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Master Seminar

Fluoreszenzmessung an roten Blutzellen

Claudia Hahn

30.05.2012

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Inhalt

Einleitung

Stokes Shift

Qualitative und quantitative Messung

Fluoreszenzmikroskop

Nachweis des Proteins NHE 7

Problem des Fluoreszenznachweises

Zusammenfassung

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Einleitung

Fluoreszenz:Fähigkeit der Absorption von Photonen und die spätere Abgabe eines Teils der absorbierten Energie

Energie von Photonen:E = hvBetrachtung des Photons als Welle:E = hc/λ

Photonen geringer Wellenlänge besitzen eine höhere Energie als langwellige Photonen

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http://www2.uni-siegen.de/dept/fb08/studium/pcfprakt/pics/jablonski.gif

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Stokes Shift

Bei der Emission der Fluoreszenz wird zusätzlich Wärme abgegeben

Folge:Anregungswellenlänge ist kleiner also EnergiereicherEmissionswellenlänge ist größer also Energieärmer

Der Shift (Verschiebung) beträgt 20-50 nm

http://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/img_fluoreszenz/stokes-shift.png

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Emissionswellenlänge so wählen, dass sie keine andere Fluoreszenz hervorruft, die die eigentliche überlagert

Bei mehreren Parametern Emissions- und Anregungswellenlängen dürfen sich nicht überlagern

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Qualitative und Quantitative Messung

Qualitative Messung

Änderung der Intensität durch Bindung des Liganden (Fluo-4)=> Keine Messung der Konzentration möglich

http://www.systektum.de/uploads/pics/20.4.1.Signalauswertung_Intensit_tsmessung_1.jpg

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http://www-user.tu-chemnitz.de/~awill/diplom/Bilder/abb3_3.gif

Quantitative Messung

Abhängig von Ligandenkonzentration => Änderung der Anregungs- und Emissionsspektren (Fura-2)=> Konzentrationsbestimmung möglich

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Fluoreszenzmikrokop

http://www.zoologie-skript.de/methoden/fluo/epifluol.jpg

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Nachweis des Proteins NHE 7

1 µL gewaschene Erythrocyten in 1 ml PBS suspendiert

Primärantikörper (1 Stunde)

Zugabe des Sekundärantikörpers (Rhodamin gebunden) (1 Stunde)

=> Fluoreszenzmikroskopie

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Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

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Kontrollmessung im FACS

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

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Messergebnis der behandelten Zellen

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

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Problem des Fluoreszenznachweises

Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

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Problem des Fluoreszenznachweises

Bindestelle des primären Antikörpers ist am C-terminalen Ende von NHE 7 Antikörper muss durch die Membran diffundieren

Der sekundäre Antikörper muss ebenfalls durch die Membran diffundieren

Am sekundären Antikörper ist Rhodamin gebunden

Damit die Diffusion gewährleistet werden kann muss die Membran durchlässig gemacht werden Verwendung verschiedener Suspensionslösungen

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PBS mit Triton-X

Triton-X = Detergenz

Permeabilisierung der Zellmembran

Zunächst Test des Verhaltens der Zellen

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

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PBS mit Glycerin

Suche nach Substanz, die Zellen permeabel machen aber nicht zerstören=> Glycerin

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

1818

Mikroskopie der Zellen in PBS und Glycerin

Viel Hintergrundfluoreszenz Keine spezifische Fluoreszenz erkennbar

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

1919

PBS mit DMSO

Zunächst der Test ob die Zellen hämolysieren

Geringfügige Formänderung, aber keine Hämolyse

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

2020

Auch hier konnte nur Hintergrundfluoreszenz gemessen werden

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

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Zusammenfassung der betrachteten Versuche

Die hier vorgestellten Substanzen hatten keinen Einfluss auf die Permeabilität der beiden Antikörper

Neue Methoden zur Permeabilisierung der Membran müssen gefunden werden

Verwendung eines anderen sekundären Antikörpers (Rhodamin evtl. zu groß)

Empfindlichere Nachweise: FACS oder konfokales Mikroskop

Andere Nachweismethoden als Fluoreszenz einsetzen

2222

Referenzen

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Hoogerwerf WA, Tsao SC, Devuyst O, Levine SA, Yun CH, Yip JW,Cohen ME, Wilson PD, Lazenby AJ, Tse CM and Donowitz M. NHE2and NHE3 are human and rabbit intestinal brush-border proteins. Am JPhysiol 270: G29-41, 1996.Kapus A, Grinstein S, Wasan S, Kandasamy R and Orlowski J.Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+ exchangerstably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence,osmotic sensitivity, and role in cell proliferation. J Biol Chem 269: 23544-23552, 1994.Lang J, Untersuchungen zur Existenz von NHE-Isoformenin Plasmamembranen humaner Erythrozyten 2012Numata M and Orlowski J. Molecular cloning and characterization of anovel Na+,K+/H+ exchanger localized to the trans-Golgi network. J BiolChem 276: 17387-17394, 2001.Numata M, Petrecca K, Lake N and Orlowski J. Identification of amitochondrial Na+/H+ exchanger. J Biol Chem 273: 6951-6959, 1998.Pizzonia JH, Biemesderfer D, Abu AA, Wu MS, Exner M, Isenring P,Igarashi P and Aronson PS. Immunochemical characterization ofNa+/H+ exchanger isoform NHE4. Am J Physiol 275: F510-F517, 1998.Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit