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IDENTIFIZIERUNG VON MIKROORGANISMEN

Identifizierung von Bakterien heißt, so

wenige Eigenschaften wie möglich und so

viele wie notwendig zu bestimmen, um

einer unbekannten Kultur ihren Platz im

Nomenklatur zuzuordnen und sie damit

auch benennen zu können.

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Grundsätzlich können 3 Gruppen von Eigenschaften für die

Identifizierung herangezogen werden:

• Morphologische Merkmale: Gram-Verhalten, Form, Größe,

Kapsel

• Physiologische Merkmale: Nachweis verschiedener Enzyme

wie Katalase, Koagulase

• Chemische Merkmale: DNA-Struktur, Zellwand-Aufbau

Unter Taxonomie (Systematik) versteht man

das Beschreiben und Ordnen der Lebewesen

in einem hierarchischen System.

Dieses beginnt mit der umfassendsten

Einheit und endet mit der kleinsten Einheit.

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Reich (Procaryotae), Division, Klasse, Ordnung,

Familie,

Gattung (Genus)

Art (Spezies, sp.)

Unterarten (Subspezies, spp.)

Bakterienstämme

Die Reihenfolge der einzelnen Kategorien (Taxa, Singular = Taxon) lautet:

Jedes Taxon umfasst alle ihr nachgeordneten Taxa, d.h. z.B.

in eine Gattung werden alle diejenigen Arten, die

miteinander ähnliche Merkmale haben, eingeordnet.

Einer Familie werden ähnliche Gattungen zugeordnet usw.

Die Art als kleinste Einheit umfasst diejenigen

Bakterienstämme die in ihren Eigenschaften

übereinstimmen.

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Biochemische Tests

Plasmakoagulase

Dieses von S. aureus gebildete Exo-Enzym führt zur Verklumpung von

Plasma. Die Mechanismen sind denen der physiologischen

Blutgerinnung ähnlich, aber nicht ident.

Die pathogenetische Bedeutung der Koagulase liegt in der Bildung

eines Fibrinschutzwalles um die in das Gewebe eingedrungenen

Staphylokokken.

Dieser Fibrinschutzwall kann später, nach entsprechender

Vermehrung, durch das von Staphylokokkenzellen gebildete

Fibrinolysin wieder aufgelöst werden.

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Plasmakoagulase

Die durch ungestörte Vermehrung ihrer Zellzahl und damit

auch ihrer pathogenen Potenz verstärkten Staphylokokken

können sich dann in die Umgebung ausbreiten.

Anwendung: Differenzierung von S. aureus und Koagulase-

negativen Staphylokokken

S. aureus: Verklumpung, S. epidermidis: keine

Verklumpung

Katalase

Die Eigenschaft eines Keimes, eine 3%ige

Wasserstoffperoxidlösung mittels Katalase in Wasser und

Sauerstoff (Gasbläschen) abzubauen, ist ein wichtiges

Differenzierungsmerkmal in der Bakteriendiagnostik.

Die Katalaseaktivität einer Kultur läßt sich einfach prüfen,

indem man sie direkt oder nach Übertragung einer kleinen

Menge Koloniemasse auf einen Objektträger mit 3%iger

H2O2-Lösung übergießt.

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Katalase

Aufsteigende Gasblasen (02) zeigen die Anwesenheit

des Enzyms an. Die Katalase ist ein

Atmungskettenenzym und wird in der

Routinediagnostik vorwiegend zur Differenzierung von

Staphylokokken und Streptokokken verwendet.

Staphylokokken: Katalase-positiv (Schaumbildung)

Streptokokken: Katalase-negativ

Man erhält eine relativ scharf begrenzte Hämolysezone um die Kolonien, die Erythrozyten sind aufgelöst, und der Blutfarbstoff ist abgebaut, sodaß eine klare Zone im sonst undurchsichtigen Blutagar entsteht (ß-Hämolyse).

Hämolyse

7

Um die Kolonien findet man grüne Höfe von

unterschiedlicher Farbintensität, in deren Bereich der

Blutfarbstoff aufgelöst ist, während die

Erythrozytenmembran weitgehend erhalten bleibt (-

Hämolyse).

-Hämolyse: Fehlende Veränderungen des Blutagars,

keine Hämolyse!

Hämolyse

Cytochromoxidase-Test

Oxidase test dient zur Abgrenzung der

Enterobakterien von anderen Gram-negativen Keimen

wie z.B. Pseudomonaden oder Aeromonaden.

