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This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.
FLUORESZIERENDE STOFFE IN DEN AUGEN DREIER GENOTYPEN 687
male Doppelbrechung auf die sichtbaren F aserelemente zurückgeht und daß die Photoelastizität ein Ausdruck gummi-elastischer Eigenschaften der in terfib rillären M atrix ist.
Abschließend kann gesagt werden, daß das Bindegewebe der Insekten einen komplexen A ufbau zeigt
und sicherlich nicht m it dem der W irbeltiere identisch ist. N ur durch eine tiefgreifende Analyse mit verschiedenen M ethoden w ird es gelingen, die einzelnen Gewebekomponenten zu erfassen, ihre Zusam m enhänge zu erkennen und ih re funktionelle Bedeutung zu verstehen.
Uber die fluoreszierenden Stoffe in den Augen dreier G en o ty p en von Plodia interpunctella
Von F rancisco F e r r a n d d e A lm e id a *
Aus dem Max-Planck-Institut für Biologie, Abteilung K ü h n , Tübingen (Z. Naturforschg. 13 b, 687—691 [1958] ; eingegangen am 22. Juni 1958)
Qualitativ gleichen sich die drei papierchromatographisch untersuchten Genotypen von Plodia interpunctella weitgehend; von den fluoreszierenden Substanzen der Augen wurden festgestellt: Isoxanthopterin, Xanthopterin, 2-Amino-6-hydroxypteridin, die Pteridine cx und e, und die noch nicht näher untersuchten Stoffe b, gr und g'. e und 2-Amino-6-hydroxypteridin stehen bei Stamm 6 in negativer Korrelation zueinander. Quantitativ übertrifft die rotäugige M utante ra die beiden anderen Genotypen vor allem durch die cr und e-Substanz. Stamm 6 enthält sehr viel 2-Amino-6-hydroxypteri- din, während die anderen Stoffe stark reduziert sind. Der Wildtyp und die rotäugige M utante von Plodia gleichen fast völlig den entsprechenden Genotypen von Ephestia.
Die A ugenfarbm utanten von E phestia unterscheiden sich nicht nur im Pigm entgehalt, sondern auch in ihrem M uster fluoreszierender Substanzen1. Bei der gleichfalls zur Fam ilie der P yra lidae gehörigen, nahe verw andten A rt P lod ia in terpunctella wurden neben der W ildform noch eine rotäugige ( ra )2 und eine schwarzäugige M utante (Stam m 6) isoliert. Es erschien nun wünschenswert festzustellen, ob auch in diesen Fällen genspezifische Fluoreszenzm uster in A bhängigkeit von der A ugenfarbe aufzufinden seien.
F ü r die A nregung und Förderung zu dieser A rbeit b in ich H errn Professor Dr. A l fr ed K ü h n
und H errn D r. A lbrecht E gelh a af zu Dank verpflichtet.
Material und Methode
Die folgenden Stämme von Plodia wurden verwendet:a) Stamm 1, Augen dunkelbraun (Wildtyp).b) Stamm 13, Augen rot (ra ).c) Stamm 6, Augen schwarz.
Die Tiere wurden im Dunkeln bei 29 — 30u C und 60 — 70% relativer Luftfeuchtigkeit gezüchtet.
* Ausgeführt mit Unterstützung der A l e x a n d e r v o nH u m b o l d t - S t i f t u n g und des „ I n s t i t u t o d eA 1 1 a C u 1 1 u r a“ in Lissabon.
