9 6 J . WEIGL
trennt und die 14C-Aktivität der Fraktionen bestimmt, wie unter 1 beschrieben. Aus Abb. 1 ist ersichtlich, daß sowohl im Eluat der basischen als auch der sauren und neutralen Aminosäuren insgesamt mindestens 3 scharfe Maxima der 14C-Aktivität über einem diffusen Untergrund von ca. 15 Ipm auftre- ten. Der 14C-Gehalt des Aminosäurenhydrolysats betrug ca. 15% der im Trichlorphon eingesetzten 14C- Aktivität.
Auf Grund unserer Arbeitshypothese sollten diese Maxima 14C-methylierten definierten Acceptoren zugeordnet werden; als solche wären demzufolge Hydrolyseprodukte hochmolekularer Serumbestandteile, d. h. in erster Linie Aminosäuren zu betrachten. Da uns methylierte Vergleichssubstanzen vorerst nicht zur Verfügung stehen, kann über die mögliche Struktur der 14C-markierten Abbauprodukte noch nichts ausgesagt werden.
Die Wirkung hoher Salzkonzentration auf die Permeabilität der pflanzlichen Zellmembran
J o s e f W e ig l
Botanisches Institut der Technischen Hochschule Darmstadt
(Z. Naturforsch. 25 b, 96— 100 [1970] ; eingegangen am 16. Oktober 1969)
Using the device of Fig. 1 (this paper and 1. c. 3) efflux of Cl® across the plasma membrane of root cortex cells was found to increase with increasing external concentration of various salts. We conclude that non-specific (passive) plasma membrane permeability (!) to anions increases with increasing external concentration of salts. As a primary result passive efflux of anions, which is downhill in the electrical gradient, increases.
Efflux of Rb® across the plasma membrane is only slightly stimulated by external KC1 and is inhibited by Ca2®.
The decrease in electrical potential with increasing external salt concentration is a consequence of the increase in passive plasma membrane permeability to anions.
Interaction of salts with charged groups of the plasma membrane is not unlikely to be the reason for the increase of the permeability to anions and for the multiple hyperbolic influx isotherm observed at high external concentrations (1 —lO O m M ). We want to emplasize that a multiple hyperbolic isotherm may be considered a feature of passive ion movement across a barrier of different charged groups.
Es muß erwartet werden, daß Ionen bei der Permeation durch Membranen in Wechselwirkung mit den geladenen Komponenten der Membranen treten. Fixe Einlagerungen von geladenen Gruppen können D o n n a n - Phänomene hervorrufen, bewegliche Gruppen können als Austauschträger wirken. Das Prinzip der Austauschdiffusion von Ionen (UssiNG *) scheint an tierischen Objekten verwirklicht zu sein. Daß dieses Problem jedoch nicht abgeklärt ist, kann man aus einer Arbeit von K e y n e s 2 entnehmen.
Das Studium der Permeationsmechanismen an pflanzlichen Zellen ist schwieriger, da die pflanzliche Zelle einem aus zwei ineinandergeschachtelten, ungleich großen Zellen gebildeten Systeme gleicht ( P f e f f e r ) . Der Efflux von Ionen aus der Pflanzenzelle wird schon nach einer kurzen Anfangsphase
1 H. H. U ssin g . Physiol. Rev. 29. 127 [1949].
durch das innere Membransystem, den Tonoplasten, limitiert. Es ist somit schwer, einen Einfluß externer Salze eindeutig als direkte Stimulierung des Efflux zu erkennen. Wir haben den Versuch unternommen, durch folgende experimentelle Anordnung eine Bearbeitung des Problems zu erreichen: Wenn man eine abgeschnittene Wurzel in eine Trennwand zwischen zwei Außenräume einspannt (Abb. 1 ), dann kann man zwei Effluxkomponenten studieren:
1. den Efflux aus den Rindenzellen ins Milieu der Rinde (Flux 2, Abb. 1 ),
2. den Efflux über das Xylem in den benachbarten Raum (Flux 3, Abb. 1).
