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1 Master Seminar Fluoreszenzmessung an roten Blutzellen Claudia Hahn 30.05.2012.

Date post:06-Apr-2015
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  • Folie 1
  • 1 Master Seminar Fluoreszenzmessung an roten Blutzellen Claudia Hahn 30.05.2012
  • Folie 2
  • 2 Inhalt Einleitung Stokes Shift Qualitative und quantitative Messung Fluoreszenzmikroskop Nachweis des Proteins NHE 7 Problem des Fluoreszenznachweises Zusammenfassung
  • Folie 3
  • 3 Einleitung Fluoreszenz: Fhigkeit der Absorption von Photonen und die sptere Abgabe eines Teils der absorbierten Energie Energie von Photonen: E = hv Betrachtung des Photons als Welle: E = hc/ Photonen geringer Wellenlnge besitzen eine hhere Energie als langwellige Photonen
  • Folie 4
  • 4 http://www2.uni-siegen.de/dept/fb08/studium/pcfprakt/pics/jablonski.gif
  • Folie 5
  • 5 Stokes Shift Bei der Emission der Fluoreszenz wird zustzlich Wrme abgegeben Folge: Anregungswellenlnge ist kleiner also Energiereicher Emissionswellenlnge ist grer also Energiermer Der Shift (Verschiebung) betrgt 20-50 nm http://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/img_fluoreszenz/stokes-shift.png
  • Folie 6
  • 6 Emissionswellenlnge so whlen, dass sie keine andere Fluoreszenz hervorruft, die die eigentliche berlagert Bei mehreren Parametern Emissions- und Anregungswellenlngen drfen sich nicht berlagern
  • Folie 7
  • 7 Qualitative und Quantitative Messung Qualitative Messung nderung der Intensitt durch Bindung des Liganden (Fluo-4) => Keine Messung der Konzentration mglich http://www.systektum.de/uploads/pics/20.4.1.Signalauswertung_Intensit_tsmessung_1.jpg
  • Folie 8
  • 8 http://www-user.tu-chemnitz.de/~awill/diplom/Bilder/abb3_3.gif Quantitative Messung Abhngig von Ligandenkonzentration => nderung der Anregungs- und Emissionsspektren (Fura-2) => Konzentrationsbestimmung mglich
  • Folie 9
  • 9 Fluoreszenzmikrokop http://www.zoologie-skript.de/methoden/fluo/epifluol.jpg
  • Folie 10
  • 10 Nachweis des Proteins NHE 7 1 L gewaschene Erythrocyten in 1 ml PBS suspendiert Primrantikrper (1 Stunde) Zugabe des Sekundrantikrpers (Rhodamin gebunden) (1 Stunde) => Fluoreszenzmikroskopie
  • Folie 11
  • 11 Diplomarbeit Jennifer Lang, Universitt des Saarlandes
  • Folie 12
  • 12 Kontrollmessung im FACS Diplomarbeit Jennifer Lang, Universitt des Saarlandes
  • Folie 13
  • 13 Messergebnis der behandelten Zellen Diplomarbeit Jennifer Lang, Universitt des Saarlandes
  • Folie 14
  • 14 Problem des Fluoreszenznachweises Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007
  • Folie 15
  • 15 Problem des Fluoreszenznachweises Bindestelle des primren Antikrpers ist am C-terminalen Ende von NHE 7 Antikrper muss durch die Membran diffundieren Der sekundre Antikrper muss ebenfalls durch die Membran diffundieren Am sekundren Antikrper ist Rhodamin gebunden Damit die Diffusion gewhrleistet werden kann muss die Membran durchlssig gemacht werden Verwendung verschiedener Suspensionslsungen
  • Folie 16
  • 16 PBS mit Triton-X Triton-X = Detergenz Permeabilisierung der Zellmembran Zunchst Test des Verhaltens der Zellen Diplomarbeit Jennifer Lang, Universitt des Saarlandes
  • Folie 17
