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Untersuchung zur Einsetzbarkeit
der Psoralen-PEO-Biotin Markierung
in der DNA-Microarray Technologie
für die Analyse von Starterkulturbakterien
und ihren Phagenresistenzgenen
Dissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
dem Fachbereich Biologie / Chemie
der
Universität Bremen
vorgelegt von
Michael Patrick Schmidt
Bremen 2004
1. Gutachter: Prof. Dr. Dietmar Blohm
2. Gutachter: PD Dr. Bernd Kazmierczak
Tag des Promotionskolloquiums:
02.06.2004
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG 1
1.1. Biotechnische Produktion von Milchprodukten 2 1.1.1. Genetische Ursachen von Fehlfermentationen................................................ 3 1.1.2. Phagenresistenzmechanismen bei Lactococcus lactis..................................... 4
1.2. Klassische Analyse in der milchverarbeitenden Industrie 7
1.3. DNA-Chip Technologie zur simultanen Genanalyse 7 1.3.1. Fragmentierungsmethoden ............................................................................ 10 1.3.2. Detektionsmethoden...................................................................................... 13 1.3.3. DNA-Markierungsmethoden......................................................................... 15 1.3.4. Strategien zur Signalamplifikation................................................................ 18
1.4. Ziel der Arbeit 20
2. MATERIAL UND METHODEN 22
2.1. Lösungen und Puffer 22
2.2. Medien und Stammhaltung 22 2.2.1. Anzucht von Mikroorganismen..................................................................... 22 2.2.2. Stammhaltung und Lagerung ........................................................................ 23
2.3. Probenmaterial 23 2.3.1. Starterkulturen............................................................................................... 23 2.3.2. Referenzstämme der DSMZ.......................................................................... 23
2.4. Extraktion von genomischer DNA und RNA 24
2.5. Molekularbiologische Software und Datenbanken 24
2.6. Oligonukleotide 25 2.6.1. Primerauswahl ............................................................................................... 25 2.6.2. Primer für den Nachweis der Phagenresistenzgene ...................................... 25 2.6.3. Sondendesign ................................................................................................ 29 2.6.4. Sonden für die Detektion von Bakterien ....................................................... 30 2.6.5. Sonden für die Detektion von Phagenresistenzgenen ................................... 31 2.6.6. Sonden und Primer für das Modellsystem .................................................... 34 2.6.7. Testen der Sondenfunktion............................................................................ 34
2.7. PCR-Amplifikation 35 2.7.1. Probenaufbereitung ....................................................................................... 35 2.7.2. Amplifizierung der Phagenresistenzgene...................................................... 35 2.7.3. Multiplex-PCR .............................................................................................. 36 2.7.4. Agarose-Gelelektrophorese........................................................................... 36 2.7.5. Einzelstrangisolierung................................................................................... 37
2.8. Fragmentierung von genomischer DNA mit Hydroxylradikalen 37 2.8.1. Konzentrationsabhängige Fragmentierung ................................................... 38 2.8.2. Temperatur- und zeitabhängige Fragmentierung .......................................... 39
2.8.3. Optimiertes Protokoll für die Fragmentierung von genomischer DNA........ 39
2.9. Markierung von DNA 40 2.9.1. Markierung von PCR-Produkten mit Psoralen-PEO-Biotin ......................... 40 2.9.2. Kontrolle der Markierungsreaktion mittels Streptavidin-Gelshiftassay........ 41 2.9.3. Direkter Vergleich des PCR-Primer Endlabels und der Psoralen-PEO-
Biotin Markierung......................................................................................... 41 2.9.4. Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration ................................. 42 2.9.5. Markierung von genomischer DNA.............................................................. 42
2.10. DNA-Microarray Hybridisierung 43 2.10.1. Chipherstellung und Sondenpositionierung .................................................. 43 2.10.2. Hybridisierungsprotokoll .............................................................................. 43 2.10.3. Auswertung der Hybridisierung .................................................................... 44 2.10.4. Optimierung der STV-Cy5 Detektionsreaktion ............................................ 45 2.10.5. Hybridisierung gegen einen Sondengradienten............................................. 45 2.10.6. Spezifischer Nachweis von Genen mit dem DNA-Microarray..................... 45 2.10.7. Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA.............. 46 2.10.8. Hybridisierungsprotokoll für genomische DNA ........................................... 47 2.10.9. Tyramid Signalamplifikation ........................................................................ 47
3. ERGEBNISSE 48
3.1. Modellsystem für die Markierungsreaktion mit Psoralen-PEO-Biotin 48 3.1.1. Test der entwickelten Primer für das Modellsystem..................................... 49 3.1.2. Hybridisierung von endmarkierten PCR-Produkten auf dem DNA-
Microarray..................................................................................................... 49 3.1.3. Kontrolle der Psoralen-PEO-Biotin Markierung mittels Streptavidin-
Gelshiftassay ................................................................................................. 51 3.1.4. Hybridisierung von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten auf
dem DNA-Microarray ................................................................................... 52 3.1.5. Direkter Vergleich der Signalintensitäten von endmarkierter und Psoralen-
PEO-Biotin markierter DNA......................................................................... 53
3.2. Optimierung der Markierungs- und Detektionsmethode 54 3.2.1. Optimierung des Verhältnisses zwischen Psoralen-PEO-Biotin und DNA-
Base ............................................................................................................... 54 3.2.2. Optimierung der Streptavidin-Cy5 Konzentration........................................ 56 3.2.3. Optimierung der Sondenkonzentration ......................................................... 57 3.2.4. Nachweisgrenze von Psoralen-PEO-Biotin und endmarkierten PCR-
Produkten ...................................................................................................... 58
3.3. Sondendesign und Primerauswahl 60 3.3.1. Datenbankrecherche ...................................................................................... 60 3.3.2. Auswahl der Sondenoligos............................................................................ 60 3.3.3. Testen der Primerfunktion............................................................................. 61 3.3.4. Testen der Sondenfunktion............................................................................ 62
3.4. Fragmentierung von genomischer DNA 64 3.4.1. Konzentrationsabhängige Fragmentierung von genomischer DNA ............. 64 3.4.2. Temperatur- und zeitabhängige Fragmentierung von genomischer DNA .... 65
3.5. Hybridisierung von genomischer DNA 67 3.5.1. Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA.............. 67 3.5.2. Hybridisierung von genomischer DNA mit unterschiedlichen
Fragmentlängen............................................................................................. 69 3.5.3. Spezifität des Nachweissystems.................................................................... 71 3.5.4. Nachweisgrenze der rDNA-Gene bei der Hybridisierung von genomischer
DNA .............................................................................................................. 73 3.5.5. Alternativer Nachweis von Bakterien über rRNA ........................................ 74 3.5.6. Direkte Detektion von Phagenresistenzgenen in Starterkulturen.................. 75
3.6. Signalamplifikation 78 3.6.1. Multiplex-PCR für den Nachweis von Phagenresistenzgenen...................... 78 3.6.2. Signalamplifikation durch den Einsatz von TSA.......................................... 81
4. DISKUSSION 83
4.1. Parameteranalyse zur Steigerung der Sensitivität auf dem DNA-Microarray 83
4.2. Sondenauswahlverfahren für den Einsatz auf dem DNA-Microarray 91
4.3. Paralleler Nachweis von Organismen und Phagenresistenzgenen 96 4.3.1. Aspekte bei der Hybridisierung von genomischer DNA .............................. 96 4.3.2. Direkter Nachweis von Bakterien aus Reinkulturen ..................................... 97 4.3.3. Direkter Nachweis von funktionellen Genen aus biologischem
Probematerial .............................................................................................. 102 4.3.4. Methodische Aspekte zur Signal- und Targetamplifizierung ..................... 104
4.4. Ausblick 106
5. ZUSAMMENFASSUNG 108
6. LITERATUR 110
7. ANHANG 129
Abkürzungsverzeichnis
Abi Abortive Infektion
biovar. Biovariation
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin
Cy3 5,5'-Disulfo-1,1'-(γ-carbopentynyl)-3,3,3',3'-tetramethylindolo-
carbocyanin-N-hydroxysuccimidester
DMSO Dimethylsulfoxid
rDNA ribosomale Gene
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
ds doppelsträngig
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
EBI European Bioinformatics Institute
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EMBL European Molecular Biology Laboratory
FISH Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
gDNA genomische DNA
G+C Mol% Guanin und Cytosin
L. Lactococcus
NCBI National Center for Biotechnology Information
OD optische Dichte
PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PCR Polymerase-Ketten-Reaktion
PEO Polyethylenoxid
PMT Photomultiplier
rRNA RNA der ribosomalen Gene
rpm Runden pro Minute
ss einzelsträngig
SDS Natriumdodecylsulfat
SNP Single nucleotide polymorphism
STV Streptavidin
TSA Tyramid Signalamplifikation
ÜN über Nacht
1. Einleitung 1
1. Einleitung
Die DNA-Microarray Technologie hat sich seit ihrer Einführung in den frühen neunziger
Jahren zu einer der wichtigsten Methoden für die simultane Gen-Analyse entwickelt, die auf
dem Prinzip der reversen Hybridisierung beruht. In diesem Hybridisierungsformat werden
oberflächenimmobilisierte Sonden für das spezifische „Einfangen“ von Zielmolekülen
eingesetzt. Durch die hohe Anzahl von heutzutage weit über hunderttausend Sonden pro cm2
auf einem Chip wird eine hochparallele Datenanalyse ermöglicht. Die DNA-Microarray
Technologie wird mittlerweile in vielen Forschungsbereichen von der Identifikation von
Organismen (Zhou, 2003), SNP-Detektion (Guo et al., 1994), „Sequencing by Hybridization“
(Eickhoff et al., 1996), Populationsgenetik (Chakravarti, 1999), Proteomics (Blagoev and
Pandey, 2001; Templin et al., 2002), Genomics (Schoolnik, 2002) und der
Krankheitsdiagnose (Howbrook et al., 2003) eingesetzt, welches sich in der Anzahl von über
4000 Publikationen widerspiegelt (November 2003, NCBI).
Neuere Ansätze versuchen, neben den erwähnten Bereichen der angewandten Forschung,
auch industriellen Anforderungen gerecht zu werden. Dabei stellt die Überwachung der
Produktqualität von Lebensmitteln eine der möglichen industriellen Anwendungen der DNA-
Microarrays dar (Blohm and Guiseppi-Elie, 2001; Howbrook et al., 2003). Vor allem in den
Bereichen, in denen Bakterien zur biotechnischen Fermentation von Nahrungsmitteln
eingesetzt werden, ist es das Ziel des Produzenten, hochwertige Produkte in einem beliebig
langen Zeitraum unverändert anbieten zu können. Eine Überwachung der Produktqualität ist
durch die vorgeschriebene mehrtägige Lagerungsfrist mit hohen Lager- und Personalkosten
verbunden und könnte durch die wesentlich kostengünstigere Chip-Technologie ergänzt und
langfristig ersetzt werden.
Im Blickpunkt dieser Arbeit steht die Anwendung von DNA-Microarrays für die
Untersuchung von Starterkulturbakterien und ihren Phagenresistenzgenen in der
Milchanalytik, da bei der biotechnischen Produktion von Milchprodukten Fehlfermentationen
auftreten, die unterschiedliche Ursachen haben können. In der Folge sollen zunächst
Grundlagen und Probleme bei der biotechnischen Produktion von Milchprodukten aufgezeigt
werden. Es schließt sich dann eine nähere Betrachtung der DNA-Microarray Technologie an –
von ihren Ursprüngen, über gängige Anwendungen bis hin zu den besonderen Anforderungen,
die sich für die Beantwortung dieser komplexen Fragestellungen ergeben.
1. Einleitung 2
1.1. Biotechnische Produktion von Milchprodukten
In der Bundesrepublik Deutschland wurden im Jahr 2002 29,4 Mio. t Milch an Molkereien
geliefert. Durch Fermentation wurden daraus 41.100 t Sauermilch- und Kefirerzeugnisse,
34.500 t Joghurt, 451.200 t Frischkäse, 43.500 t Sauermilchquark und 1.505.500 t Käse
hergestellt (Jahresbericht der Milchwirtschaft, 2002).
Für die Herstellung dieser Milchprodukte werden vorrangig Milchsäurebakterien der Gattung
Lactobacillus, Lactococcus und Leuconostoc eingesetzt (Daly et al., 1996). Sie bilden
Milchsäure aus Lactose. Durch die Freisetzung des Lactats und die damit verbundene
Ansäuerung der Milch koaguliert das Casein, es kommt am isoelektrischen Punkt des
Milchproteins bei einem pH-Wert von 4,7 zur Dicklegung der Milch. Die Milchsäure und
andere freigesetzte Stoffwechselprodukte wie Wasserstoffperoxid, organische Säuren und
Bacteriocine wirken antagonistisch auf saprophytische oder pathogene Bakterien und
verbessern dadurch die Haltbarkeit des Produkts. Stoffwechselnebenprodukte, wie Diacetyl
und Acetaldehyd, die aus dem Citratstoffwechsel stammen, sind charakteristische
Aromakomponenten der verschiedenen Milchprodukte (Ramos et al., 1994).
Die Fähigkeit von Mikroorganismen, die in der Milch enthaltenen Rohstoffe in
Stoffwechselprodukte mit neuem Geschmack oder anderer Konsistenz umzubauen, erlaubt es
heute einem ganzen Industriezweig, das Ausgangsprodukt Milch mit Hilfe von Starterkulturen
zu veredeln. Starterkulturen sind aufgrund spezifischer Eigenschaften selektierte, definierte
und lebensfähige Mikroorganismen in Reinkultur oder Mischkultur. Sie werden
Lebensmitteln in der Absicht zugesetzt, das Aussehen, den Geruch und Geschmack und die
Haltbarkeit zu verbessern (Weber, 1996). In vielen Bereichen der Lebensmittelindustrie hat
die Anwendung von Starterkulturen inzwischen einen festen Platz. Zu nennen ist z.B. die
Nutzung der alkoholischen Gärung von Reinzuchthefen bei der Herstellung von Bier und
Wein. Weiterhin werden bei der milchsauren Vergärung von Sauerkraut, Obst- und
Gemüsesaft Starterkulturen mit definierter Zusammensetzung verwendet (Weber, 1996).
Je nach Temperaturoptimum der in der Starterkultur enthaltenen Bakterien unterscheidet man
mesophile (Temperaturoptimum bei 22 bis 30°C) und thermophile Kulturen, deren optimale
Wachstumstemperatur bei 38 bis 45°C liegt (Cogan and Accolas, 1996). Die Starterkulturen
können sich aus einem einzigen Stamm (single strain starter cultures), mehreren Stämmen der
gleichen Bakterienspezies (single species, multiple strain starter cultures) oder aus mehreren
verschiedenen Spezies (multiple species starter cultures) zusammensetzen. In der
Milchwirtschaft werden mesophile Säuerungskulturen vor allem für die Rahmsäuerung und
1. Einleitung 3
die Herstellung von Frisch-, Schnitt- und Weichkäse sowie Dickmilch eingesetzt.
Starterkulturen mit thermophilen Milchsäurebakterien, zu denen die Bakterien Streptococcus
salivarius ssp. thermophilus, Lactobacillus delbrückii ssp. bulgaricus, Lactobacillus
helveticus und Lactobacillus delbrückii ssp. lactis angehören, werden für die Produktion von
Hartkäse, Butterkäse, Joghurt und Sauermilchquark benötigt. Bei der Herstellung von
Speisequark werden undefinierte, mesophile Kulturen eingesetzt, die aus homofermentativen
Stämmen der Gattung Lactococcus (L. lactis ssp. lactis, L. lactis. ssp. cremoris, L. lactis. ssp.
lactis biovar. diacetylactis) und aus dem heterofermentativen Stamm Leuconostoc
mesenteroides ssp. cremoris zusammengesetzt sind. Während die homofermentativen Stämme
der Gattung Lactococcus hauptsächlich für die Säuerung zuständig sind, bilden L. lactis. ssp.
lactis biovar. diacetylactis und der heterofermentative Leuconostoc-Stamm die wichtigen
Aromakomponenten Diacetyl und Acetoin (Weber, 1996; Siezen et al., 2002).
1.1.1. Genetische Ursachen von Fehlfermentationen
Bei der biotechnischen Produktion von Milchprodukten kann es zu Säuerungsstörungen der
Fermentation kommen, die unterschiedliche Ursachen haben können. 70-80 % aller
Produktionsstörungen während einer Fermentation werden durch Phagen verursacht (Hunger,
1986), die durch unzureichende Desinfektion der Fermenter in die Produktionstanks gelangen
(Riemelt, 1986). Die anschließende selektive Lyse von Starterkulturspezies führt zu
Säuerungsstörungen und kann zu kompletten Produktionsausfällen führen (Klaenhammer and
Fitzgerald, 1994). Aber auch bakterielle Verunreinigungen können die in der Starterkultur
enthaltenen Mikroorganismen verdrängen und so die Organismenzusammensetzung während
einer Fermentation verschieben. Aus diesem Grund wird die Milch nicht mehr zum
gewünschten Produkt umgesetzt. Außerdem können die Phagenresistenzgene, die bei der
Gattung Lactococcus zu 95% Plasmid-codiert sind (Siezen et al., 2002), bei Verlust dieser
extrachromosomalen DNA nicht mehr exprimiert werden. Die Abwehr gegen Phagen ist in
diesem Fall begrenzt und kann zur selektiven Lyse der Milchsäurebakterien führen. Durch die
Minimierung der Anzahl der an der Fermentation beteiligten Milchsäurebakterien, wird die
Säuerungsaktivität reduziert oder kommt vollständig zum Erliegen.
1. Einleitung 4
1.1.2. Phagenresistenzmechanismen bei Lactococcus lactis
Die Starterkulturbakterien können auf die ständige Bedrohung der Bakteriophagen durch
verschiedene Verteidigungsmechanismen reagieren (Forde and Fitzgerald, 1999). Abhängig
davon, in welcher Infektionsphase die Abwehr erfolgt (siehe Abb. 1), werden die
Phagenresistenzgene in vier Gruppen unterteilt (Hill, 1993; Garvey et al., 1995b; Allison and
Klaenhammer, 1998).
Abb. 1. Phagenresistenzmechanismen bei Lactococcus spec. (Glöckner, 2002) I Verhinderung der Phagenadsorption II Blockierung der DNA-Penetration III Restriktion der Phagen-DNA IV Abortive Phageninfektion – Inhibition des Phagenzusammenbaus
Gene der Gruppe I und II beeinflussen das Eindringen der Phagen-DNA in das Bakterium.
Entweder wird die Adsorption des Phagen an die Bakterienhülle verhindert (Forde and
Fitzgerald, 1999) oder die Injektion der Phagen-DNA wird blockiert (Geller et al., 1993). Bis
heute konnte nur jeweils ein Gen für diese Art der Phagenresistenz identifiziert werden (siehe
Tab. 1).
Die auf Restriktion und Modifikation basierenden Abwehrmechanismen (R/M-Systeme) der
Gruppe III werden aufgrund der Struktur ihrer Untereinheiten, der Sequenzerkennung, der
Position der Schnittstelle und des Bedarfs an Cofaktoren in 3 Typen klassifiziert (Siezen et
al., 2002). Die Restriktion wirkt nicht gezielt gegen Phagen-DNA, sondern erkennt Fremd-
DNA aufgrund von Basen-Methylierungen, die nicht dem für die Bakterienzelle typischen
Muster entsprechen. Die zellfremde DNA wird geschnitten und abgebaut. Zu den am
weitesten verbreiteten Abwehrmechanismen des R/M-Systems gehören die Gene des Typ II,
von denen bei der Gattung Lactococcus bisher 8 verschiedene identifiziert werden konnten
(siehe Tab. 1).
Die vierte Gruppe der Phagenresistenzgene wird unter dem Begriff „Abortive
Phageninfektion“ zusammengefasst (abi-Gene, siehe Tab. 1). Es konnten bisher 21
verschiedene abortive Phageninfektionsgene in Lactococcus lactis nachgewiesen werden, die
XXXX XXXX XX
I II III IV
1. Einleitung 5
die Replikation, die Transkription, die Translation und die Verpackung der Phagen-DNA ins
Capsid durch unterschiedliche Mechanismen unterbinden (Siezen et al., 2002). Wie aus der
Tab. 1 hervorgeht, beschränkt sich die durch abi-Gene vermittelte Resistenz nicht nur auf
einzelne Phagen, sondern gilt, soweit getestet, für mehrere Phagen der gleichen Spezies.
Da die bis jetzt gefundenen Resistenzgene unterschiedliche Abwehrmechanismen auslösen
können, sollten Starterkulturen über ein breites Spektrum von Phagenresistenzgenen verfügen,
um sich effektiv vor einer Phagen-Infektion schützen zu können. Durch die Kombination der
Resistenzgene mit unterschiedlicher Phagenspezifität wird zusätzlich ein Schutz vor einer
Vielzahl von Phagen gewährleistet (Siezen et al., 2002). Die Auswahl der Starterkulturen, die
ein breites Spektrum von Phagenresistenzgenen besitzen und so zu einer stabilen
Fermentation beitragen können, kam bisher in der Milch-Industrie nicht zur Anwendung.
Gen kodiert auf
Stamm Resistenz gegen
Mechanismus Literatur
Inhibition der Phagenadsorption:
ads pCI858 L.l.c. H20 936: 712 c6A: c2
Interaktion beim Anheften der Phagen
(Forde and Fitzgerald, 1999)
Blockierung der DNA-Injektion:
pip Chr L.l.l. C2 c6A: c2 verhindert die DNA-Injektion
(Geller et al., 1993)
DNA-Restriktion:
lldI pIL2614 L.l.l. Il1403 Fremd-DNA RM Typ I (Schouler et al., 1998)
lla1403 Chr L.l.l. IL1403 Fremd-DNA RM Typ I (Schouler et al., 1998b)
scrFI Chr L.l.c. UC503 Fremd-DNA 5'-CC↓NGG-3'
RM Typ II (Davis et al., 1993)
llaI pTR2030 L.l.l. ME2 Fremd-DNA 5'-CC↓WGG-3'
RM Typ II (O'Sullivan et al., 1995)
llaII pSRQ700 L.l.c. DCH-4 Fremd-DNA 5'-↓GATC-3'
RM Typ II (Moineau et al., 1995)
llaBI pJW563 L.l.c. W56 Fremd-DNA 5'-C↓TRYAG-3'
RM Typ II (Nyengaard et al., 1996)
llaBII pJW565 L.l.c. W56 Fremd-DNA RM Typ II (Nellermann et al., 1997)
llaCI pAW153 L.l.c. W15 Fremd-DNA 5'-AA↓GCTT-3'
RM Typ II (Madsen and Josephsen, 1998a)
llaDII pHW393 L.l.c. W39 Fremd-DNA 5'-GC↓NGC-3'
RM Typ II (Madsen and Josephsen, 1998b)
llaKR2I pKR223 L.l.l. diacetyl KR2 Fremd-DNA 5'-↓GATC-3'
RM Typ II (Twomey et al., 1998)
llaFI pND801 L.l.c. LL42-1 Fremd-DNA RM Typ III (Su et al., 1999)
1. Einleitung 6
Abortive Phageninfektion:
abiA pCI750, pTR2030, pCI829
L.l.l. ME2 936: sk1, 712 P335: φ31, ul36, φ48, φ50 c6A: c2
stört die Phagen-DNA-Replikation (Dinsmore and Klaenhammer, 1997)
abiB pIL2101 L.l.l. IL416 936: bIL170, nicht bIL41 Degradation des Phagen-transkripts (RNase-Aktivität)
(Cluzel et al., 1991)
abiC pTN20 L.l.l. ME2 936: sk1, jj50, P2 P335: ul36 c6A: c2
geringere Synthese von Phagen- Strukturproteinen
(Durmaz et al., 1992)
abiD pBF61 L.l.l. KR5 936: sk1 c6A: c2
Interaktion mit der Phagen-DNA (McLandsborough et al., 1995)
abiD1 pIL105 L.l.l. IL1403 936: bIL66, bIL170 c6A: c6A, bIL67
Interaktion mit Phagen-Gen-produkt, keine Translation der Phagen-RNA
(Anba et al., 1995)
abiE pNP40 L.l.l. diacetyl DRC3
936: φ712 Interferrenz bei der Phagenentwicklung in der späten lytischen Phase
(Garvey et al., 1995a)
abiF pNP40 L.l.l. diacetyl DRC3
936: φ712 c6A: φc2
verhindert die Phagenreplikation (Garvey et al., 1997)
abiG pCI750 L.l.c. UC653 936: φ712 c6A: φc2
stört die Synthese der Phagen-RNA in der späten lytischen Phase
(O'Connor et al., 1996)
abiH Chr L.l.l. diacetyl S94
936: φ59 c6A: φ53 (pr)
Mechanismus unbekannt (Prevots et al., 1996)
abiI pND852 L.l.l. M138 936: φ712 c6A: φc2
Mechanismus unbekannt (Su et al., 1997)
abiK pSRQ800 L.l.l. W1 936: p2, sk1, jj50 P335: ul36, Q30, Q33
Interaktion bei der Reifung der konkatemeren Phagen-DNA
(Emond et al., 1997)
abiL pND861 L.l.l. diacetyl LD10-1
936: φ712 c6A: φc2
posttranskriptionale Störung des lytischen Zyklus
(Deng et al., 1999)
abiM pND859 L.l.l. diacetyl UK12922
936: 712 Interaktion mit der Phagen-DNA (Deng et al., 1997)
abiN Chr L.l.c. S114 936: φ59 c6A: φ53
Mechanismus unbekannt (Prevots et al., 1998)
abiO pPF144 - 936: φ59 c6A: φ53
Mechanismus unbekannt (Prevots and Ritzenthaler, 1998)
abiP pIL2614 L.l.l. IL1403 nicht bestimmt Mechanismus unbekannt (Portugal et al., 1998)
abiQ pSRQ900
L.l. W37 936: p2 c6A: c21
konkatemere Phagen-DNA kann nicht mehr verpackt werden
(Emond et al., 1998)
abiR pKR223 L.l.l. diacetyl KR2
c2 stört die Phagen-DNA-Replikation (Twomey et al., 2000)
abiS pAW601 L.l.l. W60 nicht bestimmt Mechanismus unbekannt (Matvienko et al., 2001)
abiT pED1 L.l. W51 936: p2, p2k, sk1, jj50 P335: ul36, Q30, φ31, φ50
stört die Phagen-DNA-Replikation und die Phagen-DNA-Verpackung ins Capsid
(Bouchard et al., 2002)
abiU pND001 L.l.l. LL51-1 c2: φc2 936: φ712 P335: φul36
Stört die Synthese der Phagen-RNA
(Dai et al., 2001)
Tab. 1. Phagenresistenzgene bei Lactococcus lactis: Verhinderung der Adsorption des Phagens, Blockade der DNA-Injektion, Restriktion der Phagen-DNA und abortive Phageninfektion.
1. Einleitung 7
1.2. Klassische Analyse in der milchverarbeitenden Industrie
Um die mikrobiologische Qualität in der milchverarbeitenden Industrie zu gewährleisten,
stehen eine Reihe von Standardtechniken für die Untersuchung und Charakterisierung von
Milchprodukten zur Verfügung. In der Produktionsroutine wird dabei zumeist noch auf die
Methoden der klassischen Mikrobiologie zurückgegriffen (Glöckner, 2002). Die
Organismenidentifizierung erfolgt nach zum Teil mehrtägiger Kultivierung auf
Differenzierungsmedien. Neuere Ansätze beruhen auf molekularbiologischen Methoden, die
hinsichtlich ihrer Genauigkeit, Nachweisgrenze und dem benötigten Zeitaufwand stetig
verbessert werden. Es stehen eine Reihe von molekularbiologischen Nachweisverfahren zur
Organismenidentifizierung zur Verfügung, wie z.B. Restriktionsfragmentlängen-
Polymorphismus (Ramos and Harlander, 1990), „Randomly amplified polymorphic DNA
PCR“ (Cocconcelli et al., 1995), „Amplified Ribosomal DNA Retriction Analysis“ (Ward et
al., 1998) oder Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (Amann et al., 1997). Deren Verwendung
ist in den milchverarbeitenden Betrieben noch sehr eingeschränkt, da für komplexe
Fragestellungen eine Vielzahl von Methoden parallel zum Einsatz kommen würden (Keer and
Birch, 2003).
