügen

z. B. zum Beispiel

§ Paragraph

% Prozent

® registrierte Warenmarke

< kleiner als

≤ kleiner als oder gleich

> größer als

≥ größer als oder gleich

= gleich

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1. Einleitung und Problemstellung

1

1. Einleitung und Problemstellung

1.1 Problemstellung

Multiresistente Erreger (MRE) gelten als Auslöser schwer behandelbarer

nosokomialer Infektionen. Der Großteil der MRE kann neben dem Menschen auch

landwirtschaftliche Nutztiere kolonisieren oder seltener infizieren. In den

vergangenen Jahren wurden zunehmend Übertragungen von MRE von Nutztieren

auf den Menschen nachgewiesen.

Im Jahr 2005 wurden in den Niederlanden erstmals livestock-associated Methicillin-

resistente Staphylococcus aureus (LA-MRSA) bei Personen mit direktem Kontakt zu

Schweinen detektiert [1]. Weltweit durchgeführte Prävalenzuntersuchungen zum

Auftreten von MRSA in Tierstallungen belegen, dass v. a. Schweine und Mastkälber

vielfach kolonisiert sind [2, 3]. Eine Transmission auf enge Kontaktpersonen wie

Landwirte findet regelmäßig statt [4-6]. Deshalb empfiehlt die Kommission für

Krankenhaushygiene und Infektionsprävention (KRINKO) am Robert Koch-Institut

(RKI) ein Screening von Landwirten vor der Aufnahme in ein Krankenhaus [7].

Neben den MRSA sind seit den 2000er Jahren auch Escherichia coli (E. coli), die ein

erweitertes Spektrum an β-Laktamasen (ESBL) bilden, in den Fokus der

Aufmerksamkeit gerückt [8, 9]. Im Gegensatz zu MRSA ist hier die Datenlage zum

Vorkommen in landwirtschaftlichen Betrieben und dem zoonotischen Potential der

bei Nutztieren isolierten Erreger noch lückenhaft. Erste Studien belegen jedoch das

Auftreten von ESBL-bildende Bakterien sowohl bei kranken als auch gesunden

Nutztieren in deutschen Beständen [10-13]. Zudem scheint ein potentielles

Übertragungsrisiko auf Personen mit engem Kontakt zu Nutztieren zu bestehen [14].

Als Teil des Verbundprojektes „HICARE-Gesundheitsregion Ostseeküste“,

einem Aktionsbündnis gegen multiresistente Bakterien, sollten in der vorliegenden

Arbeit das Vorkommen von MRSA und ESBL-bildenden E. coli bei Mitarbeitern aus

landwirtschaftlichen Betrieben sowie die Belastung von Schweine-, Rinder- und

Geflügelbeständen erstmalig unter Berücksichtigung der besonderen

geographischen Region Mecklenburg-Vorpommerns (MV) untersucht werden. Neben

der phänotypischen Identifizierung sollte eine molekularbiologische Typisierung der

Isolate erfolgen, um ggf. Übereinstimmungen der humanen und tierischen Stämme

im Kontext einer potentiellen zoonotischen Transmission im Sinne des „One health“-

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1. Einleitung und Problemstellung

2

Gedankens, der durch interdisziplinäre Zusammenarbeit, die globale

Gesunderhaltung von Mensch, Tier und Umwelt erreichen möchte, evaluieren zu

können.

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1. Einleitung und Problemstellung

3

1.2 Angaben zur Tierhaltung in Mecklenburg-Vorpommern

Laut statistischem Datenblatt des Ministeriums für Landwirtschaft, Umwelt und

Verbraucherschutz (LU) waren im Jahr 2013 in MV 18.800 Personen in der

Landwirtschaft inklusive dem Gartenbau und Baumschulen beschäftigt [15].

Im Jahr 2012, also im Jahr der für diese Arbeit durchgeführten Datenerhebung,

wurden 200 schweinehaltende Betriebe mit einer Tierzahl von durchschnittlich

4229,5 Schweinen pro Betrieb vom LU verzeichnet. Ebenfalls 2012 waren in MV

3050 Rinderbetriebe, darunter 898 Betriebe mit Milchkühen, gemeldet. Im

Durchschnitt wurden pro Betrieb 180,1 Rinder bzw. 197,3 Milchkühe gehalten [16].

Damit weist MV bundesweit die höchste durchschnittliche Rinderzahl pro Betrieb auf

[17]. Laut persönlicher Auskunft des Landesamtes für Landwirtschaft,

Lebensmittelsicherheit und Fischerei MV (LALLF) waren im Jahr 2014 insgesamt 58

Putenmastbetriebe (> 100 Tiere) und 82 Broilerbetriebe (> 1000 Tiere) in MV

gemeldet.

Zum deutschlandweiten Vergleich können Daten des Statistischen Bundesamtes

herangezogen werden [17]. In Niedersachsen, dem nutztierreichsten Bundesland,

werden demnach ca. 4,5-mal so viele Rinder und 10-mal so viele Schweine gehalten

wie in MV. Dagegen ist die durchschnittliche Tierzahl pro Betrieb in MV deutlicher

höher als in anderen Bundesländern (Abb. 1). Die Datenerhebung des statistischen

Bundesamtes erfolgte im November 2011, somit divergieren die Bestandszahlen

leicht von denen des LU [17].

MV: Mecklenburg-Vorpommern; NI: Niedersachsen; BB: Brandenburg; B: Bayern

Abb. 1: Durchschnittliche Tierzahl pro Betrieb in MV im Vergleich zu ausgewählten

Bundesländern nach Daten des Statistischen Bundesamtes [17]

3905

598

1340

265 174 107 122 58 0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

MV NI BB B

Du

rch

sch

nit

tlic

he

Tier

zah

l pro

B

etri

eb

Schweine

Rinder

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1. Einleitung und Problemstellung

4

1.3 Staphylococcus aureus und Methicillin-resistente S. aureus

(MRSA)

1.3.1 Staphylococcus aureus

Gattungsmerkmale: Bakterien der Gattung Staphylococcus gehören zu den Gram-

positiven Kokken und werden der Familie der Staphylococcaceae zugeordnet. Eine

besonders wichtige Spezies ist Staphylococcus aureus (S. aureus), der seinem meist

gelblichen Phänotyp seinen Namen verdankt (lateinisch „aureus“ für „der Goldene“).

S. aureus ist wie alle Staphylokokken ein kugelförmiges, unbewegliches, fakultativ

anaerobes Bakterium. Die mitunter haufen- oder traubenförmig (altgriechisch

„staphyle“ für „Weintraube“) angeordneten Bakterien sind im Gegensatz zu den

reihenförmig angeordneten Streptokokken in der Lage das Enzym Katalase zu bilden

[18]. S. aureus ist zwischen 0,5–1,5 µm groß [19] und bis zu 7 Monate auf trockenen

Oberflächen lebensfähig [20]. Er ist nicht in der Lage Sporen zu bilden und ist relativ

unempfindlich gegenüber Schwankungen des pH-Werts. S. aureus gehört neben

z. B. S. intermedius oder S. delphini zu den Koagulase-positiven Staphylokokken. Die

positive Koagulase-Reaktion ist mikrobiologisch ein wichtiger diagnostischer Hinweis

auf S. aureus [19].

Die Anzucht von S. aureus ist auf fast allen gängigen nicht selektiven Nährmedien

möglich. Auf Blutagar ist nach 18–24 stündiger Inkubation bei 36 °C das Wachstum

von typischen gelblichen oder weißen Kolonien mit oder ohne Hämolyse sichtbar. Die

Speziesdiagnostik erfolgt über biochemische oder molekularbiologische Verfahren

[18].

S. aureus ist in der Lage, eine große Anzahl an Virulenzfaktoren zu bilden, die von

Bedeutung für die Ausprägung eines Krankheitsgeschehens sind. Dazu gehört die

schon erwähnte Koagulase, die u. a. bei der Anheftung an Wirtzellen eine Rolle

spielt. Der Clumping-Faktor führt zur Verklumpung des Blutplasmas und hilft

S. aureus sich vor der körpereigenen Abwehr zu schützen und verbessert die

Adhäsion an das Wirtsgewebe [19]. S. aureus kann Entero- und exfoliative Toxine

exprimieren. Das porenbildende Toxin „Panton-Valentin-Leukozidin“ (PVL) besteht

aus zwei Polypeptid-Ketten (lukS-PV und lukF-PV) und bindet vor allem an

Leukozyten und führt zu deren Lyse. PVL-positive Stämme können schwere

Weichteilinfektionen und nekrotisierende Pneumonien verursachen [21]. Das

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1. Einleitung und Problemstellung

5

zellwandständige Protein A beeinflusst ebenfalls die Immunabwehr, indem es

Immunglobuline (IgG) bindet und so die Opsonierung behindert [21].

Die beschriebenen Gattungsmerkmale treffen sowohl auf Methicillin-sensible (MSSA)

als auch auf die Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) zu. Eine Unterscheidung

anhand der Koloniemorphologie oder Expression bestimmter Virulenzfaktoren ist

nicht möglich.

Vorkommen und Bedeutung: Auf der Haut und den Schleimhäuten von Mensch

und Tier kommen ca. 40 verschiedene, meist fakultativ pathogene Spezies der

Staphylokokken vor [18]. S. aureus ist als Kommensale bei etwa jedem dritten

Menschen, v. a. in den Nasenvorhöfen, anzutreffen. Zwischen 0,5–2 % der

Bevölkerung ist dabei Träger eines Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) [21].

Häufig besteht lediglich eine asymptomatische Kolonisation mit S. aureus, unter

verschiedenen Umständen kann dieser jedoch schwere Infektionen (z. B.

Wundinfektionen, Pneumonien, Endokarditiden, Sepsen) auslösen [21, 22]. Die

bereits erwähnten Enterotoxine können bspw. zu Lebensmittelinfektionen führen [18].

S. aureus wird regelmäßig bei verschiedenen Tierarten nachgewiesen.

Erkrankungen von Schweinen sind vergleichsweise selten, insbesondere bei

Jungtieren jedoch möglich [19]. Bei Rindern führt S. aureus u. a. zu subklinischen

Mastitiden mit einer Erhöhung der Zellzahl der Milch und zu einer verminderten

Milchleistung. Akute Mastitiden können letal verlaufen. Besonders bei chronischen

S. aureus-Mastitiden stehen nur limitierte therapeutische Optionen zur Verfügung

und die Elimination des Erregers aus betroffenen Betrieben ist mit einem erheblichen

Aufwand verbunden [19]. Bei Geflügel kann S. aureus sowohl zu lokalen als auch zu

systemischen Infektionen führen. Ökonomisch wichtig sind in Deutschland v. a.

Erkrankungen bei Hühnern und Puten. Bei älteren Tieren führen sie zuweilen zu

schweren Infektionen des Bewegungsapparates (z. B. Arthritis, Synovitis,

Osteomyelitis); bei Jungtieren enden sie häufig letal [19].

1.3.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)

MRSA sind, wie der Name bereits sagt, gegen das β-Laktamantibiotikum Methicillin

resistent. Aufgrund des Resistenzmechanismus weisen fast alle β-Laktamantibiotika

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1. Einleitung und Problemstellung

6

in vitro und in vivo eine verminderte Wirksamkeit bis Wirkungslosigkeit auf. Diese

Resistenz ist in der Regel durch eine Mutation des Penicillinbindenden Proteins

(PBP) 2 begründet. Die Mutante des Proteins wird als PBP2a oder PBP2‘

bezeichnet. Das Gen mecA codiert für PBP2a und liegt zusammen mit weiteren

regulatorischen Genen auf einer mobilen genetischen Einheit, der „staphylococcal

cassette chromosome mec“ (SCCmec) [21]. Zurzeit sind 11 verschiede SCCmec

bekannt [23].

Neben mecA-positiven MRSA konnten indessen auch mecC-positive S. aureus

nachgewiesen werden, die ein zu 70 % homologes PBP2a exprimieren [24]. Diese

erstmals bei einem Rind dokumentierte Genvariante ist durch die übliche PCR nicht

nachweisbar [24]. MecC-positive S. aureus wurden bereits beim Menschen detektiert

[21, 24].

In den 1960ern Jahren, kurze Zeit nach der klinischen Einführung des Methicillins,

wurden erstmalig Methicillin-resistente S. aureus nachgewiesen [25]. Später wurde

die Resistenztestung nicht mehr mit Methicillin, sondern mit dem

β-Laktamantibiotikum Oxacillin durchgeführt, weshalb MRSA mitunter auch als

Oxacillin-resistente S. aureus (ORSA) bezeichnet werden [7]. Seit einigen Jahren gilt

das Cephalosporin Cefoxitin als Testsubstanz der Wahl [26]. Gelegentlich wird auch

von einem Mehrfach- oder Multiresistenten S. aureus gesprochen, wenn neben der

Resistenz gegen β-Laktamantibiotika zusätzlich Resistenzen gegen mindestens zwei

weitere Antibiotikaklassen (z. B. Makrolide oder Fluorchinolone) vorliegen.

1.3.3 Epidemiologie von MRSA beim Menschen

MRSA können epidemiologisch und molekularbiologisch in drei verschiedene

Gruppen eingeteilt werden:

- hospital-associated (HA-) MRSA

- community-acquired (CA-) MRSA

- livestock-associated (LA-) MRSA

Die Einteilung ist als nicht rigide aufzufassen, findet doch ein kontinuierlicher

Austausch zwischen den Erregern und deren Herkunftsorten statt. So können z. B.

LA-MRSA oder CA-MRSA auch zu nosokomialen Infektionen führen [27, 28]. Der

Begriff der hospital-associated community onset MRSA (HCA-MRSA) beschreibt

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1. Einleitung und Problemstellung

7

MRSA, die bei kurzen Krankenhausaufenthalten erworben wurden und in der

Normalbevölkerung zu Infektionen führen [29].

Hospital-associated MRSA (HA-MRSA): HA-MRSA spielen weltweit eine wichtige

Rolle als Erreger nosokomialer Infektionen. MRSA-Infektionen gehen im Vergleich zu

MSSA-Infektionen mit einer signifikant erhöhten Mortalität einher [21]. Im

Krankenhaus kann die Übertragung von HA-MRSA direkt und indirekt stattfinden. Der

direkte Transfer erfolgt von Patient zu Patient. Beim indirekten Transfer stellt die

Übertragung über die Hände des Personals die häufigste Transferroute dar. Eine

Transmission ist aber auch durch unbelebte Vektoren, z. B. kontaminierte

Medizinprodukte, möglich. Eine Übertragung durch Tröpfchen ist ebenfalls möglich.

Zu den typischen Risikofaktoren für den Erwerb einer HA-MRSA-Infektion zählen

u. a. eine vorausgegangene Antibiotikabehandlung, Kontakt zu anderen MRSA-

Patienten, eine bestehende Immunsuppression oder das Vorhandensein

medizinischer Devices (z. B. zentraler Gefäßkatheter) [21].

Wie bereits bei den MSSA beschrieben, können HA-MRSA bspw. zu Haut- und

Weichteilinfektionen, Endokarditiden oder Sepsen führen. In Europa werden in

Krankenhäusern häufig die klonalen Komplexe (CC) CC5, CC8, CC22, CC30 oder

CC45 isoliert [21, 28].

Der Nachweis von MRSA aus Blut oder Liquor ist laut § 2 Absatz 2 Satz 1 der

Infektionsschutzgesetz-Meldepflicht-Anpassungsverordnung [30] meldepflichtig.

Ebenso ist die nosokomiale Häufung laut § 6 Absatz 3 Infektionsschutzgesetz [31]

meldepflichtig. Für die Behandlung von MRSA-Infektionen empfiehlt es sich ein

Antibiogramm anzufertigen. Prinzipiell kommen z. B. Kombinationen aus

Glykopeptiden mit Rifampicin, Clindamycin, Gentamicin, Fosfomycin oder Linezolid

zum Einsatz. Bei MRSA-Trägern kann ggf. eine antiseptische Dekolonisierung

erfolgen. Diese ist v. a. vor einem elektiven chirurgischen Eingriff oder bei

medizinischem Personal indiziert [21].

Community-acquired MRSA (CA-MRSA): CA-MRSA werden in der Bevölkerung

ohne vorherigen Kontakt zum Gesundheitssystem detektiert. Die betroffene

Personengruppe verfügt in der Regel nicht über die gängigen Risikofaktoren zur

Akquisition eines HA-MRSA [21]. Stattdessen ist sie meist deutlich jünger und

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1. Einleitung und Problemstellung

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gesünder als die typischen HA-MRSA-Patienten [32]. Der Aufenthalt in Ländern mit

einer hohen CA-MRSA-Prävalenz (z. B. Griechenland, USA) oder der direkte und

enge Kontakt zu CA-MRSA-positiven Personen (z. B. Familienmitglieder,

Kontaktsportarten) stellen eine mögliche Transferroute dar [32]. Vor allem in den

USA verfügen CA-MRSA über weitere Virulenzfaktoren wie z. B. PVL. Der

PVL-positive Stamm „USA300“ (ST8) ist dort besonders weit verbreitet [21, 32]. In

Deutschland sind PVL-positive CA-MRSA mit 1,6–3 % der Isolate noch deutlich

seltener [21].

Livestock-associated MRSA (LA-MRSA): In den Niederlanden wurden LA-MRSA

im Jahr 2005 erstmalig bei Personen mit engem Kontakt zu Schweinen detektiert [1].

Seitdem wurden weltweit zahlreiche Nachweise von LA-MRSA bei beruflich

exponierten Personen dokumentiert [33]. Auch in Deutschland treten Kolonisationen

mit LA-MRSA bei Landwirten und Veterinären mit Großtierkontakt auf [4]. Bei dem

LA-MRSA CC398 handelt es sich um einen sogenannten „extended-host-spectrum

genotype“, d. h. Speziesbarrieren können leicht überwunden werden [34].

Nach Cuny et al. [4] waren nach Kontakt zu MRSA-positiven Schweinen 86 % der

Landwirte, 45 % der Veterinäre und 4,3 % der Familienangehörigen dieser

Risikogruppen MRSA-positiv. Dabei scheinen sowohl die Intensität des Tierkontaktes

als auch die Arbeitszeit im MRSA-positiven Betrieb einen Einfluss auf die

Übertragungswahrscheinlichkeit von LA-MRSA auf den Menschen zu haben [33, 35].

Dass es sich nicht nur um eine transiente Kolonisation handelt, demonstrieren

Studien, die belegen, dass Landwirte häufig auch nach längerer Abwesenheit vom

Betrieb MRSA-positiv blieben [6, 36].

Der CC398 ist der typische Vertreter der LA-MRSA und wurde vermutlich

ursprünglich als MSSA vom Menschen auf das Tier übertragen. Dort akquirierte er

verschiedene Resistenzeigenschaften und verlor wiederum andere Faktoren, die

seine Wirtsspezifität bedingten [37]. Die Wahrscheinlichkeit, dass Personen ohne

direkten Tierkontakt zum Träger werden, ist laut Literatur momentan als gering

einzuschätzen [4, 5]. Dennoch konnte bei Personen, die lediglich einen Hofladen

besuchten, eine leicht erhöhte LA-MRSA Prävalenz im Vergleich zur

Normalbevölkerung festgestellt werden [5].

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1. Einleitung und Problemstellung

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Es wird vermutet, dass etwa 0,8–2,0 % der im Krankenhaus isolierten MRSA

nutztierassoziiert sind [27]. In Regionen mit einer hohen Nutztierdichte ist das Risiko

eines Eintrages von LA-MRSA in das Krankenhaus deutlich erhöht [38, 39]. In

Bundesländern mit einer hohen Viehdichte (z. B. Nordrhein-Westfalen und

Niedersachsen) wiesen Laboratorien aus humanen klinischen

Untersuchungsmaterialien deutlich häufiger LA-MRSA als in anderen Teilen

Deutschlands nach. Zudem verzeichneten sie einen signifikanten Anstieg der

Nachweishäufigkeit von LA-MRSA (von 0,3 % auf 5,4 %) in den vergangenen Jahren

[40].

Neben der asymptomatischen Kolonisation sind auch ST398-bedingte Infektionen

beim Menschen belegt. So traten bereits Wund- und Hautinfektionen,

beatmungsassoziierte Pneumonien und Endokarditiden auf [28, 41]. Auch klinische

Ausbrüche durch ST398 konnten bereits verzeichnet werden [42].

Bundesweit einheitliche Daten zum Anteil der durch LA-MRSA ausgelösten MRSA-

Infektionen fehlen, da routinemäßig keine Typisierung der im Krankenhaus

gefundenen Isolate durchgeführt wird. Bislang verfügen LA-MRSA über weniger

Virulenzfaktoren und Resistenzen als HA- oder CA-MRSA [27, 43]. Die

Transmissionsrate von LA-MRSA scheint außerdem geringer als die der klassischen

HA-MRSA zu sein [44]. Hierfür könnte das jüngere Alter und die kürzere Liegedauer

von LA-MRSA-positiven Patienten ursächlich sein [45].

Die Gefahr des Eintrages von LA-MRSA in Gesundheitseinrichtungen spiegelt sich in

der „Empfehlung zur Prävention und Kontrolle von MRSA-Stämmen in

Krankenhäusern und medizinischen Einrichtungen“ der Kommission für

Krankenhaushygiene und Infektionsprävention (KRINKO) des Robert Koch-Instituts

(RKI) wider. Bis Mitte 2014 wurde empfohlen, „Patienten, die beruflich direkten

Kontakt zu Tieren in der landwirtschaftlichen Tiermast (Schweine) haben“, vor der

stationären Krankenhausaufnahme auf MRSA untersuchen zu lassen [46]. Diese

Empfehlung wurde im Juni 2014 an die aktuelle Datenlage angepasst. Nun werden

alle Personen, „die regelmäßig (beruflich) direkten Kontakt zu MRSA haben, wie z. B.

Personen mit Kontakt zu landwirtschaftlichen Nutztieren (Schweine, Rinder,

Geflügel)“, als Population mit einem erhöhten MRSA-Risiko eingestuft [21]. Trotz der

größeren Gefahr einer Kolonisation ist nicht bekannt, ob diese Risikogruppen auch

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häufiger an MRSA-Infektionen leiden als die Bevölkerung ohne direkten Kontakt zu

Nutztieren.

Neben dem CC398 kommen auch andere klonale MRSA-Gruppen in

Nutztierbeständen vor. So wurden in Deutschland ebenfalls CC9, CC30 oder CC5

detektiert [2, 47]. Auch diese nicht CC398-assoziierten LA-MRSA weisen ein

zooanthroponotisches Potential auf [2].

Das Risiko einer Übertragung auf den Menschen durch mit MRSA belastete

Lebensmittel wird bislang als gering eingeschätzt [26].

1.3.4 Epidemiologie von MRSA bei Tieren

Verschiedenste Tiere wie Hunde, Katzen, Pferde, Exoten aber auch Wildtiere können

mit MRSA kolonisiert oder infiziert sein [48-50]. In Tierkliniken können MRSA zu

nosokomialen Infektionen führen [51]. Die bei Haustieren isolierten MRSA-Stämme

entsprechen oftmals humanen Stämmen, so wurde u. a. der ST22 mehrfach bei

Haustieren nachgewiesen [50-52], wobei die anthropozoonotische Übertragung eine

wichtige Rolle zu spielen scheint [53, 54]. Ein (Re-) Transfer vom Tier auf den

Menschen scheint ebenfalls möglich zu sein [48, 55]. Bei Wildtieren werden als

Übertragungswege sowohl der Eintrag aus humanen Quellen, z. B. über Abwässer

[56], als auch über Nutztiere in die Umwelt diskutiert [10, 57].

Landwirtschaftliche Nutztiere sind vielfach asymptomatisch kolonisiert. Im Gegensatz

zu den bei Menschen und Begleittieren isolierten MRSA-Typen stehen bei den

Nutztieren LA-MRSA im Vordergrund. Neben den im Folgenden besprochenen

Nutztieren können auch weitere Arten (z. B. Mastkaninchen) Träger von LA-MRSA

sein [58].

Vorkommen und Bedeutung bei Schweinen: Im Jahr 2005 wurden erstmalig

LA-MRSA bei einem Kind eines Landwirtes aus der Schweineproduktion isoliert,

woraufhin Schweine als asymptomatische Träger und Übertragungsquelle identifiziert

werden konnten [1]. Weitere Untersuchungen in den Niederlanden ließen eine

MRSA-Prävalenz von 39 % bei Schlachtschweinen erkennen, wobei ausschließlich

der MLST ST398 isoliert wurde [59]. Auch in Deutschland folgten Untersuchungen

zum Vorkommen von MRSA in Schweinebeständen. Meemken et al. [60]

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identifizierten 18 % der untersuchten Schweinebetriebe in Nordrhein-Westfalen und

Niedersachsen als MRSA-positiv. Kurze Zeit später wurden an der deutsch-

niederländischen Grenze in 70 % der Schweinebetriebe positive Tiere gefunden [38].

Cuny et al. [4] detektierten sogar bei 82,4 % der untersuchten Schweineherden aus

unterschiedlichen deutschen Bundesländern MRSA. Im Jahr 2009 veröffentlichte die

Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) europaweite MRSA-

Prävalenzdaten von Staubproben aus Schweinezuchtbetrieben. Neben einigen

scheinbar „MRSA-freien“ Ländern (z. B. Finnland) wurden in anderen Ländern hohe

Prävalenzen nachgewiesen. Deutschland erreichte die zweithöchste Prävalenz mit

43,5 %, übertroffen von Spanien mit einer Prävalenz von 46 %. Im Durchschnitt

waren 14 % der Zuchtbetriebe und 26,5 % der Erzeugerbetriebe in den

teilnehmenden europäischen Ländern MRSA-positiv [2].

MRSA-Infektionen von Schweinen stellen bisher eher eine Ausnahme dar [61-63].

Der Nachweis in Fleischprodukten konnte hingegen häufig erbracht werden [26, 33].

Vorkommen und Bedeutung bei Rindern: In den 70er Jahren wurden MRSA

erstmalig aus Gemelksproben von Milchkühen isoliert und als Verursacher von

Mastitiden nachgewiesen [64]. Sie spielen bis heute eine wichtige Rolle als

Krankheitserreger bei Milchvieh [65]. Ferner wurden in deutschen Tankmilchproben,

die nur Milch von gesunden Tieren enthalten sollen, LA-MRSA nachgewiesen [66].

Auch MV bildet hier keine Ausnahme ([67], eigene unveröff. Daten). Folglich sind

MRSA auch in unpasteurisierten Milchprodukten nachzuweisen [68].

In Milchproben britischer Rinder gelang der erste Nachweis eines mecA-Homologes,

das nicht durch die üblichen PCR detektierbar war [24]. Diese Variante, damals als

mecALGA251 bezeichnet, wird heute mecC genannt. Auch PVL-positive MRSA wurden

bereits in boviner Milch detektiert [69].

Doch nicht nur in Rohmilch, auch in Nasentupfern von Kälbern und adulten Rindern

wurden bereits MRSA nachgewiesen [65]. Insbesondere Mastkälber sind häufig

kolonisiert [3, 70, 71] und eine direkte Übertragung auf den Menschen scheint

möglich [71].

MRSA-positive Rindfleischprodukte sind keine Seltenheit. So wurden in den

Niederlanden 10,6 % des Rindfleisches und 15,2 % des Kalbfleisches MRSA-positiv

getestet [72].

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Vorkommen und Bedeutung bei Nutzgeflügel: Auch bei gesundem Geflügel,

insbesondere Masttieren, wurden LA-MRSA nachgewiesen [73-76]. Der Vergleich

von S. aureus-Isolaten der 70er Jahre des 20. Jahrhunderts mit Isolaten aus 2006

zeigte einen deutlichen Anstieg der Resistenzsituation [73]. Bei Geflügel, v. a.

Hühnern, kommen häufig neben ST398 auch andere MRSA-Typen wie ST5 oder

ST9 vor. [47, 77, 78]. Dabei scheint ursprünglich eine Transmission des bei Geflügel

gefundenen ST5 vom Menschen auf das Tier erfolgt zu sein [78]. Eine direkte

zoonotische Übertragung von MRSA auf den Menschen mit engem Kontakt zu

Geflügel ist als sehr wahrscheinlich anzusehen [76, 79].

Beim Geflügel selbst kommen MRSA-Infektionen gelegentlich vor [80, 81]. Der

Nachweis von MRSA in Geflügelfleischproben konnte auch in MV [67, 82-84] bereits

vielfach erbracht werden [33].

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1.4 Escherichia coli und Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL)

1.4.1 Escherichia coli

Gattungsmerkmale: Die Gattung Escherichia zählt zur Familie der

Enterobacteriaceae. Die wichtigste Art stellt Escherichia coli (E. coli) dar, die 1885

von Theodor Escherich entdeckt wurde [85]. Das Gram-negative, stäbchenförmige

Bakterium hat eine Länge von 2,0–6,0 µm und eine Breite von 1,1–1,5 µm. E. coli ist

fakultativ anaerob und aufgrund der peritrichen Begeißelung in der Lage sich aktiv

fortzubewegen [86]. Sowohl in feuchter als auch in trockener Umgebung kann E. coli,

insbesondere bei niedrigen Temperaturen, mehrere Monate persistieren [20].

Die Anzucht ist auf fast allen gängigen Nährmedien möglich. Die Spaltung von

Laktose ist ein wichtiger diagnostischer Hinweis auf E. coli, obgleich ebenfalls

laktosenegative E. coli beschrieben sind. [87]. Die genaue Speziesdiagnostik erfolgt

über weitere biochemische oder molekularbiologische Verfahren [88, 89].

Die Einteilung in verschiedene Serotypen, die anhand ihrer Antigene charakterisiert

werden können, ist überwiegend von epidemiologischer Relevanz [88]. Man

unterschiedet zwischen den somatischen O-Antigene, die Bestandteile der Zellwand

sind, den flagellaren H-Antigenen, die nur bei begeißelten Stämmen zu finden sind,

den K-Antigenen als Kapselantigenen und den F-Antigenen als Fimbrienantigene.

Bei mucoiden Colistämmen kommen M-Antigene mit einer Makrokapsel vor [86].

Weiterhin kann eine Einteilung anhand der Virulenzfaktoren in unterschiedliche

Pathovare erfolgen [89].

Vorkommen und Bedeutung: E. coli tritt sowohl als Kommensale der normalen

Darmflora als auch als Infektionserreger bei Mensch und Tier auf. Viele

darmpathogene E. coli-Stämme sind in der Lage Toxine zu bilden und können

Durchfallerkrankungen hervorrufen. Neben intestinalen Symptomen können einige

E. coli durch ihre Toxine extraintestinale Infektionen verursachen (u. a. das

hämorrhagisch-urämische Syndrom [HUS]). Oftmals besitzen sie ein zoonotisches

Potential (z. B. enterohämorraghische E. coli [EHEC]) [86, 89]. E. coli treten beim

Menschen zudem als Erreger nosokomialer Infektionen in Erscheinung und können

bspw. zu Harnweginfektionen oder Sepsen führen [87].

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Insbesondere bei Saug- und Absetzferkeln lösen E. coli Durchfallerkrankungen aus.

Die Ödemkrankheit der Schweine tritt häufig nach dem Absetzen in Erscheinung und

wird durch Shigatoxin-produzierende E. coli-Stämme (STEC) ausgelöst. Die Toxine

schädigen hierbei die Gefäßwände und führen so zur Ödembildung und

neurologischen Veränderungen. Laut Infektionsschutzgesetz § 7 werden in

Deutschland beim Menschen die STEC den EHEC zugeordnet [31, 89]. Bei Sauen

sind E. coli-Stämme z. B. am Mastits-Metritis-Agalaktie-Syndrom (MMA-Syndrom)

beteiligt [86].

Bei Rindern sind zahlreiche Erkrankungen ausgelöst durch E. coli beschrieben.

Neben der neonatalen Kälberdiarrhö und Coliseptikämie der Jungtiere kann es bei

Milchkühen zur mitunter letal verlaufenden Colimastitis kommen [86].

Geflügelpathogene E. coli-Stämme werden auch als APEC (avian pathogenic E. coli)

bezeichnet. Diese können bei Hühnern und Puten zur Coliseptikämie führen.

Seltener ist die Coligranulomatose älterer Tiere [86].

1.4.2 Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL)

β-Laktamasen

β-Laktamasen sind weit verbreitete Enzyme, die von einer Vielzahl Gram-positiver

und Gram-negativer Bakterien exprimiert werden können. Sie spalten den

β-Laktamring von Penicillinen, Cephalosporinen (v.a. der 1. und 2. Generation) oder

seltener Carbapenemen und führen somit zur Wirkungslosigkeit dieser Antibiotika.

Einige β-Laktamasen verfügen über einen Serinrest im aktiven Zentrum, andere über

ein Zinkion (Metallo-β-Laktamasen) [90, 91].

Bereits 1940 wurde die erste Penicillinase bei einem E. coli-Isolat detektiert [92].

β-Laktamasen können sowohl chromosomal codiert als auch auf Plasmiden

vorliegen [91].

In der klinischen Anwendung kommen sogenannte β-Laktamase-Inhibitoren in

Kombination mit einem β-Laktamantibiotikum zum Einsatz, die die bakteriellen

β-Laktamasen inaktivieren. Zu den β-Laktamase-Inhibitoren gehören z. B.

Clavulansäure, Tazobactam oder Sulbactam [93].

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Zur Einteilung der β-Laktamasen existieren verschiedene Klassifizierungssysteme.

Insbesondere die molekulare Einteilung nach Ambler bzw. die funktionale

Charakterisierung nach Bush, Jacoby und Medeiros haben sich durchgesetzt:

- Klassifizierung nach Ambler

Ambler teilte die β-Laktamasen nach der Übereinstimmung ihrer Aminosäuresequenz

in die molekularen Klassen A bis D ein. Die Klassen A, C und D decken die

Serinenzyme ab, die Klasse B die Metallo-β-Laktamasen [94].