Der Nachweis von Cytochromoxidase erfolgt durch Auftropfen von

Oxidasereagenz (1%iges -Naphthol und N,N,Dimethyl-p-

phenylendiammoniumdichlorid) auf die verdächtigen Kolonien.

Oxidase-positive Kolonien färben sich etwa nach 30 Sekunden

dunkelblau (Indophenol-Blau), Oxidase-negative Kolonien bleiben

unverändert.

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Cytochromoxidase-Test

Mit dem Cytochrom-Oxidase-Test werden Bakterien erfaßt,

die Cytochrom c als Respirationsenzym enthalten.

Der Farbstoff N, N-Dimethyl-p-phenylen-

diammoniumchlorid fungiert dabei als künstlicher

Elektronenakzeptor.

In der reduzierten Form ist er farblos, bei Vorhandensein

von Cytochromoxidase und Luftsauerstoff, wird er oxidiert,

wobei sich ein blauer Indophenolkomplex bildet.

Cytochromoxidase-Test

N

CH3 H3C

NH2

+

N

CH3 H3C

OH

N

O

Dimethyl-p- pheny lenediamin

e

alpha-Naphtol

------------->

Indophenol blue

+ 4H + 4e

Bei Zusatz einer wäßrigen Lösung von oben genannten

Farbstoff und einer 1 %-igen alkoholischen Lösung von

- -Naphtol zum Zellmaterial spielt sich folgende

Reaktion ab:

9

Cytochromoxidase-Test

positive Reaktion

negative Reaktion

Oxidations/Fermentations-Test

O/F-Test wird z.B. zur Differenzierung von Mikrokokken

(Oxidation) und Staphylokokken (Fermentation)

verwendet.

Für den Fermentationstest wird das beimpfte

Agarröhrchen mit sterilem Paraffinöl überschichtet.

Eine positive Reaktion manifestiert sich im Umschlag des

Indikators im Zuckernährboden.

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MUG TEST

Das fluorogene Substrat MUG wird durch das Enzym

ß-D-Glucuronidase gespalten. Methylumbelliferon

ist als Spaltprodukt fluoreszenzoptisch nachweisbar.

Eine blaue Fluoreszenz des Nährbodens weist auf die

Anwesenheit von Methylumbelliferon hin.

Der E. coli-Nachweis ist erbracht, wenn Fluoreszenz

nachweisbar ist und der Indoltest positiv ausfällt.

ß-Galactosidase (Lactase) ist ein intrazelluläres Enzym, das

Lactose zu Galactose und Glucose abspaltet.

Lactose wird durch Lactose-Permease in die Zelle transportiert

und durch ß-Galactosidase gespalten.

o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid (ONPG)

ß-Galactosidase setzt Nitrophenol aus ONPG frei

Innerhalb der Enterobakterien ist diese Reaktion das wichtigste

Unterscheidungsmerkmal von coliformen Bakterien.

ONPG

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Äsculinhydrolyse

Enterokokken (D-Streptokokken) hydrolysieren das

Glucosid Äsculin (ß-Glucose-6,7-dihydroxycumarin) zu

Glucose und Äsculetin (6,7-dihydroxycumarin), welches mit

Eisen(III)-Ionen einen olivgrünen bis schwarzen Komplex

bildet.

ß-D-GLUCOSIDASE

Äsculin ist unter UV-Bestrahlung bei 365 nm fluoreszierend,

das Endprodukt Äsculetin aber nicht.

IDENTIFIZIERUNG VON MIKROORGANISMEN

API 10 ist ein miniaturisiertes System zur

Identifizierung von Enterobakterien und

anderen Gram-negativen Stäbchen mit Hilfe

von standardisierten biochemischen

Reaktionen.

Do

Ü6

12

Der API 10 Streifen besteht aus 10 Mikroröhrchen, in denen sich

verschiedene Substrate in dehydratisierter Form befinden.

Die Röhrchen werden mit der zu untersuchenden Bakteriensuspension

beimpft, welche die Substrate löst.

Die biochemischen Reaktionen können anhand von Farbumschlägen

abgelesen werden, die entweder spontan während der Inkubation oder

nach Zugabe von Reagenzien entstehen.

BUNTE REIHE

Vorbereitung des Streifens:

Eine Inkubationswanne mit Deckel bereitstellen und zur Herstellung einer feuchten Kammer 3 ml Wasser in die Wanne geben.

