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Abbau von Huminstoffen durch Bodenmikroorganismen - eine aersicht Zdenek Filip*, Harald Claus und Gerald Dippell

Umweltbundesamt, Institut fur Wasser-, Boden- und Lufthygiene, Paul-Ehrlich-StraSe 29, D-63225 Langen

Angenommen: 19. April 1998

Zusammenfassung - Summary

Huminstoffe als die unterschiedlich extrahierbaren Fraktionen der organischen Bodensubstanz beeinflussen auf vielseitige Weise die Qualitat des Bodens als Pflanzenstandort und Bestandteil der Umwelt. lnsbesondere Huminsiuren und Fulvosauren, konnen biologischen Umsetzungen durch die Bodenmikroorganismen unterlirgen. Von vielen Autoren wurde die Beteiligung unterschiedlicher Spezies von Pilzen und Aktinornyceten sowie von nichtmyzelartigen aeroben und anaerohen Bakterien am Ab- und Umbau von Huminstomen unter Laborbedingungen nachgewiesen. Es gibt mehrere Ifinweise auf einen strukturspezifischen Huminstoffabbau. der auf Zelloberflachen unter Beteiligung von Exoenzymen svdttfindet. Die herausragende Rolle phenoloxidierender Enzyme bei diesen Prozessen konnte best& tigt werden. Der Abbau der Huminstoffe wird optisch. gravimetrisch, chemoanalytisch. biochemisch (COI-Freisetzung) oder biologisch anhand des Mikrobenwachstums bzw. der Biomassebildung verfolgt. Seine quantitative Erfassung kann durch die Adsorption der Humin- stoffe an der .Mikrobenbiomasse einerseits und durch die Neubildung huminstoffahnlicher Stoffwechselprodukte andererseits erschwert werden. Es ist daher notwendig, den Abbau- und UmbauprozeD mehr- faktoriell zu verfolgen und gleichermaljen quantitative wie auch quali- tative Parameter zu beriicksichtigen. Um den nattirlichen Standortbe- dingungen naher zu kommen, sollen Mischpopulationen von Mikroor- ganismen in die Untersuchungen des Hurninstoffabbaus verstiirkt einbezogen werden.

Einleitung

Huminstoffe (Huminsauren, Fulvosauren, Humine) stellen mit ca. 50 O/o einen wesentlichen Anteil der Kohlen- stoffreserven des Bodens dar. Durch ihre spezifischen Eigenschaften pragen sie den Boden als Pflanzenstandort und Grundbestandteil der Umwelt nachhaltig. Biologische und abiotische Umwandlungen oder gar ein Abbau von Huminstoffen konnen somit nicht nur die physiko-chemi- schen und biologischen Eigenschaften des Bodens stark beeinflussen, sondern sich auch auf die grundlegenden Prozesse der Bodenbildung und -degradation auswirken. Negative Entwicklungen des Humusgehaltes wurden dem Prinzip der Nachhaltigkeit in der Bodenwirtschaft, das auch die Forderung nach der Stabilisierung der organi- schen Bodensubstanz einschlieot, entgegenwirken. Es ist daher notwendig, den biologischen Huminstoffabbau zu

* Correspondence: Prof. Dr.Dr.h.c. 2. Filip; E-mail filip@cpb.cnrs- nancy.fr

Degradation of humic substances by soil microorganisms - a review

Humic substances which represent differently extractable fractions of the soil organic matter exert multifarious effects on soil as a site for plant growth and a part of terrestrial environments. Among them espe- cially humic acids and fulvic acids nre subject to degradation and/or transformation by soil microorganisms. Several authors demonstrated the participation of different species of fungi. actinomycetes and also of non-mycelial aerobic or anaerobic bacteria in those processes under laboratory conditions. Indications exist that hurnic substances irres- pective of their structure undergo degradation on cell surfaces due to the activity of exoenzymes. I n this respect microbial phenoloxidases play an extraordinarily important role. The degradation rate of humic SUbSldnCeS can be followed by optical, gravimetric and chemoanaly- tical methods as well as using biochemical and microbiological proce- dures (C02 release, microbial growth, biomass formation). An objec- tive evaluation, however. can be hindered by the adsorption of humic substances on microbial biomass and sometimes also by formation of novel humic-like microbial metabolites. Therefore it is necessary to apply a multifactorial approach in the study of the degradation of humic substances which includes both quantitative and qualitative parameters. To better elucidate how these processes may occur under natural conditions. mixed populations of soil microorganisms should be predominantly involved in future studies. Key words: humic substances / hurnic acids / fulvic acids / microbial degradation / analytical evaluation

beleuchten. Dies geschieht vonviegend durch Laborunter- suchungen an Praparaten von Huminstoffen unterschiedli- cher Herkunft. In dieser Ubersicht, die sowohl Studien aus der Literatur als auch einige eigene Ergebnisse zusammen- fafit, werden dazu zahlreiche Beispiele erortert .