- Klassifizierung nach Bush, Jacoby und Medeiros

Diese ist funktional auf das Substratprofil und die Sensibilität gegenüber

β-Laktamase-Inhibitoren ausgerichtet und teilt die β-Laktamasen in vier verschiedene

Gruppen ein. Gruppe 1 umfasst die Cephalosporinasen, die kaum durch

Clavulansäure hemmbar sind. In der 2. Gruppe finden sich die Ambler-Klassen A und

D wieder, die Untergruppen umfassen durch β-Laktamase-Inhibitoren hemmbare

Enzyme. In der 3. Gruppe befinden sich die Metallo-β-Laktamasen, die nicht durch

β-Laktamasen, aber durch Ethylendiamintetraacetat (EDTA) hemmbar sind. Die

4. Gruppe wird durch Penicillinasen gebildet, die nicht durch Clavulansäure inhibiert

werden [90].

Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL)

Hierbei handelt es sich um β-Laktamasen mit einem erweiterten Substratspektrum.

Sie können sowohl bei Enterobacteriaceae als auch bei Nonfermentern vorkommen.

Die EFSA definiert ESBL-Bildner als resistent gegen Penicilline, 2.-, 3.- und

4.-Generationscephalosporine sowie gegen Monobactame (z. B. Aztreonam), aber in

der Regel nicht gegen Carbapeneme oder Cephamycine (z. B. Cefoxitin) [95].

Normalerweise sind sie, zumindest in vitro, durch β-Laktamase-Inhibitoren wie

Clavulansäure, Sulbactam oder Tazobactam hemmbar. Häufig liegt eine Co- oder

Multiresistenz gegen weitere Antibiotikaklassen wie Fluorchinolone oder

Aminoglykoside vor [93, 95]. Die meisten ESBL werden der Ambler Klasse A bzw.

der Gruppe 2be nach der Klassifizierung nach Bush, Jacoby und Medeiros

zugeordnet [93].

ESBL-bildende Bakterien wurden bereits Ende der 70er Jahre isoliert [96] und

Anfang der 80er Jahre erstmals aus humanen klinischen Isolaten nachgewiesen [97].

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Typischerweise entstehen ESBL durch Punktmutationen, bzw. einem

Aminosäureaustausch auf den bla-Genen, aus gewöhnlichen β-Laktamasen (z. B.

TEM-1 oder SHV-1). Die Mutation führt zu einer Affinitätsänderung im aktiven

Zentrum und erweitert so das Substratspektrum. ESBL liegen vielfach auf Plasmiden

vor und können sowohl innerhalb einer Bakterienspezies als auch zwischen

verschiedenen Spezies weitergegeben werden [98].

Häufige ESBL sind u. a. CTX-M, TEM, SHV und OXA [99]. Im Weiteren wird nicht auf

andere ESBL Familien eingegangen. Eine Datenbank mit allen derzeit bekannten

β-Laktamasen stellt die Lahey Clinic Burlington zur öffentlichen Verfügung

(www.lahey.org/Studies; letzter Zugriff 01.09.16).

Die Gruppe der AmpC β-Laktamasen (z. B. CMY) sind bisher noch seltener als

ESBL, finden in diesem Zusammenhang aber häufig Erwähnung. Sie sind wie ESBL

in der Lage Cephalosporine zu hydrolysieren, werden jedoch nicht durch

β-Laktamase-Inhibitoren gehemmt. Häufig sind sie chromosomal codiert, zunehmend

werden plasmidcodierte AmpC β-Laktamasen nachgewiesen [100]. Auch sie waren

nicht Gegenstand der Untersuchung und werden daher nachfolgend nur am Rande

erwähnt.

CTX-M β-Laktamasen: Die Abkürzung CTX-M bezieht sich auf die Fähigkeit dieser

β-Laktamasen, das Cephalosporin Cefotaxim zu hydrolysieren. Vermutlich

entwickelten sie sich aus chromosomal codierten β-Laktamasen bestimmter Kluyvera

spp., die anschließend v. a. auf E. coli und Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae)

übertragen wurden [101]. Nach dem erstmaligen Auftreten in Japan in den 80er

Jahren [102] folgten bald auch in Deutschland Funde von CTX-M β-Laktamasen aus

klinischen E. coli-Isolaten [103].

Seit etwa Anfang des 21. Jahrhunderts hat sich CTX-M zu der am weitesten

verbreiten ESBL-Gruppe in der Humanmedizin entwickelt [104, 105]. CTX-M Gene

sind in der Regel Bestandteile von Plasmiden, auf denen mitunter auch andere

β-Laktamasen und Resistenzen gegen weitere Antibiotikagruppen codiert sein

können [95]. Insgesamt gibt es über 150 verschiedene CTX-M Enzyme

(http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1; letzter Zugriff 01.09.16), die sich

aufgrund von Aminosäuresequenzhomologien in fünf phylogenetische Gruppen

einteilen lassen: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 und CTX-M-25 [104].

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In diesen Gruppen gibt es wiederum mehrere verschiedene Varianten von Allelen,

die sich nur in einzelnen Aminosäuren voneinander unterscheiden. In der

Humanmedizin hat sich die zur Gruppe 1 gehörige CTX-M-15 β-Laktamase zu der

am weitverbreitetsten ESBL in Europa entwickelt [104]. Sie wurde bereits bei E. coli-

Isolaten von Haustieren, Wildtieren und Nutztieren nachgewiesen [106, 107].

Auch in der Veterinärmedizin dominieren CTX-M β-Laktamasen, wobei CTX-M-1

gehäuft bei Isolaten europäischer Nutztiere auftritt [99].

TEM β-Laktamasen: TEM leitet sich von „Temoniera“ ab, dem Namen der Patientin,

in deren Blutprobe erstmalig die β-Laktamase entdeckt wurde [108]. Die isolierte

TEM-1 und die nahverwandte TEM-2 sind per Definition keine ESBL, da sie zwar in

der Lage sind, Penicilline und Cephalosporine der 1. Generation, nicht aber

Oxyimino-Cephalsporine zu hydrolysieren. Dies trifft ebenso auf TEM-13 zu [93]. Im

Gegensatz dazu ist die durch zwei weitere Punktmutationen aus TEM-2 entstandene

TEM-3 in der Lage, ein erweitertes Spektrum an β-Laktamantibiotika zu inaktivieren

[93].

Seit der Entdeckung der TEM β-Laktamasen wurden zahlreiche TEM-Varianten,

vorwiegend ESBL-Bildner, beschrieben [98]. Die TEM β-Laktamasen waren bis in die

1990er Jahre die mit am häufigsten in der Humanmedizin isolierten ESBL [99].

Mittlerweile sind über 200 verschiedene TEM Enzyme bekannt

(http://www.lahey.org/studies/temtable.asp; letzter Zugriff 01.09.16). Anfang der

1990er Jahren wurden bestimmte TEM-Derivate, die Inhibitor-resistenten TEM (IRT),

entdeckt. Diese sind nicht durch β-Laktamase-Inhibitoren hemmbar [93, 98].

SHV β-Laktamasen: SHV steht für „Sulfhydryl variable“; diese Enzyme gehörten

lange Zeit zu den am häufigsten aus klinischen Proben isolierten ESBL [93]. SHV-1

gehört selbst nicht zu den ESBL, da zwar eine Resistenz gegen

Breitspektrumpenicilline, nicht aber gegen Oxyimino-Cephalosporine exprimiert wird.

Im Gegensatz dazu vermittelt die durch eine Punktmutation aus SHV-1 entstandene

SHV-2 eine Resistenz gegen Breitspektrumcephalosporine und wurde erstmals

Anfang der 80er Jahre bei einer Klebsiella spp. entdeckt [97, 98]. Vermutlich bedingt

durch die vermehrte Anwendung von Cephalosporinen der 3. Generation waren SHV

β-Laktamasen bald weltweit in klinischen Isolaten anzutreffen [93]. Mittlerweile sind

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knapp 200 SHV Enzyme bekannt (http://www.lahey.org/Studies/webt.asp#SHV;

letzter Zugriff 01.09.16).

SHV gehören zwar nicht mehr zur am häufigsten nachgewiesenen ESBL-Gruppe,

aber insbesondere SHV-12 wird regelmäßig aus humanen und tierischen Quellen

isoliert [99]. Bisher sind Inhibitor-resistente SHV im Vergleich zu Inhibitor-resistenten

TEM noch relativ selten anzutreffen [109].

OXA β-Laktamasen: Die Bezeichnung OXA wurde nach der Fähigkeit dieser

β-Laktamasen gewählt, Oxacillin zu hydrolysieren. Zusätzlich vermitteln sie eine

high-level Resistenz gegen Cloxacillin und Methicillin sowie eine Resistenz gegen

Amino- und Ureidopenicilline. Sie werden durch β-Laktamase-Inhibitoren nur

schwach gehemmt [93, 110]. Die Gruppe wurde aufgrund von phänotypischen

Analogien gebildet, genotypisch variieren viele OXA Enzyme sehr stark [98].

Ursprünglich wurden OXA β-Laktamasen bei Pseudomonas aeroginosa

(P. aeruginosa) entdeckt, wobei sie mittlerweile auch bei verschiedenen anderen

Enterobacteriaceae nachgewiesen wurden [93].

Von knapp 500 beschriebenen OXA β-Laktamasen gehören nur ein kleiner Bruchteil

den ESBL an (http://www.lahey.org/Studies/webt.asp#OXA; letzter Zugriff 01.09.16).

Viele OXA ESBL leiten sich von OXA-10 ab (z. B. OXA-11, OXA-14, OXA-16) und

unterscheiden sich lediglich durch wenige Aminosäuren. Dadurch wird die bei

OXA-10 nur schwach ausgeprägte Cephalosporin- und mitunter auch

Aztreonamresistenz deutlich erhöht [93]. Insbesondere bei Acinetobacter baumanii

(A. baumanii) gibt es OXA β-Laktamasen (z. B. OXA-48), die Resistenzen gegen

Carbapeneme vermitteln [111].

1.4.3 Epidemiologie von ESBL-bildenden E. coli beim Menschen

Seit den 80er Jahren kam es in der Humanmedizin aufgrund zunehmender

Infektionen mit Penicillin-resistenten Bakterien zum vermehrten Einsatz der

Cephalosporine Cefotaxim und Ceftazidim. Kurze Zeit später wurden die ersten

ESBL-Bildner nachgewiesen; hauptsächlich handelte es sich dabei um SHV oder

TEM Enzyme. Mittlerweile werden sie von den CTX-M ESBL sowohl im klinischen als

auch im ambulanten Bereich abgelöst [105].

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Beim Menschen führen ESBL-bildende E. coli häufig zu Harnweginfektionen, aber

auch Wundinfektionen und septische Verläufe sind möglich [99, 112, 113]. Insgesamt

wird eine Zunahme von ESBL-induzierten Infektionen im stationären Sektor

beobachtet [114]. Auch außerhalb von Krankenhäusern wird ein Anstieg von durch

ESBL-bildende E. coli ausgelösten Harnweginfektionen detektiert [115]. Eine

bestimmte klonale Linie, der E. coli-ST131, wird sowohl in Deutschland als auch

weltweit besonders häufig aus klinischem und ambulantem Untersuchungsmaterial

nachgewiesen und ist vielfach mit CTX-M-15 ESBL assoziiert [116].

Es sind verschiedene Risikofaktoren für den Menschen bekannt, die einen Einfluss

auf die Akquisition eines ESBL-Bildners haben. Unter anderem zählen die Dauer des

Krankenhausaufenthaltes und generell das Vorliegen schwerer Erkrankungen dazu

[112, 117, 118]. Des Weiteren sind insbesondere der Einsatz von Antibiotika (v. a.

Breitspektrumcephalosporine und Fluorchinolone) [115, 119], die Verwendung

medizinischer Devices [113, 117] oder der Aufenthalt in endemischen Gebieten [112,

119] Risikofaktoren. Die Übertragung von ESBL-Bildnern im Krankenhaus findet u. a.

durch Schmierinfektionen (z. B. die Hände des Personals) statt [112].

Die Therapie von Infektionen mit ESBL-bildenden E. coli sollte nach den Ergebnissen

eines Antibiogramms erfolgen. Zur Therapie von ESBL-Bildnern kann bspw. auf

Fluorchinolone zurückgegriffen werden, beim Vorliegen von Multiresistenzen sind je

nach Ergebnis der Resistenztestung z. B. Carbapeneme oder Colistin mögliche

Optionen [112].

In Deutschland ist man aufgrund der KRINKO-Empfehlung zur Vereinheitlichung und

Vereinfachung der Nomenklatur mittlerweile von der Klassifizierung der ESBL-Bildner

abgekommen [112]. So soll die klinische Relevanz und nicht der

Resistenzmechanismus im Vordergrund stehen. Die Einteilung erfolgt nach aktueller

KRINKO-Empfehlung in multiresistente Gram-negativer Erreger (MRGN) anhand der

Anzahl der Resistenzen, die gegen bestimmte Antibiotikaklassen vorliegen. Die

MRGN umfassen sowohl die Enterobacteriaceae als auch die nicht-fermentierenden

Stäbchenbakterien. Die vier relevanten Antibiotikaklassen für die Einteilung sind die

Penicilline, Cephalosporine, Fluorchinolone und Carbapeneme. Die MRGN werden

bei Erwachsenen je nach Anzahl der vorhandenen Resistenzen in 3-MRGN und

4-MRGN unterteilt (Tab. 1) [112].

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1. Einleitung und Problemstellung

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Im Gegensatz zu MRSA stehen derzeit keine erfolgversprechenden MRGN-

Sanierungskonzepte bei einer Kolonisation zur Verfügung [112].

Tab. 1: MRGN-Klassifizierung nach phänotypischen Resistenzeigenschaften (modifiziert nach [112])

Antibiotikagruppe

(Leitsubstanz)

Enterobakterien und

A. baumanii

3-MRGN 4-MRGN

P. aeruginosa

3-MRGN 4-MRGN

Acylureidopenicilline

(Piperacillin) R R

nur eine der 4

Antibiotika-

gruppen ist

wirksam

R

3./4.-Generations-

Cephalosporine

(Cefotaxim/ Ceftazidim)

R R R

Carbapeneme

(Imipenem/ Meropenem) S R R

Fluorchinolone

(Ciprofloxacin) R R R

R = resistent oder intermediär empfindlich

S = sensibel

1.4.4 Epidemiologie von ESBL-bildenden E. coli bei Tieren

ESBL-Bildner sind weit verbreitet und bei unterschiedlichen Tierarten zu finden.

Bereits Ende der 1980er Jahre wurden bei Versuchshunden, an denen die

Pharmakokinetik von β-Laktamantibiotika getestet wurde, Cefotaxim-resistente

ESBL-bildende E. coli detektiert [102]. Der erste klinisch relevante Nachweis erfolgte

1998 aus einem Isolat eines Hundes, der jahrelang an einer rezidivierenden

Harnweginfektion litt [8]. Zahlreiche weitere Nachweise von ESBL-Bildnern bei

Hunden und Katzen schlossen sich an [51, 120]. Dabei werden Genotypen wie die

CTX-M ESBL, die beim Menschen eine wichtige Rolle spielen, zunehmend auch bei

Begleittieren nachgewiesen [51, 99]. Eine anthropozoonotische Übertragung ist

durch den oft sehr engen Kontakt zu den eigenen Haustieren als wahrscheinlich

anzusehen [51, 99].

Auch bei verschiedensten Wildtierarten [107, 121] und bei Zootieren [122] erfolgte

der Nachweis von ESBL-Bildnern. Die möglichen Kausalitäten zur Entwicklung von

MRE bei Wildtieren wurden bereits im Abschnitt 1.3.4 behandelt.

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1. Einleitung und Problemstellung

21

Nutztiere sind vielfach asymptomatisch mit ESBL-Bildnern kolonisiert und nehmen

eine wichtige Reservoirfunktion ein. Neben den im Weiteren dargestellten Tierarten

wurden bereits andere Nutztierarten (z. B. Mastkaninchen) positiv auf ESBL-Bildner

getestet [123]. Ebenso existieren zahlreiche Nachweise von ESBL-Bildnern bei

weiteren Bakteriengattungen wie bspw. Salmonella spp. [124], auf die im Folgenden

aber nicht weiter eingegangen wird.

Vorkommen und Bedeutung bei Schweinen: Bei Schweinen gelang der erste

Nachweis ESBL-bildender E. coli im Jahr 2002 in China, als bei 2 % der am

Schlachthof beprobten Schweine CTX-M bildende E. coli nachgewiesen wurden

[125]. Danach folgten weltweite Nachweise von ESBL-Bildnern bei Schweinen [33,

99]. In Europa ist die am häufigsten isolierte ESBL bei Schweinen CTX-M-1 [99].

In Deutschland beprobten Friese et al. [10] gesunde Schweine aus konventionellen

Mast- und Zuchtbetrieben und fanden in 16 von 32 Betrieben ESBL/ AmpC-

produzierende E. coli. Hering et al. [126] fanden in 85 % der beprobten

Schweinebetriebe Cefotaxim-resistente E. coli und identifizierten Risikofaktoren, die

u. a. das Hygieneregime betreffen. Im Jahr 2005/06 detektierte Büchter [11] bei

1,2 % der positiv getesteten E. coli-Isolaten von erkrankten Schweinen ESBL,

vorranging CTX-M-1. Die meisten Schweine litten an Enteritiden. Schink et al. [127]

wiesen wenige Jahre später ebenfalls v. a. die ESBL CTX-M-1 bei erkrankten

Schweinen nach.

In Schweinefleisch wurden ESBL-bildende E. coli bereits mehrfach detektiert [128,

129]. Der häufige Verzehr von Schweinefleisch könnte einen potentiellen Risikofaktor

für die Besiedelung des Menschen mit ESBL-bildenden E. coli darstellen [130].

Vorkommen und Bedeutung bei Rindern: Der erste Fund von ESBL-Bildnern bei

Rindern gelang ebenfalls 2002 in China. Dort wurden bei 3,1 % der auf

Schlachthöfen entnommenen Rektaltupfern CTX-M produzierende E. coli

nachgewiesen [125].

Valide Daten zur Prävalenz von ESBL-Bildnern in der deutschen Rinderpopulation

nehmen erst in den letzten Jahren zu. In Norddeutschland wurden am Schlachthof

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1. Einleitung und Problemstellung

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bei 11 % der beprobten Rindern ESBL-bildende E. coli detektiert [131]. Schmid et al.

[12] untersuchten Milch- und Mastrinder in Südbayern und fanden in 86,7 % der

untersuchten Betriebe ESBL-bildende E. coli. Die meisten Isolate enthielten die

CTX-M Gruppe 1. Friese et al. [10] fanden in 6 von 10 ostdeutschen

Milchviehbetrieben ESBL/ AmpC-produzierende E. coli. Dabei wies ein Isolat gleich

drei verschiedene β-Laktamasen auf (CTX-M, TEM und SHV). In Europa ist die

dominierende ESBL in Rinderbeständen CTX-M-1 [99].

Erkrankungen durch ESBL-bildende E. coli sind bei Rindern beschrieben, so besteht

z. B. eine Beteiligung an Kälberdurchfällen [132]. Büchter [11] fand bei 3 % der

2005/06 untersuchten E. coli-Isolate von erkrankten Rindern ESBL, die meisten Tiere

litten an einer Enteritis oder Mastitis.

In Rindfleisch konnten bereits wiederholt ESBL-Bildner nachgewiesen werden, auch

wenn die Prävalenz in der Regel niedriger als bei Geflügel- oder Schweinefleisch ist

[129, 133]. Auch der Nachweis aus unbehandelter Milch ist möglich ([129], eigene

unveröff. Daten).

Vorkommen und Bedeutung bei Nutzgeflügel: Geflügel scheint besonders häufig

mit ESBL-Bildnern kolonisiert zu sein; das gilt v. a. für europäische und asiatische

Länder [99]. Erstmalig erfolgte der Nachweis von ESBL-Bildnern bei Geflügel um die

Jahrtausendwende aus Kotproben gesunder Hühner, die zwischen 2000 und 2001 in

Spanien gesammelt wurden. Es konnten E. coli, die für die β-Laktamasen CMY-2,

CTX-M-14 und SHV-12 codierten, isoliert werden [9]. Im Jahr 2003 wurde ein zweites

Screening durchgeführt und sowohl die Prävalenz als auch die Vielfalt der

gefundenen β-Laktamasen hatten deutlich zugenommen [134]. Auch in Japan

wurden zwischen den Jahren 1999–2002 CTX-M und CMY-2 bildende E. coli im

Fäzes von gesunden Broilern nachgewiesen [135]. Es folgten zahlreiche

Untersuchungen zum Vorkommen von ESBL-Bildner bei Nutzgeflügel [33]. In

Deutschland fanden Friese et al. [10] in allen 8 getesteten Geflügelmastbetrieben

ESBL/ AmpC-produzierende E. coli, bei denen v. a. die plasmidcodierten AmpC

Laktamasen und TEM Enzyme dominierten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass

bereits Eintagsküken mit ESBL-Bildnern kolonisiert sein können und die ESBL-

Prävalenz mit zunehmendem Alter der Tiere anstieg [13]. Nach einem Review von

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1. Einleitung und Problemstellung

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Ewers et al. [99] dominieren bei europäischem Geflügel die ESBL bzw. AmpC

CTX-M-1 und CMY-2 mit zusammen über 50 %.

ESBL-bildende E. coli können an Erkrankungen von Geflügel beteiligt sein. Büchter

[11] fand in ihren Untersuchungen eine Prävalenz von 0,3 % ESBL-bildenden E. coli

bei septischem Geflügel in Deutschland.

ESBL-Bildner sind häufig in Geflügelfleisch nachzuweisen [128, 136], wobei es kaum

Unterschiede zwischen konventionell und biologisch vermarktetem Fleisch gibt [136].

Eine Gefährdung des Menschen durch den Verzehr ESBL-haltiger Geflügelprodukte

wird in der Literatur diskutiert [137], ist aber noch nicht abschließend geklärt.

1.4.5 Zoonotische Bedeutung von ESBL-bildenden E. coli

Prinzipiell ist sowohl die Übertragung von ESBL-bildenden E. coli als auch die

alleinige Übertragung von Resistenzgenen auf Enterobacteriaceae des Menschen

möglich [95]. Jedoch gibt es bislang wenig Daten zur Häufigkeit der zoonotischen

Transmission und den genauen Übertragungswegen.

Nach Ewers et al. [99] weist die Verteilung der ESBL-Bildner bei Mensch und Tier

einige Unterschiede auf; dies könnte gegen einen stetigen Resistenzaustausch

zwischen E. coli-Isolaten humanen und tierischen Ursprungs sprechen. In der

Humanmedizin waren CTX-M-14 und CTX-M-15 β-Laktamasen mit einem Anteil von

fast 50 % die am häufigsten in Europa isolierten ESBL. Bei Rinder- und

Schweineisolaten machten sie hingegen einen Anteil von 7 % bzw. 8 % aus. Beim

Geflügel kamen die CTX-M-14 β-Laktamasen lediglich auf 4 % und CTX-M-15 lagen

unter 2 %. Umgekehrt war die bei Rindern und Schweinen am häufigsten isolierte

ESBL CTX-M-1 (72 %) nur in 7 % der humanen Isolate zu finden und die beim

Geflügel dominierende AmpC CMY-2 (31 %) kam bei humanen Isolaten auf 4 % [99].

Aktuell wird jedoch ein Anstieg der CTX-M-1 ESBL beim Menschen verzeichnet

[130].

Wu et al. [138] verglichen humane und tierische Isolate aus verschiedenen

europäischen Ländern. Sowohl beim Menschen als auch bei Tieren dominierte die

CTX-M Gruppe 1, wobei große Unterschiede bei den Resistenzmustern und den

Virulenzgenen aufgezeigt wurden. Somit wurde geschlussfolgert, dass die

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1. Einleitung und Problemstellung

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Übertragung von Mensch zu Mensch weiterhin die wichtigste Transferroute bei der

Ausbreitung von ESBL-Bildnern darstellt.

Niederländische Funde identischer ESBL-Gene aus humanen klinischen Isolaten und

Geflügelfleischproben mit jeweils ähnlichen Typisierungsergebnissen weisen auf eine

mögliche Übertragung durch die Lebensmittelkette hin [137, 139]. Auch die direkte

Transmission auf Menschen mit beruflichem Kontakt zu Geflügel [14, 140] und

Schweinen [141-143] scheint möglich.

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1. Einleitung und Problemstellung

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1.5 Nachweismethoden von MRSA und ESBL-bildenden E. coli

1.5.1 Screening mittels kultureller Anzucht

1.5.1.1 S. aureus und MRSA

Zum Screening auf MRSA erfolgt beim Menschen in der Regel ein Abstrich der

Nasenvorhöfe oder von vorhandenen Wunden [21]. Bei Tieren kann je nach

Fragestellung ebenfalls ein direkter Abstrich der Nase erfolgen, bei Verdacht einer

subklinischen oder klinischen Mastitis der Milchkuh sollten Gemelksproben

untersucht werden [26]. Die Untersuchung von Stallstaubproben bietet die

Möglichkeit eines Screenings auf Herdenlevel [2]. Bei einer zu erwartenden niedrigen

Erregerkonzentration im Untersuchungsmaterial ist eine selektive Voranreicherung

empfehlenswert [144]. Goldstandard ist die Durchführung eines zweistufigen

Testverfahrens, bei dem zuerst eine Speziesdiagnostik für S. aureus erfolgt und

anschließend mittels Resistenztestung die Methicillin- bzw. Cefoxitinresistenz

nachgewiesen wird [145].

Konventioneller zweistufiger kultureller Nachweis MRSA: Zum kulturellen MRSA-

Nachweis können sowohl selektive als auch nicht selektive Nährmedien eingesetzt

werden. Eine nicht selektive Anzucht erfolgt üblicherweise auf Columbia Agar mit 5 %

Schafblut, bei dem sich nach etwa zwei Tagen, bzw. nach zusätzlicher Anreicherung

über ein Flüssignährmedium nach drei Tagen, das typische Wachstum von

S. aureus/ MRSA in gelblich-weißen Kolonien mit Hämolyse darstellt. Dem folgt der

phänotypische Resistenznachweis [145].

Selektiver kultureller Nachweis MRSA: Eine selektive Anzucht kann auf

konventionellen Nährmedien (z. B. Müller-Hinton-Agar) durch Zusatz eines

Antibiotikums (Oxacillin, Cefoxitin) und/ oder von Natriumchlorid durchgeführt

werden. Zudem stehen zum Nachweis von MRSA verschiedene bereits fertige

chromogene Nährmedien zur Verfügung, die die Detektion deutlich vereinfachen und

die Zeitspanne bis zum Befund auf 24 h verkürzen [146].

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1. Einleitung und Problemstellung

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Phänotypische Bestätigung von S. aureus: Zur Speziesbestätigung von S. aureus

eignen sich der Koagulasetest oder der Nachweis des Clumping-Faktors. Der

Koagulasetest als Referenzmethode weist die von S. aureus gebildete Koagulase

nach. Die Koagulase wandelt den Gerinnungsfaktor Prothrombin zu Thrombin um,

das Fibrinogen zu Fibrin spaltet. Durch Inkubation von S. aureus in Blutplasma

kommt es zur Koagulation. Die Ablesung erfolgt nach 4 und 18–24 h [18].

Da der Nachweis der Koagulase relativ aufwändig ist, wird stattdessen häufig der

zellwandständige Clumping-Faktor nachgewiesen. Durch den Clumping-Faktor

agglutiniert das in der Testsubstanz enthaltene Fibrinogen. Zur Erhöhung der

Spezifität und Sensitivität sind meist weitere S. aureus-spezifische Substanzen im

Testkit enthalten. So kommt es z. B. durch den Zusatz von IgG zur Reaktion mit dem

Protein A [18].

Mit Hilfe von Laborautomaten (z. B. VITEK 2®/ bioMérieux) kann ebenfalls eine

schnelle Speziesbestätigung von S. aureus erfolgen [26].

Phänotypische Methoden zur Bestätigung von MRSA: Ein schneller Nachweis

der Methicillinresistenz bei Staphylokokken kann durch kommerzielle Testkits, die auf

der Detektion des mecA-Gens beruhen, erfolgen. Die Testsubstanz enthält

Antikörper gegen das bei MRSA modifizierte Protein PBP2a und führt zu einer

Agglutinationsreaktion [147].

Nachweis der Methicillinresistenz von S. aureus: Zu den phänotypischen

Verfahren, die neben der Methicillinresistenz weitere Resistenzen nachweisen

können, zählen der Agardiffusionstest, die Agardilution und der Mikrobouillon-

Verdünnungstest (auch Mikrodilutionstest genannt). Letzterer gilt derzeit als

Goldstandard [26]. Bei diesem Testverfahren werden Verdünnungsreihen

verschiedener Antibiotika in einem Flüssignährmedium zusammen mit dem zu

untersuchenden Bakterium inokuliert. Wächst das Bakterium bei Erreichen eines

bestimmten Antibiotika-Grenzwertes, wird es als resistent eingestuft. Die Grenzwerte

werden z. B. von dem European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

(EUCAST) oder dem Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) vorgegeben

und regelmäßig aktualisiert. Eine automatisierte Aufarbeitung ist mit verschiedenen

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1. Einleitung und Problemstellung

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Systemen möglich. Aufgrund der höheren Sensitivität wird zur Testung der

Methicillinresistenz vorranging Cefoxitin eingesetzt [144].

1.5.1.2 E. coli und ESBL

Zum Screening auf ESBL-Bildner beim Menschen eignen sich v.a. Rektalabstriche,

ggf. auch Abstriche infizierter Wunden [148]. Bei Nutztieren können Kotproben als

Untersuchungsmaterial verwendet werden [95]. Es können Verfahren ohne

Anreicherung, nicht selektive oder selektive Anreicherungen erfolgen [95, 142].

Aufgrund der hohen Variabilität der ESBL-Bildner erfolgt der Nachweis durch ein

zweistufiges Testverfahren, bestehend aus einem Screening und einem

anschließendem phänotypischen oder genotypischen Bestätigungstest. Die

genotypischen Verfahren ermöglichen eine genaue Bestimmung der verschiedenen

β-Laktamasen und ST [95].

Kultureller Nachweis und Bestätigung von E. coli: Die Anzucht von E. coli kann

auf unterschiedlichen Nährmedien erfolgen. Auf Columbia Agar mit 5 % Schafblut

zeigt sich nach ca. 24–48 h das typische Wachstum mit schleimigen Kolonien, meist

mit Hämolyse. Spezielle Selektivnährmedien wie MacConkey-Agar oder Endo-Agar

unterdrücken die Gram-positive Begleitflora und zeigen die für E. coli typische

Spaltung von Laktose durch einen Farbumschlag an [87].

Durch die sogenannte „Bunte Reihe“ kann anhand spezifischer Enzymaktivitäten, die

durch einen Farbumschlag angezeigt werden, eine Spezieszuordnung erfolgen. Die

manuelle Durchführung ist jedoch zeitaufwändig. Laborautomaten ermöglichen hier

eine komfortablere Spezieszuordnung [87].

Kulturelles Screening von ESBL: Zum kulturellen Nachweis können Nährmedien

wie MacConkey oder Levine Agar mit Cephalosporinen der 3. Generation versetzt

werden, wobei je nach Indikation Cefotaxim, Ceftriaxon und/ oder Ceftazidim

geeignet sind [121, 125, 149]. Die richtige Konzentration des Cephalosporins nimmt

bei der Vermeidung von falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen eine

entscheidende Rolle ein [95].

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1. Einleitung und Problemstellung

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Zur schnellen und unkomplizierten Detektion stehen ebenso fertige selektive

chromogene Nährmedien zur Verfügung. Durch den spezifischen Farbumschlag

können bereits erste Aussagen über die Bakterienspezies getroffen und das

diagnostische Verfahren abgekürzt werden [95].

Bestätigung von ESBL und Resistenznachweis: Aufgrund der hohen Sensitivität

und Spezifität eignen sich zur phänotypischen Bestätigung der Epsilometer-Test

(E-Test) oder die Verwendung von Combination Discs [95]. Beide Bestätigungstests

beruhen auf der Hemmbarkeit von ESBL-Bildnern durch β-Laktamantibiotika mit

β-Laktamase-Inhibitor-Kombinationen. Nicht alle Cephalosporine eignen sich

gleichermaßen zur ESBL-Bestätigung [150].

Ein E-Test-Streifen enthält auf der einen Seite einen Gradienten eines

Cephalosporins und auf der anderen Seite einen Gradienten einer Cephalosporin

und β-Laktamase-Inhibitorkombination (Abb. 2). Dadurch lässt sich die minimale

Hemmkonzentration (MHK) direkt ablesen; eine Differenz von mehr als drei

Verdünnungsstufen bestätigt eine ESBL. Typische Verformungen der Hemmhöfe

sprechen ebenfalls für das Vorhandensein einer ESBL, verhindern allerdings die

Ablesung der MHK. Geeignet für den Nachweis ESBL-bildender E. coli sind u. a. die

Kombinationen Cefotaxim und Cefotaxim/ Clavulansäure sowie Ceftazidim und

Ceftazidim/ Clavulansäure [150].

Abb. 2: E-Test mit Ceftazidim und Ceftazidim/ Clavulansäure. Die Hemmbarkeit durch Clavulansäure deutet auf einen ESBL-Bildner hin.

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Bei der Combination Disc Methode werden die Hemmhofdurchmesser von

Cephalosporinen und Cephalosporin/ β-Laktamase-Inhibitorenplättchen verglichen

(z. B. Cefpodoxime Combination Disc Kit/ Oxoid). Ab einer bestimmten Differenz

kann von einem ESBL-Bildner ausgegangen werden [93, 151].