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Vorbereitung des Streifens:

Die Nummer der Untersuchungsprobe auf dem dafür vorgesehenen Teil der Inkubationswanne notieren.

Den Streifen aus der Verpackung nehmen und in die Inkubationswanne legen.

Keimsuspension

Ein Röhrchen mit 3 ml sterilem Aqua dest.

Die Bakterien im Suspensionsmedium

sorgfältig homogenisieren.

Trübung: milchig

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Beimpfung des Streifens:

Diese Suspension mit der Pasteur Pipette in die Mikroröhrchen pipettieren.

Becherchen

Röhrchen

Becherchen und Röhrchen füllen

Röhrchen füllen

Beimpfen des API-Streifens

Paraffin

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Beimpfung des Streifens:

Bei CIT Becherchen und Röhrchen füllen.

Für die anderen Reaktionen nur Röhrchen füllen.

Die unterstrichenen Reaktionen LDC, ODC, H2S

und URE hoch mit Paraffinöl überschichten.

Die Inkubationswanne schließen und bei 37°C/ 24

Stunden inkubieren.

a) 1 Tropfen Oxidasereagenz auf die Bakterienkolonie geben. b) Bei positiver Reaktion tritt innerhalb von 1-2 Minuten eine dunkle blau-violette Färbung auf. C) Die Oxidasereaktion auf dem Ergebnisblatt als 11. Test notieren.

•negative Reaktionpositive Reaktion

Die Oxidasereaktion nach folgender Methode prüfen:

16

Auswertung

Reagenzien eintropfen

17

API 10 S

Auswertung der Übungsstämme

Aeromonas hydrophila

18

Citrobacter freundii

Escherichia coli

19

Klebsiella pneumoniae

Proteus mirabilis

20

ONPG: ß-Galactosidase spaltet o-Nitrophenyl-ß-D-Galactosid (ONPG)

und weist daher auf die Lactoseverwertungsfähigkeit hin. Es wird

gelbes o-Nitrophenol aus farblosem ONPG freigesetzt. Die

Gelbverfärbung weist auf die positive Reaktion hin.

GLUCOSE und ARABINOSE: Der Verbrauch von Kohlenhydrat führt zur

Säurebildung und einem anschließenden pH-Rückgang. Der Indikator

Bromthymolblau schlägt von blau nach gelb um. Die Fermentation der

Kohlenhydrate setzt in dem am stärksten anaeroben Teil (Boden) des

Röhrchens ein. Diese Reaktionen werden deshalb im Röhrchen von

unten nach oben abgelesen.

LDC: Lysindecarboxylase baut Lysin zu Cadaverin ab. Dieses Amin

bewirkt einen pH-Anstieg in dem säuregepufferten System und ein

Umschlagen des Indikators Phenolrot von gelb nach orange.

ODC: Ornithindecarboxylase wandelt Ornithin in Putrescin (ein

basisches Amin) um. Dies bewirkt einen pH-Anstieg und ein

Umschlagen des Indikators Phenolrot von gelb nach rot.

CIT: Der Citratverbrauch bewirkt einen pH-Anstieg und ein

Umschlagen des Indikators Bromthymolblau von grün nach blau. Die

Citratverwertung weist auf einen positiven Ablauf der Reaktion hin.

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H2S: Hier werden Bakterien nachgewiesen, die Schwefelwasserstoff aus

Thiosulfat bilden können. Schwefelwasserstoff reagiert mit Eisensalzen unter

Bildung eines schwarzen Präzipitates, die Lösung im Mikroröhrchen wird

schwarz.

URE: Nachweis von Bakterien, die mit Hilfe der Urease Harnstoff in Kohlendioxid

und Ammoniak spalten können. Ammoniak bewirkt einen pH-Anstieg und ein

Umschlagen des Indikators Phenolrot von gelb nach rot. Jegliche Orange- oder

Rotfärbung weist auf den positiven Verlauf der Reaktion hin.

TDA (Tryptophandesaminase) bildet aus Tryptophan Indolbrenztraubensäure, die

in Anwesenheit von Eisen-III-Chlorid einen bräunlich-roten Farbkomplex bildet.

Dies weist auf den positiven Reaktionsverlauf hin.

IND: Der Abbau von Tryptophan führt zur Bildung von Indol. Indol und

Kovacs-Reagenz bilden einen gefärbten Komplex. Eine Rot- oder

Rosafärbung weist auf den positiven Verlauf der Reaktion hin. Die

Reaktion sollte innerhalb von 2 Minuten nach Zugabe des Reagenzes

abgelesen werden.

