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5 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information

Der Bauplan des Menschen ist in jeder Körperzelle als DNA gespeichert. Jeder Zelltyp hat aber sein spe-zifisches Expressionsmuster für RNAs und Proteine, welches durch Hormone, Zytokine oder Umweltbe-dingungen beeinflusst werden kann. Das Dogma der Molekularbiologie bedeutet: DNA besitzt die Fähigkeit zur identischen Selbster-neuerung (Replikation). Die in der DNA gespeicherte genetische Information wird auf RNA übertragen (Transkription). Die in der RNA enthaltene genetische Information wird in eine Aminosäuresequenz über-setzt (Translation). Die in einer Aminosäuresequenz enthaltene Information kann nicht auf Nucleinsäuren rückübertragen werden. Jedoch kann an RNA (z. B.

Viren) eine DNA synthetisiert werden (reverse Trans-kription). Replikation, Transkription und Translation beste-hen aus den Schritten Initiation, Elongation und Ter-mination. Für die Expression spezifischer Gene durch Trans-kription und Translation besteht die Möglichkeit einer Steigerung oder Drosselung der Genaktivität. Solche Regulationen sind die Induktion und Repression. Induk-toren führen über eine Steigerung der Genaktivität zu einer vermehrten Synthese eines oder mehrerer Pro-teine (Enzyme). Repressoren unterdrücken die Genakti-vität und verursachen dadurch eine Hemmung der Pro-teinsynthese.

Kapitel 5 · Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information80

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5.1 Nucleotide

Purin- und Pyrimidinnucleotide sind Bausteine der Nucleinsäuren und von Coenzymen. Ihre Biosynthese geht von einfachen Molekülen aus. Freie Purinbasen können im Stoffwechsel wiederverwertet werden, Pyri-midinbasen nicht. Ein Abbau des Purinskeletts ist nicht möglich. Es erfolgt lediglich ein Umbau zu Harnsäure. Pyrimidine werden vollständig abgebaut.

5.1.1 Synthese

Synthese der PurinnucleotideDie Synthese der Purinnucleotide startet mit der Be-reitstellung einer besonders aktivierten Ribose Phos-phoribosylpyrophosphat (PRPP), bei der die glyco-sidische OH-Gruppe durch Pyrophosphat aktiviert wird:

Ribose-5-Phosphat+ATP→5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat+AMP

Im nächsten Reaktionsschritt wird auf die aktivierte Ribose die Säureamidgruppe des Glutamins unter Bil-dung von Phosphoribosylamin und Pyrophosphat übertragen. Das Schlüsselenzym der Purinsynthese ist die Phosphoribosylamidotransferase:

PRPP+Glutamin→Phosphoribosylamin+Glutamat+PPa

Die weiteren Schritte vollziehen sich wie in . Abbil-dung 5.1 angegeben.

Die Anlagerung des N1 aus der α-Aminogruppe des Aspartats ähnelt der Einführung des zweiten N-Atoms bei der Harnstoffsynthese. Das C-Skelett des Aspartats wird als Fumarat zurückgewonnen.

Das erste Purinnucleotid ist die Inosinsäure (IMP; Purinbase Hypoxanthin). Durch Anlagerung der Ami-nogruppe des Aspartats an das C6 entsteht Adenosin-monophosphat (AMP). Dabei geht das C-Skelett des Aspartats wiederum als Fumarat aus der Reaktion her-vor. Für diese Reaktion wird GTP als Energiedonator benötigt.

Zur Bildung von Guanosinmonophosphat wird die Inosinmonophosphat am C2 unter Bildung von Xanthosinmonophosphat oxidiert (XMP, Base Xan-thin), ehe die Anlagerung einer Aminogruppe aus dem Glutamin unter Verbrauch von ATP erfolgen kann.

Die gebildeten Monophosphate werden unter Ver-brauch von ATP zu den Triphosphaten phosphoryliert. ATP entsteht aus ADP und Pa in der Atmungsketten-phosphorylierung.

Die Synthese der Purinnucleotide ist energieauf-wändig:4 Synthese von IMP = 4 ATP;4 Synthese von AMP = 4 ATP und 1 GTP zur Akti-

vierung von Aspartat;4 Synthese von GMP = 5 ATP.

Die Synthese der Purinnucleotide erfolgt in 3 Multi-enzymkomplexen. Lediglich die Synthese des Phospho-ribosylamins und von Adenylsuccinat (Anlagerung von Aspartat an IMP) werden durch Einzelenzyme kataly-siert.

Die Regulation der Phosphoribosyl-Amidotrans-ferase-Aktivität ist ein Beispiel für die Steuerung von Stoffwechselprozessen nach dem Prinzip der negativen Rückkopplung.

Inhibitoren der Transferase sind die Endprodukte der Reaktionskette IMP, AMP, GMP; Aktivator ist PRPP. Weitere Regulationen bestehen in der Hemmung der Oxidation von IMP zu XMP durch GMP und der Hemmung der AMP-Bildung durch IMP. Eine hohe intrazelluläre GTP-Konzentration begünstigt die Bil-dung von AMP, eine hohe ATP-Konzentration fördert die Bildung von GMP.

Synthese der PyrimidinnucleotideIm Gegensatz zur Synthese der Purinnucleotide wird bei den Pyrimidinnucleotiden zunächst der Ring synthe ti-siert, der dann auf PRPP übertragen wird (. Abb. 5.2).

Die Biosynthese beginnt mit der Bereitstellung von Carbamoylphosphat im Zytoplasma durch die Carba-moylphosphatsynthetase II. Die Unterschiede zur mito-chondrialen Carbamoylsynthetase I zeigt die . Ta-belle 5.1.

Carbamoylphosphat wird durch die Aspartattrans-carbamoylase auf Aspartat unter Bildung von Carba-moylaspartat übertragen. Unter Wasserabspaltung

C6C5

C8C4C2

N1

N3N9

Ribose

Phosphat

N7

5

62 2

24

3

17

. Abb. 5.1. Syntheseschritte bei der Bildung von Purin-nucleotiden

5.1 · Nucleotide581

kommt es zum Ringschluss unter Bildung von Dihy-droorotsäure. Diese wird zu Orotsäure dehydriert und auf PRPP unter Bildung von Orotidinmonophosphat übertragen. Durch Decarboxylierung entsteht Uridin-monophosphat (UMP). Dieses wird unter ATP-Ver-brauch zum UTP phosphoryliert.

UTP wird durch die Säureamidgruppe des Gluta-mins zu Cytidintriphosphat (CTP) aminiert.

Lediglich die Dihydroorotatdehydrogenase ist ein Einzelenzym. Die übrigen bilden 2 Multienzymkom-plexe. Der Energieaufwand beträgt für die Synthese von UMP 3 ATP und für CTP ohne Berücksichtigung der UTP-Bildung 4 ATP.

Die Regulation ist ein Beispiel für negative Rück-kopplung. UTP inhibiert die Carbamoylphosphatsyn-thetase II. Die Orotidinmonophosphatdecarboxylase wird durch UMP und CMP allosterisch gehemmt.

Phosphoribosylpyrophosphat ist ein allosterischer Aktivator der Carbamoylphosphatsynthetase II.

Synthese von DesoxyribonuleotidenDie Umwandlung der Ribonucleotide in Desoxyribo-nucleotide für die DNA-Replikation wird durch die Ribonucleotidreduktase katalysiert. Substrate des En-zyms sind die Ribonucleotiddiphosphate, in denen unter Verbrauch von NADPH2 Ribose zu Desoxyribose reduziert wird (. Abb. 5.3):

Ribonucleotid-Diphosphat+NADPH2→Desoxyribonucleotiddiphosphat+NADP++H2O

Die aktive Reduktase enthält 2 SH-Gruppen, welche für die Umwandlung der Ribo- in Desoxyribonucleotide verantwortlich sind. Dabei entsteht eine Disulfidbrücke. Das Enzym ist inaktiv. NADPH2 wird zur Reduktion des Disulfids und Reaktivierung des Enzyms verwen-det. Die Reaktion läuft wie folgt ab:4 NADPH2 reduziert FAD zu FADH2,4 FADH2 reduziert eine Disulfidbrücke in dem klei-

nen Protein Thioredoxin,4 reduziertes Thioredoxin reduziert das Disulfid in

der Reduktase und geht dabei in den oxidierten Zu-stand über (Disulfid).

Die Desoxyribonucleotiddiphosphate werden unter ATP-Verbrauch zu den Triphosphaten phosphoryliert.

Die Bildung von ThyminnucleotidenDNA enthält anstelle von Uracil Thymin. Uracil wird durch die Thymidylatsynthase in Thymin überführt.

. Tab. 5.1. Unterschiede zwischen Carbamoylsynthetase I und Carbamoylsynthetase II

Carbamoylsynthetase I Carbamoylsynthetase II

Stoffwechselweg Harnstoffzyklus Pyrimidinnucleotidsynthese

Stickstoffdonator NH4+-Ionen Säureamidgruppe des Glutamins

Aktivator N-Acetylglutamat keiner

C6C5

C4C2

N1

N3

Ribose

Phosphat

. Abb. 5.2. Syntheseschritte bei der Bildung von Pyrimidin-nucleotiden

. Abb. 5.3. Die Bildung von Desoxyribonucleotiden (aus Löffler 2005)


5

Merke

Ausgangsverbindung ist dUMP, das mittels Methy-len-FH4 zu dTMP methyliert wird. Die Methylen-gruppe –CH2– muss zur Methylgruppe –CH3 reduziert werden. Das geschieht durch die Tetrahydrofolsäure, die dabei in Dihydrofolsäure übergeht. Der fehlende Wasserstoff wird dem Tetrahydrofolat entnommen (. Abb. 5.4):

dUMP+N5,N10-Methylen-Tetrahydrofolat→dTMP+7,8-Dihydrofolat

Diese Methylierung ist unabhängig von S-Ade-nosyl-Methionin!

Die Dihydrofolatreduktase überführt unter NADPH2-Verbrauch Dihydrofolat wieder in Tetrahydrofolat.

KLINIKHemmstoffe der Purin- und Pyrimidinnucleotid-syntheseDie folgenden Verbindungen finden als Arzneimit-tel infolge ihrer antiproliferativen Wirkungen An-wendungen in der Krebstherapie (Kanzerostatika):

5 Aminopterin, Amethopterin: Hemmer der Di-hydrofolatreduktase,

5 Deazauridin: Hemmer der Orotidinphosphat-decarboxylase,

5 Fluor-dUridin, Fluoruracil: Hemmer der Thymi-dylatsynthase und

5 Ribovirin, Mycophenolsäure: Hemmer der IMP-Dehydrogenase.

Hemmer der Dihydrofolatreduktase werden auch zur Therapie von Autoimmunerkrankungen einge-setzt (Immunsuppressiva), da sie die Proliferation von immunkompetenten Zellen unterdrücken.