Die MHK verschiedener Cephalosporine kann mittels Agardiffusion oder

Mikrodilutionstest bestimmt werden. Allerdings unterscheiden sich teilweise die

Grenzwerte der verschiedenen Fachgesellschaften (z. B. EUCAST, CLSI). Die EFSA

empfiehlt mittlerweile die Verwendung der EUCAST-Grenzwerte [95].

Laborautomaten erfordern die Verwendung spezifischer ESBL-Testpanels bzw.

Testkarten [150].

1.5.2 Molekularbiologische Methoden zur Typisierung von MRSA und

ESBL-bildenden E. coli

Genotypische Untersuchungen werden neben der Speziesbestätigung zur

Charakterisierung spezifischer MRSA- oder ESBL-Gene sowie zur Darstellung von

Verwandtschaftsbeziehungen genutzt [95, 152]. Das angewendete molekulare

Verfahren richtet sich nach der zu bearbeitenden Fragestellung. Im Folgenden wird

vorrangig auf die für die vorliegende Arbeit relevanten Verfahren eingegangen.

1.5.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Bei der PCR werden genau definierte Genabschnitte vervielfältigt (amplifiziert) und

durch spezifische Primer nachgewiesen. Bei der PCR ist die Spezifität von der

Auswahl der verwendeten Primer abhängig [153].

Es gibt verschiedene Arten der PCR. Bei der Multiplex-PCR können durch den

gleichzeitigen Einsatz verschiedener Primer in einem einzelnen Arbeitsschritt diverse

Zielregionen gleichzeitig amplifiziert werden. Die Methode ist in der Entwicklung

fehleranfällig, bei korrekter Ausführung aufgrund ihrer Schnelligkeit der normalen

PCR jedoch überlegen [153]. Bei der real-time PCR lässt sich durch die Zugabe von

Fluoreszenzfarbstoffen bereits innerhalb von wenigen Stunden ein Ergebnis ablesen

[26].

Für viele Untersuchungsmethoden ist vielfach als primärer Schritt eine PCR zur

Amplifikation notwendig [154].

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S. aureus/ MRSA: Zur genotypischen Bestätigung von S. aureus werden spezifische

Gensequenzen mittels PCR, wie z. B. nuc (thermostabile Nuklease), nachgewiesen

[26]. Zur Bestätigung der Resistenz können die für das modifizierte PBP codierenden

Gene mecA oder mecC nachgewiesen werden [26]. Ebenfalls können weitere

Resistenz- und Virulenzgene von MRSA durch PCR-Untersuchungen identifiziert

werden. Dazu gehört das Gen luk-PV, das das Toxin PVL codiert [155].

Ein Screening auf MRSA kann mittels real-time PCR innerhalb von ca. 2,5 h erfolgen.

Die Methode ist in Bezug auf die Schnelligkeit der kulturellen Methode überlegen,

weist aber eine geringere Sensitivität auf [26].

E  coli/ ESBL-bildende E. coli: Auch für E. coli existieren spezielle kommerzielle

(multiplex) PCR-Amplifikationstests, die zum Screening und zur klinischen Diagnostik

eingesetzt werden können. Weiterhin können mittels PCR bestimmte

Pathogenitätsfaktoren von E. coli, wie für das Shigatoxin codierende Gene,

nachgewiesen werden [156].

Der Nachweis der ESBL-Bildung wird durch PCR der resistenzvermittelnden

bla-Gene ermittelt. Es gibt bereits kommerziell erhältliche Multiplex-PCR Assays zum

Nachweis der häufigsten ESBL Gene [150]. Auch bei ESBL-bildenden E. coli können

spezifische zusätzliche Resistenzgene, z. B. gegen Fluorchinolone (PMQR-Gene),

mittels PCR nachgewiesen werden [122].

1.5.2.2 Multilocus-Sequenztypisierung (MLST)

Bei der Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) werden Fragmente aus

verschiedenen Genloci der Bakterien sequenziert. Hierzu eignen sich v. a. die

sogenannten „Housekeeping-Gene“. Diese Gene bzw. „Loci“ werden konstitutiv

exprimiert, da sie lebenserhaltende Stoffwechselvorgänge in der Bakterienzelle

codieren. Sowohl bei MRSA als auch bei ESBL-bildenden E. coli werden

7 spezifische Housekeeping-Gene charakterisiert [95, 157]. Anhand der

Sequenzvariationen der ermittelten Allele kann der jeweilige Sequenztyp (ST)

bestimmt werden, der wiederum einem CC zugeordnet werden kann [158]. Isolate

eines bestimmten CC zeigen Übereinstimmungen in mindestens 5 der 7 Allele. Die

Datenbank http://www.mlst.net (letzter Aufruf 01.09.16) enthält alle derzeit bekannten

Sequenzen. Durch den Vergleich der sich ergebenden Sequenzen werden

Verwandtschaftsbeziehungen untereinander sowie zwischen humanen und tierischen

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Isolaten aufgezeigt [157]. Die MLST ist somit ideal für epidemiologische

Fragestellungen und zur Beleuchtung evolutionärer Zusammenhänge geeignet [26,

95], da die eindeutige Zuordnung zu bestimmten ST ein Vergleich auch zwischen

verschiedenen Laboratorien ermöglicht [158].

1.5.2.3 spa-Typisierung von S. aureus

Auf dem spa-Gen befindet sich die Information für das von S. aureus gebildete

Protein A. Die polymorphe Region X des spa-Gens besteht aus einer

unterschiedlichen Anzahl an Repeats [159]. Diese helfen epidemiologische

Verwandtschaftsbeziehungen, z. B. bei Ausbruchsgeschehen in Krankenhäusern,

darzustellen [160]. Ein Repeat besteht aus jeweils 24 Basenpaaren und jedem

Basenabschnitt wird eine bestimmte Zahl zugeordnet (r08 entspricht z. B.

„GAGGAAGACAACAACAAGCCTGGT"). Die MRSA-Isolate werden zuerst mittels

PCR amplifiziert und schließlich sequenziert. Die Zuordnung erfolgt durch einen

Abgleich mit einer Datenbank, in der aktuell über 16.243 verschiedene spa-Typen

verzeichnet sind (http://spaserver.ridom.de/, letzter Zugriff 01.09.16). Durch den

Based Upon Repeat Pattern (BURP) Algorithmus (Ridom Bioinformatics) können die

spa-Typen gruppiert und den durch die MLST gewonnenen CC zugeordnet werden

[161]. Die spa-Typisierung ist der MLST in Bezug auf Kosten und Schnelligkeit

überlegen [26].

1.5.2.4 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)

Bei der PFGE werden die durch Makrorestriktion des Genoms entstandenen

Fragmente in einem gepulsten elektrischen Feld aufgetrennt und anschließend die

entstandenen Bandenmuster verglichen. Die PFGE ist aufgrund ihrer hohen

diskriminatorischen Aussagekraft geeignet, aktuelle Ausbruchsgeschehen zu

untersuchen [152]. Die Vergleichbarkeit der entstandenen Bandenmuster zwischen

verschiedenen Laboratorien ist mitunter limitiert [158] und die Isolate sind im

Gegensatz zu den sequenzbasierten Methoden (z.B. MLST) keinen spezifischen

Typen zuordenbar [152]. Die Aussagekraft für epidemiologische Fragestellungen ist

daher begrenzt [95, 152].

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1. Einleitung und Problemstellung

32

1.5.2.5 Ganzgenomsequenzierung

Ganzgenomsequenzierungen offerieren durch ihre sehr hohe

Diskriminierungsfähigkeit breit gefächerte Informationen, die v.a. bei der Aufklärung

von Ausbruchsgeschehen vorteilhaft sein können [158]. Bei weniger diskriminativen

Verfahren wie der MLST werden nur bekannte klonale Linien detektiert (z. B. bei

MRSA: Barnimer Epidemiestamm, Rhein-Hessen-Epidemiestamm etc.). Ebenso

dient diese Methode der Ermittlung der phylogenetischen Hintergründe bestimmter

Stämme [37, 95], ist allerdings aufgrund der hohen Generierung an Datenvolumina in

der Verwaltung vergleichsweise aufwändig [158].

1.5.2.6 DNA-Sequenzierung nach Sanger

Die Didesoxymethode nach Sanger stellt eine enzymatische Methode dar, um

entweder das ganze Genom oder bestimmte Genabschnitte zu sequenzieren. Dem

PCR-Ansatz werden Abbruchnukleotide zugefügt, die eine Verlängerung des neu

synthetisierten DNA-Strangs verhindern. Die so entstandenen

Kettenabbruchprodukte werden mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und zur

Fluoreszenz angeregt. So lässt sich die Basenabfolge ablesen, die mit bekannten

Sequenzen verglichen werden kann. Vorteile sind u. a. die Automatisierbarkeit und

somit schnelle Durchführung [162].

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2. Eigene Untersuchungen

33

2. Eigene Untersuchungen

2.1 Material

2.1.1 Geräte und Materialien

In der vorliegenden Arbeit wurden die nachstehend in Tab. 2 bis Tab. 5 aufgeführten

Geräte und Materialien im Institut für Hygiene und Umweltmedizin (IHU) der

Universitätsmedizin Greifswald zur Präanalytik und Primärdiagnostik verwendet.

Tab. 2: Verwendete Geräte

Gerät Name Hersteller

Analysewaage GF-200-EC A&D Instruments Ltd., Abingdon

Autoklaven Vakulab PL MMM GmbH, Planegg bei München

Brutschrank Wärmeschrank Memmert GmbH + Co KG, Schwabach

Bunsenbrenner flammy S Schuett biotec GmbH, Göttingen

Cryoblock Cryoblock für 18 Röhrchen Mast Group, Reinfeld

Gefrierschränke Gefrierschrank bis -20 °C VIP™ Series -86 °C

Liebherr, Biberach an der Riß SANYO, Moriguchi

Glasstäbe Glasstab 250 mm x 6 mm Laborbestand

Kühlschränke Kühlschränke Liebherr, Biberach an der Riß Privileg, Stuttgart

Magnetrührer mit Heizplatte RH basic 2 MR 3001 KB

IKA®-Werke GmbH & CO KG, Staufen Heidolph Instruments GmBH & Co KG, Schwabach

Pipetten 100 µl 200–1000 µl

Eppendorf AG, Hamburg

Sicherheitswerkbank Microbiological safety cabinet class II

Thermo Electron Industries, Chateau Gontier

Styroporbox Styroporbox für Cryoblock Mast Group, Reinfeld

Styroporkartons Isolierbox aus EPS 3,5 l Bezug über Armin Baak, Schwerin

Vortexmischer REAX 2000 Schüttelmaschine

Heidolph Instruments GmBH & Co KG, Schwabach

Wasserbad mit Thermostat Medingen W G P-D Industriegesellschaft mbH, Dresden

Zentrifuge MiniSpin® Eppendorf AG, Hamburg

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2. Eigene Untersuchungen

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Tab. 3: Verwendete Verbrauchsmaterialien

Material Bezeichnung Hersteller

Einmalspatel Einweg-Drigalskispatel aus ABS-Kunststoff

über neoLab

Handschuhe Peha-soft® nitrile Paul Hartmann AG, Heidenheim

Hautdesinfektion Sterilium® Classic pure BODE Chemie GmBH, Hamburg

Kotröhrchen Stuhlröhre, 107x25mm Sarstedt, Nümbrecht

Pipettenspitzen Biosphere® Filter tips 20 µl Biosphere® Filter tips

1000 µl

Sarstedt, Nümbrecht

Probenbeutel Rotilabo Probenbeutel mit Druckleiste

Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Probengefäß, klein Mikro-Schraubröhre 2 ml, PP Sarstedt, Nümbrecht

Probenröhrchen Röhre 15 ml, pyrogenfrei Sarstedt, Nümbrecht

Schuhüberzieher Schuhüberzieher CPE blau Bezug über B+R

Trockeneis über Vertrieb & Transport von technischen Gasen Olaf Roßdeutscher, Greifswald

Tupfer mit Amiesmedium, transystem® mit Amies-Agar-Gel-Medium

Copan, Brescia

Tupfer ohne Medium FLOQSwabs™ Copan, Brescia

Vlieshauben Einmalhaarhauben, PP-Vlies Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Tab. 4: Verwendete Nährböden/ Bouillons

Medium Bezeichnung Hersteller

Blutagar Columbia Agar mit 5 % Schafblut

Becton, Dickinson and Company, Heidelberg

Trypton-Soja-Bouillon Bacto™ Tryptic-Soja-Bouillon

Becton, Dickinson and Company, Le Pont de Claix

chromogener Agar ESBL Brilliance™ ESBL Agar Oxoid, Basingstoke

chromogener Agar MRSA CHROMagar® MRSA

CHROMagar, Paris

Müller-Hinton-Agar Müller-Hinton-Agar Carl Roth GmbH, Karlsruhe

physiologische Kochsalzlösung

Natriumchlorid > 99.5 % Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Folgende Nährmedien und -böden wurden im IHU hergestellt:

Physiologische Kochsalzlösung 0,9 %:

Natriumchlorid 9 g

Destilliertes Wasser 1 l

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2. Eigene Untersuchungen

35

Tryptic-Soja-Bouillon (1 Liter):

Bacto Trypton 17 g/l,

Bacto Soyton 3 g/l,

Glucose 2,5 g/l,

Natriumchlorid 5 g/l,

Dikaliumhydrogenphosphat 2,5 g/l

Destilliertes Wasser 1 l

Müller-Hinton-Agar (1 Liter):

Rinder-Infus 2 g/l,

Maisstärke 1,5 g/l,

Pepton aus Casein 17,5 g/l,

Agar 17 g/l

Destilliertes Wasser 1 l

Tab. 5: Verwendete Arbeitskits, Chemikalien

Material Bezeichnung Hersteller

Antibiotikaplättchen Cefotaxim 5 µg Ceftazidim 10 µg

Oxoid, Basingstoke

Kryoröhrchen Cryobank rot Mast Group, Reinfeld

E-Tests ESBL CT/CTL ESBL TZ/TZL

bioMérieux, Nürtingen

Latex-Agglutinationstest MRSA

Staphaurex™ plus-Test

Remel, Dartford

Nachweis PBP2’/ PBP2a PBP2‘ Test Kit Oxoid, Basingstoke

2.1.2 Software und Internetseiten

In den Tab. 6 und 7 sind die verwendete Software und die Internetseiten sowie deren

Verwendungszweck dargestellt.

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2. Eigene Untersuchungen

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Tab. 6: Verwendete Software

Software Hersteller Verwendungszweck

Microsoft Excel 2010 Microsoft Corporation, USA Tabellenkalkulation

IBM SPSS Statistics 22 IBM, USA Statistische Analyse

EndNoteX5 Thomsen Reuters, USA Literaturverwaltung

Tab. 7: Verwendete Internetseiten

Internetseiten Verwendungszweck

http://www.eucast.org MHK nach EUCAST

http://www.lahey.org Aminosäuresequenzen ESBL

http://www.mlst.net neu:

http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli

MLST-Datenbank für E. coli

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed Literaturrecherche

http://www.sccmec.org Klassifikation MRSA SCCmec

http://spaserver.ridom.de/spaserver DNA-Sequenzen der spa-Typen von S. aureus

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2. Eigene Untersuchungen

37

2.2. Methoden

2.2.1 Studientyp, -region und -umfang, Kooperationspartner und

Datenschutz

Bei der vorliegenden Studie handelte es sich um eine deskriptive,

speziesübergreifende Querschnittsstudie, die das Vorkommen von MRSA und ESBL-

Bildnern bei landwirtschaftlichen Mitarbeitern und in Tierställen bzw. bei Tieren

aufzeigen sollte. Einbezogen wurden die Landkreise Vorpommern-Rügen (VR),

Vorpommern-Greifswald (VG), Mecklenburgische Seenplatte (MSE) und der

Landkreis Rostock (LRO). Im Zeitraum von März 2012 bis Juni 2012 wurden

insgesamt 78 Mitarbeiter, 17 Schweine-, 11 Rinder- und 6 Geflügelbetriebe sowie in

den Geflügelbetrieben 20 Puten und 40 Broiler beprobt.

Die an dieser Arbeit beteiligten Institutionen und deren Aufgaben sind in Tab. 8

dargestellt.

Tab. 8: Zuständigkeiten der beteiligten Institutionen

Beteiligte Institutionen Aufgabenfeld

Geflügelwirtschaftsverband MV Informationsschreiben Geflügelbetriebe

Institut für Hygiene und Umweltmedizin (IHU),

Universitätsmedizin Greifswald

Studienplanung- und koordination,

Probennahme Geflügelbetriebe,

Aufarbeitung humane Proben

Institut für Hygiene,

Universitätsklinikum Münster (UKM)

Auftragsarbeit Sequenzierung ESBL-

Isolate

Landesamt für Landwirtschaft,

Lebensmittelsicherheit und Fischerei MV (LALLF)

Auftragsarbeit Primärisolierung MRSA

und ESBL aus Umweltproben und

Kotsammel-/ Sockenproben

Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und

Verbraucherschutz MV (LU)

Beratung bei Studienplanung/

Akquisition Geflügelbetriebe

Robert Koch-Institut, Fachgebiet 13 (RKI, FG 13) Sequenzierung der MRSA-Isolate

Robert Koch-Institut, Fachgebiet 14 (RKI, FG 14) Primärisolierung aus Choanen- und

Kloakentupfern

Tierseuchenkasse MV (TSK) Auswahl und Beprobung der Schweine-

und Rinderbetriebe

Insgesamt nahmen an den Untersuchungen 34 Betriebe teil. Voraussetzung war die

gewerbliche Haltung von Tieren in einer ausreichenden Anzahl, d. h. es mussten

mindestens 50 Schweine oder Rinder bzw. 10.000 Puten oder Broiler gehalten

werden. Die Vorauswahl der Rinder- und Schweinebetriebe erfolgte durch Mitarbeiter

der TSK auf Basis der Repräsentativität der Betriebe für die Region und deren

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2. Eigene Untersuchungen

38

Bereitschaft zur Teilnahme. Bei der Auswahl der Geflügelbetriebe wurden

Mastgeflügelbetriebe aus MV durch den Geflügelwirtschaftsverband angeschrieben

oder direkt von Mitarbeitern des LALLF oder LU akquiriert. Die Adressen der

zustimmenden Betriebe wurden durch das LALLF an das IHU weitergeleitet.

Die Studie wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der

Universität Greifswald bewilligt (Nr. BB07/12).

Die Teilnahme der Probanden und Betriebe beruhte auf Freiwilligkeit. Den

teilnehmenden Mitarbeitern und Betrieben wurden Nummern zur Pseudonymisierung

zugeordnet. Mitarbeiter der TSK oder des IHU informierten die Probanden über das

persönliche Ergebnis. Die Betriebsleitung wurde über die Ergebnisse der Staub- und

Kot-/ Sockenproben in Kenntnis gesetzt. Die humanen und tierischen Isolate wurde

in pseudonymisierter Form kryokonserviert aufbewahrt.

2.2.2 Probennahme und -transport

2.2.2.1 Probennahme

Mitarbeiter: Vor der Teilnahme wurden die Betriebseigentümer, die Leitung der

landwirtschaftlichen Betriebe und deren Mitarbeiter über die Studie und die

Bedeutung der zu untersuchenden Erreger schriftlich aufgeklärt und

Informationsmaterialien ausgehändigt (Anlage 1). Vor Ort erfolgte erneut eine

Belehrung über die Zielrichtung der Studie und die Datenschutzrichtlinien. Unter

Angabe von Name und Geburtsdatum unterschrieben die teilnehmenden Probanden

eine Einverständniserklärung und gaben die durchschnittliche Arbeitszeit, basierend

auf einer 5-Tage-Woche, an. Vorab durchliefen die involvierten Tierärzte der TSK

und des IHU eine Schulung über die korrekte Abstrichentnahme durch einen

Humanmediziner des IHU. Die Probanden nahmen selbständig nach Anweisung mit

sterilen Tupfern (mit Amiesnährmedium) gepoolte Nasen-/ Rachentupfer zur

Untersuchung auf MRSA und Inguinalabstriche zur Untersuchung auf ESBL-Bildner

(detaillierte Durchführung siehe Anlage 1).

Des Weiteren wurde zusammen mit der Betriebsleitung ein kurzer Fragebogen, in

dem u. a. Betriebsgröße und Haltungsbedingungen ermittelt wurden, ausgefüllt

(Anlage 3a und 3b).

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2. Eigene Untersuchungen

39

Staubproben: Die Entnahme der Staubproben erfolgte analog den Anlagen 2a und

2b in Anlehnung an die Entscheidung 2008/55/EC der Europäischen Kommission

vom 20.12.2007 [163]. Pro Betrieb wurden fünf Staubproben mit trockenen, sterilen

Tupfern entnommen. Mit jedem Tupfer wurde eine Fläche von ca. 500 cm2 beprobt.

Im Zuge der Probenentnahme wurden Trennwände, Fenstersimse, Oberflächen der

Fütterungssysteme, Lüftungsanlagen und Stallwände abgestrichen.

Kotsammel- und Sockenproben: Pro Betrieb wurden zwei Kotsammelproben mit

Hilfe von Stuhlröhrchen entnommen (Anlage 2a). Eine Sammelprobe stammte von

mindestens 10 verschiedenen Tieren und beinhaltete mindestens 25 g Kot.

Existierten verschiedene Altersgruppen von Tieren im Betrieb, fand nach Möglichkeit

eine Beprobung von zwei der selbigen statt.

Anstelle der Kotsammelproben erfolgte in den Geflügelbetrieben die Beprobung

mittels Sockenproben, die aus bis zu zwei verschiedenen Stallabteilungen

entnommen wurden (Anlage 2b). Hierzu wurden bei Betreten des Stalles

autoklavierte Vlieshauben mit steriler physiologischer Kochsalzlösung befeuchtet und

über die Schuhe gezogen. Anschließend wurde die halbe Länge, mindestens jedoch

100 m, des Stalls abgeschritten.

Choanen- und Kloakentupferproben Geflügel: In bis zu zwei verschiedenen

Stallabteilungen pro Geflügelbetrieb wurden zufällig 10 Tiere aus der Herde

selektiert. Die Fixierung des Tieres erfolgte durch einen Mitarbeiter des Betriebes.

Die Entnahme der Choanen- und Kloakentupfer fand mit Hilfe eines sterilen Tupfers

mit Amies-Nährmedium statt.

2.2.2.2 Probentransport

Die von der TSK gezogenen humanen Proben wurden innerhalb von max. 24 h

mittels Kurier oder persönlich in wärmeisolierten Boxen ins IHU gebracht. Die

Temperatur sollte Raumtemperatur (max. 25 °C) nicht übersteigen. Die Proben der

Mitarbeiter aus Geflügelbetrieben wurden innerhalb von 2 h von der Autorin der

vorliegenden Arbeit direkt ins IHU gebracht und dort unmittelbar weiterverarbeitet.

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2. Eigene Untersuchungen

40

Die Staub- und Kotproben aus den Rinder- und Schweinebetrieben wurden von der

TSK mit einem Kurier direkt an das LALLF übersandt. Die Sockenproben aus den

Geflügelbetrieben wurden von der Autorin der vorliegenden Arbeit überwiegend

direkt im LALLF abgegeben oder ebenfalls mit einem Kurier übersandt. Die

Temperatur sollte bei den Staubproben 25 °C und bei den Kot-/ Sockenproben 8 °C

nicht übersteigen (Anlage 2a/b). Die Choanen- und Kloakentupfer wurden mittels

Kurier gekühlt innerhalb von 24 h ins RKI übersandt.

Spätestens 24– 48 h nach der Probennahme erfolgte die Aufbereitung der Proben im

Labor. Zur molekularbiologischen Untersuchung wurden die kryokonservierten

MRSA- und ESBL-Isolate auf Trockeneis innerhalb von 24 h dem RKI bzw. dem UKM

zugestellt.

2.2.3 Bakteriologische Untersuchungen

2.2.3.1 MRSA

MRSA-Isolierung aus humanen Nasen-Rachentupfern: Die humanen Nasen-/

Rachentupfer wurden im IHU auf das Vorkommen von MRSA untersucht. Dafür

erfolgte ein direkter fraktionierter Ausstrich der Tupfer auf CHROMagar™ MRSA und

Columbia Agar mit 5 % Schafblut. Anschließend wurde der Tupfer in Bacto™ Tryptic-

Soja-Bouillon ausgeschüttelt. Die Platten und die Bouillon wurden bei 36 ± 1 °C für

18–24 h inkubiert und anschließend abgelesen. Fiel die erste Ablesung negativ aus,

wurde die Bouillon sowohl auf dem chromogenen als auch auf dem Columbia Agar

ausgestrichen und erneut bei 36 ± 1 °C für 18–24 h inkubiert. Nach weiteren 24 h fand

die zweite und letzte Ablesung statt.

Auf dem chromogenen Nährmedium zeigen sich verdächtige Kolonien mit einem

rosa- bis pinkfarbenen Wachstum. Die Zugehörigkeit zu S. aureus wurde mittels

Staphaurex® Plus Latex-Agglutinationstest und die Methicillin-Resistenz mit dem

Nachweis des PBP2a bestätigt. Die Stamm-Asservierung von mindestens einer

MRSA-Kolonie pro Proband erfolgte gemäß Herstellerangaben in Kryoröhrchen bei

-20 °C.

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2. Eigene Untersuchungen

41

MRSA-Isolierung aus Staub- und Choanentupfern: Die Aufarbeitung der

Staubproben erfolgte im LALLF und die der Choanentupfer im RKI FG 14 jeweils in

enger Anlehnung an die Methode der EFSA zur Untersuchung von Staubproben in

Schweinebeständen [2]. Die Staubproben wurden gepoolt, die Choanentupfer

einzeln in 100 ml Müller-Hinton-Bouillon supplementiert mit 6 % Natriumchlorid

gevortext. Anschließend erfolgte eine Inkubation bei 37 °C für 18–24 h. Danach

wurde 1 ml der Suspension in 9 ml Bacto™ Tryptic-Soja-Bouillon supplementiert mit

3,5 mg/l Cefoxitin und 50 mg/l Aztreonam überführt und wieder bei 37 °C für 18–24 h

inkubiert. Weiter erfolgte ein fraktionierter Ausstrich auf CHROMagar™ MRSA und

eine Inkubation bei 37 °C für 24 h. Eine letzte Ablesung fand nach weiteren 24 h statt.

Verdächtige Kolonien wurden auf Columbia Agar mit 5 % Schafblut überführt und

mittels Staphaurex® Plus als S. aureus bestätigt. Die Isolate wurden anschließend

bei -20 °C kryokonserviert.

2.2.3.2 ESBL-bildende E. coli

ESBL-Isolierung aus humanen Leistenabstrichen: Die Aufarbeitung der humanen

Leistenabstriche erfolgt im IHU. Die Tupfer wurden direkt auf BrillianceTM ESBL Agar

und auf Columbia Agar mit 5 % Schafblut ausgestrichen. Zusätzlich wurden die

Tupfer in Bacto™ Tryptic-Soja-Bouillon ausgeschüttelt. Nach einer 18–24 stündigen

Inkubation bei 36 ± 1 °C erfolgte die erste Ablesung der Nährmedien. Die bebrütete

Bouillon wurde erneut auf dem chromogenen und dem Columbia Agar ausgestrichen

und bei 36 ± 1 °C inkubiert. Nach weiteren 18–24 h und final nach 48 h wurden die

Nährböden nochmals abgelesen.

E. coli zeigt sich auf diesem chromogenen Medium als blaue oder pinke Kolonien.

Bei grünem Wachstum handelt es sich nach Herstellerangaben voraussichtlich um

Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp. oder Citrobacter spp. Gemäß

Hersteller kann bei farblosen Kolonien von Salmonella spp. oder Acinetobacter spp.

und bei farblosem Wachstum mit einem bräunlichen Hof von Proteus spp.,

Morganella spp. oder Providencia spp. ausgegangen werden.

Phänotypisch verdächtige Kolonien wurden in physiologischer Kochsalzlösung

suspendiert (McFarland Standard 0,5) und auf Müller-Hinton-Agar ausgespatelt.

Anschließend erfolgte ein Agardiffusionstest mit Cefotaxim 5 µg und Ceftazidim

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2. Eigene Untersuchungen

42

10 µg. Die Größe der Hemmhöfe wurde nach den Grenzwerten der EUCAST

ausgewertet (Tab. 9). Lag gegen mindestens eines der beiden Cephalosporine eine

Resistenz vor, wurde zusätzlich ein Epsilometertest durchgeführt. Für diesen wurden

die Kombinationen Cefotaxim/ Clavulansäure und Ceftazidim/ Clavulansäure getestet

(Abb. 2). Die typische Verformung des Hemmhofes als Ellipse und/ oder wenn der

Quotient der MHK mit und ohne Clavulansäurezusatz ≥ 8 ausfiel, wurden als positiv

gewertet. Die verdächtigen Isolate wurden gemäß Herstellerangaben in

Kryoröhrchen bei -20 °C gelagert.

Tab. 9: Grenzwerte für Enterobacteriaceae nach EUCAST Version 4.0 (http://www.eucast.org)

Cephalosporin Durchmesser Hemmhof in mm Sensibel ≥ Resistent <

Cefotaxim 5 µg 20 17

Ceftazidim 10 µg 22 19

ESBL-Isolierung aus Kot-, Socken-, und Kloakentupfern: Die Aufarbeitung der

Kot- und Sockenproben erfolgte im LALLF. Die Proben wurden in einem Verhältnis

von einem Teil Probe zu 9 Teilen gepuffertem Peptonwasser gemischt und 18–24 h

bei 36 ± 1 °C inkubiert. Anschließend erfolgte ein fraktionierter Ausstrich auf

BrillianceTM ESBL Agar mit erneuter 18–24 stündiger Inkubation bei 36 ± 1 °C.

Bei positivem Wachstum auf dem chromogenen Nährmedium fand die Bestätigung

mittels Cefpodoxim Combination Disc Kit statt. Nach Aufschwemmung der

verdächtigen Kolonien in physiologischer Kochsalzlösung wurde die Lösung auf

Müller-Hinton-Agar entsprechend dem McFarland Standard 0,5 ausgespatelt. Die

Platzierung der Testplättchen mit 10 µg Cefpodoxim und 10/ 1 µg Cefpodoxim/

Clavulansäure fand in einem Abstand von mindestens 3 cm statt. Nach 18 h

Inkubation bei 36 ± 1 °C wurde die Differenz der Hemmhöfe ermittelt. Bei einem

Hemmhofunterschied ≥ 5 mm gilt das Isolat als ESBL-Bildner. Pro Platte wurde

jeweils eine der morphologisch unterschiedlich wachsenden Kolonien nach

Herstellerangaben bei -20 °C kryokonserviert.

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2. Eigene Untersuchungen

43

Analog zur Methode des LALLF fand die Aufarbeitung der Kloakentupfer im RKI

(FG 14) statt. Im Gegensatz zur Methode des LALLF wurden pro Probe fünf zufällig

ausgewählte Kolonien separat kryokonserviert, auch wenn morphologisch kein

unterschiedliches Wachstum festgestellt wurde. Morphologisch unterschiedlich

wachsende Kolonien wurden hingegen immer bei -20 °C kryokonserviert.

2.2.4 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung

2.2.4.1 MRSA

Die Charakterisierung und Resistenztestung der MRSA-Isolate erfolgte im Nationalen

Referenzzentrum für Staphylokokken und Enterokokken des RKI (FG 13).

Bestätigungstest und Resistenztestung MRSA: Initial wurde mit der Durchführung

des Plasmakoagulasetests die Zugehörigkeit zu S. aureus bestätigt. Die MHK wurde

mit dem Mikrobouillon-Verdünnungstest gemäß den Grenzwerten der EUCAST

(www.eucast.org/clinical_breakpoints/; letzter Aufruf 01.09.16) bestimmt. Folgende

Substanzen waren Gegenstand der Untersuchung: Benzylpenicillin, Oxacillin,

Fosfomycin, Gentamicin, Linezolid, Erythromycin, Clindamycin, Oxytetrazyklin,

Tigecyclin, Vancomycin, Teicoplanin, Ciprofloxacin, Trimethoprim/ Sulfamethoxazol,

Rifampicin, Fusidinsäure, Mupirocin, Moxifloxacin, Daptomycin und Oxacillin/

Sulbactam.

spa-Typisierung/ Nachweis mecA und luk-PV/ MLST Typisierung MRSA: Die

spa-Typisierung wurde in Anlehnung an Harmsen et al. durchgeführt [160]. Die

Zuordnung erfolgte mit der Ridom StaphType software (Ridom GmbH, Version

2.2.1). Mittels PCR wurde das Vorhandensein der Resistenz- und Virulenz-

assoziierten Gene mecA [164] und luk-PV [165] getestet. Eine MLST wurde für alle

repräsentativen Isolate und jeden spa-Typ durchgeführt [157]. Die Sequenzen der

Primer für die MLST entsprachen den von Enright beschriebenen [157] mit

Ausnahme des Primers für das Gen „Triosephoshat Isomerase“ (tpi), bei dem die

Sequenz „5-GCATTAGCAGATTTAGGCGT-3“ genutzt wurde. Die Zuordnung

erfolgte mit Hilfe der frei zugänglichen MLST Datenbank

(http://www.mlst.net/submissions/default.asp; letzter Zugang 01.09.16).

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2. Eigene Untersuchungen

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2.2.4.2 ESBL-bildende E. coli

Die Aufarbeitung der ESBL-Isolate fand im Institut für Hygiene des UKM statt. Die

Isolate wurden mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/ Ionisation und

Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (MALDI-TOF MS) als E. coli bzw.

E. hermanii bestätigt. Isolate die nicht der Gattung Escherichia zugeordnet werden

konnten, wurden von den weiteren Analysen ausgeschlossen.

