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FAME-Workstation
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Bestimmung der Fettsäureverteilung in raffinierten Ölen und
Fetten mittels alkalischer Umesterung
mit der FAME-Workstation
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FAME-Workstation
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Einführung
Tierische und pflanzliche Fette spielen als
Bestandteil unserer täglichen Ernährung
sowie als Schmier- und Gleitmittel eine
wichtige Rolle. Nach der EU-Lebensmit-
telinformationsverordnung sind Lebensmit-
telhersteller seit Dezember 2016 verpflich-
tet, die Fettsäurezusammensetzung auf der
Verpackung anzugeben. Für die Deklara-
tion wird nicht nur die Fettsäurezusammen-
setzung von Fetten und Ölen untersucht,
sondern auch die der cis- und trans-Fett-
säuren. Außerdem wird der Reinheitsgrad
bestimmt.
Die Triglyceride der Fettsäuren lassen sich
gaschromatographisch jedoch nicht analy-
sieren. Dafür bedarf es der Spaltung und
Derivatisierung des Fettes. Die Esterbin-
dungen werden aufgebrochen und die
freien Fettsäuren in ihre korrespondieren-
den Fettsäuremethylester überführt. Im
Gegensatz zu den jeweiligen Fettsäuren
sind die Fettsäuremethylester (FAMEs) un-
polar, moderat flüchtig und eignen sich für
die GC-Analyse.
Es gibt unterschiedliche Vorschriften, die
eine Analytik von ölhaltigen Proben auf
FAMEs beschreiben. Als Vorlage für die hier
vorliegende Applikation dient die Norm der
American Oil Chemists‘ Society (AOCS) Ce
2-66. Diese Norm enthält mehrere Metho-
den zur Aufarbeitung von Fett-Proben, wo-
bei die Methode 3 und Methode 4 (Abbil-
dung 1) der Norm für die Automatisierung
verwendet werden. Methode 4 dient der
Aufarbeitung von Fettproben mit einer Säu-
rezahl < 2. Die Methode 3 hingegen ist eine
umfassende Aufarbeitungsmethode. Sie ist
jedoch auch aufwendiger und zeitintensi-
ver.
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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Probenvorbereitung einer Öl-Probe mithilfe der Norm AOCS Ce 2-66.
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Gerätekonfiguration Die Analyse eines Fettes auf seine Fettsäu-
ren wurde auf einem System realisiert, das
sowohl Aufarbeitung der Probe wie auch
die Analyse vollautomatisch durchführen
kann. Dafür wurde ein 7890A GC-FID Sys-
tem von Agilent Technologies mit einem
S/SL-Injektor von SIM verwendet. Für die
Probenvorbereitung wurde ein PAL RTC Au-
tosampler von CTC Analytics eingesetzt.
Abbildung 2 zeigt die Konfiguration der ein-
zelnen Module auf der x-Achse des Samp-
lers.
Geräteaufbau Agilent 7890 GC mit FID-Detektor,
S/SL-Injektor und BPX-70 Säule 60 m
PAL RTC 120 cm mit Agitator, 2x
Parkstationen, 2x Tray-Holder mit 3x
VT-54 Racks und 3x VT-15 Racks,
Vortexer, Waschstation und Solvent-
Modul
Software CHRONOS Software von Axel Sem-
rau®
DataApex Clarity
Abbildung 2: Anordnung der Module eines PAL 3 RTC auf einem Agilent GC 7890 mit FID.
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Messparameter und Ergebnisse
Der Aufbau einer Lösung zur Probenvorbe-
reitung nach AOCS Ce 2-66 mit zwei ver-
schiedenen Probenvorbereitungsvarianten
bedarf eines flexiblen Systems zur Automa-
tisierung. Der PAL RTC Sampler mit auto-
matischem Tool-Wechsel ermöglicht genau
dieses. Mit zwei Parkstationen ist es mög-
lich, bis zu 6 verschiedene Spritzen-Tools
für verschiedene Aufgaben an dem System
zu verwenden. Dies liefert einen möglichst
hohen Grad an Effizienz und Flexibilität und
hilft Verschleppungen zu vermeiden.