1.3. DNA-Chip Technologie zur simultanen Genanalyse
Eine viel versprechende Methode, die eine simultane Analyse von fermentationsrelevanten
Organismen, Phagen und Phagenresistenzgenen ermöglichen könnte, ist die DNA-Chip oder
DNA-Microarray Technologie, die auf dem molekularbiologischen Prinzip der „reversen“
Hybridisierung beruht. Sie ermöglicht eine sensitive und hochparallele DNA-Analytik von
tausenden von Genen auf einem DNA-Chip (Lander, 1999).
Ursprünglich für die de novo-Sequenzierung genomischer DNA-Fragmente konzipiert (Bains
and Smith, 1988; Drmanac et al., 1989; Khrapko et al., 1989; Saiki et al., 1989), fand das
Hybridisierungsformat in der Folge eine Vielzahl von weiteren Anwendungsgebieten.
Mittlerweile werden die DNA-Microarrays – wie sie in Folge bezeichnet werden - verwendet,
um die komplette Genexpression von Zellen zu analysieren (Chuang et al., 1993). Parallel zur
Analyse der Genexpression hat sich der Microarray im letzten Jahrzehnt zu einer sehr
effektiven Methode entwickelt, um biologisches Probenmaterial untersuchen zu können
(Ehrmann et al., 1994).
Der DNA-Microarray selber besteht aus einer systematischen Anordnung von Sonden auf
einer festen Trägeroberfläche. Er besitzt eine Fläche von wenigen Quadratzentimetern und
1. Einleitung 8
kann aus mehreren Arrays bestehen. Heute existieren zwei grundsätzliche Formen von DNA-
Microarrays, die entweder durch die Verwendung von längeren PCR-Produkten (100 bis etwa
2500 Nukleotide) als Sonden charakterisiert sind oder auf dem Einsatz von kürzeren
synthetischen Oligonukleotiden (<10 Nukleotide bis 70mere) beruhen (Strothmann, 1999).
Poly- oder Oligonukleotidsonden werden je nach Fragestellung eingesetzt. Ein Vorteil der
Oligonukleotid-Arrays besteht darin, dass durch die kurzen Sondensequenzen
Kreuzhydridisierungen mit ähnlichen Sequenzen minimiert werden können. Hierdurch wird
die Spezifität der Hybridisierung erhöht, da einzelne Basen-Fehlpaarungen das Gleichgewicht
der Hybridisierung stärker beeinflussen. Die Detektion von „perfect match“ und „mismatch“
wird so erst möglich (Guo et al., 1994; Hacia et al., 1996; Urakawa et al., 2003).
Die Sonden werden auf ihre Matrix, entweder Nylon, Glas, Silica, Gold oder Silizium
aufgebracht. Nylon und Glas werden als Trägermedium aufgrund ihrer einfachen Herstellung
und den geringen Kosten bevorzugt (Blohm and Niemeyer, 1999; Cheung et al., 1999;
Pirrung, 2002). Insbesondere Glas ermöglicht eine effektive kovalente Bindung der Sonden
(Li et al., 2002). Eine Vielzahl von Studien beschäftigt sich ausschließlich mit der
Optimierung der genutzten Oberflächen (Beier and Hoheisel, 1999; Benters et al., 2001; Diehl
et al., 2001).
DNA-Microarrays unterscheiden sich von klassischen Hybridisierungsansätzen durch eine
erheblich höhere Dichte der immobilisierten Fängersonden. Bis zu 1.000.000 verschiedene
Oligonukleotidsonden können mittlerweile auf DNA-Microarrays aufgebracht werden.
Verfahren für die Generierung von abgegrenzten Feldern (spots) aus verschiedenen
Fängeroligonukleotiden im µm-Bereich waren dafür unabdingbar. Einen Meilenstein stellte
diesbezüglich die Einführung von Techniken für die hochaufgelöste „on-chip“-Synthese von
organischen Oligomeren dar, einem ursprünglich für Peptidsynthese konzipierten Verfahren
(Fodor et al., 1991; Maskos and Southern, 1992; Lipshutz et al., 1999). Fodor et al. adaptierte
hierfür photolithographische Maskierungstechniken aus der Halbleiterproduktion (Fodor et
al., 1991). Alternativ können die Sonden auch enzymatisch und chemisch synthetisiert und
mit automatisierbaren Dispenser- und Plotter-Systemen auf chemisch aktivierten Glasträgern
kovalent immobilisieren werden (Lipshutz et al., 1999). Die Sonden werden durch
„Spotting“-Roboter auf die Oberfläche des Arrays aufgebracht, in einem kontaktfreien
Verfahren durch Piezo- oder Ink-Jet-Systeme oder mit Hilfe von Stahlnadeln, die bei
Oberflächenkontakt kleinste Volumina ablegen. Bedingt durch steuerungstechnische Grenzen,
können nur mittlere Sondendichten erzielt werden.
1. Einleitung 9
Die Sondenauswahl erfolgt anhand der zur Verfügung stehenden Gensequenzen des zu
detektierenden Gens oder Organismus. Durch eine Datenbankrecherche in einer
Nukleotiddatenbank, wie z.B. der des „National Center for Biotechnology Information“
(NCBI), werden unter Betrachtung von eventuellen Redundanzen, Sequenzen für die zu
untersuchenden Gene zusammengestellt. Liegen die Sequenzen nicht vor, müssen die
entsprechenden Gene sequenziert werden. Durch ein multiples Alignment, das durch den
ClustalW-Algorithmus erstellt werden kann, können konservierte bzw. nicht konservierte
Bereiche der Sequenzen gefunden werden (Thompson et al., 1994). Die Sonden werden dann
mit bioinformatischen Programmen aus den Sequenzinformationen generiert. Dabei können
Parameter festgelegt werden, die den Ausschluss von Oligonukleotiden mit Hang zur Bildung
von inter- und intramolekularen Wechselwirkungen oder unerwünschten Schmelz-
temperaturen ermöglichen. Mittlerweile gibt es eine Vielzahl von kommerziellen Software-
Programmen, wie z.B. DNA-Star, Oligo6, Omega, Jellyfish, ARB etc., die diese Auswahl
ermöglichen. Die Spezifität und Funktionstüchtigkeit der Sonden muss aber bei allen
Programmen durch biologische Experimente validiert werden, da noch nicht alle
Hybridisierungsparameter vollständig und korrekt am Computer simuliert werden können
(Matveeva et al., 2003).
Für die simultane Genanalyse wird die zu untersuchende Probe auf dem DNA-Microarray
hybridisiert, hierbei kann es sich um PCR-Produkte, cDNA, rRNA oder genomische DNA
handeln. Die Detektion der Hybridisierung kann schließlich über markierungsfreie oder
markierungsabhängige Methoden erfolgen (siehe 1.3.2). In den meisten Fällen wird die Ziel-
DNA mit einem Farbstoff gekoppelt (siehe 1.3.3) und die Hybridisierungsergebnisse mit
einem Scanner quantifiziert.
Zu den gängigen Anwendungen der DNA-Microarray Technologie zählen die Vergleiche von
Expressionsmustern, der Nachweis von DNA-Sequenzvarianten und die Detektion von
Organismen. Die vergleichende Studie der Expressionsmuster zweier Proben wird über eine
Zweifarbenhybridisierung ermöglicht. Die in cDNA umgeschriebene RNA der Proben wird
hierfür mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert und gegen ausgewählte Sonden
hybridisiert. Auf diese Weise können Unterschiede in der Genexpression identifiziert werden
(Schena et al., 1995; Salin et al., 2002). Die Bestimmung von Ähnlichkeiten ganzer Genome
und Genomabschnitte über die Markierung von genomischer DNA ist ebenfalls möglich
(Behr et al., 1999; Salama et al., 2000; Gill et al., 2002; Schoolnik, 2002; Zhou, 2003).
Weiterhin spielt die Detektion von DNA-Sequenzvarianten in der klinischen Diagnostik eine
immer größer werdende Rolle, wie. z.B. der Nachweis von Punktmutationen (single
1. Einleitung 10
nucleotide polymorphisms, SNP’s), die mittlerweile durch die Microarray Technologie
ermittelt werden können (Guo et al., 1994). Der Nachweis von pathogen Bakterien und
Untersuchungen zur Organismenzusammensetzung in unbekannten Umweltproben ist ein
weiteres Forschungsgebiet (Wu et al., 2001; Ye et al., 2001; Call et al., 2003). Der spezifische
Nachweis von Organismen erfolgt derzeit meist über die Hybridisierung von amplifizierter
rRNA (Guschin et al., 1997; Small et al., 2001; Loy et al., 2002; Wilson et al., 2002) und in
einigen neueren Studien auch ohne deren Amplifizierung (Bavykin et al., 2001; El Fantroussi
et al., 2003; Peplies, 2003). Aber auch genomische DNA kann als Probenmaterial für die
Untersuchung auf dem DNA-Microarray eingesetzt werden (Ye et al., 2001). Der Nachweis
von rDNA (Cho and Tiedje, 2001; Borucki et al., 2003; Call et al., 2003) und weiteren
funktionellen Genen über genomische DNA gelang aber bisher nur mit vorheriger
Amplifikation des Probenmaterials (Ye et al., 2001; Schoolnik, 2002; Zhou and Thompson,
2002; Zhou, 2003). Die Amplifikation ist notwendig, da eine Anreicherung von genetischen
Elementen, wie sie im Falle der rRNA, die bis zu 98 % der Gesamt-RNA eines Organismus
darstellt, im Genom nicht vorkommen (Schoolnik, 2002). Der direkte Nachweis von Genen
wird daher einerseits durch die Komplexität der Zielmolekülfindung bei der Hybridisierung
von Genomen erschwert und anderseits durch die zu geringe Anzahl von Zielmolekülen
beeinträchtigt. Diese Schwierigkeit wird bei der Untersuchung der Expression von Zellen sehr
deutlich, da der Nachweis der mRNA mit dem DNA-Microarray ohne die Amplifikation über
die RT-PCR bisher nicht gelang (Ye et al., 2001). Ein weiterer Grund ist die zu geringe
Stabilität der mRNA-Moleküle für den direkten Nachweis (Schoolnik, 2002), der durch den
Einsatz von genomischer DNA umgangen werden könnte, da genomische DNA sehr stabil ist
und so der experimentelle Aufwand reduziert werden kann (Wu et al., 2001; Cho and Tiedje,
2002). Die Detektion von funktionellen Genen auf DNA-Ebene könnte demnach durch die
Erhöhung der Sensitivität erreicht werden und wird in dieser Arbeit für den direkten
Nachweis von Genen über gDNA untersucht.
1.3.1. Fragmentierungsmethoden
Wie in dem vorherigen Kapitel erwähnt, kann es sich bei der Untersuchung von Proben im
„reversen“ Hybridisierungsformat um PCR-Produkte, cDNA, rRNA oder genomische DNA
handeln (Wetmur, 1991). Für eine Vielzahl von DNA-Microarray Anwendungen werden
PCR- bzw. RT-PCR Produkte für die Hybridisierung verwendet, um spezifische Gene
nachzuweisen oder die Genexpression untersuchen zu können (Ye et al., 2001).
1. Einleitung 11
Für den direkten Nachweis von genomischer DNA muss diese, im Gegensatz zu PCR-
Produkten, aufgrund ihrer Größe in hybridisierbare Fragmente zerkleinert werden, da die
Sondenzugänglichkeit durch die ausgeprägten dreidimensionalen Strukturen der gDNA
stärker eingeschränkt ist (Kelly et al., 2002). In der vorliegenden Arbeit wird eine
sequenzunabhängige Zerkleinerung der gDNA bevorzugt, da die sichere Vorhersage von
Sekundärstrukturfaltungen bei mehreren hundert bp langen Fragmenten noch immer ein
ungelöstes bioinformatisches Problem darstellt. Somit kann die Faltung der Ziel-DNA nur
bedingt beim Sondendesign berücksichtigt werden. Die unspezifische Fragmentierung bietet
den Vorteil von variablen Sekundärstrukturfaltungen und damit variabler
Sondenzugänglichkeit, die sich positiv auf die Hybridisierungseffizienz auswirken kann
(Kelly et al., 2002).
Eine Vielzahl von Methoden stehen zur Fragmentierung von DNA zur Verfügung, die sich in
drei unterschiedliche Kategorien unterteilen lassen: enzymatische, mechanische oder
chemische Fragmentierung von Nukleinsäuren (Sambrook et al., 1989).
Die Verwendung von enzymatischen Verfahren eignet sich nur bedingt zur
sequenzunabhängigen Fragmentierung von gDNA, da Restriktionsenzyme eine vorgegebene
spezifische Erkennungssequenz besitzen (Zhang et al., 2001). Durch einen gleichzeitigen und
partiellen Verdau mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen kann eine zufällige
Zerkleinerung aber ermöglicht werden. Die enzymatische Fragmentierung durch die
Restriktionsendonuklease DNase I, die in Gegenwart von hohen Mn2+ Konzentrationen
Doppelstrangbrüche induziert, ist nur bedingt möglich, da dessen Einsatz, zu nicht
reproduzierbaren Ergebnissen führt (Sambrook et al., 1989; Zhang et al., 2001).
Die mechanische Fragmentierung beruht auf dem Prinzip der Zerkleinerung der DNA durch
Scher-Kräfte. Die Scherung kann durch Ultraschall oder Druck, der durch die Pressung der
DNA in kleine Öffnung erzeugt wird, erfolgen. Das Scheren der DNA mit Hilfe einer Spritze
führt aber nur zu einer schwachen Fragmentierung und zu keiner Bevorzugung eines
Größenbereichs (Hengen, 1997). Beim Scheren mit Ultraschall wird die DNA zum
Schwingen angeregt und zerbricht dabei in Abhängigkeit von der Schallmenge und Zeitdauer
zufällig in kleinere Stücke (Deininger, 1983). Sie besitzt den Nachteil des Materialaufwandes,
da eine sehr kleine und sterile Ultraschallspitze benötigt wird (Oefner et al., 1996).
Eine optimale Lösung für die Fragmentierung von genomischer DNA bezüglich
Reproduzierbarkeit, Kosten und Festlegung der Fragmentgröße, wird durch chemische
Nukleasen ermöglicht, zu denen Methidiumpropyl-EDTA-Eisen (MPE.Fe(II)) oder
Eisenammoniumsulfat (EDTA.Fe(II)) gehören (Tullius et al., 1987; Papavassiliou, 1995;
1. Einleitung 12
Zhang et al., 2001). Grundlage für die Fragmentierung mit EDTA.Fe(II) bildet die Fenton-
Reaktion, bei der Wasserstoffperoxid durch Eisen(II) reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid
wird durch diese Reaktion in hochreaktive Hydroxylradikale und Hydroxid-Ionen gespalten.
Durch die Zugabe von Natriumascorbat kommt es zu einem zyklischen Prozess. Das oxidierte
Eisen(III) wird wieder zu Eisen(II) reduziert und steht somit erneut für die Bildung von
Hydroxylradikalen zur Verfügung (siehe Abb. 2). Die freien, hochreaktiven
Hydroxylradikale, die auf diese Weise entstehen, reagieren mit der doppelsträngigen DNA
und initiieren eine Reaktion am C-4’-Atom der Desoxyribose (Balasubramanian et al., 1998;
Pogozelski and Tullius, 1998). Diese Interaktion führt letztendlich zur Eliminierung eines
Nucleosids und zu 5’- und 3’-Phosphatresten (siehe Abb. 2). Die Fenton-Reaktion besitzt den
wesentlichen Vorteil, dass die Hybroxylradikale die DNA sequenzunabhängig fragmentieren
und somit die Spaltungen statistisch über die Nukleinsäure verteilt sind (Papavassiliou, 1995).
Weiterhin kann die Größe der fragmentierten DNA aufgrund der Konzentrationen der
Reagenzien festgelegt werden (Kelly et al., 2002).
Abb. 2. Fragmentierung von DNA durch Hydroxylradikale aus der Fenton-Reaktion.
1. Einleitung 13
1.3.2. Detektionsmethoden
Die Detektion der hybridisierten Ziel-DNA auf dem DNA-Microarray kann durch zwei
unterschiedliche Ansätze erfolgen. Die markierungsfreien und markierungsabhängigen
Nachweissysteme der Ziel-DNA.
Im Verlauf der letzten zehn Jahre wurden verschiedene Verfahren zur markierungsfreien
Detektion biomolekularer Interaktionen an Festphasen untersucht. Diese Techniken erlauben
die direkte Beobachtung von Bindungseregnissen an Oberflächen. Die markierungsfreien
Nachweissysteme beruhen auf unterschiedlichen physikalischen Messverfahren, wie z.B.
optische, elektrochemische oder massensensitive Verfahren (Wang, 2000).
Einen vergleichenden Überblick über optische Analyseverfahren findet man bei Brecht und
Gauglitz (Brecht and Gauglitz, 1995), zu der unter anderem die reflektrometrische
Interferenz-Spektroskopie (RIfS) zählt (Brecht and Gauglitz, 1995; Piehler et al., 1997b;
Haake et al., 2002). Das Messprinzip der RIfS beruht auf einer Änderung der optischen
Schichtdicke durch die Bindung eines Analyten, beispielsweise eines Antikörpers oder einer
Nukleinsäure an die beschichtete Oberfläche eines Objektträgers (Piehler et al., 1997a; Sauer
et al., 1999). Zur Detektion wird die Teilreflektion von Licht an den verschiedenen
Phasenübergängen und die dabei entstehenden sich addierenden bzw. subtrahierenden
Phasen-Überlagerungen genutzt. Die Intensität des reflektierten Lichtes wird
wellenlängenunabhängig gemessen und ist proportional zur Schichtdicke. Die
Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie stellt eine weitere optische Detektionsmethode
dar, mit der Änderungen des Brechungsindex oder der Schichtdicke nachgewiesen werden
können (Gotoh et al., 1997).
Die massensensitiven Verfahren beruhen auf einem anderen Prinzip. Bei mechanischen
Beanspruchungen (Spannungen) bestimmter Klassen von Ionenkristallen treten Polarisationen
auf, die durch die Verschiebung der Ladungsschwerpunkte im Kristallverbund verursacht
werden. Massensensitive Sensoren nutzen diese Oberflächenpotentiale an den Grenzflächen
von Festkörpern als sensorisches Prinzip, d.h. die Umwandlung von elektrischen Impulsen in
mechanische Deformationen (Jonata et al., 1994). So konnten u.a. verschiedene DNA-
Interaktionen, wie Protein-DNA-Bindungen (Nikura et al., 1996) und die enzymatischen
Spaltung von DNA (Wang et al., 1999) untersucht werden.
Bei den elektrochemischen Nachweissystemen können durch die Anlagerungen von
Nukleinsäuren an komplementären Sonden Wechselwirkungen an einem Transducer
gemessen werden. Elektronen verändern so z.B. das Redoxpotenzial am Transducer (Umek et
1. Einleitung 14
al., 2001). Durch den Einsatz von „peptide nucleic acid“ (PNA) konnten Punkt-Mutationen
mit diesem elektrochemischen Nachweissystem detektiert werden (Palecek et al., 1998).
Bei den markierungsabhängigen Ansätzen wird hingen die Ziel-DNA mit einem Marker
versehen. Die etablierteste Detektionsmethode zum Nachweis von Hybridisierungs-
ereignissen in der DNA-Microarray Technologie ist die Markierung der DNA mit einem
Fluoreszenzfarbstoff (Epstein et al., 2002a). Bei der Fluoreszenzmarkierung handelt es sich in
der Regel um Fluorescein- oder Carboxymethylindocyanine-Farbstoffe. Sie besitzen den
Nachteil des Quensching-Effekts, der sich bei mehrmaligem Messen in abnehmenden
Signalintensitäten auswirkt (Torimura et al., 2001). Die radioaktive Markierung der DNA ist
ebenfalls zur Detektion geeignet. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmarkierung erreicht sie zwar
eine höhere Sensitivität, aufgrund des experimentell erhöhten Sicherheitsaufwandes steht sie
aber in der analytischen Routine im Hintergrund. Die radioaktive Markierung kommt daher in
der DNA-Microarray Technologie kaum noch zur Anwendung (Salin et al., 2002).
Eine weitere Methode beruht auf der Verwendung von polymeren Microbeads, in die
Nanokristalle aus Zinksulfid-Cadmiumselenid eingebettet sind und als Marker an der Ziel-
DNA gebunden werden. Die Farbe und damit die Wellenlänge, in der sie Licht emittieren,
variiert mit der Größe der eingesetzten Nanokristalle. Auf diese Weise lassen sich aufgrund
der Intensitätsstufen und der 6 verschiedenen Farben theoretisch bis zu 1 Millionen
verschiedene Signale abtrennen (Han et al., 2001). Eine weitere Detektionsmethode beruht
auf der „Sandwich-Hybridisierung“, bei der unmarkierte DNA auf dem DNA-Microarray
hybridisiert wird und im Anschluss mit fluoreszenzmarkierten Reporteroligonukleotiden
nachgewiesen wird (Epstein et al., 2002b). Der Einsatz dieser „Sandwich-Hybridisierung“ ist
für den Nachweis von vielen Genen nur schwer etablierbar, da der experimentelle Aufwand,
zwei funktionsfähige Sonden pro Target zu etablieren, zu hoch ist und die unzureichende
Menge von einer Fluoreszenzmarkierung pro Reportermolekül die Sensitivität erniedrigt. Des
Weiteren erhöht sich die Wahrscheinlichkeit von Kreuzhybridisierungen, die aufgrund der
erhöhten Komplexität der Hybridisierung entstehen (Chandler et al., 2003).
Bedingt durch die mangelnde Sensitivität und dem hohen apparativen Aufwand der
markierungsfreien Nachweisverfahren können diese Methoden noch nicht mit den
markierungsabhängigen Nachweissysteme konkurrieren (Lin et al., 2002; McKendry et al.,
2002; Perraut et al., 2002; Vercoutere and Akeson, 2002).
1. Einleitung 15
1.3.3. DNA-Markierungsmethoden
Für eine markierungsabhängige Detektion der Ziel-DNA auf dem DNA-Microarray muss die
DNA zuvor markiert werden. Die Markierungsmethoden für Nukleinsäuren werden in zwei
Kategorien eingeteilt. In die enzymatischen und chemischen Markierungsmethoden.
Die enzymatischen Markierungsreaktionen werden durch DNA-Polymerasen oder terminale
Transferasen katalysiert. Der Einbau des Markers erfolgt entweder über markierte Nukleotide
die während der PCR eingebaut werden oder über endmakierte Primer (Ye et al., 2001). Eine
weitere Anwendung ist das „Radom-prime Labeling“ (Feinberg and Vogelstein, 1983). Bei
der „Random-prime“ Markierung wird durch die Kombinationen von markierten
Oligonukleotiden (z.B. Hexameren), die dem Klenow-Fragment als Primer dienen und
statistisch alle möglichen Basenkombinationen abdecken, die Nukleinsäure markiert. Die
Random Primer konnten für die Markierung von genomischer DNA zur Standardisierung von
Gen-Expressionsexperimenten in Studien von Talaat verwendet werden (Talaat et al., 2002).
Einen anderen Ansatz bietet die Nick-Translation (Rigby et al., 1977). Die Markierung via
Nick-Translation beruht auf „Strangbrüchen“, die durch die Endonuklease DNase I in die
doppelsträngige DNA eingeführt werden. Die dabei entstehenden freien 3’-Hydroxylgruppen
werden durch die Polymerase I mit markierten Nukleotiden aufgefüllt. Der Strangbruch
bewegt sich auf Grund der 5’-3’ Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase I in Richtung des
3’-Terminus. Auch diese Markierungsmethode konnte zur Markierung von genomischer DNA
verwendet werden. Im Vergleich zum „Random-prime labeling“ konnten zweieinhalb mal
höhere Signalintensitäten auf dem DNA-Microarray gemessen werden (Talaat et al., 2002).
Eine weitere enzymatische Markierungsmethode wird durch den Einsatz der Terminalen-
Desoxynucleotidyltransferase möglich (Langer et al., 1981). Diese addiert an die 3’-OH-
Enden markierte Nukleotide. Eine Untersuchung der Genexpression von Saccharomyces
cerevisiae war so möglich (Wodicka et al., 1997).
Bei den chemischen Markierungsmethoden wird zwischen den chemischen und
photochemischen Markierungen unterschieden. Chemische Markierungsmethoden beruhen
auf dem Einbau von aktivierten Amino- oder Thiol Gruppen in die Nukleinsäuren, die als
Akzeptor für Fluoreszenzfarbstoffe fungieren (Proudnikov and Mirzabekov, 1996). Die
Markierung konnte Ansorge et al. ausnutzen, um Proteine, Nukleinsäuren und Peptide über
Fluoreszenzfarbstoffe sensitiv nachzuweisen (Ansorge et al., 1987). Eine andere chemische
Methode, das „Universal Linkage System“, beruht auf dem kovalenten Anbinden eines Platin-
Farbstoff Komplexes an die Guanin-Reste der Nukleinsäure, wobei es sich bei dem Farbstoff
1. Einleitung 16
um beliebige Fluoreszenzfarbstoffe handeln kann (Alers et al., 1999; van Gijlswijk et al.,
2001).
Bei den photochemischen Markierungsmethoden sind verschiedene photoreaktive Substanzen
bekannt, die innerhalb der Nukleinsäure interkalieren und durch Photoreaktion kovalent an
die flankierenden Basen gebunden werden können (Proudnikov and Mirzabekov, 1996).
Diese Substanzen umfassen Coumarin-Verbindungen (Psoralen, Angelicin) (Lee et al., 1994),
Acridin-Farbstoffe (Acridinorange) (Baruah and Bierbach, 2003), Phenanthroline
(Ethidiumbromid) (Reinhardt and Krugh, 1978), Phenazine (Kleinwachter et al., 1986) und
Phenothiazine (Viola et al., 2003). Neben dem bekannten Ethidiumbromid gehört auch das
Psoralen zu den photoreaktiven Substanzen (Sheldon et al., 1986). Psoralen ist ein
kostengünstiges, bifunktionales, photoreaktives Molekül, welches unter UV Bestrahlung
kovalente Bindungen mit Nukleinsäuren ausbildet (Saffran et al., 1988). In einer zwei Stufen-
Reaktion interkaliert Psoralen in die Nukleinsäure, bevor es in einer Photoreaktion bei 320-
400 nm kovalent an Pyrimidin-Basen bindet. Untersuchungen haben gezeigt, dass am
häufigsten das Adukt mit Thymin, gefolgt von Cytosin gebildet wird (Bethea et al., 1999).
Weiterhin wurde in der Literatur auch die Kopplung des Psoralen an Adenin beschrieben
(Yun et al., 1992). Bei der Psoralen-Markierung handelt es sich um eine Cycloaddition. Die
Basen reagieren in dieser Reaktion mit ihrer 5’,6’-Doppelbindung mit den Psoralen-
Molekülen. In dem Psoralenmolekül hingegen stehen 2 reaktive Seiten, die 4’,5’- (Furan) und
die 3’,4’-(Pyron) Doppelbindungen, zur Ausbildung einer kovalenten Bindung zur Verfügung
(siehe Abb. 3). Aus diesem Grund ist die Bildung verschiedener Cycloadukte möglich. Es
besteht neben der Möglichkeit zur Ausbildung von zwei Monoadukten (Furanseite oder
Pyronseite) auch die Möglichkeit zur Ausbildung von Diadukten (cross-links), wenn die
geometrische Basenkonformation in der dsDNA dies zulässt (Tessman et al., 1985).