PCR und MLST-Typisierung ESBL-Bildner: Die β-Laktamasegene blaCTX-M, blaTEM,

blaSHV und blaOXA wurden per Multiplex-PCR eruiert [166]. Die MLST fand nach dem

von Wirth et al. [167] publizierten Protokoll statt. Dafür wurden Fragmente der 7

Housekeeping-Gene Adenylatkinase (adk), Fumerathydratase (fumC), Isocitrat-/

Isopropylmalat-Dehydrogenase (icd), Malatdehydrogenase (mdh), Adenylsuccinat-

dehydrogenase (purA) und das ATP/ GTP binding motif (recA) bestimmt. Die

Sequenzanalyse erfolgte mit der SeqSphere+ software (Ridom GmbH, Version 1.0).

Die MLST ST und die CC wurden entsprechend einer öffentlich zugänglichen

Datenbank (http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli; letzter Aufruf 01.09.16)

zugeordnet. Die SeqSphere+ software wurde genutzt, um die phylogenetische

Abstammung mittels Minimum Spanning Tree (MSTree) darzustellen.

Bei ausgewählten Isolaten erfolgte eine Subtypisierung mittels Sanger-

Sequenzierung. War keine eindeutige Zuordnung möglich, wurden alle möglichen

Allele angegeben. Wurde kein Ergebnis erzielt, wurden die Isolate als „nicht

typisierbar“ bezeichnet.

2.2.5 Statistische Analyse

Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt. Konfidenzintervalle für

Prozentzahlen wurden nach der Methode von Wilson ermittelt. Die statistischen

Verfahren sind in Tab. 10 aufgeführt und die Werte wurden mit Hilfe von IBM SPSS

Statistics 22 bestimmt.

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2. Eigene Untersuchungen

45

Tab. 10: Statistische Berechnungen

Statistisches Testverfahren Geprüfte Variable

Mann-Whitney-U-Test Alter Proband und Geschlecht allgemein

Arbeitszeit nach Geschlecht allgemein

MRSA-Status und Arbeitszeit/ Betrieb

ESBL-Status und Alter

ESBL-Status und Arbeitszeit/ Betrieb

Exakter Test nach Fisher MRSA-Status Proband und MRSA-Status Betrieb

MRSA-Status und Geschlecht

MRSA-Status und Betriebsgröße Schwein

MRSA-Status und Nutzung Rein-Raus-Verfahren

Schwein

MRSA-Status und Auslauf Schwein

MRSA-Status und Biohaltung Schwein

ESBL-Status und Geschlecht

ESBL-Status Probanden und Betrieb

ESBL-Status und Betriebsgröße Schwein

ESBL-Status und Verwendung Rein-Raus-Verfahren

Schwein

ESBL-Status und ökologischer/ konventioneller Betrieb

Schwein

ESBL-Status und Auslauf Schwein

ESBL-Status und Betriebsgröße Rind

ESBL-Status und Auslauf Rind

ESBL-Status und Betriebsgröße Huhn

t-Test MRSA-Status und Alter

Durchschnittsalter nach Geschlecht und MRSA-Status

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2. Eigene Untersuchungen

46

2.3 Ergebnisse

2.3.1 Studienpopulation

2.3.1.1 Untersuchte Landwirte

In landwirtschaftlichen Betrieben wurden 78 Mitarbeiter (31 Frauen und 47 Männer)

auf MRSA, davon 73 Mitarbeiter (31 Frauen, 42 Männer) zusätzlich auf die

Kolonisation mit ESBL-bildenden E. coli getestet. Bei zwei Probanden handelte es

sich nicht direkt um Mitarbeiter aus landwirtschaftlichen Betrieben. Zum einen wurde

ein Säugling mit in die Analyse aufgenommen, der von seiner Mutter während der

gesamten Arbeitszeit im landwirtschaftlichen Betrieb mittels Tragetuch mitgeführt

wurde. Zum anderen wurde ein pensionierter Landwirt, der weniger als 30 m von

einem Geflügelstall entfernt und zusammen mit einem der untersuchten

Geflügelstallarbeiter wohnte, in die Untersuchung aufgenommen. Im Folgenden sind

diese Personen mit eingeschlossen, wenn von „Mitarbeitern“ gesprochen wird.

Von den 78 Probanden arbeiteten 36 Personen in Schweinebetrieben, 25 in

Rinderbetrieben und 17 in Geflügelbetrieben. Das Durchschnittsalter betrug

45,4 Jahre (95 % Konfidenzintervall (CI) 42,6–48,2) mit einem Median von

47,0 Jahren. Es zeigte sich, dass die teilnehmenden Frauen im Mittel älter als die

Männer waren, der Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant (p = 0,15)

(Tab. 11).

Basierend auf einer 5-Tage-Woche betrug die tägliche Arbeitszeit für alle Arbeiter

durchschnittlich 6,7 h (95 % CI 6,0–7,5) mit einem Median von 8,0 h. Frauen

arbeiteten im Schnitt signifikant länger (p = 0,03).

Tab. 11: Alter und durchschnittliche Arbeitszeit pro Werktag der Teilnehmer

Merkmal Männer (n = 47) Frauen (n = 31)

Mittelwert Alter (Jahre) 44,2 (95 % CI  40,4–48,0) 47,3 (95 % CI  43,1–51,5)

Median Alter (Jahre) 46,0 48,0

Mittelwert tägliche Arbeitszeit (h) 6,2 (95 % CI  5,2–7,2) 7,6 (95 % CI  6,4–8,7)

Median tägliche Arbeitszeit (h) 8,0 8,5

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2. Eigene Untersuchungen

47

2.3.1.2 Untersuchte landwirtschaftliche Betriebe

Insgesamt nahmen 34 Betriebe an der Untersuchung teil, in 12 Betrieben wurden

keine Mitarbeiter beprobt. Im Landkreis VR befanden sich 11 Betriebe, in VG 12

Betriebe, im LRO 7 Betriebe und im Landkreis MSE 4 Betriebe.

Schweinebetriebe: Insgesamt 17 der 34 Betriebe waren Schweinehaltungen. Davon

lagen 7 im LRO, 6 in VR, 3 im Landkreis VG, und einer im Landkreis MSE. Es waren

sowohl reine Mast-, Zucht- und Aufzuchtbetriebe als auch gemischte Betriebe

beteiligt (Tab. 12).

Tab. 12: Kennzahlen der 17 untersuchten Schweinebetriebe

Kennzahl Ausprägung Anzahl

Nutzungsrichtung Mast

Zucht

Aufzucht

Gemischt

5

2

1

9

Betriebsgröße Haltung > 700 Schweine

Haltung 151-700 Schweine

Haltung 50-150 Schweine

13

3

1

Verwendung

Rein-Raus-System

Ausschließlich

Teilweise

Nein

13

2

2

Auslauf Ja

Nein

3

14

Haltungsform Biologische Betriebe

Konventionelle Betriebe

4

13

In 13 Betrieben wurden über 700, in drei Betrieben 151–700 Tiere und in einem

Betrieb 50–150 Tiere gehalten.

Das Rein-Raus-Verfahren, bei dem alle Schweine eines Durchgangs gleichzeitig ein-

und ausgestallt werden, wurde in 13 Betrieben angewendet. Zwei Betriebe nutzten

dieses System teilweise und zwei Betriebe belegten ihre Ställe kontinuierlich.

In 14 Betrieben erfolgte eine ausschließliche Stallhaltung, wohingegen in drei

Betrieben den Tieren zeitweilige Ausläufe gewährt wurden. Bei vier Betrieben

handelte es sich um ökologische/ biologische Tierhaltungen (gemäß EG-Öko-

Verordnung [168]).

Die Haltungsformen der untersuchten Betriebe waren insgesamt sehr heterogen, vor

allem in Betrieben, die Tiere mit unterschiedlichen Nutzungsrichtungen hielten.

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2. Eigene Untersuchungen

48

Überwiegend wurden die Schweine auf Spalten- (11/17) oder Teilspaltenböden

(9/17) gehalten. Am dritthäufigsten war die Haltung von Ferkeln in sogenannten

Flatdecks (8/17), bei denen die Böden der Aufzuchtabteile eine geringere

Spaltenweite aufweisen.

Rinderbetriebe: Es nahmen 11 Rinderbetriebe an den Untersuchungen teil, wobei

sich 9 im Landkreis VG und 2 im Landkreis VR befanden.

Sieben Betriebe hielten über 250 Tiere, drei weitere Betriebe stallten zwischen

100–250 und ein Betrieb zwischen 50–99 Tieren ein. Alle Betriebe hielten Milchvieh,

zwei Betriebe zusätzlich Mastvieh und ein Betrieb zusätzlich Mastvieh und

Mutterkühe (Tab. 13).

Tab. 13: Kennzahlen der 11 untersuchten Rinderbetriebe

Kennzahl Ausprägung Anzahl

Nutzungsrichtung Milchvieh

Milchvieh/ Mastvieh

Milchvieh/ Mastvieh/ Mutterkühe

8

2

1

Betriebsgröße Haltung > 250 Rinder

Haltung 100–250 Rinder

Haltung 50–99 Rinder

8

2

1

Verwendung

Rein-Raus-System

Ja

Nein

0

11

Weidehaltung Ja

Nein

6

5

Haltungsform Biologische Betriebe

Konventionelle Betriebe

0

11

Auch aufgrund der überwiegenden Milchviehhaltung wurde das Rein-Raus-Verfahren

nicht praktiziert. Der Großteil der Tiere wurde in Laufställen auf Voll- oder

Teilspaltenböden gehalten. Weidehaltung war bei 6 Betrieben eine temporäre

Option. Es waren keine ökologischen Betriebe beteiligt.

Geflügelbetriebe: Insgesamt nahmen 6 Geflügelbetriebe teil. Bei 4 Betrieben

handelte es sich um Hühnermast-, bei 2 um Putenmastbetriebe (Tab. 14). Alle

Masttiere wurden in Bodenhaltung auf Tiefstreu gehalten und waren der

konventionellen Landwirtschaft zuzuordnen. Bei allen untersuchten Betrieben wurde

das Rein-Raus-Verfahren praktiziert.

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2. Eigene Untersuchungen

49

Tab. 14: Kennzahlen der 6 untersuchten Geflügelbetriebe

Kennzahl Ausprägung Anzahl

Nutzungsrichtung Hühnermast

Putenmast

4

2

Betriebsgröße Hühner: > 100.000 Tiere 2

20.000–100.000 Tiere 2

Puten: 10.000–20.000 Tiere

2

Verwendung

Rein-Raus-System

Ja

Nein

6

0

Auslauf Ja

Nein

0

6

Haltungsform Biologische Betriebe

Konventionelle Betriebe

0

6

Von den vier untersuchten Hühnermastbetrieben lagen drei im Landkreis VR und

einer im Landkreis MSE. Zwei Betriebe hielten über 100.000 Tiere und zwei Betriebe

zwischen 20.000–100.000 Tieren.

Die Putenmastbetriebe lagen beide im Landkreis MSE und hielten zwischen 10.000–

20.000 Tiere.

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2. Eigene Untersuchungen

50

2.3.2 Vorkommen von MRSA

2.3.2.1 Mitarbeiter

Von den 78 untersuchten Mitarbeitern wurden 20 (25,6 %) positiv auf MRSA getestet;

davon waren alle in der Schweinehaltung beschäftigt (Tab. 15).

Tab. 15: MRSA-Nachweise der untersuchten Probanden, aufgeschlüsselt nach Tierhaltung

Tierart MRSA-positive Mitarbeiter % (95 % CI)

Schwein 20/36 55.6 (38.9–70.98)

Rind 0/25 0

Geflügel

Broiler 0/8 0

Mastputen 0/9 0

Summe 20/78 25.6 (16.7–35.9)

Das Baby und der pensionierte Landwirt wiesen keine nasale Kolonisation mit MRSA

auf, beide hatten keinen direkten oder indirekten Kontakt zur Schweinehaltung.

Alle bis auf einen MRSA-positiven Mitarbeiter waren in Betrieben mit einer MRSA-

positiven Staubprobe beschäftigt. Probanden, die in einem Betrieb mit einer MRSA-

positiven Staubprobe arbeiteten, hatten ein statistisch signifikant höheres Risiko,

selbst zum LA-MRSA-Träger zu werden (p < 0,001; Phi = 0,82). Deshalb wurden in

den folgenden Betrachtungen nur Mitarbeiter eingeschlossen, die in MRSA-positiven

Betrieben arbeiteten (n = 24).

Alter und MRSA-Status: Das Durchschnittsalter aller Mitarbeiter aus den MRSA-

positiven Betrieben (n = 24) betrug 49,0 Jahre (95 % CI 44,4–53,5) mit einem Median

von 48,5 Jahren. Das Alter der 19 MRSA-positiven Mitarbeiter aus diesen

Schweinebetrieben belief sich auf durchschnittlich 48,7 Jahre (95 % CI 44,1–53,3)

mit einem Median von 49,0 Jahren, das der 5 MRSA-negativ getesteten Mitarbeiter

auf 50,0 (95 % CI 30,0–70,0) mit einem Median von 48,0 Jahren. Die starken

Überschneidungen beider Gruppen sind in Abb. 3 ersichtlich (p = 0,82).

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2. Eigene Untersuchungen

51

Abb. 3: MRSA-Status und Alter der Probanden aus Betrieben mit MRSA-positiven Staubproben

Geschlecht und MRSA-Status: In den MRSA-positiv getesteten Schweinebetrieben

arbeiteten 12 Frauen und 12 Männer, von denen 10 Frauen und 9 Männer selbst

MRSA-positiv waren. Die Verteilung der MRSA-Positivität zwischen den

Geschlechtern spricht dafür, dass kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen

Frauen und Männern bestand, wie der exakte Test nach Fisher bestätigte (p = 1,0).

Alter, Geschlecht und MRSA-Status: In Betrieben mit MRSA-positiven

Staubproben waren die untersuchten Frauen durchschnittlich 50,9 Jahre (95 % CI

45,72–56,11) und die Männer 47,0 Jahre (95 % CI 38,72–55,28) alt (p = 0,39).

MRSA-positive Frauen waren statistisch signifikant älter als MRSA-positive Männer

(p = 0,03) und MRSA-negative Frauen (p = 0,03) (Tab. 16).

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2. Eigene Untersuchungen

52

Tab. 16: Durchschnittsalter (in Jahren) der untersuchten Probanden in MRSA-positiven Schweinebetrieben nach Geschlecht und MRSA-Status

MRSA-positiv MRSA-negativ

Vergleich innerhalb der Zeile

Männer 43,8 (n = 9) 56,7 (n = 3) p = 0,15

Frauen 53,1 (n = 10) 40,0 (n = 2) p = 0,03

Vergleich inner-halb der Spalte

p = 0,03 p = 0,32

Arbeitszeit und MRSA-Status: Durchschnittlich arbeiteten die MRSA-positiven

Probanden 8,8 h pro Werktag (95 % CI 8,28–9,22), die MRSA-negativen Probanden

6,9 h pro Werktag (95 % CI 3,21–10,63). Von den fünf MRSA-negativ beprobten

Probanden aus MRSA-positiv getesteten Betrieben arbeitete ein Proband täglich

lediglich 1,6 h am Tag, wodurch das Konfidenzintervall wie oben beschrieben sehr

groß ausfällt. Der exakte Test nach Fisher bestätigte, dass kein statistisch

signifikanter Zusammenhang zwischen der durchschnittlichen Arbeitszeit und dem

MRSA-Status bestand (p = 0,24).

Arbeitszeit im Betrieb, Geschlecht und MRSA-Status: Bei der Betrachtung von

Geschlecht, Arbeitszeit und MRSA-Status ergaben sich keine statistisch signifikanten

Unterschiede zwischen MRSA-positiven (p = 0,97) und MRSA-negativen (p = 0,80)

Probanden (Abb. 4).

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2. Eigene Untersuchungen

53

Abb. 4: Arbeitszeit, Geschlecht und MRSA-Status der Mitarbeiter aus MRSA-positiven Betrieben

2.3.2.2 Staubproben landwirtschaftlicher Betriebe

Schweinebetriebe

Von den 17 gepoolten Staubproben aus Schweinebetrieben wurden 6 MRSA-positiv

getestet (35,3 %). Diese Schweinebetriebe waren auf alle teilnehmenden Landkreise

verteilt.

Nutzungsart der Schweinebetriebe und MRSA-Status: Es wiesen sowohl reine

Mastschweinhaltungen als auch gemischte Zucht- und Aufzuchtbetriebe MRSA-

positive Staubproben auf (Tab. 17).

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2. Eigene Untersuchungen

54

Tab. 17: Betriebsart und MRSA-Status der Schweinebetriebe

Betriebsart Anzahl untersuchter

Betriebe Anzahl MRSA-positiver

Betriebe

Mast 5 3

Zucht 2 0

Aufzucht 1 0

Zucht/ Aufzucht 6 3

Zucht/ Aufzucht/ Mast 2 0

Summe 17 6

Betriebsgröße der Schweinebetriebe und MRSA-Status: Alle MRSA-positiv

getesteten Betriebe hielten > 700 Schweine, die vier Betriebe mit ≤ 700 Schweinen

waren MRSA-negativ. Der exakte Test nach Fisher zeigte keine statistische

Signifikanz (p = 0,14).

Haltungsform der Schweinebetriebe und MRSA-Status: Das Rein-Raus-

Verfahren wurde von 5 der 6 MRSA-positiven Schweinebetriebe ausschließlich

verwendet. Der andere positive Betrieb nutzte dieses Verfahren nur teilweise. Es gab

keinen statistisch signifikanten Einfluss des Rein-Raus-Verfahrens auf den MRSA-

Status der Betriebe (p = 0,56). Alle MRSA-positiv getesteten Betriebe hielten die

Tiere durchgehend im Stall (p = 0,24). Keiner der untersuchten vier Betriebe mit

ökologischer Tierhaltung wies MRSA auf, eine statistische Signifikanz wurde nicht

nachgewiesen (p = 0,14).

Rinder- und Geflügelbetriebe

In keiner der untersuchten Staubproben aus Rinder- oder Geflügelbetrieben konnten

MRSA nachgewiesen werden.

Bei keinem der 60 untersuchten Choanentupfer wurden MRSA detektiert.

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2. Eigene Untersuchungen

55

2.3.2.3 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung

Alle der 20 Mitarbeiter- und Staubproben-MRSA-Isolate wiesen das mecA-Gen auf

und waren PVL-negativ.

Resistenztestung, MLST und spa-Typisierung

Alle MRSA-positiven Isolate wiesen Resistenzen gegen Benzylpenicillin, Oxacillin

und Oxytetrazyklin auf. Die MLST ergab bei allen Isolaten eine Zugehörigkeit zum

CC398 (Tab. 18).

Tab. 18: Ergebnisse der Typisierung der MRSA-positiven Isolate der Nasen-Rachentupfern von Mitarbeitern und Staubproben aus Schweineställen (modifiziert nach [169])

Betrieb Herkunft klonaler

Komplex

(CC)

spa-Typ Resistenzmuster

OXA TET ERY CLI CIP MFL GEN

Betrieb Nr. 1 * Staubprobe CC398 t1451 x x x x

Betrieb Nr. 4 Staubprobe CC398 t034 x x x x

Mitarbeiter 4-2 CC398 t2370 x x x x

Mitarbeiter 4-3 CC398 t10721 x x

Mitarbeiter 4-4 CC398 t034 x x x x

Mitarbeiter 4-5 CC398 t2370 x x x x

Mitarbeiter 4-6 CC398 t2370 x x

Mitarbeiter 4-8 CC398 t2370 x x x x

Mitarbeiter 4-9 CC398 t2370 x x x x

Mitarbeiter 4-10 CC398 t2370 x x x x

Betrieb Nr. 7 Staubprobe CC398 t034 x x x x x

Mitarbeiter 7-1 CC398 t034 x x x x x x

Mitarbeiter 7-2 CC398 t034 x x x x x x

Mitarbeiter 7-3 CC398 t3275 x x x x x x

Mitarbeiter 7-5 CC398 t034 x x x x x x

Betrieb Nr. 8 Staubprobe CC398 t034 x x x x

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2. Eigene Untersuchungen

56

Mitarbeiter 8-1 CC398 t034 x x x x

Mitarbeiter 8-2 CC398 t011 x x x x

Betrieb Nr. 9 Mitarbeiter 9-1# CC398 t011 x x x x x

Betrieb Nr. 11 Staubprobe CC398 t011 x x

Mitarbeiter 11-1 CC398 t011 x x x

Mitarbeiter 11-2 CC398 t011 x x x

Mitarbeiter 11-3 CC398 t011 x x

Betrieb Nr. 12 Staubprobe CC398 t011 x x

Mitarbeiter 12-2 CC398 t2370 x x

Mitarbeiter 12-3 CC398 t034 x x

*in diesem Betrieb keine Teilnahme von Mitarbeitern #die zugehörige Staubprobe des Betriebes fiel MRSA-negativ aus

Mitarbeiter: Fünf der 20 positiven Mitarbeiter-MRSA-Proben wiesen allein eine

Resistenz gegen β-Laktame und Oxytetrazyklin auf. Acht Isolate exprimierten

zusätzlich eine Erythromycin- und Clindamycinresistenz. Zwei dieser Isolate

verfügten neben der β-Laktam- und Tetrazyklinresistenz zusätzlich über eine

Resistenz gegen Gentamicin. Die Isolate von vier Mitarbeitern, die alle im gleichen

Betrieb (Betrieb Nr. 7) beschäftigt waren, wiesen Resistenzen gegen Antibiotika aus

fünf verschiedenen Klassen (β-Laktame, Tetrazykline, Makrolide, Lincosamide und

Fluorchinolone) auf. Das MRSA-Isolat eines Mitarbeiters (Mitarbeiter 9-1) exprimierte

ebenfalls Resistenzen gegen fünf Antibiotikaklassen; dieses Isolat exprimierte

allerdings an Stelle der Fluorchinolon- eine Gentamicinresistenz (Tab. 18).

Bei den 20 MRSA-positiv getesteten Mitarbeiter-Isolaten wurden 5 verschiedene

spa-Typen detektiert, wobei t2370 (7/20), gefolgt von t034 (6/20) und t011 (5/20) am

häufigsten isoliert wurden. Die spa-Typen t10721 und t3275 kamen jeweils einmal

vor.

Staubproben: Von den 6 MRSA-positiven Staubproben wiesen zwei Isolate allein

Resistenzen gegen die β-Laktame Benzylpenicillin und Oxacillin sowie gegen

Oxytetrazyklin auf und exprimierten demnach keine Multiresistenz (Tab. 18). Drei der

vier weiteren Staubproben zeigten eine zusätzliche Resistenz gegen Erythromycin

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2. Eigene Untersuchungen

57

und Clindamycin. Ein Isolat exprimierte zusätzlich neben der β-Laktam- und

Tetrazyklinresistenz auch Resistenzen gegen Fluorchinolone (Ciprofloxacin,

Moxifloxacin) und Aminoglykoside (Gentamicin).

Insgesamt konnten drei verschiedene spa-Typen aus den Staubproben isoliert

werden. Am häufigsten war t034 (3/6) nachweisbar, gefolgt von t011 (2/6) und t1451

(1/6).

Vergleich der Resistenzmuster: Vier der 6 MRSA-Staubproben wiesen das gleiche

Resistenzmuster auf (Tab. 18), dass auch in mindestens einer der zugehörigen

MRSA-positiv getesteten Mitarbeiterproben detektiert wurde. Bei dem MRSA-Isolat

der Staubprobe aus Betrieb Nr. 4 wurde eine Erythromycin- und

Clindamycinresistenz festgestellt, die ebenfalls in 6 von 8 MRSA-Mitarbeiter-Isolaten

aus diesem Betrieb nachgewiesen wurde. In der Staubprobe aus Betrieb Nr. 8 fand

sich das gleiche Resistenzmuster wie in den beiden korrespondierenden humanen

MRSA-Isolaten wieder. Die Staubprobe aus Betrieb Nr.11 und ein Mitarbeiterisolat

zeigten eine Resistenz gegen Oxacillin und Oxytetrazyklin, zwei weitere MRSA-

Mitarbeiter-Isolate aus diesem Betrieb wiesen zusätzlich eine Gentamicinresistenz

auf. Die Staub- und Mitarbeiter-Isolate aus Betrieb Nr.12 wiesen ausnahmslos das

gleiche Resistenzmuster auf. In Betrieb Nr. 7 wies das MRSA-Isolat aus der

Staubprobe im Gegensatz zu den zugehörigen vier MRSA-Mitarbeiter-Isolaten keine

Erythromycinresistenz auf. Jedoch exprimierten alle Isolate eine Clindamycin- und

Fluorchinolonresistenz.

Vergleich der isolierten spa-Typen: In Tab. 18 ist die Verteilung der spa-Typen der

Probanden und Staubproben aus den zugehörigen Betriebe dargestellt. Insgesamt 8

humane Isolate wiesen den selben spa-Typ wie das Isolat der korrespondierenden

Staubprobe auf. In drei Betrieben wurden jeweils Staub- und humane Isolate mit

identischen spa-Typen sowie Resistenzprofilen detektiert.

Der Vergleich der Repeatprofile der isolierten spa-Typen zeigt, dass sich die spa-

Typen t034 und t011 einzig durch zwei zusätzliche Repeats unterschieden (Tab. 19).

Der ebenfalls häufig isolierte spa-Typ t2370 unterscheidet sich von t034 durch die

Duplikation des zweiten Repeats.

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2. Eigene Untersuchungen

58

Tab. 19: Repeats der isolierten spa-Typen (http://spaserver.ridom.de/spaserver)

spa-Typ

Repeatprofil

08 16 34 02 25 02 25 34 24 25

t034 x x x x x x x x x

t011 x x x x x x x

t2370 x xx* x x x x x x x

t1451 x x x x x x

t10721 x xx*

t3275 x x x x x x x x

* Duplikation des Repeats

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2. Eigene Untersuchungen

59

2.3.3 Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli

2.3.3.1 Mitarbeiter

Insgesamt gaben 74 Mitarbeiter einen Inguinalabstrich ab. Einer dieser Probanden

wurde von den Analysen ausgeschlossen, weil bei diesem in der Schweinehaltung

Beschäftigten Morganella morganii ssp. sibonii mit zweifelhaftem Befund bzgl. des

ESBL-Status nachgewiesen wurde (Cefotaxim + Ceftazidim resistent, E-Test mit

Cefotaxim und Ceftazidim für diese Spezies nicht ausgelegt). Dieser hätte durch

weitergehende Untersuchungen bestätigt werden müssen. Der Fokus der

vorliegenden Arbeit lag auf ESBL-bildenden Escherichia spp.

Bei 5 der in die Analyse eingeschlossenen 73 Mitarbeitern (6,8 %) konnte ein ESBL-

bildender E. coli nachgewiesen werden (Tab. 20). Der in die Auswertung

eingeschlossene Säugling und der Proband ohne direkten Tierkontakt wiesen keinen

ESBL-bildenden E. coli auf.

Tab. 20: Anzahl ESBL-positiver Betriebe und Mitarbeiter

Anteil ESBL-positiv getesteter Betriebe/

teilnehmende Betriebe

Anteil ESBL-positiv getesteter

Mitarbeiter/ teilnehmende

Mitarbeiter

Anzahl der in ESBL-positiven

Betrieben beschäftigten

Mitarbeiter

Schwein 14/17 3/32 30

Rind 6/11 2/24 18

Geflügel

Hühnermast

Putenmast

3/4

0/2

0/9

0/8

7

0

Summe 23/36 5/73 55

Alle Mitarbeiter mit einem ESBL-positiven Befund arbeiteten in Betrieben mit einer

ESBL-positiven Kotsammelprobe. In die weiteren statistischen Analysen wurden nur

die 55 Probanden eingeschlossen, die in Betrieben mit einer ESBL-positiven

Kotsammelprobe beschäftigt waren. Es wurde kein statistisch signifikanter

Zusammenhang zwischen dem ESBL-Status der Betriebe und den dort beschäftigten

Mitarbeitern mit dem exakten Test nach Fisher festgestellt (p = 0,23; Phi = 0,16).

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2. Eigene Untersuchungen

60

Alter und ESBL-Status: Im Mittel waren die Probanden aus den ESBL-positiven

Betrieben 46,6 Jahre (95 % CI 43,1–50,0) alt (Median 47,0 Jahre). Bei den

Mitarbeitern mit einem ESBL-positiven Befund betrug das Durchschnittsalter 47,4

(95 % CI 38,7–56,1) und Median 46,0 Jahre (Abb. 5). Die ESBL-negativen Mitarbeiter

waren im Mittel 46,5 Jahre alt (95 % CI 42,7–50,2), mit einem Median von 47,0

Jahren. Gemäß Mann-Whitney-U-Test ergab sich kein statistisch signifikanter

Unterschied zwischen den Gruppen (p = 0,94).

Abb. 5: Vergleich des Alters der ESBL-positiven und ESBL-negativen Mitarbeiter aus Betrieben mit einer ESBL-positiven Kotsammelprobe

Geschlecht und ESBL-Status: Insgesamt arbeiteten 26 Frauen und 29 Männer in

Betrieben mit einer ESBL-positiven Kotsammelprobe. Bei den als ESBL-negativ

getesteten Probanden waren 23 Personen weiblich und 27 männlich. Von den fünf

ESBL-positiv getesteten Probanden waren drei weiblich und zwei männlich.

Hinsichtlich der Kolonisation mit ESBL-Bildnern bestand kein statistisch signifikanter

Unterschied zwischen Männern und Frauen (p = 0,45).

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2. Eigene Untersuchungen

61

Arbeitszeit und ESBL-Status: Die durchschnittliche Arbeitszeit aller Probanden aus

Betrieben mit einem ESBL-positiven Befund betrug 6,7 h pro Werktag (95 % CI 5,7–

7,7). Ein statistisch signifikanter Unterschied der Arbeitszeit zwischen den ESBL-

positiven und den ESBL-negativen Probanden konnte nicht festgestellt werden

(p = 0,13) (Tab. 21).

Tab. 21: Durchschnittliche Arbeitszeit pro Werktag der ESBL-positiven und ESBL-negativen Mitarbeiter aus ESBL-positiven Betrieben

Durchschnittliche Arbeitszeit (h)

ESBL-positive Mitarbeiter

(n = 5)

ESBL-negative Mitarbeiter

(n = 50)

Mittelwert 9,2 (95 % CI 7,2–11,2) 6,5 (95 % CI 5,4–7,5)

Median 8,5 8,0

Minimum 8,0 0,0*

Maximum 12,0 12,0

* pensionierter Proband ohne direkten Tierkontakt

2.3.3.2 Kot-/ Sockenproben landwirtschaftlicher Betriebe

Schweinebetriebe

Es wiesen 14 der 17 untersuchten Schweinebetriebe (82,4 %) mindestens eine

ESBL-positive Kotsammelprobe auf. In der Publikation der Ergebnisse der

Schweinebetriebe kam es zu einer Verwechslung. Fälschlicherweise wurden

insgesamt 15 von 17 Betrieben als ESBL-positiv bezeichnet [170]. Das trifft für das

Jahr 2012 nicht zu.

Insgesamt wurden 36 Isolate gefunden, wobei es sich bei drei Isolaten aufgrund der

identischen MLST und PCR-Ergebnisse vermutlich um Klone des gleichen E. coli im

selben Betrieb handelte (Anhang, Tab. 26). Ein Isolat wurde als E. hermanii bestätigt.

Nutzungsart der Schweinebetriebe und ESBL-Status: Bei allen untersuchten

Nutzungsarten konnten ESBL-bildende Escherichia spp. aus den Kotsammelproben

isoliert werden. Bei zwei Mastbetrieben und einem Zucht/ Aufzucht-Betrieb wurden

keine ESBL-Bildner nachgewiesen (Tab. 22).

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2. Eigene Untersuchungen

62

Tab. 22: Betriebsart und ESBL-Status der Schweinebetriebe

Betriebsart Anzahl getesteter Betriebe Anzahl ESBL-positiver Betriebe

Mast 5 3

Zucht 2 2

Aufzucht 1 1

Zucht/ Aufzucht 6 5

Zucht/ Mast 1 1

Zucht/ Aufzucht/ Mast 2 2

Summe 17 14

Betriebsgröße der Schweinebetriebe und ESBL-Status: Bei den ESBL-positiven

Betrieben waren sowohl Betriebe mit > 700 (11/13) Schweinen als auch Betriebe mit

≤ 700 (3/4) Schweinen betroffen. Ein Einfluss der Betriebsgröße auf den ESBL-

Status des Betriebes konnte statistisch nicht nachgewiesen werden (p = 0,12).

Haltungsform der Schweinebetriebe und ESBL-Status: Von den ESBL-positiven

Schweinebetrieben nutzten vier Betriebe das Rein-Raus-Prinzip teilweise oder gar

nicht. Die restlichen 10 Betriebe verwendeten dieses Verfahren vollständig. Alle

ESBL-negativen Betriebe wandten das Rein-Raus-Verfahren vollständig an

(p = 0,42). Bei diesen Betrieben handelte es sich um Betriebe mit konventioneller

Tierhaltung. Die Haltungsart, ob konventionell oder ökologisch, hatte keinen

statistisch signifikanten Einfluss auf den ESBL-Status (p = 0,42).

In zwei ESBL-positiven Betrieben stand den Schweinen zumindest ein zeitweiliger

Auslauf zur Verfügung. Eine Signifikanz bzgl. Auslauf und ESBL-Status wurde nicht

nachgewiesen (p = 0,47).

Rinderbetriebe

Insgesamt wiesen 6 der 11 (54,5 %) getesteten Rinderbetriebe mindestens eine

ESBL-positive Sammelkotprobe auf. Es konnten 10 Isolate gewonnen werden

(Anhang, Tab. 27).

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2. Eigene Untersuchungen

63

Nutzungsart der Rinderbetriebe und ESBL-Status: Die Aufteilung der

Rinderbetriebe nach Nutzungsart im Zusammenhang mit dem ESBL-Status ist in

Tab. 23 aufgeschlüsselt. Es wiesen sowohl reine Milchviehbetriebe als auch ein

gemischter Betrieb mit Milch- und Masttieren ESBL-positive Kotproben auf.