Methodischer Nachweis des Huminstoffabbaus Eine Moglichkeit, den Abbau von Huminstoffen zu ver-

folgen und nachzuweisen, bietet die Ermittlung des mikro- biellen Wachstums auf huminstoffhaltigen Nahrmedien. Huminstoffpraparate ermoglichen allerdings in der Regel nur ein sehr begrenztes Mikrobenwachstum, insbeson- dere wenn sie als die einzige C-Quelle eingesetzt werden (Murzakov et al., 1989; Kontchou und Blondeau, 1992). Oft ist auch die Abgrenzung eines spezifisch auf Huminstoffe zu beziehenden Bakterienwachstums schwierig, da etwa durch eine ,,Verunreinigung" der Huminstoffpraparate mit anderen C-Quellen oder durch den Eintrag geringer Men-

Z. Pflanzenernahr. Bodenk.. 161, 6 0 5 6 1 2 (1998) 0 WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69451 Weinheim, 1998 0044-3263/98/0612-0605 $17.50+ .Sol0

Filip. Claus und Dippell 606

gen von Nahrsubstanzen aus der Luft Wachsturnssteige- rungen zustande kornrnen konnen (Geller, 1983).

Setzt man hurninstoffhaltigen Nahrrnedien eine leicht- verwertbare C-Quelle (z.B. Glucose) gezielt zu, so kornrnt ein verstarktes Mikrobenwachsturn zustande (Kontchou und Blondeau, 1990), das nicht irnrner rnit dern Abbau von Hurninstoffen einhergeht. Es ist bekannt, da13 Hurnin- stoffe das Mikrobenwachsturn auch indirekt beeinflussen konnen, indem sie den Bakterienstoffwechsel stirnulieren (Visser, 1985). Diese Wirkungen konnen rnit der Oberfla- chenaktivitat kolloidaler Hurninstoffe in Verbindung ste- hen, die eine Nahrstoffdiffusion durch die Zellrnernbran begunstigen konnen (Chen und Schnitzer, 1978; Tschapek et a]., 1981).

Eine Moglichkeit, den rnikrobiellen Abbau optisch zu verfolgen, kann die graduelle Entfarbung hurninstoffhalti- ger Nahrmedien bieten (Bhardwaj und Gaur, 1971; Khan- delwal und Gaur, 1980). Es wird ernpfohlen, Farbverande- rungen anhand der Lichtabsorption bei 350 nrn zu rnessen (Blondeau, 1989; Dari et a]. 1995). Bei etwaigern Farbver- gleich sol1 auf die Ubereinstirnrnung der pH-Werte geach- tet werden. Es ist auch zu beachten, daB eine Farbande- rung der Nahrlosung durch eine Adsorption der dunklen Hurninstoffe an die Mikrobenbiornasse zustande kom- men kann (Mishustin und Nikitin, 1961; Behmel, 1988; Dari et al., 1995). In solch einern Fall ist die Ablosung der adsorbierten Substanzen von der Biornasse durch Wasch- oder Extraktionsverfahren rnoglichst vollstandig durchzu- fuhren und eine darauffolgende Korrektur der gernesse- nen optischen Dichte vorzunehrnen. Ein zusatzliches Pro- blem kann dort auftreten, wo der Hurninstoffabbau durch die gleichzeitige Bildung dunkelgefarbter rnikrobieller Stoffwechselprodukte (Pigrnente) begleitet wird. In die- sern Fall ist die optische Beurteilung des Abbauprozesses nicht anzuwenden (Gordienko und Kunz, 1984).

Eine gravirnetrische Errnittlung rnikrobieller Abbaulei- stungen durch die quantitative Ruckgewinnung der Hu- rninstoffpraparate kann rnit ahnlichen Problernen behaftet sein. In der Regel sind die auf der Mikrobenbiornasse adsorbierten oder durch polyrnere rnikrobielle Stoffwech- selprodukte gebundenen Hurninstoffe nicht vollstandig freizusetzen (Dehorter et al., 1992). Auch kann der Anteil von irn Medium noch verbliebenen Hurninstoffen zu gering und sornit gravirnetrisch nur ungenau zu erfassen sein. Eine weitere rnethodische Vorgehensweise ist die Bestirnrnung der Mineralisierungsrate anhand der C0, - Freisetzung (Steinbrenner und Mundstock, 1975; Monib et al. 1981). Radioaktive Markierungen der Hurninstoffe bie- ten dabei die Moglichkeit einer besseren analytischen Erfassung. In Versuchen von Haider und Martin (1988) wurde hierzu ein Boden fur 6 Monate rnit ''C-rnarkiertern Stroh inkubiert; anschlieaend wurden Hurninstoffe extra- hiert. Bei diesen Verfahren ist allerdings sicherzustellen, daB die Hurninstoffe gleichrnaBig rnarkiert werden und nicht nur periphere, rnikrobiell leicht verwertbare Teile des kornplexen Molekuls durch die anschlieBenden 14C0,-

Messungen erfant und als Gesarntabbau interpretiert wer- den.