1 E. H a d o r n u . A. K ü h n , Z. Naturforschg. 8 b, 582 [1953].
Zur papierchromatographischen Untersuchung wurden die Köpfe in einem Gemisch von Methanol (75 Tie.) und 1-proz. Ammoniak (̂ 25 Tie.) zerrieben und der überstehende Extrakt nach Abzentrifugieren auf Chro- matographier-Papier (Whatman Nr. 1) aufgetragen. Für ein eindimensionales Chromatogramm (Laufmittel: Propanol-lproz. Ammoniak 2 : 1) wurden 5 (in 0,1 ml Methanol-Ammoniak), für ein zweidimensionales (Propa- nol-Ammoniak, Butanol-Essigsäure) 10 Köpfe (in0.2 ml) verwendet. Die ganze Behandlung wurde zum Schutz der photolabilen Substanzen bei Rotlicht durchgeführt. Die Auswertung erfolgte fluorometrisch direkt vom P ap ier3’ *’5. Die Bezeichnung der noch nicht identifizierten Stoffe mit Buchstabensymbolen entspricht der bei Ephestia benutzten1.
Ergebnisse
1. Q u a l i t a t i v e V e r t e i l u n g d e r S t o f f e
Das Fluoreszenzm uster von P lod ia (Abb. 1; Tab. 1) um faßt folgende Flecke: b, cx , gr, e, Iso- xanthopterin (g ), X anthopterin (h ) , g und 2- A m ino-6-hydroxypteridin (kx). D er grün fluoreszierende Fleck gr, der wahrscheinlich dem „d-Stoff“ von E phestia entspricht, kom m t nu r beim W ildtyp vor; anderseits tr itt bei Stam m 6 ein blauvioletter
2 F. F. d e A l m e id a , Z. Naturforschg. 13, 617 [1958].3 A . K ü h n , Naturwissenschaften 42, 529 [1955].4 A . E g e l h a a f , Z. Vererbungslehre 87, 769 [1956].5 E . R e is e n e r - G l a s e w a l d , Z. Vererbungslehre 87, 668 [1956].
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Abb. 1. Anordnung der fluoreszierenden Stoffe aus Köpfen vom Wildtyp (a) und Stamm 6 (b) von Plodia interpunctella auf zweidimensionalen Chromatogrammen. I —III : Flecken gruppen der eindimensionalen Chromatogramme (Abb. 4).
Abszisse: R f-Werte in Butanol-Essigsäure. Ordinate: R f-Werte in Propanol-Ammoniak.
Fleck (g ') auf, der den ändern Stäm m en fehlt; gr und g treten nur in sehr geringer Menge auf. Die drei Genotypen stimmen daher im wesentlichen qualitativ überein.
Der bei E phestia beschriebene „f-Fleck“ ist auch bei allen drei P/ocfo’a-M utanten nachweisbar, da er aber durch einen braunen Fleck teilweise verdeckt wird, wurde er nicht weiter berücksichtigt.
Es war festgestellt worden, daß der „ k-Fleck“ bei E phestia aus zwei blau fluoreszierenden, photolabilen Stoffen besteht (kj und k2) 6' 7,8, von denen der erstere dem 2-Am ino-6-hydroxypteridin und der zweite dem noch nicht völlig aufgeklärten P terid in
„HBo“ von D rosophila entspricht. Aus diesem geht durch UV-Bestrahlung u. a. die 2-Amino-6-hydr- oxypteridin-8-carbonsäure hervor.
Zur Untersuchung des k-Flecks von Plodia wurden aus zweidimensionalen Chromatogram men die betreffenden Flecke ausgeschnitten und 1/2 Stde. in dest. W asser gelegt. Von dem E luat wurden auf 2 Chrom atogramme je 2 Flecke aufgetragen und auf dieselben B lätter als Kontrollen 2-Amino-6-hydroxypteridin, die entsprechende Carbonsäure (8) und „HB2“ *. D er eine Fleck des Extrakts wurde jeweils mit UV bestrahlt (8 M in.). Als Lösungsmittel dienten N H 4C1 (3%) und N a2H P 0 4 (15%). Der Versuch wurde mit M aterial von jedem der drei Stämme durchgeführt.
