Bioorganische ChemieEnzymatische Katalyse 2011
Prof. Dr. A. Jäschke
INF 364, Zi. 308, Tel. 54 48 51 [email protected]
Ringvorlesung Chemie B - Studiengang Molekulare Biotechnologie
4. Beispiel: Nucleosidmonophosphat-Kinasen
Enzymfamilie
Die Core-Domäne der NMP-Kinasen
Gly-X-X-X-X-Gly-Lys
Die P-Schleife interagiert mit der Phosphorylgruppe des ATP
Komplexe von NTPs mit Mg2+
sind die eigentlichen Substrate für alle NTP-abhängigen Enzyme
Rolle: 1. Neutralisation, unspez. Wechselwirkungen2. definierte Konformation3. Zusätzliche Kontaktstellen - Bindungsenergie
Rolle der gebundenen Wassermoleküle
Die Bindung von ATP induziert starke Konformationsänderungen
Mechanismus
• Deckel klappt zu
• 2. Substrat (NMP) wird gebunden – weitere Konformationsänderung - Triphosphat in direkter Nähe zum Monophosphat
• Aktive Enzymkonformation entsteht nur, wenn beide Substrate gebunden sind – Verhinderung der Konkurrenz durch Wasser
• Katalyse durch Annäherung
Zusammenfassung
• Zentrales Thema: Stabilisierung des Übergangszustandes
• 5 grundlegende Strategien:– Verwendung der Bindungsenergie– Kovalente Katalyse– Allg. Säure-Base-Katalyse– Metallionenkatalyse– Katalyse durch Annäherung
Zusammenfassung
• Proteasen ermöglichen eine schwer durchführbare Reaktion
• Carboanhydrasen machen eine schnelle Reaktion noch schneller
• Restriktionenzyme führen hochspezifische Spaltungsreaktionen aus
• NMP-Kinasen katalysieren den Austausch von Phosphorylgruppen ohne vorübergehende Hydrolyse
Hammerhead ribozyme(RNase)
Synthetic variation(cleaves in trans)
You are in charge of what it will cleave
Molecular Scissors
Ribozymes- history
1982 Cech: Tetrahymena rRNA intron is self-spliced out
Altman and Pace: Ribonuclease P RNP: RNA component alone can process the 5’ ends of tRNAs
Mitochondrial group I introns also can self-splice
Then group II introns in mitochondria (lariat-formers)
Mutations (100’s):Internal guide sequencesecondary structure
Conserved base analysis (100’s) confirms structure
X-ray diffraction: a few 3-D structures
Free guanosine
Self-cleavage viathe hammerhead motif
Hammerhead ribozyme (self-cleavage): plant viroids and human delta virus (with Hepatitis C)
Ribozyme mechanisms
Zum Vergleich: RNase A
Katalytische Strategien
• Architektur des katalytischen Zentrums
• Aktivierung des Nukleophils
• Stabilisierung des Übergangszustandes
• Protonierung der Abgangsgruppe
Weitere katalytische Aktivitäten –künstliche Ribozyme
Rationales
• Exporation of the catalytic bandwidthof RNA
• Understand structural and mechanisticprinciples
• Compare with protein enzymes, deducegeneral governing principles
Catalysis of C-C bond formation by ribozymes
Diene
Dienophile
Otto Diels Kurt Alder(1876-1952) (1902-1958)
The Diels-Alder reaction
Ose et al. Nature 2003
Catalysis of Diels-Alder reactions in Nature
Mevinolin(Aspergillus terreus)
Alflabene(Alpinia flabellata)
Carpanone(Cinnamomum sp.)
•Secondary metabolites thought to be biosynthesized via Diels-Alder reaction:
First solved structure of an enzyme which is assumedto catalyze a Diels Alder Reaktion by Ose et al.:
•Macrophomate Synthase (MPS)
To date, there is no solid proof for the existence ofDiels-Alderases in Nature.
Solanapyrones A(Alternaria solani)
HJ Kim et al. Nature 473, 109-112 (2011) doi:10.1038/nature09981
The spinosyn aglycone biosynthetic pathway.
Artificial biopolymeric Diels-Alder catalysts
catalytic antibodies(Abzymes)
catalytic RNA(Ribozymes)
Abzyme1E9
1.– SO22. [Ox.]
1E9 + TSA
+
+
Ribozyme
•hydrophobic interactions•1 hydrogen bond
Involved Interactions:
structure and mechanism ?
Seelig & JSeelig & Jääschke, schke, Chem. Biol.Chem. Biol. 19991999 (6) 167(6) 167--176176
Seelig & JSeelig & Jääschke, schke, Chem. Biol.Chem. Biol. 19991999 (6) 167(6) 167--176176
Catalytic minimal motiv
The hallmarks of enzymaticcatalysis – saturation behaviour &
multiple turnovers
Seelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & JSeelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & Jääschke, A. schke, A. AngewAngew. Chem.. Chem. 20002000 (112) 4764(112) 4764--4768.4768.
The hallmarks of enzymatic catalysis - Stereoselectivity
R,R product S,S product
Seelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & JSeelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & Jääschke, A. schke, A. AngewAngew. Chem.. Chem. 20002000 (112) 4764(112) 4764--4768.4768.
The crystal structure of the Diels-Alderase ribozyme
RNA – product interactions
Serganov, A., Keiper, S., Malinina, L., Serganov, A., Keiper, S., Malinina, L., TereschkoTereschko, V., , V., SkripkinSkripkin, E., , E., HHööbartnerbartner, C., , C., PolonskaiaPolonskaia, A., , A., PhanPhan, A. T. , Wombacher, R., Micura, R., , A. T. , Wombacher, R., Micura, R., DauterDauter, Z., J, Z., Jääschke, A., Patel, D. J.: schke, A., Patel, D. J.: Nature Nature StructStruct. . Mol. Biol.Mol. Biol. 20052005 (12) 218(12) 218--224.224.
Comparison with Protein Diels-Alderases
Hugot et al. PNAS 2002 (99) 9674-9678.
Architecture
Mechanistic considerations
• Catalysis by „approximation“ in a hydrophobic pocket
• Stabilisation of the transition state by shape complementarity
• Destabilisation of diene substrate towards the transition state
• Electronic effects
G9
U17
RNA mutationsSubstrate mutations
RNA-product interactions
A3
Atomare Mutagenese