Nicht selten wird versucht, die analytischen Ungenauig- keiten dadurch zu urngehen, daB auf quantitative Aussa- gen vollig verzichtet wird und die Untersuchungen sich lediglich auf die Erfassung von qualitativen von Mikroor- ganisrnen bewirkten Veranderungen der Hurninstoffe beschranken. Zurn Einsatz kornrnen dann vor allern Ele- rnentaranalyse, Quantifizierung funktioneller Atorngrup- pen, Fraktionierung der Hurninstoffe nach dern Moleku- largewicht, sowie spektroskopische Charakterisierung durch UV-, VIS-, FTIR- und "C-NMR-Messungen (Dehor- ter et al., 1992; Gordienko und Kunz, 1984; Ramunni et al., 1987; Solntseva, 1994; Swift et al., 1987; u.a.). Auch bei sol- chen rnethodischen Ansatzen sollte allerdings bedacht werden, daB die zu untersuchenden Stoffgernische auch andere Bestandteile als nur die urspriinglich eingesetzten Substanzen enthalten konnen (z.B. rnikrobielle Zellbe- standteile und Stoffwechselprodukte).

Zusarnrnenfassend kann man feststellen, daB der Nach- weis des rnikrobiellen Abbaus von Hurninstoffen rnetho- disch recht schwierig zu erbringen ist. Es ist zu ernpfehlen, rnehrere Verfahren anzuwenden, urn aus den gewonnenen Indizien ein rnoglichst objektives Bild uber den mikrobiel- len Abbau der Hurninstoffe zu erhalten.

Humins toffab bau durch he tero trop he Bakterien und mikrobielle Mischkulturen

Eine der grundlegenden Arbeiten uber den rnikrobiellen Abbau von Bodenhurninstoffpraparaten wurde bereits in den 60er Jahren von Mishustin und Nikitin (1961) verof- fentlicht. Die Autoren benutzten eine waBrige Bodensu- spension als Inokulurn und stellten nach 3 Wochen einen Hurninstoffabbau von bis zu 52% fest. Aus den Mischkul- turen konnten unterschiedliche Bakterienstarnrne, insbe- sondere Pseudornonaden isoliert werden. Ein in Anwesen- heit zusatzlicher Nahrstoffe verfolgter Hurninstoffabbau wies eine positive Korrelation zur Aktivitat von Peroxida- sen irn Kulturrnediurn auf. Auch die von Bhardwaj und Gaur (1971) aus Boden isolierten Bakterien Bacillus subti- lis und Bacillus brevis waren lediglich in Anwesenheit einer leichtverwertbaren C-Quelle in der Lage, die Entfar- bung eines hurninstoffhaltigen Nahrrnediurns herbeizu- fuhren. Mathur und Paul (1967a) stellten die Fahigkeit, Hurninstoffe als alleinige C-Quellen zu verwerten, nicht nur bei Bacillus sp. und Pseudomonas sp. fest, sondern auch bei anderen typischen Bodenbakterien wie Agrobacte- rium sp. und Arthrobacter sp.

Tuyev und Emtsev (1984) untersuchten den Abbau eines auf 0,7% Aschegehalt gereinigten und fraktionierten Hurninstoffpraparats aus Podsol durch ein anaerobes pro- teolytisches Bakteriurn Clostridium sporogenum. Der anhand von strukturellen Veranderungen der Hurnin- stoffe verfolgte Abbau fand innerhalb der ersten 30 Tage

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statt; nach 60 Tagen kam er zum Erliegen. Der N-Gehalt des Huminstoffpraparats ging bis um 40% zuruck, offen- sichtlich durch die Abspaltung hydrolysierbarer Humin- stoffanteile. Eine Abnahme um bis zu 63 O/o wurde bei den COOH-Gruppen festgestellt; der Gehalt an OH-Gruppen blieb dagegen fast unverandert. Das C/H-Verhaltnis stieg leicht an; dies kann als ein Hinweis auf eine gewisse ,,Aro- matisierung" der Resthuminstoffe bewertet werden.

Cordienko und Kunz (1984) verwendeten in ihren Unter- suchungen Huminstoffe aus Torf, der zuvor mit Pflanzen- biomasse (Lupine) kompostiert wurde. Pseudomonasfluo- rescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas sp.. Bacil- lus mesentericus, Bacillus megaterium, Mycobacterium citreum und Actinomyces globisporus Cjeweils Bodeniso- late) waren einzeln und noch effektiver als Mischkulturen in der Lage, in huminstoffhaltigen Medien zu wachsen. Dabei wurde Stickstoff verwertet, der wahrscheinlich in Form von Peptiden in den Huminstoffen vorlag. IR-Spek- tren der Resthuminstoffe deuteten auf eine Neubildung organischer Substanzen, insbesondere in Kulturen mit Glucose-Zusatz wahrend des Abbauversuchs, hin.