In Verbindung mit der Software-Plattform
CHRONOS entsteht eine leistungsstarke
Automatisierung mit intelligenter Zeitpla-
nung und Verschachtelung und optimaler
Auslastung des gesamten Systems.
Schnittstellen zu fast allen gängigen Chro-
matographie-Auswertesystemen öffnen
diese CHRONECT Robotic Lösung für ana-
lytische Systeme fast aller Hersteller. Die
hier vorgestellte Automatisierung ist daher
nicht an eine bestimmte Gerätekonfigura-
tion gebunden. Die Messparameter des
Gaschromatographen für die aufbereiteten
Proben wurden aus der AOCS Norm Ce 1f-
96 gewählt (Tabelle 1). Diese Norm be-
schreibt nur die chromatographischen Be-
dingungen für die FAME-Analytik.
Tabelle 1: Parameter des Gaschromatographen.
Heizrate [°C/min] Endtemperatur [°C] Haltezeit [°C] Gesamtzeit [min]
70 0 0
5,00 220 15 45
Injektor 250 °C, 1 mL/min, Split 1:30
Detektor 250 °C, 25 mL/min N2 Makeup
Trägergas H2
Trennsäule BPX 70, 60 m, 250 µm i.d. und 0,25 µm Film
Die Methode 3 beschreibt die Probenvorbe-
reitung mittels alkalischer Verseifung durch
methanolisches Natriumhydroxid (meth.
NaOH) und nachfolgender Methylierung mit
methanolischem Bortrifluorid (meth. BF3).
Anschließend wird der Ansatz bis zum Sie-
den erhitzt und mit n-Heptan verdünnt. Es
folgt eine weitere Siedephase und danach
eine Ausfällung mit gesättigtem Natrium-
chlorid. Es bilden sich zwei Phasen, wobei
die obere organische Phase über Natri-
umsulfat getrocknet und anschließend in
das GC-FID injiziert wird. Als Vorlage für die
Probenaufbereitung dienen 50 mg Öl-Probe
in einem 10 mL Vial mit Crimp-Kappe.
Die Umesterung geschieht vollständig in
dem 10 mL Vial und die anschließende
Trocknung der Probe über Natriumsulfat
wird in einem 2 mL Vial durchgeführt. Der
PAL RTC liefert mit dem Automatic Tool-
Change die beste Lösung für das verschlep-
pungsfreie Vorbereiten dieser Proben bei
gleichzeitiger Vollautomatisierung. Das
Analyseergebnis einer Öl-Probe, die nach
dieser Methode aufgearbeitet wurde ist in
Tabelle 2 zu sehen.
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Tabelle 2: Fettsäurezusammensetzung eines Olivenöls und Vergleich mit Literaturdaten.
Durch die Nutzung der Plattform CHRONOS
in Kombination mit dem PAL RTC ist es
möglich, bis zu 40 Öl-Proben innerhalb von
24 h aufzuarbeiten und mittels GC-FID zu
analysieren (Abbildung 3). Bei dieser Art
der Probenvorbereitung werden aggressive
Reagenzien wie das meth. BF3 verwendet.
Um Korrosion an den Tools des PAL zu ver-
meiden, ist auf eine regelmäßige Wartung
des Systems zu achten.
Die Magneten an den Tools für den Trans-
port der Vials, sind dafür speziell anfällig.
Diese sollten regelmäßig gereinigt werden.
Bei kontinuierlicher Nutzung sollte dies ein-
mal im Monat geschehen. Für Proben die
als Feststoff vorliegen, eignet sich diese
Probenvorbereitung sehr gut.
Abbildung 3: Beispiel einer verschachtelten CHRONOS Sequenz von fünf Proben nach AOCS Ce 2-66 Methode 3 innerhalb von 3 h.
1 Die Werte entsprechen dem Trade Standard Applying to Olive Oil and Olive Pomace Oil des Internationalen Oli-
venölrates (Madrid) von 1998.