NIT: Nitrite bilden mit Sulfanilsäure und N,N-Dimethyl-1-Naphthylamin

einen roten Komplex. Nach dem Ablesen der Glucose-Reaktion und

Kontrolle der Blasenbildung infolge der Nitratreduktion werden die

oben genannten Reagenzien zugesetzt. Bei positiver Reaktion tritt

Rotfärbung ein.

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BETRIEBS- UND PERSONALHYGIENE

Eine mikrobiologische Kontrolle aller Oberflächen, mit denen

Lebensmittel bei der Ver- und Bearbeitung, Verpackung und dem

Transport in Berührung kommen, ist unbedingt notwendig.

Maschinen, Geräte, Finger, Hände, Türklinken usw. sollen einer

Stufenkontrolle unterzogen werden.

Die auf sämtlichen Oberflächen befindlichen Keime können durch

Abklatsch-, Abstrich- oder Abschwemmverfahren erfasst werden.

Abklatschverfahren

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Beim Abklatschverfahren (Rodac-Platten, Replicate Organism Detection

and Counting oder Folien) wird eine Agarnährbodenfläche auf die zu

untersuchende Oberfläche gedrückt.

Zu starkes Andrücken muß wegen möglicher Rißbildung im Agar

vermieden werden.

Die Keime der Untersuchungsfläche bleiben weitgehend auf dem

Nährboden haften.

Der Nährboden wird dann bebrütet. Die abgeklatschten

Mikroorganismen entwickeln sich zu Kolonien, die gezählt und

ausgewertet werden.

Abklatschverfahren

Die Rodacplatte ist so konstruiert, daß eine überstehende, konvexe

Nährbodenfläche zur Verfügung steht, die mit der zu untersuchenden

Fläche in Berührung gebracht wird.

Der Deckel der Schale drückt nicht auf die Agarschicht und läßt einen

genügenden Luftraum über.

Abklatschverfahren

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Methoden zur Resistenzbestimmung

Bestimmung des Hemmhofdurchmessers – Agardiffusionstest

Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK, MIC) – Dilutionstest– E-Test

ANTIBIOGRAMM

Die Resistenzprüfung von Erregern in vitro, auch

Empfindlichkeitsbestimmung genannt, ist deshalb

notwendig, weil die Empfindlichkeit vieler Bakterienarten

von Stamm zu Stamm wechselt und das Resistenzverhalten

nicht im voraus zu erkennen ist.

Daraus ergibt sich die zwingende Notwendigkeit der

Resistenztestung zur vollständigen Befunderstellung.

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ANTIBIOGRAMM

Durch die Testung erfolgt der Ausschluss jener Substanzen,

die schon in vitro nicht wirksam sind und damit für die

klinische Anwendung nicht in Frage kommen.

Bezüglich der wirksamen Substanzen entscheiden dann

andere Parameter (Bioverfügbarkeit, Applikation, klin.

Aspekte, etc.) über deren Einsatz beim Patienten.

ANTIBIOGRAMM

Eine Keimsuspension wird mittels eines Glasspatels

flächendeckend auf einem Nährboden aufgetragen.

Mit einem Dispenser, der die Antibiotika-Testblättchen

enthält, werden diese Testblättchen auf den Agar

gedrückt.

Die Probe wird nun 24 Stunden bei 37°C bebrütet und

dann ausgewertet.

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Agardiffusionstest

Die Antibiotika diffundieren von dem aufgelegten imprägnierten

Filterpapierplättchen in das Agar und bewirken je nach Wirksamkeit

eine Hemmung des Bakterienwachstums um das Testplättchen

(Hemmhof).

Bei Unwirksamkeit der Testsubstanz kommt es zu einem ungehinderten

Bakterienwachstum.

Abhängig von der Größe des Hemmhofes und der

Wirkstoffkonzentration werden die Ergebnisse in "sensibel" (oder

empfindlich), "mäßig sensibel" und "resistent" (oder unempfindlich)

unterteilt.

Antibiotikaplättchen

OXACILLIN OX

CEFAZOLIN CZ

TEICOPLAMIN TEC

NORFLOXAIN NOR

AMPICILLIN AM

CEFLAZIDIM CAZ

27

E. coli

28

Kl. pneumoniae

Dilutionstest

Beim Reihenverdünnungstest wird eine geometrische Verdünnungsreihe des Antibiotikums hergestellt. In die einzelnen Röhrchen der Verdünnungsreihe werden gleiche Mengen der zu prüfenden Bakteriensuspension gegeben. Nach der Bebrütung wird festgestellt, bei welcher minimalen Antibiotikum-Konzentration kein makroskopisch sichtbares Bakterienwachstum mehr stattgefunden hat (MHK).