Durch die Synthese von biotinylierten Psoralenderivaten ist es möglich (siehe Abb. 3), die
Nukleinsäurespezifität des Psoralens mit der Detektionssensitivität des Streptavidin-Biotin
Systems zu verbinden (Saffran et al., 1988). Streptavidin besitzt vier hochaffine
Bindungstellen für Biotin; die Bindungskonstante ist mit 10-15 mol-l eine der höchsten
natürlichen Bindungskonstanten. Bei der Markierung von Nukleinsäuren werden Einbauraten
von einem Psoralen-Biotin Molekül pro 40 Basenpaaren erreicht (Oser et al., 1988;
Wassarman, 1993). Die Detektion von Psoralen-Biotin markierter DNA erfolgt über die
Anbindung eines Streptavidin-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugates, wie z.B. das Streptavidin-
Cy5-Konjugat, an die biotinylierte DNA. Die Detektion kann so mit gängigen
Fluoreszenzscannern erfolgen.
1. Einleitung 17
Abb. 3. Struktur des Psoralen-PEO-Biotin Derivates.
Die Verwendung einer Markierungsmethode für genomische DNA in der DNA-
Chiptechnologie muss unter mehreren Aspekten ausgewählt werden. Für den direkten
Nachweis von Phagenresistenzgenen und pathogenen Organismen in Fermentationsproben
sind Nachweisgrenzen im Femto- bis Attomolaren-Bereich und geringe Markierungskosten
für einen hohen Probendurchsatz erforderlich. Die Markierung von genomischer DNA über
endmarkierte Primer in der PCR kann daher ausgeschlossen werden, da für jedes
nachzuweisende Gen, ein eigenes Primerpaar eingesetzt werden müsste. Außerdem
ermöglicht die Endmarkierung keine Mehrfachmarkierung der Probe. Bei den anderen
enzymatischen Reaktionen ist die Reproduzierbarkeit der Experimente stärker eingeschränkt,
da die Markierungsreaktionen von der Enzymaktivität beeinflusst wird, die abhängig vom
Substrat, Co-Faktoren und Ionenkonzentrationen ist (Talaat et al., 2002).
Im Gegensatz zur enzymatischen Markierung ist die Reproduzierbarkeit bei chemischen
Reaktionen höher, da ein Puffer für die optimalen Reaktionsbedingungen ausreicht. Die
Kosten der Reaktion liegen dabei vergleichsweise niedrig. So belaufen sich die Preise für die
enzymatischen Markierungen für 1 µg DNA auf 50.00 US$ für die Einbau von markierten
Nukleotiden, auf 25 US$ bei der Markierung mit der terminalen Transferase und auf 15 US$
beim „random-prime Labeling (Zhang et al., 2001). Bei der chemischen Markierung mit
Psoralen-PEO-Biotin liegen die Kosten bei nur 0.5 US$ pro µg DNA (Zhang et al., 2001).
Zusätzlich wird durch den Einbau mehrerer Psoralen-Biotin Moleküle eine
Mehrfachmarkierung der Probe ermöglicht (Davidson and Malkinson, 1996).
Furanseite
Pyronseite
1. Einleitung 18
1.3.4. Strategien zur Signalamplifikation
Ein weiterer Bereich von zunehmendem Interesse beinhaltet Strategien zur
Signalamplifikation für den Nachweis von geringen Probenmengen (Kricka, 1999).
Grundsätzlich existieren zwei verschiedene Ansätze, die für die DNA-Chiptechnologie
eingesetzt werden können, zu denen die Amplifikation einer zu detektierenden Probe und die
Verstärkung eines vorhandenen Signals gehören (Schweitzer and Kingsmore, 2001; Epstein et
al., 2002b).
Die Amplifikation der Target-DNA kann durch die „polymerase chain reaction“ (PCR) (Saiki
et al., 1988), der „strand displacement amplification“ (SDA) (Little et al., 1999), der „nucleic
acid sequence-based amplification“ (NASBA) (Compton, 1991) oder der „ligase chain
reaction“ (LCR) (Barany, 1991) erreicht werden. Die Anwendung dieser Techniken ist im
Bereich der Microarray-Technologie stark begrenzt. Daher hat sich speziell die Multiplex-
PCR in den letzten Jahren zu einer sinnvollen Ergänzung für die Microarray-Technologie
weiterentwickelt (Call et al., 2001a). Sie kombiniert die parallele Vervielfältigung von
geringen Probenmengen in der Multiplex-PCR mit der hohen Spezifität des DNA-
Microarrays (Call et al., 2001a; Chizhikov et al., 2001). So konnte die Diskriminierung von
pathogenen und nicht pathogenen Escherichia coli Stämmen in Lebensmitteln in der Studie
von Chizhikow et al. gezeigt werden. Die selektive Anreicherung von Nukleinsäuren durch
spezifische Sonden, die an eine abtrennbare Matrix gebunden sind, ist eine weitere
Möglichkeit, Nukleinsäuren aufzukonzentrieren (Tano et al., 1995). Die Sensitivität der HIV-
Detektion konnte in der Arbeit durch die Verwendung von HIV-spezifischen DNA-Sonden,
die an eine Polystyren-Latex Matrix gebunden waren, um den Faktor 100 gesteigert werden.
Die Strategien zur Signalamplifikation ohne Targetamplifikation beruhen auf der
Verwendung von mehreren Reporter-Molekülen, die durch eine Mehrfachmarkierung, wie der
Psoralen-PEO-Biotin Markierung (Zhang et al., 2001), eine Enzym-Substrat Reaktion wie der
„Tyramid Signalamplifikation“ (TSA) (Bobrow et al., 1989), eine Reduktion von Silber unter
Einsatz von Nanopartikeln (Taton et al., 2000) oder eine „rolling circle amplification“ (RCA)
(Lizardi et al., 1998; Nallur et al., 2001) realisiert werden können. Ein weiterer Ansatz ist die
„branched DNA“ (bDNA) Technologie. Sie beruht auf der Kopplung von
Signalamplifikationsmolekülen an die gebundene Nukleinsäuren (Urdea et al., 1987; Yu et al.,
2002). Die Signalamplifikationsmoleküle besitzen bis zu 15 Äste mit je drei Bindungsstellen
für weitere Oligonukleotide, die mit einer alkalischen Phosphatase gekoppelt sind. Ein
Signalamplifikationsmolekül bindet bis zu 45 AP-markierte Oligonukleotide, die für die
Amplifikation genutzt werden können. Diese „Sandwich-Hybridisierung“ setzt jedoch eine
1. Einleitung 19
komplementäre Bindungsstelle voraus, die bei der Detektion von mehreren Genen variiert und
angepasst werden müsste. Das Problem kann durch den Einsatz einer Enzym-Substrat
Reaktion umgangen werden, wie z.B. der „Tyramid Signalamplifikation“ (Bobrow et al.,
1989). Ursprünglich wurde diese Form der Signalamplifikation für Immunoassays entwickelt,
um schwache Signale zu verstärken. Mittlerweile findet sie eine breite Anwendung in der
FISH (Schönhuber et al., 1999; Speel et al., 1999; Pernthaler et al., 2002).
Der Assay beruht auf einer Enzym-Substrat Reaktion, die auf einer sequenzunabhängigen
Anbindung des Reportermoleküls beruht. Hierfür kann z.B. das Streptavidin-Biotin System
mit der Enzym-Substrat Reaktion gekoppelt werden. Dabei binden die Reportermoleküle, in
diesem Fall das Streptavidin Meerrettich-Peroxidase Konjugat (STV-HRP), an die zuvor
biotinylierte DNA (De Jong et al., 1985). Durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid wird das
Enzym aktiviert und setzt im Anschluss ein inaktives Substrat, das Tyramid, in ein aktives
Substrat um. Die dabei entstehenden hoch reaktiven Tyramid-Intermediate können an
Proteine oder an das Enzym selbst binden (Pernthaler et al., 2002). Die Tyramid-Moleküle
werden mit einem Farbstoff gekoppelt, wie z.B. dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 oder FITC, um
die Signalamplifikation detektieren zu können (siehe Abb. 4). Neuere Untersuchungen zeigen,
dass die Abgrenzung der Signalamplifikation auch ohne Kavitäten auf dem DNA-Microarray
möglich ist, da Tyramid-Moleküle lokal gebunden bleiben und kaum diffundieren (Karsten et
al., 2002).
Abb. 4. Tyramid Signalamplifikation auf dem DNA-Microarray.
1. Einleitung 20
1.4. Ziel der Arbeit
Die auf dem Gebiet der Microarray-Technologie und der Etablierung neuer
molekularbiologischer Techniken erzielten Fortschritte, haben in den letzten Jahren neue
Möglichkeiten eröffnet, komplexe biologische Fragestellungen in der Forschung beantworten
zu können. Die Anwendbarkeit der DNA-Microarray Technologie in der Industrie ist bisher
durch eine Reihe von methodischen Defiziten eingeschränkt. Hierzu gehören unzureichende
Nachweisgrenzen, die eine vorherige Amplifizierung des limitierenden Probenmaterials
notwendig machen, und aufwendige Protokolle für die Aufbereitung der zu hybridisierenden
Zielmoleküle.
Ziel dieser Arbeit ist es, ein Protokoll zu etablieren, das die industrielle Anwendbarkeit von
DNA-Microarrays ermöglicht und somit die Basis für eine breite Nutzung dieser Technik
schafft. Die notwendigen Arbeitschritte von der DNA-Extraktion, Fragmentierung,
Markierung und Hybridisierung werden so untereinander ausgearbeitet und optimiert, dass
eine Zusammensetzung dieser Module möglich ist und der Nachweis der DNA direkt über
genomische DNA erfolgen kann (siehe Abb. 5).
Abb. 5. Vorgehensweise beim Einsatz der DNA-Chip Technologie für den direkten Nachweis von genomischer DNA.
Da herkömmliche Markierungsverfahren für einen Routine-Einsatz in der Industrie sehr
kostenintensiv sind, wird die Einsetzbarkeit der Psoralen-PEO-Biotin Markierung für
genomische DNA getestet. Die Markierungsmethode wird anhand eines Modellsystems mit
PCR-Produkten optimiert und deren Signalintensitäten mit denen von endmarkierten PCR-
Produkten verglichen. In diesem definierten Modellsystem wird weiterhin die Auswirkung der
Produktlänge auf die Hybridisierungseffizienz und die Signalintensität untersucht, um die
1. Einleitung 21
Sensitivität des Nachweises zu optimieren. Die Ergebnisse des Modellsystems werden an
genomischer DNA validiert, um zu überprüfen, ob sich die gewonnenen Erkenntnisse des
Modellsystems auf genomische DNA übertragen lassen. Hierfür wird die gDNA mit einer
chemischen Fragmentierungsmethode, der Fenton-Reaktion, in unterschiedliche
Fragmentgrößen sequenzunabhängig zerkleinert und auf dem DNA-Microarray hybridisiert.
Im Anschluss an die Etablierung und Optimierung der Methoden, ist es Ziel dieser Arbeit, die
Anwendbarkeit am Beispiel des direkten Nachweises von Organismen und
Phagenresistenzgenen in der Milch-Analytik zu überprüfen, da bei der biotechnischen
Produktion von Milchprodukten Fehlfermentationen auftreten, die unterschiedliche Ursachen
haben können. Durch die Erstellung eines „Milch-Chips“ kann es der Industrie ermöglicht
werden, Starterkulturen aufgrund ihrer Organismenzusammensetzung und ihres
Phagenresistenzgen-Spektrums so auszuwählen, dass sie zu einer stabileren Fermentation
beitragen können. Um dieses zu ermöglichen, werden etablierte rRNA-Sonden für den
Nachweis von Organismen der Gattung Lactococcus auf ihre Einsatzfähigkeit auf dem DNA-
Microarray überprüft und Sonden für die Detektion der in Lactococcus lactis vorkommenden
Phagenresistenzgene generiert. Nach erfolgreicher Sondentestung wird in der vorliegenden
Arbeit untersucht, ob das etablierte Protokoll für den direkten Nachweis von genomischer
DNA eingesetzt werden kann.
Da die Sensitivität der Microarray-Technologie für den direkten Nachweis von geringen
Mengen an pathogen Organismen und Phagenresistenzgenen in Starterkulturen limitiert ist,
wird abschließend die Psoralen-PEO-Biotin Markierung in Kombination mit der Multiplex-
PCR und der „Tyramid Signalamplifikation“ in der DNA-Microarray Technologie etabliert
und am Beispiel von ausgewählten Phagenresistenzgenen getestet.
2. Material und Methoden 22
2. Material und Methoden
Für alle Lösungen wurde entsalztes und über eine Reinstwasseranlage (SG Reinstwasser)
gereinigtes Wasser mit einem Leitwert < 0,5 mS/cm3 verwendet. Die Chemikalien wurden
soweit nicht anders beschrieben in p.A.-Qualität oder mit molekularbiologischem
Reinheitsgrad von den Firmen Merck, Sigma oder Fluka bezogen. Die Agarose stammte von
Biozym, die Taq-Polymerase von Biomaster.
2.1. Lösungen und Puffer
Lysozymlösung 1 mg/ml (100.000 U/mg) Lysozym aus Hühnereiweiß in TE-Puffer
1x PBS 150 mM NaCl, 50 mM Kaliumphosphat pH 7,0
80 g/l NaCl, 2 g/l KCl, 26,8 g/l Na2HPO4 – 7x H2O,
2,4 g/l KH2PO4, ad 1 l mit ddH2O, pH 7,4
1x Hybridisierungspuffer 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01% SDS
Waschpuffer 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01% SDS
Amplifikationspuffer 2 M NaCl, 1 % Blockierungsreagenz (Roche), 1x PBS
5x Probenpuffer 100 mM EDTA, 20 % Ficoll 400, 0,1 % Bromphenolblau,
0,1 % Xylenxyanol, pH 7,3
TETBS 1x TBS, 5 mM EDTA, pH 7,5
TBE-Puffer 89 mM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,3
TE-Puffer 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7,4
20 x SSC 150 mM NaCl, 15 mM Na3-Citrat, pH 7,0
Stopp-Puffer 500 mM Thioharnstoff, 50 mM EDTA pH 7,0
2.2. Medien und Stammhaltung
2.2.1. Anzucht von Mikroorganismen
M17-Medium zur Anzucht von Lactococcus spec. (Terzaghi and Sandine, 1975)
Die Anzucht von L. lactis erfolgte entsprechend den Versuchsanforderungen entweder auf
Agar-Platten oder in 5 ml Flüssigmedium über Nacht im Brutschrank (Heraeus) oder
Schüttelinkubator (Braun Labtherm/Labshaker) bei 28-30°C und 120 rpm.
M17-Medium 0,5 g Ascorbinsäure, 5,0 g Fleischextrakt, 2,5 g Hefeextrakt, 0,25 g MgSO4,
19,0 g Na-ß-Glycerolphosphat, 2,5 g Pepton aus Casein, 2,5 g Pepton aus
Fleisch, 5,0 g Pepton aus Soja, H2O ad 1000 ml, pH 7,2
GM17-Medium M17-Medium mit 0,5% Lactose
2. Material und Methoden 23
2.2.2. Stammhaltung und Lagerung
Für die Herstellung von Stammkulturen wurden frische ÜN-Kulturen in sauergefallener,
tyndalisierter Milch überführt. Zur Tyndalisierung wurde sterile 11%ige (w/v) Skim-Milch
(Oxoid) dreimal für 30 min bei 90°C im Thermoblock (Eppendorf) inkubiert und jeweils im
Anschluss bei RT abgekühlt. Die Kulturen wurden in 1,5 ml tyndalisierte Milch überimpft.
Zur langfristigen Lagerung wurden die Kulturen bei 30°C über Nacht inkubiert und bei -80°C
eingefroren.
2.3. Probenmaterial
2.3.1. Starterkulturen
Als Ausgangsmaterial für die Analyse der Phagenresistenzgene wurden Wisby (heute
Danisco, Niebüll) bzw. aus verschiedenen Produktionsstandorten der Nordmilch e.G.
Starterkulturen bezogen. Die original verpackten Kulturen wurden unter der Sterilwerkbank
geöffnet und für die einzelnen Untersuchungen aliquotiert. Folgende Starterkulturen standen
zur Verfügung:
Probat 8/0 ’97 Lot.-Nr. L63417121K
Probat 505 Lot.-Nr. L94029932K
Probat M7 Lot. Nr. L93713732K
Probat M4 Lot. Nr. L93117432K
Laut Herstellerangaben setzt sich die Starterkultur Probat 8/0 wie folgt zusammen: 80-98%
Lactococcus lactis ssp. lactis und ssp. cremoris, 1-10% L. lactis ssp. lactis biovar.
diacetylactis, 1-15% Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris. Für die anderen
Starterkulturen waren keine genaueren Angaben vorhanden.
2.3.2. Referenzstämme der DSMZ
Für die Etablierung der Methode zum spezifischen Nachweis von genomischer DNA wurden
zwei Stämme von der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSMZ, Braunschweig) bezogen und verwendet (siehe Tab. 2).
2. Material und Methoden 24
Organismus Referenz Anzucht
Lactococcus lactis ssp. lactis DSMZ 20481 GM-17 Medium, 28–30°C
Lactococcus lactis ssp. cremoris DSMZ 20069 GM-17 Medium, 28-30°C
Salmonella choleraesius LT2 DSMZ 11320 LB Medium, 28-30°C
Bacillus cereus DSMZ 626 LB Medium, 28-30°C
Pseudomonas fluorescens DSMZ 6290 LB Medium, 28-30°C
Tab. 2. Verwendete Organismen für den spezifischen Nachweis von genomischer DNA.
2.4. Extraktion von genomischer DNA und RNA
Genomische DNA wurde entweder mit dem Qiagen DNeasy-Kit laut den Protokollvorschriften von Qiagen oder mit dem AGOWA Maxi DNA Isolation Kit nach den Angaben des Herstellers extrahiert. Die genomische DNA wurde in Wasser aufgenommen und bei -20°C gelagert. Ein RNase-Verdau erfolgte vor dem Proteinverdau durch die Zugabe von 4 µl RNase (100 mg/ml) für 2 min bei RT. RNA wurde mit dem Qiagen RNeasy Mini Kit aus dem Probenmaterial laut den Angaben des Herstellers für Gram-positive Bakterien extrahiert. Die extrahierte RNA wurde mit 30 µl RNase-freiem Wasser von der Säule eluiert und bei -20°C gelagert.
2.5. Molekularbiologische Software und Datenbanken
Sequenzrecherche: Entrez am NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ Alignment-Tools: ClustalW am EBI http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/ Sequenz- und Sondenvergleich: BLAST am NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ Genedoc 2.6. http://www.psc.edu/biomed/genedoc/ Sequenzanalyse: ORF Finder am NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html Sonden- und Primerdesign: Oligo 6.31 Molecular Biology Insights, Cascade, USA DNA-Star LaserGene Inc. Madison, Wisconsin, USA Gelanalysesoftware: Gel-Pro Analyzer 3.1 Media Cybernetics, Carlsbad, USA
2. Material und Methoden 25
2.6. Oligonukleotide Sämtliche Primer und Sonden wurden, soweit nicht anders gekennzeichnet, von der Firma
ThermoHybaid (Ulm) bezogen. Die Lagerung der in H2O gelösten PCR-Primer und Sonden-
Stammlösungen [100 pmol/µl] erfolgte bei -20°C. Für die Nomenklatur der Primer wurden
die ersten Buchstaben des zu amplifizierenden Gens verwendet. Der Zusatz F steht für den
Sense-Primer, R für den Antisense-Primer. Bei der Verwendung des Primerpaares wurden
diese Kürzel durch ein X ersetzt.
2.6.1. Primerauswahl
Alle verwendeten Primer wurden mit dem Programm PrimerSelect (DNA-Star, Wisconsin)
unter Vermeidung von Sekundärstrukturen und Primer-Dimeren generiert. Ihre Spezifität
wurde mit dem Programmen BLAST überprüft. Um eine spätere Verwendung der Primer für
den simultanen Nachweis von mehreren Genen in einer Multiplex-PCR zu ermöglichen,
wurde darauf geachtet, dass die Schmelztemperatur aller generierter Oligonukleotide um nicht
mehr als 4°C (48-52°C) variierte.
2.6.2. Primer für den Nachweis der Phagenresistenzgene
Die Primer für den Nachweis der Phagenresistenzgene sind in den Tab. 3-7 aufgeführt. Aus
den Tabellen geht das von den Oligonukleotiden erkannte Gen, dessen Sequenz und Länge,
aber auch die Bindungsposition im Gen bzw. die Länge des entsprechenden PCR-Produktes
hervor.
Primer Zielgen/ Acc. Nr.
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Prod. Länge
EpsC F1 ads-epsC CCTGAGTGTAATAGCGGAATC 21 48,4 24-44
EpsC R1 AF036485 AF100297 AF100298
CTAATCCCCCTAAAATATCAATCC 24 51,6 499-522
499
EpsC F2 ads-epsC CCTATTTTGGTCCACCCTG 19 49,3 9-27
EpsC R2 AF100297 ATCCTTCCTCAAAACTTCCAT 22 50,5 402-423 415
Inj-Pip F1 Inj-Pip CGCATTGCCTAGTATCACGA 20 51,4 1041-1060
Inj-Pip R1 L14679 GTCAAGCTTGTTAAAACTGTTATCA 24 51,1 1491-1514 474
Inj-Pip F2 Inj-Pip ATGCCAGAAATCAAAGAAAAACT 23 51,0 673-695
Inj-Pip R2 L14679 TTGGTCAATAACAGCGAGAACT 22 48,1 1116-1137 465
Tab. 3. Primer zur Detektion der Gene für die Inhibition der Phagenadsorption und der Injektion der Phagen-DNA.
2. Material und Methoden 26
Primer Zielgen/ Acc. Nr.
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Prod. Länge
LldI F1
RM Typ I hsdR
TTGCCTCGGAATACCATACC 20 51,6 1007-1027
LldI R1
U90222 AF034786
CTAACACAGCCCCATCATCC 20 51,7 1443-1462 456
LldI F2 U90222 AF034786
ACGGGGTGGCTCAAGTT 17 49,7 257-273
LldI R2 U90222 AF034786
ATGGGCATCGGGTATCC 17 49,8 710-726 470
LldI F3 U90222 AF034786
GATTCTCCAGCGATTCTAACC 21 49,9 2062-2082
LldI R3 U90222 AF034786
GGCAACTGCTCCACCACT 18 50,4 2469-2486 425
Lla1403 F1 RM Typ I hsdR
ACGGGCCTACATGATTGATA 20 49,5 1803-1822
Lla1403 R1 AF013165 GATGACTTTGGGGTTCTGC 19 49,1 2188-2206
404
Lla1403 F2 RM Typ I hsdR
TGCGGGAGAAGATTTTAGTCA 21 51,7 2250-2270
Lla1403 R2 AF013165 ATCTCTTGTTGGCTCATTTCATC 23 51,8 2656-2678 429
Tab. 4. Primer für die Amplifikation der Restriktions & Modifikationssystem I-Gene.
Primer Zielgen/ Acc. Nr.
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Prod. Länge
ScrFI M F1 RM Typ II hsdM
AATGATTAAAGAAAAGCGACTACG 24 51,3 42-65
ScrFI M R1 M87289 U89998
AAGGAAATCCACCGACAAGA 20 51,1 426-445 404
ScrFI M F2 RM Typ II hsdM
TCGGTGGATTTCCTTGTCA 19 50,9 431-449
ScrFI M R2 M87289 U89998
TGCCCATCCCAAAGTTTATC 20 51,6 832-851 421
ScrFI R F1
RM Typ II hsdR
CGTTTCTCATGGTCTGGTTCT 21 50,8 343-363
ScrFI R R1
U89998 GGCGCTTGTTTCCTTCATAC
20 51,6 732-751 409
LlaI M F1 RM Typ II hsdM
TTGATGGAATGCGACTTGATA 21 50,7 365-385
LlaI M R1
U17233 CTCCCGCTTAACTCTTCTGC 20 51,0 746-765 401
2. Material und Methoden 27
LlaI R F1 hsdR ATTGAGCTTTTTCCGACAGG 20 51,1 2719-2738
LlaI R R1 U17233 CTTGATTATGCATTTCTTCTACCC 24 51,2 3168-3191 473
LlaII R F1 RM Typ II hsdR
TACGTTCTAAAATCCCCTCCAT 22 51,4 405-426
LlaII R R1 U16027 GGCAACACTTTCCGTAACTAATA 23 50,2 837-859 455
LlaII R F2 RM Typ II hsdR
GAAGCGGTTGCCTGTGG 17 51,9 347-363
LlaII R R2 U16027 CCCGAATACTACGTGAACTGG 21 51,4 811-831
485
LlaBI R F1 RM Typ II hsdR
AAATGGAGCAGAAGCAAAACA 21 51,8 108-128
LlaBI R R1 X97263 GTCGTCGTATTCATAAACTGGA 22 48,8 534-555 448
LlaBI R F2 RM Typ II hsdR
TAATTGGATGGGGACCTATGA 21 51,0 329-349
LlaBI R R2 X97263 GACTTTGGCTTGATCTCCTCTAA 23 51,4 710-732 404
LlaBII R F1 RM Typ II hsdR
AGCCGTAGTGCTACACAGGAA 21 51,7 298-318
LlaBII R R1 Y12736 GGAATTCGGGACGCTTTAT 19 50,9 739-757 460
LlaBII R F2 RM Typ II hsdR
AGATGGCAGAGGAAGGCTATC 21 51,8 1085-1105
LlaBII R R2 Y12736 AAGCGTTCTTTATTTTTCATCTCA 24 51,5 1506-1529 445
LlaCI R F1 RM Typ II hsdR
CTAAGCCGCCTAGTTTTTGTC 21 50,6 546-566
LlaCI R R1 AJ002064 CTAGTGAATAGCGAATTTGAGAAA 24 49,9 955-978 433
LlaCI R F2 RM Typ II hsdR
CAGATTTTTAAGCCTTCCCTCTA 23 51,1 217-239
LlaCI R R2 AJ002064 ACAGGCTCCGAATGTAAAAGA 21 50,9 614-634 418
LlaDII R F1 RM Typ II hsdR
TGCCAGAATAGATGCAACTTGT 22 51,7 39-60
LlaDII R R1 Y12707 TGAGGACGCCTTCCAACA 18 51,9 426-423 385
LlaDII R F2 RM Typ II hsdR
ATCCAGCAAATAAGACTCAAACTA 24 49,2 1129-1152
LlaDII R R2 Y12707 TGCTAACATAATATCAAAATCTGG 24 48,3 1572-1595 467
LlaKRII F1 RM Typ II hsdR
GATTACGATGATAGCGATTTACAA 24 50,3 19-42
LlaKRII R1 AF051563 TTTGAACACTTTTGCCACAAG 21 50,6 399-419 401
LlaKRII F1 RM Typ II hsdR
AACTGGCGACTAATGATGACTG 22 51,1 1049-1070
LlaKRII R1 AF051563 TCCCATTTTCCTTCTAACACTTC 23 51,2 1565-1487 439
Tab. 5. Primer für die Restriktions & Modifikationssystem II-Gene.
2. Material und Methoden 28
Primer Zielgen/ Acc. Nr.
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Prod. Länge
LlaFI F1 RM Typ III hsdR
GGATGCTATTATGAACGGTTTAGA 24 51,6 2190-2213
LlaFI R1 AF054600 AGTAATTGGCCATCATTGACTTT 23 51,5 2575-2597 408
LlaFI F1 RM Typ III hsdR
GAAAACATGCTCAATAGTCAGTCT 24 49,2 346-369
LlaFI R1 AF054600 TTCATAAATTCTCCAAGGTCATA 23 48,0 763-785 440
Tab. 6. Primer für die Restriktions & Modifikationssystem III-Gene.
Primer Zielgen/ Acc. Nr.