5.1.2 Funktion

Nucleotide üben vielfältige metabolische Funktionen aus:4 Energiestoffwechsel: Adenylsäuresystem, insbe-

sondere ATP; GTP für spezielle Reaktionen,4 Monomere der Nucleinsäuren,4 physiologische Mediatoren: cAMP und cGMP als

»second messenger«; GTP für die cap-Bildung am 5‘-Ende von mRNA oder die Signaltransduktion durch Bindung an G-Proteine,

. Abb. 5.4. Biosynthese des Des-oxythymidylats (dTMP) (aus Löffler 2005)

6

5.1 · Nucleotide583

Prüfungsfallstricke

4 Bestandteile von Coenzymen wie NAD(P), FAD und CoA,

4 aktivierte Intermediate: UDP-Glucose, UDP-Galac-tose; GDP-Mannose, GDP-Fucose; CDP-Cholin, CDP-Ethanolamin, CDP-Diacylglycerol, CMP-Neu raminsäure.

5.1.3 Abbau der Nucleotide

Nucleotidasen spalten die Phosphorsäure-Esterbin-dung zwischen Pentose und Phosphat hydrolytisch. Sie sind Phosphatasen. Es entsteht ein Nucleosid und an-organisches Phosphat:

B–R–P+H2O→B–R+Pa.

Nucleosidasen spalten die N-glycosidische Bindung zwischen Base und Pentose hydrolytisch. Sie sind Glyco-sidasen. Es entstehen die freien Basen und der Zucker:

B–R+H2O→B+R (bzw. dR).

Nucleosid-Phosphorylasen spalten Nucleoside phos-phorolytisch unter Bildung von Ribose- bzw. Desoxyri-bose-1-Phosphat:

B–R+H2PO4–→B+R–1–P (bzw. dR–1–P).

Ribose-1-Phosphat kann durch eine Mutase in Ribose-5-Phosphat überführt und im Stoffwechsel wiederverwer-tet werden. Desoxyribose-1-Phosphat wird abgebaut.

Das Purinskelett kann synthetisiert, aber nicht ab-gebaut werden!

Adenin wird zu Hypoxanthin desaminiert, Guanin zu Xanthin. Hypoxanthin wird über Xanthin zur Harn-säure oxidiert. Das erforderliche Enzym ist die Xanthin-oxidase mit FAD als Coenzym. Das gebildete FADH2 überträgt den Wasserstoff auf molekularen Sauerstoff unter Bildung von H2O2. Die Xanthinoxidase ist in den Peroxisomen der Leber lokalisiert.

Das Pyrimidinringsystem kann im Organismus vollständig zu CO2, H2O und NH3 abgebaut werden. Nach Spaltung des Pyrimidinrings entstehen interme-diär β-Aminosäuren, wie z. B. aus Uracil β-Alanin.

BergungsstoffwechselDie Purinsynthese ist energetisch aufwändig. Deshalb werden die Basen Adenin, Guanin und Hypoxanthin

wiederverwertet. Folgende Enzyme sind von Bedeu-tung:4 Die Adenosindesaminase überführt Adenosin

bzw. Desoxyadenosin durch Abspaltung von NH3 in Inosin/Desoxyinosin (Base Hypoxanthin),

4 Die Purinnucleosidphosphorylase spaltet Inosin/Desoxyinosin in Hypoxanthin und Pentose-1-Phosphate.

Die eigentlich wiederverwertenden Enzyme sind:4 die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Trans-

ferase (HGPT), die auf Hypoxanthin bzw. Guanin Ribose-1-Phosphat aus dem PRPP überträgt:

Hypoxanthin/Guanin+PRPP→IMP/GMP+PPa.

4 die Adenin-Phosphoribosyl-Transferase (ARRT), die auf Adenin Ribose-1-Phosphat überträgt:

Adenin+PRPP→AMP+PPa.

KLINIKEin Adenosindesaminase-Mangel führt zu schweren Immundefekten (SCID: severe com-bined immunodeficiency). Ursache ist eine Akku-mulation von Adenosin/Desoxyadenosin, die durch Nucleosid- und Nucleotidkinasen zu ATP/dATP phosphoryliert werden. dATP ist ein alloste-rischer Inhibitor der Ribonucleotidreduktase. Daraus entsteht ein Mangel an Desoxyribonucleo-tiden, eine Hemmung der DNA-Replikation und der Lymphozytenproliferation, die zu einem Anti-körpermangel führt. Das Lesh-Nyhan-Syndrom beruht auf einem genetischen Defekt der HGPT.

Eine Wiederverwertung von Pyrimidinbasen ist nur auf der Stufe der Nucleoside möglich, die unter ATP-Verbrauch zu den Nucleotiden phosphoryliert werden. Die dafür erforderlichen Enzyme sind die Uridin-Cyti-din-Kinase und die Thymidinkinase.

5.1.4 Pathobiochemie

Die Hyperurikämie, als Krankheitsbild Gicht, spielt unter Wohlhabenden der Gesellschaft eine vorrangige-re Rolle, da sie sowohl genetische als auch ernährungs-bedingte Ursachen hat.


5

KLINIKDie Gicht ist durch eine Erhöhung des Blutspiegels an Harnsäure (Hyperurikämie) und ihrer Ablage-rung in den Bindegeweben, insbesondere in klei-neren Gelenken, gekennzeichnet. Die primäre Hy-perurikämie beruht auf genetischen Störungen im Purinstoffwechsel. Die sekundäre Hyperurikämie ist die Folge erworbener Erkrankungen, die einen vermehrten Zellabbau oder eine verminderte Aus-scheidung über die Niere verursachen. Allopurinol ist ein therapeutisch genutzter Inhibitor der Xanthinoxidase. Weiterhin ist eine Ver-abfolgung von Urikosurika angebracht, z. B. Pro-benecid, die die Ausscheidung von Harnsäure be-günstigen. Neben einer medikamentösen Therapie spielt die Einhaltung von Diäten eine wichtige Rolle: Reduktion von Alkohol und purinreichen Nahrungsmitteln wie Kaviar und Fleischprodukten, dafür Kohlenhydrate und Milchprodukte. Eine Erhöhung des Harnsäurespiegels wird auch bei Typ I Glycogenose (v. Gierke) beobachtet. Infolge des Fehlens der Glucose-6-Phosphatase wird Glucose-6-Phosphat vermehrt im Pentosphos-phatweg in Ribose-5-Phosphat überführt, aus welchem Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) ent-steht. Dieses stimuliert die Purinsynthese und es kommt zu einer gesteigerten Bildung von Uraten. Auch beim Lesh-Nyhan-Syndrom ist die Gicht eine Begleiterkrankung. Sulfonamide wirken antibakteriell als Struk-turanaloga der p-Aminobenzoesäure bei der Syn-these der Tetrahydrofolsäure, die in Bakterien, aber nicht beim Menschen möglich ist (GK Chemie, 7 Kap. 8: Vitamine, Folsäure) (Chemotherapeutika) und hemmen dadurch alle FH4-abhängigen Pro-zesse im Nucleotid- und Aminosäurestoffwechsel. Weiterhin finden Sulfonamide Anwendung als Anti-diabetika und Diuretika.

5.2 Nucleinsäuren

5.2.1 Grundbegriffe

Die informationsspeichernden Elemente in der DNA sind die Gene für Ribonucleinsäuren und Proteine. Das Genom beinhaltet die gesamte genetische Infor-mation einer Zelle. Ihr Proteom ist die Gesamtheit realisierter Information durch Proteine (GK Chemie 7 Kap. 7.2).

Veränderungen im Genom können ausgelöst wer-den durch:

4 Rekombination genetischen Materials zwischen meist homologen Chromosomen (z. B. in der Meiose),

4 Verlagerung von Genen innerhalb des Genoms durch Transposition und

4 stabile Mutationen.

Punktmutationen betreffen den Austausch einer Base. Nucleotidsubstitutionen sind die Transition und Transversion. Die Transition ersetzt eine Purin- eine andere Purinbase bzw. eine Pyrimidinbase eine an-dere Pyrimidinbase. Bei der Transversion wird eine Purin- durch eine Pyrimidinbase ersetzt und umge-kehrt. Daraus können sich folgende Konsequenzen ergeben:4 Missense-Mutation: es entsteht ein Triplett, wel-

ches eine andere Aminosäure codiert,4 neutrale Mutation: das veränderte Triplett codiert

die gleiche Aminosäure oder4 Nonsense-Mutation: die Nucleotidsubstitution

führt zu einem Stopp-Codon, wodurch eine ver-kürzte Aminosäuresequenz entsteht.

Deletionen (Verlust von Nucleotidsequenzen) und In-sertionen (Einfügen neuer Nucleotidsequenzen) be-wirken immer Veränderungen des Leserahmens und damit Veränderungen der Aminosäuresequenz.

Chromosomenmutationen führen zu Verän de-rungen der gesamten Chromosomenstruktur, ihrer Entfernung oder Verdopplung, z. B. XO oder XXY bei den Geschlechtschromosomen. Chromosomenbrüche induzieren eine Translokation der Fragmente, wobei fusionierte Gene entstehen können.

KLINIKMutationen können zum Auftreten von Erkran-kungen führen. Wenn sie sich in der Keimbahn manifestieren, sind sie vererbbar. Beispiele für Mutationen sind:5 die Sichelzellanämie: Ursache Punktmutation

im β-Globingen, Austausch A/T führt zum Er-satz von Glu6 gegen Val in der β-Kette. Folge ist eine Klebrigkeit des Hb im desoxygenierten Zustand. Hb aggregiert, bindet weniger O2 und führt zu einer sichelförmigen Verformung der Erythrozyten.

5 Phenylketonurie: Mutationen im Phenylalan-inhydroxylase-Gen bewirken, dass Phe nicht mehr in Tyr umgewandelt werden kann (Fol-gen 7 Aminosäurestoffwechsel).

6

585

5 Cystische Fibrose (Mucoviszidose): Deletion im Gen für den Cl–-Transporter in Epithelzell-membranen (Folge: u. a. zäher muköser Schleim in den Bronchien).

Monogenetisch bedingte Erkrankungen sind Ziele einer Gentherapie, die einen Ersatz des mutierten Gens anstrebt.

5.2.2 DNA-Replikation

Jeder Zellteilung geht eine Verdopplung des Chromo-somenbestandes voraus. Das setzt die identische Ver-dopplung (Replikation) der DNA voraus, die in der S-Phase des Zellzyklus erfolgt. Die Replikation von 3,2 Milliarden Basenpaaren der menschlichen Zellen er-fordert etwa 8 h.

Die Replikation ist semikonservativ, d. h. an jedem Elternstrang wird ein Tochterstrang synthetisiert, so-dass bei der Zellteilung die Tochterzellen je einen El-ternstrang und einen neu synthetisierten Strang enthal-ten (. Tab. 5.2).

Mit der Replikation werden auch die Histone und Nichthistonproteine verdoppelt. Die Verteilung der elterlichen Chromatinproteine auf die Filial-DNA er-folgt zufällig. Die frei bleibenden Plätze werden durch Neusynthese in der G1-Phase besetzt.

An der DNA-Replikation sind folgende Enzyme beteiligt:4 DNA-Polymerasen mit den Desoxyribonucleosid-

Triphosphaten (dATP, dGTP, dTPP, dCTP),4 Helicasen, Topoisomerasen,4 Primase,4 Ligasen sowie4 Telomerasen.

Die Replikation beginnt an spezifischen Startstellen, den ORs (origins of replication). Eukaryontische DNA enthält mehrere ORs (. Abb. 5.5).