Eine Neubildung von Fulvosauren und gleichzeitig auch die Entstehung einer unloslichen Huminstoff-Fraktion (Humin) haben Ramunni et al. (1987) in ihren Versuchen beobachtet. Die Autoren untersuchten den Abbau von Huminstoffen in einem wassrigen Bodenextrakt. Nach 12 Monaten unter aeroben Verhaltnissen (Dauerbeluftung) wurden 58 010 der zugegebenen Huminstoffe umgesetzt; bei Anaerobiose (N,-Begasung) waren es 35% und bei wechselnden Bedingungen aeroblanaerob 40%. Bei der Beliiftung der Kulturen stieg die Neubildung von Fulvo- sauren um mehr als das Zweifache im Vergleich zu anaero- ben Bedingungen an. Gleichzeitig nahm jedoch die hoch- molekulare Huminstoff-Fraktion (> 300.000 Dalton) unter aeroben Bedingungen ab.

Einen Ruckgang der hochmolekularen Fraktion von Huminstoffen und eine Zunahme des niedermolekularen Anteils wurde auch in Versuchen von Swift et al. (1987) ver- zeichnet. Die Autoren konnten drei Bakterienstamme aus einem Boden unter Dauerwiese und vier aus einem Wald- boden isolieren, die in der Lage waren, Bodenhuminstoffe als alleinige C- und N-Quellen zu nutzen. Fur weiterge- hende Experimente wurde Pseudomonas maltophilia be- nutzt. Die Koloniezahlen des Bakteriums stiegen in stati- schen Kulturen mit Huminstoffen bei 20°C von los auf lo8 in nur zwei Wochen an. Kontchou und Blondeau (1990) konnten in ihren Abbauexperimenten dagegen keine Ver- anderung in der Molekulargewichtsverteilung der Humin- stoffe nachweisen. Durch eine Mischkultur von Bodenmi- kroorganismen, die grampositive und gramnegative Bakte- rien enthielt (Bazillen, Pseudomonaden), kamen eine leichte Abnahme des Kohlenhydratanteils und uneinheit- liche Veranderungen des COOH-Gehaltes der Humin- stoffe zustande.

Munakov (1988) und Munakovet al. (1989,1990) fanden bei Huminstoff-Fraktionen, die einen hoheren Anteil von

oxidierten Strukturen enthielten, einen bis zu 45 Yoigen Abbau (gemessen als TOC), vorwiegend durch gramposi- tive und coryneforme Bakterien verursacht. In Versuchsan- satzen mit Huminstoffpraparaten, die reich an aromati- schen Strukturen waren, wuchsen vermehrt Nocardien und oligotrophe Bakterien. Die TOC-Abnahme lag hier lediglich bei 22%. Fur eine qualitative Beurteilung wird von den Autoren die Pyrolyse-Gaschromatographie emp- fohlen.

Solntseva (1994) konnte Stamme von Bacillus subtilis, B. megaterium, Flavobacterium rigense, Nocardia opaca und Pseudomonas alcaligenes aus Podsol isolieren, die in der Lage waren, Huminstoffe als die einzigen C- und N-Quel- len zu verwerten. In Schuttelkulturen bei 24°C bewirkte B. subtilis eine Abspaltung aliphatischer Strukturen durch Demethylierung der eingesetzten Huminstoffe. Die stark- ste Veranderung der elementaren Zusammensetzung der Huminstoffe wurde durch I;: rigense herbeigefuhrt; der C/H-Quotient stieg in den ersten 30 Tagen durch den Abbau von Aliphaten an. Danach wurden auch aromati- sche Huminstoflkomponenten hydrolytisch angegriffen. Auf die quantitative Erfassung des Huminstoffabbaus wurde bei diesen Untersuchungen allerdings verzichtet.

In Versuchen von Huttmann und Beyer (1996) waren 97 heterotrophe Bakterien- und Pilzisolate aus einem Podsol in der Lage, mit Fulvosauren, Huminsauren oder einem wassrigen Bodenextrakt als einzige C-Quelle zu wachsen. Die Autoren schlieI3en aus ihren Versuchen auf eine aktive Beteiligung der Mikroorganismen an Podsolisierungspro- zessen im Boden.

Huminstoffabbau durch Actinomyceten

Actinomyceten gehoren zu den myzelbildenden Boden- bakterien. Viele Vertreter der Gattung Streptomyces besit- Zen die Fahigkeit, huminstoffahnliche Substanzen zu bil- den und auch strukturell komplizierte organische Stoffe abzubauen (Kuster, 1955; Kutzner, 1968). Einige sind zum Abbau von Lignin befahigt (McCarthy, 1987; Zimmermann, 1990).

