Update Onkologie

PathologieMolekularpathologie

Aktuelles – Ausblicke 2017

Dr. Petra BesuchInstitut für Pathologie am

Onkologische Diagnostik

Molekularpathologie

Klinische Befunde

Immunhistochemie

Morphologie

Labor

Bildgebung

1. Bedeutung der „liquid Biopsie“ (ctDNA) bei Progression von pulmobronchalen Adenokarzinomen unter TKI‐Therapie

Häufigkeit  genetischer Alterationen /Mutationsprofile bei ALK und EGFR TKI‐Resistenz

Probengewinnung für EGFR T790M Mutationsanalytik:

prinzipiell auf drei Arten möglich

2. Biopsie am Tumorgewebe

BevorzugterProbentyp bei

NSCLC Mutationsanalytik1–

3

BevorzugterProbentyp bei

NSCLC Mutationsanalytik1–

3

3. Zytologie

Probenqualität und Tumorzellgehalt oft geringer als bei

Gewebebiopsien4–8

1. Isolation von zellfreier Tumor‐DNA (ctDNA) aus

Blut

Neues Verfahren

1. Pirker R, et al. J Thorac Oncol. 2010;5:1706–13; 2. Marchetti A, Normanno N. Patholgica 2010;102:119–22; 3. Eberhard D, et al. J Clin Oncol. 2008;26:983–94; 4. Kimura H, et al. Br J Cancer 2006;95:1390–5; 5. Oshita F, et al. Br J Cancer 2006;95:1070–5; 6. Smouse J, et al. Cancer Cytopathol. 2009;117:67–72; 7. Van Eijk R, et al. PLoS One 2011;6:e17791; 8. Rekhtman N, et al. J Thorac Oncol. 2011;6:451–8.

Gewebeanalytik als Voraussetzung der Molekularpathologie

• Kritische Materialmenge• Kritischer Tumoranteil• Mikrodissektion

Tumor

normales Gewebe

Entstehung von ctDNA bzw. cfDNA• cfDNA = circulating free DNA• ctDNA = circulating tumor DNA

Modifiziert nach Crowley et al, Nature Reviews Clinical Oncology 10, 472‐484; 2013

Zirkulierende Tumor DNA (ctDNA)

• ctDNA = Tumor‐DNA, die in den Blutstom abgegebenwurde.

• ctDNA kann 0.01% ‐ > 90% der gesamten zellfreien DNA (cfDNA) ausmachen.

• Die Menge an ctDNA istabhängig von der Tumorlast / variiert zwischen Patientenmit verschiedenen klinischenTumorstadien→ geringe Tumorlast: falsch negativ

Diaz and Bardelli, 2014 Journal of Clincial Oncology 32

Probleme der ctDNA‐Analytik • Aufgrund der instabilen Natur der ctDNA muss die Blutprobe korrekt

entnommen und verarbeitet werden.

• Nur 10(‐30)ng cfDNA pro 4 (‐5)ml Plasma extrahierbar. 

• Die Menge an ctDNA is abhängig von der Tumorlast und variiert individuell.

• Schwierigkeit, ctDNA von normaler cfDNA zu unterscheiden

• Die verwendete Technik muss sensitive genug sein, geringe Konzentrationengenetischer Varianten zu erkennen.

Diaz and Bardelli, 2014 Journal of Clincial Oncology 32

FFPE versus ctDNAFFPE ‐ Proben

• Aus tumorhaltigen Biopsien/Resektatenextrahierte Tumor‐ DNA

• Fixierungsbedingte Probleme mit der DNA‐Qualität

• Gemisch aus normaler und tumoröser DNA • Zeitaufwand bei der histopathologischen

Vorbereitung• Makro‐/Mikrodissektion für größtmögliche

Tumorzellausbeute erforderlich• Für einige Patienten sind keine Tumorproben

verfügbar• Die Probe repräsentiert den Tumor zu einem

festen Zeitpunkt.

ctDNA ‐ Proben

• ctDNA stammt direkt aus dem Tumor• Gewinnbar aus der Plasmakomponente von 

Vollblut• Große Fragmentgrößen sind möglich• Es werden kleine Mengen extrahiert:

~ 30ng/ 5ml Plasma• Separation innerhalb weniger Stunden nach

Erhalt der Blutprobe• Serielle Proben können während der Behandlung

zu verschiedenen Zeitpunkten entnommenwerden. 