Meßgruppe Fleeken-Nr. Fluoreszenzfarbe
R f in Pro- panol-XH3
R f in Butanol -Essigsäure n
I bClgr
orangeeisgrüngrün
0.070,100.14
0.080,150,22
2626
4II e
Isox.g'
X anth.
eisgrün violettbl. violett bl. blaugrün
0.190,180,260,25
0,160,230,160.23
2626
926
II I 2-A-6-hpt.. blau 0.35 0,33 26
Tab. 1. Fluoreszenzfarbe und ß/-W erte der fluoreszierenden Substanzen aus Köpfen von Plodia interpunctella. n = Anzahl der untersuchten Flecke. Isox. = Isoxanthopterin; X an th .= X anthopterin; 2-A-6-hpt. = 2-Amino-6-hydroxypteridin.
6 A. E g e lh a a f , Naturwissenschaften 43. 309 [1956]. 8 M. V is c o n tin i , A. K ü h n u . A. E g e lh a a f , Z. Naturforschg.7 M. V is c o n tin i, E . L o e s e r u . A. E g e lh a a f , Naturwissenschaf- 11b , 501 [1956].
ten 43, 379 [1956]. * Für die Überlassung der reinen Substanzen danke ichHerrn Prof. M. V is c o n tin i , Zürich.
FLUORESZIERENDE STOFFE IN DEN AUGEN DREIER GENOTYPEN 6 8 9
Die E rgebnisse w aren im m er gleich (Abb. 2) :1. D urch B estrahlung entsteht aus k kein Photolyse-
produkt,2. der Fleck aus der nicht bestrahlten Probe w an
dert einheitlich, und3. beide Flecke (bestrah lt und nicht bestrahlt) zei
gen genau denselben 7?/-Wert, den des 2-Amino- 6-hydroxypteridins.
Rf0,7
0.6
0.5
I 'oy 1<h0-3
^0,2
Abb. 2. Eindimensionales Chromatogramm von k-Extrakten aus Köpfen von Plodia und verschiedenen reinen Stoffen als Vergleichsubstanzen, a k-Extrakt mit UV (365 m^a) bestrahlt, b derselbe nicht bestrahlt, c 2-Amino-6-hydroxypteridin, d
„HB2“, e 2-Amino-6-hydroxypteridin-8-carbonsäure. L aufm ittel: NH4C1-Lösung.
Danach kann k von P lod ia als einheitliche Substanz (2-A m ino-6-hydroxypteridin) angesehen w erden ; „k2“ ( = H B 2) kom m t im Gegensatz zu E phestia nicht vor.
D a der g -F leck in der Fluoreszenzfarbe (violettblau) dem Isoxanthopterin gleicht, wurden noch die ähnlich fluoreszierenden Derivate Isoxanthopte- rincarbonsäure und Isoxanthopterinessigsäure zum Vergleich aufgetragen; g ist jedoch auf G rund der .fy-Werte m it keinem dieser beiden Stoffe identisch.
2. Q u a n t i t a t i v e V e r t e i l u n g d e r S t o f f e
Q uantitativ unterscheiden sich die drei Genotypen sehr sta rk (Abb. 3 ; Tab. 2 ) . Vergleicht m anden W ildtyp m it der rotäugigen M utante, so siehtm an, daß bei der letzteren alle fluoreszierendenStoffe m it A usnahm e von k in größerer Menge vorhanden sind. A ußerordentlich hoch ist die Fluoreszenzintensität des e-Flecks. D am it stim m en der Wildty p und d ie ro täu g ige M utante von P lod ia m it den
entsprechenden G enotypen von E phestia (a und a) vö llig überein .
Im Gegensatz dazu sind — w ieder m it Ausnahm e von k — bei Stamm 6 alle Fluoreszenzstoffe in viel geringerer Menge vorhanden als beim W ildtyp. Besonders auffallend ist die hohe K onzentration an 2-Am ino-6-hydroxypteridin, durch welche Stamm 6 an die M utante bch von E p h es tia 1,5 erinnert. Durch das (wenn auch schwächere) V orhandensein der übrigen fluoreszierenden Stoffe unterscheidet sich Stamm 6 aber wesentlich von bch.
