Post on 16-Aug-2019
transcript
Agrar- und ErnährungswissenschaftlicheFakultät
Welche Gene regulieren die Fluchtund die Futtersuche?
In vivo Studien am Modellorganismus Caenorhabditis elegans
Hochschultagung 2017
Dr. Dieter-Christian Gottschling
Institut für Humanernährung und Lebensmittelkunde
Molekulare Prävention
CAU Kiel
02.02.2017
dcgottschling 2017 2
Bedeutung spezifischer Verhaltensweisen
adaptive Bewegungsverhalten: Flucht, Abwehr und Nahrungssuche
Beispiel: Nahrungssuche
• Fische (Ward et al., 2012; Nakayama et al., 2012; Voellmy et al., 2014)
• Insekten (Wu et al., 2003; Wu et al.2005; Zhang et al., 2013)
• Nematoden (Sawin et al., 2000; Milward et al., 2011; Pirri und Alkema, 2012)
• Nager (Levy et al., 2016; Wernecke et al., 2016)
• Primaten (Chapman, 1989; Oftedal et al., 1991; Boyer et al., 2006)
ArterhaltungÜberlebensstrategien
nachhaltigkeitsblog.de
rudelstellungen-klargestellt.de
dcgottschling 2017 3
Adaptive Antworten von C. elegans auf Nahrungsverfügbarkeit
• u.a. auf neuronaler Ebene reguliert
• entsprechende Mechanismen weitgehend ungeklärtangepasst nach Ben Arous et al., 2009
angepasst nach Calhoun et al., 2014
global search
Bewegungsverhalten Bewegungsaktivität
Hy
per
ak
tivit
ät
randomisierte Bewegung
gerichtete Bewegung
Nah
run
gsv
erfü
gb
ark
eit
dcgottschling 2017 4
Forschungsziel:
Identifizierung von neuen evolutionär konservierten Faktoren/Signalwegen
in Caenorhabditis elegans, die Bewegungsphänotypen induzieren
in silico Screen
Zweiporendomänen-Kalium Kanäle (K2P)
als potentielle Kandidaten identifiziert
• neuronal exprimiert
• regulieren das Membran-Ruhepotential
• in vivo Funktionen weitgehend ungeklärt
dcgottschling 2017 5
Aufbau und Funktion von K2P-Kanälen
M1 M
3
C-Terminus
N -Terminus
P1 P2
Zellmembran
K+
K+Extrazellulär
Zytosolisch
K+
(-)
(+)
nach Renigunta et al., 2015, angepasst
Hyperpolarisation
Null-Mutation,
SF-Mutation
Überexpression
-65 mV-80 mV
0 mV
Ruhepotential
nach Bear et al., 2005, angepasst
Regulatoren:• Temperatur, mechanische Stimulation, osmotische Stimulation
• PH, O2, Fettsäuren, posttranslationale Modifikationen
• Anästhetika, pharmakologische Wirkstoffe
SF
dcgottschling 2017 6
Methodik Teil I:
Teil I: Identifizierung von K2P-Kandidaten
mit Bewegungsphänotypen (K I)
Teil II: Suche nach
K I-Regulatoren (K II)
3. Phänotypisierung:
• Kriechen
• Schwimmen
2. Allel-Prüfung:
• PCR
• Sequenzierung
Zellebene:
• Motor Neuronen
1. C. elegans
Mutanten:
• Null-Allele
• SF-Allele
E. coli OP50 Agar-Platten, 20°C M9 Puffer, 20°C
Kriechbewegung (S-Form) Schwimmbewegung (C-Form)
Analyseparameter:• Aktivität (Geschwindigkeit, Wellen-Parameter)
• Verhalten (Bewegungsrichtung, Bewegungsdauer)
• Expressionsmuster (Mikroskopie: Co-Lokalisation)
• „Rescue“-Potential (biolistische Transformation)
• Zellspezifische Effekte (selektive Überexpression)
N2
twk-
7(nf1
20)
twk-
7(gk
7600
44)
twk-
30(o
k130
4)
twk-
40(tm
6834
)
twk-
43(g
k590
127)
twk-
46(g
k568
572)
0.00
0.03
0.05
0.08
0.10
0.13
0.15
0.18
0.20
****
Sp
on
tan
eou
s
cra
wli
ng v
elo
cit
y [
mm
*s-1
]
dcgottschling 2017 7
Ergebnisse: Kandidaten-Screen (K I) von C. elegans Mutanten
motor-neuronal exprimierter K2P-Kanälen
• TWK-7(null) Mutanten zeigen ein hyperaktives spontanes Kriechverhalten (ad libitum, 20°C).