Die Initiation der Replikation erfordert eine Ent-windung der DNA-Doppelhelix in den ORs. Daran sind beteiligt: Helicasen, Topoisomerasen, die die ent-stehende Superspiralisierung der DNA bei der Ent-windung aufheben, sowie Einzelstrang-stabilisierende Proteine. Im Ergebnis entsteht eine Replikationsblase mit 2 Replikationsgabeln. Die Replikation der DNA läuft in beiden Richtungen ab. Sie ist bidirektional vom Ursprung weg.

KLINIKDie Topoisomerase-Hemmer Topotecan und Irino tecan sind hochpotente Kanzerostatika, die sich vom Camptothecin, einem natürlich vor-kommen den Chinolin-Alkaloid ableiten, welches selbst aber zu toxisch ist. Sie hemmen die DNA- Replikation.

Die Elongation erfordert verschiedene DNA-Poly-merasen, die den elterlichen Strang (Matrize) in 3′-5′-Richtung lesen und den Tochterstrang in 5′-3′-Rich-tung synthetisieren.

Daraus ergibt sich, dass ein Strang kontinuierlich repliziert werden kann (Führungsstrang), während der andere »im Rückwärtsgang« der Polymerase (ent-gegen der Wanderungsrichtung der Replicationsgabel) diskontinuierlich unter Bildung kurzer Okazaki-Frag-mente von ca. 150–200 Nucleotiden aufgebaut wird (Verzögerungsstrang).

DNA-Polymerasen verknüpfen die Desoxyribonu-cleosid-Triphosphate dATP, dGT, dCTP, dTTP unter Abspaltung von Pyrophosphat zu einem neuen DNA-Polymer.

Alle DNA-Polymerasen benötigen eine freie 3′-OH-Gruppe, um die Desoxyribonucleotide anzu-knüpfen. Dies Problem wird am Start durch die Bildung von Primern gelöst. Diese sind kurze RNA-Stücke aus 3–10 Nucleotiden, die durch Primasen (RNA-Polyme-rasen) gebildet werden.

An der Replikation der DNA bei Säugetieren sind folgende Polymerasen beteiligt:

. Tab. 5.2. Die Replikation der eukaryontischen DNA

Schritt Mechanismus Produkt

1 Initiation Erkennung des OR (origin of replication), Entwindung der DNA, Bildung der Replikations-blase mit 2 Replikationsgabeln, Bildung der Primer

2 Elongation Synthese der kontinuierlichen und diskontinuierlichen Tochterstränge unter Verbrauch von Desoxyribonucleosid-Triphosphaten

3 Termination Verschmelzung der Replikationsblasen, Entfernung der Primer, Auffüllung der Lücken und Ligierung der Fragmente

5.2 · Nucleinsäuren


5

Merke

4 α-Polymerase: Synthese von Primern (Primase-Ak-tivität) und Okazaki-Fragmenten am Verzöge-rungsstrang,

4 δ-Polymerase: kontinuierliche Synthese am Füh-rungsstrang,

4 β- und ε-Polymerasen: Reparaturenzyme sowie4 γ-Polymerase: Replikation mitochondrialer DNA.

Die α-, β-, δ- und ε-Polymerasen kommen im Zell-kern vor. Die γ-Polymerase befindet sich im Mito-chondrium.

Die Polymerasen katalysieren eine nucleophile Re-aktion zwischen der 3′-OH-Gruppe und der α,β-Phos-phorsäure-Anhydridbindung des zu bindenden Des-oxynucleosidtriphosphats:

(DNA)n+dNTP→(DNA)n+1+PPa; dNTP=dATP, dGTP, dCTP, dTTP

Durch Abbau des Pyrophosphats wird die Reaktion ir-reversibel.

Um den Verzögerungsstrang zu komplettieren, müssen die RNA-Primer abgebaut, die entstehenden Lücken durch die β-Polymerase aufgefüllt und die Stücke durch Ligasen miteinander verbunden werden.

Die Replikation ist beendet (Termination), wenn sich alle Replikationsblasen vereinigt haben.

Die Replikation linearer DNA birgt eine Komplika-tion: die am elterlichen Verzögerungsstrang syntheti-sierte DNA kann an ihrem 3′-Ende nicht zu Ende syn-thetisiert werden. Der hier liegende Primer kann nach seinem Abbau nicht durch DNA ersetzt werden, sodass sich die DNA bei jeder Replikation weiter verkürzt. Um einem Verlust von Genen vorzubeugen, enthalten diese als Telomeren bezeichneten DNA-Abschnitte hochre-petitive G-reiche Basensequenzen. Nach etwa 50 Repli-kationen ist in somatischen Zellen jedoch der Vorrat aufgebraucht. Es kommt zu Genverlusten und damit zum Zelltod (biologische Uhr).

In den Keimbahnzellen, den Stammzellen der Hä-matopoese und der Haut sowie in Tumorzellen befindet sich eine Telomerase, die eine Wiederverlängerung der Telomere bewirkt. Die Telomerase enthält eine RNA, die zur Kettenverlängerung genutzt wird. Das Enzym wirkt wie eine reverse Transkriptase (7 Viren). Dadurch sind sehr viel mehr Zellteilungen möglich.

Replikation ist die Verdopplung der DNA vor einer Zellteilung in der S-Phase an den Replikationsga-beln, die an »den origins of replication« (OR) ent-stehen. Die DNA-Polymerasen lesen in 3’-5’-Rich-

. Abb. 5.5. Schema der Replikation von DNA (aus Löffler 2005)

6

587

tung den zu replizierenden Strang ab und synthe-tisieren in 5’-3’-Richtung. Der Führungsstrang wird kontinuierlich (δ-Polymerase), der Folgestrang diskontinuierlich unter Bildung der Okazaki-Frag-mente gebildet (α-Polymerase). Die Okazaki-Frag-mente haben eine Länge von ca. 140 Nucleotiden. Die DNA-Polymerasen benötigen einen RNA-Primer zur Anknüpfung an das freie 3’-OH-Ende von Des-oxyribonucleotiden. Die nach Abbau der Primer entstandenen Lücken werden durch die β-Polyme-rase gefüllt. Ligasen katalysieren die Verknüpfung der DNA-Stücke. Telomerasen katalysieren nur in wenigen Geweben, z. B. Keimbahn, Haut, hämo-poetische Stammzellen, Tumore, die Wiederverlän-gerung von Telomeren.

5.2.3 DNA-Schädigung und -Reparatur

Die hohe Stabilität der DNA wird durch effektive Repa-raturprozesse gewährleistet. Ursachen für notwendige Reparaturen sind:4 Die thermische Spaltung N-glycosidischer Bin-

dungen von Purinbasen,4 die Desaminierung von Cytosin zu Uracil,4 die Bildung von Thymindimeren durch UV-Licht.

Dabei sind zwei Mechanismen bedeutungsvoll: die Basen exzisionsreparatur und die Nucleotidexzision.

Bei der Basenexzision wird das fehlerhafte Desoxy-ribonucleotid entfernt und die Lücke mit einer Poly-merase und Ligase geschlossen. Bei der Nucleotidexci-sionsreparatur wird ein aus etwa 20 Nucleotiden beste-hendes Stück in der Umgebung der fehlerhaften Base herausgeschnitten und die Lücke durch Polymerasen und Ligasen geschlossen.

Voraussetzung ist die Intaktheit des komplementä-ren DNA-Strangs.

5.2.4 Transkription

Die Umschreibung von DNA-Genen in einsträngige RNA-Sequenzen bezeichnet man als Transkription (. Tab. 5.3). Die Transkription findet im Zellkern/Nu-cleolus statt und liefert noch nicht funktionstüchtige RNA-Transkripte (Vorläufermoleküle), die zu den funktionsfähigen RNAs »prozessiert« werden müssen und in der Lage sind, die Kernporen zu passieren. Es wird nur ein DNA-Strang abgelesen und transkribiert:4 Matrizen- oder nichtcodierender Strang ist der

DNA-Strang, an dem die RNA-Synthese erfolgt (–Strang),

4 der komplementäre DNA-, Nichtmatrizen- oder codierende Plus-Strang, der nicht transkribiert wird, entspricht der Basensequenz der transkribier-ten RNA, wobei T statt U steht (+Strang).

Die erforderlichen Enzyme sind die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen. Im Gegensatz zu den Prokaryon-ten gibt es bei Eukaryonten 3 Polymerasen:4 RNA-Polymerase I transkribiert r-RNA-Gene im

Nucleolus,4 RNA-Polymerase II transkribiert m-RNA-Gene im

Kern, sie ist durch α-Amanitin, das Gift des Knol-lenblätterpilzes (bizyklisches Polypeptid) in sehr niedrigen Konzentrationen hemmbar; und die

4 RNA-Polymerase III transkribiert im Zellkern t-RNA-Gene, die 5S-r-RNA der Ribosomen sowie die sn-RNAs. Sie wird durch hohe α-Amanitin-Konzentrationen gehemmt.

Die RNA-Polymerasen brauchen keine Primer, um mit der Synthese zu beginnen. Gelesen wird in Richtung 3′-5′, synthetisiert wird in Richtung 5′-3′. Das 5′-Ende ist demzufolge ein Nucleotid-Triphosphat. Substrate sind Ribonucleosid-Triphosphosphate der Purinbasen A und G und der Pyrimidinbasen C und U. Die freie OH-Gruppe am C’3 des ersten Nucleotids wird mit der α-Phosphatgruppe am C’5 des zweiten Nucleotids ver-bunden. Dabei wird Pyrophosphat frei, welches sofort in 2 anorganische Phosphate hydrolysiert wird. Das Gleichgewicht der Reaktion liegt demzufolge auf Seiten

. Tab. 5.3. Die Transkription

Schritt Mechanismus Produkt

1 Initiation Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor unter Mitwirkung von Transkriptions-faktoren.

2 Elongation Aufbau der RNA unter Verbrauch von Nucleosid-Triphosphaten.

3 Termination Prä-RNAs, Abbruch der Kettenverlängerung nach Erkennung von Stopp-Signalen auf der DNA.



5


Merke

Merke

des Produkts Phosphodiesterbindung. Der Reaktions-mechanismus der Anlagerung eines Nucleotids an die 3′-OH-Gruppe entspricht dem der DNA-Polyme-rasen.

Die Initiation der Transkription beginnt mit der Bindung der Polymerase an den Promotor.

Die Promotorregion, oberhalb des 3′-Endes der Startnucleotidsequenz der DNA gelegen, ist eine re-gulatorische Erkennungssequenz zur Bindung der Poly-merase zusammen mit Transkriptionsfaktoren, die für die Polymeraseaktivität beim Start essenziell sind (Erkennung und Bindung) und einen Initiationskom-plex bilden. Promotoren enthalten AT-reiche Sequen-zen (TATA-Boxen) sowie eine variable Anzahl von CCAAT- bzw. GC-Boxen, die für die Aufspaltung der DNA in Einzelstränge und die Bindung von Transkrip-tionsfaktoren erforderlich sind, um der Polymerase das Ablesen der Basenfolgen zu ermöglichen.

Basensequenzen, wie die AT- und GC-reichen Re-gionen in den Promotoren, werden, da sie in vielen Genen auftreten, Consensus-Sequenzen genannt.