In Untersuchungen von Khandelwal und Gaur (1980) erwiesen sich 9 von insgesamt 21 untersuchten Streptomy- ceten-Stammen in der Lage, Huminstoffpraparate aus Stalldung als alleinige C-Quelle und in geringerem Aus- ma0 auch als gemeinsame C- und N-Quelle zu verwerten. Streptomyces candidus, Streptomyces garyphalus, Streptomy- ces rubescens, Streptomyces violaceoruber und Streptomyces viridochromogenes wurden identifiziert. S. candidus war am effektivsten. Wurden die Huminstoffpraparate einer Nahr- losung als zusatzliche Nahrstoffquellen zugesetzt, vermin- derte sich ihre Konzentration nach 40 Tagen um 44-48%. Praparate von Bodenhuminstoffen wurden hochstens zu 26% abgebaut. Monib et a]. (1981) untersuchten 28 Isolate von Streptomyceten auf ihre Fahigkeit hin, Huminstoffe abzubauen. Uber die Messungen der optischen Dichte von

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Kulturrnedien konnte nach 120 Tagen auf eine Abbaulei- stung zwischen 19-34% geschlossen werden. In Sandkul- turen rnit Hurninstoffpraparaten als einzige C-Quellen wurde anhand von C0,-Freisetzung eine Mineralisie- rungsrate von 11-21% errnittelt. Bis zu 66% der Gesarnt- rnenge an CO, wurden in den ersten drei Versuchstagen freigesetzt.

Auf halbfesten Agar-Medien rnit Hurninstoffen als einzi- gen C- und N-Quellen konnten Hayakawa und Nonomura (1987) eine Vielzahl von Boden-Actinornyceten der Gat- tungen Streptomyces, Micromonospora, Streptosporangium, Nocardia, Dactylosporangium, Microtetraspora und Thermo- monospora isolieren.

In einern uber 200 Tage dauernden Versuch wurde von Steinbrenner und Mundstock (1975) der Abbau verschiede- ner Hurninstof€Traktionen aus Schwarzerde unter der Ein- wirkung von Nokardien als Reinkulturen bzw. einer natiir- lichen Bodenpopulation verfolgt. Die Bestirnrnung der C0,-Freisetzung ergab, daD von den Hurninsauren etwa 10%,von den Fulvosauren 14% und von dern Hurninstoff- gesarntextrakt etwa 16% abgebaut wurden. Die Mischpo- pulation erwies sich dabei als etwas effektiver als die Rein- kultur von Nocardia erythropolis. Die Autoren karnen zu dern SchluD, daB Hurninstoffe selbst unter optirnalen Laborbedinungen gegenuber enzyrnatischen Angriffen von Mikroorganisrnen weitgehend resistent sind.

Kontchou und Blondeau (1992) fuhrten Untersuchungen zurn Abbau von Hurninstoffen aus Waldboden mit Strepto- myces viridosporus unter Zugabe von Nahrstoffen durch. Bei Zugabe von 0,25% Glucose konnten die Autoren nach 48 Stunden eine Entfarbung des Mediums urn ca. 60% feststellen. Davon gingen allerdings ca. 25% auf die Ad- sorption der Huminstoffe an Zellrnasse zuruck. Unter- schiede irn Molekulargewicht deuteten auf einen bevor- zugten Abbau des hochmolekularen Anteils der Hurnin- stoffe hin. Dari et al. (1995) konnten 15 Starnrne von Strep- tornyceten aus Boden isolieren, die die Fahigkeit besaDen, Huminstoffe zu entfarben. Die Abbauaktivitat war bei einer Dauerbegasung der Kulturen rnit 0, am hochsten (rnax. 47%). Der Abbau fand an der Zelloberflache statt und wurde durch die Hurninstoffadsorption (bis zu 28%) begleitet. Der Mechanisrnus des Hurninstoffabbaus wird weitgehend auf die enzyrnatische Aktivitat von Phenoloxi- dasen (Peroxidasen) zuruckgefuhrt.

In eigenen Modellversuchen wurde der Abbau von Hurninstoffpraparaten aus Grund- und FluBwasser (Fuhr- berg, St. Mary's River) durch einige Phenoloxidase-bil- dende Streptornyceten und Pilze untersucht. Nach 3 Wochen konnte in Streptornyceten-Kulturen, in denen Hurninstoffe als zusatzliche C- und N-Quellen vorlagen, eine Entfarbung beobachtet werden. Auch wurde die Bil- dung rnikrobieller Biornasse in den Versuchsansatzen gefdrdert (Abb. 1).

Aus der Menge der aus Kulturlosungen und Biornasse extrahierten Rest-Hurninsauren konnte man ableiten, dal3 Hurninsauren aus Grundwasser nur geringfugig abgebaut

wurden. Die FluD-Hurninsaure wurde durch zwei S. virido- sporus-Starnrne (Ligninperoxidase-Bildner) zu ca. 45 O/o

abgebaut. Auch rnit S. michiganensis (Tyrosinase-Bildner) wurde ein Abbau urn ca. 16% festgestellt. Bei S. euryther- mus war die Ausbeute an Hurninsauren am Versuchsende hoher als die eingesetzte Menge, was auf eine Neubildung von Huminstoffen hindeutete. Den spektroskopischen Daten (Tab. 1) kann man einen Ruckgang der Molekular- groBe und der arornatischen Anteile der Hurninsauren in den rnikrobiellen Kulturen entnehrnen.