Bei dieser Versuchsanordnung besteht die Hoffnung, einen direkten Effekt externer Salze auf den
2 R. D. K e y n e s , in: Ion transport in excitable cells, Symposium on Biophysics and Physiology of Biological Transport, Springer-Verlag, Wien-New York 1967.
This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3.0 Germany License.
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SALZKONZENTRATION UND PERM EABILITÄT DER ZELLMEMBRAN 97
Abb. 1. Ionenfluxe im Wurzelgewebe. Bei diesem Schema wird von den weitgehend akzeptierten Vorstellugen Gebrauch gemacht, daß 1. das Plasma der Zellen durch Plasmodesmen zu einem Symplast verbunden ist und daß 2. der freie Raum vom Xylem durch eine wirksame Diffusionssperre getrennt ist. CS = Caspari Streifen, V = Vakuole, FR = Freier Raum, R = Milieu der Rinde, X — Milieu des angeschnitte
nen Xylems, TP = Tonoplast, PL = Plasmalemma.
Efflux aus den Rindenzellen (Flux 2) erkennen zu können, da hier kein absolutes Limit durch den Tonoplasten wirksam ist, sondern eine Verschiebung in der Größe der Effluxkomponenten (Flux 2 und3) zu erwarten is t3. Der Efflux aus vorinkubierten kurzen Wurzelsegmenten liefert Angaben über die Summe von Flux 2 und 3.
Versuche
8 cm lange Maiswurzeln wurden 24 Stdn. in 5 10~4 m K36C1 vorinkubiert, dann eine Stde. in fließendem Wasser gewaschen und in Portionen von10 Stüde so in eine Trennwand zwischen zwei Kammern eingesteckt wie es in Abb. 1 dargestellt ist (vgl. auch 1. c . 3) . Die beiden Kammern waren mit 5 ' 1 0 ~ 4 m KCl beschickt. Nach 3 Stdn. (Zeitpunkt 0 in Abb. 2) wurde begonnen, den Efflux aus der Rinde in 5 min Intervallen zu messen. Nach 5 Intervallen wurde durch Zugabe von l M K35C1 die Außenkonzentration plötzlich auf 5 -10 _ 2 mK35C1 erhöht. Dies hatte eine ungefähr 20 bis 30-fache Steigerung der Effluxgeschwindigkeit zur Folge (Abb. 2 ) . Schon im ersten Intervall nach der Konzentrationserhöhung war diese Steigerung zu mehr als 2/s erreicht. In Abb. 2 ist der Differenzenquotient des Efflux d IPM/df eingetragen. 5 ’ 10_ 2 M Mannit verursacht diese Effluxsteigerung nicht. Andere Salze (NaCl, KoS04 , CaCL , Cholinchlorid) bewirken je doch eine ähnliche Erhöhung des 36C1-Efflux.
200 mit 5 -10_ 4 m K36C1 vorinkubierte und eine Stde. mit Wasser gewaschene Wurzeln wurden mit
3 J. W e i g l , Planta 84, 311 [1969].
Abb. 2. Änderung der Geschwindigkeit (dIPM/di) des 36C1Q-Efflux aus den Rindenzellen bei plötzlicher Erhöhung der Außenkonzentration an KCl (oder anderer Salze). IPM
= Impulse pro Minute.
den Spitzen nach unten in ein Glasrohr (Chromatographie-Säule 3 ' 1 0 cm) eingebracht, zuerst etwa3 Stdn. mit 5 • 10~4 M K35C1 und dann weitere 3 Stdn. mit einem kontinuierlichen linearen Gradienten von5 - IO-4 M bis 10 -1 M K35C1 eluiert. Das Flüssigkeitsniveau in der Säule wurde bei 2 cm unter den Schnittstellen der Wurzeln aufrecht erhalten. Mit einem Fraktionenkollektor wurden Eluatfraktionen von ca. 3 ml Volumen gesammelt (Durchflußgeschwindigkeit ca. 3 ml/min). Die Radioaktivität der Eluatfraktionen wurde im Szintillations-Spektro- meter gemessen (Abb. 3 ) . Während der maximal6-stdg. Versuche konnte keine Blutung festgestellt werden. Die Versuche zeigen, daß der Efflux von
Abb. 3. 36C1®-Efflux aus Maiswurzeln in Abhängigkeit von einem linearen kontinuierlichen KCl-Gradienten im Milieu. Die Versuche wurden in einer Chromatographie-Säule ausge
führt.