Jede Polymerase hat ihre eigenen Transkriptionsfak-toren (TF I–III). Neben den klassischen Transkrip-tionsfaktoren gibt es auch spezifische Transkriptions-faktoren, die aktivierend oder hemmend (Aktivatoren, Repressoren) in die Transkription eingreifen. Dazu gehören die intrazellulären Rezeptorproteine z. B. für Steroidhormone.

Weiterhin gibt es auf der DNA Enhancer- und Silencer-Sequenzen, die weiter von der Promotorre-gion entfernt liegen, aber durch Schleifenbildungen der DNA zusammen mit an diese DNA-Regionen binden-den Proteinen den Start einer RNA-Synthese verstär-ken oder hemmen können.

Die Initiationsfaktoren werden mit Beginn der RNA-Synthese (Elongation) abgelöst. Der Prozess der eigentlichen Synthese ist nicht genau bekannt. Die DNA liegt als 10 nm-Fibrille vor. Ob die Nucleosomenstruk-tur aufgelöst wird, ist nicht geklärt. Es muss jedoch zu einer reversiblen Entwindung der DNA kommen, damit die Polymerasen den Matrizenstrang ablesen können.

Ebenfalls nicht bekannt sind die Terminations-sequenzen auf der eukaryonten DNA. Von einem Gen können verschieden lange Transkripte erhalten werden.

Die RNA-Polymerasen besitzen keine Korrektur-möglichkeiten für falsch eingebaute Nucleotide. Die Fehlerquote liegt bei ~10–5, d. h. pro 100.000 Nucleotide wird ein falsches Nucleotid eingebaut.

An DNA-Genen werden auch RNAs transkribiert, deren Funktion unbekannt ist.

Alle Primärtranskripte werden mit einem erheblichen Basenüberschuss synthetisiert. Gut bekannt ist die Über-führung der hn-RNA = prä-m-RNA in die funktions-fähige m-RNA.

Die posttranskriptionalen Modifikationen der hn-RNA bestehen aus:4 der Anheftung der cap-Gruppe (7Methyl-GTP)

an das 5′-Ende der m-RNA. Diese ermöglicht den Transport der m-RNA vom Kern ins Zytoplasma, schützt die m-RNA vor dem Abbau durch Exonu-cleasen und dient der Orientierung bei der Bindung der m-RNA an die kleine Ribosomenuntereinheit bei der Initiation der Proteinbiosynthese,

4 der Synthese einer Poly-A-Sequenz am 3′-Ende der mRNA aus bis zu 200 AMP-Resten, die die Lebens-dauer der m-RNA im Zytoplasma bestimmen und

4 der Entfernung der Introns (Spleißen).

Introns haben eine durchschnittliche Größe von 5500 Nucleotiden. Die Exon-Intron-Grenze wird durch spe-zifische Consensus-Sequenzen markiert. Das Spleißen wird von sn-RNA-Protein-Komplexen (sn-RNPs) kata-lysiert. Die sn-RNPs binden an die hn-RNA, die eben-falls als RNP vorliegt, markieren die Spleißstellen und schneiden zuerst an der 5′-Exon-Intron-Grenze und verbinden das Ende des Introns mit einer OH-Gruppe innerhalb des Introns, wobei sich eine »Lasso-ähnliche« Struktur des Introns ausbildet (Lariat-Struktur), die das 3′-Ende an den Spaltungskomplex (Spleißosom) he-ranführt. Nun wird das 3′-Ende an der Exon-Intron-Grenze geschnitten und die Enden zwischen den Exons werden ligiert. Eine freie OH-Gruppe innerhalb des Introns greift die Phosphodiesterbindung am Exon- Intron-Übergang an. Das entstehende freie 3′OH-Ende des Exons I greift dann am Übergang zu Exon II an, wodurch das Intron eliminiert und die beiden Exons verbunden werden. Das Intron in der Lariat-Struktur wird freigesetzt.

Einige intronische RNAs können sich selbst spleißen (Ribozyme).

Histon-RNAs enthalten keine Introns und keinen Poly-A-Schwanz. Das Spleißosom ist ein komplexer Apparat aus hn-RNA, sn-RNAs und Proteinen, der eine zwei-6

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fache Umesterung von Phosphodiesterbindungen zur Entfernung der Introns katalysiert. Die Lariatstruktur wird auf dem stromabwärts (5’-3’) gelegenen Intron (nicht Exon) gebildet.

Alternatives Spleißen bedeutet, dass aus einer hn-RNA verschiedene m-RNAs entstehen können. Dabei wer-den neben den Introns auch Exons entfernt.

RNA-Editing ist ein posttranskriptionaler Basen-austausch auf der m-RNA. Dieser führt dazu, dass z. B. in der m-RNA für Apolipoprotein B in der Mukosa zelle frühzeitig ein Stopp-Codon entsteht (Umwandlung von Cytosin in Uracil durch Desaminierung), wodurch das ApoB48 als Bestandteil der Chylomikronen gebildet wird, in der Leber, wo das Editing unterbleibt, hingegen Apo B100 als Komponente der VLDL entsteht. Das Edit-ing besteht in Veränderungen der Basensequenz.

Variable RNA-Termination beim Transkriptions-vorgang, alternatives Spleißen und RNA-Editing sind für das Entstehen unterschiedlicher Kopien eines Gens verantwortlich und eine Erklärung da-für, dass mittels 25.000–30.000 Protein-Genen über 100.000 verschiedene Proteine synthetisiert werden können.

Das »Processing« von prä-r-RNAs und prä-t-RNAs ist einfacher, da Nucleasen bestimmte Konformations-merkmale erkennen. Die prä-r-RNA ist ein 45 S-Kom-plex, aus dem die 28 S-, 18 S- und 5,8 S-r-RNAs heraus geschnitten werden. Die 5 S-r-RNA wird von einem anderen Gen geliefert und durch Polymerase III trans-kribiert. Die Assemblierung mit Proteinen erfolgt ebenfalls im Nucleolus, wird aber erst im Zytoplasma komplettiert. Die prä-t-RNAs werden sowohl vom 5′- als auch vom 3′-Ende verkürzt und erst dann die CCA-Sequenz an das 3′-Ende angebunden. Weiterhin finden posttranskriptional zahlreiche Basenmodifikationen statt.

Transkription ist die Überschreibung einer DNA- in eine RNA-Sequenz durch DNA-abhängige RNA-Polymerasen. Die Polymerasen erkennen und bin-den mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren an ihre Promotoren, von denen aus die Transkription be-ginnt. RNA-Polymerase I transkribiert r-RNA-Gene

im Nucleolus; RNA-Polymerase II transcribiert m-RNA-Gene im Kern, sie ist durch α-Amanitin, das Gift des Knollenblätterpilzes hemmbar; RNA-Poly-merase III transkribiert im Zellkern t-RNA- und andere 5S-RNA-Gene, sie ist durch hohe α-Amani-tin-Konzentrationen hemmbar. RNA-Polymerasen benötigen keine Primer. Die Transkriptionsprodukte müssen durch ein Processing in die reifen RNA-Formen überführt werden, um den Zellkern verlassen zu können. Die verschiedenen pro-RNA-Formen unterliegen einem unterschiedlichen Zurechtschneiden.

5.2.5 Translation

Translation bedeutet die Übersetzung des in der m-RNA enthaltenen genetischen Codes in eine Aminosäure-sequenz. Der Code besteht aus 64 Codons, davon sind 3 Stopp-Codons.

Der genetische Code ist ein Triplett-Code, d. h. 3 Basen in Sequenz bestimmen die Aminosäure. Er ist degeneriert, da mit Ausnahme von Met und Trp alle Aminosäuren mehrere Basentripletts haben. 61 Codons codieren 20 Aminosäuren. Er ist universell, da alle Lebe-wesen für die Translation fast den gleichen Code benut-zen (in Mitochondrien gibt es z. B. Abweichungen).

Für die Spezifität des Codes sind die ersten beiden Basen im Triplett verantwortlich. In der dritten Positi-on wird lediglich zwischen Purin- und Pyrimidinbase unterschieden. Diese dritte Base paart mit der ersten Base im Anticodon-Bereich der t-RNA, die meist Hy-poxanthin ist und sowohl mit Pyrimidinen als auch Purinen paaren kann (wobble- oder Wackelsitz-Paa-rung).

Daraus ergeben sich folgende Konsequenzen:4 Eine Punktmutation der dritten Base des Codons

wirkt sich biologisch nur dann aus, wenn ein Stopp-Codon entsteht.

4 Die Bindung zwischen Codon- und Anticodon-Be-reich ist nicht so stabil, wie wenn 3 Basen über Was-serstoffbrücken verbunden wären. Es muss also im Translationsprozess weniger Energie zur Auflösung der Basenpaarungen zwischen dem Codon auf der m-RNA und dem Anticodon auf der t-RNA aufge-wendet werden.

4 Die zweite Base entscheidet, ob die Aminosäure hydrophile oder hydrophobe Reste besitzt. Bei Mutationen der zweiten Base werden hydrophobe gegen hydrophile Reste ausgetauscht. Der gene-tische Code ist konservativ.

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5


Die codogene Basensequenz einer m-RNA be-steht aus 3000 Basen, die die Aminosäuresequenz eines Proteins aus 1000 Aminosäuren bestimmt. Bei einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100 für eine Aminosäure hätte das Protein ein Molekulargewicht von 100.000.

Ribosomen sind die Organellen, an denen sich im Zyto-plasma und in den Mitochondrien die Proteinbiosyn-these vollzieht. Die kleine Untereinheit des Ribosoms ist primärer Datenempfänger und Datenleser über die Bindung von m-RNA und Start-Aminosäure. Die große Untereinheit ist die eigentliche Fabrik der Proteinsyn-these.

Bei Eukaryonten codiert eine m-RNA eine Poly-peptidkette. Sie ist monocistronisch. Die Proteinsyn-these verläuft vom N- zum C-terminalen Ende. Dabei wird die m-RNA in 5′-3′-Richtung abgelesen. Eine m-RNA wird nicht nur durch ein, sondern durch meh-rere Ribosomen unter Polysomenbildung translatiert.

Ähnlich wie bei der Replikation und Transkription kann auch bei der Proteinbiosynthese zwischen Initia-tion, Elongation und Termination unterschieden wer-den (. Tab. 5.4).

Der erste Schritt der Proteinbiosynthese besteht in einer Aktivierung der Aminosäuren und ihrer Bindung an die CCA-Sequenz der t-RNAs. Für jede Aminosäure gibt es mindestens eine t-RNA entsprechend der Dege-neriertheit des Codes. Die dafür notwendigen Enzyme sind die Aminoacyl-t-RNA-Synthetasen. Die Reak-tion besteht aus 2 Einzelschritten:4 Aktivierung der Aminosäure mit ATP unter Bil-

dung eines Aminoacyladenylats (Aminoacyl-AMP) unter Freisetzung von Pyrophosphat und Hydro lyse des Pyrophosphats (Analogie zur Akti-vierung von Fettsäuren);

4 Übertragung des Aminoacyladenylats auf die Ribo-se des 3′-terminalen Adenosinrests der t-RNA un-ter Bildung einer Aminoacyl-t-RNA.