Die Elernentar-Analysen belegten einen deutlichen Anstieg der N-Gehalte in den Rest-Huminsauren. Dies kann als ein indirekter Hinweis fur die Anwesenheit neu- gebildeter stickstoffreicher Stoffwechselprodukte angese- hen werden.

Dehorter et al. (1992) haben den Hurninstoffabbau durch Streptornyceten anhand von "C-NMR-Messungen ver- folgt. Es wurden keine wesentlichen Strukturveranderun- gen der Hurninstoffe festgestellt. Man kann sornit an-

S eurythermus0lL S mlchqonensisOl5 Svtridosporus 2L3 Sviridosponrs ATCC 39115

Abbildung 1: Bildung von Streptomyceten-Biomasse in Anwesenheit aquatischer Huminstoffe (HS) aus einem Grundwasser (Fuhrberg) und einem FluDwasser (St. Mary's River). Figure 1: Formation of streptomycetes-biomass in the presence of humic substances (HS) from a groundwater (Fuhrberg) and a river- water (St. Mary's River).

Tabelle 1: Spektroskopische Eigenschaften von Rest-Huminsauren aus Kulturen einiger Streptomyceten Table 1: Some spectroscopic properties of the residual humic acids from cultures of some streptomycetes

~~ ~~ ~~ ~ ~

Variante E4/E6 Aromatizitat Molekulargewicht (Oh)" (Dalton)')

Huminsaure aus Grundwasser S. eutythermus S. michiganensis S. viridosp. 243 Huminsaure aus St. Mary's River S. eutythemus S. michiganensis

S. viridosp. 243

6.39 6,74 6.46 6,20

5.31 4.50 4,90 4,70

48 29 18 22

32 18 17 11

3800 2300 1400 I700

2500 1400 1300 860

') Bestimmt anhand der molaren Absorption bei 280 nm (nach Chin

et al. 1994)

Abbau von Huminstoffen durch Mikroorganismen 609

nehmen, daB der Abbau an der Zelloberflache unspezi- fisch erfolgt und die jeweils abgespalteten Molekulbe- standteile direkt in die Mikrobenzellen aufgenommen werden.

Huminstoffabbau durch Pilze

Arbeiten, die sich rnit dem Abbau von Huminstoffen durch Pilze befassen, sind ebenfalls bereits aus den 60er Jahren bekannt. Hurst (1963) konnte in Versuchsansatzen rnit Polystrictus versicolor einen Abbau von COOH-Grup- pen und eine im Zusammenhang damit stehende Entfar- bung von Huminstoffen feststellen. Bei 29 Pilzisolaten wurde die Fahigkeit nachgewiesen m-Hydroxybenzoe- saure zu reduzieren und auch Huminstoffe zu entfarben. Daraus wurde auf einen reduktiven Mechanismus des Huminstoffabbaus geschlossen. Aus ihren Experimenten rnit Penicillium frequentans zogen Mathur und Paul (1967a) die SchluDfolgerung, daD nicht nur periphere N-haltige Teile der Huminstoffe mikrobiell verwertet werden, son- dern daD der Pilz die aromatischen Struktureinheiten sogar bevorzugt angreift. Eine Fraktionierung uber Sepha- dex-Saulen ergab, da13 alle Huminstomraktionen dem Abbau unterlagen, die Fraktion von > 50 000 Dalton jedoch am starksten. Weitere Untersuchungen von Mathur und Paul (1967b) ergaben, daB in Kulturen von P. frequen- tans Salicylalkohol als ein Abbauprodukt angereichert wurde. Der Pilz war nicht in der Lage, polycyklische Koh- lenwasserstoffe oder Trihydroxyphenole abzubauen, dafur aber verschiedene Spaltstucke von Lignin, aromatische Aminosauren und Glycoside. Die Vermutung lag nahe, daB solche Substanzen und ihre Kondensationsprodukte in dem Teil des Huminstoffmolekiils enthalten waren, der von P. frequentans angegriffen wurde. Als ein wichtiger Abbaumechanismus wurde die Spaltung von Ethergrup- pen in dem komplexen Huminstoffmolekul (Paul und Mafhur, 1967) angesehen.

Bhardwaj und Gaur( 1971) fanden bei Bodenisolaten von Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger und Aspergillus ory- zae die Fahigkeit, Huminstoffe in Gegenwart einer leicht- verwertbaren C-Quelle (Glucose) abzubauen. In Untersu- chungen von Khandelwal und Gaur (1980) wurden die als alleinige C-Quellen eingesetzten Huminsauren aus Stall- dung durch A . fumigatus, Fusarium solani und Penicillium roseo-purpureum entfarbt. Bodenhuminsauren wurden schlechter verwertet; auf Agarplatten rnit Huminstoffzu- satz erzeugte nur F: solani entfarbte Zonen. Mishra und Sri- vastava (1986) testeten 9 Pilzisolate (Zelluloseabbauer) auf ihre Fahigkeit hin, Bodenhuminstoffe abzubauen. Wurden die Huminstoffe als alleinige C-Quellen einge- setzt, so wurden rnit Aspergillus awamori, Humicola inso- lense und Penicillium sp. Abbauraten nach Entfarbung auf 25-30 O/o geschatzt.