N2
twk-7(null)
dcgottschling 2017 8
N2
twk-
7(nf1
20)
twk-
7(gk
7600
44)
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60*** ***
Sp
on
tan
eou
s B
BC
F [
Hz]
N2
twk-
7(nf1
20)
twk-
7(gk
7600
44)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50***
***
BB
SF
[H
z]
• TWK-7(null) induziert Hyperaktivität in einer koordinierten Art und Weise.
Ergebnisse: Bewegungsaktivität und -qualität von TWK-7(null) Mutanten
BBCF Body bending crawling frequency
BBSF Body bending swimming frequency
dcgottschling 2017 9
angepasst nach Donnelly et al., 2013 und Wormatlas.org
DB
VB VD
DD
VB
DB
AVB
PVC
D Kontraktion
Kontraktion
Entspannung
Entspannung
Muskulatur
V
Richtung der Wellenausbreitung
Richtung der Kriechbewegung
A
P
aktives exzitatorisches Signal
aktives inhibitorisches Signal
aktives Signal
inaktives Signal
DD
VD
Exkurs: Die sinusoidale Bewegung von C. elegans
Sensorisches Signal
(Nahrungsmangel)
dcgottschling 2017 10
Ergebnisse: Expressionsmuster von TWK-7 in C. elegans
V
KopfB
100 µm
A P
A anterior
P posterior
D dorsal
V ventral
D
Schwanz Neuronen
50 µm
Gelb: cholinerge Motor-Neuronen (exzitatorisch)
Rot: GABAerge Motor-Neuronen (inhibitorisch)
Kolokalisationsstudie (spezifische Genexpression):
• TWK-7 wird in allen cholinergen und GABAergen Motor-Neuronen exprimiert.
dcgottschling 2017 11
Ergebnisse: Zellspezifische Effekte durch selektive Überexpression
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
******
**
--
*********
Background:
twk-7(gk760044)
twk-7(nf120)
N2
Transgene: twk-7p::
TWK-7
unc-17p::
TWK-7
unc-17
(1kb)p::
TWK-7
unc-17
(1kb)p::
TWK-7
(G282C)
chol.
neurons
chol. MN
-
Sp
on
tan
eou
s B
BC
F [
Hz]
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
***
***
***
***
AMotor neurons:
Transgene:
D
- TWK-7 TWK-7(G282C)
B A B
-D
***
Background:
twk-7(null)
N2
Sp
on
tan
eou
s B
BC
F [
Hz]
• Die Expression von TWK-7 in cholinergen B-Typ Motor-Neuronen ist hinreichend
um die spontane Bewegungsaktivität zu modulieren.
chol.: cholinergic
MN: motor neurons
dcgottschling 2017 12
1. Vorwärtsgenetischer Screen (EMS-Mutagenese Screen)
3. Genotypisierung:
• WGS, Bioinformatik2. Phänotypisierung:
• Hyperaktivität
kin-2(cau-1) Allel(R92H)
Teil I: Identifizierung von K2P-Kandidaten
mit Bewegungsphänotypen (= TWK-7)
Teil II: Ermittlung von
TWK-7 Regulatoren
KIN-2KIN-1
cAMP
inaktive PKA
KIN-1KIN-2
cAMP
aktive PKA
angepasst nach Wang et al., 2013
Methodik Teil II: potentielle Regulatoren von TWK-7
KIN-2KIN-1
cAMP
dauerhaft inaktive PKA
kin-2 Allel
dominant-negativ(G310D)
X
dcgottschling 2017 13
N2
twk-
7(nf1
20)
kin-2
(cau
1)
pde-
4(ce
268)
gsa-
1(ce
94)
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
***
***
******
twk-7(null)
Gs(gf)
Sp
on
tan
eo
us
BB
CF
[H
z]
• GαS(gf)-Mutanten phänokopieren die hyperaktive Kriechbewegung von TWK-7(null).
gf : „gain-of-function“
Ergebnisse Teil II: Potentielle Regulatoren von TWK-7
KIN-1KIN-2
cAMP
aktive PKA
TWK-7
Hyperaktivität!
geschlossener
Kanal
cAMPPDE-4
ACY-1
GSA-1
AMP
?
dcgottschling 2017 14
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
Transgene: (-)unc-47p::
twk-7
unc-47p::
kin-2(G310D)
N2
twk-7(nf120)
kin-2(cau-1)
twk-7,kin-2
***
******
* *
**
******
******
***
**
Sp
on
tan
eo
us
BB
CF
[H
z]
• TWK-7(null) und die PKA/KIN-1 induzieren epistatisch Hyperaktivität
während der spontanen Kriechbewegung.