Analytik von Resistenzmutationen mittels ctDNA

Vorteile• weniger invasiv• unabhängig von der Heterogenität des Tumors

• mehrfache Probenentnahmen möglich

Nachteile• z.Zt. weniger sensitiv als Analyse an Tumorbiopsie

• nicht alle Tumoren geben DNA ins Blut ab

• noch nicht in der klinischen Routine etabliert (erste Ringversuche für T790M)

2. Immunonkologie

Chen and Mellman, 2013

Tumor

Lymphknoten

Blutgefäß

Freisetzung von Krebszellantigenen

(Krebszelltod)ChemotherapieStrahlentherapie

Zielgerichtete Therapie(BRAFi oder MEKi)

Priming und Aktivierung

(APCs und T-Zellen)Anti‐PDL1Anti‐PD1

Anti‐CTLA‐4

3

Erkennung von Krebszellen durch

T-Zellen (CTLs, Krebszellen)

6

Infiltration von T-Zellen in Tumoren

(CTLs, Endothelzellen)Anti‐VEG

5

Abtötung von Krebszellen(Immun- und Krebszellen)

Anti‐PDL1Anti‐PD1

Anti‐CSF‐1R

71

Präsentation von Krebszellantigenen

(dendritische Zellen/APCs)

VakzineIFN‐α

2

APC: Antigenpräsentierende Zelle; CTL: Zytotoxische T‐Zelle

Erkennung, Angriff und Zerstörung von Krebszellen

durch das Immunsystem ist einmehrstufiger Prozess

Trafficking von T-Zellenzu Tumoren

4

Krebs‐Immunzell‐Zyklus

PD‐L1‐Expression im Tumor‐Mikromilieu kann die antitumorale T‐Zell‐Aktivität inhibieren

1. Merelli, et al. 2014; 2. Pardoll 2012; 3. Powderly et al. ASCO 201312

TCRMHC

PD‐L1Makrophage

PD‐1

T‐ZelleT‐ZelleT‐Zelle

TCRMHC

Tumor‐zelle

PD‐L1 PD‐1

T‐ZelleT‐ZelleT‐Zelle

Inaktive T‐ZelleAktive T‐Zelle

TCRMHC

Tumor‐zelle

Co-Stimulator

T‐ZelleT‐ZelleT‐Zelle

Granzyme

Perforine

ApoptotischeTumorzelle

Die T-Zell-Aktivität kann blockiert werden durch:• PD-L1-Expression von Tumorzellen und/oder• PD-L1-Expression von Tumor-infiltrierenden

Immunzellen

PD‐L1 („programmed cell death‐ligant 1“)/PD‐1 („programmed cell death protein 1“)

Verschiedene Zellen können PD‐L1 exprimieren

PD‐L1

Makrophage

PD‐L1

Tumorzelle

PD‐L1

T‐Zelle

PD‐L1

DC

Potenzielle Zielzellen für antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) 

Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Basic immunology: Functions and disorders of the immune system. 4th edition; 2012

Chen DS, et al. Clin Cancer Res 2012;18:6580–7

Herbst RS, et al. ASCO 2013

*PD-L1+ ist definiert als Patienten mit ≥ 5 % tumorinfiltrierenden Immunzellen, die positiv für PD-L1 sind‡Chirurgische Tumorproben; §PD-L1-positiv ist definiert als Patienten mit ≥ 5 % tumorinfiltrierenden Immunzellen, die positiv für PD-L1 sind