Wie die Versuche von Ruocco und Barton (1978) zeigten, ist die Aufnahme von Huminsauren durch Mycelien von A . niger ein pH- und z.T. auch ein Energie-abhangiger Pro-

zess. Die Aufnahme war in Anwesenheit von Glucose am hochsten im sauren pH-Bereich (pH 3,O) und wurde durch Zugabe von Natriumazid oder 2,4-Dinitrophenol um ca. 62% reduziert. Nur 42% der aktiv aufgenommenen Hu- minstoffe waren durch alkalische Behandlung rnit 0,s N NaOH aus der Biomasse wieder extrahierbar, ein Hinweis auf eine kovalente Bindung und/oder Umwandlung der Huminsauren.

Ende der 80er Jahre wurden ligninabbauende Pilze (WeiBfaulepilze) verstarkt in die Versuche zum Abbau von Huminstoffen einbezogen. Phanerochaete chrysosporium konnte in Versuchen von Haider und Martin (1988) in nur 18 Tagen ca. 35% von I4C-markierten Huminstoffen mine- ralisieren. Der Abbau war von einer Entfarbung der Kul- turfliissigkeit begleitet.

In Versuchen, die Dehorter et al. (1992) rnit P. chrysospo- rium und Trametes versicolor an Praparaten von Bodenhu- minstoffen durchfihrten, konnte bereits nach 5-8 Tagen ein Abbau von ca. 30% festgestellt werden. Nach einer lan- geren Versuchsdauer wurden durch P. chrysosporium bis zu 60% der Huminstoffe mineralisiert. Die Gelfiltration der Reststoffe zeigte, darj der Abbau vor allem den hochmole- kularen Anteil betraf. Auch war den NMR-Spektren zu entnehmen, daB die theoretisch leichtabbaubaren Be- standteile wie Kohlenhydrate nicht in erster Linie ange- griffen wurden. Ein Abbau der Huminstoffe an der Zell- oberflache und eine anschlieBende Aufnahme der Abbau- produkte in das Pilzmyzel werden vermutet. Eventuell kann aber auch eine unspezifische extrazellulare Spaltung der Huminstoffmolekiile mittels freier Radikale erfolgen. In beiden Fallen konnte man die gleichzeitige Einbezie- hung von sowohl aliphatischen als auch aromatischen Strukturbausteinen der Huminstoffe in den AbbauprozeB vermuten.

In eigenen Laborversuchen wurden die bereits erwahn- ten aquatischen Huminstoffe als Modellsubstanzen einem Abbau durch einige ligninolytische Pilze unterworfen. Die Pilze waren in der Lage, Huminstoffe in unterschiedlicher Weise strukturell zu verandern und auch teilweise zu ver-

l o o ,

Cclod lP81 Pversicolor Postreatus Pchrys 1556 Pchrys6909

Abbildung 2: Ausbeuten (oh) an Rest-Huminsauren (HS) aus einigen Pilzkulturen. Figure 2: Yields (Oh) of residual humic acids (HS) isolated from some fungal cultures.

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werten. Die beobachteten Effekte traten vornehmlich auf, wenn Huminstoffe als zusatzliche C- und N-Quellen fur die Mikroorganismen vorlagen. Ein Isolat von Cladospo- rium cladosporioides (P8) erwies sich unter den spezifi- schen Kultivierungsbedingungen als besonders effektiv (Abb. 2).

Insbesondere wurden folgende Charakteristiken der Huminstoffe verandert: Elementare Zusammensetzung (leichte Abnahme von C, relative Zunahme von N, Zu- nahme von 0); Spektroskopische Eigenschaften (UV/ VIWFTIR); Abnahme des aromatischen Charakters (molare Adsorption bei 280 nm); Zunahme des aliphati- schen Anteils (Aminosauren, Kohlenhydrate).

Abbau von Huminstoffen durch Enzympriiparate

An dem Huminstoffabbau im Boden sind offensichtlich gleiche Enzymsysteme (Lignin-Peroxidasen, Mn-Peroxi- dasen, Laccasen) beteiligt wie am Ligninabbau (Tuor et al., 1995). So korrelierte die Entfarbung von Huminstoffen durch Streptomyceten mit dem Auftreten einer intrazellu- laren Peroxidase-Aktivitat (Dari et al. 1995).

Faison und Kirk (1985) stellten fest, daB durch Veratrylal- kohol, eine Substanz, die die Aktivitat der Ligninperoxi- dase steigert, auch der Huminstoffabbau durch Pilze gefor- dert wird. Eine durch Schutteln der Versuchsansatze besorgte Erhohung der 0,-Zufuhr sowie die Erhohung der N-Konzentration fuhrten zur Hemmung der Abbauaktivi- tat und auch der Ligninperoxidase-Aktivitat in der Pilzkul- tur. Dagegen erwies sich eine Zugabe von Glucose fur den Huminstoffabbau und die Enzymproduktion als forder- lich.