Diese Reaktionen sind hochspezifisch und manche Synthetasen besitzen Korrekturfähigkeit. So kann z. B. bei der Aktivierung von Leucin ein falsch gebundenes Valin aus dem Aminoacyl-t-RNA-Komplex wieder ab-gespalten werden.

Die Startaminosäure ist Methionin. Für die Ini tia-tion, Elongation und Termination werden Initia-tions(eIF)-, Elongations(eEF)- und Freisetzungsfak toren (eRF) benötigt, die Proteine mit sehr speziellen Funktio-nen sind. Die für die Knüpfung von Peptidbindungen notwendige Energie wird durch GTP bereit gestellt.

Die Initiation der Proteinbiosynthese beginnt mit der Bindung von Methioninyl-t-RNA an den eIF2 unter Beteiligung von GTP und die Übertragung auf die kleine Untereinheit des Ribosoms (40S). Für die Initia-tion muss das Ribosom in seine kleine und große Unter-einheit dissoziiert sein.

Danach erfolgen die Bindung der m-RNA und die Zuordnung der Methioninyl-t-RNA an das Startcodon AUG der m-RNA unter Mitwirkung von eIF1 und Ver-brauch von ATP.

Der nächste Schritt ist die Anlagerung der großen ribosomalen Untereinheit (60 S). Unter Spaltung des GTP dissoziieren alle eIF aus dem Initiationskom-plex ab.

Im Initiationskomplex sind mehrere Bindungsstel-len entstanden (. Abb. 5.6):4 die Peptidyl- oder P-Stelle, an die die Startamino-

säure-t-RNA gebunden ist und4 die Akzeptor- oder A-Stelle, an die die nächste

Aminoacyl-t-RNA gebunden wird.

In die E-Position (exit) gelangen die freien t-RNAs nach Ausbildung einer Peptidbindung.

Die Elongation erfolgt durch Bindung einer Amino-acyl-t-RNA mittels eEF1 und GTP an der A-Stelle (. Abb. 5.7). Die nächsten Schritte bestehen in4 der Übertragung der in P-Stellung stehenden Ami-

nosäure auf die in A-Stellung befindliche Amino-säure durch die aus dem Ribosom stammende Pep-tidyltransferase-Aktivität unter Bildung einer Peptidbindung und

. Tab. 5.4. Die Proteinbiosynthese

Schritt Mechanismus Produkt und Reaktion

1 Präinitiation Bildung des aktivierten Aminoacyl-t-RNA-Komplexes

2 Initiation Bildung des Startkomplexes aus Startaminosäure-t-RNA, kleiner ribosomaler Untereinheit, m-RNA, Assemblierung mit der großen Untereinheit, GTP-Verbrauch

3 Elongation Polypeptid-t-RNA, Aminosäure-t-RNA, Verbrauch von GTP, Ausbildung der Peptidbindungen

4 Termination Freisetzung der Polypeptidkette und der letzten t-RNA, GTP-Verbrauch

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4 der Abspaltung der nicht mehr nötigen t-RNA, ihre Verlagerung in den E-Ort und die Translokation des entstandenen Peptids in den P-Ort unter Spal-tung von GTP unter Mitwirkung von eEF2.

Die Termination findet statt, wenn ein Stopp- Codon in den A-Ort einrückt. Dann binden eRF und GTP an das Ribosom. Dadurch werden die Peptidkette und die letzte t-RNA unter GTP-Spaltung freigesetzt.

Die Proteinsynthese kann durch Phosphorylierung von eIF2 reguliert werden. Der phosphorylierte eIF2

bindet an einen Guaninnucleotid-Austauscherfaktor und wird dadurch inaktiv. Nach Dephosphorylierung spaltet der Komplex wieder auf. Häm hemmt die Phos-phorylierung von eIF2 und fördert dadurch die Globin-synthese in den Retikulozyten. Die Stabilität der m-RNA im Zytosol ist ebenfalls eine Möglichkeit zur Regulation der Proteinsynthese. Die Proteinbiosyn-these ist sehr energieaufwändig. ATP wird für die Ak-tivierung der Aminosäuren, für die Sortierung der m-RNA an der kleinen Untereinheit des Ribosoms so-wie für die Funktionen der Chaperone verbraucht. GTP

. Abb. 5.6. Initiation der Proteinbio-synthese (aus Löffler 2005)



5

ist für die Initiation, Elongation und Termination erfor-derlich.

Die im Zytoplasma verbleibenden Proteine sowie die für den Import in Kern, Mitochondrien oder Per-oxisomen vorgesehenen Proteine werden an freien Po-lysomen im Zytoplasma synthetisiert. Die Bildung von Proteinen, die in das endoplasmatische Retikulum, in die Lysosomen oder in die Zellmembran gelangen sollen oder zum Export aus der Zelle durch Exozytose vorgesehen sind, werden am endoplasmatischen Reti-kulum (raues ER) synthetisiert, zum Golgi-Komplex befördert und in Vesikel verpackt.

Die Synthese dieser Proteine beginnt zunächst im Zytoplasma mit der Bildung einer N-terminalen Signal sequenz aus etwa 20 Aminosäuren. Diese wird an ein im Zytoplasma befindliches Ribonucleoprotein (SRP= signal recognition particle, kleine zytoplasma-tische RNA, sc-RNA) gebunden, wodurch der Fortgang der Proteinsynthese unterbunden wird.

Über einen SRP-Rezeptor auf der Membran des endoplasmatischen Retikulums wird der SRP-markier-te Peptid-Ribosomenkomplex gebunden und auf einen spezifischen Ribosomenrezeptor (Translocon) umge-lagert. Dadurch geht die Proteinsynthese im Lumen

. Abb. 5.7. Elongationsprozesse bei der Proteinbiosynthese (aus Löffler 2005)

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des endoplasmatischen Retikulums weiter. Durch eine Signalpeptidase wird das Signalpeptid abgespalten.

Das Signalpeptid enthält einen hohen Anteil von Aminosäuren mit hydrophoben Resten und wird nicht im endoplasmatischen Retikulum glycosyliert.

Proteine, die mit einer Signalsequenz synthetisiert wer-den, heißen Prä-Proteine. Ist eine limitierte Proteolyse notwendig, um sie in ihre biologisch aktive Form zu überführen, handelt es sich um Pro-Proteine. Ein Prä-Pro-Protein ist demzufolge ein Translationsprodukt, welches am endoplasmatischen Retikulum syntheti-siert und posttranslational durch die Signalase und wei-tere Proteasen in das aktive Protein umgewandelt wer-den muss.

Glycoproteine werden nicht an den zytosolischen freien Polysomen gebildet.

Hemmstoffe der Proteinbiosynthese haben therapeu-tische Bedeutung (. Tab. 5.5).

KLINIKDas Diphtherietoxin hemmt durch Poly-ADP- Ribosylierung eines Diphthamidrests den Elonga-tionsfaktor eEF-2 (= Translokase) und damit die Translation. Diphthamid ist eine posttranslationale Histidinmodifikation.

In der Präinitiation werden Aminoacyl-t-RNA-Kompexe gebildet. Die Met-t-RNA als Startaminosäure, m-RNA, die kleine Ribosomenuntereinheit, Initiations-

faktoren und GTP bilden einen Startkomplex, der durch die große ribosomale Untereinheit kom-plettiert wird. Die Met-RNA befindet sich am P-Ort des Ribosoms. Am A-Ort wird die nächste Amino-acyl-t-RNA mit GTP gebunden. Es erfolgt die Über-tragung der am P-Ort gebundenen Aminosäure auf die am A-Ort befindliche Aminosäure unter Ausbil-dung einer Peptidbindung und die GTP-abhängige Translokation in den P-Ort. Der Vorgang wieder-holt sich, bis ein Stopp-Codon auf der m-RNA er-scheint.

Zytoplasmatische Proteine, nucleare, mitochondriale und peroxisomale Proteine werden durch freie Poly-somen synthetisiert. Proteine für das endoplasmatische Retikulum, den Golgi-Komplex, Lysosomen und Zell-membranen sowie extrazelluläre Proteine werden mit einer Signalsequenz synthetisiert (Prä-Proteine), die das Anbinden der Polysomen an das endoplasmatische Retikulum gewährleistet. Die Proteine werden im endo-plasmatischen Retikulum und im Golgi-Komplex post-translational modifiziert und in Vesikel verpackt. Die Einnahme der nativen Konformation der neu synthe-tisierten Proteine wird durch Chaperone und Enzyme beschleunigt. Pro-Proteine müssen durch limitierte Proteolyse in die funktionsfähigen Proteine überführt werden.

5.2.6 Regulation der Genexpression

Die Regulation der Genexpression beinhaltet nicht nur die Beeinflussung der Ablesbarkeit der DNA bei der Transkription, der Aktivität insbesondere der RNA-Poly merase II, sondern auch die Regulation des Trans-ports durch die Kernporen und die Abbauprozesse von RNA im Zytoplasma.

Einige Möglichkeiten der Regulation sind:4 Methylierung von Cytosin führt zu Inaktivierung,

Demethylierung zu Aktivierung von Genen,

. Tab. 5.5. Hemmstoffe der Proteinbiosynthese

Hemmer Gehemmte Reaktion Therapeutische Anwendung

Tetrazykline Bindung der Aminoacyl-tRNA an die Akzeptorstelle von 70S-Ribosomen von Bakterien

Breitbandantibiotikum

Streptomycin Bindung an 30S-Untereinheit von Tuberkulose-Bakterien Tuberculose

Chloramphenicol Hemmung der Peptidyltransferase von 70S-Ribosomen Antibiotikum zweiter Wahl

Diphtherietoxin Hemmung der Translocase in 80S-Ribosomen

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4 Methylierungen/Demethylierungen von Histonen u. a. postranslationale Modifikationen am Chro-matin beeinflussen die Genaktivität. Durch Modi-fikation basischer Aminosäuren in den Histonen werden die Wechselwirkungen mit der sauren DNA abgeschwächt,

4 durch Ligandenbindung aktivierte Transkriptions-faktoren fördern die Bildung spezifischer Initia-tionskomplexe der RNA-Polymerase, Beispiel: DNA-Bindung von durch Steroidhormone aktivierten Rezeptoren,

4 Hemmung des Transports von Transkriptionsfak-toren vom Zytoplasma in den Kern, z. B. Bindung von NF-κB an IκB,

4 Bindung der m-RNA im Zytoplasma an Proteine verhindert ihren Abbau, z. B. Stabilisierung der Transferrinrezeptor m-RNA.

Hormonrezeptoren im Zytoplasma (z. B. für Steroid-hormone, Retinsäure, T3) werden durch Bindung ihrer Liganden aktiviert, dimerisieren, wandern in den Zell-kern und binden in der großen Furche an die DNA. Sie enthalten folgende Domänen:4 für die Bindung des Hormons 4 trans-Elemente für die DNA-Bindung (cis-Ele mente

auf der DNA, die Palindrome darstellen können),4 für die Aktivierung des Initiationskomplexes der

Transkription.