1. Kohrt, et al. 2013; 2. Roche/Genentech-Daten; 3. Herbst, et al. 2014; 4. Powles, et al. ASCO 2014

PD-L1+ Tumorzellen (Melanom)1

PD-L1+ Immunzellen (NSCLC)1

Prävalenz von PD-L11–3

TumortypNichtklinische

Studie1,2*‡

(Immunzelle), Ť

Phase-I-Studie3

Immunzelle* Tumorzelle‡

NSCLC 45 % 26 % 24 %

RCC 20 % 25 % 10 %

Melanom 40 % 36 % 5 %

Harnblase4 - 27 % 11 %

HNSCC 33 % 28 % 19 %

Magenkarzinom - 18 % 5 %

CRC 45 % 35 % 1 %

Pankreaskarzinom - 12 % 4 %

Mammakarzinom - 27% 12%

PD‐L1 als Zielstruktur (von Anti‐PDL1‐ Therapeutika) wird von vielen Tumorzellen und tumorinfiltrierenden Immunzellen exprimiert

PD‐L1‐Färbemuster /Intensität

Scheel AH et al, Oncoimmunology 2016. 5(5):e1131379

Alle Intensität scoren (≠Her2/neu)  Tumorzellen können

schwach gefärbt sein ("1+")

Prädiktive PD‐L1‐ Immunhistochemie beim nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom

Qualitative Färbemuster, 4 Antikörper              PD‐L1‐ IHC Assays in klinischen Studien

PD‐L1‐ Prävalenz in Phase‐II/III‐NSCLLC‐Studien

Scheel A.H. et al.Pathologe 2016,37: 557‐567

3. Tumor‐ infiltrierenden Lymphozyten (TIL) bei Brustkrebs ‐ein neuer Marker für die Routine‐Pathologie ?

“The clinical relevance of T‐cells in the control of …human cancers is now beyond doubt.” Schumacher & Schreiber, Science 2015 

Stromale TILMuster Tumor‐infiltrierender Lymphozyten

Lymphozyten‐prädominanter Brustkrebs (LPBC) „mehr Lymphozyten als Tumorzellen“ (≥60% TIL) 

intratumorale TIL – in direktem Kontakt mit Tumorzellen

Stromale TIL‐ zwischen Tumorzellen

Auswertung von Tumor‐infiltrierenden Lymphozyten (TIL) in Mammakarzinomen: Empfehlungen einer Internationalen TIL 

Arbeitsgruppe 2014

Salgado, Denkert et al., Annals of oncology, 2015

TIL – klinische RelevanzTIL‐ prädiktiv für das Ansprechen auf neoadjuvante Chemotherapien

TIL korrelieren in der GeparSixto‐Studie mit einem hohen Ansprechen auf eine neoadjuvante Chemotherapie (pCR)

TIL sind assoziiert mit einem Ansprechen auf neoadjuvante Chemotherapie (GeparTrio, n=814)

Denkert et al. JCO 2015

TIL beim Mammakarzinom

Bestimmung der stromalen TIL am HE‐Schnitt Bislang kein definierter Schwellenwert, z. Zt. > 50‐60 % TIL Deskriptive Angabe „lymphozyten‐prädominantes 

Mammakarzinom“ ↑TIL haben einen prognos schen Wert: → assoziiert mit guter 

Prognose in Triple‐negativen‐ und HER2+ Karzinomen ↑TIL sind prädik ve Marker: → pCT↑ nach neoadjuvanter→ 

Therapie→ besseres Ansprechen auf Anti‐

HER2‐Therapie (Trastuzumab)               Auswertung am HE‐ Schnitt reicht, immunhistochemische 

Phänotypisierung z.Zt. nicht erforderlich, immunologische Gensignaturen nicht überlegen

TIL – Biomarker ?