Vergleicht m an die A ugenfarbe m it dem P terid in gehalt, so läßt sich feststellen, daß einer zunehm enden V erdunkelung der Augen eine V erm inderung der fluoreszierenden Stoffe entspricht. Auch hierin zeigt sich die Ü bereinstim m ung m it den V erhältnissen bei E phestia 9.
a) C harakterisierung d er genotyp isch en U nterschiede in eindim en sionalen C hrom atogram m en
Die Fluoreszenzintensitäts-V erteilung entlang eindim ensionalen C hrom atogram m en stim m t völlig mit den aus den zweidim ensionalen Chrom atogram m en gewonnenen Ergebnissen überein (Abb. 4 ) .
Im 1. Abschnitt zeigen W ild- und ra-Rasse einen viel höheren Gipfel als Stam m 6. Im 2. Abschnitt erhebt sich die ra-K urve außerordentlich hoch über die K urven der beiden anderen Genotypen. Im3. Abschnitt übertrifft Stam m 6 den W ildtyp und die M utante ra. Diese beiden Genotypen gleichen auch in der Intensitätsverteilung der eindim ensionalen Chrom atogram m e völlig dem W ildtyp und der a-M utante von E p h es tia 3.
b ) K orre la tion zw ischen 2 -A m in o-6 -h ydroxyp terid in und der e-Substanz
Die Zusam m enstellung der Fluoreszenzwerte von Stam m 6 ließ eine Beziehung zwischen e und2-A m ino-6-hydroxypteridin verm uten, indem häufig der E rhöhung des einen eine Senkung des anderen Flecks entspricht. D iese Beziehung w urde an H and von 26 Chrom atogram m en geprüft und als negative K orre la tion (K orrelationskoeffizient r = —0, 466; t r = 2 ,56* ) bestätigt. Sie ist nach dem J-Test m it
9 A. K ü h n , Naturwissenschaften 4 3 , 25 [1956].
) / l - r*
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Abb. 3. Verteilung und Konzentration (Höhe der Säulen = Galvano- meterwerte) der fluoreszierenden Stoffe in zweidimensionalen Chromatogrammen für drei Genotypen von Plodia interpunctella. Wildtyp (schwarze Säulen) im Vergleich zu
den Mutanten (weiße Säulen), a mit ra, b mit Stamm 6.
Stämme b ci e Isox. X anth. 2-A-6-hpt. gr g' T
1 71,3 1003,3 264,7 90,8 153,6 60,5 5,4 _ 1649,6(26) (26) (26) (26) (26) (22) (26)
13 92,3 1241.0 1757,4 187.8 519.1 42,2 — — 3839,8(20) (20) (20) (20) (20) (16)
6 13,2 285,4 70,7 54,3 70.3 479,9 — 6,6 980,4(26) (26) (26) (26) (26) (26) (26)
Tab. 2. Durchschnittliche Fluoreszenzintensität (in Galvanometereinheiten) der verschiedenen Flecke für drei Genotypen von Plodia interpunctella aus zweidimensionalen Chromatogrammen. Zahlen in ( ) = Anzahl der gemessenen Flecke.
T = Gesamtfluoreszenz.
P = 0 .0178 als „bedeutsam “ zu betrachten und weist Auch der Vergleich der F luoreszenzintensitäten auf eine stoffliche Beziehung zwischen diesen beiden von e- und k-Substanz bei den drei Genotypen Substanzen hin. (Abb. 3) läßt dieselbe A bhängigkeit erkennen.
NOTIZEN 6 9 1
Abb. 4. Fluorometer-Kurven eindimensionaler Chromatogramme; m ittlere Meßwerte von je 5 Köpfen der Genotypen ra+, ra und Stamm 6. Abszisse: 2-mm-Abschnitte der Chromatogrammstreifen. Laufm ittel: Propanol-Ammoniak. Die
Pfeile bezeichnen die Gipfel, welche den verschiedenen Flecken entsprechen.