98 J . WEIGL
36C1 mit steigender Konzentration von K35C1 im Wurzelmilieu zunimmt. Es wurde in mehreren Versuchen gefunden, daß die Effluxisothermen einen multihyperbolischen Verlauf haben könnten. Dies konnte jedoch nicht mit Sicherheit ermittelt werden, zumal wir neuerdings fanden (unveröffentlicht), daß die Influxisothermen für CI® zwischen 1 — 100 mM KCl je nach Pflanzenart und Versuchsbedingung auch nicht immer den vielfach gefundenen multihyperbolischen Verlauf aufweisen.
Wurzen wurden 14 Stdn. in 5 - 10_ 6 m K36C1 vor- inkubiert, 1 Stde. in Wasser gewaschen, in 2 m lange Segmente geschnitten, und diese nochmals1 Stde. in Wasser gewaschen. Dann wurden je 30 der so vorbehandelten Segmente in je 100 ml 5 • 10~ 4 oder 10-1 M KCl geschüttelt. Der Efflux von 36C1 (Summe von Flux 2 und 3, Abb. 1) erwies sich wie früher von der hohen Außenkonzentration unabhängig (vgl. 1. c. 3) .
Wurzeln wurden 18 Stdn. mit 5 ‘ 10~4 M KCl (markiert mit 8(>Rb) vorinkubiert, gewaschen und der Efflux in 5 • 10 -4 M RbCl + 5 • 10~4 M KCl oder 5 - 10-4 m RbCl + 5 - 10~2 m KCl oder 5 - 10_ 4 m RbCl + 5 • 10 -2 M CaClo untersucht. Die Ergebnisse bestätigen vollständig frühere Untersuchungen 3, bei denen im Efflux-Medium KCl statt RbCl verwendet wurde: 5 ‘ 102 KC1 steigert den Rb®-Efflux aus der Rinde nur schwach, 5 - 10~2 M CaCL hemmt den anfänglichen Rb®-Efflux aus der Rinde und den Rb^- Flux über das Xylem in die Nachbarkammer.
Diskussion
Die Versuche zeigen im wesentlichen,
1. daß die Steigerung des 36C1®-Efflux durch E rhöhung der K3°Cl-Konzentration im Milieu sehr schnell einsetzt. (Die Halbwertszeit der Geschwindigkeitserhöhung ist ungefähr der der Auffüllung des freien Raumes des Wurzelgewebes gleich.
2. daß der 36C1®-Efflux mit steigender Konzentration von K35C1 im Milieu zunimmt. (Dies zeigt, daß die Effluxsteigerung nicht durch ein plötzliches Leckwerden des Plasmalemmas bei einer bestimmten Außenkonzentration bedingt ist, sondern eine Funktion der Außenkonzentration ist.)
3. daß die Effluxsteigerung nur durch Salze, nicht etwa durch Mannit hervorgerufen wird.
4 J. W e i g l . Planta 75. 327 [19 6 7 ] .5 J. W e i g l . Planta 79, 197 [1968],
Diese Effekte existieren nicht in der gleichen Weise für den Rb®-Efflux.
Wir haben in früheren Untersuchungen eine gewisse Spezifität der Effluxsteigerung durch Salze beobachtet3-5 . Auch aus einer kurzen Notiz in einer Arbeit von H o pe et al. 6 konnte mann diesen Schluß ableiten. Es zeigt sich nun aber mit der in der vorliegenden Arbeit angewandten Methode, daß die Effluxsteigerung völlig unspezifisch durch externe Salze hervorgerufen wird. Wahrscheinlich unterstreicht dies die Bedeutung der beschriebenen Methodik für Effluxstudien. Auch z. B. für Inhibitorversuche empfiehlt sich diese Methode; denn wenn man die Fluxe 2 und 3 nicht getrennt beobachtet, kann man nicht entscheiden, ob der Inhibtor Flux 2 oder 3 beeinflußt. K e y n e s 2 hebt die Bedeutung der Innenkonzentration hervor. Einen sicheren Grund für die Veränderungen kennen wir vorläufig nicht.