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Epsilometer-Test

BESTIMMUNG DER KEIMZAHL VON OBERFLÄCHEN UND LUFT

Ü7: BESTIMMUNG DER KEIMZAHL VON OBERFLÄCHEN

(GRUPPENBEISPIEL)

Ü8: BESTIMMUNG DER LUFTKEIMZAHL

(GRUPPENBEISPIEL)

Ü 9: ANLEGEN EINES ANTIBIOGRAMMS

(GRUPPENBEISPIEL)

DO

30

Ü7: OBERFLÄCHE

Verschiedene Oberflächen (Arbeitsplatz,

Sterilbank, etc.) werden mittels Rodac

Platten abgeklatscht.

Inkubation: 37°C, 1d; Auszählen der KBE

Ergebnis:.................................

DO

Ü8: LUFT

Impaktion-Verfahren

Die zu untersuchende Luft wird mittels eines Zentrifugalsammlers angesaugt und durch einen Spalt auf einen im Inneren des Gerätes befindlichen Nährbodenstreifen aufgeschleudert.

Verwendetes Gerät: Biotest-Luftkeimsammler (Abscheidevolumen 40 l/min)

Nährbodenstreifen in den Zentrifugalsammler einlegen Zentrifugalsammler 1 min betreiben Nährbodenstreifen entnehmen und inkubieren: 37°C, 1d Auszählen der KBE Ergebnis: KBE/m3 = KBE x 1000:40 =...........................

DO

31

Ü9: ANLEGEN EINES ANTIBIOGRAMMS0,1 ml einer Keimsuspension auf einer Agarplatte gleichmäßig mit einem Glasspatel verteilen und trocknen lassen.

Mittels eines Dispensers werden die Antibiotikablättchen auf die Agaroberfläche aufgebracht.

Inkubation: 37°C, 1 d

Auswertung:

Antibiotikaresistenz ungehindertes Bakterienwachstum

Hemmung des Bakterienwachstums HemmhofbildungErgebnis: Hofbildung

Antibiotikum: +/-

1...................................... ....................2...................................... ....................3...................................... ....................4...................................... ....................5...................................... ....................6...................................... ....................

DO

NICHT-KULTURELLE UND INDIREKTE KULTURELLE METHODEN

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Gaschromatographie (GC) Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die Erstellung chemotaxonomischer Profile (Aminosäuren,

Fettsäuren, Kohlenhydrate) bietet neue, genaue und schnelle

Identifizierungsmöglichkeiten von Mikroorganismen.

Fermentierende Bakterien, insbesondere Anaerobier, bilden

als Endprodukte ihres Kohlenstoff- und Energiestoffwechsels

verschiedene organische Verbindungen, die sich in

Nährmedien wie aber auch in Eiter und Exsudaten anreichern

und mittels HPLC oder GC nachweisen lassen.

Die Art und Menge dieser Endprodukte sind gruppen- und

speziesspezifisch und somit von großer diagnostischer

Bedeutung.

Gaschromatographie (GC) Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die Identifizierung von Bakterien mittels GC wird schon seit

langem zu diagnostischen und taxonomischen Studien

verwendet.

Es handelt sich hierbei um den Nachweis eines

bakterienspezifischen Fettsäuremusters.

Verschiedene Gattungen weisen unter standardisierten

Bedingungen ein gleichbleibendes, typisches Fettsäureprofil

auf.

Die Art und Verteilung sowie die quantitativen Abweichungen

der vorliegenden Fettsäuren erlauben eine genaue

Charakterisierung der zu untersuchenden Mikroorganismen.

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Elektrophorese in der Diagnostik

Die elektrophoretische Differenzierung - in allen ihren

Variationen - und vor allem die Verwendung

elektrophoretischer Muster intrazellulärer löslicher Proteine,

deren Gehalt genetisch determiniert ist, führte in der

bakteriologischen Diagnostik zu einem zusätzlichen

Hilfsmittel in der Taxonomie der Mikroorganismen.

Elektrophorese in der Diagnostik

Die gelelektrophoretische Auftrennung basiert auf der Abspaltung

eines Proteingemisches in seine Komponenten im elektrischen Feld

durch die unterschiedlichen Eigenladungen und Molekulargewichte

der einzelnen Fraktionen.