KIN-1KIN-2
cAMP
aktive PKA
TWK-7
Hyperaktivität!
geschlossener
Kanal
Epistase
Ergebnisse Teil II: Regulation von TWK-7
erster Hinweis
auf Epistase
dcgottschling 2017 15
***
0
20
40
60
80
100
Transgene: (-)unc-47p::
twk-7
unc-47p::
kin-2(G310D)
N2
twk-7(nf120)
kin-2(cau-1)
twk-7,kin-2
****
**
****
*
**
**
Sp
on
tan
eo
us
cra
wli
ng
str
aig
htn
ess
[%
]
1 mm
KIN-1KIN-2
cAMP
aktive PKA
TWK-7
geradliniges, gerichtetes
Bewegungsverhalten!
geschlossener
Kanal
N2 twk-7(nf120)
twk-7(null) Hintergrund
unc-47p::kin-2(G310D)
twk-7(null) Hintergrund
kin-2(cau-1) Hintergrund
unc-47p::kin-2(G310D)
Epistase
• TWK-7(null) und die PKA/KIN-1 induzieren epistatisch ein geradliniges, gerichtetes
Verhalten während der spontanen Kriechaktivität.
Ergebnisse Teil II: Regulation von TWK-7
zweiter Hinweis
auf Epistase
dcgottschling 2017 16
0
20
40
60
80
100
Transgene: (-) unc-47p::twk-7 unc-47p::kin-2(G310D)
N2
twk-7(nf120)
kin-2(cau-1)
twk-7,kin-2
f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b f r b
f : forwardr : restingb : backward
Crawling activity:
***
*** ***
*
*
*** ***
******
***
*
*** ***
**
***
***
Tem
po
ral
dis
trib
uti
on
of
spo
nta
neo
us
cra
wli
ng
[%
]
KIN-1KIN-2
cAMP
aktive PKA
TWK-7
persistierende
Vorwärtsbewegung!
geschlossener
Kanal
N2
twk-7(nf120) 10 mm
Time span: 17h
ad libitum
Epistase
• TWK-7(null) und die PKA/KIN-1 induzieren epistatisch eine persistierende
Vorwärtsbewegung während der spontanen Kriechaktivität.
Ergebnisse Teil II: Regulation von TWK-7
dritter Hinweis
auf Epistase
dcgottschling 2017 17
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8N2
twk-7(nf120)
kin-2(cau-1)
twk-7,kin-2
off foodon food
*** *** ***
** ** **
*
Net-
forw
ard
BB
CF
[H
z]
on food
on food
off food
off food
WT, 20°C
WT, 20°C
D.-Ch. Gottschling, 2016, unveröffentlicht
WT: Wildtyp
• TWK-7(null) und die PKA/KIN-1 agieren epistatisch während
der Nahrungssuche, ohne die Netto-Vorwärtsaktivität im
nahrungsfreien Raum weiter zu steigern.
Adaptives Verhalten im Kontext von Nahrungsverfügbarkeit
dcgottschling 2017 18
Zusammenfassung:
Implikation eines Modells für adaptives Verhalten in C. elegans
KIN-1KIN-2
cAMP
aktive PKA
TWK-7
multiple
Bewegungs-
Phänotypen
(adaptives Verhalten)
geschlossener
K2P Kanal
Nahrungsmangel
Effiziente
Erschließung neuer
NahrungsquellenEpistase
C. elegans
(sensorisches Signal)
+ weitere Faktoren/Signalwege
Ähnliche Verhaltensweisen: Insekten, Fische, Nager und Primaten.
Modell
dcgottschling 2017 19
Konklusion:
• TWK-7 ist hiermit der erste K2P-Kanal in C. elegans, für den
native in vivo -Funktionen charakterisiert wurden.
• Die Epistase zwischen PKA und TWK-7 generiert multiple
Phänotypen, die das Bewegungsverhalten spezifisch
beeinflussen.
• Die induzierten Phänotypen sind diejenigen, die während der
Nahrungssuche auch durch andere Organismen manifestiert
werden.
dcgottschling 2017 20
The Molecular Prevention Lab:
University of Kiel
Institute of Human Nutrition and Food Science
Dept. of Molecular Prevention
Heinrich - Hecht - Platz 10
24118 Kiel
Tel.: ++49-(0)431/880-5657
Fax: ++49-(0)431/880-5658
Lüersen, K., Gottschling, D. Döring, F. (2016)
Complex Locomotion Behavior Changes Are Induced in Caenorhabditis elegans by the Lack of the Regulatory Leak K+
Channel TWK-7. GSA GENETICS Journal
Gottschling, D., Döring, F., Lüersen, K. (2016)
The Gαs pathway and the two-pore domain K+ channel TWK-7 act epistatically in GABAergic motor neurons to affect the
locomotion behavior of Caenorhabditis elegans. GSA GENETICS Journal (under review)
Recently published:
The model organism
Caenorhabditis elegans Kai Lüersen Dieter Gottschling Frank Döring