Tab. 23: Betriebsart und ESBL-Status Rinderbetriebe

Nutzungsart Anzahl getesteter

Betriebe Anzahl ESBL-positiver Betriebe

Milchvieh 8 5

Milchvieh/ Mast 2 1

Milchvieh/ Mutterkuh/ Mast 1 0

Summe 11 6

Betriebsgröße der Rinderbetriebe und ESBL-Status: Von den 7 Betrieben die

über 250 Rinder hielten, waren 3 Betriebe ESBL-positiv. Von den 4 Betrieben, die

≤ 250 Rinder hielten, waren 3 ESBL-positiv. Ein statistisch signifikanter

Zusammenhang der Betriebsgröße und des ESBL-Status konnte nicht nachgewiesen

werden (p = 0,35).

Haltungsform der Rinderbetriebe und ESBL-Status: Das Rein-Raus-Verfahren

wurde in den Rinderbetrieben nicht genutzt. Bei keinem der Rinderbetriebe handelte

es sich um einen ökologischen Betrieb. In 6 Betrieben wurde den Tieren ein

zeitweiliger Auslauf ermöglicht, 5 davon wiesen eine ESBL-positive Kotsammelprobe

auf (p = 0,07).

Geflügelbetriebe

Es wiesen 3 der 6 Geflügelbetriebe (50 %) eine ESBL-positive Sockenprobe auf,

wobei je Sockenprobe ein E. coli-Isolat detektiert wurde. Bei allen positiven Betrieben

handelte es sich um Hühnermastbetriebe. Die beiden teilnehmenden

Putenmastbetriebe waren dementsprechend ESBL-negativ. Da sich die Haltung von

Mastputen und Masthühnern unterscheidet, wurden bei der nachfolgenden

statistischen Auswertung die Putenmastbetriebe nicht eingeschlossen.

In zwei Betrieben fanden sich ESBL-positive Tiere mittels Kloakentupferproben,

wobei in einem Betrieb ein ESBL-positives Tier und in dem anderen Betrieb

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2. Eigene Untersuchungen

64

8 ESBL-positive Tiere detektiert wurden. Insgesamt wurden 41 Isolate sequenziert

und 10 unterschiedliche Isolate bei den 9 ESBL-positiven Tieren nachgewiesen

(Anhang, Tab. 28).

Betriebsgröße der Hühnermastbetriebe und ESBL-Status: Zwei der drei ESBL-

positiven Hühnermastbetriebe hielten zwischen 20.000 und 100.000 Tieren. Der

andere ESBL-positive Betrieb hielt > 100.000 Tiere. Der ESBL-negative

Hühnermastbetrieb hielt  > 100.000 Tiere. Eine statistische Signifikanz der

Betriebsgröße bestand nicht (p = 0,50).

Haltungsform der Hühnermastbetriebe und ESBL-Status: Alle Geflügelbetriebe

nutzten das Rein-Raus-Verfahren und hielten die Tiere ausschließlich im Stall.

Ökologische Betriebe nahmen nicht teil.

2.3.3.3 Molekularbiologische Untersuchungen

Die gewonnenen Isolate wurden im Institut für Hygiene des UKM typisiert. Es erfolgte

eine Speziesbestätigung mittels MALDI-TOF MS für Escherichia spp. Bei einem

Isolat handelte es sich um die Spezies E. hermanii, die aufgrund ihrer Zugehörigkeit

zu den Escherichia spp. in die Auswertung aufgenommen wurde.

PCR und MLST-Ergebnisse

Insgesamt wurden 61 Isolate in die weiteren Analysen eingeschlossen. Diese ließen

sich 40 verschiedenen ST und 13 verschiedenen CC zuordnen. Der ST162 (n = 11)

trat, gefolgt von ST10 (n = 4), am häufigsten auf. In 23 Fällen ließ sich den ST keine

CC zuordnen. Es wurden 7 verschiedene Kombinationen der β-Laktamasegene

gefunden. Am häufigsten wurde CTX-M (n = 28) ohne Kombination mit anderen

β-Laktamasen nachgewiesen (Abb. 6 und Abb. 7).

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2. Eigene Untersuchungen

65

Abb. 6: Häufigkeit der nachgewiesenen Resistenzgene blaCTX-M, blaOXA, blaSHV und blaTEM bei den untersuchten Spezies (modifiziert nach [170])

Die eingekreisten Zahlen stehen für den ST, die Zahlen auf den Verbindungslinien stellen die Anzahl unterschiedlicher Allele zwischen den ST dar. Die CC sind grau unterlegt. A: farbliche Darstellung der unterschiedlichen ESBL Gene. B: Verwandtschaft humaner und tierischer Isolate

Abb. 7: Darstellung der Verwandtschaftsgrade mittels Minimum spanning trees (MSTree), basierend auf den MLST-Ergebnissen (nach [170])

5

1 0 2

32

0 0

11 8

2 1 3

1 0 2 2

0

5

10

15

20

25

30

35

CTX-M OXA SHV TEM

Mitarbeiter Schweine Rinder Geflügel

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2. Eigene Untersuchungen

66

Mitarbeiter: Den fünf ESBL-positiven Mitarbeiter-Isolaten wurden fünf verschiedene

ST und zwei verschiedene CC zugeordnet, in drei Fällen wurden keine

entsprechenden CC ermittelt (Abb. 7). Alle humanen ESBL-positiven E. coli-Isolate

wiesen CTX-M β-Laktamasen auf, zwei Isolate codierten zusätzlich für TEM und ein

Isolat für OXA (Abb. 6). Die detaillierten Ergebnisse der Untersuchung der

β-Laktamasegene und ST sind in Tab. 25 im Anhang aufgeführt.

Schweinebetriebe: Den 33 gewonnenen ESBL-Bildnern aus den

Schweinebetrieben ließen sich 27 verschiedene ST und 7 verschiedene CC

zuordnen. In 13 Fällen konnte den ST kein entsprechender CC zugeordnet werden

(Anhang, Tab. 26). Der ST10 trat insgesamt viermal in ökologisch wirtschaftenden

Betrieben auf und wies zwei verschiedene Kombinationen an β-Laktamasegenen auf

(2x blaCTX-M; 2x blaCTX-M und blaTEM).

Der MLST ST88 trat in zwei Schweinebetrieben auf, wobei es sich bei einem Betrieb

um einen reinen Zucht-, bei dem anderen um einen Zucht-/ Aufzuchtbetrieb handelte.

Beide Betriebe wiesen CTX-M ESBL und ein Betrieb zusätzlich TEM auf. Der ST48

wurde ebenfalls in zwei unterschiedlichen Betrieben detektiert. Bei einem Betrieb

handelte es sich um einen Zucht- und Aufzuchtbetrieb, der andere Betrieb hielt

zusätzlich Masttiere. Beide Betriebe waren im gleichen Landkreis lokalisiert und die

Isolate codierten für blaCTX-M. Auch der ST101 wurde in zwei unterschiedlichen

Betrieben aus den gleichen Landkreisen isoliert, auch hier handelte es sich in einem

Fall um einen Zucht- und Aufzuchtbetrieb, der andere hielt zusätzlich Mastschweine.

Bis auf eine Ausnahme exprimierten alle Isolate CTX-M ESBL; ein Isolat exprimierte

lediglich TEM. TEM β-Laktamasen wurden zusätzlich bei 10 weiteren Isolaten

nachgewiesen (Abb. 6). Ein Isolat wurde als E. hermanii verifiziert, dieses codierte für

eine CTX-M ESBL.

Rinderbetriebe: In den Rinderbetrieben wurden 10 ESBL-bildende E. coli

nachgewiesen, die 9 verschiedenen ST und vier verschiedenen CC zugeordnet

werden konnten. Fünfmal konnten den ST keine CC zugeordnet werden. Der ST446

trat, mit identischer ESBL Familie (CTX-M), zweimal in unterschiedlichen

Milchviehbetrieben aus dem gleichen Landkreis auf. Acht Isolate exprimierten eine

CTX-M ESBL, zwei davon codierten ebenfalls für OXA und ein Isolat wies zusätzlich

das Resistenzgen blaTEM auf. Ein weiteres Isolat wies die CTX-M und TEM

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2. Eigene Untersuchungen

67

β-Laktamasen auf. Ein Isolat wies nur SHV, ein weiteres nur TEM auf (Anhang, Tab.

27).

Geflügelbetriebe: Aus den Sockenproben der Hühnermastbetriebe konnten drei

ESBL-Bildner isoliert werden. Die Isolate wiesen unterschiedliche ST (ST2705,

ST115, ST162) und einen CC (CC469) auf; zweimal konnte den ST kein CC

zugeordnet werden (Anhang, Tab. 28). Ein Isolat codierte für das Resistenzgen

blaCTX-M, zwei Isolate codierten für SHV und TEM (Abb. 6).

Von den Kloakenabstrichen wurden pro Probe fünf Kolonien konserviert; alle

unterliefen der MLST und Multiplex-PCR. Bis auf eine Ausnahme handelte es sich in

allen Fällen vorrausichtlich um Klone von E. coli, weshalb diese nicht weiter in die

Auswertung mit einflossen, um das Ergebnis nicht zu verfälschen. Letztendlich

wurden 10 Isolate von 9 verschiedenen Tieren gewonnen. Alle Isolate gehörten zum

ST162 und CC469. Fünf Isolate wiesen sowohl SHV als auch TEM, fünf Isolate

wiesen nur SHV β-Laktamasen auf. Aus einem Kloakenabstrich wurden zwei Isolate

mit unterschiedlichen ESBL Familien isoliert. Diese codierten einmal für die

β-Laktamasen SHV und TEM und einmal nur für SHV.

Sanger-Sequenzierung und Vergleich ESBL-Gene/ ST bei Mensch und Tier

Abb. 7A stellt den Zusammenhang der ESBL-Gene mit den ST dar. Abb. 7B

illustriert, dass insgesamt drei ST (ST3891, ST542, ST648) sowohl beim Menschen

als auch beim Tier vorkamen. Die CTX-M-positiven ST3891-Isolate stammten von

einem Mitarbeiter und von Rinderkotproben aus dem gleichen Betrieb. Die Sanger-

Sequenzierung zeigte, dass es sich in beiden Fällen um CTX-M-1/-61 β-Laktamasen

handelte (Tab. 24). Der CTX-M-positive ST542 wurde bei einem Mitarbeiter-Isolat

eines Rinderbetriebes detektiert. Das ebenfalls CTX-M-positive tierische ST542-

Isolat stammte hingegen aus einem Schweinebetrieb. Der Proband mit der CTX-M-

positiven ST648-Probe arbeitete mit Schweinen. Das tierische ST648-Isolat stammte

aus einem anderen Schweinebetrieb und exprimierte eine TEM ESBL.

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2. Eigene Untersuchungen

68

Tab. 24: Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung und MLST der humanen und korrespondierenden tierischen ESBL-positiven Isolate

Betrieb Isolat ESBL-Allele MLST ST

Betrieb Schwein Nr. 4

Mitarbeiter 4-6

Kotprobe 4-1

Kotprobe 4-2

Kotprobe 4-3

CTX-M*, TEM-104/-206

CTX-M*, TEM-104/-206

CTX-M-1/-61

CTX-M-1/-61

ST648

ST3947

ST453

ST88

Betrieb Schwein Nr. 18 Mitarbeiter 18-1

Kotprobe 18

CTX-M-1/-61, TEM-104/-206

CTX-M-1/-61, TEM-104/-206

ST367

ST10

Betrieb Rind Nr. 6

Mitarbeiter 6-4

Mitarbeiter 6-5

Kotprobe 6

CTX-M-15/-28/-88, OXA*

CTX-M-1/-61

CTX-M-1/-61, OXA*

ST405

ST542

ST533

Betrieb Rind Nr. 10 Mitarbeiter 10-1

Kotprobe 10

CTX-M-1/-61

CTX-M-1/-61

ST3891

ST3891

* Sequenzierung nicht erfolgreich

Beim Vergleich der ESBL-Allele zwischen den humanen und tierischen Isolaten der

zugehörigen Betriebe finden sich bei Schweinebetrieb Nr. 4 und Nr. 18

Übereinstimmungen, wobei sich die MLST ST voneinander unterschieden (Tab. 24).

In Betrieb Nr. 4 war die CTX-M-Sequenzierung des humanen Isolates nicht

erfolgreich, dieses weist zudem die Variante TEM-104/-206 auf. Die

korrespondierenden Kotproben wiesen ebenfalls eine nicht typisierbare CTX-M und

TEM-104/-206 β-Laktamase auf, sowie bei zwei weiteren Isolaten die Variante

CTX-M-1/-61. In Schweinebetrieb Nr. 18 exprimierten sowohl das Isolat des

Mitarbeiters als auch der zugehörigen Kotsammelprobe die β-Laktamasen

CTX-M-1/-61 und TEM-104/-206. In Rinderbetrieb Nr. 6 stimmten die ESBL Gene der

Mitarbeiter-Isolate und der tierischen Probe teilweise überein. Die ESBL-Varianten

der Isolate der Probanden unterschieden sich voneinander, das korrespondierende

Isolat wies sowohl die bei einem Mitarbeiter detektierte CTX-1/-61 ESBL als auch

eine nicht typisierbare OXA β-Laktamase auf.

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2. Eigene Untersuchungen

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2.3.4 MRSA- und ESBL-Status der Mitarbeiter und Betriebe

Ein Mitarbeiter (Proband 4-6) aus einem Schweinebetrieb wies sowohl einen MRSA

als auch einen ESBL-bildenden E. coli auf (vgl. Tab. 18 und Tab. 24). Bei dem

nachgewiesenen MRSA handelte es sich um einen zum CC398 gehörenden spa-Typ

t2370 der gegen Oxacillin und Oxytetrazyklin resistent war. Bei dem ESBL-Bildner

handelte es sich um einen E. coli, der eine CTX-M und eine TEM-104/-206

β-Laktamase exprimierte, die dem MLST ST648 zugeordnet werden konnte. Der

zugehörige Betrieb (Nr. 4) wurde ebenfalls MRSA- und ESBL-positiv getestet.

Allerdings handelte es sich um einen CC398 spa-Typ t034, der neben Oxacillin und

Oxytetrazyklin auch gegen Erythromycin und Clindamycin resistent war. Die ESBL-

bildenden E. coli der Kotsammelproben konnten den ST3893, ST453, ST3947 und

ST88 zugeordnet werden. Alle codierten für blaCTX-M, und das ST3947-Isolat

ebenfalls für TEM-104/-206.

Insgesamt wiesen fünf Schweinebetriebe sowohl eine MRSA-positive Staubprobe als

auch eine ESBL-positive Kotsammelprobe auf.

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3. Diskussion

70

3. Diskussion

3.1 Material und Methoden

3.1.1 Studienpopulation, Betriebsfragebögen und statistische

Auswertung

Studienpopulation: Als Teil des Modellprojektes „HICARE-Gesundheitsregion

Ostseeküste“, einem lokal fokussierten Aktionsbündnis, bezog sich die Projektregion

v. a. auf die nordöstlichen Landkreise in MV. Da die Studie somit nicht alle

Landkreise berücksichtigte und nur eine kleine Stichprobe von Betrieben untersucht

werden konnte, sind die vorliegenden Ergebnisse nicht repräsentativ für ganz MV.

Des Weiteren muss davon ausgegangen werden, dass die freiwillige Teilnahme der

Betriebe und Probanden eine gewisse Selektion vorausgesetzt hat, da bspw.

Betriebe mit einem unvorteilhafteren Hygieneregime unterrepräsentiert sein könnten.

Aufgrund der verstärkten negativen Pressemitteilungen während des

Beprobungszeitraumes im Jahr 2012 herrschten seitens der Tierhalter große

Bedenken, die auch durch intensive Aufklärung und Informationen nicht vollständig

ausgeräumt werden konnten. So entstand pro Tierart eine unterschiedliche Anzahl

an teilnehmenden Betrieben und Probanden, wodurch der Vergleich untereinander

erschwert wurde.

In jeweils 6 Schweine- und Rinderbetrieben, bei denen Staub- und Kotproben

entnommen werden durften, wurden keine Mitarbeiter beprobt. Da bei einigen dieser

Betriebe auch MRSA- und ESBL-positive Isolate nachgewiesen wurden, muss davon

ausgegangen werden, dass in der Realität die humane Kolonisationsrate mit MRSA

und ESBL-Bildnern höher liegen könnte.

Betriebsfragebögen: Hinsichtlich der Erfassung der Betriebsrahmenparameter wie

Tierzahl und Haltungsform wurde von jedem Betrieb ein Fragebogen (Anlage 3a/b)

ausgefüllt. Obwohl der Einsatz von Antibiotika in den Betrieben ein wichtiger

Risikofaktor für die Entstehung von MRE zu sein scheint [95, 171], wurde dieser in

den teilnehmenden Betrieben nicht erfasst. Der Grund war, dass das LU etwa

zeitgleich in landwirtschaftlichen Betrieben in MV selbst eine umfassende Erhebung

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3. Diskussion

71

des Antibiotikaverbrauchs durchführte und eine zusätzliche Erfassung durch das

HICARE-Projekt von Seiten des LU als kontraproduktiv eingestuft wurde.

Eine Information, die im Fragebogen dokumentiert, aber nicht in die statistische

Auswertung aufgenommen wurde, ist die Haltung von weiteren Tierarten in den

Betrieben. Diese Variable wurde nach ersten Datenbegutachtungen als zu instabil

eingestuft. So hätte u. a. die Entfernung der Tierställe der verschiedenen Tierarten

untereinander, die Anzahl der dort gehalten Tiere sowie deren Haltungsart und

MRSA-oder ESBL-Status mit erfasst werden müssen. Neben Nutztieren wurden in

vielen untersuchten Betrieben auch Begleittiere (z. B. Hunde, Katzen, Pferde oder

Schafe) gehalten. Im Ergebnis einer Metaanalyse wurde die Haltung von anderen

Nutztierarten in Schweinemastbetrieben als protektiver Faktor vor einer MRSA-

Besiedelung von Schweinen ermittelt [171]. Die Autoren vermuten, dass in kleineren,

familiär geführten Betrieben häufiger weitere Nutztierarten gehalten werden als es in

großen industrialisierten Betrieben der Fall zu sein scheint. Eine innerbetriebliche

Übertragung von MRE von Nutztieren auf Begleittiere wie Hund und Katze ist

prinzipiell möglich [172, 173].

Statistische Verfahren: Aufgrund der kleinen Gruppengrößen bei der statistischen

Auswertung (z. B. ESBL-positive Probanden n = 5), müssen die gewonnenen

Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden, weshalb ergänzend deskriptive

Analysen hinzugezogen wurden. Bei der statistischen Auswertung können sich

zudem Faktoren ggf. beeinflussen und auch Confounder nicht ausgeschlossen

werden. So wurden im Fragebogen z. B. mehr Daten erfasst als letztendlich in die

Auswertung eingeflossen sind (u. a. die Erfassung der Landkreise oder die parallele

Haltung anderer Tierarten im gleichen Betrieb). Diese Faktoren könnten als Proxy-

Variablen angesehen werden.

3.1.2 MRSA

Probennahme zum MRSA-Nachweis: Die Probennahme zur Untersuchung auf

MRSA bei den Mitarbeitern entspricht den aktuellen Empfehlungen der KRINKO.

Diese rät als Screeningmaßnahme auf MRSA zum Abstrich beider Nasenvorhöfe und

des Rachens. Mitunter ist ein Abstrich der Leiste und des Perineums ebenfalls

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3. Diskussion

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sinnvoll [21]. Im klinischen Sektor konnte dargelegt werden, dass eine höhere Anzahl

von Abstrichorten zu verbesserten Detektionsraten der MRSA-Träger führten [174,

175]. Da die Exposition in den landwirtschaftlichen Betrieben vor allem durch den

Stallstaub stattfindet [2], erscheint der Nasen-Rachen-Bereich besonders betroffen.

Dennoch wurde in der vorliegenden Arbeit bei einer Stichprobe von Mitarbeitern

(n = 10) ebenfalls Inguinaltupfer auf MRSA untersucht (Daten nicht dargestellt). Die

Detektion zusätzlicher MRSA-Träger gelang dadurch jedoch nicht.

Als Screeningmethode auf MRSA hat sich in Schweine- und Geflügelställen die

Entnahme von Staubproben bewährt [2, 76, 144]. Hingegen ist die Staubbelastung in

den bei Milchvieh häufig anzutreffenden halboffenen Boxenlaufställen

vergleichsweise gering, wobei unklar ist, in welchem Umfang sich das auf die MRSA-

Detektionsrate auswirkt. Laut Literatur hätten Tankmilchproben die MRSA-

Nachweisrate verbessern können [144], was eigene vorliegende und bisher

unveröffentlichte Daten aus dem Jahr 2013 bestätigen. Eine Beprobung von

Einzeltieren ist nicht nur zeitaufwändiger, sondern auch kostenintensiver und stellt

nicht zuletzt eine zusätzliche Belastung für die Tiere dar. Dennoch könnte sie ein

differenziertes Verteilungsmuster der MRSA-Varianten in den Betrieben vermitteln

[76].

Nachweis und Resistenztestung MRSA: Bei humanen Nasen-Rachen-Abstrichen

hat sich die direkte Kultivierung auf chromogenen MRSA-Nährmedien bewährt [175,

176]. Da die oberen Schleimhäute das natürliche Habitat von S. aureus darstellen,

kann in der Regel von einer ausreichend hohen Bakteriendichte ausgegangen

werden. Trotzdem wurde zusätzlich eine nicht selektive Anreicherung durchgeführt.

Mit dieser Methode hat das Labor des IHU gute Erfahrungen gemacht. Der

Latexagglutinationstest zum Nachweis des PBP2a entspricht dem aktuellen

Wissensstand, allerdings könnten mecC-positive MRSA übersehen werden [24].

Aufgrund der vermuteten niedrigen Erregerkonzentration in den Staubproben wurde

entsprechend den Empfehlungen der EFSA eine doppelte Anreicherung durchgeführt

[2, 144].

Die Resistenztestung der MRSA-Isolate erfolgte nach dem Standardprotokoll des

RKI. Die zusätzliche Testung auf Benzylpenicillin mag obsolet erscheinen, da MRSA

im Allgemeinen resistent gegen alle gängigen β-Lactame sind. Jedoch wurden auch

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3. Diskussion

73

Penicillin-sensible MRSA beschrieben [177]. Die Resistenztestung von Oxacillin

allein und in Kombination mit Sulbactam wird klassischerweise zur Detektion von

borderline-Oxacillin resistenten S. aureus (BORSA) durchgeführt. BORSA weisen in

der Regel eine erhöhte Resistenz gegen Penicilline auf, sind aber im Gegensatz zu

MRSA sensibel gegen die Kombination Oxacillin mit Sulbactam [164]. In der

vorliegenden Studie wurde allerdings auch ein Oxacillin/ Sulbactam-sensibles, mecA-

positives Isolat detektiert. Das illustriert, dass die Resistenztestung allein keine

ausreichende Aussagekraft zur Unterscheidung von MRSA und BORSA bietet und

generell ein Nachweis des mec-Genes erfolgen sollte.

3.1.3 ESBL-bildende E. coli

Probennahme zum ESBL-Nachweis: Zur Bestimmung des ESBL-Status der

teilnehmenden Mitarbeiter wurden von den Probanden selbständig Inguinalabstriche

entnommen. Rektaltupfer hätten vermutlich zu einer höheren Nachweisrate geführt,

so konnten bei Bewohnern von Pflegeheimen durch Rektaltupfer 23 % mehr positive

Probanden als durch Inguinaltupfer (96 % versus 73 %) identifiziert werden [178].

Dennoch wurde aufgrund der vermuteten geringeren Compliance bei der Anwendung

von Rektaltupfern in der vorliegenden Arbeit davon Abstand genommen. So willigten

vier Probanden zwar in der Entnahme von Nasen-Rachen-Abstrichen ein, jedoch

nicht in Leistenabstriche. Bei der Interpretation der Ergebnisse sollte die eventuell

divergierende Sensitivität von Rektal- gegenüber Inguinalabstrichen berücksichtigt

werden.

Sammelkot- und Sockenproben sind eine einfache Methode, um einen Überblick

über die ESBL-Prävalenz in einer größeren Tierherde zu erlangen [10, 12, 13, 142].

Auch Kloakentupfer sind nachweislich eine adäquate Methode zur Überprüfung des

ESBL-Status von Tieren aus Geflügelbeständen [14, 140].

Bakteriologische Untersuchung ESBL: Die gewählte Methode der ESBL-

Isolierung stimmt mit den Empfehlungen der EFSA überein [95]. Sowohl bei

humanen als auch bei tierischen Proben wurde eine nicht selektive Voranreicherung

mit einem peptonhaltigen Nährmedium durchgeführt, die bei einer niedrigen ESBL-

Konzentration zu einer höheren Detektionsrate führt [12].

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3. Diskussion

74

Bisher ist der Einsatz von speziellen chromogenen ESBL-Nährmedien weniger weit

verbreitet [179] als der Einsatz von MacConkey-Agar, supplementiert mit einem

Cephalosporin [14, 140, 180]. Beide Verfahren basieren jedoch auf den gleichen

Grundlagen. Die Verwendung von bereits fertigen ESBL-Nährmedien könnte die

Standardisierung der ESBL-Identifikation vereinfachen, da stets dasselbe

Cephalosporin in gleicher Konzentration Anwendung findet.

Beim Vergleich verschiedener Studienergebnisse sollte immer die eingesetzte

Methode berücksichtigt werden, da es andernfalls zu Fehlinterpretationen kommen

kann, sei es bei der Probennahme (Rektal-/ Inguinalabstrich, Stuhlprobe) oder der

Analytik (mit/ ohne Voranreicherung, selektive/ nicht selektive Voranreicherung,

Verwendung unterschiedlicher Nährmedien).

Als Kritik gilt anzumerken, dass die phänotypische ESBL-Bestätigung der humanen

und tierischen Isolaten geringgradige Differenzen aufwies. So wurden im IHU die

humanen ESBL-verdächtigen Isolate mittels Agardiffusiontest mit Cefotaxim und

Ceftazidim und anschließendem E-Test mit eben diesen Antibiotika mit und ohne

Clavulansäure bestätigt. Die Interpretation der Ergebnisse des E-Tests ist mitunter

sehr subjektiv [181], weshalb alle zweifelhaften Isolate kryokonserviert und

anschließend mittels PCR typisiert wurden. Die tierischen ESBL-verdächtigen Isolate

wurden mittels Cefpodoxim Combination Disc Kit bestätigt. Vorteil dieses Tests ist

die einfache Durchführbarkeit und objektive Interpretation der Ergebnisse. Gemäß

einer Stellungnahme der EFSA sind beide Tests zur phänotypischen ESBL-

Bestätigung geeignet [95], auch wenn für die Combination Disc Methode bei gleicher

Sensitivität eine höhere Spezifität nachgewiesen wurde [151].

Weiterhin können mit beiden Bestätigungsverfahren Inhibitor-resistenten ESBL

übersehen werden und auch das gleichzeitige Vorliegen verschiedener ESBL

Familien oder von AmpC β-Laktamasen kann zu falsch negativen Ergebnissen

führen [93].

In Bezug auf die OXA β-Laktamasen muss bedacht werden, dass sie durch

Clavulansäure nur unzureichend hemmbar sind [110]. Bei den meisten OXA

β-Laktamasen handelt es sich zudem nicht um ESBL-Bilder [93]. Das könnte auch

der Grund sein, dass kein Isolat gefunden wurde, das lediglich blaOXA exprimierte,

sondern OXA immer in Kombination mit anderen ESBL-Resistenzgenen

nachgewiesen wurde.

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3. Diskussion

75

Ein Proband musste von der Analyse ausgeschlossen werden, da er mit Morganella

morganii ssp. sibonii kolonisiert war. Die beschriebenen Bestätigungsverfahren

waren auf die Detektion von ESBL-bildenden E. coli abgestimmt. Demzufolge konnte

trotz positiven Wachstums auf dem Brilliance™ ESBL-Agar keine Aussage über das

Vorhandensein einer ESBL getroffen werden. Der E-Test hätte in diesem Fall

anstelle von Cefotaxim/ Clavulansäure oder Ceftazidim/ Clavulansäure mit dem

4.-Generationscephalosporin Cefepim und Clavulansäure durchgeführt werden

müssen, da Morganalla spp. häufig über chromosomal induzierbare AmpC

β-Laktamasen verfügen [95].

Die Isolation lediglich einer morphologisch unterschiedlichen ESBL-verdächtigen

Kolonie bei den humanen und Kotsammelproben könnte zu einer eingeschränkten

Detektion der ESBL-Diversität geführt haben. Bei den Kloakentupfer wurden

unabhängig vom Phänotyp immer bis zu fünf Kolonien typisiert, wodurch sich jedoch

nur in einem Fall bei einem Huhn zwei unterschiedliche Kombinationen an ESBL

Familien bei gleichen MLST-Ergebnissen nachweisen ließen.

Eine Resistenztestung der ESBL-Isolate fand nicht statt. Somit ist keine Aussage, bei

welchen Isolaten es sich um 3- oder 4-MRGN handelt, möglich.

Molekularbiologische Untersuchungen ESBL: Die Multiplex-PCR ist die

empfohlene Methode zur Identifizierung der β-Laktamasegene [95].

Eine Bestimmung auf Ebene der Allele wurde in der vorliegenden Arbeit für die

humanen und die korrespondierenden tierischen Isolate durchgeführt. Aufgrund der

hohen Übereinstimmung der Gensequenzen einiger Allele untereinander konnte die

verwendete Methode diese auf 2–3 verschiedene Allele eingrenzen. Die ESBL

CTX-M-1 und CTX-M-61 unterscheiden sich bspw. nur in einer Aminosäure.

Die MLST zum Nachweis der 7 Housekeeping-Gene ist eine etablierte Methode, um

Verwandtschaftsbeziehungen zwischen einzelnen Isolaten aufzuzeigen [95]. Andere

Methoden, wie z. B. die PFGE, verfügen über eine hohe diskriminatorische Kraft und

hätten zu zusätzlichen Erkenntnissen verhelfen können, auch wenn die

Vergleichbarkeit zwischen den Laboren nicht immer gegeben ist [95, 158]. Allerdings

scheint bei ESBL-bildenden E. coli die MLST auch in Bezug auf die

Diskriminierungsfähigkeit der PFGE überlegen zu sein [182].

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3. Diskussion

76

3.2 Vorkommen von MRSA

3.2.1 Mitarbeiter

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass Mitarbeiter in

Schweinebetrieben besonders durch LA-MRSA gefährdet sind [4, 5, 169]. Insgesamt

waren 55,5 % der Probanden mit beruflichem Kontakt zu Schweinen mit MRSA

kolonisiert. Bezieht man nur Mitarbeiter aus Betrieben mit MRSA-positiven

Staubproben ein, waren es 79,2 %. Diese Ergebnisse sind kongruent mit

Ergebnissen anderer deutscher Studien, die zwischen 77 % und 86 % MRSA-positive

Landwirte in der Schweinehaltung detektierten [4, 5, 38].

Als mögliche Einflussfaktoren wurden in der vorliegenden Arbeit Geschlecht, Alter

und die durchschnittliche Arbeitszeit der Mitarbeiter im Betrieb erfasst. Da der MRSA-

Status des Betriebes einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Kolonisation der

Mitarbeiter hatte (p < 0,001), wurden in die statistischen Analysen nur Mitarbeiter

eingeschlossen, die in MRSA-positiven Betrieben gearbeitet hatten. Somit wurden 19

MRSA-positive und 5 MRSA-negative Probanden in die weiteren Analysen

aufgenommen.

Es konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem MRSA-Status

und dem Geschlecht nachgewiesen werden. Auch die Literatur bietet bisher wenig

Anhaltspunkte, ob es geschlechtsspezifische Gründe für die Akquisition von MRSA

gibt. Nach Bisdorff et al. (4) sind Männer mit beruflichem Kontakt zu Schweinen

signifikant häufiger mit MRSA kolonisiert als Frauen. Auch in Pflegeheimen wurden

Männer häufiger als Träger von MRSA identifiziert als Frauen [183]. Die Gründe

hierfür sind noch weitgehend unklar.

Ebenso war kein statistisch signifikanter Einfluss des Alters der Probanden auf den

MRSA-Status nachweisbar. Im klinischen Bereich zeigte sich dagegen, dass

Personen über 60 Jahren signifikant häufiger MRSA-Träger waren als jüngere [184].

Nach einer Studie von Gopal et al. [185] waren bei einem Aufnahmescreening im

Krankenhaus die MRSA-positiven Patienten durchschnittlich 74,4 Jahre und die

MRSA-negativen 56,2 Jahre alt. Ein Grund könnte auf die mit dem steigenden Alter

erhöhte Morbidität und die damit verbundenen Krankenhausaufenthalte

zurückzuführen sein.

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3. Diskussion

77

Wurden in der vorliegenden Arbeit die Faktoren Alter und Geschlecht gemeinsam

betrachtet, konnte gezeigt werden, dass MRSA-positive Frauen signifikant älter als

MRSA-positive Männer waren (p = 0,03). Zwar waren die teilnehmenden Frauen

generell älter als die untersuchten Männer, es wurde jedoch keine statistische

Signifikanz nachgewiesen (p = 0,15). Zudem konnte aufgezeigt werden, dass MRSA-

positive Frauen signifikant älter als MRSA-negative Frauen waren (p = 0,03). Das

bedarf jedoch der Überprüfung in weiteren Studien, da nur zwei Frauen in MRSA-

positiven Betrieben überhaupt negativ getestet wurden.