Wir glauben, daß man über den Charakter von Flux 3 (auch durch Versuche an intakten Pflanzen!) wenig sichere Information erwerben kann3. Die Transpiration vermindert nicht nur Flux 6, sondern könnte auch Flux 3 steigern (vgl. Abb. 1 ) . Der Wasserstrom könnte Ionen im Grenzbereich zwischen Symplast und Gefäßraum anreichern. Möglicherweise existiert sogar in den an die Gefäße grenzenden Zellmembranen ein Koppelungseffekt. Unter Transpirationsbedingungen könnte somit jeder klare Zusammenhang zwischen Außenkonzentration und Geschwindigkeit des Ionentransports vom Milieu ins Xylem verwischt sein.
Die Befunde, daß 1. der Efflux von 36C1~ aus der Rinde unspezifisch (aber unterschiedlich für Anionen und Kationen) durch Salze, nicht jedoch durch Mannit stimuliert wird und daß 2. der Efflux von 8(iR b£ über das Xylem weder durch Mannit, noch durch Salze hoher Konzentration gehemmt wird 3, bestärken uns aber in der Vermutung, daß es sich bei der beobachteten Steigerung des 3GC lc -Efflux nicht um eine osmotische oder kompetitive Hemmung von Flux 3 oder 5, sondern um eine physikalische Wechselwirkung der Salze mit Plasmalemma-Komponen- ten handelt. Hier darf man an Ionenaustausch oder an einen Flux denken, der durch Abschirmung negativer Membranladungen induziert wird. Ebenso könnten Salze des Wasserstoffbrückengerüst der Membranen und des Membranwassers lockern und
6 A. B. H o p e . A. S im p s o n u . V. A. W a l k e r . Austral. J . biol.Sei. 19. 355 [1966].
I
SALZKONZENTRATION UND PERMEABILITÄT DER ZELLMEMBRAN 99
dadurch eine höhere Membranpermeabilität verur
sachen. Wir wollen, ohne vorerst die Ursache auf
molecularem Niveau zu kennen, die Bedeutung die
ser durch Salze hervorgerufenen Verringerung des
Permeationswiderstandes zu erläutern versuchen
(Abb. 4).
a) Sa; K®nieder, Na® nieder
i aA1
PDHlOOmVA A —
a i 11 r +1 : t I i
Cle Cle K® K® CI® K®Na®
b) Sa: K® nieder, Na® hoch
A k PD<100mVt i i i * !
C1©ci© K® K® Cl®K®Na®
c) Sa: K® hoch, Na®hoch
*♦ 1 i .1 !
1
* A PDClOOmV
1 i1 f
H +
CI® CI® K ® K ® C le K®Na®
Abb. 4. Tendenz der Änderung der unspezifischen passiven Ionenfluxe und des elektrischen Potentials durch hohe Salzkonzentration im Milieu. Hohe Salzkonzentration im Milieu erhöht die Permeabilität des Plasmalemmas für die unspezifischen (passiven) Anionenfluxe. Bei hoher Außenkonzentration (Cie-Influx > Cle -Efflux) wird der spezifische K®-In- flux durch unspezifischen Kationeninflux überlagert, welcher an Nettoinflux von Cle gekoppelt ist. Sa = Außenkonzentration; Anion im Milieu = CI®. Punktiert: unspezifische (passive) Fluxe; ausgezogen: spezifische Cl®.Fluxe mit Sättigungskinetik, wahrscheinlich direkt an einen chemischen Energieflux (z. B. ATP-Spaltung) gekoppelt; gestrichelt: spezifische K®-Fluxe, direkte Koppelung an chemischen Energie
flux wahrscheinlich, aber nicht mit Sicherheit bekannt.