Die Elektrophorese wird in verschiedenen Bereichen wie in der

medizinischen Diagnostik, der Lebensmittelanalyse, der Genetik

und der Mikrobiologie eingesetzt.

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PCR

Bei dieser 1985 zum ersten Mal publizierten Methode ist es

möglich, Nukleinsäuremoleküle millionenfach identisch zu

vervielfachen, dadurch können kleine Mengen von

Nukleinsäuren und sogar einzelne Moleküle spezifisch

nachgewiesen werden.

Diese Technik basiert auf einem 3-Schritt-Zyklus, gestartet

durch eine Hitzedenaturierung der zu untersuchenden DNS

und deren Umwandlung von einem Doppelstrang in einen

Einzelstrang.

PCR

Im zweiten Schritt der Reaktion werden spezifische kurze Oligonukleotide (primer) in einer bestimmten Region an beide Stränge der Startnukleinsäure hybridisiert.

Die hybridisierten Oligonukleotide werden nun von einer DNS-Polymerase durch Aneinanderfügen von Nukleotiden zu einem neuen DNS-Strang verlängert, der komplementär zur Ausgangssequenz ist.

Durch Wiederholung dieser Vorgangsweise kann eine millionenfache Kopie eines DNS-Moleküls erreicht werden.

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Impedanzmessung

Bei der Impedanzmessung, ein indirekt kulturelles Verfahren, werden

mikrobiell bedingte Widerstands- oder Leitfähigkeitsänderungen gemessen,

die bei der Vermehrung von Mikroorganismen durch entstehende

Stoffwechselprodukte in einem Wachstumsmedium auftritt.

Wachsende Mikroorganismen produzieren Stoffwechselprodukte, welche bei

einer Anreicherung in einem flüssigen Medium zur Änderung des elektrischen

Widerstandes führen.

Die Leitfähigkeit nimmt zu bzw. der Widerstand ab.

Diese Änderungen werden allerdings erst registriert, wenn sich vermehrende

Mikroorganismen eine Zellzahl von etwa 106- 107/ml erreicht haben.

Direkte Epifluoreszent-Filter-Technik (DEFT)

Die DEFT stellt eine verbesserte mikroskopische Gesamtkeim- bzw. Gesamtzellzahlbestimmung dar, wobei allerdings keine Unterscheidungen zwischen toten und vermehrungsfähigen bzw. stoffwechselaktiven Zellen möglich ist.

Mikroskopische Zählung der in einem Nahrungsmittel vorhandenen Mikroorganismen nach Filtration durch Vorbehandlung filtrierbar gemachter Lebensmittelhomogenisate.

Anschließend werden die auf dem Filter abgeschiedenen Mikroorganismen mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und im Fluoreszenzmikroskop ausgezählt. Die Methode wird zur raschen Keimzahlbestimmung innerhalb 30-45 min, insbesondere zur mikroskopischen Rohstoff- und Verarbeitungskontrolle, eingesetzt.

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Limulus polyphemus

Das Aktives Zentrum des Hämocyanins von Limulus polyphemus, dem Pfeilschwanzkrebs.

Limulus-Test (LAL)

Der Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test (LAL) ist eine sehr rasche,

hochempfindliche Methode zum quantitativen und qualitativen

Nachweis von Lipopolysacchariden gramnegativer Bakterien

(Endotoxinen) in flüssigen und festen Lebensmitteln.

Das Blut des Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphemus) gerinnt bei

einer Infektion mit gramnegativen Bakterien.

Dabei kommt es zu einer Gelbildung zwischen Zellwandbestandteilen

(Lipopolysacchariden) dieser Bakterien und den Amöbozyten, den

einzigen Blutkörperchen des Limulus-Blutes.

37

Limulus-Test (LAL)

Die Amöbozyten enthalten Proenzyme und Agglutinationsenzyme.

Bei Anwesenheit von Lipopolysacchariden werden die Proenzyme

aktiviert. Diese reagieren weiter mit den Agglutinationsenzymen unter

Gelbildung.

Der Nachweis von Endotoxinen erfolgt aufgrund dieser Gelbildung.

Der Nachweis von Endotoxinen erfolgt aufgrund dieser Gelbildung.

Da zwischen der Endotoxinkonzentration und dem Keimgehalt eine

lineare Korrelation besteht, kann aufgrund des ermittelten

Endotoxingehaltes der Grad der Verunreinigung mit gramnegativen

Bakterien bestimmt werden