MRSA-negative Mitarbeiter hielten sich durchschnittlich kürzer im Betrieb auf als die

MRSA-positiven Probanden, allerdings konnte keine statistische Signifikanz

nachgewiesen werden. Andere Arbeiten zeigten hingegen einen statistischen

Zusammenhang zwischen der Arbeitszeit von landwirtschaftlichen Mitarbeitern und

der nasalen MRSA-Kolonisationsrate auf [35, 186]. Nachweislich können bereits sehr

kurze Aufenthalte in landwirtschaftlichen Betrieben auch ohne direkten Tierkontakt zu

einem erhöhten Risiko einer MRSA-Kolonisation führen [5]. Ursächlich könnte eine

aerogene Transmission sein [186, 187], da MRSA an Staubpartikel gebunden selbst

außerhalb von Ställen über längere Distanzen mit der Luft transportiert werden

können [57]. Verschiedene umweltbedingte Faktoren beeinflussen die Ausbreitung

und Überlebensdauer von S. aureus, somit ist eine Risikokalkulation für Personen die

in tierdichten Regionen wohnen, schwer durchführbar. Die MRSA-

Mindestkonzentration in der Luft, die zu einer sicheren MRSA-Kolonisation führt, ist

bisher unbekannt, auch wenn bei höheren MRSA-Konzentrationen eine nasale

Kolonisation wahrscheinlicher erscheint [186]. Cuny et al. [4] fanden im Nordwesten

Deutschlands, der Region mit der größten Anzahl an Nutztierhaltungen

Deutschlands, keine MRSA-Kolonisation in der Bevölkerung ohne direkten

Tierkontakt. Dagegen wurde in den Niederlanden ein Zusammenhang zwischen

Tierdichte und LA-MRSA-Kolonisation in der Normalbevölkerung nachgewiesen [39].

In Geflügel- und Rinderbetrieben wurden keine MRSA-positiven Mitarbeiter

detektiert, auch wenn es in der Literatur bereits zahlreiche Hinweise einer direkten

Übertragung von diesen Tierarten auf enge Kontaktpersonen gibt [5, 71, 76].

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3. Diskussion

78

3.2.2 Schweinebetriebe

In 6 der 17 (35,3 %) gepoolten Staubproben aus Schweinebetrieben waren MRSA

nachweisbar. Untersuchungen im Nordwesten Deutschlands aus dem Jahr 2008

ergaben eine deutlich niedrigere MRSA-Herdenprävalenz von 18 %, allerdings

wurden hier Einzeltiere beprobt [60]. Im Gegensatz dazu wurde im Folgejahr an der

deutsch-niederländischen Grenze mit der gleichen Methode eine weitaus höhere

Prävalenz von 70 % detektiert [38]. Auswertungen von Staubproben durch die EFSA

zeigten in deutschen Schweinezuchtbetrieben eine Prävalenz von 45 % [2], was

weitgehend kongruent zu den eigenen Ergebnissen ist. Zudem decken sich

größtenteils die Methode der Probennahme und -analyse. Die in der vorliegenden

Arbeit leicht divergierende Prävalenz kann auf den hohen Anteil untersuchter

Mastbetriebe, auf die niedrigere Zahl teilnehmender Betriebe oder auf regionale

Unterschiede zurückzuführen sein. Die von Alt et al. [188] ermittelte MRSA-Prävalenz

von 39 % in ostdeutschen Betrieben ist deckungsgleich mit den vorliegenden

Ergebnissen und deutet zudem an, dass im deutschlandweiten Vergleich die

Detektionsrate im Osten niedriger als in den tierdichten Regionen im Westen zu sein

scheint.

Die Auswertung des Betriebsfragebogens ergab, dass alle MRSA-positiven Betriebe

über 700 Tiere hielten. Allerdings fiel der Großteil der beprobten Betriebe in diese

Kategorie (13/17). Zudem waren zwei der kleineren Betriebe biologisch

wirtschaftende Betriebe, was einen Einfluss auf die MRSA-Prävalenz haben könnte.

Dass Betriebe mit einer höheren Tierzahl häufiger LA-MRSA-positiv sind als kleinere

Betriebe, wurde bereits nachgewiesen [2, 171]. Im Ergebnis einer Metaanalyse sind

Betriebe ab einer Größe von > 500 Tieren MRSA-Risikobetriebe [171]. Die Gründe

sind vermutlich multifaktoriell: So könnte z. B. in großen Betrieben mit zunehmender

Besatzdichte und Gruppengröße die Ausbreitungstendenz der MRE ansteigen [95].

Auch werden in größeren Betrieben meist häufiger Tiere zugekauft als in Betrieben

mit einer niedrigen Tierzahl, wodurch der Eintrag von MRSA in den Bestand

gefördert werden könnte [189]. Die vorliegende Arbeit unterstützt die Annahme, dass

größere Betriebe häufiger MRSA-positiv sind, da alle Betriebe, die weniger als 700

Tiere hielten, MRSA-negativ getestet wurden.

Bis Juni 2014 stufte die KRINKO lediglich berufliche Kontaktpersonen zur

Schweinemast als Risikopopulation für eine MRSA-Kolonisation ein [46], da

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3. Diskussion

79

Mastschweine häufiger MRSA-Träger zu sein scheinen als andere Nutzungsgruppen

[187]. Mittlerweile ist sowohl die Beschränkung auf die Nutzungs- als auch auf die

Tierart aufgehoben und es werden nun alle beruflich exponierten Personen zu

Schweinen, Rindern und Geflügel als MRSA-Risikogruppe angesehen [21]. Dass

nicht nur reine Schweinemastbetriebe betroffen sind, konnte auch die vorliegende

Arbeit nachweisen, da es sich bei der Hälfte der MRSA-positiven Schweinebetriebe

um kombinierte Zucht- und Aufzuchtbetriebe handelte.

Nach Fromm et al. [171] hat die Nutzung des Rein-Raus-Verfahrens keinen Einfluss

auf den MRSA-Status. Auch in der vorliegenden Studie war kein statistisch

signifikanter Einfluss nachweisbar (p = 0,56). Das Rein-Raus-Verfahren, bei dem alle

Tiere gleichzeitig ein- und ausgestallt werden, soll verhindern, dass

Krankheitserreger durch Zukauf von Tieren in die bestehende Herde eingetragen

werden. Dennoch können die Tiere schon bei der Einstallung mit MRSA kolonisiert

sein [190] oder im späteren Verlauf (z. B. durch den Einsatz von Antibiotika) einen

MRSA akquirieren [71].

Auch ob es sich um einen konventionellen oder ökologischen Betrieb handelt, hat

nach den Ergebnissen von Fromm et al. [171] keinen Einfluss auf den MRSA-Status.

Zwar wies keiner der vier in der vorliegenden Arbeit untersuchten ökologischen

Betriebe eine MRSA-positive Staubprobe auf, jedoch konnte hierfür keine statistische

Signifikanz nachgewiesen werden (p = 0,14). Ursächlich für die MRSA-negativen

Ergebnisse könnte zum einen die niedrigere Tierzahl in den ökologischen Betrieben

sein, so hielten zwei der Betriebe weniger als 700 Schweine. Aber auch die in der

Regel geringere Besatzdichte und der stärker reglementierte Antibiotikaeinsatz

kommen als Einflussfaktoren in Betracht. Statistisch gesehen kann es sich aufgrund

der geringen Anzahl teilnehmender ökologischer Betriebe auch um einen

Zufallsbefund handeln, da 7 konventionelle Schweinebetriebe ebenfalls MRSA-

negativ getestet wurden. Allerdings konnten auch Cuny et al. [191] in einem

alternativen Haltungssystem keine MRSA nachweisen. Heine [192] detektierte in 11

von 42 ökologisch wirtschaftenden Betrieben MRSA und lag mit diesen Ergebnissen

zumindest unter dem deutschlandweiten Durchschnitt.

Fromm et al. [171] konstatierten hingegen einen Einfluss der Bodenbeschaffenheit.

So hatten Schweine, die überwiegend auf Spaltenböden gehalten wurden, ein

erhöhtes MRSA-Risiko. Spaltenböden sind weit verbreitet und sollen den Kontakt der

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3. Diskussion

80

Tiere mit ihren Exkrementen minimieren, allerdings ist die Reinigung der Böden

häufig mangelhaft [171]. Auch die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tiere

wurden entweder auf Spalten- oder auf Teilspaltenböden gehalten, die untersuchten

Ferkel meist in Flatdecks, die über vergleichsweise schmalere Spalten verfügen.

Aufgrund einer fehlenden Vergleichsgruppe, z. B. Schweinen auf reiner

Tiefstreuhaltung, erfolgte in der vorliegenden Arbeit keine Aufnahme dieses Faktors

in die Risikoanalyse.

Von Interesse wäre ebenfalls, von welchen Zulieferern die Tiere bezogen wurden.

Der Tierhandel spielt im Rahmen der Globalisierung eine wichtige Rolle bei der

Ausbreitung resistenter Erreger über Ländergrenzen hinweg, so auch bei

CC398-MRSA [190].

3.2.3 Rinder- und Geflügelbetriebe

Überraschenderweise wiesen alle Rinder- als auch alle Geflügelbetriebe MRSA-

negative Staubproben auf, obwohl bereits zahlreiche Nachweise von MRSA bei

Rindern [193, 194] und Geflügel [76, 195] im Staub geführt wurden. Auch in MV

gelang in Putenmastbetrieben der Nachweis von MRSA aus einer von fünf

getesteten Staubproben sowie bei im Schlachthof untersuchten Hühnern [82, 83].

Die niedrige Zahl der teilnehmenden Geflügelbetriebe könnte einen Grund für den

fehlenden MRSA-Nachweis darstellen.

Alle in der vorliegenden Arbeit untersuchten Rinderbetriebe hielten Milchkühe, einige

zusätzlich Mastvieh oder Mutterkuhherden. Mastkälber scheinen besonders häufig

kolonisiert zu sein [71, 194]; in der vorliegenden Arbeit wurden jedoch keine reinen

Mastkälberbestände beprobt. Dass MRSA auch bei Milchkühen in MV eine Rolle

spielen, zeigte ein Nachweis aus dem Jahr 2009, bei dem eine von 25

Tankmilchproben MRSA-positiv getestet wurde [67]. Das konnte durch vorliegende

Untersuchungen aus dem Jahr 2013, in der 2 von 10 Tankmilchproben einen MRSA-

positiven Befund aufwiesen, bestätigt werden (eigene unveröff. Daten).

3.2.4 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung

Die Zugehörigkeit aller MRSA-Isolate zum CC398 ist wenig überraschend, macht

dieser Komplex doch den Großteil aller aus europäischen Nutztierbeständen

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3. Diskussion

81

isolierten MRSA aus [2]. Allerdings werden sporadisch auch andere Sequenztypen

isoliert [2], weshalb die MLST ein wichtiger Bestandteil der Surveillance darstellt.

Keines der Isolate exprimierte das Gen luk-PV. Das bestätigt, dass PVL-positive

LA-MRSA bisher selten in Europa anzutreffen sind [27, 196]. Trotz des Fehlens

dieses Virulenzfaktors ist eine Unterscheidung allein anhand des von ihm

verursachten klinischen Bildes nicht möglich. So können auch PVL-negative

ST398-MRSA zu tiefen Hautinfektionen beim Menschen führen [27].

Mehr als die Hälfte (15/26) der gewonnenen MRSA-Isolate waren den spa-Typen

t011 und t034 zuzuordnen. Diese zählen auch überregional zu den am häufigsten

isolierten spa-Typen der LA-MRSA [38, 47, 59, 197]. Allerdings wurden auch einige

seltenere spa-Typen nachgewiesen, wie z. B. der aus einer Staubprobe stammende

t1451. Dieser wurde bereits einige Jahre zuvor bei MRSA-Isolaten von Schweinen

und Patienten aus Deutschlands detektiert [38]. Ursprünglich könnte er sich durch

den Verlust eines Repeats bspw. aus t011 (vgl. Tab. 19) entwickelt haben.

Der bisher ebenfalls nur selten nachgewiesene t2370 war sogar der am häufigsten

bei Mitarbeitern isolierte spa-Typ. Er trat bei insgesamt 7 Isolaten von Probanden aus

zwei unterschiedlichen Betrieben auf. Aufgrund seiner engen Verwandtschaft zu t034

liegt es nahe, dass er durch eine Mutation aus eben diesem entstanden sein könnte

(vgl. Tab. 19). Um die genauen phylogenetischen Hintergründe zu analysieren,

wären jedoch weitere Untersuchungen nötig.

Die Resistenz gegen Oxacillin und Oxytetrazyklin ist charakteristisch für den CC398.

Vermutlich liegt das am hohen Einsatz dieser Antibiotika in der Tierhaltung, so waren

β-Laktame (2012: 507 t) und Tetrazykline (2012: 566 t) in Deutschland die

mengenmäßig am häufigsten eingesetzten Antibiotikagruppen [198]. Insgesamt 7

Isolate exprimierten ausschließlich eine Resistenz gegen β-Laktame und

Oxytetrazyklin und wiesen dementsprechend keine Multiresistenz auf.

Der CC398 weist besonders häufig Resistenzen gegen β-Laktame, Oxytetrazyklin,

Erythromycin und Clindamycin auf [27]. Dies stimmt mit den Ergebnissen der

vorliegenden Arbeit überein (n = 10), auch wenn dieser Resistenzphänotyp lediglich

in zwei verschieden Betrieben nachgewiesen wurden. So zeigte sich dieses

Resistenzprofil sowohl in der Staubprobe aus Betrieb Nr. 4 als auch in 6 der 8

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3. Diskussion

82

korrespondierenden humanen Isolate. Makrolide stellten mit 145 t im Jahr 2012

(2013: 126 t) die mengenmäßig am vierthäufigsten eingesetzte Antibiotikaklasse in

der Veterinärmedizin dar. Der Einsatz von Lincosamiden ist hingegen

vergleichsweise gering (2012: 15 t) [198].

Kreuzresistenzen zwischen diesen beiden Gruppen sind relativ häufig, da Makrolide

und Lincosamide sich beide an die 50-S-Untereinheit der bakteriellen Ribosomen

binden. Die Makrolid-Lincosamid-Resistenz wird vielfach über sogenannte erm-Gene

vermittelt, die ebenfalls für Kreuzresistenzen zu Streptogramin B verantwortlich sind

(MLSB-Resistenz) [199]. Dabei ist die Methylierung der bakteriellen rRNA für die

Resistenz verantwortlich, die die Bindung des Antibiotikums am Zielort verhindert

[200].

In der vorliegenden Arbeit wurde kein Nachweis der erm-Gene durchgeführt, jedoch

konnten bereits erm(A), erm(B), erm(C) und erm(T) LA-MRSA CC398 isoliert werden

[201]. Die erm-Gene sind nicht nur bei S. aureus nachweisbar, sondern auch bei

anderen potentiell pathogenen Erregern. Der horizontale Austausch dieser

Resistenzgene ist dementsprechend zwischen verschiedenen Bakterienspezies

möglich [202].

Bei dem Vergleich der Resistenzmuster aus Betrieb Nr. 7 fällt auf, dass das MRSA-

Isolat aus der Staubprobe im Gegensatz zu den humanen Isolaten keine Resistenz

gegen Erythromycin exprimierte. Das zeigt auch, dass eine Lincosamidresistenz

nicht zwangsläufig mit einer Makrolidresistenz gekoppelt sein muss

In Betrieb Nr. 7 wurden bei allen Isolaten Resistenzen gegen die Fluorchinolone

Ciprofloxacin und Moxifloxacin (Tab. 18) nachgewiesen. Auch wenn die

Fluorchinolonresistenzen leicht rückläufig bei den HA-MRSA sind, werden dennoch

weiterhin Resistenzraten über 86 % detektiert [203]. Zudem scheint der Einsatz von

Fluorchinolonen in der Humanmedizin mit einem erhöhten MRSA-Risiko einher zu

gehen [204]. Hingegen sind Fluorchinolon-resistente LA-MRSA in Deutschland

bislang relativ selten [27]. Es ist nicht bekannt, ob in dem Mastbetrieb mit dem

Fluorchinolon-resistenten MRSA-Isolat oder bei dessen Zulieferern Fluorchinolone

kurativ eingesetzt wurden (siehe 3.1.). Mengenmäßig liegt der Einsatz der

Fluorchinolone in der Veterinärmedizin zwar deutlich unter denen der Tetrazykline

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3. Diskussion

83

oder Penicilline, allerdings wird in den letzten Jahren ein kontinuierlicher Anstieg des

Verbrauches beobachtet (2012: 10 t, 2013:12 t) [198].

Gentamicin-resistente LA-MRSA wurden bei insgesamt drei Isolaten von Mitarbeitern

detektiert. In der Humanmedizin sind die Resistenzraten von Gentamicin bei

HA-MRSA seit Jahren im einstelligen Bereich (2012: 5,7 %) [203]. In der

Veterinärmedizin ist der Einsatz von Aminoglykosiden zumindest leicht rückläufig

(2012: 40 t, 2013: 39 t) [198]. Generell kann die Gentamicinresistenz über

verschiedene Gene codiert werden. Häufig ist in diesem Zusammenhang das meist

plasmidcodierte Gen aacA-aphD für die Resistenz verantwortlich. Dies gilt auch für

LA-MRSA [205].

Bisher sind Gentamicin-resistente LA-MRSA selten in Deutschland [27]. Jedoch

konnten in den Jahren 2004 und 2005 in MV bereits zwei aacA-aphD vermittelte

Gentamicin-resistente LA-MRSA von erkrankten Schweinen isoliert werden. In

beiden Fällen handelte es sich um den spa-Typ t011 und es lagen ebenfalls die

CC398-typischen Penicillin- und Tetrazyklinresistenzen vor [63]. In der vorliegenden

Arbeit wurden die zwei Isolate des spa-Typs t011 in Kombination mit einer Penicillin-,

Tertrazyklin- und Gentamicinresistenz (Isolate 11-1, 11-2, Tab. 18) bei Mitarbeitern

aus der Schweinehaltung detektiert. Ein weiteres Gentamicin-resistentes Isolat

(Isolat 9-1, Tab. 18) wies zudem eine Makrolid-Lincosamid-Resistenz auf.

Interessanterweise handelt es sich bei allen Gentamicin-resistenten Isolaten um den

spa-Typ t011 und um Funde bei Mitarbeitern. Das verdeutlicht, dass der

beschriebene Resistenzphänotyp auch unter dem zoonotischen Aspekt von

Bedeutung ist.

Neuere Studien zeigen z. T. höhere Prävalenzen von Gentamicin-resistenten LA-

MRSA auf [79, 197]. So detektierten Buntenkoetter et al. [197] bei 34,4 % der MRSA-

Isolate aus konventionellen Schweinebetrieben eine Gentamicinresistenz, hingegen

nur bei 13,9 % der MRSA-Isolate aus ökologischer Haltung. Ob dies einen aktuellen

Trend widerspiegelt, müssen künftige Studien zeigen.

Insgesamt exprimierten fünf humane Isolate Resistenzen gegen fünf

Antibiotikaklassen und dementsprechend eine Multiresistenz. Sollte es zu Infektionen

mit diesen Isolaten kommen, wären die Behandlungsoptionen deutlich

eingeschränkt. Keine Resistenzen lagen z. B. gegen Tigezyklin, Vancomycin,

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3. Diskussion

84

Daptomycin oder Linezolid vor, die bei der Behandlung humaner MRSA-Infektionen

eine wichtige Rolle spielen. Das Vorkommen neuer Resistenzgene sollte jedoch

überwacht werden, v. a. wenn sie Multiresistenzen vermitteln. So codiert z. B. das

vga(A)-Gen Resistenzen gegen Lincosamide, Pleuromutiline und Streptogramin A

und wurde bereits bei LA-MRSA aus Staubproben von Geflügelställen in

Deutschland detektiert [79]. Das Gen cfr codiert Resistenzen gegen Phenicole,

Lincosamide, Oxazolidinone (z. B. Linezolid), Pleuromutiline und Streptogramin A

und kann auch bei E. coli auftreten [206]. Bisher sind Nachweise in Deutschland zwar

noch selten, dennoch konnte dieses Gen bereits bei norddeutschen CC398-MRSA-

Isolaten von Schweinen detektiert werden [207].

3.2.5 Zoonotisches Potential

Insgesamt wurden in drei verschiedenen Betrieben identische spa-Typen und

Resistenzprofile bei MRSA-Isolaten der humanen und korrespondierenden

Staubprobe nachgewiesen (vgl. Tab. 18). Aufgrund der hohen Variabilität des

Protein A stellt das einen Hinweis auf einen zoonotischen Transfer dar. Aber auch in

den anderen Fällen ist aufgrund des ausschließlichen Nachweises von LA-MRSA bei

den Landwirten davon auszugehen, dass diese während der Arbeit erworben

wurden. Zudem wurden vielfach die gleichen oder sehr ähnliche spa-Typen und/

oder Resistenzmuster detektiert, deren Unterschiede auf einfachen Mutationen

beruhen könnten.

Die vorliegenden Untersuchungen bestätigen, dass Personen, die in Betrieben mit

einer MRSA-positiven Staubprobe arbeiten, ein statistisch signifikant höheres Risiko

für eine MRSA-Kolonisation aufweisen. Dabei scheinen Personen mit engem

beruflichem Kontakt zu Schweinen besonders gefährdet. Dass keine MRSA-positiven

Rinder- und Geflügelbetriebe oder Mitarbeiter in diesen Betrieben gefunden wurden,

sollte nicht als Zeichen gewertet werden, dass MRSA bei diesen Tierarten zu

vernachlässigen sind. So fanden Richter et al. [76] in 90 % der untersuchten

Putenmastbetrieben und bei 37,3 % der Mitarbeiter MRSA. Auch Bisdorff et al. [5]

detektierten bei landwirtschaftlichen Mitarbeitern mit Kontakt zu Geflügel und Rindern

MRSA, wenngleich die Prävalenz deutlich geringer als bei Personen mit Kontakt zu

Schweinen ausfiel. In den Niederlanden wurde ebenfalls eine im Vergleich zu

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3. Diskussion

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Schweinen niedrige Prävalenz von MRSA bei Masthühnern detektiert, doch der enge

Kontakt zu MRSA-positiven Masthühnern wurde als Risikofaktor einer humanen

MRSA-Kolonisation identifiziert [195]. Auch eine Übertragung von LA-MRSA von

Rindern auf beruflich exponierte Personen stellt keine Seltenheit dar [35, 193].

Momentan existieren keine Standardprotokolle zur Vermeidung einer zoonotischen

Transmission von LA-MRSA auf enge Kontaktpersonen zu Nutztieren. Das Tragen

von Atemschutzmasken kann vor einer aerogenen Übertragung schützen [208],

wobei die Praktikabilität und somit die Compliance der Personen vermutlich eine

entscheidende Rolle spielt. Wichtig ist es, durch geeignete Fachinformationen die

gefährdeten Personengruppen für die Thematik zu sensibilisieren und auf das

bestehende Risiko einer Transmission oder Infektion hinzuweisen. Ob der Aufbau

von spezifisch-pathogen, in diesem Fall MRSA-freien Beständen eine

erfolgversprechende Option darstellt, müssen künftige Studien zeigen. Problematisch

ist, dass der Neuerwerb eines MRSA in einem MRSA-freien Betrieb innerhalb

kürzester Zeit vonstattengehen kann [209]. Eine potentielle Option wären MRSA-

spezifische Zuchtmaßnahmen. So wurde kürzlich ein Genlokus bei Mastschweinen

beschrieben, der mit der nasalen Kolonisation mit S. aureus assoziiert zu sein scheint

[210].

In der vorliegenden Arbeit waren fünf Mitarbeiter aus Betrieben mit MRSA-positiven

Staubproben und anderen positiven Probanden selbst nicht mit MRSA kolonisiert.

Mutmaßlich könnte das auf das individuelle Mikrobiom zurückzuführen sein. So

scheint z. B. die Kolonisation mit einem MSSA durch kompetitive Hemmung einen

protektiven Faktor darzustellen [208]. Häufig handelt es sich zudem um eine

transiente und keine permanente Kolonisation, dennoch bleiben viele Landwirte auch

nach längerer Abwesenheit vom Betrieb weiterhin MRSA-positiv [6, 36]. Die Gründe,

warum einige Menschen mit engem Nutztierkontakt nicht oder nur vorübergehend zu

LA-MRSA-Trägern werden, sind bislang nur unzureichend erforscht.

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3.3 Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli

3.3.1 Mitarbeiter

Insgesamt wiesen 5 Mitarbeiter (6,8 %) einen ESBL-bildenden E. coli auf. Alle positiv

getesteten Mitarbeiter arbeiteten in Betrieben mit einer ESBL-positiven

Kotsammelprobe. Dennoch konnte, vermutlich aufgrund des Stichprobenumfanges,

keine statistisch signifikant häufigere Kolonisation von Mitarbeitern in ESBL-positiven

Betrieben nachgewiesen werden (p = 0,23). Andere Studien legen jedoch ein

erhöhtes Risiko für enge Kontaktpersonen zu ESBL-positiven landwirtschaftlichen

Nutztieren nahe [14, 140, 143].

Valenza et al. [211] fanden eine intestinale Kolonisationsrate von 6,3 % ESBL-

bildenden E. coli in der bayerischen Bevölkerung, welches mit dem in der

vorliegenden Arbeit ermitteltem Vorkommen übereinstimmt. Eine ähnlich hohe

Prävalenz wurde mit 5,8 % in der Schweiz [212] detektiert, in den Niederlanden ist

das Vorkommen mit 8,6 % ESBL-bildenden Enterobacteriaceae geringfügig höher

[119]. Die in der vorliegenden Arbeit aus Compliancegründen unterschiedliche

Probenentnahme und die geringere Probandenzahl könnten zu der beobachteten

niedrigen Prävalenz geführt haben.

Die Kolonisationsrate der landwirtschaftlichen Mitarbeiter mit ESBL-Bildnern liegt

nicht über der Detektionsrate in der Bevölkerung und ist im Vergleich zur

beobachteten MRSA-Prävalenz deutlich niedriger. Eine Erklärung könnte im

natürlichen Habitat der Enterobacteriaceae zu finden sein. So werden E. coli in der

Regel über den fäkal-oralen Weg übertragen, während S. aureus als Kommensale

der (Nasen-) Schleimhäute besonders leicht über Staub in der Luft übertragbar ist

[57, 213].

Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem Alter und Vorkommen von

ESBL-Bildnern bei Mitarbeitern konnte nicht belegt werden, ebenso kein Einfluss von

Geschlecht oder Arbeitszeit. Risikofaktoren für den Erwerb von ESBL-bildenden

E. coli durch landwirtschaftliche Mitarbeiter sind in der Literatur bisher nur

unzulänglich beschrieben. Dohmen et al. [143] fanden Hinweise einer Korrelation

zwischen der täglichen Arbeitszeit in schweinehaltenden Betrieben und der ESBL-

Kolonisation der Mitarbeiter.

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3. Diskussion

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Analog zur vorliegenden Arbeit wurde in der bayerischen Bevölkerung kein

Zusammenhang zwischen dem Alter und der ESBL-Kolonisationsrate festgestellt

[211]. Im Gegensatz dazu konnte im klinischen Sektor aufgezeigt werden, dass

Personen über 60 Jahre häufiger ESBL-bildenden E. coli aufweisen als jüngere

[115]. Studien aus dem klinischen und ambulanten Bereich deuten auf ein erhöhtes

Risiko von Frauen hin [113, 115]. Eine mögliche Erklärung könnte die bei Frauen

größere Wahrscheinlichkeit einer Harnweginfektion darstellen, da diese ebenfalls ein

potentieller Risikofaktor für eine ESBL-Akquisition zu sein scheint [115]. Ob

tatsächlich für Männer oder Frauen ein höheres Risiko einer ESBL-Kolonisation

besteht oder das Risiko wie von Valenza et al. [211] angedeutet für beide Gruppen

gleich ist, werden weitere Studien verifizieren müssen. Diese sollten separat für die

Bevölkerung, die verschiedenen klinischen Sektoren als auch für die potentielle

Risikogruppe der Landwirte erfolgen.

Ein Mitarbeiter wies eine Kolonisation mit einer CTX-M-15/-28/-88 ESBL auf.

CTX-M-15 ist eine häufige ESBL von E. coli-Isolaten aus dem klinischen Bereich [95,

214]. Zudem war das Isolat dem ST405-Komplex zuzuordnen (Anhang, Tab. 26), der

ebenfalls eher human- als nutztierassoziiert ist [99]. Denkbar wäre es, dass der

Mitarbeiter den ESBL-Bildner im Gesundheitswesen erwarb, allerdings treten

CTX-M-15 ESBL ebenfalls in der gesunden Bevölkerung auf, gehören hier aber

häufig den weniger virulenten Phylogruppen A oder D an [211]. Ein Zusammenhang

zwischen Reisen in endemischen Gebiete und dem Erwerb von CTX-M-15 ESBL

scheint ebenfalls zu bestehen [119]. Da die phylogenetischen Gruppen nicht

bestimmt und keine anamnestischen Daten erhoben wurden, ist keine weiterführende

Aussage möglich.

Ein weiterer Mitarbeiter aus demselben Betrieb wies eine CTX-M-1/-61 ESBL auf.

CTX-M-1 ist die am häufigsten aus Rinder- und Schweinebetrieben isolierte ESBL

[99]. Diese ESBL Determinante trat zudem bei zwei weiteren Mitarbeitern aus

anderen Betrieben auf.

Bei einem Mitarbeiter konnte die CTX-M ESBL nicht weiter typisiert werden. Gründe

könnten bspw. Frameshift-Mutationen sein [170]. Zwei Probanden wiesen zusätzlich

zu den CTX-M auch TEM-104/-206 β-Laktamasen auf. Bei letzteren handelt es sich

nicht um ESBL [214]. Ein Proband wies zusätzlich zur CTX-M ESBL eine OXA

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3. Diskussion

88

β-Laktamase auf, die kein Ergebnis bei der Typisierung erzielte. Ob es sich dabei um

eine ESBL handelte, kann somit nicht verifiziert werden.

3.3.2 Schweinebetriebe

Die Prävalenz der ESBL-Bildner in Schweinebetrieben fiel mit 82,4 % (14/17) am

höchsten von allen untersuchten Tierarten aus. Sie ist somit deutlich höher als in

anderen Untersuchungen aus dem europäischen Raum [95, 129, 215]. Friese et al.

[10] untersuchten im gleichen Zeitraum im Norden und Osten Deutschlands

Schweinebetriebe und fanden eine niedrigere Prävalenz von 50 %. Auch Hering et al.

[126] untersuchten zeitgleich deutsche Mastbetriebe und wiesen in 83 % der

Kotsammelproben Cefotaxim-resistente E. coli nach. Die Prävalenz ist somit zwar

identisch zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, jedoch wurden diese Isolate

nicht als ESBL-Bildner bestätigt.

Risikofaktoren für die Akquisition von ESBL-bildenden E. coli in Schweinebetrieben

konnten nicht eruiert werden, allerdings war die Varianz mit nur drei ESBL-negativen

Betrieben sehr klein. Ein statistisch signifikanter Einfluss der Betriebsgröße konnte

nicht dargestellt werden (p = 0,12). So hielten zwei ESBL-negative Betriebe > 700

und ein ESBL-negativer Betrieb ≤ 700 Schweine. Es handelte sich jeweils um

konventionelle Betriebe.

Alle vier teilnehmenden ökologischen Betriebe waren ESBL-positiv. Bisher sind keine

umfassenden vergleichenden Studien zum Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli

in konventionellen und ökologischen Schweinebetrieben in Deutschland publiziert.

Da der Einsatz von Antibiotika, insbesondere von Cephalosporinen, zu einer

Selektion von ESBL-Bildnern führen kann [95, 142, 216] und diese in ökologischen

Betrieben in der Regel restriktiver eingesetzt werden, wären weitere Studien in dieser

Richtung wünschenswert. Neben dem Einsatz von Antibiotika scheinen sich auch

das Hygieneregime und Betriebsmanagement sowie bauliche Faktoren auf den

ESBL-Status des Betriebes auszuwirken [126].

In den Schweinebetrieben konnte die höchste Anzahl an ESBL-bildenden E. coli

(n = 33) mit bis zu vier unterschiedlichen ESBL-Bildnern pro Betrieb gewonnen

werden (Anhang, Tab. 26). In einigen Fällen wurden die gleichen ST und CC in

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3. Diskussion

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unterschiedlichen Betrieben isoliert. Der ST10-Komplex dominierte und wurde

insgesamt bei 8 Isolaten aus Schweinebetrieben nachgewiesen, wobei der ST10 bei

insgesamt vier verschiedenen Betrieben auftrat. Hierbei waren zwar verschiedene

Nutzungsrichtungen (Aufzucht, Zucht, Mast) betroffen, jedoch handelte es sich

ausschließlich um ökologische Betriebe. Zwei dieser Betriebe waren im gleichen

Landkreis lokalisiert und die isolierten ESBL-Bildner wiesen identische MLST und

PCR Ergebnissen auf.

Da es sich in einem Fall um einen Zucht-, im anderen Fall um einen Aufzuchtbetrieb

handelte, liegt die Vermutung nahe, dass der Aufzuchtbetrieb seine Tiere von dem

Zuchtbetrieb erhalten haben könnte. Der vertikale Transfer von resistenten E. coli

von Sauen zu Ferkeln wurde bereits nachgewiesen [217]. Aber auch der Tierhandel

nimmt eine wichtige Position bei der Verbreitung von ESBL-Bildnern ein [216].

Der ST10 konnte ebenfalls in einem Rinderbetrieb nachgewiesen werden (Anhang,

Tab. 27). Allerdings wies dieses Isolat neben CTX-M auch das Gen blaOXA auf, das

bei keinem der ST10 ESBL-Bildner aus den Schweinebetrieben detektiert wurde,

auch wenn in zwei Fällen zusätzlich TEM β-Laktamasen nachweisbar waren.

Bis auf eine Ausnahme wiesen alle aus Schweinebetrieben isolierten ESBL-Bildner

CTX-M ESBL auf. Strauß et al. [214] untersuchten die in der vorliegenden Arbeit

gewonnen ESBL-Isolate im Rahmen einer Evaluierung eines neuen Assays zur

Subtypisierung der Gene blaCTX-M, blaTEM und blaSHV. Diese Ergebnisse zeigten, dass

es sich v. a. um CTX-M-1/-61 ESBL handelte. Das deckt sich mit Ergebnissen von

Ewers et al. [99], die die CTX-M-1 β-Laktamasen als dominierende ESBL in

europäischen Schweine- und Rinderbeständen bestätigten. TEM ESBL traten nach

deren Ergebnissen nur selten auf. Das Gen blaTEM war in der vorliegenden Arbeit

zwar bei einem Drittel der Isolate zusätzlich zu CTX-M nachweisbar, allerdings

handelte es sich dabei nicht um ESBL-bildende TEM Enzyme [214]. Hingegen wies

das CTX-M-negative Isolat eine TEM-15 ESBL und eine nicht ESBL-bildende

TEM-135 β-Laktamase auf [214]. Friese et al. [10] bestätigten die Dominanz von

CTX-M und TEM β-Laktamasen in norddeutschen Schweinebetrieben. Keines der

Isolate aus Schweinebetrieben wies eine OXA oder SHV β-Laktamase auf. Auffällig

ist die niedrige Diversität der ESBL-Gene im Vergleich zu CTX-M-Isolaten aus dem

klinischen Sektor in der Humanmedizin [214].

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3. Diskussion

90

Bei der Untersuchung einer Kotsammelprobe eines Schweinebetriebes wurde ein

ESBL-bildendes E. hermanii-Isolat detektiert. Ob es originär tatsächlich aus der

intestinalen Kolonisation eines Schweines stammt oder ob es sich um eine

Verunreinigung aus der Umgebung handelt, kann nachträglich nicht verifiziert

werden. Jedoch exprimierte es, wie die weiteren aus diesem Betrieb isolierten ESBL-

bildenden E. coli, ebenfalls eine CTX-M ESBL. Das könnte auf einen horizontalen

Resistenzgentransfer zwischen verschiedenen Spezies hindeuten.

3.3.3 Rinderbetriebe

In 6 von 11 Rinderbetrieben (54,5 %) wurden ESBL-bildende E. coli nachgewiesen.

Im Vergleich dazu wurden nach Erhebungen der EFSA im Jahr 2008 11,8 % und im

Folgejahr lediglich 1,4 % Cefotaxim-resistente E. coli bei deutschen Rindern

detektiert. In anderen europäischen Ländern (z. B. Österreich) gelang bei Rindern

häufig sogar kein Nachweis [95]. Friese et al. [10] wiesen hingegen in 6 von 10

Milchviehbetrieben ESBL-Bildner nach, was mit den vorliegenden Ergebnissen

kongruent ist. Zeitgleich wurde mit 86,7 % ESBL-positiven Betrieben eine noch

höhere Prävalenz in süddeutschen Rinderbeständen detektiert [12]. Eigene

Untersuchungen aus dem Jahr 2013 zeigen einen Anstieg der Prävalenz auf 90 %

(n = 10, unveröff. Daten).

Statistisch signifikante Risikofaktoren für das Vorhandensein von ESBL-Bildnern in

Rinderbeständen konnten nicht identifiziert werden. Das Alter der beprobten Tiere

wurde zwar nicht erfasst, aber soweit möglich, wurden stets Proben von

unterschiedlichen Altersgruppen gezogen. Dass jüngere Rinder häufiger ESBL-

Träger sind als ältere, wurde bereits aufgezeigt [12, 129, 218] und ist ein Phänomen,

das weder auf Rinder noch auf ESBL-Bildner beschränkt ist [33, 217]. Vermutlich

spielt hierbei die Reifung des Immunsystems während der ersten Lebenswochen

eine wichtige Rolle [33].

Milchkühe scheinen eher ESBL-Träger als Mastrinder zu sein [12, 218]. Ob das

bspw. in der häufigeren Anwendung von Antibiotika bei Milchvieh oder der im

Vergleich längeren Lebenserwartung begründet ist, ist bislang nicht abschließend

geklärt. Alle in der vorliegenden Arbeit untersuchten Rinderbetriebe hielten

mindestens Milchkühe. Aufgrund dessen fehlt der Vergleich zu reinen Mastbetrieben.

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3. Diskussion

91

Unter Umständen kann die relativ hohe Prävalenz durch die Überpräsenz des

Milchviehs erklärt werden, v. a. da bereits ähnlich hohe Detektionsraten in deutschen

Milchviehherden gefunden wurden [10].

Analog zu den Schweinebetrieben scheinen auch in Rinderbetrieben weitere

mögliche Risikofaktoren für der Entstehung von ESBL-bildenden E. coli der Zukauf

von Tieren, das Hygieneregime und der Einsatz von 3.- und

4.-Generationscephalosporinen zu sein [219]. Bei Milchvieh werden diese auch lokal

zum Trockenstellen nach der Laktationsperiode oder zur Behandlung von klinischen

Mastitiden angewendet. Diese Behandlung scheint die Entstehung von Resistenzen

weniger zu fördern als der systemische Einsatz, sollte aber dennoch stets restriktiv

erfolgen [95].

Fast alle detektierten ESBL-Isolate wiesen Kombinationen unterschiedlicher

Genfamilien und MLST ST auf (Anhang, Tab. 27). Jedoch wurden in zwei

unterschiedlichen Milchviehbetrieben CTX-M-positive ST446-Isolate nachgewiesen.

Ob ein Zusammenhang zwischen den Betrieben bestand, bspw. ob Tiere vom

gleichen Betrieb zugekauft wurden, ist nicht bekannt.

In 80 % (8/10) der Fälle konnten CTX-M ESBL nachgewiesen werden. Bei einem

Isolat traten sogar drei Genfamilien in Erscheinung (CTX-M, OXA und TEM). Bei den

drei nachgewiesenen TEM β-Laktamasen handelte es sich nicht um ESBL-Bildner

[214]. Allerdings konnte bei einem Isolat nur die TEM Familie nachgewiesen werden,

demnach könnte hier ein anderes, selteneres ESBL-Gen für die Resistenz

verantwortlich sein [220]. Der Review von Ewers et al. [99] differenzierte nicht

zwischen Schweine- und Rinderbetrieben. Dementsprechend ist nach dieser Arbeit

CTX-M-1, gefolgt von weiteren CTX-M Untergruppen, als die dominante ESBL in

europäischen Beständen angegeben. Die CTX-M-1/-61 spielten in den in der

vorliegenden Arbeit untersuchten Rinderbetrieben die vorherrschende Rolle [214].

3.3.4 Geflügelbetriebe

Drei von vier (75 %) Hühnermastbetrieben wiesen eine ESBL-positive Sockenprobe

auf. In zwei dieser Betriebe wurden zusätzlich via Kloakenabstrich mit ESBL-Bildnern

kolonisierte Tiere detektiert. Die Anzahl der teilnehmenden Hühnermastbetriebe war

in Bezug auf die statistische Auswertung gering. Dennoch lässt der Nachweis in

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3. Diskussion

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Dreiviertel der Betriebe ein hohes Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli in diesem

Sektor vermuten. Friese et al. [10] fanden in 8 von 8 untersuchten

Hühnermastbetrieben ESBL/ AmpC-bildende E. coli, wobei der Großteil der Isolate

für AmpC codierte. Auch in anderen Studien wurden ähnlich hohe Prävalenzen

nachgewiesen [14, 140, 173].

In der vorliegenden Arbeit konnte kein Zusammenhang des ESBL-Nachweises mit

der Betriebsgröße aufgezeigt werden (p = 0,5). Der ESBL-negative

Hühnermastbetrieb gehörte zu den größeren Betrieben mit > 100.000 Tieren.

Das Alter der Tiere als separater Risikofaktor ging nicht in die Auswertung ein. Die

Tiere aus dem ESBL-negativen Betrieb gehörten mit ca. einer Lebenswoche zu den

jüngsten getesteten Tieren, während sich die Tiere in den ESBL-positiven Betrieben

in der Mitte oder am Ende der Mastperiode befanden (Daten nicht dargestellt). Dies

könnte andeuten, dass jüngere Masthühner seltener mit ESBL-Bildern kolonisiert

sein könnten. Dies bestätigen Untersuchungen von Laube et al. [13], die bei

Masthühnern, im Gegensatz zu Untersuchungen von Schweine- und Rinderbetrieben

[12, 217], eine Zunahme der ESBL-Prävalenz im Verlauf der Mastperiode feststellten.

Unabhängig davon können bereits Eintagsküken mit ESBL-Bildern kolonisiert sein

[13, 221], die diese von den Eltern- und Großelterntieren durch vertikalen Transfer

erwerben können [221]. Ursächlich für die Zunahme der ESBL-Prävalenz im Verlauf

der Mastperiode könnten z. B. die Anreicherung von ESBL-Bildnern in der Umgebung

[13] und die steigende Besatzdichte am Ende der Mastperiode sein. Auch der

Einsatz von Antibiotika spielt eine nicht zu vernachlässigende Rolle [13]. Weiterhin ist

es denkbar, dass ESBL-bildende E. coli durch ein mangelhaftes Hygieneregime im

Verlauf verschiedener Mastdurchgänge in der Umgebung persistieren und auf

nachfolgend eingestallte Tiere übertragen werden [222]. Ob die kurze Lebensdauer

von Masthühnern von in der Regel sechs Wochen eine ausreichende Reifung des

Immunsystems wie bei Schweinen und Rindern erlaubt, ist zudem zweifelhaft.

In der vorliegenden Arbeit wurden in Hühnermastbetrieben häufig die Genfamilien

SHV und TEM nachgewiesen (Anhang, Tab. 28). CTX-M wurde hingegen nur in einer

Sockenprobe detektiert, die zugehörigen 10 Kloakenabstriche fielen alle ESBL-

negativ aus. Das zeigt, dass mittels Sockenproben deutlich mehr Probenmaterial von

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3. Diskussion

93

unterschiedlichen Tieren gewonnen und somit ein besserer Überblick über das

Vorkommen von ESBL-Bildnern in der Tierpopulation erlangt werden kann.

In einem Hühnermastbetrieb mit einer SHV- und TEM-positiven Sockenprobe wurden

insgesamt 8 von 10 Tieren ESBL-positiv getestet. Diese Isolate waren entweder

SHV- und TEM-positiv oder nur SHV-positiv. Auffällig ist, dass sowohl aus der

Sockenprobe dieses Betriebes als auch in allen 8 Isolaten aus den

Kloakenabstrichen der ST162 isoliert wurde. Das spricht dafür, dass es sich jeweils

um den gleichen E. coli -Klon handeln könnte, der unterschiedliche und mutmaßlich

plasmidcodierte Resistenzgene erworben hat. Bemerkenswerterweise wurde in

einem anderen Betrieb ein weiterer ST162 bei einem Tier nachgewiesen, wobei die

zugehörige Sockenprobe einen ST2705 aufwies. Ursächlich könnte hierfür die

Methode sein, da durch die Einzelbeprobung der Tiere die Diversität der ESBL-

Isolate in den Ställen besser dargestellt werden könnte. Für ein umfassendes Bild

müssten bei einer Einzelbeprobung allerdings deutlich mehr Tiere untersucht

werden. Interessant wäre es zu wissen, ob die beiden Betriebe mit ST162-positiven

Isolaten eventuell den gleichen Kükenzulieferer in Anspruch nahmen. Dann bestünde

die Möglichkeit, dass schon die Eintagsküken bei Erreichen des Mastbetriebes mit

ESBL-Bildnern kolonisiert waren [13]. Diese Frage stellt sich auch in Anbetracht der

Tatsache, dass es sich bei allen SHV-Isolaten um das Allel SHV-12 handelte und um

TEM-1/-98/-206 oder TEM-135 β-Laktamasen [214]. Die Varianz der bla-Gene ist

somit auch beim Geflügel relativ gering.

Im Ergebnis des Reviews von Ewers et al. [99] dominierten in europäischen

Geflügelbetrieben v. a. die ESBL/ AmpC-Bildner CTX-M-1 und CMY-2 [99]. In der

vorliegenden Arbeit wurde keine PCR für die blaCMY-Gene durchgeführt, da das

Vorkommen von AmpC-Bildnern nicht Gegenstand der Untersuchung war. Trotzdem

wurden SHV und TEM ESBL nach Ewers et al. [99] eher selten nachgewiesen (ca.

10 % bzw. ca. 14 %). Laube et al. [13] stellten eine hohe Diversität der ESBL/ AmpC-

Gene in den 7 von ihnen getesteten Hühnermastbetrieben fest [13]. So dominierten

in einigen Betrieben die Gene blaTEM und blaCMY, während in anderen v. a. blaSHV

überwog. Zusätzlich wurden Veränderungen im Auftreten der Resistenzgene im

Verlauf der Mastperiode beschrieben. In niederländischen Geflügelbetrieben konnte

ebenfalls eine hohe Variabilität der ESBL-Genfamilien und MLST ST nachgewiesen

werden, darunter auch der in der vorliegenden Studie dominierende ST162.

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3. Diskussion

94

Zusätzlich wurden Legebetriebe positiv auf das Vorkommen von ESBL-Bildnern

getestet [173].

ESBL-positive Puten und Putenmastbetriebe wurden nicht detektiert, allerdings

nahmen auch nur zwei Betriebe an der Untersuchung teil. Bislang gibt es deutlich

mehr Untersuchungen und Funde von ESBL-Bildnern in Broiler- als in

Putenmastbetrieben [95]. Da ESBL-Bildner dennoch bei Puten auftreten [223], wären

weitere Studien in letztgenannten Betrieben wünschenswert.

3.3.5 Zoonotisches Potential

Insgesamt wurden drei MLST ST (ST542, ST648, ST3891) sowohl beim Menschen

als auch bei Tieren detektiert (vgl. Abb. 7B). Dem ST648 kommt eine besondere

Bedeutung zu, da er weltweit aus humanen und tierischen Quellen isoliert werden

kann und häufiger als andere ST mit ESBL-Plasmiden, weiteren Resistenzgenen und

Virulenzfaktoren assoziiert zu sein scheint [99, 224]. In der vorliegenden Arbeit

codierte das ST648-Isolat aus Schweinefäzes im Gegensatz zum humanen Isolat

nicht für CTX-M und die TEM-Familie, sondern nur für TEM. Beide Isolate stammten

zudem aus unterschiedlichen Betrieben, wodurch ein direkter epidemiologischer

Zusammenhang nicht aufgezeigt werden konnte.

Hingegen gibt es starke Hinweise einer direkten zoonotischen Übertragung in einem

Rinderbetrieb. Hier wiesen die humane und eine tierische Probe die identischen PCR

und MLST-Ergebnisse auf (vgl. Tab. 24); bei beiden Isolaten handelte es sich um

ST3891-E. coli. Aufgrund der hohen Anzahl an möglichen Allelvarianten ist die

Wahrscheinlichkeit, die gleichen ST zufällig zu finden, als sehr gering anzusehen.

Zusätzlich codierten beide Isolate für eine CTX-M-1/-61 ESBL, was den Verdacht

einer zoonotischen Transmission weiter erhärtet.

Nach dem derzeitigen Kenntnisstand ist das der erste Hinweis auf eine zoonotische

Übertragung eines ESBL-bildenden E. coli aus einem Rinderbetrieb auf den

Menschen. Allerdings gibt es bereits deutliche Hinweise einer Übertragung von

ESBL-Bildnern von Nutzgeflügel [14, 140] oder Schweinen [141-143] auf den

Menschen, wobei in der vorliegenden Studie keine ESBL-positiven Probanden in

Geflügelbetrieben detektiert wurden. Hingegen waren nach Untersuchungen von

Dierikx et al. [14] 33,3 % der Mitarbeiter (n = 18) aus Geflügelbetrieben mit ESBL-

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3. Diskussion

95

Bildnern kolonisiert. Die nachgewiesenen Isolate wiesen mitunter die gleichen ESBL-

Gene und Plasmide auf, die in den Kotproben der Tiere gefunden wurden. Auch

Huijbers et al. [140] fanden Hinweise auf eine Übertragung von ESBL-Bildern von

Geflügel auf den Menschen; so waren 27,1 % der Probanden mit engem

Geflügelkontakt ESBL-positiv. Hierbei wurden in fünf Fällen die gleichen MLST,

ESBL-Gene und Plasmidfamilien wie in den tierischen Isolaten nachgewiesen;

zudem gab es Hinweise eines horizontalen Resistenzgentransfers. Der enge Kontakt

zu Geflügel wurde als Risikofaktor für eine Kolonisation mit ESBL/ AmpC-bildenden

E. coli eingeordnet. In den Niederlanden wiesen 39 % der Geflügelfleischproben die

gleichen ESBL Genotypen auf wie Isolate aus humanen klinischen

Probenmaterialien, was den Verdacht eines zoonotischen Austausches über den

direkten Kontakt zu lebenden Tieren hinaus nahe legt [137].

Ein horizontaler Gentransfer von blaCTX-M-1 tragenden Plasmiden zwischen humanen

und tierischen E. coli wurde auch in Schweinebetrieben aufgezeigt [141]. Eine direkte

Übertragung ESBL-tragender E. coli von Schweinen auf den Menschen scheint

ebenfalls möglich [142, 143, 225].

In der vorliegenden Studie wurde bei einem der ESBL-positiven Probanden aus

einem Schweinebetrieb und der korrespondierenden Schweinekotprobe die

CTX-M-1/-61 ESBL in Kombination mit TEM-104/-106 nachgewiesen. Die MLST-

Ergebnisse des Mitarbeiters und der Kotsammelprobe unterschieden sich jedoch

voneinander. Weiterhin wies ein ESBL-positives Isolat eines Mitarbeiters aus einem

weiteren Schweinebetrieb das Gen blaTEM-104/-106 auf, während die CTX-M nicht weiter

spezifiziert werden konnte. Die korrespondierenden tierischen Kotproben wiesen

diese ESBL-Gene ebenfalls auf, wenn auch nicht in Kombination. Es kann zumindest

nicht ausgeschlossen werden, dass es sich bei den nicht typisierbaren CTX-M ESBL

des humanen und tierischen Isolates um die gleiche ESBL Determinante handeln

könnte. Die identischen Resistenzgene fanden sich zudem in einem humanen und

dem korrespondieren tierischen Isolat aus einem Rinderbetrieb. Die Ergebnisse

könnten hinweisend auf einen horizontalen Gentransfer sein. Um diese These zu

stützen, wären weitere Untersuchungen, z. B. die Bestimmung der Plasmidfamilien,

notwendig.

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3. Diskussion

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Nach Ewers et al. [99] ist CTX-M-1 mit 72 % die am häufigsten nachgewiesene

β-Laktamase bei Schweinen und Rindern; beim Menschen macht sie lediglich 7 %

aller ESBL-Isolate aus. Neue Studien deuten allerdings auf eine Zunahme der

CTX-M-1 beim Menschen hin [211, 226]. So waren nach Strauß et al. [214]

CTX-M-1/-61 nach CTX-M-15/-28/-88 die am zweithäufigsten isolierten Allele aus

humanen klinischen Isolaten. Leistner et al. [130] wiesen bei einem

Aufnahmescreening CTX-M-1 mit 44 % sogar als dominierende ESBL nach. Zudem

wurde der häufige Verzehr von Schweinefleisch als Risikofaktor für die Akquisition

eines ESBL-Bildners identifiziert [130], wobei CTX-M-1 ESBL regelmäßig in

tierischen Produkten unterschiedlicher Spezies nachgewiesen werden [129, 136]. Da

Vegetarier gleichermaßen mit ESBL-Bildnern kolonisiert zu sein scheinen [227],

müssen weitere Transferrouten, wie der Eintrag und die Verbreitung in die Umwelt

über Gülledüngung oder Wildtiere [107], in Betracht gezogen werden.

Eine Zuordnung, ob ein bestimmter ST oder CC eher human- oder (nutz-)tier-

assoziiert ist, ist häufig nicht möglich, da viele CC bei verschiedenen Spezies

gleichermaßen in Erscheinung treten. So konnte bspw. der in der vorliegenden Arbeit

bei den Nutztieren dominierende ST10-Komplex bereits zuvor bei Tieren als auch

beim Menschen nachgewiesen werden. [99].

Weiterhin konnte ein Isolat eines Mitarbeiters aus der Schweinhaltung dem ST23-

Komplex zugeordnet werden, ebenso wie das Isolat aus Schweinefäzes eines

anderen Betriebes. Beide Isolate codierten die Gene blaCTX-M und blaTEM. Eine

gewisse genetische Verwandtschaft der Isolate liegt somit zwar vor, aber auch hier

konnte kein epidemiologischer Zusammenhang nachgewiesen werden und es könnte

sich auch um eine voneinander unabhängige Entwicklung handeln. Isolate des ST23-

Komplexes wurden bereits bei Nutz-, Haus- und Wildtieren sowie bei Infektionen des

Menschen detektiert [99].

E. hermanii wurde bisher nur selten als humanes Pathogen isoliert und scheint

primär bei Mischinfektionen eine Rolle zu spielen, wurde aber auch bei

Monoinfektionen beschrieben [228], deren Verlauf durch das Vorhandensein einer

ESBL vermutlich noch weiter erschwert werden würde.

Insgesamt wurde nur bei einem der fünf ESBL-positiven Mitarbeitern ESBL Familien

isoliert, die sich nicht in der korrespondierenden tierischen Kotsammelprobe des

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3. Diskussion

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Betriebes widerspiegelten. Hierdurch verdichtet sich der Verdacht eines

epidemiologischen Zusammenhanges.

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3. Diskussion

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3.4 Co-Kolonisation MRSA und ESBL-bildende E. coli

Ein Proband zeigte sowohl eine Kolonisation mit einem ESBL-bildenden E. coli als

auch mit einem MRSA. Seine Beschäftigung erfolgte in einem schweinehaltenden

Betrieb, der ebenfalls in der Staubprobe MRSA und in den Kotsammelproben ESBL-

Bildner aufwies.

Konkrete Zahlen zur Prävalenz von Personen in der gesunden Bevölkerung, die

Träger von mehr als einem MRE sind, sind bisher nicht bekannt. Allerdings wurde in

den letzten Jahren in deutschen Krankenhäusern eine Zunahme der Co-Kolonisation

und -Infektion mit MRSA und ESBL-Bildnern beobachtet [229]. Auch in Pflegeheimen

sind Co-Kolonisationen mit MRE mit einer Prävalenz von 39 % keine Seltenheit [230].

Ein gemeinsamer Risikofaktor stellt die Anwendung von Antibiotika dar [230]. Der

Gesundheitsstatus der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Landwirte wurde nicht

erfasst, so könnten z. B. chronische Erkrankungen wie Diabetes mellitus oder

kürzlich vorausgegangene Krankenhausaufenthalte Einfluss auf den MRE-Status

nehmen. Die Einnahme von Antibiotika in der Vergangenheit könnten das natürlich

vorhandene individuelle Mikrobiom gestört und somit die Kolonisation mit einem

MRSA oder ESBL-Bildern unterstützt haben.

Insgesamt wurden in fünf weiteren Schweinebetrieben sowohl MRSA als auch ESBL-

Bildner nachgewiesen. Fischer et al. [225] wiesen sogar in 59 % der untersuchten

Schweinebetriebe sowohl MRSA als auch ESBL-Bildner nach. Zudem gibt es

Hinweise, dass eine Korrelation zwischen dem Auftreten von MRSA und ESBL-

Bildnern in schweinehaltenden Betrieben besteht [213]. Das verdeutlicht erneut die

große Bedeutung von Nutztieren als Reservoir für Antibiotikaresistenzen. Die

Prinzipien, die für das Auftreten von Resistenzen in Tierställen verantwortlich

gemacht werden, beschränken sich nicht auf eine Bakterienart bzw. einen

Resistenzmechanismus. So fördert der Antibiotikaeinsatz die Entstehung

verschiedenster Resistenzen inklusive MRSA und ESBL [33] und stellt somit einen

nicht zu vernachlässigenden Risikofaktor dar. In diesem Zusammenhang kommt der

Stallhygiene und den generellen Haltungsbedingungen eine wichtige Bedeutung zu.

Die Untersuchung der Dynamik und Epidemiologie von Co-Kolonisationen von MRSA

und ESBL-Bildnern bei Mensch und Tier können mit dieser Arbeit nicht hinreichend

evaluiert werden, sollten aber Gegenstand künftiger Untersuchungen sein.

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3. Diskussion

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3.5 Ausblick

Während die Zahl der MRSA-Infektionen seit einigen Jahren stagniert bzw. leicht

rückläufig ist, wird eine deutliche Zunahme der ESBL-Bildner bzw. MRGN in der

Humanmedizin beobachtet [231]. Neben dem Vorkommen im nosokomialen Bereich

werden MRE zunehmend in der allgemeinen Bevölkerung detektiert [21]. Die

Akquisition kann von verschiedenen Quellen ausgehen; die Übertragung durch

Nutztiere oder Lebensmittel sollte dabei nicht außer Acht gelassen werden [21, 130].

Die vorliegende Arbeit konnte verdeutlichen, dass Nutztiere auch in MV, dem am

dünnsten besiedelten Bundesland Deutschlands, mit wenigen, aber sehr großen

Tierhaltungen, eine wichtige Reservoirfunktion für MRE einnehmen. MRSA waren in

über einem Drittel der untersuchten Schweinehaltungen nachweisbar und in

Betrieben mit MRSA-positiven Staubproben wurden weit mehr MRSA-positive als

MRSA-negative Mitarbeiter detektiert. ESBL-bildende E. coli zeigten in der

untersuchten Tierpopulation eine noch höhere Prävalenz und wurden in Schweine-,

Rinder- und Hühnermastbetrieben nachgewiesen.

Die direkte Transmission von MRSA von Tieren auf landwirtschaftliches Personal gilt

mittlerweile als gesichert [21]. Dennoch ist bisher nicht abschließend geklärt, warum

einzelne Personen, die im gleichen Betrieb tätig sind, einen MRSA akquirieren und

andere nicht. Die Transferrouten von ESBL-bildenden E. coli vom Tier zum

Menschen sind im Gegensatz zu MRSA bisher weit weniger untersucht. Die

generelle Zunahme der CTX-M ESBL und im Speziellen von CTX-M-1 sowie die

Übereinstimmungen bestimmter Allele bei Mensch und Tier, die in dieser Arbeit

aufgezeigt wurden, legen den Verdacht nahe, dass die direkte zoonotische

Übertragung eine wichtige Transferroute darstellen könnte. Aufgrund der

Globalisierung und der hohen Anzahl nationaler und internationaler Tiertransporte

sowie der Stellung Deutschlands als bedeutender Importeur von lebenden

Schweinen, gewinnt dieser Umstand zusätzlich an Bedeutung [95].

Die Einflussfaktoren auf die Entstehung von MRE in der Tierhaltung sind

hochkomplex. Der Einsatz von Antibiotika spielt zwar eine herausragende Rolle,

doch kann das Problem mit der bloßen Forderung der Reduktion des

Antibiotikaeinsatzes nicht befriedigend gelöst werden. Ansätze müssen u. a. in der

Surveillance des Medikamentenverbrauches und den Haltungsbedingungen inklusive

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3. Diskussion

100

Stallhygiene und Tiergesundheitsmanagement (z. B. Impfungen) liegen. Erste

Schritte zu einer verbesserten Medikamentenerfassung und daraus resultierende

Schritte einer sinnvollen Antibiotikaminimierung auf Betriebsebene sollten mit der 16.

Novelle des Arzneimittelgesetzes, die im Jahr 2014 in Kraft getreten ist, beschritten

werden [232]. Mit der Deutschen Antibiotikaresistenzstrategie (DART) wurde ein

Bündel von Maßnahmen erarbeitet, um Antibiotika-Resistenzen in Deutschland zu

erkennen, zu verhüten und zu bekämpfen. Damit stellt auch die vorliegende Arbeit

einen Beitrag zur DART dar.

Des Weiteren muss bedacht werden, dass resistente Bakterien auch ohne den

Einsatz von Antibiotika entstehen können. So bieten Biofilme, die vielfach in Tränk-

und Wasserleitungen zu finden sind, aufgrund des hohen Konkurrenzdrucks um

Nährstoffe und dem geringen Platzangebot, ideale Bedingungen für die Entstehung

resistenter Bakterien. Um sich einen evolutionären Vorteil zu sichern, bilden einige

Bakterien selbst antimikrobielle Substanzen, wodurch wiederum die Bildung von

Resistenzen gefördert wird [233]. S. aureus ist ein bekannter Biofilmbildner. Daher ist

es wenig überraschend, dass LA-MRSA im Stallmilieu in der Lage sind, ebendiese zu

bilden [234]. Metallionen induzieren mitunter ebenfalls Antibiotikaresistenzen. Zink

und Kupfer werden häufig wegen ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirkung in der

Tierhaltung supplementiert, doch ist z. B. die Zinkresistenz mit einer

Methicillinresistenz bei S. aureus gekoppelt; deren Einsatz kann vielleicht zu einer

Selektion von MRSA führen [235]. Ähnliche Effekte wurden auch beim Einsatz von

Zink und der Entstehung von multiresistenten E. coli beobachtet [236].

Die Entwicklung von Resistenzen gegen neue Antibiotikaklassen und die

Übertragung von Plasmiden die Multiresistenzen oder Resistenzen gegen wichtige

Reserveantibiotika codieren, erfordern eine kontinuierliche Surveillance. So ist bspw.

das Auftreten von nutztierassoziierten Resistenzen gegen Linezolid [207], einem

wichtigen MRSA-Therapeutikum, Besorgnis erregend. Der kürzliche Nachweis

Plasmid-vermittelter Colistin-Resistenzen über mcr-Gene bei E. coli-Isolaten von

Nutztieren erregte weltweit Aufmerksamkeit [237, 238], wird bei schweren humanen

Infektionen mit hochresistenten Gram-negativen Erregern auf das Polymyxin Colistin

zurückgegriffen. Die Vermutung, Bakterien erlitten durch das Vorhandensein von

zusätzlichen Resistenzplasmiden einen Verlust der Fitness, wurde zudem kürzlich für

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3. Diskussion

101

ESBL-bildende E. coli widerlegt [224], wodurch die Dringlichkeit der Erforschung von

Resistenzmechanismen und potentiellen Reservoiren noch weiter unterstrichen wird.

Die Entstehung und Ausbreitung von MRE stellt ein Problem dar, dass weder vor

Spezies- noch vor Ländergrenzen Halt macht. Umso mehr erfordert es eine

interdisziplinäre und transsektorale Zusammenarbeit, um den sich beständig

verändernden Herausforderungen zu begegnen und im Sinne des „One-Health“

Gedankens eine nachhaltige, optimierte Eindämmung von antibiotikaresistenten

Bakterien zu erreichen.

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4. Zusammenfassung

102

4. Zusammenfassung

Multiresistente Erreger (MRE) sind in der Humanmedizin gefürchtet als Auslöser

nosokomialer Infektionen, aber auch in der Veterinärmedizin an verschiedenen

Krankheitsgeschehen beteiligt. Zudem nehmen landwirtschaftliche Nutztiere eine

Reservoirfunktion für MRE ein, sind sie vielfach asymptomatisch kolonisiert.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Vorkommens von

Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) und Extended-spectrum β-Laktamase

(ESBL) bildenden E. coli bei landwirtschaftlichen Mitarbeitern und Nutztieren in

Mecklenburg-Vorpommern im Jahr 2012. In die Untersuchungen konnten 17

Schweine-, 11 Rinder- und 6 Geflügelbetriebe und 78 dort Beschäftigte einbezogen

werden.

Zur Isolation von MRSA bei Mitarbeitern wurden kombinierte Nasen-Rachen-

Abstrichtupfer direkt und nach nicht selektiver Anreicherung auf einem chromogenen

MRSA-Nährmedium ausgestrichen. Weiterhin wurden fünf Staubproben pro Betrieb

gepoolt untersucht. In den Geflügelbetrieben erfolgte je bei einer Stichprobe von 10

Tieren ein Choanenabstrich. Bei den Staub- und Choanentupfern fanden eine

selektive, doppelte Anreicherung und anschließend ein Ausstrich auf einem

chromogenen MRSA-Nährmedium statt. Der Mikrobouillon-Verdünnungstest diente

der Ermittlung des Antibiotikaresistenzphänotyps. Anschließend erfolgten eine spa-

Typisierung, Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) sowie Polymerase-

kettenreaktion (PCR) auf das Vorkommen des Genes luk-PV.

Von den 78 Mitarbeitern wiesen 20 einen MRSA auf. Diese arbeiteten ausnahmslos

in der Schweinehaltung und bis auf eine Ausnahme in Betrieben mit einer MRSA-

positiven Staubprobe (p < 0,001). Von den 34 beprobten Betrieben wiesen 6 MRSA-

positive Staubproben auf, wobei es sich ausschließlich um Schweinehaltungen

handelte und sowohl Mast- als auch Zuchtbetriebe betroffen waren. Alle MRSA-

Isolate ließen sich dem klonalen Komplex (CC) 398 zuordnen, dem klassischen

livestock-associated MRSA (LA-MRSA). Das für den Virulenzfaktor Panton-Valentin-

Leukozidin codierende Gen luk-PV wurde nicht detektiert.

Insgesamt konnten den Isolaten 6 verschiedene spa-Typen zugeordnet werden,

wobei t034 (9/26), t011 (7/26) und t2370 (7/26) dominierten. Die weiteren spa-Typen

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4. Zusammenfassung

103

(t10721, t1451, t3275) traten jeweils nur einmal auf. Alle Isolate wiesen Resistenzen

gegen Oxacillin und Oxytetrazyklin auf. Der häufigste Resistenzphänotyp zeigte

zusätzlich eine Resistenz gegen Erythromycin und Clindamycin (16/26). Resistenzen

gegen Fluorchinolone (5/26) und Gentamicin (3/26) traten deutlich seltener in

Erscheinung.