Komponente % Fläche % Fläche Literatur1
C16:0 (Palmitinsäure) 11,4 7,5 – 20,0
C18:1 (Ölsäure) 76,0 55,0 – 83,0
C18:2 cc 6,1 3,5 – 21,0
Andere Fettsäuren 6,4 0,0 – 10,0
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Bei der Methode 4 der AOCS Norm Ce 2-66
geschieht die Umesterung von ca. 50 mg
Probe mittels methanolischem Kaliumhyd-
roxid (meth. KOH). Zuerst wird die Probe in
n-Heptan gelöst. Nach der Phasentren-
nungwird die organische Phase mit Wasser
gewaschen und über Natriumsulfat ge-
trocknet. Das trockene Extrakt wird in n-
Heptan aufgenommen und direkt aus dem
Vial in das GC-FID System injiziert (Tabelle
3).
Ein grober Ablauf der Probenvorbereitung
ist in Tabelle 4 dargestellt und beinhaltet
alle wichtigen Arbeitsschritte. Diese Art der
Probenvorbereitung eignet sich hervorra-
gend für die Aufarbeitung von Öl-Proben in
kurzer Zeit. Wenn gewünscht, kann die Pro-
benvorbereitung um bis zu 40 Minuten pro
Probe beschleunigt werden, indem eine
Zentrifuge zur Erzielung einer schnelleren
Phasentrennung eingesetzt wird. Dies er-
höht den Durchsatz von 32 auf ca. 70 Pro-
ben in 24 h. Ein Analysenergebnis nach die-
ser Methode ist in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 3: Allgemeine Schritte der Probenvorbereitung nach Methode 4
Task Beschreibung
Transfer Add n-heptane
Transfer Add 2 M methanolic KOH
VortexVial Shake sample well
WaitOverlapped Wait for phase separation
Transfer Transfer 0.5 mL water into next vial with LS2
Transfer Transfer 0.5 mL of upper phase to next vial with LS2
VortexVial Shake sample well
WaitOverlapped Wait for phase separation
Transfer Transfer 2 drops of upper phase onto sodium sulfate
Transfer Dilute with heptane LS2
VortexVial Shake sample well
Tabelle 4: Allgemeine Schritte der Probenvorbereitung nach Methode 3 aus der CHRONOS-Methode.
Task Beschreibung
Transfer Add 0.5 M methanolic NaOH with LS2
Transfer Move to Agitator
WaitOverlapped Heat until dissolved
Transfer Add methanolic BF3 with LS3
WaitOverlapped Boil Time 1
Transfer Add heptane with LS2
WaitOverlapped Boil Time 2
Transfer Add saturated sodium chloride with LS3
WaitOverlapped Shake for 15 sec
Transport Remove vial from Agitator vial on tray
WaitOverlapped Wait for phase separation
Transfer Transfer 1 mL with LS2 to destination vial with sodium sulfate
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Tabelle 5: Fettsäureverteilung eines realen Öls aus dem Lebensmittelbereich.
2 Die Daten basieren auf einer Einfachmessung des Ölherstellers mit manueller Probenvorbereitung.
Komponente Ist % Fläche Soll % Fläche2 C14:0 0,06 0,07
C16:0 4,30 4,29
C16:1 0,22 0,27
C18:0 1,94 1,97
C18:1 c 63,66 63,86
C18:2 ct 0,02 0,04
C18:2 cc 18,26 18,42
C18:3 t 0,16 0,15
C18:3 ccc 8,15 8,25
C20:0 0,56 0,56
C20:1 1,03 1,02
C22:0 0,28 0,27
C24:0 0,12 0,13
C24:1 0,13 0,13
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Das Hauptaugenmerk bei dieser Applikation
liegt auf der Automatisierung der eigentli-
chen Probenvorbereitung. Dabei ist ein Kri-
terium ein ausreichendes Spülen aller ver-
wendete Spritzen um Verschleppung zwi-
schen verschiedenen Proben zu vermeiden
und eine gute Phasentrennung beim ausfäl-
len des Triglycerids zu erreichen. Dies führt
zu einer genaueren Abnahme der organi-
schen Phase nach der Methylierung. Um
eine möglichst saubere Probe zu injizieren
wurde das aufbereitete Produkt anschlie-
ßend mit Wasser 1:1 gewaschen und die
organische Phase über Natriumsulfat ge-
trocknet.