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Prod. Länge
AbiA F1 abiA TTCCTTAAAAACGATAGTTGAAAT 24 48,8 666-689
AbiA R1 U17233 M63080
TGTGACCACGTACTTTTATTGTAA 24 49,1 1086-1109 444
AbiB F1 abiB GATAACATGCCAATTCCAACTG 22 51,4 85-106
AbiB R1 M77708 ATCGGTATTACTTTTATTTCGTCT 24 48,0 567-590 506
AbiC F1 abiC CCTAGTTTTGGATTATGGTATGG 23 49,5 115-137
AbiC R1 M95956 AAATCTTTTGTTTAGGCTCTTCA 23 49,3 647-6669 555
AbiD F1 abiD GGAGAGCTACAAGTCGGTGAGT 22 51,8 385-406
AbiD R1 U10992 TAGGGGCATAAAAAGTTGGTG 21 51,3 788-808 424
AbiDI F1 abiDI ATAGTCCAGCATTTAAGCATCATA 24 49,9 545-568
AbiDI R1 AF116286 ACCCAATCCTCAGAAAAACC 20 49,7 1012-1031 487
AbiEII F1 abiEII GCACAGTCTATTGAACGGGTAAT 23 51,9 229-251
AbiEII R1 U36837 GAGCCAATCTTCAAACAGTTCTT 23 51,3 698-720 492
AbiF F1 abiF TTTATGTGCAGAATACCAAGAGTC 24 50,1 384-407
AbiF R1 U36837 AATAGGATTTTCGCAAGTTAGC 22 49,6 826-847 464
AbiGI F1 abiGi GCAGAGGGAAAAGCACAAA 19 50,3 136-154
AbiGI R1 U60336 ACACTAAAATTCAAAAGACCATTCT 25 49,8 566-590 455
AbiH F1 abiH GGAGCGATTTTGAAGAACAGAC 22 52,0 182-203
AbiH R1 X97651 TGGCGAATGAAATCCTAATACTAC 24 51,6 613-636 455
AbiI F1 abiI CAGACTATTATTGGGAAAAACACC 24 51,0 383-406
AbiI R1 U38973 ACAATCTCTAACCCACAATGACTT 24 50,7 780-803 398
AbiK F1 abiK TTGTTTATCAAAATGGCACATA 22 48,0 1099-1120
AbiK R1 U35629 AACCTCTATCAACAGACCCAGTAT 24 49,9 1548-1571 473
AbiL F1 abiLII AAGGAGGGTATTCAATCACAGTT 23 50,5 424-446
AbiL R1 U94520 CAAGACATTCATTATTCGTTTCAA 24 50,9 818-841 418
2. Material und Methoden 29
AbiM F1 abiM ATGCTAAACCGAAATACACAGAAG 24 51,7 194-217
AbiM R1 U41294 CATTTTTATCCCACCTATTGTCAG 24 51,7 611-634 441
AbiN F1 abiN TTTAATAAGGAGTTACAGATTGATG 25 49,5 61-85
AbiN R1 Y11901 CTCCTAGTTTGTTATTTACACTTTC 25 51,1 502-526 466
AbiP F1 abiP GACCCATACTCCATTTTTACATCA 24 51,8 289-312
AbiP R1 U90222 TCTAATTTTTGCATATCGGTTTTC 24 51,8 690-713 425
AbiQ F1 abiQ CAGCACTTATGTAGGGGTTGTT 22 50,4 126-147
AbiQ R1 AF001314 CTTTTTCATGAGCAGCTTTTCTAT 24 51,3 443-466 341
AbiT F1 abiTII ATGGTTGGATTCCTATGATTATGA 24 51,3 215-238
AbiT R1 AF483000 TGCTGTATTTGCGTTTCTCG 20 51,6 595-614 400
AbiU F1 abiU ATGGTGCCTAGAAACGAAGTAGTA 24 51,3 1090-1113
AbiU R1 AF188839 CTGTTTGTATTGCGATTGGATAA 23 51,6 1485-1507 418
Tab. 7. Primer für den Nachweis der Abortiven Phagen Gene.
2.6.3. Sondendesign
Vor dem Sondendesign wurden die kodierenden Sequenzen der verschiedenen
Phagenresistenzgene in der NCBI Datenbank mit ihren entsprechenden Accession-Nummern
ermittelt und für weitere Arbeitsschritte im FASTA-Format archiviert. Im Fall der
Phagenresistenzgene bei denen mehrere Sequenzeinträge gefunden wurden, wurde die für das
Sondendesign zugrunde gelegte Sequenz durch ein Alignment mit CLUSTALW ermittelt. Die
Konstruktion der Sonden erfolgte mit der herkömmlichen Primer und Sonden-Design-
Software Oligo 6.31 unter Vorgabe bestimmter Parameter. Diese Parameter erlaubten den
Ausschluss von Oligonukleotiden mit Hang zur Bildung von inter- (Dimerbildung) und
intramolekularen Wechselwirkungen (Hairpins). Neben den bereits genannten Kriterien des
einheitlichen Schmelzpunktes (Tm) zwischen 48°C und 52°C sollten die generierten
Oligonukleotide außerdem eine Länge von 21 bp besitzen, um eine gewisse Spezifität zu
gewährleisten. Für die Berechnung der Schmelztemperatur wurde die „nearest neighbor“
(Breslauer et al., 1986) verwendet. Zur Kontrolle der Sondenspezifität wurden die
entwickelten Sonden in einer BLAST-Anfrage gegen bereits vorhandene Datenbankeinträge
abgeglichen (Li et al., 2002). Dieses Vorgehen sollte das Entstehen von falsch-positiven
Detektionssignalen in den nachfolgenden Hybridisierungsexperimenten minimieren.
2. Material und Methoden 30
2.6.4. Sonden für die Detektion von Bakterien
Die Sonden für die Detektion verschiedener Bakterien sind in Tab. 8 aufgeführt. Sie liegen in
Antisense-Orientierung vor und binden somit 16S rDNA sowie 16S rRNA. Die
Sondenbindungsstellen und das 16S rDNA Alignment der verschiedenen Organismen sind im
Anhang aufgeführt (siehe 7.2.). Das Alignment wurde mit ClustelW erstellt, mit denen aus der
Tab. 9 hervorgehenden Sequenzen. Die Bindungsstellen und das Alignment wurden mit
GeneDoc visualisiert.
Sonden
Name
Sequenz (5’-3’) bp Tm Referenz Organismus
EUB338 GCT GCC TCC CGT AGG AGT 18 51,5 (Amann et al., 1990)
Alle Eubakterien
LGCc354 CCG AAG ATT CCC TAC TGC 18 46,8 (Meier et al., 1999)
Low GC Organismen
Llc68 TGC AAG CAC CAA TCT TCA TC 20 50,9 (Beimfohr et al., 1993)
L.l. ssp. cremoris
Lll68 TAC AAG TAC CAA CCT TCA GC 20 44,4 (Beimfohr et al., 1993)
L.l. ssp. Lactis
Lla271 CTA TAA TGC TTA AGT CCA CG 20 42,3 (Beimfohr et al., 1993)
Lactococcus Lactis
Tab. 8. Verwendete Sonden für den spezifischen Nachweis von Mirkoorganismen.
Mikroorganismus Accession Nr.
Lactococcus lactis ssp. cremoris M58836
Lactococcus lactis ssp. lactis X64887
Escherichia coli J01859
Tab. 9. Accession-Nummern der 16S rDNA Sequenzen von den verwendeten Organismen.
EUB338:
Die Sonde ist spezifisch für alle Eubakterien (Position 338-355 bzgl. des E. coli Alignments).
Sie erfasst eine der hochkonservierten Bereiche der 16S rDNA.
LGCc354:
Die Sonde bindet an eine hochkonservierte Targetregion der 16S rDNA (Position 354-355)
und überlappend um 2 Nukleotide mit der Sonde EUB338. Die Sonde erfasst grampositive
Bakterien mit einem niedrigen GC-Gehalt.
2. Material und Methoden 31
Lll68:
Spezifische Sonde für Lactococcus lactis ssp. lactis. Sondenposition 68-89
Llc68:
Spezifische Sonde für Lactococcus lactis ssp. cremoris. Sondenposition 68-89
Lla271:
Die Sonde ist eine Gruppensonde von Lactococcus, die alle Untergruppen erfasst und bindet
an eine konservierte Region der 23S rDNA, die spezifisch für die Gattung der Lactococcen ist
(232-323).
2.6.5. Sonden für die Detektion von Phagenresistenzgenen
Die Sonden für den Nachweis der Phagenresistenzgene sind in den Tab. 10-14 aufgeführt.
Aus patenrechtlichen Gründen können die Sequenzen der Sonden nicht veröffentlich werden.
Sonden
Name
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Hybridisiert mit PCR-Produkt
EpsC S1 CCT GAT ATA TTA TTT GAT TTT 21 51,9 54-74 EpsC X1
EpcC S2 AAG GAG TAC TAA GTC AGA TAA 21 50,3 82-102 EpcC X2
Inj-Pip S1 CAG GAC TTA GTA CTA GAA TGA 21 51,1 1337-1357 Inj-Pip X1
Inj-Pip S2 ACG AAT TTA TTA CTT ATT TAC 21 49,5 707-727 Inj-Pip X2
Tab. 10. Sonden zur Detektion der Gene für die Inhibition der Phagenadsorption und der Injektion der Phagen-DNA.
Sonden
Name
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Hybridisiert mit PCR-Produkt
LldI S1 ATA ATA ATA CGA TTT TAG TGA 21 49,9 1118-1138 LldI X1
LldI S2 CAG ATT CCT CTA GAG TAG ATC 21 51,9 377-397 LldI X2
LldI S3 CTA TAT ATT GAT CGA GAA ATG 21 52,3 2083-2103 LldI X3
LldI S4 AAC GAA TTA AGA AAA TAT TAC 21 51,8 1286-1306 LldI X1
Lla1403 S1 ATA TTA ATA CGA TTT ATA TGG 21 48,4 1931-1951 Lla1403 X1
Lla1403 S2 TTA TAT GAC CAT GAG ATT ATT 21 51,7 2542-2562 Lla1403 X2
Tab. 11. Sonden für den Nachweis von Restriktions & Modifikationsystem I-Gene.
2. Material und Methoden 32
Sonden
Name
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Hybridisiert mit PCR-Produkt
ScrFI M S1 ATA GAA AAA CAG CTA AAT ATA 21 49,9 218-238 ScrFI M X1
ScrFI M S2 TAT TAA ATA CTT TGG AAG AAC 21 51,9 611-631 ScrFI M X2
ScrFI R S1 ATT TAC GAT ATA ATA AGT TTG 21 50,0 458-478 ScrFI R X1
ScrFI R S2 GTA TAT TTT GAT AGT GGT ATG 21 49,5 712-734 ScrFI R X1
LlaI M S1 TAT ACA ATT ACC CAA TAT ACT 21 49,5 661-681 LlaI M X1
LlaI R S1 TTA TAA ATA AAA AAC TAA CCA 21 51,0 2858-2878 LlaI R X1
LlaII S1 AAG ATG TAT CTC TAC TAG CAA 21 51,1 648-668 LlaII X1; LlaII X2
LlaII S2 CTG TAG AAA ATC TAG TAA ACC 21 51,0 517-537 LlaII X2; LlaII X1
LlaBI S1 GTA AAA CAT GAA CTA ATA AGA 21 49,5 175-195 LlaBI X1
LlaBI S2 TAA TCA AGT TAA GTT CAA GTC 21 51,6 570-590 LlaBI X2
LlaBII S1 ATA ATT TTA GTT TGG TAT ATG 21 49,8 349-369 LlaBII X1
LlaBII S2 CTA TTC ATT AGA ACA TCC TAC 21 51,0 1437-1457 LlaBII X2
LlaCI S1 ATA TAA CCT GAT GTA ATT AGA 21 48,9 836-856 LlaCI X1
LlaCI S2 TAA GAA ATA AGC TAA ATA ATG 21 50,7 433-453 LlaCI X2
LlaDII S1 CTT AGG ATA TCT ATG GAA TAG 21 51,0 165-185 LlaDII X1
LlaDII S2 ATC GAA GAT AAT AGA CAC TAA 21 51,2 1266-1286 LlaDII X2
LlaKRII S1 AGT ACG GTA ATA ATA TTG AGA 21 51,7 197-217 LlaKRII X1
LlaKRII S2 AAA GTA GGG TTA ATA AAG TAA 21 51,6 1295-1315 LlaKRII X2
Tab. 12. Sonden für den Nachweis von Restriktions & Modifikationsystem II-Gene.
Sonden
Name
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Hybridisiert mit PCR-Produkt
LlaFI S1 TCT ATA ACT CGA ACA ATA AAC
21 52,0 2528-2548 LlaFI X1
LlaFI S2 GTA TTT CGT TAG ACA GTC TAT
21 50,6 533-553 LlaFI X2
Tab. 13. Sonden für den Nachweis von Restriktions & Modifikationsystem III-Gene.
Sonden Name
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Hybridisiert mit PCR-Produkt
AbiA S1 AGT CAT CTA CAT ATC GAA CTA 21 51,0 704-724 AbiA X1
AbiA S2 TAT ATA ACT TCC GTC AGA TAC 21 51,6 1051-1071 AbiA X1
AbiB S1 CAT TTA ATA CAT CTC TCG TAT 21 51,6 176-196 AbiB X1
AbiB S2 AGG GTA GTA GTT TTT TAA TAA 21 51,6 490-510 AbiB X1
AbiC S1 AGT TAG TAT AGG AGC AAT TAA 21 51,7 214-234 AbiC X1
AbiC S2 GTA TAC TTA ATG TGT TCA TGA 21 49,1 245-265 AbiC X1
2. Material und Methoden 33
AbiD S1 TTT CTG AAT TAC TAT ATA TGC 21 49,9 422-442 AbiD X1
AbiD S2 CTA TAT ATG CTA AAA TCT AAA 21 48,1 411-431 AbiD X1
AbiDI S1 TAA TGA AAG TAT TTA TTT GTC 21 49,9 626-646 AbiDI X1
AbiDI S2 TTC TCT TTT ATA TGA TCA TTC 21 51,4 921-941 AbiDI X1
AbiEII S1 TAC ATA TTT CAG TAA TTA CCC 21 52,0 245-265 AbiEII X1
AbiEII S2 ATA AGC TAA TAC TTC TAT CTG 21 48,6 490-510 AbiEII X1
AbiF S1 ATC ACC ACT ATA TAG ATC TTT 21 50,0 442-462 AbiF X1
AbiF S2 CTG TAT AAC CTA ACT ACG TTC 21 51,6 702-722 AbiF X1
AbiGI S1 TAT ATA TCT CCA CTC ATG TTC 21 51,2 442-462 AbiGI X1
AbiGI S2 TGA TTC TTC TCA TAT ACT CAA 21 51,8 344-364 AbiGI X1
AbiH S1 GAT AAA CAT CTT CCA TAG TAT 21 50,5 542-562 AbiH X1
AbiH S2 CAG TAT CGA ATG TAC TAT CTT 21 51,2 332-352 AbiH X1
AbiI S1 TTC TCT TAG TTA AGT AAT GGT 21 51,0 404-424 AbiI X1
AbiI S2 AAT CTT AAC TTT GTA TAG ACC 21 50,5 597-617 AbiI X1
AbiK S1 TAT TAC CGA ACT ATA TAT GTG 21 50,5 1115-1135 AbiK X1
AbiK S2 ATACACATAGTATACCATGGA 21 51,7 1266-1286 AbiK X1
AbiL S1 CGT AAA ACT ATG ACT ATC TCT 21 51,0 511-531 AbiLII X1
AbiL S2 TTA CCT TCT TTT AAA TTA CTC 21 51,6 666-686 AbiLII X1
AbiM S1 TCT TCT ACT TCT GTG TAT TTC 21 50,9 204-224 AbiM X1
AbiM S2 CTT TAT TAT TTT GTT CTG ATT 21 51,9 236-256 AbiM X1
AbiN S1 CTG TTA GTA ATT TAA CTG TTC 21 49,9 239-259 AbiN X1
AbiN S2 GAA GAC CTA TTT ATA GAT TCA 21 51,0 339-359 AbiN X1
AbiP S1 TAT AAT TTC AAC AAT ATC ATC 21 49,9 343-363 AbiP X1
AbiP S2 ACA TCT GTA TAA AGC TCT AAA 21 51,7 406-426 AbiP X1
AbiQ S1 CTA GTT ACT ATT CGA CTT CTT 21 50,7 231-251 AbiQ X1
AbiQ S2 AGT CTA GTT ACT ATT CGA CTT 21 49,8 234-254 AbiQ X1
AbiT S1 AGT ATC TTT CAT AAT CAT AGG 21 50,9 226-246 AbiTII X1
AbiT S2 TCT CAG TAT CTT TCA TAA TCA 21 51,8 230-250 AbiTII X1
AbiU S1 TTT ATC TCT TAC TAC TTC GTT 21 51,2 1102-1122 AbiU X1
AbiU S2 TAA TAG TCA TAC CAA TGT AAG 21 49,9 1439-1459 AbiU X1
Tab. 14. Sonden für den Nachweis der Abortiven Phagen Gene.
2. Material und Methoden 34
2.6.6. Sonden und Primer für das Modellsystem
Die verwendeten Sonden und Primer der untersuchten Fragmentlängen im Modellsystem sind
in den Tab. 15-16 dargestellt.
Primer Zielgen/ Acc. Nr.
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Prod. Länge
Fo Master hsdR GGTTTCATGCAAGCTTATTATCA 23 50,9 472-494
Re 147 U90222 GGCTTCAGCGGTATCTTCACTA 22 53,0 597-618
147
Fo Master hsdR GGTTTCATGCAAGCTTATTATCA 23 50,9 472-494
Re 246 U90222 GGGTATCCGCAAAACTGTA 22 47,6 699-717
246
Fo Master hsdR GGTTTCATGCAAGCTTATTATCA 23 50,9 472-494
Re 566 U90222 GGCTTCAGCGGTATCTTCACTA 22 52,3 1016-1037
566
Fo Master hsdR GGTTTCATGCAAGCTTATTATCA 23 50,9 472-494
Re 821 U90222 ATTCGTTTCATTTCCTCATCACT 23 51,4 1270-1292
821
Fo Master hsdR GGTTTCATGCAAGCTTATTATCA 23 50,9 472-494
Re 1077 U90222 GCCTGGCAACTTTCCTTTAT 20 50,4 1529-1548
1077
Fo Master hsdR GGTTTCATGCAAGCTTATTATCA 23 50,9 472-494
Re 1308 U90222 ACCATTCAAGAGTGTCCCATTAT 23 51,1 1757-1779
1308
Fo 116 hsdR TTATTTAATTGGCGGACTGAAGAC 24 53,7 640-663
Re 116 U90222 ACGAGAATGGTATATTGGCTAATCA 25 53,2 731-755
116
Tab. 15. Primer für die verschiedenen Fragmentlängen.
Sonden
Name
Sequenz (5’-3’) bp Tm Position Hybridisiert mit PCR-Produkt
S1 CCT TTA AAA AAT CCA TCT TC 20 43,1 511-530 147 bp, 246 bp, 566 bp, 821 bp, 1077 bp, 1308 bp
S2 AAA TCA AAC AAA TCG GAA AC 20 46,2 673-692 116 bp, 232 bp
Tab. 16. Sonden zur Detektion der verschiedenen Fragmentlängen.
2.6.7. Testen der Sondenfunktion
Für die Überprüfung der Funktionalität der erzeugten Sonden und zur Kontrolle des
Sondenauswahlverfahrens wurden die in 2.6.2 aufgeführten Primer zur Synthese von PCR-
Produkten an definierten Kulturen verwendet (siehe 2.7.1 und 2.7.2). Zur Aufreinigung der
PCR-Produkte wurde das PCR Purification Kit der Firma Qiagen nach Angaben des
Herstellers verwendet. Die Elution der DNA erfolgte mit TE-Puffer. Der DNA-Gehalt wurde
2. Material und Methoden 35
im Photometer (GeneQuant, Pharmacia) bestimmt. Im Anschluss wurden die PCR-Produkte
mit Psoralen-PEO-Biotin markiert und quantifiziert (siehe 2.9.1 und 2.9.3). In der
Hybridisierung wurden 2 pmol DNA eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden einzeln auf dem
DNA-Microarray mit den entsprechenden Sonden hybridisiert (siehe 2.10.2).
2.7. PCR-Amplifikation
2.7.1. Probenaufbereitung
Um eine schnelle Analyse der Proben zu ermöglichen, wurden die PCR-Reaktionen mit aus
Zelllysaten freigesetzter DNA durchgeführt. Eine frische ÜN-Kultur wurde hierfür wie unter
2.2.1 in GM17-Medium angezogen. Die Kulturen wurden zum Zellaufschluss nach der
Anzucht bei 5000 rpm für 10 min zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Das
entstandene Pellet wurde zweimal mit 1 ml 10 mM Tris-HCl pH 9,0 gewaschen und
anschließend in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf) überführt. Nach dem letzten
Waschschritt wurden die Zellen in 1 ml 10 mM Tris-HCl bei 95°C für 10 min bei 800 rpm in
einem Thermomixer (Thermomixer 5436, Eppendorf) lysiert. Nach dem Absetzen der
Zelltrümmer als weißes Bodenpellet wurden die lysierten Kulturen bei -20°C gelagert.
2.7.2. Amplifizierung der Phagenresistenzgene
Die Amplifizierung der Phagenresistenzgene wurde entweder im Gradientencycler MJ
Research PTC-200 (Biozym) oder im MJ Research (Biozym) in einem Endvolumen von 50 µl
durchgeführt. Der PCR-Ansatz enthielt 4 µl Zelllysat, 3 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM
Tris-HCl pH 9,0, je 200 µM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 1 Unit Taq-Polymerase
(Pharmacia), sowie je 0,4 µM Primer. Da alle in 2.6.2 aufgeführten Primer ihren
Schmelzpunkt in einem Temperaturfenster von 4°C haben, konnten alle zur Verfügung
stehenden Primerpaare unter den selben PCR-Bedingungen eingesetzt werden:
Anfangsdenaturierung 2 min bei 95°C, 30 Zyklen Amplifikation mit je 45 sec bei 95°C, 45
sec bei 50°C und 90 sec bei 72°C und abschließender Polymerisierungsphase von 5 min bei
72°C. Der spezifische Nachweis der PCR-Produkte erfolgte über ein Agarosegel (siehe 2.7.4)
oder wie unter 2.10.6 beschrieben mit Hilfe des DNA-Microarrays.
2. Material und Methoden 36
2.7.3. Multiplex-PCR
Für die simultane Detektion von mehreren Phagenresistenzgenen wurde die DNA mit dem
Qiagen DNeasy Tissue Kit, laut dem Protokoll für Gram-positive Bakterien von Qiagen,
extrahiert. Die DNA wurde mit Aqua dest. von der Säule eluiert. Die gleichzeitige
Amplifikation von bis zu 4 Phagenresistenzgenen erfolgte mit 30 PCR-Zyklen (vgl. 2.7.2).
50 µl eines Multiplex-PCR Ansatzes enthielt 800 ng aufgereinigte DNA, 3 mM MgCl2,
50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9,0, je 200 µM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 1 Unit Taq-
Polymerase (Pharmacia), sowie je 0,2 µM Primer. Die für die Multiplex-PCR verwendeten
Primerkombinationen sind in Tab. 17 dargestellt.
Die Multiplex-PCR Produkte wurden anschließend gepoolt, mit dem Qiagen Purification Kit
aufgereinigt und mit TE-Puffer eluiert. Die Markierung wurde wie unter 2.9.1 beschrieben
durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden in einem 3%igen Agarosegel für 90 min aufgetrennt
und angefärbt (siehe 2.7.4). Zusätzlich erfolgte der spezifische Nachweis der Multiplex-
Fragmente mit Hilfe des DNA-Microarrays (siehe 2.10.6).
Multiplex- PCR Nr.
Primerpaare
1 LlaDII X1 (385 bp) EpsC X2 (415 bp) LlaBII X2 (445 bp) LlaI X1 (473 bp)
2 LlaI M X1 (401 bp) LlaCI X2 (418 bp) LlaBI X1 (448 bp) Inj-Pip X1 (474 bp)
3 ScrFI R X1 (409 bp) ScrFI M X2 (421 bp) LlaII X1 (455 bp) LldI X2 (470 bp)
4 Lla1403 X1 (404 bp) LldI X3 (425 bp) EpsC X1 (499 bp) Inj-Pip X2 (465 bp)
5 ScrFI M X1 (404 bp) LlaBII X1 (460 bp) LlaII X2 (485 bp) LlaKRII X1 (401 bp)
6 LlaDII X2 (467 bp) LlaBI X2 (404 bp) LlaCI X1 (433 bp) LlaKRII X2 (439 bp)
7 ScrFI R X2 (409 bp) LldI X1 (456 bp) Lla1403 X2 (429 bp) LlaFI X1 (440 bp)
Tab. 17. Kombinationen der Multiplex-PCR Primerpaare für die Phagenresistenzgene I-III.
2.7.4. Agarose-Gelelektrophorese
Die Analyse der Bandengröße erfolgte in einem 1-3%igen TBE-Agarosegel in Gelkammern
mit 75 bzw. 100 ml Volumen (Biometra bzw. Pharmacia). Dazu wurden 10 µl PCR-Ansatz
mit 2 µl 6x Probenpuffer versetzt und mit 10 µl Molekulargewichtsmarker (40 ng/µl 1 kb
Ladder, Gibco BRL) aufgetragen. Die Anfärbung der DNA-Fragmente erfolgte durch eine
2. Material und Methoden 37
20minütige Inkubation des Gels in 1x TBE-Puffer, der 3 µg/ml Ethidiumbromid enthielt.
Anschließend wurde das Gel im UV-Transilluminator (Reprostar; Cannag) bei 302 nm
ausgewertet.
2.7.5. Einzelstrangisolierung
Die in 2.7.2 beschriebene Methode zur Amplifikation der Phagenresistenzgene wurde durch
den Einsatz von biotinylierten Antisenseprimern modifiziert. Nach der PCR lag somit ein
Strang nicht markiert und der andere Strang biotinyliert vor. Durch Streptavidin beschichtete
Magnetpartikel wurde der biotinylierte Strang vom unmarkierten Strang getrennt.
Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mit dem Qiagen Purification Kit. Die
Konzentration der PCR-Produkte wurde photometrisch bestimmt (Pharmacia, GeneQuant).
Für die Einzelstrangisolierung von 20 pmol dsDNA wurden 200 µl der STV-beschichteten
Magnetpartikellösung (10 mg/ml, Boehringer Mannheim) in eine Mikrotiterplatte gegeben.
Die Magnetpartikel wurden dreimal im Magnetständer für 3 min auf einem Schüttler mit
180 µl TETBS gewaschen und der Überstand jeweils verworfen. 20 pmol dsDNA wurden mit
TETBS auf ein Volumen von 100 µl aufgefüllt, auf die Magnetpartikel pipettiert und
resuspendiert. Die Mikrotiterplatte wurde 30 min bei RT geschüttelt, um das Anbinden der
biotinylierten DNA an die STV-Magnetpartikel zu ermöglichen. Der Überstand wurde von
den Magnetpartikeln mit Hilfe des Magnetständers separiert und entfernt. Im Anschluss
erfolgte ein dreimaliges Waschen der Mikrotiterplatte mit TETBS für 3 min auf dem Schüttler
und ein letztes Waschen mit TE-Puffer für 3 min. Vor der Denaturierung wurde der TE-Puffer
entfernt und 50 µl 100 mM NaOH auf die Beads pipettiert. Die Beads wurden 3 min bei RT
auf dem Schüttler gewaschen und der Überstand, der die einzelsträngige DNA enthielt, in ein
Cup überführt. 50 µl 100 mM NaOH wurden erneut auf die restliche Lösung in der
Mikrotiterplatte gegeben und der oben beschriebene Waschschritt wiederholt. Die Überstände
wurden vereinigt und mit 50 µl 200 mM HCl, 5 µl 1 M Tris-HCl (pH 7,0) und 1 µl 0,5 M
EDTA neutralisiert. Die ssDNA wurde im Photometer quantifiziert.