Ein zooanthroponotischer Transfer liegt aufgrund des ausschließlichen Nachweises

des CC398 nahe; zudem wiesen drei humane Isolate die identischen spa-Typen und

Resistenzmuster wie die jeweiligen korrespondierenden Isolate aus den

Stallstaubproben auf. Weder aus den Staubproben der Rinder- und Geflügelbetriebe

inklusive Choanentupfern, noch aus den Proben der dort arbeitenden Beschäftigten

konnten MRSA isoliert werden.

Zur Isolation der ESBL-bildenden E. coli von den Mitarbeitern erfolgten

Leistenabstriche. In den Tierbeständen wurden Kotsammel- bzw. Sockenproben, in

den Geflügelställen zusätzlich bei einer Stichprobe von 10 Tieren pro Betrieb

Kloakenabstriche entnommen. Bei den humanen Proben erfolgte sowohl eine direkte

Kultivierung auf einem selektiven chromogenen ESBL-Nährmedium, als auch eine

nicht selektive Anreicherung. Die tierischen Proben wurden erst nach nicht selektiver

Anreicherung auf dem ESBL-Nährmedium ausgestrichen. Nach der Bestätigung der

verdächtigen Isolate als ESBL-Bildner fanden eine MLST zur Charakterisierung der

Housekeeping-Gene und eine Multiplex-PCR zur Detektion der β-Laktamasen

CTX-M, TEM, SHV und OXA statt. Für ausgewählte Isolate erfolgte eine

Subtypisierung mittels Sanger-Sequenzierung.

Von den 73 in die Auswertung einbezogenen Mitarbeitern wiesen fünf ESBL-bildende

E. coli auf, drei dieser Personen waren in Rinder-, zwei in Schweinebetrieben

beschäftigt. Alle fünf Isolate codierten CTX-M-Gene, zwei Isolate wiesen ebenfalls

TEM, ein Isolat zusätzlich OXA auf.

Insgesamt wiesen 14 Schweine-, 6 Rinder- und 3 Geflügelbetriebe ESBL-bildende

E. coli auf. Zudem konnten in 9 der 60 Kloakentupfer aus zwei unterschiedlichen

Betrieben ESBL-Bildner detektiert werden. CTX-M war die am häufigsten in Rinder-

und Schweinebetrieben nachgewiesene β-Laktamase, in den Geflügelbetrieben

dominierte SHV.

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4. Zusammenfassung

104

Alle ESBL-positiven Probanden waren in ESBL-positiven Betrieben beschäftigt. Ein

Isolat eines Probanden und das korrespondierende Isolat aus der Kotsammelprobe

des Rinderbetriebes wiesen beide den MLST ST3891 und eine CTX-M-1/-61

β-Laktamase auf. Das deutet auf einen potentiellen zoonotischen Transfer hin.

Zudem wurden in drei Isolaten von Mitarbeitern und den zugehörigen tierischen

Kotproben die gleichen ESBL-Allele gefunden, wodurch ein horizontaler Gentransfer

möglich erscheint.

Die Ergebnisse zeigen die weite Verbreitung von LA-MRSA in Schweinebetrieben

(35 %) in Mecklenburg-Vorpommern und die damit einhergehende Gefährdung der

Mitarbeiter auf. ESBL-bildende E. coli waren in mehr als Zweidrittel der untersuchten

Betriebe nachweisbar und wurden in Schweine-, Rinder- und Masthühnerhaltungen

detektiert. Darüber hinaus weisen die Ergebnisse erstmals auf eine potentielle

zoonotische Übertragung von Rindern auf den Menschen hin. Die hohen

Detektionsraten von MRSA und ESBL-bildenden E. coli bei landwirtschaftlichen

Nutztieren als auch die potentielle Übertragung auf Mitarbeiter unterstreichen die

Notwendigkeit einer regelmäßigen Surveillance.

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5. Summary

105

5. Summary

Multiresistant bacteria are known as human pathogens causing nosocomial

infections, but they are also harmful in veterinary medicine. Livestock are often

asymptomatic carriers and therefore an important reservoir. This study was meant to

present data on the occurrence of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and

extended-spectrum β-lactamases (ESBL) producing E. coli in farm workers and

livestock in Mecklenburg Western-Pomerania (MP) in 2012. In total, 17 pig farms, 11

cattle farms, 6 poultry farms and 78 farm workers were included.

For human MRSA sampling combined nasopharyngeal swabs were streaked onto a

chromogenic MRSA plate directly and after an enrichment step. To find out the

animal colonization rate, five pooled dust samples were collected at every

participating farm. Additionally, at each poultry farm oropharyngeal swabs of ten

randomly selected animals were taken. After double enrichment the dust samples

and the oropharyngeal swabs were streaked onto a chromogenic MRSA agar plate.

Antimicrobial susceptibility testing was performed using the broth microdilution assay.

Furthermore, spa-typing, multilocus sequence typing (MLST) and polymerase chain

reaction (PCR) identifying the gene luk-PV was performed.

In total, 20 of 78 farm workers tested positive for MRSA. All of these worked at pig

farms and, despite one exception, in farms with an MRSA-positive dust sample

(p < 0,001). Six of 34 pooled dust samples were MRSA-positive; all were pig farms

including fattening and breeding farms. All MRSA isolates belonged to the clonal

complex (CC) 398 and were therefore livestock-associated MRSA (LA-MRSA). None

of the isolates contained the gene luk-PV which encodes the toxin Panton-Valentine-

leukocidin.

Six different spa types were detected and t034 (9/26), t011 (7/26) and t2370 (7/26)

predominated. Other spa types (t10721, t1451, t3275) were observed only once.

As all isolates were CC398, a zooanthroponotic transfer seemed to be very likely.

Furthermore, three MRSA-isolates from humans showed the same spa types and

resistance patterns to those found in the corresponding dust samples. Neither the

dust samples from cattle and poultry farms including the oropharyngeal swabs nor

farm workers from cattle and poultry were tested positive for MRSA.

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5. Summary

106

Inguinal swabs from farm workers were screened for ESBL-producing E. coli. For

evaluation of the livestock colonization rate, pooled fecal samples were taken in pig

and cattle farms and in poultry farms boot swabs and cloacal swabs were collected.

The human samples were streaked onto a chromogenic ESBL screening plate

directly and additionally, after an unselective enrichment step. The livestock samples

were streaked onto the chromogenic plate after an unselective enrichment step. After

confirmation of the suspected ESBL-isolates, MLST was performed to characterize

the housekeeping genes. For detection of the β-lactamases genes blaCTX-M, blaTEM,

blaSHV and blaOXA a multiplex PCR was used. For the human isolates and the

corresponding livestock isolates Sanger sequencing of the PCR products was

performed to enable further subtyping of the ESBL genes.

Five of 73 included farm workers carried ESBL-producing E. coli. Three of these farm

workers worked at cattle farms and two worked at pig farms. All human ESBL-

positive isolates harbored CTX-M. In addition, two isolates were positive for the TEM

group and one isolate for OXA β-lactamases.

In total, 14 pig farms, 6 cattle farms and 3 broiler farms tested positive for ESBL-

producing Escherichia spp. Nine of 60 cloacal swabs, collected from two different

broiler farms, harbored ESBL-producers. CTX-M was the most frequently found

ESBL at pig and cattle farms. In poultry farms SHV predominated.

All ESBL-positive farm workers were employed at farms with ESBL-positive livestock

fecal samples. One human isolate shared the identical MLST sequence type 3891

and CTX-M-1/-61 to an isolate found in the corresponding cattle fecal sample,

indicating a zoonotic transfer. Furthermore, three human isolates showed similar

ESBL alleles to the corresponding livestock samples, which may indicate a horizontal

gene transfer.

The study shows the high prevalence of LA-MRSA in pig farms (35%) in MP as well

as the zoonotic risk for pig farm workers. ESBL-producing E. coli were found in over

two thirds of the livestock farms, including pig, cattle and broiler farms. Furthermore,

for the first time the results indicate a potential zoonotic transfer from cattle to a farm

worker.

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5. Summary

107

The high frequencies of MRSA and ESBL-producing E. coli found in livestock and the

potential zoonotic transfer to farm workers emphasize the necessity of regular

surveillance measurements.

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Tabellenverzeichnis

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Tabellenverzeichnis

Tab. 1: MRGN-Klassifizierung nach phänotypischen Resistenzeigenschaften

(modifiziert nach [112]) .........................................................................................................20

Tab. 2: Verwendete Geräte ..................................................................................................33

Tab. 3: Verwendete Verbrauchsmaterialien ..........................................................................34

Tab. 4: Verwendete Nährböden/ Bouillons ...........................................................................34

Tab. 5: Verwendete Arbeitskits, Chemikalien .......................................................................35

Tab. 6: Verwendete Software ...............................................................................................36

Tab. 7: Verwendete Internetseiten ........................................................................................36

Tab. 8: Zuständigkeiten der beteiligten Institutionen .............................................................37

Tab. 9: Grenzwerte für Enterobacteriaceae nach EUCAST Version 4.0

(http://www.eucast.org) .........................................................................................................42

Tab. 10: Statistische Berechnungen .....................................................................................45

Tab. 11: Alter und durchschnittliche Arbeitszeit pro Werktag der Teilnehmer .......................46

Tab. 12: Kennzahlen der 17 untersuchten Schweinebetriebe ...............................................47

Tab. 13: Kennzahlen der 11 untersuchten Rinderbetriebe ....................................................48

Tab. 14: Kennzahlen der 6 untersuchten Geflügelbetriebe ...................................................49

Tab. 15: MRSA-Nachweise der untersuchten Probanden, aufgeschlüsselt nach

Tierhaltung ...........................................................................................................................50

Tab. 16: Durchschnittsalter (in Jahren) der untersuchten Probanden in MRSA-positiven

Schweinebetrieben nach Geschlecht und MRSA-Status ......................................................52

Tab. 17: Betriebsart und MRSA-Status der Schweinebetriebe ..............................................54

Tab. 18: Ergebnisse der Typisierung der MRSA-positiven Isolate der Nasen-Rachen-

tupfern von Mitarbeitern und Staubproben aus Schweineställen (modifiziert nach [169]) ......55

Tab. 19: Repeats der isolierten spa-Typen (http://spaserver.ridom.de/spaserver) ................58

Tab. 20: Anzahl ESBL-positiver Betriebe und Mitarbeiter .....................................................59

Tab. 21: Durchschnittliche Arbeitszeit pro Werktag der ESBL-positiven und ESBL-

negativen Mitarbeiter aus ESBL-positiven Betrieben ............................................................61

Tab. 22: Betriebsart und ESBL-Status der Schweinebetriebe ...............................................62

Tab. 23: Betriebsart und ESBL-Status Rinderbetriebe ..........................................................63

Tab. 24: Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung und MLST der humanen und

korrespondierenden tierischen ESBL-positiven Isolate .........................................................68

Tab. 25: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli bei Mitarbeitern ..................... 138

Tab. 26: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Schweinebetrieben ......... 138

Tab. 27: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Rinderbetrieben .............. 140

Tab. 28: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Geflügelbetrieben ........... 141

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Abbildungsverzeichnis

129

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Durchschnittliche Tierzahl pro Betrieb in MV im Vergleich zu ausgewählten

Bundesländern nach Daten des Statistischen Bundesamtes [17] .......................................... 3

Abb. 2: E-Test mit Ceftazidim und Ceftazidim/ Clavulansäure. .............................................28

Abb. 3: MRSA-Status und Alter der Probanden aus Betrieben mit MRSA-positiven

Staubproben .........................................................................................................................51

Abb. 4: Arbeitszeit, Geschlecht und MRSA-Status der Mitarbeiter aus MRSA-positiven

Betrieben ..............................................................................................................................53

Abb. 5: Vergleich des Alters der ESBL-positiven und ESBL-negativen Mitarbeiter aus

Betrieben mit einer ESBL-positiven Kotsammelprobe...........................................................60

Abb. 6: Häufigkeit der nachgewiesenen Resistenzgene blaCTX-M, blaOXA, blaSHV und

blaTEM bei den untersuchten Spezies (modifiziert nach [170]) ...............................................65

Abb. 7: Darstellung der Verwandtschaftsgrade mittels Minimum spanning trees

(MSTree), basierend auf den MLST-Ergebnissen (nach [170]) .............................................65

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Anhang

130

Anhang

Anlage 1: Probandeninformation für das MRE-Screening bei

Mitarbeitern in der Tierhaltung

Sehr geehrte Probandin, sehr geehrter Proband,

jeder Mensch ist am gesamten Körper mit verschiedenen Bakterien besiedelt, die in

der Regel keine Erkrankungen verursachen, da sie zur natürlichen Bakterienflora des

Menschen gehören. Es gibt aber auch Bakterien, die den Menschen besiedeln und

potentielle Krankheitserreger sind, z. B. Staphylococcus aureus. Etwa jeder Dritte

von uns trägt dieses Bakterium in der Nase. Die Besiedlung verläuft im Regelfall

symptomfrei, kann aber auch Infektionen verursachen, so z. B. Haut- und

Wundinfektionen, selten lebensbedrohliche Erkrankungen. S. aureus kann

gegenüber bestimmten Antibiotikaklassen unempfindlich sein (MRSA), dies

erschwert die Behandlung von Infektionen durch diesen Erreger. Zudem gibt es auch

Darmbakterien, die zusätzliche Resistenzmechanismen tragen können, z. B.

sogenannte ESBL-Bildner. Bei resistenten Bakterienstämmen ergibt sich dann ein

Risiko, wenn sie bspw. im Rahmen einer Operation, eines Katheters oder einer

chronischen Wunde in den Körper gelangen und eine Infektion verursachen, weil

aufgrund der Resistenz der antibiotische Behandlungserfolg schwerer erreichbar ist.

Die Kenntnis der Besiedlung mit resistenten Bakterien ist für die eigene Sicherheit

von Bedeutung, aber auch zur Unterbindung der Weiterverbreitung auf empfindliche

Personen. Ein weiterer Vorteil der Kenntnis einer derartigen Besiedelung besteht

darin, dass im Falle von MRSA der betreffende Träger saniert werden kann.

Aufgrund der in den letzten Jahren stattfindenden zunehmenden Ausbreitung von

resistenten Bakterien bei landwirtschaftlichen Nutztieren steigt zugleich das Risiko

ihrer Übertragung auf in der Tierhaltung Beschäftigte. Die Kenntnis dieser

Ausbreitung ist ein wichtiger Baustein zur Verhütung der weiteren Ausbreitung dieser

Erreger und für den individuellen Schutz der Beschäftigten. Deshalb bitten wir Sie,

mit Hilfe eines Nasen- und Leistenabstrichs zu überprüfen, ob Sie dort mit

resistenten Bakterien besiedelt sind. Für eine Risikoabschätzung ist es erforderlich,

eine ausreichend große Stichprobe zu untersuchen (sog. Screening).

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Anhang

131

Im Zusammenhang mit dem Screening werden auch persönliche Daten

aufgezeichnet, z. B. Geburtstag und Geschlecht. Alle Patientendaten unterliegen

dem Datenschutz. Die Anzahl der Personen, die Zugang zu diesen Daten haben, ist

eng begrenzt. Diese Personen unterliegen der Schweigepflicht.

Diese Untersuchung und deren Ergebnis haben für Sie und Ihren Betrieb

keinerlei Nachteile! Eine Besiedelung der Nasenschleimhaut mit Staphylococcus

aureus oder ESBL-Bildnern im Darm ist normalerweise nicht therapiebedürftig. Die

Kenntnis über die Besiedlung ist für Sie im Falle einer bevorstehenden invasiven

Maßnahme (z. B. eine Operation) oder bei einer Infektion von Vorteil.

Selbstverständlich ist Ihre Teilnahme freiwillig. Sie können jederzeit die

Weiterführung ohne Angabe von Gründen ablehnen. Es entstehen Ihnen

dadurch keine Nachteile.

Die Beprobung nehmen Sie nach Anleitung selbstständig vor:

Die Nasenabstriche werden mit dem BBL CultureSwabTM gewonnen. Der BBL

CultureSwab besteht aus einem sterilen Tupfer und einem Röhrchen mit

Transportmedium, in das der Tupfer nach Probenentnahme gesteckt wird.

Den sterilen Tupfer bitte nur am Griff anfassen.

Die Spitze des sterilen Tupfers darf nicht berührt werden oder mit Gegenständen

in Kontakt kommen, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden.

Mit einem Tupfer wird aus dem Rachen und dem linken und rechten Nasenloch

eine Probe genommen.

Den Tupfer in den Mund einführen und am Rachen entlangstreichen.

Den Tupfer etwa 1 cm tief (bis zum Ende des Nylonkopfes) in die Nase einführen.

Den Tupfer jeweils 4x an der Innenseite der Nasenflügel im Kreis entlang reiben.

Dabei einen leichten, gleichmäßigen Druck ausüben und den Tupfer ohne

Unterbrechung zwischen Zeigefinger und Daumen rotieren.

Die Tupfer nach dem Abstrich sofort in das Röhrchen mit dem Transportmedium

stecken und verschließen.

Das Röhrchen bitte mit Ihrem Namen, Datum und Abstrichort (Nase und/ oder

Rachen) beschriften.

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Anhang

132

Die Beprobung in der Leiste/ am Damm:

Die Abstriche werden mit dem BBL CultureSwabTM gewonnen. Der BBL

CultureSwab besteht aus einem sterilen Tupfer und einem Röhrchen mit

Transportmedium, in das der Tupfer nach Probenentnahme gesteckt wird.

Den sterilen Tupfer bitte nur am Griff anfassen.

Die Spitze des sterilen Tupfers darf nicht berührt werden oder mit Gegenständen

in Kontakt kommen, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden.

Den Tupfer an der Leiste hinab bis zum Damm führen.

Dabei einen leichten, gleichmäßigen Druck ausüben.

Den Tupfer nach dem Abstrich sofort in das Röhrchen mit dem Transportmedium

stecken und verschließen.

Das Röhrchen bitte mit Ihrem Namen, Datum und Abstrichort (Leiste) beschriften.

Bei Fragen können Sie sich jederzeit an einen Arzt des Instituts für Hygiene und

Umweltmedizin oder direkt an Frau Dahms wenden: Telefon: 0 38 34 –------------

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Anhang

133

Anlage 2: Merkblätter zur Probenentnahme

Anlage 2a: Merkblatt zur Probenentnahme Schwein/ Rind

Während der Probenentnahme sind Handschuhe zu tragen.

Probenentnahme MRSA

Durchführung:

- Pro Betrieb werden 5 Staubproben entnommen.

- Mit einem trockenen, sterilen Tupfer etwa 500 cm2 beproben, bevorzugt die

obere Stallwand. Dies möglichst in verschiedenen Stalleinheiten wiederholen.

- Tupfer in Plastiktüte geben.

Dokumentation:

- Kennzeichnen (z. B.: HICARE MRSA, Datum/Nummer des Betriebs, Teilprobe 1).

- Probe bei Raumtemperatur lagern (zwischen +2 °C und +25 °C).

- so schnell wie möglich, aber nach spätestens einer Woche soll die Probe im LALLF

vorliegen.

Probenentnahme ESBL

Durchführung:

- Pro Betrieb werden jeweils zwei Kotsammelproben genommen.

- Je Sammelprobe werden insgesamt mindestens 25 g Kot von mindestens 10

Tieren benötigt.

- Die Proben werden, wenn vorhanden, aus zwei verschiedenen Altersgruppen

genommen.

Dokumentation:

- Die Kotsammelproben werden in Einwegtüten verpackt und gekennzeichnet

(z. B.: HICARE ESBL, Datum/ Nummer des Betriebes, Teilprobe 1).

- Die Probe wird gekennzeichnet und gekühlt (+2 °C – +8 °C) schnellstmöglich (max.

48 h) ins LALLF transportiert.

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Anhang

134

Anlage 2b: Merkblatt zur Probennahme Geflügel

- vor Betreten des Stallgebäudes Handschuhe und Plastikstiefelüberzieher anlegen

Probenentnahme MRSA

Durchführung:

- Pro Betrieb werden 5 Staubproben entnommen.

- Mit einem trockenen sterilen Tupfer etwa 500 cm2 beproben, bevorzugt die obere

Stallwand. Dies möglichst in verschiedenen Stalleinheiten wiederholen.

- Tupfer in sterile Plastiktüte geben.

Dokumentation:

- Kennzeichnen (z. B.: HICARE MRSA, Datum/ Nummer des Betriebs, Teilprobe 1).

- Probe bei Raumtemperatur lagern (zwischen +2 °C – 25 °C).

- so schnell wie möglich, aber nach spätestens einer Woche soll die Probe im LALLF

vorliegen.

Probenentnahme ESBL

Vorbereitung:

- 250 ml gekühlte, sterile physiologische Kochsalzlösung (0,9 %) bereithalten.

- autoklavierte Vlies-Hauben fungieren als sterile Sockenüberzieher.

- Mit den angelegten Plastikstiefelüberziehern nicht mehr die

Schuhzeugdesinfektionseinrichtungen betreten.

Durchführung Boden-, Volieren-, Freiland- und Ökohaltungen

- Jede Probe besteht aus einem Paar Sockenüberzieher, die über die

Plastikstiefelüberzieher gezogen werden.

- Sockenüberzieher mit physiologischer Kochsalzlösung anfeuchten.

- je Sockenpaar 100 Meter über die Stallbodenfläche und/ oder auf den

Bodenrosten in allen Bereichen des Gebäudes entlanglaufen.

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Anhang

135

Dokumentation

- Die Proben werden einzeln in Einwegtüten verpackt.

- Probenkennzeichnung vornehmen (z. B.: HICARE ESBL, Datum/ Nummer des

Betriebes, Teilprobe 1).

- Die Probe wird gekennzeichnet und gekühlt (+2 °C – +8 °C) schnellstmöglich (max.

48 h) ins LALLF transportiert.

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Anhang

136

Anlage 3: Beprobungsbögen mit Kennzahlen zu den Betrieben

Anlage 3a: Beprobungsbogen Schwein/ Rind

Betrieb Nr./ Landkreis:

Tierart: Schwein □ Rind □

Haltung anderer

Tierarten im Betrieb:

Ja

Und zwar:

Nein

Nutzungsart: Zuchtbetrieb □ Milchvieh □

Aufzuchtbetrieb □ Mutterkuhhaltung □

Mastbetrieb □ Mastvieh □

Anderes □ Anderes □

Und zwar: Und zwar:

Tierzahl: 50–150 □ 50–99 □

151–700 □ 100–250 □

> 700 □ > 250 □

Haltungsform: Flatdeck □ Anbindehaltung □

Spaltenboden □ Laufstall □

Teilspaltenboden □ Boxenlaufstall □

Tiefstreustall □ Tretmiststall □

Anderes □ Tiefstreustall □

Und zwar: Einraumlaufstall □

Mehrraumlaufstall □

Spaltenboden □

Anderes □

Und zwar:

Rein-Raus-System: Ja □ Nein □

Ökologischer Betrieb: Ja □ Nein □

Auslauf/ Weidegang: Ja □ Nein □

Besonderheiten:

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Anhang

137

Anlage 3b: Beprobungsbogen Geflügel

Betrieb Nr./ Landkreis:

Tierart: Huhn □ Pute □

Haltung anderer

Tierarten im Betrieb:

Ja

Und zwar:

Nein

Nutzungsart: Legehennen □ Mast □

Masthühner □ Zucht □

Anderes □

Und zwar:

Tierzahl: 10.000–20.000 □ 10.000–20.000 □

20.000–100.000 □ 20.000–30.000 □

> 100.000 □ > 30.000 □

Haltungsform: Käfighaltung □ Bodenhaltung □

Bodenhaltung □ Freilandhaltung □

Freilandhaltung □ Ökologische Haltung □

Ökologische Haltung □ Anderes □

Anderes □

Rein-Raus-System: Ja □ Nein □

Auslauf: Ja □ Nein □

Besonderheiten:

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Zusätzliche Tabellen

Tab. 25: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli bei Mitarbeitern

Proband aus

Betrieb Landkreis MLST-Ergebnisse der Housekeeping-Gene ST MLST CC ESBL PCR-Ergebnisse

adk fumC gyrB icd mdh purA recA

CTX-M OXA SHV TEM

S-4-6 S-4 MSE 92 4 87 96 70 58 2 648 n. z.* + - - +

S-18-1 S-18 VR 6 4 12 1 20 65 7 367 ST23 Cplx# + - - +

R-6-4 R-6 VG 35 37 29 25 4 5 73 405 ST405 Cplx + + - -

R-6-5 R-6 VG 112 11 5 12 8 8 86 542 n. z. + - - -

R-10-1 R-10 VG 9 8 12 138 9 12 6 3891 n. z. + - - -

* nicht zuzuordnen; #Complex

Tab. 26: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Schweinebetrieben

Betrieb Landkreis MLST-Ergebnisse der Housekeeping-Gene ST MLST CC ESBL PCR-Ergebnisse

adk fumC gyrB icd mdh purA recA CTX-M OXA SHV TEM

S-1 VG 9 23 64 18 11 8 6 278 ST278 Cplx + - - -

S-1 VG 10 11 198 8 8 13 73 1287 n. z. + - - +

S-1 VG 6 4 4 18 24 5 14 56 ST155 Cplx + - - +

S-2 VG 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - -

S-2 VG 6 4 12 1 20 12 7 88 ST23 Cplx + - - +

S-3 VG 20 45 41 43 5 32 2 117 n. z. + - - -

S-3 VG 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - -

Page 149: Aus dem Institut für Hygiene und Umweltmedizin (Direktor ... · reihenförmig angeordneten Streptokokken in der Lage das Enzym Katalase zu bilden [18]. S. aureus ist zwischen 0,5–1,5

S-4 MSE 340 498 370 413 325 307 276 3893 n. z. + - - -

S-4 MSE 99 6 33 33 24 8 7 453 ST86 Cplx + - - -

S-4 MSE 340 499 371 423 326 308 277 3947 n. z. + - - +

S-4 MSE 6 4 12 1 20 12 7 88 ST23 Cplx + - - -

S-5 VR 9 6 33 131 24 8 7 641 ST86 Cplx + - - -

S-5 VR 57 497 1 245 7 8 2 3888 n. z. + - - -

S-5 VR 92 4 87 96 70 58 2 648 n. z. - - - +

S-6 VR 112 11 5 12 8 8 86 542 n. z. + - - -

S-6 VR 64 7 1 8 8 8 6 871 n. z. + - - -

S-6 VR 10 11 4 1 8 250 2 3890 n. z. + - - -

S-6* VR 10 11 125 8 7 8 2 3274 n. z. + - - -

S-7 VR 6 4 4 16 24 8 14 58 ST155 Cplx + - - -

S-9 LRO 43 41 15 18 11 7 6 101 ST101 Cplx + - - +

S-9 LRO 6 4 14 1 20 62 7 345 n. z. + - - -

S-11 LRO 9 175 33 131 24 8 7 877 n. z. + - - -

S-11 LRO 6 11 4 8 8 8 2 48 ST10 Cplx + - - -

S-12 LRO 6 11 4 8 8 306 2 3892 n. z. + - - -

S-12 LRO 10 27 5 10 12 8 49 189 ST165 Cplx + - - +

S-12 LRO 43 41 15 18 11 7 6 101 ST101 Cplx + - - -

S-12 LRO 10 11 4 8 8 18 2 215 ST10 Cplx + - - -

S-14 LRO 6 4 12 1 20 13 7 23 ST23 Cplx + - - +

S-14 LRO 6 11 4 10 7 8 6 93 ST168 Cplx + - - +

S-15 LRO 10 11 4 1 8 8 2 34 ST10 Cplx + - - -

S-15 LRO 6 11 4 8 8 8 2 48 ST10 Cplx + - - -

Page 150: Aus dem Institut für Hygiene und Umweltmedizin (Direktor ... · reihenförmig angeordneten Streptokokken in der Lage das Enzym Katalase zu bilden [18]. S. aureus ist zwischen 0,5–1,5

S-18 VR 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - +

S-19 VR 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - +

* E. hermanii

Tab. 27: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Rinderbetrieben

Betrieb Landkreis MLST-Ergebnisse der Housekeeping-Gene ST MLST CC ESBL PCR-Ergebnisse

adk fumC gyrB icd mdh purA recA

CTX-M OXA SHV TEM

R-x-1 VR 6 31 5 28 1 1 2 57 ST350 Cplx + + - +

R-3 VG 6 19 3 26 11 8 6 446 ST446 Cplx + - - -

R-3 VG 6 6 5 10 9 8 6 154 n. z. - - - +

R-6 VG 6 4 5 18 11 8 14 533 n. z. + + - -

R-9 VG 100 23 7 45 7 3 7 1250 n. z. - - + -

R-9 VG 6 19 3 26 11 8 6 446 ST446 Cplx + - - -

R-10 VG 9 8 12 138 9 12 6 3891 n. z. + - - -

R-11 VG 85 88 78 29 59 58 62 354 ST354 Cplx + - - -

R-11 VG 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - -

R-11 VG 6 7 57 8 8 18 2 3889 n. z. + - - +

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Tab. 28: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Geflügelbetrieben

Betrieb Landkreis MLST-Ergebnisse der Housekeeping-Gene ST MLST CC ESBL PCR-Ergebnisse

adk fumC gyrB icd mdh purA recA

CTX-M OXA SHV TEM

Ergebnisse der Sockenproben

G-1/ Broiler VR 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +

G-2/ Broiler VR 10 11 4 10 7 8 2 2705 n. z. - - + +

G-9/ Broiler MSE 4 26 39 25 5 31 19 115 n. z. + - - -

Ergebnisse der Kloakentupferproben

G-1/ Tier 1

VR

9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -

G-1/ Tier 2 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +

G-1/ Tier 3 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +

G-1/ Tier 5 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -

G-1/ Tier 7 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -

G-1/ Tier 8 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +

G-1/ Tier 9 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -

G-1/ Tier 9 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +

G-1/ Tier 10 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -

G-2/ Tier 7 VR 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +

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Anhang

142

Publikationen

Die Ergebnisse der vorgelegten Dissertation haben Eingang in folgende peer-

reviewed Artikel gefunden:

- Dahms C, Hübner NO, Wilke F, Kramer A. Mini-review: Epidemiology and

zoonotic potential of multiresistant bacteria and Clostridium difficile in livestock

and food. GMS Hyg Infect Contr 2014;9(3):Doc21

- Dahms C, Hübner NO, Cuny C, Kramer A. Occurrence of methicillin-resistant

Staphylococcus aureus in farm workers and the livestock environment in

Mecklenburg-Western Pomerania, Germany. Acta Vet Scand 2014; 56(1):53.

- Dahms C, Hübner NO, Kossow A, Mellmann A, Dittmann K, Kramer A.

Occurrence of ESBL-producing Escherichia coli in livestock and farm workers

in Mecklenburg-Western Pomerania, Germany. PLoS One

2015;10(11):e0143326.

- Strauß LM, Dahms C, Becker K, Kramer A, Kaase M, Mellmann A.

Development and evaluation of a novel universal β-lactamase gene subtyping

assay for blaSHV, blaTEM and blaCTX-M using clinical and livestock-associated

Escherichia coli. J Antimicrob Chemother 2015;70(3):710-5.

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Anhang

143

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und

keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen

wissenschaftlichen Einrichtung vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und

dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Ort, Datum Unterschrift

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Anhang

144

Danksagung

An erster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. Kramer herzlichst für die Betreuung

meiner Dissertation danken. Weiterhin danke ich Herrn PD Dr. Hübner als Initiator

des Projektes „HICARE-Gesundheitsprojekt Ostseeküste“, für die Möglichkeit in

einem interdisziplinären Projekt diese Fragestellung aufzuarbeiten.

Ein besonderer Dank gilt dem Bundesministerium für Bildung und Forschung, dass

die finanzielle Durchführung des HICARE-Projektes ermöglicht hat.

Vielen Dank an das Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und Verbraucherschutz

MV, insbesondere an Frau Dr. Dayen, für die Unterstützung bei der Akquisition der

Geflügelbetriebe. Aus dem gleichen Grund gilt mein Dank allen Beteiligten aus dem

Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei MV.

Mein besonderer Dank gilt den Mitarbeitern der Tierseuchenkasse, im Speziellen

dem Schweine- und Rindergesundheitsdienst für ihr Engagement und ihre

Unterstützung. Dies gilt natürlich auch für alle landwirtschaftlichen Betriebe und

Probanden, die trotz häufig negativer Pressemeldungen, den Mut und Willen

bewiesen haben, bei der Beleuchtung der Resistenzsituation behilflich zu sein.

Den MTAs Frau Lindstedt und Frau Sümnicht danke ich nicht nur dafür, dass sie ihre

Laborräume mit mir geteilt haben, auch standen sie mir immer mit Rat zu Seite.

Ich danke Frau Dr. Cuny und ihrem Team für die Analysen der MRSA-Isolate im RKI.

Ferner gilt mein Dank Frau K. Levin für die Bearbeitung der Geflügeltupferproben

und Herrn PD Dr. Mellmann und seinem Team für die Bearbeitung der ESBL-Isolate

und die Erstellung des MSTree.

Frau Dr. Dittmann danke ich für die hilfreichen Anmerkungen bei der Korrektur dieser

Arbeit. In diesem Zug möchte ich auch Fabian für die Hilfestellung bei

computertechnischen Fragen und Phillip für die Durchsicht danken.

Florian, dir gilt mein besonderer Dank für die unzähligen fachlichen Diskussionen,

den Einblick, den du mir aus humanmedizinischer Perspektive eröffnet hast und für

die moralische Unterstützung.


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