Im Plasmalemma der Pflanzenzelle arbeitet eine
spezifische Influxpumpe für Cle mit Sättigungskine
tik. Daneben gibt es ein spezifisches Influxsystem für
K® 7. Es ist nicht ganz klar, ob der spezifische K®-
Influx an einen chemischen Energieflux oder an den
Anionenflux gekoppelt ist. Beide Influxsysteme besit
zen jedoch hohe Affinität für Ionen, d. h. sie beschleu
nigen bei niederer Außenkonzentration die Ionen
permeation (Abb. 4 a). Der Efflux von Cle und K®
7 E . E p s t e in , Nature [London] 212, 1324 [1966].8 N. H ig in b o t h a m , B. E t h e r t o n u . R. J. F o s t e r , Plant
Physiol. 42, 37 [1967],
erfolgt unspezifisch und passiv. Da am Plasmalemma
eine elektrische Potentialdifferenz (PD) von unge
fähr 100 mV herrscht (innen — ), müßte man an
nehmen, daß der spezifische Influx von K® lang
samer ist als der spezifische Influx von CI®. Da es
hierfür keinen sicheren Beweis gibt, kann man auch
erwägen, daß der Efflux von Kationen insgesamt
größer als der der Anionen ist.
Hohe Salzkonzentration im Milieu erhöht die Per
meabilität des Plasmalemmas. Es kommt gemäß der
Richtung des elektrischen Potentials vornehmlich zu
einer Steigerung des ^m'onenefflux. Es ist zu erwar
ten, daß mit zunehmender Außenkonzentration die
elektrische Potentialdifferenz kleiner wird. Dies
konnte experimentell beobachtet werden 8’ 9. Hervor
gehoben werden muß jedoch, daß als primäre W ir
kung der hohen Salzkonzentration die Verringerung
des Permeationswiderstandes des Plasmalemmas an
zusehen ist. Die Folge davon ist die Erniedrigung
des elektrischen Potentials. Wäre es umgekehrt, d. h.
wäre die Potentialerniedrigung die primäre Reak
tion auf die hohe Salzkonzentration, dann müßte sich
als Folge davon eine Verringerung des Anionen-
efflux einstellen. Die Tatsache, daß die Potential
erniedrigung durch eine Erhöhung der Plasma-
lemmapermeabilität zustande kommt, beweist, daß
das Potential hauptsächlich zwischen Milieu und
Plasma herrscht.
Hohe Außenkonzentration an Salz erhöht den un
spezifischen (passiven) Anionen-Influx. Der Cl®-In-
flux ist stärker als der S042®-Influx. Je höher der
Anionen-Influx, desto höher ist die Potentialdiffe
renz, d. h. bei hoher Außenkonzentration wird der
Kationeninflux vom Anionen-Influx abhängig 7. Aus
der Beobachtung, daß der Kationen-Influx bei Er
höhung der Außenkonzentration seine Selektivität
mehr und mehr verliert7, kann man schließen, daß
bei hoher Salz-Konzentration im Milieu die unspezi
fische Influxkomponente im Plasmalemma für Kat
ionen erhöht wird. Der unspezifische passive Efflux
von Kationen wird nicht oder nur schwach erhöht,
da er gegen das elektrische Potential gerichtet ist.
Ca2® hemmt den Efflux von Rb® durch das Plasma
lemma. Es ist zu erwarten, daß Ca2® den passiven
Flux von Kationen mit größerem hydratisierten Ra
dius (z.B. Na®!) noch stärker beeinflußt. Nur bei
Anwesenheit von Ca2® ist bei niederer Außenkon-
9 U. K i s h im o t o , J. cellular, comparat. Physiol. 66, 43[1965].
100 SALZKONZENTRATION UND PERMEABILITÄT DER ZELLMEMBRAN
zentration von KCl der K®-Influx selektiv; er ver
liert aber seine Selektivität gegenüber Na®, wenn
Ca20 aus dem Medium entfernt wird, d. h. wenn un
spezifischer Kationeninflux möglich wird ' .
Man kann dies zusammenfassend wie folgt sche
matisieren:
Abgesehen von spezifischen Trägersystemen wer
den wesentliche Permeabilitätseigenschaften des
Plasmalemmas durch negativ geladene Membran
komponenten (Phospholipide?) bestimmt.