  • 17 PBS mit Glycerin Suche nach Substanz, die Zellen permeabel machen aber nicht zerstren => Glycerin Diplomarbeit Jennifer Lang, Universitt des Saarlandes
  • Folie 18
  • 18 Mikroskopie der Zellen in PBS und Glycerin Viel Hintergrundfluoreszenz Keine spezifische Fluoreszenz erkennbar Diplomarbeit Jennifer Lang, Universitt des Saarlandes
  • Folie 19
  • 19 PBS mit DMSO Zunchst der Test ob die Zellen hmolysieren Geringfgige Formnderung, aber keine Hmolyse Diplomarbeit Jennifer Lang, Universitt des Saarlandes
  • Folie 20
  • 20 Auch hier konnte nur Hintergrundfluoreszenz gemessen werden Diplomarbeit Jennifer Lang, Universitt des Saarlandes
  • Folie 21
  • 21 Zusammenfassung der betrachteten Versuche Die hier vorgestellten Substanzen hatten keinen Einfluss auf die Permeabilitt der beiden Antikrper Neue Methoden zur Permeabilisierung der Membran mssen gefunden werden Verwendung eines anderen sekundren Antikrpers (Rhodamin evtl. zu gro) Empfindlichere Nachweise: FACS oder konfokales Mikroskop Andere Nachweismethoden als Fluoreszenz einsetzen
  • Folie 22
  • 22 Referenzen Attaphitaya S, Park K and Melvin JE. Molecular cloning and functional expression of a rat Na+/H+ exchanger (NHE5) highly expressed in brain. J Biol Chem 274: 4383-4388, 1999. Baird NR, Orlowski J, Szabo EZ, Zaun HC, Schultheis PJ, Menon AG and Shull GE. Molecular cloning, genomic organization, and functional expression of Na+/H+ exchanger isoform 5 (NHE5) from human brain. J Biol Chem 274: 4377-4382, 1999. Bookstein C, DePaoli AM, Xie Y, Niu P, Musch MW, Rao MC and Chang EB. Na+/H+ exchangers, NHE-1 and NHE-3, of rat intestine. Expression and localization. J Clin Invest 93: 106-113, 1994. Bookstein C, Musch MW, DePaoli A, Xie Y, Rabenau K, Villereal M, Rao MC and Chang EB. Characterization of the rat Na+/H+ exchanger isoform NHE4 and localization in rat hippocampus. Am J Physiol 271: C1629-38, 1996. Goyal S, Vanden Heuvel G and Aronson PS. Renal expression of novel Na+/H+ exchanger isoform NHE8. Am J Physiol 284: F467-F473, 2003.
  • Folie 23
  • 23 Hoogerwerf WA, Tsao SC, Devuyst O, Levine SA, Yun CH, Yip JW, Cohen ME, Wilson PD, Lazenby AJ, Tse CM and Donowitz M. NHE2 and NHE3 are human and rabbit intestinal brush-border proteins. Am J Physiol 270: G29-41, 1996. Kapus A, Grinstein S, Wasan S, Kandasamy R and Orlowski J. Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+ exchanger stably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence, osmotic sensitivity, and role in cell proliferation. J Biol Chem 269: 23544- 23552, 1994. Lang J, Untersuchungen zur Existenz von NHE-Isoformen in Plasmamembranen humaner Erythrozyten 2012 Numata M and Orlowski J. Molecular cloning and characterization of a novel Na+,K+/H+ exchanger localized to the trans-Golgi network. J Biol Chem 276: 17387-17394, 2001. Numata M, Petrecca K, Lake N and Orlowski J. Identification of a mitochondrial Na+/H+ exchanger. J Biol Chem 273: 6951-6959, 1998. Pizzonia JH, Biemesderfer D, Abu AA, Wu MS, Exner M, Isenring P, Igarashi P and Aronson PS. Immunochemical characterization of Na+/H+ exchanger isoform NHE4. Am J Physiol 275: F510-F517, 1998. Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007
  • Folie 24
  • 24 Vielen Dank fr Ihre Aufmerksamkeit
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