4. Bedeutung der pathologischen Komplettremission (pCR)

Einfluß residuales DCIS

pCR ist ein starker Prädiktor des Krankheitsverlaufs nach neoadjuvanter Chemotherapie

Bear et al. JCO 24, 2019–2027, 2005

DFS OS

Mazouni et al. JCO 25(19), 2650–2655, 2007

Nahezu komplette pathologische Remission

Histologische Befunde nach neoadjuvanter Chemotherapie

Heterogenes Ansprechen der intraduktalen             disseminierte und intraduktale residuale(DCIS‐) Komponente                                                      Zumorzellen 

Ck8/18

Signifikanz des N‐Status nach neoadjuvanterChemotherapie (NCT)

Schneeweiss et al. Anticancer Drugs 15(2), 127–135 (2004)

Nodalstatus nach neoadj. Chemotherapie      Tumorgröße nach neoadj. Chemotherapie

Der N‐Status nach NCT scheint  für das Überleben signifikanter als diepCR des Primärtumors in der Brust zu sein

Lymphknoten

Ck8/18

Wie soll eine pathologische Remission definiert sein?

N‐Status bei pCRBei pCR ist der Nodalstatus für das Überleben hoch signifikant.

Bear et al. JCO 24, 2019–2027, 2005 

pCR sollte definiert werdenals komplette Abwesenheit von Tumorzellen sowohl in der Brust als auch in den LK(totale pcR / tpCR) 

Tumorregression nach neoadjuvanter Chemotherapie (NCT)

http://www.mdanderson.org/breastcancer_RCB 

Residual Cancer burden score – Symmans (2006, 2007)

Muster des Therapieansprechens

Restitutio ad integrummultifokal                                      hypozellulär                                     geschrumpft 

Tumorbett

Zellularität

„Knackpunkt: nicht nur in „hotspots“, systematische Schätzung der Zellularität als Näherung

auch im Vergleich zur prätherapeutischen Stanze!

Klassifikation des Ansprechens nach NCT

Residual Cancer burden score – Symmans (2006, 2007)

Tumorbett: Größe                                 Zellularität                           Lk‐Met: Anzahl/ Durchmesser

http://www.mdanderson.org/breastcancer_RCB

Empfehlungen der AGO

5. Neue Tumorentitäten der WHO‐Klassifikation von 2016

Molekulare Daten und klinisch‐pathologische Studien des vergangenen Jahrzehnts haben die Kenntnis über Morphologie und biologisches Verhalten der Nierentumoren erweitert, sodass neue Tumorentitäten von der WHO anerkannt wurden:

• hereditäre‐Leiomyomatosis‐ und Nierenzellkarzinom (HLRCC)‐assoziiertes Nierenzellkarzinom

• Succinat‐Dehydrogenase(SDH)‐defizientes Nierenzellkarzinom

• tubulozystisches Nierenzellkarzinom 

• Nierenzellkarzinom der erworbenen Zystenniere 

• klarzellig‐papilläres Nierenzellkarzinom

HLRCC‐assoziiertes Nierenzellkarzinom Variante des papillären NZK, Typ 2 Autosomal‐ dominante Erkrankung ← Keimbahnmuta on des  

Fumarathydratase‐Gens (auf 1q42.3‐q43): kutane/uterine Leiomyome und in  20% NZK

Papilläres, solides, tubuläres Wachstumsmuster, diffus infiltratives Wachstumsmuster

Charakteristische Morphologie: große Zellkerne, sehr prominente Nukleolen mit perinukleärem Halo

Klinisch aggressiv, schlechtere Prognose (als andere NZK), oft frühe lymphogene/ hämatogene Metastasierung

Manifestationsalter: LM Uterus: 30 J LM Haut 35.45 J., NZK: 46 Jahre

IHC: Verlust der Expression von FH Punktmutationen od. Deletionen/

Insertionen im FH‐Gen → Fumarat→] Malat (Krebs‐Zyklus) Induktion Glykolyse,Aktivierung von 