2.8. Fragmentierung von genomischer DNA mit Hydroxylradikalen
Die Fragmentierung von genomischer DNA erfolgte durch eine chemische Reaktion, der
Fenton-Reaktion. Diese wurde anhand von genomischer DNA aus Kälber-Thymus (Sigma)
optimiert. 1 mg der lyophilisierten Kälber DNA wurde in 1 ml Aqua dest. aufgenommen
(1 mg/ml) und anschließend entsalzt, da restliche Salze wie z.B. Tris, die Fenton-Reaktion
2. Material und Methoden 38
hemmen. Die DNA wurde dafür mit einer sterilen Spritze in einen Dialyserahmen (Slide-A-
Lyzer 10K, Pierce) überführt und mit 0,1x PBS pH 7,0 für 24 Stunden umgepuffert. Die DNA
konnte im Anschluss für die Fragmentierung direkt verwendet werden.
Für die Fragmentierung wurde die Fe(II)-EDTA Stammlösung stets frisch hergestellt. Hierfür
wurden 50 µl 10 mM Eisenammoniumsulfat mit 50 µl Aqua dest. gemischt und im Anschluss
mit 100 µl EDTA [10 mM] versetzt [2,5 mM Fe(II)-EDTA Lösung]. 20 µl Fe(II)-EDTA
Lösung [2,5 mM] wurden dann mit 80 µl Wasser auf eine Arbeitskonzentration von 500 µM
verdünnt. Zum Abstoppen der Reaktion wurden pro 100 µl Reaktionsansatz 25 µl Stopp-
Puffer [500 mM Thioharnstoff, 50 mM EDTA] zugegeben.
2.8.1. Konzentrationsabhängige Fragmentierung
Es wurden 2 bis 20 µg Kälber-Thymus DNA in einem Endvolumen von 40 µl mit gleichen
Konzentrationen der Fenton Reagenzien versetzt und in einem Cup kurz gevortext. Die
Endkonzentrationen betrugen 10 mM Fe(II)-EDTA, 1 mM Natriumascorbat, 0,03 % (siehe
Tab. 18). Die Ansätze wurden für 30 min bei RT auf einem Thermomixer inkubiert. Im
Anschluss wurden 20 µl Stopp-Puffer zu den Reaktionen gegeben. 10 µl Probe wurden für die
Analyse mit 2 µl Probenpuffer vermischt. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte in einem
1%igen Agarosegel für 45 min bei 100 Volt. Das Gel wurde wie unter 2.7.4 angefärbt. Die
Negativ-Kontrolle enthielt 10 µg Thymus-DNA, die sofort nach der Zugabe der Reagenzien
abgestoppt wurde.
Reagenzien 2 µg gDNA 5 µg gDNA 10 µg gDNA 15 µg gDNA 20 µg gDNA
Thymus DNA [1 µg/µl]
2 µl 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl
1xPBS 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl
Natriumascorbat [10 mM)
4 µl 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl
H2O2 [0,3 %] 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl 4 µl
FE(II)-EDTA [50 µM]
8 µl 8 µl 8 µl 8 µl 8 µl
H20 18 µl 15 µl 10 µl 5 µl -
Gesamt-Volumen 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl
Tab. 18. Eingesetzte Mengen zur konzentrationsabhängigen Fragmentierung von DNA über die Fenton-Reaktion.
2. Material und Methoden 39
2.8.2. Temperatur- und zeitabhängige Fragmentierung
Die temperaturabhängige Fragmentierung wurde bei 20°C, 30°C, 40°C oder 50°C auf dem
Thermomixer für 0, 1, 2, 3, 4, 5 und 10 min durchgeführt. 10 µl Kälber Thymus DNA
[1 µg/µl] wurden mit 8 µl 1x PBS, 8 µl Natriumascorbat [50 mM], 32 µl Fe(II)-EDTA
Komplex [125 µM], 8 µl 0,3 % H2O2 und 14 µl H2O versetzt. Das Endvolumen betrug 80 µl
[0,1x PBS, 5 mM Natriumascorbat, 50 µM Fe(II)-EDTA Komplex, 0,03% H2O2]. Nach
Ablauf der Zeit wurden 10 µl Probe mit 2 µl Stopp-Puffer und 2 µl Probenpuffer gemischt.
Die Produkte wurden wie unter 2.7.4 beschrieben in einem 1%igen Agarosegel für 45 min
aufgetrennt und angefärbt.
2.8.3. Optimiertes Protokoll für die Fragmentierung von genomischer DNA
Für die Fragmentierung von genomischer DNA aus Bakterien musste die gDNA, nachdem sie
mit dem Qiagen DNeasy Kit extrahiert wurde, für die Fenton-Reaktion umgepuffert werden
(Microcon-30, dreimal mit 500 µl 0,1xPBS, 7 min bei 14.000g). Genomische DNA die mit
dem AGOWA Kit extrahiert wurde, konnte direkt nach der Extraktion fragmentiert werden,
wenn nach dem zweiten Waschvorgang mit dem im Kit enthalten Waschpuffer BLM 2, die
DNA mit 70%igen Aceton gewaschen wurde. Der DNA-Gehalt wurde photometrisch
bestimmt.
Die optimierte Fragmentierung von 10 µg beinhaltet eine Endkonzentration von 0,1x PBS,
5 mM Natriumascorbat, 50 µM Fe(II)-EDTA Komplex und 0,03% H2O2 in einem 80 µl
Reaktionsvolumen. Für die Fragmentierung von mehr als 10 µg wurden die Volumina auf ein
Vielfaches von 80 µl erhöht, die Endkonzentrationen der Reagenzien blieben hingegen
unverändert. Der Reaktionsansatz wurde für 5 min bei 30°C in einem Thermomixer inkubiert
und nach Ablauf der Zeit mit 25 µl Stopp-Puffer pro 100 µl Reaktionsansatz abgestoppt. Die
fragmentierte DNA wurde im Anschluss zweimal mit 500 µl TE-Puffer in einem Microcon-30
(Millipore) umgepuffert. Die Elution der DNA erfolgte für 3 min bei 1000 g. Der DNA-
Gehalt wurde schließlich photometrisch bestimmt.
2. Material und Methoden 40
2.9. Markierung von DNA
2.9.1. Markierung von PCR-Produkten mit Psoralen-PEO-Biotin
Zum Austesten der Sondenfunktionalität und zum Nachweis von PCR-Produkten mit dem
DNA-Microarray wurden die Phagenresistenzgene, wie in 2.7.2 und 2.7.3 beschrienen,
zunächst amplifiziert und die entstandenen PCR-Produkte dann mit Psoralen-PEO-Biotin
(Pierce) markiert. Hierfür wurde der DNA-Gehalt nach der Amplifizierung photometrisch
bestimmt. Die Menge des einzusetzenden Psoralen-PEO-Biotins wurde folgendermaßen
berechnet:
XP
VLn=
** (1)
n: Unmarkierte DNA in pmol
L: Länge des PCR-Produktes
V: Markierungsverhältnis pmol Psoralen zu pmol DNA-Base
P: Konzentration von Psoralen-PEO-Biotin in µM
X: Einzusetzende Menge an Psoralen-PEO-Biotin in µl der Stocklösung [20 mM]
Die PCR-Produkte wurden mit dem Qiagen Purification Kit aufgereinigt und mit TE-Puffer
eluiert. Der DNA-Gehalt wurde photometrisch bestimmt. Im Anschluss wurde die zu
markierende DNA in ein 100 µl Cup überführt und mit TE-Puffer, abzüglich der
einzusetzende Menge an Psoralen, auf ein Volumen von 50 µl aufgefüllt. Die PCR-Produkte
wurden in einem PCR-Cycler (Landgraf) für 10 min bei 95°C denaturiert. Nach der
Denaturierung wurden die Reaktionsgefäße schnell in einen –80°C Kühlschrank überführt
und für 15 min schockgefroren, um eine Renaturierung zu unterbinden. Dieser Schritt konnte
durch flüssigen Stickstoff ersetzt werden, wobei dieser über die Reaktionsgefäße gegossen
wurde. Die gefrorene DNA-Lösung wurde bei 4°C in der Hand aufgetaut, im Dunkeln mit der
entsprechenden Menge an Psoralen-PEO-Biotin [20 mM] versetzt, gevortext und auf Eis
gestellt. Eine 96 Well Mikrotiterplatte (Falcon) wurde vorher in einem Eis-Bad positioniert
und die gekühlten Proben in die Wells pipettiert.
Das UV-Crosslinken erfolgte anschließend bei 366 nm für 25 min bei 4°C mit einer UV-
Lichtquelle (Ulta-Lum, Ambion). Nach der UV-Bestrahlung wurden die Proben aus den
Wells in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt. Die Entfernung nicht gebundener Psoralen-PEO-
2. Material und Methoden 41
Biotin Moleküle erfolgte durch die Fällung der DNA. Dafür wurde die DNA mit 1/10
Volumenanteil 3 M Natriumacetat pH 4,8 und 2,5 Volumenanteilen eiskaltem 100% Ethanol
versetzt und bei –20°C für 30 min präzipitiert. Nach einem Zentrifugationsschritt von 30 min
bei 13.000 rpm, wurde der Überstand vorsichtig dekantiert. Im Anschluss wurden 500 µl
eiskaltes 70 %iges Ethanol ins Reaktionsgefäß pipettiert und erneut 20 min bei 13.000 rpm
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet unter einem Abzug für 15 min
getrocknet, um restliches Ethanol zu entfernen. Die markierte DNA wurde in 20 µl Aqua dest.
aufgenommen und direkt für die Hybridisierung eingesetzt oder bei -20°C gelagert (siehe
2.10.2).
2.9.2. Kontrolle der Markierungsreaktion mittels Streptavidin-Gelshiftassay
Zur Überprüfung der Markierung der DNA, wurde ein Gelshiftassay durchgeführt. Dazu
wurden ca. 1 pmol markierte DNA mit 4 µl Streptavidin (16 pmol/µl) für 30 min bei RT auf
einem Thermomixer inkubiert. Zu diesem Ansatz wurden 2 µl Probenpuffer gegeben und die
markierten Produkte in einem 2%igen Agarosegel für 90 min aufgetrennt. Die Auswertung
des Gels erfolgte nach durchgeführter Ethidiumbromidfärbung auf einem Transilluminator,
mit anschließender Graustufenanalyse des digitalisierten Bildes mit der Software Gel-Pro.
2.9.3. Direkter Vergleich des PCR-Primer Endlabels und der Psoralen-PEO-
Biotin Markierung
Für den direkten Vergleich des PCR-Primer Endlabels und der Psoralen-PEO-Biotin
Markierung wurden die Signalintensitäten der Hybridisierung miteinander verglichen. Hierzu
wurden die in Tab. 15 aufgeführten Primer verwendet, um PCR-Produkte von 116 bp bis
1308 bp zu synthetisieren. Die PCR-Reaktionen wurden entweder mit 5’ endmarkierten Cy5-
Primern oder mit nicht markierten Primern durchgeführt. Letztere wurden im Anschluss, wie
unter 2.9.1 beschrieben markiert, aufgereinigt und in Wasser aufgenommen. Da eine
Konzentrationsbestimmung der Produkte über das Photometer nicht möglich ist, wurde der
DNA-Gehalt mit der Software Gel-Pro bestimmt. Dafür wurde 1 µl der Produkte mit 1 µl 6x
Probenpuffer und 4 µl Wasser versetzt, und mit 10 µl des Molgewichtsmarkers (100 ng/µl)
auf ein 1%iges Agarose-Gel aufgetragen. Die Konzentration der endmarkierten PCR-
Produkte konnte photometrisch bestimmt werden. Je 1 pmol PCR-Produkt wurde für die
Hybridisierung eingesetzt und für 2 Stunden auf dem Slide hybridisiert (siehe 2.10.2).
2. Material und Methoden 42
2.9.4. Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration
Das optimale Verhältnis zwischen DNA-Base und Psoralen-PEO-Biotin wurde durch die
Variation der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration untersucht. Dazu wurden gleiche Mengen
der PCR-Produkte 246 bp, 566 bp und 821 bp (siehe Tab. 15) mit einer ansteigenden Menge
an Psoralen-PEO-Biotin versehen. Das Verhältnis zwischen Psoralen-PEO-Biotin und DNA-
Base variierte in den Verhältnissen 30:1, 15:1, 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2 und 1:10. Die
einzusetzende Psoralenmenge wurde wie unter 2.9.1 berechnet. Die Stammlösung des
Psoralen-PEO-Biotins [20 mM] wurde mit TE-Puffer auf 2 mM verdünnt, da sonst zu kleine
Volumina pipettiert werden mussten. Die Volumina wurden mit TE-Puffer auf 40 µl
Markierungsvolumen aufgefüllt und wie unter 2.9.1 markiert. Die Produkte wurden nach der
Markierung in 20 µl Wasser aufgenommen. Die Konzentration der Psoralen-PEO-Biotin
markierten DNA wurde nach der gelelektrophoretischen Auftrennung der DNA über ein
Agarosegel und der anschließenden Auswertung der Banden mit Gel-Pro ermittelt (vgl. 2.9.3).
Im Anschluss wurde 1 pmol des markierten PCR-Produktes wie unter 2.10.2 hybridisiert.
2.9.5. Markierung von genomischer DNA
Für die Markierung von genomischer DNA wurde ein Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basen
Verhältnis von 8:1 gewählt. Die einzusetzende Menge an Psoralen-PEO-Biotin wurde wie
folgt berechnet:
XP
VG=
1515** (2)
G: Unmarkierte gDNA in µg
V: Markierungsverhältnis pmol Psoralen zu pmol DNA-Base
P: Konzentration von Psoralen-PEO-Biotin in µM
X: Einzusetzende Menge an Psoralen-PEO-Biotin in µl der Stammlösung [20 mM]
1515: Konvertierungsfaktor von µg in pmol
Die Nukleinsäure, wurde wie unter den in 2.9.1 aufgeführten Protokollvorschriften, markiert
und bis zur Hybridisierung bei -20°C gelagert.
2. Material und Methoden 43
2.10. DNA-Microarray Hybridisierung
2.10.1. Chipherstellung und Sondenpositionierung
Für die Hybridisierung der PCR-Produkte und der genomischen DNA auf DNA-Microarrays
wurden Pico-Slides der Firma PicoRapid (Bremen) verwendet. Die Slides besitzen eine
Phenyldiisothiocyanat (PDITC) Oberfläche, an die aminomodifierte Oligonukleotide kovalent
gebunden werden können. Die Sonden (siehe Tab. 9 und Tab. 11-15) wurden mit einer 5’C6-
Aminolink Modifikation bestellt und in Wasser aufgenommen (100 µM Stammlösung). Die
Sondenoligonukleotide wurden mit Wasser auf 10 µM verdünnt. Mit einem Top-Spotter
wurden die Sonden, in einer Arraygröße von 6 x 4 Spots, auf einen Slide aufgebracht und
immobilisiert. Die Anzahl der Arrays auf den einzelnen Slides war variabel. Nach dem
Aufbringen der Sonden erfolgte die kovalente Sondenanbindung für 24 Stunden in einer
feuchten Kammer, bevor die freien reaktiven Gruppen auf dem Slide nach den Angaben des
Herstellers in einem Blockierungschritt deaktiviert wurden. Unter Argon Schutzgas wurden
die PicoSlides luftdicht in Slideboxen eingeschweißt. Die Lagerung der Chips erfolgte bei
-20°C; mit einer maximalen Haltbarkeit von 3 Monaten.
2.10.2. Hybridisierungsprotokoll
Die blockierten PicoSlides wurden bei RT aufgetaut und in 25 ml Prähybridisierungspuffer (2
mg/ml BSA, 500 µg/ml Heringssperma, 900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4 und 0,01 %
SDS) für eine Stunde bei 48°C prähybridisiert. Die Slides wurden nach dem Prähybridisieren
kurz mit Wasser abgespült und mit Luftdruck getrocknet. Die markierte DNA wurde in 2x
Hybridisierungspuffer aufgenommen und mit Wasser auf 100 µl aufgefüllt. Die
Endkonzentration des Hybridisierungspuffers betrug 900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl
(pH 7,4) und 0,01 % SDS. Die Probenlösung wurde 10 min bei 95°C denaturiert, für 10 min
auf Eis gestellt und kurz zentrifugiert. Im Anschluss wurde die Probe mittig auf den Slide
pipettiert. Der Slide wurde mit einem Deckglas versehen, so dass sich die Flüssigkeit
gleichmäßig verteilen konnte. Es folgte eine Hybridisierung für 1–2 Stunden bei 46°C in einer
feuchten Hybridisierungskammer (Vermicon) in einem Wärmeschrank. Nach der
Hybridisierung wurde das Deckglas durch leichtes Schwenken des Slides in einer mit Wasser
gefüllten Küvette abgelöst. Die Slides wurden in eine Glasküvette überführt und mit 100 ml
Waschpuffer bei 46°C auf einem Schüttler für 10 min gewaschen. Im Anschluss wurden sie
kurz mit Wasser abgespült und erneut mit Luft getrocknet. Die Slides konnten nach der
2. Material und Methoden 44
Hybridisierung von endmarkierten PCR-Produkten sofort mit einem Fluoreszenzscanner
(Axon), bei einer PMT von 500 im Cy3-Kanal und 750 für den Cy5-Kanal, gescannt werden.
Für PCR-Produkte, die Psoralen-PEO-Biotin markiert wurden, erfolgte eine Inkubation mit
Streptavidin-Cy5 (Zytomed). Dazu wurde der getrocknete Slide mit 100 µl STV-Cy5
Detektionslösung inkubiert, die 900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01 % SDS und 80
pmol Streptavidin-Cy5 enthielt. Der Slide wurde mit einem Deckglas abgedeckt. Die
Anbindung des Streptavidin an die biotinylierte DNA fand für 20 min bei RT im Dunkeln
statt. Das Deckglas wurde nach der Inkubation mit einer wassergefüllten Küvette durch
vorsichtiges schwenken entfernt und der Pico-Slide für 10 min mit 100 ml Waschpuffer
gewaschen. Der Slide wurde mit Luftdruck getrocknet und mit den oben beschriebenen
Einstellungen am Axonscannen gescannt.
2.10.3. Auswertung der Hybridisierung
Die Rohdaten der Hybridisierungsergebnisse wurden mit der Software GenePix 4.1 (Axon)
ermittelt. Für die Berechnung der absoluten Signalintensität der Sonden, wurde der lokale
Hintergrund vom eigentlichen Sondensignal (Median) subtrahiert. Die Daten wurden in das
Computerprogramm Excel importiert und der Mittelwert der absoluten Signalintensitäten der
jeweiligen Sonden, die mehrfach auf dem Array vorhanden waren, gebildet. Die
Standardabweichung wurde aus dem Mittelwert dieser absoluten Signalintensitäten errechnet.
Jede Sonde befand sich bis zu zehnmal auf dem Array. Die erhaltenen Daten wurden mit
Excel in Diagrammen visualisiert.
Zur Absicherung der Ergebnisse wurde bei jeder Hybridisierung das Oligonukleotid M13B-
Cy3 (5’ GTAATC-ATGGTCATAGCTGTT-3’) als positive Kontrolle in der
Hybridisierungslösung mitgeführt. Anhand dieser Positiv-Kontrolle konnten die
Schwankungen zwischen den einzelnen Slides und den Hybridisierungen aufgrund der
Signalintensitäten der Sonde M13cB-Amino (5’-AACAGCTATGACCATGATTAC-3’)
normiert werden. Als Negativ-Kontrolle wurde die Sonde To-C (5’-
ATGTAATCTAATTTTCAGAGC-3’) eingesetzt, eine Sequenz aus der Tomate, die keine
Homologien zu den untersuchten Genen aufzeigt. Alle Hybridisierungen waren zweifach
Bestimmungen, um die Ergebnisse statistisch abzusichern.
2. Material und Methoden 45
2.10.4. Optimierung der STV-Cy5 Detektionsreaktion
Die optimale einzusetzende Streptavidin-Cy5 Menge wurde durch Variationen der
Streptavidin-Cy5 Konzentration bestimmt. Hierfür wurden die PCR-Produkte 246 bp, 566 bp
und 821 bp synthetisiert (siehe 2.7.2) und wie unter 2.9.1 mit einem Markierungsverhältnis
von 15:1 markiert. 1 pmol des PCR-Produktes wurde, wie unter 2.10.2 beschrieben, einzeln
auf einem Slide hybridisiert. Die DNA Konzentration der markierten PCR-Produkte wurde
zuvor über ein Agarosegel und Gel-Pro bestimmt (vgl. 2.9.3). Die Hybridisierung wurde nach
zwei Stunden abgebrochen. Die Detektion der Hybridisierung erfolgte mit unterschiedlichen
Streptavidin-Cy5 Konzentrationen (200, 400, 800, 1600, 3200 und 6400 nM). Es wurden
1,25 µl, 2,5 µl, 5 µl, 10 µl, 20 µl bzw. 40 µl Streptavidin-Cy5 (16 pmol/µl) mit 50 µl 2x
Hybridisierungspuffer gemischt und mit Wasser auf ein Volumen von 100 µl aufgefüllt.
2.10.5. Hybridisierung gegen einen Sondengradienten
Zur Überprüfung von eventuellen sterischen Effekten, die das Anbinden des STV-Cy5
Konjugats an die Psoralen-PEO-Biotin markierte DNA behindern könnte, wurden die Sonden
S1 und S2 in verschiedenen Verdünnungen (10 µM, 5 µM, 1 µM, 0,5 µM und 0,1 µM) auf
den DNA-Chips immobilisiert. In einer anschließenden Hybridisierung mit dem Psoralen-
PEO-Biotin markierten PCR-Produkten (246 bp, 566 bp und 821 bp) sollte der Einfluss der
Sondenverdünnungen auf das Hybridisierungssignal getestet werden. Für die Hybridisierung
wurde jeweils 1 pmol Psoralen-PEO-Biotin markiertes PCR-Produkt eingesetzt. Die
Hybridisierung erfolgte wie in 2.10.2 beschrieben.
2.10.6. Spezifischer Nachweis von Genen mit dem DNA-Microarray
Der Nachweis von funktionellen Genen nach ihrer Amplifikation über die PCR erfolgte mit
spezifischen Sonden (vgl. 2.6.7) mit dem DNA-Microarray. Dafür wurden die
nachzuweisenden Gene mit den in 2.6.2 aufgeführten Primern, wie unter 2.7.2 bzw. 2.7.3
beschrieben, amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mit dem Qiagen Purification-Kit
aufgereinigt, Psoralen-PEO-Biotin markiert und auf dem DNA-Microarray mit den
entsprechenden Sonden hybridisiert (siehe 2.9.1 und 2.10.2).
2. Material und Methoden 46
2.10.7. Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA
Das unspezifische Anbinden der genomischen DNA an die Slide-Oberfläche wurde durch
verschiedene Blockierungsschritte optimiert. Der Prähybridisierungs-, Hybridisierungs-,
Wasch- und Detektionspuffer wurde hierfür variiert. Die erfolgreiche Optimierung wurde
über das Signal zu Hintergrundverhältnis zweier Sonden ermittelt. Hierfür wurden die
Signalintensitäten und der lokale Hintergrund der Sonden EUB338 und LldI S1 ausgewertet.
Die Hybridisierung erfolgte wie in 2.10.2 beschrieben, zusätzlich aber mit den unten
aufgeführten Modifikationen. Es wurde je 1 pmol des Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-
Produktes LldI X1, 1 pmol des Cy5-endmarkierten PCR-Produktes 16S und 5 µg
fragmentierte Psoralen-PEO-Biotin markierte Thymus-DNA in der Hybridisierungslösung
eingesetzt. Psoralen-PEO-Biotin markierte Thymus DNA wurde als genomische DNA
verwendet, da keine Kreuzreaktionen, mit den Sonden EUB338 und LldI S1 festgestellt
werden konnten. Die Hybridisierung wurde mit 80 pmol STV-Cy5 nachgewiesen.
Das PCR-Produkt 16S (223 bp) wurde über konservierte Primer, 16S-3Fo (5’-
CACACTGGAACTGAGACACGG-3’) und 16S-3Re (5’-TATTACCGGGGC-TGCTGG-3’)
aus der 16S rDNA amplifiziert. Als Template für die Amplifizierung der beiden PCR-
Produkte wurde die Starterkultur Probat 505 verwendet. Die Bedingungen der PCR sind in
2.7.2 beschrieben. Das PCR-Produkt 16S wurde von der Sonde EUB338 und das PCR-
Produkt LldI X1 von der Sonde LldI S1 gebunden. Für die Optimierung des
Hybridisierungsprotokolls wurden verschiedene Konzentrationen von Reagenzien in den
einzelnen Puffern ausgetestet, um den Hintergrund zu reduzieren (siehe Tab. 19).
A B C D E
BSA in der Prähybridisierungslösung
0 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml
Milchpulver im Waschpuffer
0 % 2 % 4 % 6 % 8 %
BSA in der STV-Cy5 Detektionslösung
0 mg/ml 0,2 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml
BSA in der Hybridisierungslösung
0 µg/µl 0,2 µg/µl 0,5 µg/µl 1 µg/µl 2 µg/µl
Psoralen in der Prähybridisierungslösung
0 µg/ml 0,4 µg/ml 4 µg/ml 20 µg/ml 40 µg/ml
Tab. 19. Eingesetzte Konzentrationen zur Verbesserung des Signal zu Hintergrund Verhältnisses.
2. Material und Methoden 47
2.10.8. Hybridisierungsprotokoll für genomische DNA
Für die Hybridisierung von genomischer DNA wurde das Hybridisierungsprotokoll variiert.
Die extrahierte, fragmentierte und markierte DNA wurde mit einem GeneFrame (AP-Gene)
auf einen prähybridisierten Slide für 20 Stunden hybridisiert [900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl
pH 7,4, 0,01 % SDS und 0,5 µg/µl BSA]. Das Volumen wurde durch den Geneframe auf 70
µl reduziert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit dem Waschpuffer II [900 mM NaCl,
20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,01 % SDS und 4 % Milchpulver] bei 46°C auf einem Schüttler
für 10 min. Der Hybridisierungsnachweis erfolgte mit 35 µl STV-Cy5 Detektionslösung, die
900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01 % SDS und 29 pmol Streptavidin-Cy5, enthielt.
Die Detektionslösung wurde auf den Array pipettiert, mit einem Deckglas (24 mm x 24 mm)
abgedeckt und 20 min bei RT inkubiert. Das Deckglas wurde mit einer wassergefüllten
Küvette vorsichtig durch schwenken entfernt und der Slide für 10 min mit 100 ml
Waschpuffer gewaschen. Der Slide wurde wie unter 2.10.2 beschrieben getrocknet.
2.10.9. Tyramid Signalamplifikation
Für die Signalverstärkung mit TSA auf dem DNA-Microarray wurde genomische DNA wie
unter 2.10.8 beschrieben vorbereitet. Auf die Prähybridisierung und das BSA in der
Hybridisierungslösung wurde verzichtet. Die Hybridisierungslösung enthielt dafür 1 %
Blockierungsreagenz (Roche). Die Hybridisierung erfolgte im Geneframe für 18 Stunden bei
46°C auf dem Slide. Anschließend erfolgte ein 10 minütiger Waschschritt bei 46°C im
Waschpuffer. Der Nachweis der Hybridisierung erfolgte mit 35 µl STV-HRP
Detektionslösung pro Subarray, die 900 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01 % SDS und
1,4 µg Streptavidin-HRP (Zymed) enthielt. Die Detektionslösung wurde auf den Array
pipettiert, mit einem Deckglas (24 mm x 24 mm) abgedeckt und 20 min bei RT inkubiert. Der
Slide sollte ab diesem Zeitpunkt nicht mehr trocken fallen. Das Deckglas wurde entfernt und
der Slide für 10 min im Waschpuffer bei RT gewaschen. Im Anschluss erfolgte ein
Pufferaustausch für die Signalamplifikation für 5 min auf einem Schüttler in 1x PBS.