In Versuchen von Dehorter und Blondeau (1992) wurde die Produktion von Lignin-Peroxidasen und Mn-Peroxida- sen in Kulturen von P. chrysosporium und T versicolor durch Zugabe von Huminsauren signifikant gesteigert. Aus der beobachteten Verminderung des durchschnittli- chen Molekulargewichts der Huminstoffe, die auch in zell- freien Kulturfiltraten festzustellen war, wurde auf eine wesentliche Beteiligung dieser extrazellularen Enzyme an dem AbbauprozeB geschlossen.

Auch beim Abbau von kohleburtigen Huminstoffen zu niedermolekularen Fulvosaure-ahnlichen Verbindungen durch Nematoloma frowardii b19 wurden Lignin-Peroxida- sen, Mn-Peroxidasen und Laccasen nachgewiesen (Hof- richter und Fritsche, 1996, 1997a).

In unseren Versuchen mit Cladosporium cladosporioides konnte ebenfalls eine Dositive Korrelation zwischen lirrni-

Mn-Peroxidasen (Dehorter und Blondeau, 1992; Hofrichter und Fritsche, 1997b) an der Depolymerisation von Humin- stoffen aufgezeigt. Da Phenoloxidasen in ihren aktiven Wirkungszentren Metalle enthalten (Fe, Cu, Mn), sind sie in ihrer Aktivitat von einer ausreichenden Kationenkon- zentration im Medium abhangig. Bei der Oxidation von Mn2+ durch Mn-Peroxidasen oder Laccasen konnen hier- bei reaktive Mn-Oxide entstehen. Wie die Versuche von Sunda und Kieber( 1994) zeigen, konnen solche Mn-Oxide, die von zahlreichen Mikroorganismen gebildet und auf ihrer Oberflache abgelagert werden, einen partiellen Abbau von Huminstoffen unter Entstehung mikrobiell leicht verwertbarer organischer Substrate (Pyruvat, Ace- ton, Acetaldehyd, Formaldehyd) bewirken.

Der enzymatische Abbau aliphatischer Seitenketten von Huminstoffen (Aminosauren) ist in vitro ebenfalls mog- lich (Jahnel et al., 1993). Im Kulturfiltrat von C. cladospo- rioides wurden in eigenen Experimenten hydrolytische Enzymaktivitaten (Arylesterasen) nachgewiesen.

SchluDfolgerungen

Man kann feststellen, dal3 eine Vielzahl von Bodenbakte- rien (einschliefllich Actinomyceten) und Pilzen Humin- stoffe angreifen konnen. Mischpopulationen konnen besonders effektiv sein, da sie uber einen vielseitigen Enzymapparat verfugen und seinen sukzessiven Einsatz auch ermoglichen. Auf diese Weise konnten die heteroge- nen und komplex miteinander verbundenen Strukturein- heiten von Huminstoffmolekulen wirksam umgesetzt wer- den. Insbesondere unter Bodenbedingungen sollte man davon ausgehen, daI3 der Huminstoffabbau weniger durch Einzelspezies, und vielmehr durch die komplexe Boden- mikroflora herbeigefuhrt wird.

Der Abbaumechanismus bedarf weiterer klarender Untersuchungen. Die Beteiligung von Lignindestruenten, obwohl im Labor sehr effektiv, erscheint okologisch eher fraglich. So benotigen einige der am Abbau partizipieren- den Enzyme (Peroxidasen) fur ihre optimale Aktivitat pH-Werte, die meistens deutlich unter den ublicherweise im Boden menbaren liegen. Dennoch wurden Phenoloxi- dase-Aktivitaten in Boden wiederholt nachgewiesen (Filip und Preusse, 1985; Filip und Claus, 1995). In einem okolo- gisch orientierten Zugang zur Problematik des mikrobiel- len Abbaus von Huminstoffen sollten kunftig verstarkt naturliche standortspezifische und moglichst gut charakte- risierte mikrobielle Mischpopulationen berucksichtigt werden, die sowohl Pilze als auch Bakterien einschlie- - IJen. nolytischer Aktivitat, Laccase-Aktivitat und Huminstoff-

abbau aufgezeigt werden (Claus und Filip, 1998). Auch

Danksagung beim Huminstoff-abbauenden Bakterium Bacillus sphaeri- cus konnten wir die Laccase-Aktivitat nachweisen (Claus et al., 1996; CIaus und Filip, 1997).

In wenigen in vitro Studien wurde die Beteiligung VOn Laccasen ( f i n e et al. 1988; CIaus und Filip, 1998) und

Die hier envahnten eigenen Arbeiten wurden rnit Forderrnitteln der Deurschen F o r ~ c h u n g ~ g e ~ e i n s c ~ a ~ t (DFG) irn Rahrnen des Schwerpunkt- prograrnrns ,ROSIG" unterstiitzt.

Abbau von Huminstoffen durch Mikroorganismen 61 1

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