HIF

Fumarathydratase: ‐ Leiomyom, Uterus

6. Neues zu GIST

Mutationen bei den anderen („wild type“) GIST:

BRAF‐Mutationen (1‐2%) NF1‐assoziiert (< 1%) SDH‐defizient (~5%)

Übliche Mutationen bei GIST

Succinat‐Dehydrogenase Komplex

Bardella et al. Bioch Biophys Acta 2011                                                                                       Ricketts et al.J Urol 2012

Metastasen von gastralen GIST bei Einteilung nach üblichen Risikogruppen

Risikogruppe(Miettinen)

GIST, „üblich“ SDH‐defizienter GIST

kein 0% 33% (!)

Sehr gering 2% 67%

gering 3,5% 60%

mittelgradig 12 – 16% 71%

hoch 55 – 86% 82%

Imatinib wirkt nicht bei SDH‐defizienten GIST

Multinoduläre Architektur bei GIST ‐ hochgradig assoziiert mit SDH‐ Defizienz

Sensitivität 99%

Spezifität 99%

Doyle et al. Histopathology 2012

Magenwand

Charakteristika von SDH‐defizienten GIST 

c‐kit

SDHB

Hornick et al., Modern Pathology (2014) 27: 47‐ 63

Lokalisation im Magen Multinodulär und plexiform Epitheloid >> gemischte  Nicht so selten (~8% der gastralen 

GIST) Meist bei Kindern und jungen 

Erwachsenen Mutationen in jedem SDHx Gen 

außer SDHAF2, ~30% SDHA→ Verlust der Protein‐Expression

IHC für SDHB: Expressionsverlustunabhängig vom mutierten Gen(Screening für “SDH‐defiziente GIST”)

sonst gleicher immunhisto‐chemischer Phänotyp wiekonventionelle GIST(CD117 +, DOG1+, CD34 +)

Merkmale SDH‐defiziente GIST GIST mit intakter SDH

bevorzugtes Alter Kinder, junge Erwachsene ältere Erwachsene

Geschlechtsverteilung F >> M F = M

Anatomische Lokalisation Magen Gesamter GI‐Trakt

Multifokalität häufig selten

Multinodulärer Aufbau fast immer selten

Zytomorphologie Epitheloid/ gemischt spindelzellig >> epitheloid

Prognosevorhersage möglich nach Lokalisation, Größe und Mitoserate

nein ja

LK‐Metastasen häufig ungewöhnlich

Klinisches Verhalten von Metastasen indolent aggressiv

Sensitiv für Imatinib nein in den meisten Fällen

KIT/PDGFRA Mutationen keine ~ 95%

SDHx Mutationen (Keimbahn) ~ 50% keine

Assoziierte Syndrome Carney‐ Syndrom NF1, familiäre GIST

7. Neue Auflage der TNM‐Klassifikation‐seit 1.1.2017 in Kraft!

Neue Klassifikationen für: Thymus Niedriggradige muzinöse Neoplasien der Appendix Kutane Lymphome / multiple Myelome

Änderungen: Kopf‐Hals‐Tumoren (Stadiengruppierung für HPV‐

assoziierte Oropharynx‐Ca Tumoren ösophago‐gastraler Übergang:  

Klassifikation wie Magen‐Ca Neue Klassifikationskriterien für Tumoren:

‐ Leber, intrahepat. Gallengänge, Gallenblase, Ampulle‐ Pankreas: für pT1‐3 nur noch Größe relevant‐ Anzahl regionaler Lks

Geringe Ergänzungen/ Verfeinerungen:‐ Lunge, Knochen, Weichgewebe, Haut, Gyn, Uro

Neu: „Essentielle Prognosefaktoren“ für:

Tumoren von Kolon/Rektum, Mamma, Melanom,  Prostata

For every problem there is a solution that is simple, fast and false.