Anschließend wurde auf den nassen Slide 25 µl des frisch angesetzten TSA-
Amplifikationspuffers pipettiert, der durch die Zugabe von 1 µl Tyramid-Cy5 (Perkin-Elmer)
und 10 µl der H2O2 Lösung (5 µl 30% H2O2 in 1000 µl PBS) zu 1000 µl Amplifikationspuffer
hergestellt wurde. Der Slide wurde mit einem Deckglas für 15 min bei 37°C in einer
Hybridisierungskammer (Vermicon AG) inkubiert. Das Deckglas wurde entfernt und es folgte
ein fünfminütiger Waschritt bei RT in 1x PBS auf einem Schüttler. Der Slide wurde wie unter
2.10.2 beschrieben getrocknet und gescannt.
3. Ergebnisse
48
3. Ergebnisse
3.1. Modellsystem für die Markierungsreaktion mit Psoralen-PEO-Biotin
Die Anwendbarkeit und die Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode
wurde anhand eines Modellsystems mit verschiedenen PCR-Produkten aus dem
Phagenresistenzgen lldI auf dem DNA-Microarray getestet. Die Primer und die Sonden für
dieses System wurden über die Software Oligo6 und DNA-Star generiert (vgl. 2.6.1 und
2.6.3).
Mit diesem Modellsystem konnte der Einfluss der Fragmentlänge und die
Sondenbindungstelle auf die Hybridisierungseffizienz untersucht werden. Wie in Abb. 6
dargestellt, variierten die mit DNA-Star generierten Fragmente im Modellsystem in ihrer
Länge vom kleinsten Fragment mit 116 Basenpaaren bis zum größten Fragment mit 1308
Basenpaaren. Der Nachweis der Fragmente auf dem DNA-Microarray erfolgte mit zwei
Sonden, die mit der Software Oligo6 generiert wurden. Es wurde eine endständige Sonde S1
und eine mittelständige Sonde S2 verwendet, bezogen auf die Fragmentlängen die größer oder
gleich 566 bp waren. Für kleinere Fragmente unter 566 bp, waren beide Sonden endständig.
Die DNA-Fragmente wurden aus dem Phagenresistenzgen lldI über die PCR synthetisiert
(siehe 2.6.6). Als Template wurde genomische DNA aus der Starterkultur Probat 8/0
verwendet, die per PCR positiv auf das Vorhandensein dieses Plasmid-codierenden Gens
getestet wurde (siehe 2.6.2 und 2.7.2).
Abb. 6. Fragmentlängen und Positionen der Sonden S1 und S2 im Modellsystem für die Testung und Optimierung der Markierungsreaktion.
3. Ergebnisse
49
3.1.1. Test der entwickelten Primer für das Modellsystem
Die Funktionalität der generierten Primer für das Modellsystem (siehe 3.1) wurde durch die
Synthese der unterschiedlichen Fragmentlängen überprüft (siehe 2.6.6 und 2.7.2). In dem
Geldbild in Abb. 7 sind die Ergebnisse des Primertests deutlich zu erkennen. Wie theoretisch
ermittelt, konnte durch den Einsatz der Primerpaare DNA-Fragmente mit einer Länge von 116
bp, 147 bp, 246 bp, 566 bp, 821 bp, 1077 bp und ein 1308 bp aus dem Gen lldI der
Starterkultur Probat 8/0 amplifiziert werden (siehe 2.7.1). Nach der Betrachtung des
Agarosegels bleibt festzuhalten, dass alle für das Modellsystem benötigten Fragmentlängen
synthetisiert werden konnten.
Abb. 7. Geldbild zum Funktionstest der generierten Primerpaare.
3.1.2. Hybridisierung von endmarkierten PCR-Produkten auf dem DNA-
Microarray
Die Funktionalität der generierten Sonden S1 und S2 wurde durch die Hybridisierung von
endmarkierten, doppel- und einzelsträngigen PCR-Produkten getestet. Hierzu wurden die
PCR-Fragmente mit Cy5-markierten Senseprimern über die PCR endmarkiert (siehe 2.7.2).
Die Synthese der Produkte wurde durch den modifizierten Primer nicht beeinflusst (Daten
nicht dargstellt). Um den Einfluss von ssDNA und dsDNA auf die Hybridisierungseffizienz
untersuchen zu können, wurde neben den Cy5-markierten Senseprimern und den
unmarkierten Antisenseprimern in einem zweiten Ansatz Cy5-markierte Senseprimer und
biotinylierte Antisenseprimer verwendet, um die ssDNA isolieren zu können. Die
Einzelstrangisolierung erfolgte wie in 2.7.5 beschrieben. 1 pmol der doppelsträngigen bzw.
einzelsträngigen PCR-Fragmente wurden für zwei Stunden einzeln auf dem DNA-Microarray
Längen-standard
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp
1500 bp
147 bp 116 bp 246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bp MM
3. Ergebnisse
50
hybridisiert und ausgewertet (siehe 2.10.2). Die Hybridisierung wurde zweimal wiederholt,
um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gewährleisten zu können. Für die Darstellung der
Hybridisierungssignale wurden die absoluten Werte anhand der Positivkontrolle M13cB
normiert (siehe 2.10.3).
Abb. 8. Hybridisierungsergebnis von 1 pmol Cy5-endmarkierter einzelsträngiger DNA.
Wie aus der Abb. 8 zu erkennen ist, können für die Sonden S1 und S2 bei allen
Fragmentlängen Hybridisierungsereignisse gemessen werden. Die Signale variierten von 2000
bis zu 14000 absoluten Signalintensitäten. Bei Fragmente die kleiner als 566 bp waren,
konnten für beide Sonden ähnliche Signalintensitäten gemessen werden. Dagegen wurden bei
längeren Fragmenten schwächere Signale für die Sonde S2 ermittelt. Insgesamt nahm für
beide Sonden die Signalintensität mit der Länge des hybridisierten Fragmentes deutlich ab.
Abb. 9. Hybridisierungsergebnis von 1 pmol Cy5-endmarkierter doppelsträngiger DNA.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
147 bp 116 bp 246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bp
Fragmentlänge
Abso
lute
Sig
nalin
tens
ität
S1S2
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
147 bp 116 bp 246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bp
Fragmentlänge
Abso
lute
Sig
nalin
tens
ität
S1S2
3. Ergebnisse
51
Im Vergleich zur Hybridisierung von einzelsträngiger DNA zeigte die Hybridisierung von
doppelsträngiger DNA schwächere Hybridisierungssignale. Die Signalintensitäten schwanken
zwischen 250 und 6500 absoluten Einheiten und nahm auch bei der Hybridisierung von
längeren Fragmenten ebenfalls stark ab (siehe Abb. 9). Im Durchschnitt zeigt die
mittelständige Sonde S2 schwächere Signale als die endständige Sonde S1. Bei dem längsten
Fragment mit 1308 bp konnte für die Sonde S2 kein Hybridisierungssignal mehr
nachgewiesen werden.
Die Ergebnisse zeigen, dass die beiden erstellten Sonden und PCR-Produkte als Testsystem
für die Etablierung und Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Markierung verwendbar sind.
Die Hybridisierung von einzelsträngiger DNA resultiert in höhere Signalintensitäten, die aber
den Aufwand der Einzelstrangisolierung nicht rechtfertigen, da auch mit doppelsträngiger
DNA detektierbare Hybridisierungssignale nachgewiesen werden konnten. Aus diesem Grund
wurde für die weiteren Versuche auf die Einzelstrangisolierung von DNA verzichtet.
3.1.3. Kontrolle der Psoralen-PEO-Biotin Markierung mittels Streptavidin-
Gelshiftassay
Nach erfolgreicher Sondentestung mit endmarkierten PCR-Produkten im Modellsystem, sollte
die Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode an unmarkierten PCR-Produkten getestet
werden. Zu diesem Zweck wurde das Anbinden der Psoralen-PEO-Biotin Moleküle an die
DNA über einen STV-Gelshiftassay kontrolliert. In diesem Assay wurde das unmarkierte
PCR-Produkt (246 bp Fragment) mit Psoralen-PEO-Biotin markiert und im Anschluss mit
Streptavidin inkubiert (siehe 2.9.2). In Abb. 10 ist das Ergebnis des Gelshiftassays nach seiner
elektrophoretischen Auftrennung, mit Hilfe eines Graustufenanalyseprogramms Gel-Pro
dargestellt. Die Graustufenanalyse weist bei der Kontrolle, dem unmarkierten PCR-Produkt,
einen Peak bei ca. 250 Basenpaaren auf (siehe Abb. 10, grüne Linie). Deutlich sichtbar ist
hingegen der Gelshift bei dem Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkt 246 bp. Neben
dem Peak des freien PCR-Produktes bei 246 bp ist die Existenz von zwei weiteren Peaks bei
ca. 350 bp und 430 bp erkennbar (siehe Abb. 10, blaue Linie). Diese Peaks stellen
höhermolekulare Adukte der Streptavidin-Biotin Kopplung dar. Je nach Markierungsgrad des
eingesetzten PCR-Produktes kommt es zur Bindung verschiedener Mengen von Streptavidin
an die DNA. Durch die Masse von ca. 60 kD werden die Laufeigenschaften der entstandenen
Adukte verändert. Die Lage der gekoppelten Streptavidin-Moleküle ist aufgrund der
sequenzunabhängigen Markierung nicht definierbar. Die verschiedenen Produkte innerhalb
3. Ergebnisse
52
einer Bande sind dementsprechend divers und nehmen mit steigender Menge an gebundenem
STV zu.
Als Ergebnis dieses Experimentes konnte das Funktionsprinzip der Psoralen-PEO-Biotin
Markierung unter den gewählten Parametern nachgewiesen werden, ohne die eine Bindung
der STV-Moleküle und damit der beschriebene Gelshift nicht möglich wäre.
Abb. 10. Streptavidin Gelshiftassay des 246 bp Fragmentes (grün: unmarkiert; blau: markiert)
3.1.4. Hybridisierung von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten
auf dem DNA-Microarray
Nach erfolgreicher Testung der Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode im Gelshiftassay
erfolgte die Adaptierung dieser Methode an die DNA-Chip Technologie.
Dazu wurden die unmarkierten PCR-Produkte 116 bp bis 1308 bp mit Psoralen-PEO-Biotin,
mit einem 2:1 Verhältnis von Psoralen zu DNA-Base, markiert (siehe 2.9.1). Eine
Quantifizierung der markierten PCR-Produkte war über das Photometer nicht mehr möglich,
da Psoralen ebenso wie DNA ein Emmissionsmaxima bei 260 nm aufweist. Daher wurden die
markierten PCR-Produkte über ein Agarosegel mit einer definierten Menge eines
Molekulargewichtsmarkers quantifiziert (siehe 2.9.3). Im Anschluss wurde 1 pmol der
Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkte für 2 Stunden einzeln auf dem Chip
hybridisiert und ausgewertet (siehe 2.10.2 und 2.10.3).
MM MM
3. Ergebnisse
53
Abb. 11. Hybridisierung von 1 pmol Psoralen-PEO-Biotin markierter doppelsträngiger DNA.
Die Hybridisierung von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten zeigt deutliche
Signale für alle eingesetzten PCR-Produkte. Wie aus der Abb. 11 zu erkennen ist, variieten
die Hybridisierungssignale von 1000 bis 39000 absoluten Signalintensitäten. Die
Signalintensität der beiden Sonden erhöhte sich mit der Länge des hybridisierten Fragmentes.
Für die endständige Sonde S1 konnte erst mit dem 566 bp Fragment deutliche Signale
gemessen werden, wohingegen für die mittelständige Sonde S2 schon beim kleinsten
Fragment mit einer Länge von 246 bp deutliche Signale detektiert wurden. Ab einer Länge
von 1077 Basenpaaren nahm die Signalintensität nicht mehr zu und erreichte in diesem
System ein Plateau.
3.1.5. Direkter Vergleich der Signalintensitäten von endmarkierter und
Psoralen-PEO-Biotin markierter DNA
Die beiden Markierungsmethoden wurden anhand der Signalintensitäten miteinander
verglichen, um die Vorteile einer mehrfachen Markierung zu verdeutlichen. Der direkte
Vergleich von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten mit denen von endmarkierten
PCR-Produkten ist in Abb. 12 dargestellt. Die Signalintensität nahm mit der Länge der PCR-
Produkte bei der Endmarkierung deutlich ab (siehe Abb. 12 A), während die Signalintensität
bei der Psoralen-PEO-Biotin Markierung bis zu einer Länge von 1077 Basenpaaren zunahm
(siehe Abb. 12 B). Es konnte eine Steigerung der Signalintensitäten bei dem längsten
Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkt im Vergleich zu dem endmarkierten PCR-
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bp
Fragmentlänge
Abso
lute
Sig
nalin
tens
ität
S1
S2
3. Ergebnisse
54
Produkt um den Faktor 30 gemessen werden. Die Hybridisierungssignale konnten bei den
Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten aufgrund der Mehrfach-Markierung
demnach deutlich gesteigert werden.
Abb. 12. Direkter Vergleich der Hybridisierungssignale bei der Endmarkierung (A) und der Psoralen-PEO-Biotin Markierung (B) von PCR-Produkten.
3.2. Optimierung der Markierungs- und Detektionsmethode
3.2.1. Optimierung des Verhältnisses zwischen Psoralen-PEO-Biotin und
DNA-Base
Das optimale Verhältnis zwischen DNA-Base und Psoralen-PEO-Biotin wurde durch die
Variation der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration untersucht. Dazu wurden gleiche Mengen
der PCR-Produkte 246 bp, 566 bp und 821 bp mit einer ansteigenden Menge an Psoralen-
PEO-Biotin versehen (siehe 2.9.4). Das Verhältnis zwischen Psoralen-PEO-Biotin und DNA-
Base variierte von 30:1 bis 1:10. Die Experimente erfolgten in Doppelbestimmungen. Die
Daten wurden im Anschluss normiert (siehe 2.10.3).
Bei der Optimierung des Verhältnisses von Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Base ist ein
sigmoider Kurvenverlauf zu erkennen (siehe Abb. 13 und Abb. 14). Der Kurvenverlauf beider
Sonden erreicht bei einem Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basenverhältnis von 15:1 ein
Sättigungsbereich. Die Signalintensitäten konnten durch die Erhöhung des Verhältnisses von
Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Base im Vergleich mit dem aus 3.1.4 erhaltenen Ergebnissen
um bis zu einem Faktor 3 gesteigert werden. Für das kleinste Fragment konnte bei einem
Verhältnis von 15:1 eine Signalintensität für die Sonde S1 von ca. 9000, für das mittlere
Fragment eine Signalintensität von etwa 18000 und für das längste Fragment eine
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
246 bp 566 bp 821 bp 1077 bp 1308 bpA
bsol
ute
Sign
alin
tens
ität
S1
S2
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
147bp
116bp
246bp
566bp
821bp
1077bp
1308bp
Abs
olut
e Si
gnal
inte
nsitä
t
S1
S2
A B
3. Ergebnisse
55
Signalintensität von ca. 55000 gemessen werden (siehe Abb. 13). Für die Sonde S2 konnten
ähnlich hohe Hybridisierungssignale gemessen werden. Für das kleinste Fragment mit 246 bp
konnte eine Signalintensität von ca.12000, für das mittlere Fragment etwa 28000 und für das
Längste eine Signalintensität von ca. 45000 gemessen werden (siehe Abb. 14).
Abb. 13. Abhängigkeit der Signalintensität vom Verhältnis der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration zu DNA-Base für die Sonde S1.
Abb. 14. Abhängigkeit der Signalintensität vom Verhältnis der Psoralen-PEO-Biotin Konzentration zu DNA-Base für die Sonde S2.
Sonde S1
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
0 5 10 15 20 25 30 35
Verhältnis pmol Psoralen zu 1 pmol DNA Base
Abso
lute
Sig
nalin
tens
ität
246 bp566 bp821 bp
Sonde S2
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
0 5 10 15 20 25 30 35
Verhältnis pmol Psoralen zu 1 pmol DNA Base
Abs
olut
e S
igna
linte
nsitä
t
246 bp566 bp821 bp
3. Ergebnisse
56
3.2.2. Optimierung der Streptavidin-Cy5 Konzentration
Der Nachweis der Hybridisierung findet über das Reportermolekül Streptavidin-Cy5 statt. Die
Optimierung der einzusetzenden Streptavidin-Cy5 Menge wurde durch die Variation der
Streptavidin-Cy5 Konzentration bestimmt. Hierfür wurden die PCR-Produkte bei einem
optimierten Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basen Verhältnis von 15:1 markiert (vgl. 3.2.1)
und einzeln auf dem Chip hybridisiert. Die Hybridisierung wurde mit unterschiedlichen STV-
Cy5 Konzentrationen nachgewiesen (siehe 2.10.4).
Abb. 15. Einfluss der Streptavidin-Cy5 Konzentration auf das Hybridisierungssignal für die Sonde 1.
Wie anhand der Abb. 15 zu erkennen ist, nahm die Signalintensität für alle PCR-Produkte bis
zu einer Konzentration von 800 nM für die Sonde S1 zu. Eine weitere Steigerung der
Streptavidin-Cy5 Konzentration auf 1600 nM führte hingegen zu einer Abnahme der
absoluten Signalintensitäten der Fragmente. Für die Sonde S2 waren die Ergebnisse
kongruent (Daten nicht gezeigt). Die Abnahme ist durch die unspezifische Bindung des
Streptavidin-Cy5 an die Chip-Oberfläche zu erklären, was am Bespiel des 821 bp Fragment in
Abb. 16 gezeigt wird. Ab einer Streptavidin-Cy5 Konzentration von 800 nM wurde eine
Sättigung der Streptavidin Moleküle an die biotinylierte DNA erreicht. Höhere
Konzentrationen führten zu einem erhöhten Hintergrund, der sich negativ auf die absolute
Signalintensität auswirkte. Ab einer Konzentration von 6400 nM Streptavidin-Cy5 wurde das
eigentliche Signal vom Hintergrund überlagert. Aus diesem Grund wurde für die folgenden
Experimente eine Streptavidin-Cy5 Konzentration von 800 nM verwendet.
200400
8001600
32006400
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Abso
lute
Sig
nalin
tens
itäte
n
Streptavidin-Cy5 Konzentration in nM
246 bp
566 bp
821 bp
3. Ergebnisse
57
Abb. 16. Darstellung der Signalintensitäten mit steigender Konzentration an STV-Cy5.
3.2.3. Optimierung der Sondenkonzentration
Zur Überprüfung von eventuellen sterischen Effekten, hervorgerufen durch die Anzahl der gebundenen DNA-Moleküle an einer Sonde, die das Anbinden des 60 kDa großen Streptavidin-Moleküls an die DNA beeinflussen könnte, wurden die Sonden S1 und S2 in verschiedenen Sondenkonzentrationen auf den Chip immobilisiert (siehe 2.10.5). Ein pmol Psoralen-PEO-Biotin markiertes PCR-Produkt wurde einzeln auf dem Chip hybridisiert. Wie aus Abb. 17 zu entnehmen ist, nahm die Signalintensität mit steigender Sondenkonzentration zu und näherte sich der Sättigung. Die erhöhte Sondenkonzentration wirkte sich somit positiv auf die Signalintensität aus. Sterische Effekte, die das Anbinden der Streptavidin-Moleküle an die DNA beeinflussen könnten, konnten nicht beobachtet werden.
Abb. 17. Variation der Sondenkonzentration auf dem DNA-Microarray.
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
200 400 800 1600 3200 6400
Konzentration von Streptavidin-Cy5 in nM
Abs
olut
e Si
gnal
inte
nsitä
t
SignalHintergrundabs. Intensität
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Sondenkozentration in µM
Abs
olut
e S
igna
linte
nsitä
t
246 bp S1566 bp S1821 bp S1246 bp S2566 bp S2821 bp S2
3. Ergebnisse
58
3.2.4. Nachweisgrenze von Psoralen-PEO-Biotin und endmarkierten PCR-
Produkten
Die Nachweisgrenze des DNA-Microarrays von endmarkierten und Psoralen-PEO-Biotin
markierten PCR-Produkten wurde ebenfalls anhand des Modellsystems getestet. Die
markierten PCR-Produkte mit einer Länge von 246 bp, 566 bp und 821 bp wurden einzeln auf
dem DNA-Microarray in den Konzentrationen 10 nM, 1 nM, 100 pM und 10 pM hybridisiert.
Die Hybridisierung der Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkte wurden mit 800 nM
Streptavidin-Cy5 auf dem DNA-Microarray nachgewiesen. Wie aus Abb. 18 zu erkennen ist,
konnten die endmarkierten PCR-Produkte bis zu einer Konzentration von 1 nM (100 fmol/100
µl) nachgewiesen werden. Konzentrationen unter 1 nM waren mit der Cy5-Endmarkierung
nicht mehr detektierbar (Daten nicht dargestellt).
Abb. 18. Nachweisgrenze für endmarkierte PCR-Produkte im Modellsystem.
Im Gegensatz dazu, konnten noch geringere Mengen von Psoralen-PEO-Biotin markierten
PCR-Produkten detektiert werden. Wie aus Abb. 19 der zu entnehmen ist, wurden Fragmente
noch bis zu einer Konzentration von 10 pM nachgewiesen, was bei einem
Hybridisierungsvolumen von 100 µl einer DNA-Menge von 1 fmol entspricht. Die
Nachweisgrenze der Methode ist auf Grundlage dieser experimentellen Daten im
Modellsystem demnach erreicht.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
246 bp S1 246 bp S2 566 bp S1 566 bp S2 821 bp S1 821 bp S2
Sonde und Produktlänge
Abs
olut
e S
igna
linte
nsitä
t
1000 fmol100 fmol
3. Ergebnisse
59
Abb. 19. Nachweisgrenze für Psoralen-PEO-Biotin markierte PCR-Produkte.
Für den direkten Vergleich der Nachweisgrenzen beider Markierungen wurde die
Hybridisierungsergebnisse des PCR-Produktes 821 bp für die Sonde S1 von 1000 fmol bis 1
fmol end- und Psoralen-PEO-Biotin-markierter DNA logarithmisch dargestellt (siehe Abb.
19). Während die Nachweisgrenze bei der Endmarkierung bei 100 fmol lag, konnten bis zu
1 fmol Psoralen-PEO-Biotin markierter DNA nachgewiesen werden. Die Sensitivität konnte
somit durch die Psoralen-PEO-Biotin Markierung im Vergleich zur Endmarkierung um den
Faktor 100 gesteigert werden.
Abb. 20. Vergleich der Nachweisgrenze für endmarkierte (A) und Psoralen-PEO-Biotin markierte DNA (B) am Beispiel der Hybridisierung des 821 bp langen PCR-Produktes für die Sonde S1.
1
10
100
1000
10000
100000
Abso
lute
Sig
nalin
tens
ität
1000 fmol100 fmol10 fmol1 fmol
A B
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
246 bp S1 246 bp S2 566 bp S1 566 bp S2 821 bp S1 821 bp S2
Sonde und Produktlänge
Abs
olut
e Si
gnal
inte
nsitä
t
1000 fmol100 fmol10 fmol1 fmol
3. Ergebnisse
60
3.3. Sondendesign und Primerauswahl
3.3.1. Datenbankrecherche
Nach erfolgreicher Etablierung der Psoralen-PEO-Biotin Markierung wurden Sonden für den
Nachweis von Phagenresistenzgenen generiert. Zur Ermittlung der relevanten Sequenzen
wurde eine Datenbankrecherche in der NCBI-Datenbank durchgeführt. Die Accession-
Nummern sowie die entsprechenden Sequenzen wurden für die Auswahl der Sonden und
Primer festgehalten (siehe 2.6.2). Die codierenden Sequenzbereiche wurden herausgefiltert
und im FASTA-Format gespeichert. Redundante Sequenzeinträge wurden berücksichtigt,
indem durch das Alignment mit ClustalW konservierte Bereiche, für die Primer und Sonden,
selektiert wurden. Die codierenden Bereiche dieser Sequenzen (cds) bildeten die Grundlage
für die Sonden- und Primerauswahl. Es wurden insgesamt 34 Sequenzeinträge für
Phagenresistenzgene, die in Lactococcus beschrieben sind, gefunden (siehe Tab. 3 - Tab. 7).
Die Phagenresistenzgene wurden in vier Gruppen eingegliedert, zu denen die Inhibition der
Phagenadsorption, die Inhibition der Injektion der Phagen-DNA, die Restriktion der Phagen-
DNA und die abortiven Phageninfektion gehören (siehe 1.1.2).
3.3.2. Auswahl der Sondenoligos
Die Sonden für die Detektion der Phagenresistenzgene auf dem DNA-Microarray wurden
durch die Software Oligo6 generiert. Die Sonden wurden unter Berücksichtigung des Tm-
Wertes, sowie der inter- und intramolekularen Wechselwirkungen von der Software erstellt
(siehe 2.6.3). Für jedes Gen wurden 2 Sonden aus der generierten Liste ausgewählt. Die
Sondenfunktionalität wurde durch die Hybridisierung von spezifischen PCR-Produkten auf
dem DNA-Microarray überprüft (siehe 2.6.7). Die Lage der Sonden im PCR-Produkt war für
die Auswahl sekundär, da nach erfolgreicher Sondentestung, primär genomische DNA mit
den Sonden detektiert werden sollte. Bei der Sondenauswahl wurde aber berücksichtigt, dass
ein PCR-Produkt von beiden Sonden gebunden werden konnte, um die Anzahl der PCR bzw.
die Multiplex-PCR Ansätze für die Sondentestung zu minimieren. Wie aus den Tab. 10 - Tab.
14 zu entnehmen ist, wurden insgesamt 2 Sonden für die Detektion der Gene für die
Inhibition der Phagenadsorption, 2 Sonden für die Injektion der Phagen-DNA, 6 Sonden für
den Nachweis von Restriktions & Modifikationssystem Typ I, 18 Sonden für den R/M Typ II
und 2 Sonden für den R/M Typ III ausgewählt. Des Weiteren wurden 36 Sonden für den
Nachweis von abortiven Phagen Genen selektiert.
3. Ergebnisse
61
3.3.3. Testen der Primerfunktion
Zur Überprüfung der Primerfunktion wurden alle Primer für den Nachweis der Phagenresistenzgene an definierten Kulturen getestet. Die Primer wurden unter Vermeidung von Sekundärstrukturen und Primer-Dimeren generiert. Um eine spätere Verwendung der Primer für den simultanen Nachweis von mehreren Genen in einer Multiplex-PCR zu ermöglichen, wurde darauf geachtet, dass die Schmelztemperatur aller generierter Oligonukleotide untereinander um nicht mehr als 4°C variierte. Die Produktlänge sollte nur zwischen 400 und 500 bp betragen, um ein Gleichgewicht zwischen der Hybridisierungs-effizienz und der Amplifizierung gewährleisten zu können (siehe Tab. 3 - Tab. 7). Vier molekulargenetisch charakterisierte Starterkulturen und eine Quarkprobe (Glöckner, 2002) wurden zur Überprüfung der Primerfunktion für die Phagenresistenzgene der Gruppe I-IV per PCR getestet (siehe 2.7.2). In den Gelbildern in Abb. 21 und Abb. 22 sind die Ergebnisse anhand der resultierenden Banden deutlich zu erkennen.
Abb. 21. Überprüfung der Primerfunktion für die Phagenresistenzgene der Gruppen I-III.
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp MM
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp
MM LlaI R
X1 LlaBI X1
LlaII X2
LlaDII X2
LlaDIIX1
LlaCI X2
LlaCIX1
LlaBII X2
LlaBIIX1
LlaBI X2
LlaII X1
473 bp
448 bp
485 bp
467 bp
385bp
418bp
433bp
445bp
460bp
404bp
455 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp
MM
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp
MM EpsC X1
Inj-Pip X1
LlaI M X1
ScrFI R X1
ScrFI M X2
ScrFI M X1
Lla1403 X2
Lla1403 X1
LldI X3
LldI X2
LldIX1
Inj-Pip X2
EpsC X2
499 bp
474 bp
401 bp
409 bp
421bp
404bp
429bp
404bp
425bp
470bp
456bp
465 bp
415 bp
3. Ergebnisse
62
Abb. 22. Überprüfung der Primerfunktion für die Phagenresistenzgene der Gruppe IV. Nach der Betrachtung der Bandengröße bleibt festzuhalten, dass mit den generierten
Primerpaaren die erwartete Produktlänge erzielt werden konnte (siehe 2.6.2). Die PCR-
Produkte wurden nicht sequenziert, da die Primerpaare an definierten Kulturen getestet
wurden und eine Hybridisierung auf dem DNA-Microarray zur Sequenzüberprüfung erfolgte
(siehe 3.3.4). Mit den für die Gene llaKR2I, llaFI, abiA, abiF, abiI, abiK, abiT und abiU
ausgewählten Primern konnten weder aus den Starterkulturen noch aus den Quarkprobe PCR-
Produkte amplifiziert werden. Die Untersuchung des kompletten Phagenresistenzgen-
Spektrums der einzelnen Starterkulturen und der Quarkprobe ist im Anhang dargestellt (siehe
Tab. A1).