Neben der Entwicklung der Methode zur
Probenvorbereitung wurden die Parameter
des Agilent GC-FID Systems angepasst um
eine ausreichend gute Trennung der Fett-
säuremethylester zu erhalten. Hierfür
wurde ein FAME Standard mit 11 Kompo-
nenten von C14:0 bis C24:0 injiziert und
das Temperaturprogramm entsprechend
angepasst.
Für die Entwicklung der Methode wurden
Standardlösungen bestehend aus verschie-
denen Fettsäuremethylestern vermessen.
Abbildung 4 zeigt ein Chromatogramm des
eingesetzten Standards. Mit dem GC-Para-
metern aus konnte eine gute Trennung al-
ler Analyten erzielt werden. Selbst C18:3
und C20:0 zeigen eine entsprechende
Trennung.
Zusätzlich wurde der Restek FAME 37 Stan-
dard mit insgesamt 37 Fettsäuremethyl-
estern injiziert, um eine genauere Kalibrie-
rung der Retentionszeit für die verschiede-
nen Fettsäuren zu erhalten. Das Chromato-
gramm ist in Abbildung 5 dargestellt und
zeigt ebenfalls den Bereich von C14:0 bis
C24:1 mit entsprechend mehr Signalen in
dem Bereich.
Abbildung 4: Chromatogramm einer Trennung von 11 FAME-Analyten von C14:0 bis C24:0.
Für die Validierung der kompletten Me-
thode wurde anschließend noch eine Real-
probe gemessen, deren Kenndaten be-
kannt waren (Abbildung 6). Ein Vergleich
der Fettsäurezusammensetzung mit den
Kenndaten zeigte nur geringe Abweichun-
gen zu den Daten, die mit der Probe aus-
gehändigt wurden (Tabelle 5).
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Die vollautomatische Analyse einer Öl-
Probe liefert somit vergleichbare Daten zur
manuellen Probenvorbereitung. Die gerin-
gen Abweichungen der Daten von denen
des Öl-Herstellers liegen deutlich innerhalb
der Verfahrensabweichung von teilweise
bis zu 20 % für einzelne Komponenten
nahe an der am Signal/Rausch-Verhältnis.
Abbildung 5: Ein Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Restek FAME 37 Standards.
Abbildung 6: Messung von Fettsäuren in einer realen Öl-Probe.
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Zusammenfassung
Die hier vorgestellte Automatisierung der
FAME-Analytik nach der AOCS Norm er-
möglicht es, die komplette Analyse einer
Öl-Probe vollautomatisch durchzuführen.
Die manuelle Vorarbeit reduziert sich auf
das Wechseln von Lösemittel und das ma-
nuelle Einwiegen der Probenvorlage von Öl-
Proben. Das Hantieren mit der Probe und
den Chemikalien wird komplett vom Auto-
sampler übernommen, sowie die automati-
sche Injektion in das GC-FID System.
Gleichzeitig wird die Menge an verwendeter
Probe und die Menge an Chemikalien redu-
ziert auf wenige Milliliter pro Probe. Dazu
wird das Gefahrenpotenzial für den Mitar-
beiter im Labor deutlich reduziert, da dieser
nur noch bedingt mit gefährlicheren Chemi-
kalien in Kontakt kommt.
Das Auswechseln der Chemikalienvorräte
am Autosampler selbst kann einmal pro
Tag durchgeführt werden und beläuft sich
auf das Nachfüllen der Waschlösungen und
eventuell die Reaktionsreagenzien nachfül-
len. Lediglich kompliziertere Matrices wie
Futtermittel und generell Feststoffe bedür-
fen eventuell weiterer Vorbehandlung.
Die Automatisierung sichert dem Anwender
zum einen ein verschleppungsfreies Arbei-
ten und zum anderen einen hohen Durch-
satz. Die Probenvorbereitung über CHRO-
NECT Robotic ist robust und kann im 24 h
Einsatz betrieben werden. Der Proben-
durchsatz kann so gegenüber der manuel-
len Probenvorbereitung gesteigert werden.
Abhängig von den chromatographischen
Bedingungen können in 24 Stunden 27 bis
40 Proben abgearbeitet werden.
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