Für die Bindung an die DNA ist eine Dimerisierung der durch Liganden aktivierten Transkriptionsfaktoren notwendig. In der DNA-Bindungsdomäne dieser Pro-teine finden sich folgende Strukturen:4 Zink-Finger (Komplexierung eines Zn-Atoms

durch Cys- oder His-Reste führt zu einer Protein-schleife): zu den Zn-Finger-Proteinen gehören die Rezeptorproteine für Steroidhormone, T3, Calci-triol und Retinoide,

4 Leucin-Zipper; eine leucinreiche Helix bewirkt die Dimerisierung über hydrophobe Wechselwirkun-gen; CREB (cAMP-responsives Element-bindendes Protein) ist ein solcher Ligand,

4 Helix-Loop-Helix-Elemente; Schleifenstrukturen, die durch die Wechselwirkungen von 2 Helices ge-bildet werden.

Über die Erhöhung des zellulären cAMP-Spiegels können Gene aktiviert werden, die ein cAMP-res-ponsives Element (CRE) in ihrer Regulatorregion enthalten. cAMP-bindende Proteine (CREB) aktivie-ren diese Gene.

NF-κB aktiviert im Genom eine Vielzahl von Genen, die im Zusammenhang mit oxidativem Stress und akuten Entzündungsreaktionen stehen. Er liegt im Zytoplasma im Komplex mit IκB vor und ist inaktiv. Durch Phosphorylierung von IκB durch verschie-dene Kinasen wird der Komplex gelöst. NF-κB wan-dert in den Zellkern. IκB wird in Proteasomen abge-baut. Die Proteinsynthese wird in der Initiations-phase durch Phosphorylierung des eIF-2 reguliert, der dadurch inaktiviert wird. Die eIF-2-Kinase wird durch Interferone, Hitzeschock, Mangel an Wachs-tumsfaktoren und Aminosäuren aktiviert und durch Häm gehemmt. Häm stimuliert dadurch die Globinsynthese in den erythrozytären Vor-stufen.

KLINIKHemmstoffe der Genexpression finden unter ver-schie denen Gesichtspunkten in Forschung und Praxis Anwendung. Solche Pharmaka sollten bak-terielles Wachstum und damit Infektionen bekämp-fen oder proliferatives und metastasierendes Wachs-tum von Tumoren verhindern. Die erste Gruppe von Substanzen sollte selektiv für prokaryontische Prozesse, die zweite Gruppe gut verträglich für den Menschen sein, d. h. Tumorselektivität besitzen.

. Tab. 5.6. Substanzen mit antiproliferativen Wirkungen

Antibiotikum Wirkungsmechanismus Organismus

Rifamycin und Rifampicin

binden an die bakterielle RNA-Polymerase und hemmen den Start der Transkription, Hemmung der RNA-Polymerase (Therapeutikum)

Prokaryont

Actinomycin interkaliert in der DNA-Doppelhelix und hemmt dadurch die RNA-Poly-merase (Einsatz in der Forschung)

Pro- und Eukaryont

Erythromycin hemmt die Translokation des Codons an der großen Untereinheit des Ribosoms (Therapeutikum)

Prokaryont

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5.2.7 DNA- und RNA-Viren

Viren sind Zellparasiten, die sich nicht selbst replizieren können. Sie infizieren Zellen und verwenden die zell-eigenen Replikations-, Transkriptions- und Transla-tionsmechanismen sowie die vorhandenen Energie-quellen und Bausteine für ihre Vermehrung.

Viren sind infektiöse Partikel – aber keine Lebe-wesen – die beim Menschen schwere Infektionen verur-sachen können. Sie zeigen einen sehr ähnlichen Auf-bau. Im Inneren der Viren ist einzel- oder doppel-strängige DNA (DNA-Viren) oder einzel- oder doppelsträngige RNA (RNA-Viren) lokalisiert. An die Nucleinsäuren sind Proteine gebunden. Der Nu-cleinsäure-Protein-Komplex ist das Nucleocapsid. Als Bestandteile kommen virale Proteine, aber auch zell-eigene Proteine, wie Histone, vor. Das Nucleocapsid ist von einer Proteinhülle umgeben, dem Capsid, welches aus Untereinheiten, den Capsomeren, be-steht. Weiterhin können Viren eine Hüllmembran besitzen, deren Lipidkomponenten von den Viren selbst gebildet werden oder den Membranlipiden der infizierten Zelle entstammen. Viren haben keinen eigenen Stoffwechsel. Zur Synthese ihrer Nucleinsäu-ren und Proteine nutzen sie den genetischen Apparat der Wirtszelle.

Viren sind keine Lebewesen und demzufolge nicht den Prokaryonten zuzuordnen. Viren sind unab-hängige genetische Elemente.

Die Infektion beginnt mit der Adsorption der Viren an die Zellmembran der Wirtszelle. Dabei binden sie an spezifische Strukturen der Zellmembran, wie Rezep-toren, Cadherine oder Integrine, die als Virus-Rezep-toren wirken. Penetration bedeutet das Eindringen in die Wirtszelle mittels Endozytose. Danach findet die Freisetzung der Nucleinsäuren statt. Die DNA der DNA-Viren wird in das Genom der Wirtszelle aufge-nommen.

Produktive Virusinfektionen bestehen in einer massiven Neubildung von Viren, die die Zellen durch Zelllyse (lytischer Weg) oder Knospung unter Mitnah-me von Zellmembranbestandteilen verlassen.

Latenz bedeutet, dass das Virus in die Zelle inte-griert ist. Das Virusgenom wird dann, wenn überhaupt, nur in geringem Maße repliziert (lysogene Viren).

Das Genom der für den Menschen pathogenen RNA-Viren ist klein und überwiegend einsträngig.

RNA-Viren können sich nach unterschiedlichen Mechanismen vermehren:

4 Zeigt die Virus-RNA eine so genannte (+)-Pola-rität, so kann sie direkt als m-RNA in der Zelle dienen. Für ihre Replikation wird sie durch eine virale RNA-abhängige RNA-Polymerase in einen (–)-Strang umgeschrieben, der als Matrize für die Replikation neuer (+)-RNA dient.

4 Virus-RNA mit primärer (–)-Polarität muss durch die RNA-abhängige RNA-Polymerase in einen (+)-Strang umgeschrieben werden, der dann als m-RNA verwendet wird.

4 Retroviren wie HIV-I bilden ein diploides RNA-Ge-nom aus, welches durch die viruseigene reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben und als Pro-virus-DNA in das Wirtsgenom aufgenommen wird. Die reverse Transkriptase katalysiert die Synthese eines DNA-Strangs, der zur Virus-RNA komplemen-tär ist. Anschließend baut sie den RNA-Strang im DNA-RNA-Hybrid ab und ersetzt ihn durch DNA. Die virale RNA sowie Proteine werden vom Wirts-genom aus transkribiert und translatiert. Die neuen Viren verlassen die Zelle durch Knospung. HIV-Vi-ren befallen v. a. T-Lymphozyten und Makrophagen. Diese sterben nach Wochen bis Monaten ab.

Das besonders Gefährliche am HIV ist seine hohe Mutationsrate.

Beispiele für RNA-Viren neben HIV sind:4 Picornaviren: Einzelstrang-RNA mit Capsid; Polio-

Virus verursacht Kinderlähmung,4 Arboviren: Einzelstrang-RNA mit Capsid und

Hülle; Tollwut-Virus,4 Myxoviren: Einzelstrang-RNA mit Capsid und

Hülle; Influenza-Virus.

DNA-Viren translozieren ihre meist doppelsträngige DNA in den Zellkern. Durch die zellulären Transkrip-tionsmechanismen entstehen virale m-RNAs, die virale Proteine translatieren. Für die Replikation der viralen Genome gibt es unterschiedliche Mechanismen, wobei die zelleigene Replikationsmaschinerie, aber auch die reverse Transkription (z. B. Hepatitis B-Virus) verwen-det wird.

DNA-Viren sind:4 Poxviridae: Doppelstrang-DNA mit Capsid und

Hülle, Pocken-Virus,4 Herpes-Viren: Doppelstrang-DNA mit Capsid und

Hülle, Herpes-simplex-Virus,4 Papova-Viren: Doppelstrang-DNA mit Capsid und

ohne Hülle, Papilloma-Virus, welches Hautwarzen (einige Typen auch Genitalwarzen) verursacht.



5

4 Hepatitis B-Virus mit Capsid und Hülle, Erreger der Hepatitis B.

Zur Abwehr von Virusinfektionen werden Komponen-ten der unspezifischen und spezifischen Immunme-chanismen des Organismus genutzt:4 Mononukleäre Zellen, Makrophagen und Killerzel-

len erkennen virusbefallene Zellen oder Viruspar-tikel und phagozytieren sie.

4 Die Präsentation von Virusantigenen durch den MHC-I-Kompex aktiviert T- und B-Lymphozyten.

4 Die Lyse virusbefallener Zellen erfolgt durch das Komplementsystem unter Mithilfe der von B-Lym-phozyten stammenden Antikörper.

4 Es werden α- und β-Interferone gebildet.

KLINIKDurch Impfung wird vorbeugend gegen Virusin-fektionen interveniert. Für die Chemotherapie von Virusinfektionen werden Nucleosidanaloga ein-gesetzt, die die Vermehrung des Virus hemmen. Proteasehemmstoffe inhibieren die Umwandlung viruscodierter Pro-Proteine in die funktionellen Proteine.

5.2.8 DNA-Übertragung

Die Transfektion ist die Infektion von höheren euka-ryontischen Zellen mit DNA (z. B. mit Plasmiden) oder RNA. Dieser Vorgang wird häufig auch als Transforma-tion bezeichnet, obwohl der Begriff Transformation den Übergang einer normalen Zelle in eine Tumorzelle beschreibt.

Transduktion beschreibt in der Molekulargenetik die Genübertragung mittels Viren. Von medizinischem Interesse ist die Transduktion von Onkogenen durch RNA-Tumorviren.

5.2.9 In-vitro-DNA-Rekombination, Gentechnik

Gentechnik ist der Begriff für Verfahren, die den Trans-port, die Stabilisierung und Expression fremder DNA in Zellen ermöglichen.

Klonierung ist die Einschleusung von DNA mittels geeigneter Vektoren in Einzelzellen und ihre anschlie-ßende Vermehrung. Die Herstellung genetisch weitge-hend identischer Organismen kann durch Embryonen-spaltung oder mittels Kerntransplantation in eine ent-kernte Eizelle erfolgen. Das so genannte therapeutische

Klonen dient der Gewinnung von Ersatzgeweben mit günstigen antigenen Eigenschaften (Gewebezüchtung).

Klonierungsvektoren sind gentechnische Vehikel zur Übertragung von Fremd-DNA in Fremdzellen zu deren Vermehrung (Klonierung). Expressionsvekto-ren sind so aufgebaut, dass eine codierende DNA-Se-quenz transkribiert und translatiert werden kann. Als solche Vektoren können Plasmide und Viren verwen-det werden.

Ein Plasmid ist eine kleine, im Zytoplasma von Bakterien vorkommende zirkuläre DNA, die wenige Gene enthält und unabhängig von der chromosomalen DNA repliziert wird. Sie enthält u. a. Resistenzfaktoren für Antibiotika, die sie für die Gentechnik sehr brauch-bar machen. Bei der Klonierung wird das zirkuläre Plasmid durch Restriktionsenzyme unter Bildung spe-zifischer Schnittstellen gespalten, damit durch Ligation DNA-Fragmente mit kompatiblen Enden eingeführt werden können.