3.3.4. Testen der Sondenfunktion
Zur Kontrolle der Sondenfunktion und des Vorgehens bei der Sondenauswahl wurden die
PCR-Produkte aus 3.3.3 verwendet. Die PCR-Produkte des jeweiligen Gens wurden mit
Psoralen-PEO-Biotin markiert und zur Überprüfung der Sondenfunktion und Kreuzreaktivität,
einzeln auf dem DNA-Microarray hybridisiert (siehe 2.6.7). Die Reproduzierbarkeit wurde
durch Doppelbestimmungen statistisch abgesichert (siehe 2.10.3). Jede Sonde befand sich bis
zu zehnmal auf dem Array.
Wie aus der Abb. 23 zu entnehmen ist, variierten die Hybridisierungssignale von 1000 bis
18000 absoluten Signalintensitäten für die einzelnen PCR-Produkte der
Phagenresistenzgruppe I-III. Für die Sonden Lla1403 S2, ScrFI R S1 und LlaDII S1 konnten
nur schwache bzw. im Falle der Sonde Inj-Pip S2 keine Hybridisierungssignale mit dem
korrespondierenden PCR-Produkt detektiert werden.
Abi B
AbiC
Abi D
Abi DI
AbiE
AbiG
AbiH
AbiL
AbiM
AbiN
Abi P
Abi Q
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp MM
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp MM
505 bp
555bp
424 bp
487 bp
492bp
455bp
455bp
418bp
441bp
466bp
425 bp
341 bp
3. Ergebnisse
63
Abb. 23. Hybridisierungssignale der Sonden der Phagenresistenzgruppe I-III.
In Abb. 24 sind die Hybridisierungsergebnisse der PCR für die Phagenresistenzgene der
abortiven Phageninfektion dargestellt. Für alle Sonden konnten spezifische Hybridisierungs-
signale mit den markierten PCR-Produkten gemessen werden. Wie aus beiden Abbildungen
deutlich wird, sind die Hybridisierungssignale der einzelnen Sonden untereinander sehr
heterogen. Sie schwankten von 671 bis 25326 absoluten Signalintensitäten.
Abb. 24. Hybridisierungssignale der Sonden der Phagenresistenzgruppe IV.
Auffällig war, dass für die meisten Sondenpaare eines Gens, unterschiedlich starke
Signalintensitäten gemessen werden konnten, obwohl das gleiche Ziel-Molekül in der
Hybridisierung eingesetzt wurde. So konnte zum Beispiel für die Sonde AbiDI S1 ein Signal
von 19250 und für die Sonde AbiDI S2 von 2500 gemessen werden. Für einige Sondenpaare
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
EpsC S1
EpsC S2
Inj-P
ip S1
Inj-P
ip S2
LldI S
1
LldI S
2
LldI S
3
LldI S
4
Lla140
3 S1
Lla140
3 S2
ScrFI M
S1
ScrFI M
S2
ScrFI R
S1
ScrFi R
S2
LlaI M
S1
Lla R
1 S1
LlaII S
1
LlaII S
2
LlaBI R
S1
LlaBI R
S2
LlaBII R
S1
LlaBII R
S2
LlaCI R
S1
LlaCI R
S2
LlaDII R
S1
LlaDII R
S2
Sonde
Abs
olut
e Si
gnal
inte
nsitä
t
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
AbiB S1
AbiB S2
AbiC S
1
AbiC S
2
AbiD S
1
AbiD S
2
AbiDI S
1
AbiDI S
2
AbiE S1
AbiE S2
AbiG S1
AbiG S2
AbiH S
1
AbiH S
2
AbiL S1
AbiL S2
AbiM S1
AbiM S2
AbiN S
1
AbiN S
2
AbiP S1
AbiP S2
AbiQ S1
AbiQ S2
Sonde
Abs
olut
e Si
gnal
inte
nsitä
t
3. Ergebnisse
64
konnten aber ähnliche Hybridisierungssignale ermittelt werden, z.B. für AbiN, AbiP oder
AbiQ. Insgesamt gesehen konnten alle PCR-Produkte der Phagenresistenzgene spezifisch
über die generierten Sondensatz nachgewiesen werden, da keine falsch-positiven
Hybridisierungssignale mit den synthetisierten PCR-Produkten auf dem DNA-Microarray
detektiert werden konnten.
3.4. Fragmentierung von genomischer DNA
Für die Fragmentierung von genomischer DNA in hybridisierbare Fragmente wurde die
Fenton-Reaktion gewählt, die eine sequenzunabhängige Zerkleinerung der DNA durch
Hydroxylradikale ermöglicht. Im Modellsystem konnte das höchste Hybridisierungssignal mit
einer Fragmentlänge von 1000 bp gemessen werden (siehe 3.1.4). Daher wurde die Spaltung
der genomischen DNA durch die Fenton-Reaktion für diese Größenordnung optimiert. Zu
diesem Zweck, wurde durch die Variation der Zeit, sowie der Temperatur und der
Konzentration der Reagenzien die Bedingungen für die Fenton-Reaktion ermittelt, mit denen
die gDNA in Fragmente mit einer Länge von unter 1000 bp gespalten werden kann.
3.4.1. Konzentrationsabhängige Fragmentierung von genomischer DNA
Zunächst wurde bei gleich bleibender Konzentrationen der Fenton-Reagenzien die
Fragmentierung von DNA-Mengen zwischen 2 und 20 µg genomischer DNA untersucht.
Hierzu wurden die unterschiedlichen DNA-Mengen für 30 Minuten mit den Fenton-
Reagenzien inkubiert (siehe 2.8.1). Als Negativkontrolle dient ein Ansatz, bei dem die
Fenton-Reaktion sofort nach der Zugabe der Reagenzien mit einem Stopp-Puffer
unterbrochen wurde.
Wie aus Abb. 25 zu entnehmen ist, wurde die genomische DNA unterschiedlich stark
fragmentiert. Die gDNA der Negativ-Kontrolle, wurde wie erwartet nicht fragmentiert, da die
Fenton-Reaktion sofort nach dem Start abgebrochen wurde. Die genomische DNA der
Negativ-Kontrolle konnte auf Grund ihrer Größe nicht im 1 % Agarosegel komplett
aufgetrennt werden. Höher molekulare DNA war somit noch in der Geltasche sichtbar. Durch
die Extraktion der DNA wurde aber ein Teil der gDNA durch Scherkräfte degradiert. Aus
diesem Grund sind noch eine Bande bei ca. 50 kb und ein diffuser Bandenschmier zu
erkennen. Die anderen Spuren zeigen unterschiedliche DNA-Mengen nach der
Fragmentierung. Die Spur für 2 µg DNA zeigt deutlich die erfolgreiche Fragmentierung in
3. Ergebnisse
65
DNA-Größen unter 750 bp. Mengen von 5 µg bis 20 µg konnten ebenfalls fragmentiert
werden, wobei die Abhängigkeit der Fragmentgröße von der DNA-Konzentration zu erkennen
ist. Eine Menge von 5 µg DNA weist Fragmentgrößen unterhalb von 1000 bp, 10 µg hingegen
unter 1500 bp. Bei einer DNA-Menge von 15 µg bzw. 20 µg DNA wird die gDNA in
Fragmente kleiner als 4 kb bzw. 8 kb gespalten. Da in allen Spuren bis auf die
Negativkontrolle keine Banden mehr zu erkennen sind, kann davon ausgegangen werden, dass
in allen Ansätzen höher molekulare DNA komplett gespalten wurde. Die Fragmentierung ist
demnach von der DNA-Menge abhängig und wurde für die weiteren Experimente optimiert.
Abb. 25. Abhängigkeit der Fragmentgröße von der DNA-Konzentration.
3.4.2. Temperatur- und zeitabhängige Fragmentierung von genomischer
DNA
Nachdem in 3.4.1 gezeigt werden konnte, dass gDNA durch die Fenton-Reaktion
konzentrationsabhängig fragmentiert werden konnte, wurde im folgenden Experiment der
Einfluss der Temperatur und der Zeit auf die Fenton-Reaktion für deren weitere Optimierung
untersucht. 10 µg genomische DNA wurden bei 20°C, 30°C, 40°C und 50°C für 0-10
Minuten fragmentiert, um die Effizienz der Fragmentierung zu verbessern. Gleichzeitig wurde
die Konzentration der Reagenzien erhöht (siehe 2.8.2).
Die Ergebnisse der zeit- und temperaturabhängigen Fragmentierung von 10 µg genomischer
DNA sind in Abb. 26 dargestellt. Anhand der Abbildung ist zu erkennen, dass zum
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp
10 kb
Längen-standard
250 bp
500 bp
750 bp
1000 bp
10 kb
Längen-standard
10 µg 2 µg 5 µg 15 µg 20 µg NK MM MM
3. Ergebnisse
66
Startzeitpunkt in allen vier Temperaturansätzen eine diskrete Bande bei 50 kb und höher
molekulare DNA in der Geltasche sichtbar waren. Die Fragmentgrößen nehmen bei allen
Ansätzen mit der Reaktionszeit ab, wobei die gDNA schon nach einer Minute in kleinere
Fragmente zerkleinert wurde. Eine diskrete Bande bei ca. 50 kb ist nicht mehr sichtbar (Spur
2-7). Deutlich zu erkennen ist die erhöhte Geschwindigkeit der Fragmentierung bei höheren
Temperaturen ab 40°C. Bei 50°C ist die genomische DNA schon nach einer Minute unter 750
bp fragmentiert, was im Vergleich zu 20°C zehn Minuten benötigt. Die optimalen
Fragmentgrößen für die Hybridisierung um die 1000 bp sind daher bei Temperaturen über
40°C und den eingesetzten Konzentrationen nicht mehr zu realisieren. Da eine zu starke
Degradierung der DNA bei zu hohen Temperaturen vermieden werden musste, wurde die
Fragmentierung von 10 µg genomische DNA in den folgenden Experimenten bei 30°C für 5
min durchgeführt. Für die Fragmentierung größerer DNA-Mengen wurde nur das Volumen an
die entsprechende DNA-Menge angepasst, die Konzentrationen blieben unverändert (siehe
2.8.3).
Abb. 26. Fragmentierung von 10 µg genomischer DNA bei 20°C (A), 30°C (B), 40°C (C) und 50°C (D) zu verschiedenen Zeitpunkten.
Die Reproduzierbarkeit der Spaltung der DNA wurde nach der erfolgreichen Optimierung
überprüft. Hierzu wurden die Schwankungsbreiten von fünf identischen Fragmentierungs-
Zeit in min
Zeit in min
A B
C D
Längen-standard
Längen-standard
250 bp
500 bp 750 bp
1 kb
10 kb
250 bp
500 bp 750 bp
1 kb
10 kb
500 bp 750 bp
1 kb
10 kb
250 bp
500 bp 750 bp
1 kb
10 kb
1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 10’ 0’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 10’ 0’
1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 10’ 0’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 10’ 0’
250 bp
MM MM
MM MM
3. Ergebnisse
67
experimenten miteinander verglichen. 10 µg genomische DNA wurde bei 30°C für 5 Minuten
fragmentiert. Dabei zeigte sich, das die Reproduzierbarkeit gewährleistet war, da keine
Schwankungsbreiten auftraten (Daten nicht gezeigt). Daher konnte ein reproduzierbares und
schnelles Protokoll für die Fragmentierung von gDNA entwickelt werden. Durch die
Variation von Zeit, Konzentration und Temperatur konnte die Fragmentierung von
genomischer DNA für Fragmentgrößen unterhalb von 1000 Basenpaaren optimiert werden.
3.5. Hybridisierung von genomischer DNA
Für die Etablierung einer PCR-unabhängigen Methode zur Detektion von Organismen und
Phagenresistenzgenen mit dem DNA-Microarray, wurde zunächst das Hybridisierungs-
protokoll für genomische DNA optimiert. Die Validierung der Methode zum direkten
Nachweis von genomische DNA wurde im Anschluss durch verschieden Beispiele überprüft.
3.5.1. Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA
Das Hybridisierungsprotokoll, für die Hybridisierung von genomischer DNA, wurde an dem
in 2.10.7 beschriebenen System und verwendeten Reagenzien optimiert, da im Vergleich zu
PCR-Produkten, bei der Hybridisierung von genomischer DNA ein stark erhöhter Hintergrund
gemessen werden konnte. Durch die Blockierung der Slide-Oberfläche sollte einerseits die
unspezifische Bindung des Streptavidin-Cy5-Moleküls, andererseits die unspezifische
Bindung der genomischen DNA, verringert werden. Die Optimierung erfolgte über die
Ermittlung des Verhältnisses von Signal zu Hintergrund (S/N). Bei diesen Experimenten
handelte es sich jeweils um Doppelbestimmungen, um die Ergebnisse statistisch abzusichern.
Die Hybridisierung wurde wie in 2.10.2 beschrieben, zusätzlich aber mit denen in Tab. 20
aufgeführten Modifikationen, durchgeführt.
Als erstes wurde die Prähybridisierung verbessert. Vor der Optimierung des
Hybridisierungsprotokolls, waren die Signale kaum vom Hintergrund zu diskriminieren (siehe
Tab. 20). Durch Zugabe von unterschiedlichen Konzentrationen an BSA in die
Prähybridisierungslösung konnte das S/N-Verhältnis verbessert werden, wobei ab einer BSA-
Konzentration von 5 mg/ml keine Steigerung mehr festgestellt werden konnte. Das S/N-
Verhältnis stieg für die Sonde LldI S1 von 1,2 ohne Optimierung, auf ein Verhältnis von 9,3,
bei einer Zugabe von 5 mg/ml BSA in der Prähybridisierungslösung (siehe Tab. 20). Das für
die Sonde EUB338 von 1,8 auf 9,3. Insgesamt konnte daher eine etwa siebenfache Steigerung
3. Ergebnisse
68
des Signal/Rausch-Verhältnisses durch die Blockierung der Slide-Oberfläche mit BSA
ermittelt werden.
Durch die Einführung eines Milchpulver-Blockierungsschrittes in der Waschlösung, sollte
eine weitere Blockierung der Slide-Oberfläche, vor der Zugabe von Streptavidin-Cy5, erreicht
werden. Wie aus der Tab. 20 zu entnehmen ist, konnte durch die Zugabe von Milchpulver zur
Waschlösung das Hintergrundsignal reduziert werden und somit das S/N-Verhältnis deutlich
verbessert werden. Ab einer Konzentration von 4 % Milchpulver konnte keine Verbesserung
mehr festgestellt werden. Das unspezifische Anbinden des Streptavidin-Cy5 Moleküls konnte
durch diese Maßnahmen um den zwei Faktor verringert werden.
BSA in der Prähybridisierungs-lösung in mg/ml
0 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml
Sonde
S/N-Verhältnis
EUB 338
1,8
LldI S1
1,2
EUB 338
2,5
LldI S1
3,1
EUB 338
4,1
LldI S1
3,9
EUB 338
9,4
LldI S1
8,6
EUB 338
9,3
LldI S1
8,6
Milchpulver in der Waschlösung 0 % 2 % 4 % 6 % 8 %
Sonde
S/N-Verhältnis
EUB 338
9,3
LldI S1
8,6
EUB 338
15,1
LldI S1
13,5
EUB 338
19,5
LldI S1
20,4
EUB 338
19,6
LldI S1
20,3
EUB 338
19,7
LldI S1
20,4
BSA in der STV-Cy5 Detektionslösung 0 mg/ml 0,2 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml
Sonde
S/N-Verhältnis
EUB 338
19,7
LldI S1
20,4
EUB 338
19,5
LldI S1
20,4
EUB 338
19,8
LldI S1
20,2
EUB 338
19,5
LldI S1
21,1
EUB 338
19,6
LldI S1
20,5
BSA in der Hybridisierungs-lösung
0 mg/ml 0,2 mg/ml 0,5 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml
Sonde
S/N-Verhältnis
EUB 338
19,1
LldI S1
20,6
EUB 338
20,8
LldI S1
23,1
EUB 338
23,5
LldI S1
24,0
EUB 338
23,4
LldI S1
24,1
EUB 338
23,5
LldI S1
24,0
Psoralen in der Prähybridisierungs-lösung
0 µg/ml 0,4 µg/ml 4 µg/ml 20 µg/ml 40 µg/ml
Sonde
S/N-Verhältnis
EUB 338
23,5
LldI S1
24,0
EUB 338
29,5
LldI S1
28,6
EUB 338
30,5
LldI S1
29.1
EUB 338
30,2
LldI S1
29,3
EUB 338
30,4
LldI S1
28,9
Tab. 20. Optimierung des Signal zu Hintergrund Verhältnisses bei der Hybridisierung von genomischer DNA.
3. Ergebnisse
69
Die Zugabe von BSA zur der Detektionslösung führte bei einer Konzentration zwischen 0,2
mg/ml bis 4 mg/ml zu keiner Verbesserung der Resultate (siehe Tab. 20). Der Zusatz von
BSA während der Hybridisierung führte hingegen zu einer leichten Verbesserung des
Signal/Hintergrund-Verhältnisses. Die Zugabe von 0,5 mg/ml BSA zur Hybridisierunglösung
führte zu einer Verbesserung für die Sonde EUB338 von 19,1 auf 23,5 und für die LldI S1
von 20,6 auf 24,0. Höhere BSA-Konzentrationen konnten das S/N-Verhältnis nicht weiter
verbessern (siehe Tab. 20). Daher konnte eine Steigerung von 23 % bei der Verwendung von
0,5 mg/ml BSA in der Hybridisierungslösung erreicht werden.
Die eingefügten Blockierungsschritte führten zu keiner vollständigen Blockierung des
Hintergrundes, die bei der Hybridisierung von PCR-Produkten erreicht wurde (Daten nicht
gezeigt). Das S/N-Verhältnis erhöhte sich für die Sonde LldI S1 von 1,2 ohne Optimierung,
auf 24,0 mit Optimierung und für die Sonde EUB338 von 1,8 auf 23,5. Aus diesem Grund
wurde ein weiterer Blockierungsschritt eingefügt. Durch die Absättigung der Slide-
Oberfläche mit Psoralen, sollte ein unspezifisches Anbinden des noch freien Psoralen-PEO-
Biotins in der DNA-Lösung, welches durch die Fällung nicht ganz entfernt worden war,
verhindert werden. Wie aus der Tab. 20 zu entnehmen ist, konnte durch die Zugabe von 4
µg/ml Psoralen zur optimierten Prähybridisierungslösung eine weitere Steigerung von 29 %
des S/N-Hintergrund Verhältnisses erreicht werden.
Insgesamt gesehen konnte durch die Optimierung des Prä-, Hybridisierungs- und
Waschpuffers der erhöhte Hintergrund reduziert werden, der bei der Hybridisierung von
genomischer DNA auftrat. Durch die Zugabe von Psoralen, BSA und Milchpulver in den
einzelnen Arbeitsschritten konnte das Signal zu Hintergrund-Verhältnis für die Sonde LldI S1
von 1,2 auf 28,9 und für die Sonde EUB338 von 1,8 auf 30,4 erhöht werden. Das Signal zu
Rausch-Verhältnis konnte im Durchschnitt um 2000 % gesteigert werden Das
Hybridisierungsprotokoll für genomische DNA wurde demnach erfolgreich optimiert.
3.5.2. Hybridisierung von genomischer DNA mit unterschiedlichen
Fragmentlängen
Nach erfolgreicher Optimierung des Hybridisierungsprotokolls für genomische DNA (siehe
3.5.1), wurden die in 3.1.4 anhand von PCR-Produkten dargestellte Abhängigkeit der
Signalintensität von der Fragmentlänge mit der Hybridisierung von genomischer DNA
verifiziert. Wie aus der Abb. 11 zu entnehmen ist, sind mit längeren PCR-Produkten höhere
Signalintensitäten als mit kürzeren zu erreichen. Für die Fragmente von ca. 1000 bp konnten
3. Ergebnisse
70
die stärksten Hybridisierungssignale gemessen werden. Analog dazu wurde genomische DNA
aus der Starterkultur Probat 8/0 extrahiert, für 5, 7.5, 10, 12.5 und 15 min, wie unter 2.8.3
beschrieben, bei 20°C fragmentiert, um Fragmentgrößen für die Hybridisierung von <100,
<500, <750, <1000 und <1500 bp zu erhalten. Die gDNA wurde mit Psoralen-PEO-Biotin wie
unter 2.9.5 markiert und im Anschluss 20 Stunden auf dem DNA-Microarray hybridisiert
(siehe 2.10.8). Die genomische DNA wurde mit validierten rDNA-Sonden aus der FISH,
nachgewiesen (siehe 2.6.4).
Abb. 27. Einfluss der Fragmentlänge auf die Hybridisierung von 10 µg genomischer DNA.
Die Abb. 27 zeigt das Hybridisierungsergebnis für 10 µg Starterkultur Probat 8/0 nach
20stündiger Hybridisierung. Die Signalintensitäten der jeweiligen Sonden beschreiben eine
Gauß-Kurve. Wurde DNA mit einer durchschnittlichen Länge von unter 100 bp hybridisiert,
waren die Signale sehr schwach, da nur sehr wenig Markierungen aufgrund der Länge der
Fragmente eingebaut werden konnten. Für genomische DNA, mit einer Länge unter 1000 bp,
konnten für alle Sonden die stärksten Hybridisierungssignale gemessen werden. Eine weitere
Erhöhung der Fragmentlänge um 500 bp führte hingen zu keiner weiteren Erhöhung der
Signalintensität. Die gemessen Signal der einzelnen Sonden nahmen für größere Fragmente
als 1000 bp sogar wieder ab. Die Signale der etwa 1000 Basenpaaren langen Fragmente,
konnten im Vergleich zu den kleinsten Fragmenten mit unter 100 bp im Durchschnitt um den
Faktor 10 gesteigert werden.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
EUB338 LGCc354 Lla271 Llc68 Lll68
Sonde
Abs
olut
e Si
gnal
inte
nsitä
t
<100 bp<500 bp<750 bp<1000 bp<1500 bp
3. Ergebnisse
71
Auffällig war, dass für alle vier Sonden, EUB338, LGGc354, Llc68 und Lll68, die das gleiche
Zielmolekül binden, unterschiedliche Signalintensitäten gemessen werden konnten. Die
Sonde EUB338, die alle Eubakterien nachweist, zeigte das schwächste Signal, die Sonde
Llc68, die für Lactococcus lactis ssp. cremoris spezifisch ist, das Stärkste. Die Sonde
LGCc354, die alle grampositiven Bakterien mit niedrigen GC-Gehalt detektiert, die Sonde
Lla271, die die Gattung Lactococcus nachweist, und die Sonde Lll68, die Lactococcus lactis
ssp. lactis bindet, zeigten mittlere Signalintensitäten. Die Signalintensität der Negativ-
Kontrolle lag auf der Höhe des Hintergrundes.
Die Abhängigkeit der Signalintensität von den Fragmentlängen konnte für genomische DNA
bestätigt werden. Für die weiteren Versuche wurde daher die genomische DNA in Fragmente
mit einer Länge von unter 1000 Basenpaaren fragmentiert, um ein Equilibrium zwischen der
Signalintensität und der Hybridisierungseffizienz gewährleisten zu können.
3.5.3. Spezifität des Nachweissystems
Die in 3.5.2 erhaltenen Daten für die Hybridisierung von genomischer DNA wurden auf ihre
Spezifität untersucht, da mit den bisherigen Experimenten nicht bewiesen werden konnte, ob
die gesamte Methode spezifisch für den Nachweis von Organismen ist oder ob es sich um
unspezifische Hybridisierungssignale handelte.
Die Spezifität der Methode wurde durch die Hybridisierung von genomischer DNA aus
Reinkulturen der Subspezies Lactococus lactis ssp. lactis und Lactococcus lactis ssp.
cremoris überprüft. Die Hybridisierungssignale von gattungsfremden Bakterien wie Bacillus
cereus, Salmonella choleraesuis LT2 und Pseudomonas fluorescens wurden zur
Untersuchung der Spezifität ebenfalls untersucht. Es wurden die Sonden Llc68, Lll68,
EUB338, LGCc354 und Lla271 für die Analyse verwendet. 10 µg gDNA des jeweiligen
Bakteriums wurden fragmentiert, Psoralen-PEO-Biotin markiert und für je 20 Stunden auf
dem DNA-Microarray hybridisiert (siehe 2.9.5 und 2.10.8).
Da die verwendeten Sonden sowohl rDNA als auch rRNA detektieren können, wurde
weiterhin überprüft, ob es sich bei der nachzuweisenden Nukleinsäure um genomische DNA
oder rRNA handelt. Zu diesem Zweck wurden gleiche Mengen an RNase-behandelter und
nicht RNase-behandelter genomischer DNA hybridisiert.
3. Ergebnisse
72
Abb. 28. Überprüfung der Spezifität für die Hybridisierung von genomischer DNA.
Die Hybridisierung von genomischer DNA aus L.l. ssp lactis auf dem DNA Microarray führte
zu Hybridisierungssignalen für die Sonde EUB338, LGCc354, Lla271 und Lll68. Die Sonde
Llc68, für den Nachweis von L.l. ssp. cremoris, zeigte keine Signalintensitäten (siehe Abb.
28). Im Gegensatz dazu führt die Hybridisierung von genomischer DNA aus L.l. ssp cremoris
zu Signalintensitäten der Sonde EUB338, LGCc354, Lla271 und Llc68. Es konnten keine
Signalintensität für die Sonde Lll68 nachgewiesen werden, die L.l. ssp. lactis detektiert (Abb.
28). Die Hybridisierung von genomischer DNA anderer Gattungen führte zu keinen
Hybridisierungssignalen der Sonden Lla271, Llc68 und Ll68 (Daten nicht dargestellt). Für die
Sonde EUB338 konnten hingen bei allen Hybridisierungen Signale gemessen werden. Bei der
Hybridisierung von Bacillus cereus, bei dem es sich um ein grampositives Bakterium mit
niedrigem GC-Gehalt handelt, konnte zusätzlich ein Hybridisierungssignal für die Sonde
LGCc354 ermittelt werden. Die Spezifität der Methode konnte demnach durch die
Hybridisierung von genomischer DNA aus unterschiedlichen Bakterien gezeigt werden.
Die Hybridisierungsergebnisse von RNase-behandelter und nicht RNase-behandelter
genomischer DNA, zeigten keine nennenswerten Unterschiede (Daten nicht gezeigt). Aus den
experimentellen Daten kann daher entnommen werden, dass es sich bei diesem Nachweis um
genomische DNA handelt und nicht um rRNA Verunreinigungen, die bei der DNA-
Extraktion entstehen können.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
EUB338 LGCc354 Lla271 Llc68 Lll68 Kontrolle
Sonde
Abs
olut
e Si
gnal
inte
nsiti
tät
Lactococcus lactisssp. lactis
Lactococcus lactisssp. cremoris
3. Ergebnisse
73
3.5.4. Nachweisgrenze der rDNA-Gene bei der Hybridisierung von
genomischer DNA
Die Nachweisgrenze der rDNA-Gene, bei der direkten Hybridisierung von genomischer
DNA, wurde durch die Hybridisierung von unterschiedlichen Mengen von genomischer DNA
aus Lactococcus lactis ssp. cremoris bestimmt. Der DNA-Gehalt wurde nach dem
Fragmentieren gemessen und 5, 10 bzw. 15 µg genomische DNA mit Psoralen-PEO-Biotin
markiert. Da eine Konzentrationsbestimmung nach dem Markieren mit dem Photometer nicht
mehr möglich war, wurde der komplett markierte Ansatz auf dem DNA-Microarray
hybridisiert.