DiskussionDer W ildtyp und die ro täugige M utante ra von
P lod ia zeigen dasselbe Stoffinventar in derselben quantitativen V erteilung wie die entsprechenden
N O T I
Zur Biosynthese des Coniins
Von U l r i c h S c h ie d t f und H a n s G ü n te r H ö s s
M ax-Planck-Institut für Biochemie, München(Z. Naturforschg. 13 b, 691—692 [1958] ; eingegangen am 12. Ju li 1958)
Die Alkaloide des gefleckten Schierlings ( Conium maculatum) Coniin, A^-Methyl-coniin, y-Conicein, Con- hydrin und Pseudoconhydrin gehören zur Klasse der Piperidinalkaloide. Nach R o b in so n 1 gilt Lysin als Ausgangssubstanz für die Biogenese dieser Gruppe von Alkaloiden. Um diese Hypothese zu prüfen, haben wir in die Blätter von 13 bis 14 Monate alten Schierlingspflanzen 2,2 mg uniform markiertes L-Lysin-14C • 2 HCl mit einer Gesamtaktivität von 9,8 * 106 Imp./Min. injiziert. Nach drei Tagen wurden die Pflanzen getrocknet und auf Coniin aufgearbeitet. Aus sieben Pflanzen wurden insgesamt 118 mg racemisches Coniin-hydrochlorid, Schmp. 113,5°, mit einer spezifischen Aktivität von 4,3 • 103 Imp./Min./mMol isoliert. Schmelzpunkt und spezifische Aktivität blieben auch nach mehrmaligem Umkristallisieren aus Aceton konstant. Eine C r a i g -
1 R. R o b in s o n , „The Structural Relations of Natural Products“, Oxford University Press, London 1955, p. 64.
Genotypen von Ephestia . Die M utante ra greift an späterer Stelle in die B ildungskette der Ommo- chrome ein als a; ih r genspezifisches Fluoreszenzm uster ist, wie Parabioseversuche gezeigt h a b e n 2, direkt abhängig vom A usfall der P igm entierung durch Ommochrome. Da die V erm ehrung der fluoreszierenden Stoffe bei ra vor allem P terid ine betrifft, haben wir es auch bei dieser M utante m it einem Fall von biochemischer P olyphänie zu tu n 9.
Die außerordentliche V erm ehrung von 2-Amino- 6-hydroxypteridin hat Stam m 6 m it der M utante bch von E phestia gem einsam. Im Gegensatz zu dieser ist aber Isoxanthopterin nicht reichlicher, sondern schwächer vorhanden als beim W ildtyp. D am it nähert sich Stam m 6 der M utante r o s y 2 von D roso p h ila 10, bei der Isoxanthopterin fehlt und 2-Amino- 6-hydroxypteridin gleichfalls stark angereichert w ird. Ob wie dort die A ktivität der X anthinoxydase betroffen ist, läßt sich noch nicht sagen. Ebenso bleibt noch zu untersuchen, ob der dunklere F arb eindruck des Auges m it der w eitgehenden R eduktion der gelben cx- und e-Substanz zusam m enhängt.
10 E. H a d o r n u . I. S c h w in c k , Z. Vererbungslehre 87, 5 2 8[ 1 9 5 6 ] .
Z E N
Fraktionen Nr. (r)Abb. 1. Grundprozeß der C r a i g - Verteilung, ra = 18, F = 2 ,0 . System sek. Butanol/W asser, V = 2 ,0 . • ---------- • experimentell gewonnene Kurve; x --------x auf G = 0,76 berechnete Kurve. Die spezifischen Aktivitäten der Fraktionen 4, 6, 8, 9, 11 sind in 103 Imp./Min./mMol 4,0; 4 ,5; 4,2; 4,3;
4,5.