In manchen Hefen vorkommende plasmidähnliche Komponenten sind die YAK’s. Cosmide sind genetisch veränderte Plasmide zur Klonierung von großen DNA-Fragmenten (40 kB).

Genbanken (DNA-Bibliotheken) sind die Ansamm-lung der gesamten genomischen DNA (Genom) eines Organismus in Form von klonierten DNA-Fragmen-ten. Man unterscheidet zwischen genomischen Biblio-theken und cDNA-Banken.

KLINIKDie medizinische Bedeutung von Resistenzfak-toren gegen Antibiotika in Bakterien beruht da-rauf, dass es durch die Einnahme von Antibiotika aus therapeutischen Gründen oder den Verzehr von Fleisch antibiotikabehandelter Tiere zur Selektion und Anreicherung antibiotikaresistenter Bakterien in der Darmflora kommen kann und pathogene Mikro-organismen diese Resistenzfaktoren übernehmen. Durch Ligation eukaryontischer Gene in Plas-mide kann eine Expression eukaryontischer Pro-teine in Bakterienkulturen erreicht werden, die z. B. für die Produktion von Hormonen genutzt wird. Da-mit ist man unabhängig von der Extraktion aus humanem Material und die Kosten für die Bereit-stellung solcher Therapeutika vermindern sich. Das Risiko, mit HIV- und Hepatitis-Viren infiziert zu wer-den, ist ebenfalls minimiert. Zur Erstellung einer Genombank muss die ge-samte zelluläre DNA durch Einwirkung von Restrik-tionsenzymen in Fragmente von 30.000–40.000 Basenpaare gespalten werden, die danach in einen 6

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geeigneten Vektor, z. B. Cosmid oder Virus, einge-baut und vermehrt werden. Die Genombank des Menschen würde bei 3,2 Milliarden Basenpaaren aus mindestens 80.000 verschiedenen Klonen bestehen. Zum Aufbau einer cDNA-Bank wird die zur zellulären mRNA komplementäre cDNA durch re-verse Transkription gewonnen und in der Regel in Expressionsvektoren kloniert (cDNA-Expressions-bibliothek). Die Anreicherung und Isolierung einzelner Klone aus einer Genbank erfolgt mittels Hybridi-sierung mit radioaktiv markierten Oligonucleotid-Sonden. Die PCR spielt dabei eine wichtige Rolle.

Bei Knockout-Mäusen wird durch so genanntes »Gene targeting« spezifisch die Funktion eines Gens ausge-schaltet. Solche Tiere eignen sich als Modellsysteme für menschliche Stoffwechselvorgänge und Krankheiten sowie Gentherapien (das Mausgenom ist zu 98% iden-tisch mit dem menschlichen Genom).

Transgene Tiere tragen in ihrem Genom zusätzlich zu ihren natürlichen Genen Fremdgene. Zu ihrer Über-tragung stehen viele Methoden zur Verfügung, z. B. die Injektion in eine befruchtete Eizelle oder in kultivierte embryonale Stammzellen bzw. die Anwendung von modifizierten Retroviren. Die Verwendung transgener Tiere bezieht sich auf:4 die Charakterisierung menschlicher Erkrankungen,4 Verwendung transgener Tiere als Gewebe- oder

Organspender,4 die Erzeugung pharmazeutisch relevanter Proteine

in Milchdrüsen.

5.2.10 Analyse von Nucleinsäuren

Auf die Blot-Techniken (Northern-, Southern-Blots) zur Darstellung von DNA-Fragmenten oder RNAs und die PCR wird auf GK Chemie, 7 Kap. 7.2 verwiesen.

KLINIKRFLP, der Restriktionsfragment-Längenpoly-morphismus lässt sich u. a. nutzen:5 in der Populationsgenetik,5 als genetischer Marker zur Durchführung

von Verwandtschaftsanalysen und zur Über-führung von Straftätern und

5 zur pränatalen Diagnostik vererbbarer Erkran-kungen.

Der genetische Fingerabdruck dient der Analyse genetischer Merkmale zur Identifizierung von Indi-viduen (Vaterschaft, Täter-Ermittlung). Der RFLP wird zusammen mit der PCR zur Charakterisierung hochvariabler DNA-Bereiche (Satelliten-DNA = keine Gene), die individualspezifisch sind, eingesetzt. Für die Analyse ist die DNA einer einzigen Zelle aus-reichend.

5.2.11 Abbau

Der Abbau von Nucleinsäuren findet abgesehen von den Prozessen im Verdauungstrakt im Zytoplasma statt. Endonucleasen (DNasen, RNasen) spalten im Inneren eines Polynucleotidstrangs unter Bildung von Oligonucleotiden. Exonucleasen setzen Nucleotide vom 5′- oder 3′-Ende frei. Beide Enzymgruppen spal-ten Phosphorsäurediesterbindungen hydrolytisch. Nu-cleinsäureabbauende Enzyme sind in den Lysosomen lokalisiert.

5.3 Faltung und Modifikation von Proteinen

5.3.1 Proteinfaltung

Die Einnahme der nativen Raumstruktur durch die synthetisierte Polypeptidkette ist ein thermodynamisch freiwilliger Prozess, der durch die Aminosäuresequenz bestimmt wird.

Die Ausbildung der Konformation erfolgt spontan langsam und wird in vivo durch die intrazellulären hohen Proteinkonzentrationen beeinträchtigt.

Für die Beschleunigung der Faltung werden in vivo Hilfsproteine genutzt:4 Proteindisulfidisomerasen beschleunigen die Aus-

bildung von Disulfidbrücken und korrigieren die Ausbildung von falsch gebildeten Disulfidbrücken.

4 Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerasen katalysie-ren die Umwandlung von cis-konfigurierten Peptid-bindungen am Prolin in die trans-Form.

4 Chaperone stabilisieren intermediäre Faltungs-strukturen und verhindern eine unspezifische Ag-gregation. Sie »trimmen« die neu synthetisierten Polypeptidketten in ihre richtige Konformation und verbrauchen dabei ATP. Einige Chaperone ge-hören zu den Hitzeschockproteinen, z. B. Hsp 70, die bei Temperaturerhöhung vermehrt gebildet werden.

6

5.3 · Faltung und Modifikation von Proteinen


5

Merke


Falsch gefaltete Proteine werden in den Proteaso-men abgebaut.

In vivo können lösliche Proteine mit vorwiegend α−Strukturen in β-Strukturen umgelagert werden, die zur Ausbildung unlöslicher Aggregate führen (7 Pri-onen-Erkrankungen, Alzheimer-Krankheit mit Amyloidbil-dung, GK Chemie, 7 Kap. 5.3).

5.3.2 Adressierung von Proteinen

Die Zielsteuerung der Proteine während und nach ihrer Synthese (Sortierung = »protein targeting«) in verschiedene Zellkompartimente oder zur Exozytose erfolgt durch spezifische Markierungen.4 Signalsequenzen bestimmen die Translokation von

Peptidketten während ihrer Synthese in das endo-plasmatische Retikulum.

4 Viele Sekret- und Membranproteine erhalten Oligo-saccharid-Sequenzen, die im endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Komplex via Dolicholphos-hat-aktivierter Oligosaccharide an die Proteine ge-bunden werden. Als spezieller Sortierungskomplex sendet der Golgi-Apparat Proteine zu Lysosomen, Sekretgranula oder in die Zellmembran.

4 Durch Mannose-6-Phosphat werden Proteine gekennzeichnet, die in Lysosomen transportiert werden.

4 Im Zytosol synthetisierte mitochondriale Proteine enthalten an ihrem N-Terminus spezifische Amino-säuresequenzen, die sich von den Signalsequenzen durch ihren hohen Arginingehalt unterscheiden.

4 Kleine im Zytosol synthetisierte Kernproteine durchdringen die Kernmembran leicht. Große Pro-teine (> 90 kDa) benötigen eine Kern-Lokalisa-tionssequenz und Energie in Form von ATP.

4 Die Verankerung zytosolischer Proteine in der Zellmembran geschieht durch N-Myristoyl- oder S-Palmitoyl-Gruppen oder die Bindung über Ge ranyl- oder Farnesylgruppen (Prenylreste) an C-terminale Cysteine von Membranproteinen. Ein Sonderfall ist der GPI-Anker für Acetylcholineste-rase.

5.3.3 Limitierte Proteolyse

Die limitierte Proteolyse ist eine posttranslationale Modifikation. Sie dient der Bildung aktiver Proteine aus inaktiven Vorstufen. Beispiele sind

4 die Umwandlung von Proenzymen in aktive pro-teolytische Enzyme,

4 die Umwandlung von Prohormonen in aktive Hor-mone.

Ein Prä-Pro-Protein (Prä-Pro-Insulin) wird über eine Signalsequenz in das endoplasmatische Re-tikulum überführt. Das nach Abspaltung der Signal-sequenz durch Signalasen entstanden Pro-Protein (Pro-Insulin) wird durch eine weitere limitierte Pro-teolyse in das aktive Protein (Insulin) gespalten. Das Tripeptid Glutathion ist kein posttransla-tionales Proteolyseprodukt, wie z. B. die Liberine des Hypothalamus. Es wird in 2 ATP-abhängigen Reaktionen aus Glutamat, Cystein und Glycin gebil-det. Die γ-Glutamyl-Cystein-Synthetase verknüpft Glutamat über seine γ-Carboxylgruppe mit Cystein. Die Glutathionsynthetase kondensiert das Dipeptid mit Glycin.

5.3.4 Proteinglycosylierung

Die Glycosylierung von Proteinen ist ein posttransla tio-nales Geschehen, welches im endoplasmatischen Retiku-lum und Golgi-Komplex stattfindet. Man unterscheidet O- und N-glycosidisch gebundene Oligosaccharide.

O-glycosidisch gebundene Kohlenhydratreste wer-den schrittweise durch Glycosyltransferasen als UDP-aktivierte Zucker auf die OH-Gruppe von Serin-, Threonin- und Hydroxylysinresten in den Proteinen übertragen.

Bei N-glycosidisch an Asparagin gebundenen Oli-gosacchariden wird die Zuckerstruktur in einem höher molekularen Vorläufermolekül an Dolicholphosphat synthetisiert, vom Dolicholphosphat auf das Protein übertragen und danach in die endgültige Struktur durch Abspaltung von Monosacchariden umgewandelt.

Die Biosynthese der Proteoglycane erfolgt durch schrittweise Übertragung der Disaccharideinheiten an die Core-Proteine.

KLINIKDurch eine ausbleibende Lysinhydroxylierung im Kollagen ist die Anlagerung von Glucose- Galactose-Disacchariden beeinträchtigt und die Fibrillenbil-dung der Kollagene gestört. Das Ehlers-Danlos-Syndrom VI ist durch eine Überdehnbarkeit der Haut, Überstreckung der Gelenke und Verformun-gen der Wirbelsäule gekennzeichnet.

599

5.3.5 Verankerung von Proteinen und Membranen

Die Bindung von Proteinen an der Zellmembran ge-schieht durch N-Myristoyl- oder S-Palmitoylgruppen oder die Bindung über Geranyl- oder Farnesylgruppen (Prenylreste) an C-terminale Cysteine von Membran-proteinen. Die gebundenen Proteine sind periphere Membranproteine. Ein Sonderfall ist der GPI-Anker (Glycosyl-Phosphatidylinositol-Anker) für Acetylcho-linesterase.