Durch KCl, CaCl2, K2S04 wird der passive Cl0-
Flux erhöht, da K 0 und Ca20 die negativen Mem
branladungen abschirmen.
Ca20 kondensiert oder vernetzt die Membranstruk
tur. Dies wirkt sich hauptsächlich auf den unspezifi
schen passiven Flux von Kationen mit großem hydra-
tisierten Radius aus.
Ca20 ist nötig um den selektiven K +-Influx bei
niederer Außenkonzentration von K 0 +Na° zu er
halten.
Bei NaCl in hoher Konzentration (Abb. 4 b)
nimmt der unspezifische Kationeninflux (Na0-In-
flux!) in Richtung des elektrischen Potentials, d.h.
der bergab-F\ux nach innen zu. NaG und K~ kon
kurrieren nicht nennenswert, da (auf Grund der
niederen Außenkonzentration an K 0) die unspezi
fische passive Komponente des K 0-Influx gering
bleibt.
Bei NaCl und KCl in hoher Außenkonzentration
(Abb. 4 c) konkurrieren K 0 und Na~ um das An
ion, welches mit Sättigungskinetik aufgenommen
ivn; denn beim Influx im hohen Konzentrations
bereich wird die elektrische Neutralität gewahrt. Die
Konkurrenz der Kationen herrscht also nur, wenn
Nettoinflux von C1J herrscht. Ohne Nettoinflux von
CI0 gibt es keinen gekoppelten unspezifischen (pas
siven) Influx von Kationen, d. h. der K 0-Influx ist
dann selektiv.
10 K. T o r i i u. G. G. L a t ie s , Plant Physiol. 41, 863 [1966].11 B. P e n t h u . J. W e ig l , Z. Naturforsch. 24 b, 342 [1969].
Bei hoher Außenkonzentration von KCl, wo der
Kationenflux vornehmlich unspezifisch und passiv
ist, wird nicht nur der Rb0-Efflux, sondern auch
der K 0-Influx 7 durch Ca20 gehemmt.
Bei hoher Außenkonzentration (1 — 100 m M )
zeigt die Ionenaufnahme mehrere Sättigungskurven.
Da bei hoher Außenkonzentration die Permeabilität
des Plasmalemmas für Anionen erhöht ist und als
Folge davon der Efflux von Anionen erhöht ist und
das elektrische Potential erniedrigt ist, muß der pas
sive Anioneninflux durch das Plasmalemma bei
hoher Außenkonzentration sehr groß werden. Wir
haben bereits früher abgeschätzt5, daß bei hoher
Innenkonzentration (nach Vorinkubation) und
hoher Außenkonzentration Influx- und Effluxge-
schwindigkeit die gleiche Größenordnung besitzen.
Aktiver Influx vom Plasma in die Vakuole ist sehr
wahrscheinlich. Eine andere Frage ist, ob bei hoher
Außenkonzentration (über 1 m M ) die Sättigungs
kurven die aktiven Fluxe durch den Tonoplasten 10
oder die passive Wechselwirkung der Ionen mit ver
schiedenen Plasmalemmakomponenten widerspiegeln.
Nicht nur Ionenaustausch, sondern auch die oben
postulierte Besetzung von negativen Gruppen der
Membran mit dem in steigender Konzentration ap
plizierten Kation erfolgt mit Sättigungskinetik. Mem
branen sind aus verschiedenen geladenen Gruppen
aufgebaut, die Ionen verschieden stark binden. Jede
einzelne Wechselwirkung gehorcht einer Lang-
m u i r sehen Adsorptionsisotherme.
An diesen Untersuchungen wird mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft und unter Mitarbeit von S. v. R h ö n e c k seit dem Jahre 1967 gearbeitet 4’ 5. In einer früheren Veröffentlichung 11 wurde unter 1. c. 15 auf die vorliegenden Untersuchungen hingewiesen, da wir sie für das Verständnis der Wirkung des Lichtes auf die Ionenaufnahme unentbehrlich halten.
12 G. E. B r ig g s , A. B . H o p e u . R . N. R o b e r t s o n , in: Electrolytes and plant cells, Blackwell, Oxford 1961.