5.3.6 Nichtenzymatische Glycierung

Die nichtenzymatische Umsetzung von Glucose mit freien Aminogruppen von Proteinen, Lipiden (Phos-phatidylethanolamin) und DNA (Guanin) wird als Glycierung (nichtenzymatische Glucosylierung) be-zeichnet. Dabei reagiert die Carbonylgruppe der Glu-cose in ihrer azyklischen Form mit Aminen unter Aus-bildung eines Aldimins (Schiff ’sche Base), die sich über eine Amadori-Umwandlung in eine Aminoketose (Amadori-Produkt) umlagert. Amadori-Produkte werden durch Oxidationen, Dehydratisierungen und Gruppenumlagerungen in fortgeschrittene Glycierungs-produkte (advanced glycation end products, AGEs) überführt.

Die Glucose-Adducte führen zu Struktur- und Funk tionsänderungen von Proteinen. Durch Bindung an verschiedene Rezeptoren lösen sie oxidativen Stress und die Aktivierung verschiedener Signaltransduk-tionsketten aus. Die Glycierung ist eine physiologische, posttranslationale Modifikation, die unter den Bedin-gungen einer Hyperglykämie (Diabetes mellitus) patho-genetische Bedeutung erlangt.

KLINIKHämoglobin mit einer Halbwertszeit von 100–120 Tagen ist ein Maß für die Glycierung und damit die Höhe der Blutglucosekonzentration der letzten 6–8 Wochen. Die Bestimmung des glycierten HbA1c (Amadori-Produkt des Hb) ist der Gold- Standard zur Beurteilung des diabetischen Stoff-wechsels. Werte unter 7% sind bei einem Diabe-tiker als optimal zu bewerten. Normalwerte sind 4–6%. Sowohl Amadori-Produkte als auch die AGEs spielen bei der Entstehung der diabetischen Folge-erkrankungen, degenerativen Hirnerkrankungen (z. B. Alzheimer-Krankheit) und bei Amyloidosen anderer Genese eine Rolle.

5.4 Proteolyse

5.4.1 Proteasen

Einteilung und Mechanismen wurden im 7 Kap. 3.5.1 abgehandelt.

5.4.2 Lysosomale Proteasen

Die Einteilung dieser Enzyme und ihre Bedeutung u. a. für die Antigenpräsentation durch Makropha-gen im MHC-II-Komplex wurde im 7 Kap. 3.5.1 be-schrieben.

5.4.3 Zytosolische Proteolyse

Der Proteinabbau im Proteasom und seine Bedeutung für die Präsentation von Peptidantigenen im MHC-I-Komplex wurden im Komplex 7 Kap. 3.5.1 abgehandelt.

5.5 Tumorbiochemie

5.5.1 Kanzerogenese

Umwelt- und Ernährungsfaktoren sind bis zu 90% für Krebserkrankungen verantwortlich. Bei den übrigen 10% sind genetische und virale Faktoren sowie eine Strahlenexposition von Bedeutung.

Chemische Kanzerogene sind:4 polyzyklische Aromaten (z. B. Benzanthracen),4 aromatische Amine,4 sekundäre Amine, die mit Nitrit-Ionen Nitrosa-

mine bilden,5 Stilbenanaloga weiblicher Sexualhormone,5 alkylierende Substanzen.

Chemische Karzinogene entfalten ihre Wirkungen erst nach 20–30 Jahren. Sie werden im Organismus z. T. erst unter Beteiligung des Cytochrom P450-Systems in die aktiven Formen umgewandelt. Viele chemische Kanze-rogene können mit DNA interagieren und mutagene Wirkungen haben.

UV- und radioaktive Strahlungen wirken ebenfalls kanzerogen und mutagen.

Auch Viren können krebsauslösend sein. Onko-gene Viren wirken krebserzeugend durch die Integra-tion ihres Genoms in die Zelle, wobei bei DNA-Viren deren DNA direkt, bei RNA-Viren das durch reverse Transkription erzeugte Amplifikat in der Zell-DNA ge-bunden wird.

5.5 · Tumorbiochemie


5

Merke


Onkogene sind Gene, deren Genprodukte die Ur-sache für die Transformation gesunder Zellen zu Tumor-zellen sind.4 Virale Onkogene werden in das Zellgenom inte-

griert. Bei den DNA-Tumorviren besitzen die On-kogene nicht nur tumorinduzierende Wirkungen, sondern sind auch für die Replikation der Virus-DNA verantwortlich. Onkogene von Retroviren sind nur für die Zelltransformation von Bedeu-tung.

4 Zelluläre Onkogene leiten sich von Protoonko-genen ab, die als normale Bestandteile im Genom gesunder Zellen vorliegen. Die Umwandlung von Protoonkogenen in Onkogene erfolgt durch Muta-tionen.

Protoonkogene werden nach ihren zellulären Funk-tionen in 5 Gruppen eingeteilt:4 Wachstumsfaktoren, z. B. EGF, b-FGF, TGF,4 Rezeptoren, z. B. Tyrosinkinaserezeptoren für Wachs-

tumsfaktoren (EGF-R, PDGF-R),4 Proteine, die in Signaltransduktionswege einge-

bunden sind, z. B. Tyrosinkinasen, c-ras, Cycline,4 Transkriptionsfaktoren, wie jun, c-myc, c-fos,4 Tumorsuppressorgene, z. B. APC (benannt nach

Adenomatosis polyposis coli) oder Rb (benannt nach Retinoblastom).

Tumorsuppressorgene (Antionkogene) codieren Pro-teine, die Zellwachstum und Tumorbildung unter-drücken. Dazu gehören Gene, die verantwortlich sind für die Reparatur von DNA-Schäden oder für die Chro-mosomenstabilität, sowie Gene, die die Zellvermeh-rung und Alterung sowie die Expression von Proto-onkogenen und ihre Expression kontrollieren.

Die physiologische Funktion dieser Gene besteht nicht in der Unterdrückung neoplastischen Wachs-tums, sondern in der Kontrolle von Proliferation und Differenzierung von Zellen. Das p53-Protein ist das bedeutendste Suppressor-Genprodukt, weil Verände-rungen des p53-Gens am häufigsten bei menschlichen Tumoren gefunden wurden.

p53 ist ein nucleäres Phosphoprotein, welches wahrscheinlich als Transkriptionsaktivator dient. p53 hemmt den Übergang von der G1- in die S-Phase bei DNA-Schädigungen und wird bei DNA-Schäden vermehrt gebildet. Es hemmt die Phosphorylierung von Rb. Damit kann die Zelle nicht von der G1- in die S-Phase gelangen. p53 kann auch die Apoptose aktivieren.

p53 sorgt dafür, dass eine Zelle sich nur dann teilt, wenn ihre Informationszentrale intakt ist. Rb ist ein Protein des Zellkerns wie p53. Es wird durch Phosphorylierung durch Cdk’s inaktiviert und leitet durch Freisetzung von Wachstumsfaktoren die S-Phase ein.

Rb ist bei mehr als 60% aller menschlichen Tumo-ren und p53 bei mehr als 50% aller Tumoren mutiert oder deletiert. Für die Tumorentstehung sind wahr-scheinlich Veränderungen in beiden Allelen von Tumor-suppressorgenen notwendig.

KLINIKTumoren mit mutierten Rb- und p53-Proteinen haben eine schlechte Prognose. Bei ihnen spricht auch eine Chemo- und Strahlentherapie nur un-genügend an.

Das APC-Gen ist bei Dickdarmtumoren das am häufigsten mutierte Gen. Es codiert für Catenine, die mit Cadherinen assoziiert sind und deren Ver-bindung zu den Aktinfilamenten des Zytoskeletts vermitteln. Catenine spielen zudem eine Rolle bei Signalübertragungen. Beim Retinoblastom liegt eine Mutation im Rb-Gen vor.

5.5.2 Therapie

Zytostatika werden zur medikamentösen Tumorthera-pie verwendet. Sie werden eingeteilt in4 Antimetabolite: Strukturanaloga von Purinen und

Pyrimidinen oder Nucleosiden,4 Alkylierende Verbindungen: die Wirkung des

Cyclophosphamids beruht auf einer Alkylierung der DNA und ihrer Vernetzung sowie fehlerhaften Basenpaarungen; es wird auch als Immunsuppres-sivum verwendet. Methansulfonsäureester wie Busulfan rufen ebenfalls Vernetzungen der DNA hervor.

4 Zytostatisch wirkende Antibiotika lagern sich zwischen die DNA-Stränge und hemmen die Repli-kation.

4 Mitose-Hemmstoffe sind z. B. Vinca-Alkaloide und Colchicin.

5101

Fallbeispiel

5.5.3 Apoptose

Apoptose ist der programmierte Zelltod. Sie steht dem durch Noxen induzierten Zelltod, der Nekrose, gegen-über, die durch Autolyse gekennzeichnet ist.

Kennzeichen der Apoptose sind: Schrumpfen der Zellen, charakteristische Fragmentierung der DNA, Auflösung der Zellmembran in Vesikel und Phagozyto-se der Zellreste.

Apoptose wird ausgelöst durch4 Todesrezeptoren, integralen Membranproteinen

aus der TNF-Rezeptor-Familie (z. B. CD95). Nach Bindung entsprechender Liganden wird ein Adap-terprotein aktiv, welches die Aktivierung der Cas-pasen (Proteolyse 7 Kap. 3.5) einleitet.

4 Freisetzung von Cytochrom c und Bindung an Apaf-1, welches nach ATP-abhängiger Oligomeri-sierung die Caspase 9 aktiviert (7 Kap. 3.5).

Ein etwas übergewichtiger 56-jähriger Patient kommt in die Sprechstunde seines Hausarztes und klagt über anfallsartige Schmerzen im Grundgelenk der 1. Zehe beider Füße. Er habe diese Schmerzen schon häufiger gespürt, sie seien aber immer wieder von alleine verschwunden. Auf Nachfrage berichtet er, dass er am vergangenen Wochenende ein Familienfest ge-feiert habe und gut gegessen und getrunken habe. Auch sonst esse er gern viel Fleisch und trinke regel-mäßig abends ein bis zwei Flaschen Bier. Bei der körperlichen Untersuchung fallen eine Rötung, Schwellung und Druckempfindlichkeit über

den betroffenen Stellen auf. Differenzialdiagnostisch kommt neben der Hyperurikämie mit Gicht auch die rheumatoide Arthritis in Betracht. Eine Harnsäurebe-stimmung im Blut allerdings zeigt eine deutliche Erhö-hung der Uratkonzentration, was die Hyperurikämie beweist. Zur Behandlung erhält der Patient für den aku-ten Anfall nicht steroidale Antiphlogistika (z. B. Diclo-fenac), sowie einen Xanthinoxidase Hemmer (z. B. Allopurinol). Des Weiteren empfiehlt der Hausarzt eine Reduktion des Fleisch- und Alkoholkonsums sowie eine Reduktion des Körpergewichts und reichlich Flüssig-keitszufuhr.

5.5 · Tumorbiochemie

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