Abb. 29. Nachweisgrenze für den direkten Nachweis von genomischer DNA aus L.l. ssp. cremoris auf dem DNA-Microarray.
Wie aus der Abb. 29 zu erkennen ist, zeigten die eingesetzten Mengen von 10 und 15 µg
gDNA bei allen Sonden Hybridisierungssignale. Bei der Hybridisierung von 5 µg
genomischer DNA, konnte für die Sonde EUB338 kein Hybridisierungssignal mehr detektiert
werden. Die restlichen Sonden wiesen bei dieser Menge noch schwache Signale auf. Die
Nachweisgrenze für die Detektion der rDNA-Gene liegt bei ca. 5 µg genomische DNA. Für
die Detektion von Bakterien sollte demnach mindestens 5 µg genomische DNA eingesetzt
werden, um noch Hybridisierungssignale messen zu können.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
EUB338 LGCc354 Lla271 Llc68 Lll68 Kontrolle
Sonde
Abso
lute
Sig
nalin
tens
ititä
t
5 µg 10 µg15 µg
3. Ergebnisse
74
3.5.5. Alternativer Nachweis von Bakterien über rRNA
Zur Überprüfung, ob sich die Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode auch für den
Nachweis von rRNA eignet, wurde RNA aus der Starterkultur Probat 8/0 extrahiert (siehe
2.4). 5 µg RNA wurde mit Psoralen-PEO-Biotin markiert (siehe 2.9.5) und auf dem DNA-
Microarray für 2 Stunden hybridisiert. Im Gegensatz zur Hybridisierung von genomischer
DNA, konnte bei der Hybridisierung von RNA auf die Fragmentierung verzichtet werden, da
native RNA-Moleküle hybridisiert wurden (~ 100-2300 Basenpaaren).
Abb. 30. Hybridisierungsergebnisse von 5 µg Psoralen-PEO-Biotin markierter RNA.
Wie aus der Abb. 30 zu entnehmen ist, führte die Hybridisierung von RNA, zu positiven
Hybridisierungssignalen der 16S und 23S rRNA-Sonden. Für die 23S Sonde Lla271 konnten
die deutlichsten Hybridisierungssignale und für die Sonden EUB338 und Lll68 die
schwächsten Signale gemessen werden. Mittlere Signalintensitäten konnten für die Sonden
Llc68 und LGCc354 detektiert werden. Der Nachweis der wesentlich instabileren mRNA der
Phagenresistenzgene, über die generierten Sonden, gelang aber nicht (Daten nicht gezeigt).
Die Psoralen-PEO-Biotin Markierungsreaktion kann somit ebenfalls für die Markierung von
rRNA verwendet werden und wäre für den Nachweis von Bakterien eine Alternative.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
EUB338 LGCc354 Lla271 Llc68 Lll68
Sonde
Abs
olut
e S
igna
linte
nsitä
t
3. Ergebnisse
75
3.5.6. Direkte Detektion von Phagenresistenzgenen in Starterkulturen
Der Nachweis der Phagenresistenzgene in Starterkulturen, mit vorheriger Amplifikation über
die PCR, konnte in 3.3.4 mit dem DNA-Microarray gezeigt werden. Nach der Etablierung der
Hybridisierung von genomischer DNA auf dem DNA-Microarray (siehe 3.2, 3.4 und 3.5.1)
sollten die Phagenresistenzgene der Gruppe I-III, die zu 98 % Plasmid-codiert vorliegen, ohne
PCR nachgewiesen werden. Hierfür wurden 20 µg der charakterisierten Starterkultur Probat
8/0 (Glöckner, 2002) und 10 bzw. 20 µg der nicht charakterisierten Starterkultur Probat 505
einzeln auf dem DNA-Microarray hybridisiert. Die Hybridisierungen wurden zweimal
wiederholt. Die Starterkulturen wurden wie in 3.3.3 dargestellt auf das Vorhandensein von
Phagenresistenzgenen durch die PCR überprüft, um die Ergebnisse der Microarray-
Hybridisierung validieren zu können. Die PCR-Untersuchung des Phagenresistenzgen-
Spektrums der beiden Starterkulturen ist im Anhang dargestellt (siehe Tab. A1).
Abb. 31. Hybridisierungsergebnis von 20 µg Starterkultur Probat 8/0 auf dem DNA-Microarray mit eingezeichnetem Schwellenwert.
Wie aus Abb. 31 zu erkennen ist, konnten für die Sonden der rDNA-Gene die höchsten
Signalintensitäten gemessen werden. Die Signale schwankten von 500 für die Sonde EUB338
bis 7000 absoluten Signalintensitäten für die Sonde Llc68. Die Sonden der positiv getesteten
Phagenresistenzgene der Gruppe I-III zeigten eher schwache Signale. Lediglich für die
Sonden EpsC S2, LldI S2 und LlaII S2 konnten stärke Signalintensitäten gemessen werden.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
EUB338
LGCc 3
54
Lla271
Llc 68
Lll68
EpsC S1
EpsC S2
LldI S
1
LldI S
2
Lla140
3 S1
Lla140
3 S2
LlaII S
1
LlaII S
2
LlaBII R
S1
LlaBII R
S2
LLaC
I S1
LlaCI S
2
Kontro
lle
Sonde
Abso
lute
Sig
nalin
tens
ität
3. Ergebnisse
76
Die ermittelten Signale für die Sonden der negativ getesteten Phagenresistenzgene lagen in
Höhe der Negativ-Kontrolle (Daten nicht dargestellt). Somit konnten keine falsch-positiven
Hybridisierungssignale gemessen werden.
Zur Absicherung der Hybridisierungsergebnisse für gDNA, wurde ein Schwellenwert
festgelegt. Dieser Schwellenwert betrug das Zweieinhalbfache der höchsten Negativkontrolle
(Sabatti et al., 2002). Nach Abzug dieses Schwellenwertes von den absoluten
Signalintensitäten, in diesem Fall lag der Cut-off bei 325 absoluten Signaintensitätem, zeigten
nur noch die 16S und 23S Sonden, die Sonden EpsC S2 und Lla1403 S2, LldI S1 und S2, die
Sonden LlaBII S1 und S2, und die Sonden LlaII S1 und S2, ein signifikantes Signal. Diese
Ergebnisse stimmen mit den Ergebnisse des Nachweises der Phagenresistenzgene über die
PCR überein (siehe Tab. A1). Die Signale der restlichen Phagenresistenzgen-Sonden lagen
nach der Einführung des Signifikant-Wertes unter dem Schwellenwert. Somit konnten die
Phagenresistenzgene scrFI und llaCI nicht direkt in der Starterkultur Probat 8/0 nachgewiesen
werden.
Abb. 32. Hybridisierungsergebnisse von 10 µg und 20 µg Starterkultur Probat 505 auf dem DNA-Microarray.
Die Ergebnisse der Hybridisierung von 10 und 20 µg genomischer DNA aus der Starterkultur
Probat 505 ist in Abb. 32 dargestellt. Die Sonden für die Detektion der rDNA zeigten
Hybridisierungssignale von minimal 300 bis maximal 7800 absoluten Signalintensitäten. Die
Verhältnisse der Signalintensitäten der rDNA-Sonden untereinander waren für beide
Starterkultur fast identisch (vgl. Abb. 31). Für die Sonde Llc68 konnten die eindeutigsten
Hybridisierungssignale gemessen werden.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
EUB338
LGCc 3
54
Lla271
Llc 68
Lll68
EpcC S1
EpcC S2
LldI S
1
LldI S
2
Lla140
3 S1
Lla140
3 S2
LlaBI R
S1
LlaBI R
S2
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S1
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S2
LlaII S
1
LlaII S
2
Kontro
lle
Sonde
Abs
olut
e Si
gnal
inte
nsitä
t
10 µg20 µg
3. Ergebnisse
77
Hohe Signalintensitäten konnten ebenfalls für die Sonde des Phagenresistenzgens epsC S2 bei
10 µg detektiert werden. Die restlichen Phagenresistenzgene wiesen nur schwache Signale bei
10 µg auf. Die Verdopplung der hybridisierten Menge von 10 µg auf 20 µg an genomischer
DNA zeigte eine Steigerung der Signalintensitäten bei den meisten Sonden von ca. 100 %.
Für die Sonden der Phagenresistenzgene scrFI, llaI, llaCI und llaDII konnten keine
Hybridisierungsereignisse gemessen werden (Daten nicht dargestellt).
Die Schwellenwerte lagen nach deren Berechnung, die das Zweieinhalbfache der höchsten
Negativkontrolle entsprachen, für 10 µg genomische DNA bei 125 und für 20 µg bei 625
absoluten Signalintensitäten. Wie in Abb. 33 zu erkennen ist, konnten nach dem Abzug der
Schwellenwerte für 10 und 20 µg die rDNA-Gene eindeutig nachgewiesen werden. Das
Signal für die Sonde EUB338 war bei 20 µg nicht mehr signifikant. Die Sonden der
Phagenresistenzgene EpsC S1 und EpsC S2, LldI S1 und S2, Lla1403 S2, LlaBI S1 und S2,
LlaBII S1 und S2 lagen über dem Schwellwert für 10 µg. Bei 20 µg genomischer DNA
zeigten nur noch die Sonden EpsC S1 und S2 und die Sonde LldI S2 Signale. Dieses lag an
dem höheren Schwellenwert, da die unspezifischen Bindungen mit der Menge der
hybridisierten DNA zunehmen. Der Hintergrund und die Negativ-Kontrollen erhöhen sich
dementsprechend. Wie an den erhöhten Standartabweichungen zu erkennen ist, stieg damit
auch die Schwankungsbreite der absoluten Signalintensitäten der identischen Sondenspots auf
dem Chip. Somit konnten nur 5 der 11 in der Starterkultur Probat 505 vorhandenen
Phagenresistenzgene mit dem DNA-Microarray direkt nachgewiesen werden (vgl. Tab. A1).
Abb. 33. Hybridisierungsergebnisse für 10 und 20 µg Starterkultur Probat 505 nach Abzug des Schwellenwertes.
0
500
1000
1500
2000
2500
EUB338
LGCc 3
54
Lla271
Llc 68
Lll68
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1
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2
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lle
Sonde
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inte
nsitä
t
10 µg20 µg
3. Ergebnisse
78
3.6. Signalamplifikation
Ein limitierender Faktor für den direkten Nachweis von funktionellen Genen mit dem DNA-
Microarray, ist die zu geringe Anzahl von Gen-Kopien pro Bakterium. Aus diesem Grund
wurden zwei unterschiedliche Strategien zur Signalamplifikation für die DNA-
Chiptechnologie getestet, um funktionelle Gene eindeutiger detektieren zu können: Die
Amplifikation der Ziel-DNA und die Verstärkung eines vorhandenen Signals. Die
Amplifikation des Ziel-DNA sollte durch den Einsatz einer Multiplex-PCR erreicht werden,
die Signalamplifikation durch eine Enzym-Substrat Reaktion auf dem Microarray.
3.6.1. Multiplex-PCR für den Nachweis von Phagenresistenzgenen
Eine Vervielfältigung der Phagenresistenzgene der Gruppe I-III in 28 Uniplex-PCR-
Reaktionen ist für den Einsatz in der Routineanalytik nicht geeignet und wurde daher durch
die Verwendung von vier Primerpaaren in einer Multiplex-PCR vereinfacht (siehe 2.7.3). Für
die Amplifizierung der Phagenresistenzgene in der Multiplex-PCR wurden die in Tab. 17
aufgeführten Primerkombinationen gewählt. Es wurden die Starterkulturen Probat 505 und
Probat 8/0 untersucht. Da bis zu vier Primerpaare in einem Reaktionsansatz verwendet
wurden, war eine Identifizierung der Produkte im 3%igen Agarosegel nicht mehr eindeutig
(siehe Abb. 34), da sich die PCR-Produkte nur um wenige Basenpaare unterschieden. Es
waren keine weiteren unspezifischen Banden zu erkennen. Alle vorhandenen Banden lagen
im Bereich zwischen 385 und 550 Basenpaaren (siehe 2.6.2). Die korrekte Amplifikation, und
somit der Nachweis der Gene in den Starterkulturen, wurde mit dem DNA-Microarray
überprüft. Die Multiplex-PCR Ansätze der Starterkulturen wurden vor der Aufreinigung
vereinigt, mit Psoralen-PEO-Biotin markiert und komplett auf den DNA-Microarray
hybridisiert (siehe 2.7.3).
Abb. 34. Agarose-Gel der Multiplex-PCR Ansätze 1-7 der Starterkultur Probat 505. 1 2 3 4 5 6 7
400 bp
500 bp
Längen-
standard
300 bp
600 bp
MM MM
3. Ergebnisse
79
Das Hybridisierungsergebnis der Multiplex-PCR Ansätze der Starterkultur Probat 505 ist in
Abb. 35 dargestellt. Für die spezifischen Sonden der Phagenresistenzgene der Gruppe I-III
konnten Hybridisierungssignale zwischen 1000 und 53000 absoluten Signalintensitäten
gemessen werden. Die Sonden EpsC S1, EpsC S2, Inj Pip S1, Inj Pip S2, LlaI R S1, Lla1403
S2, LlaCI S1 und LlaDII S1 zeigten schwächere Hybridisierungssignale (siehe Abb. 35). Für
die Sonden LlaKRII S1, LlaKRII S2 und LlaFI S1 konnten keine Hybridisierungssignale
detektiert werden. Diese Gene konnten in der PCR ebenfalls nicht detektiert werden (siehe
Tab. A1). Somit konnten keine falsch-positiven oder falsch-negativen Hybridisierungs-
ereignisse gemessen werden. Im Vergleich zur direkten Hybridisierung von genomischer
DNA der Starterkultur Probat 505, bei der nur 5 Phagenresistenzgene nachgewiesen wurden
(vgl. 3.5.6), konnten durch den Einsatz der Muliplex-PCR mit anschließender Hybridisierung
auf dem DNA-Microarray alle in der Starterkultur vorhandenen Phagenresistenzgene der
Gruppe I-III nachgewiesen werden.
Abb. 35. Hybridisierungsergebnis der Multiplex-PCR Ansätze von Starterkultur Probat 505.
Die Hybridisierung der Multiplex-PCR Ansätze der Starterkultur Probat 8/0 führte ebenfalls
zu positiven Ergebnissen. Wie aus der Abb. 36 zu erkennen ist, konnten Hybridisierungs-
signale zwischen 850 und 47000 absoluten Signalintensitäten gemessen werden. Für die
Sonde LlaDII S1 und LlaDII S2, LlaKRII S1 und LlaKRII S2, Inj-Pip S1 und Inj-Pip S2,
LlaFI S1, LlaBI S1 und LlaBI S2 konnten keine Hybridisierungssignale detektiert werden.
Die Ergebnisse der Multiplex-PCR mit anschließender Hybridisierung stimmten mit den
Ergebnissen der Uniplex-PCR für die Starterkultur Probat 8/0 überein (siehe Tab. A1). Somit
konnten keine falsch-positiven oder falsch-negativen Hybridisierungsereignisse nachgewiesen
1
10
100
1000
10000
100000
LldI S
1
Lla140
3 S2
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1
Inj-P
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3
Lla140
3 S1
Sonde
Ab
solu
te S
ign
ali
nte
nsi
tät
3. Ergebnisse
80
werden. Es konnten alle 7 vorhandenen Phagenresistenzgene detektiert werden, während bei
der direkten Hybridisierung von genomischer DNA nur 5 Gene ermittelt werden konnten.
Abb. 36. Hybridisierungsergebnis der Multiplex-PCR Ansätze von Starterkultur Probat 8/0.
Der Nachweis der Phagenresistenzgene konnte mit der Multiplex-PCR mit anschließender
Hybridisierung auf dem DNA-Microarray demnach im Vergleich zur Uniplex-PCR für beide
Starterkulturen korrekt gezeigt werden (vgl. Tab A1). Die parallele Amplifizierung mit den
eingesetzten Primer-Paaren war spezifisch. Für beide Hybridisierungsergebnisse war
auffällig, dass eine starke Verschiebung der Mengenverhältnisse durch die Multiplex-PCR
detektiert werden konnte. So konnten für die PCR-Produkte eines Multiplex-PCR Ansatzes
auf der einen Seite hohe Signalintensitäten für eine Sonde, auf der anderen Seite aber auch
sehr niedrige Signalintensitäten für eine andere Sonde gemessen werden. Dieses ist
beispielhaft in Abb. 36 anhand des Multiplex-PCR Ansatzes Nr. 7 (LldI, ScrFI M, ScrFI R
und LlaII ) zu erkennen.
Der Vergleich der Hybridisierungsergebnisse zwischen der Uniplex-PCR und der Multiplex-
PCR mit anschließender Hybridisierung zeigten Unterschiede in den Höhen der
Signalintensitäten (siehe 3.3.4). Dieses ist dadurch zu erklären, dass bei der Hybridisierung
des Multiplex-Ansatzes die kompletten Multiplex-PCR Ansätze vereinigt und hybridisiert
wurden (siehe 2.7.3), während bei der Uniplex-PCR nur 2 pmol eingesetzt wurden.
Dementsprechend hoch sind die Signalintensitäten bei der Multiplex Hybridisierung für viele
Sonden. Generelle Aussagen über die Signalverstärkungsrate sind wegen den genannten
Problemen der Multiplex-PCR aber nicht zu treffen.
1
10
100
1000
10000
100000
EpsC
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LlaI R
S1
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1
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LlaBI
R S2
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S1
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LldI S
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Lla14
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2
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ScrF
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1
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S1
Sonde
Ab
solu
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ign
ali
nte
nsi
tät
3. Ergebnisse
81
Da alle Gene erfolgreich in den 7 Multiplex-PCR Ansätzen amplifiziert und mit dem DNA-
Microarray nachgewiesen werden konnten, erweist sich der Einsatz der Multiplex-PCR als
eine sensitive Alternative zur direkten Hybridisierung von genomischer DNA, setzt aber eine
Amplifikation über die PCR voraus und verhindert selbst semi-quantitative Aussagen.
3.6.2. Signalamplifikation durch den Einsatz von TSA
Um funktionelle Gene auch bei geringen Konzentrationen ohne PCR-Amplifikation
nachweisen zu können, wurde die Einsatzfähigkeit der Tyramid Signalamplifikation zur
Steigerung der Sensitivität des DNA-Microarrays getestet. Es wurden je 10 µg genomische
DNA der Starterkultur Probat 505 auf dem DNA-Microarray hybridisiert. Um die
Signalamplifikation messen zu können, wurde eine Hybridisierung ohne Signalamplifikation
mit Streptavidin-Cy5 nachgewiesen und parallel dazu eine zweite Hybridisierung mit
Signalamplifikation unter Verwendung von Streptavidin-HRP und Tyramid-Cy5 durchgeführt
(siehe 2.10.9). Die Ergebnisse der Hybridisierung sind in Abb. 37 und Abb. 38 dargestellt.
Wie aus der Abb. 37 zu erkennen ist, konnten die Signalintensitäten mit Signalamplifikation
um einen Faktor zehn, im Vergleich zu den Signalintensitäten ohne Signalamplifikation,
gesteigert werden.
Abb. 37. Hybridisierungsergebnisse mit und ohne Signalamplifikation.
Für die Sonden EUB338 und Lll68 konnten ohne Signalamplifikation schwache
Signalintensitäten von 425 bzw. 621, mit Signalamplifikation stärkere Signale von 2000 bis
4300 detektiert werden. Die Signalintensität der Sonde LGCc354 erhöhte sich von 1400 auf
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
EUB338 LGCc354 Lla271 Llc68 Lll68
Sonde
Abso
lute
Sig
nalin
tens
ität
STV-Cy5TSA
3. Ergebnisse
82
12000 absolute Signalintensitäten. Für die Sonde Lla271 und Llc68 konnten die höchsten
Signalamplifikationen festgestellt werden. Die Signale erhöhten sich von 6600 auf 37000 für
die Sonde Lla271 bzw. von 12500 auf 60100 für die Sonde Llc68.
Der Nachweis der Phagenresistenzgene war hingegen nicht eindeutig. Es konnten zwar mit
TSA Signale für die Sonden der Phagenresistenzgene der Gruppe I-III detektiert werden, die
Intensitäten lagen aber im Bereich der Negativkontrolle, so dass ein eindeutiger Nachweis
dieser Gene misslang (vgl. Abb. 38).
Abb. 38. Hybridisierungsergebnisse mit und ohne Signalamplifikation.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
EUB338
LGCc 3
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Abs
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nsitä
t
STV-Cy5TSA
4. Diskussion
83
4. Diskussion
Der Einsatz DNA-analytischer Verfahren, wie der PCR und anderen
Amplifizierungstechniken oder auch diversen Hybridisierungstechniken wie Southern-,
Northern- oder anderen Blot-Techniken, haben in den letzten Jahren neue Möglichkeiten
eröffnet, komplexe biologische Fragestellungen beantworten zu können (Keer and Birch,
2003). Aufgrund der zum Teil sehr aufwendigen und kostenintensiven Techniken, hat sich ein
neues Format, die DNA-Microarray Technologie, zu einer der molekularbiologischen
Techniken des letzten Jahrzehnts entwickelt. Sie beruht auf dem Prinzip der reversen
Hybridisierung und stellt ein geeignetes Format für den hochparallelen Nachweis von Genen
dar, deren Anwendbarkeit bisher durch verschiedene methodische Defizite eingeschränkt
wurde (Peplies, 2003). So belegen zwar zahlreiche Beispiele die universelle Einsatzfähigkeit
dieser Nachweistechnik, sind aber aufgrund mangelnder Sensitivität der Methode und
limitierendes Probenmaterial auf eine vorherige Amplifikation mit anschließender
Hybridisierung beschränkt (Freeman et al., 2000). Für einen hohen und kostengünstigen
Probendurchsatz ist dieses methodische Defizit nicht zu vernachlässigen. Daher wurde in der
vorliegenden Arbeit untersucht, ob durch die Steigerung der Sensitivität ein direkter
Nachweis von genomischer DNA, ohne vorherige Amplifikation, mit der DNA-Microarray
Technologie möglich ist. Dieses wurde am Beispiel des direkten Nachweises von Organismen
und Phagenresistenzgenen in der Milch-Analytik überprüft, da bei der biotechnischen
Produktion von Milchprodukten Fehlfermentationen auftreten, die unterschiedliche Ursachen
haben können. Bei der Beantwortung dieser komplexen Fragestellung bietet sich die DNA-
Microarray Technologie an, da sie eine hochparallele und kostengünstige Analyse ermöglicht.
4.1. Parameteranalyse zur Steigerung der Sensitivität auf dem DNA-
Microarray
Eine Steigerung der Sensitivität des DNA-Microarrays, die für einen direkten Nachweis von
genomischer DNA unumgänglich ist, kann durch verschiedene Parameter ermöglicht werden.
Zu diesen Parametern gehören die Art des Nachweissystems (Freeman et al., 2000), die
Konzentrationen der immobilisierten Fängeroligonukleotide (Peterson et al., 2001), die Länge
der eingesetzten Sonden (Relogio et al., 2002) und die Chip-Oberfläche (Pirrung, 2002), die
einen erheblichen Einfluss auf die Sensitivität ausüben. Für den Nachweis der
Hybridisierungsereignisse von genomischer DNA mit spezifischen Sonden auf dem DNA-
4. Diskussion
84
Microarray wurde daher ein markierungsabhängiges Nachweissystem ausgewählt, um die
Sensitivität des Detektionssystems zu maximieren. Es wurde auf eine photochemische
Markierungsreaktion zurückgegriffen, die Psoralen-PEO-Biotin Markierung, da die Kosten
für andere markierungsabhängige Nachweissysteme bei einem hohen Probendurchsatz nicht
zu vernachlässigen sind (Zhang et al., 2001) und eine Steigerung des Fluoreszenzsignals
durch den Einbau mehrerer Reportermoleküle ermöglicht wird (Andras et al., 2001). Die
Anwendbarkeit und die Optimierung der Psoralen-PEO-Biotin Markierungsmethode wurde
anhand eines Modellsystems mit verschiedenen PCR-Produkten auf dem DNA-Microarray
getestet (vgl. Abb. 6). Die PCR-Produkte variierten vom kleinsten Fragment mit 116 bp bis
zum größten Fragment mit 1308 bp, um die Auswirkungen der Länge auf die
Hybridisierungseffizienz und Signalintensität in diesem definierten System austesten zu
können. Die Funktionalität der generierten Sonden wurde im Vorfeld durch die
Hybridisierung von endmarkierten doppelsträngigen und einzelsträngigen PCR-Produkten
überprüft. Alle aufgebrachten Sonden trugen einen 5’-Aminolinker, der mit den aktivierten
Isothiocyanatgruppen an der Microarray-Oberfläche reagiert und so eine überwiegend
definierte Orientierung der immobilisierten Fängeroligonukleotide ermöglicht (Benters et al.,
2002).
Die Hybridisierung von einzelsträngiger DNA resultierte, im Vergleich zur Hybridisierung
von doppelsträngiger DNA, in höheren Signalintensitäten, die aber den Aufwand der
Einzelstrangisolierung nicht rechtfertigten, da auch mit doppelsträngiger DNA detektierbare
Hybridisierungssignale nachgewiesen werden konnten (vgl. Abb. 8 und Abb. 9). Für die
Detektion von genomischer DNA wäre eine Einzelstrangisolierung ohnehin nicht praktikabel,
da ein DNA-Strang zuvor per PCR oder mit enzymatischen Methoden biotinyliert werden
müsste.
Eine empirische Untersuchung, die die Hybridisierungseffizienz unterschiedlich langer
doppel- und einzelsträngiger DNA-Moleküle auf dem DNA-Microarray umfassend
untersucht, ist in der Literatur bisher nicht beschrieben. Guo et al. konnten zwar zeigen, dass
mit einzelsträngigen DNA-Molekülen höhere Signalintensitäten als mit doppelsträngigen
DNA-Molekülen erreicht werden konnte, die Untersuchung war aber auf ein PCR-Produkt
mit 157 bp beschränkt (Guo et al., 1994). Ähnliche Resultate konnte auch Call et al. erlangen.
Die Hybridisierung nach 1-minütiger Denaturierung eines 104 Basenpaaren langen PCR-
Produktes führte im Vergleich zur Hybridisierung eines nativen PCR-Produktes, zu einer
Verdopplung der Signalintensitäten (Call et al., 2001b). Längere Denaturierungsszeiten
ergaben keine weiteren Verbesserungen. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse
4. Diskussion
85
unterstützen daher die aufgeführten Resultate, da mit allen einzelsträngigen Fragmenten, die
unterschiedlich lang waren, mindestens doppelt so hohe Signalintensitäten erreicht werden
konnten. Eine mögliche Erklärung ist darin zu finden, dass zwar beide Ansätze vor der
Hybridisierung denaturiert wurden, der einzelsträngige PCR-Ansatz aber nicht wieder mit
dem Gegenstrang renaturieren konnte, da dieser durch die Einzelstrangisolierung entfernt
wurde. Im Gegensatz dazu kann es bei dem denaturierten doppelsträngigen PCR-Ansatz
wieder zur Renaturierung kommen (Wetmur, 1991). So unterliegt der Ansatz der
Konkurrenzsituation zwischen Renaturierung und Hybridisierung mit den vorhandenen
Sonden, welche sich in niedrigeren Signalintensitäten widerspiegelt. Dieses konnte für alle
Fragmentlängen gezeigt werden (vgl. Abb. 8 und Abb. 9). Durch die Zugabe von „Blocking“-
Oligonukleotiden, die an den komplementären Strang des Ziel-Moleküls binden, kann dieses
Problem gelöst werden. Sie werden in hohen Konzentrationen zur denaturierten
Hybridisierungslösung gegeben. Eine Renaturierung der komplementären Stränge wird so
erschwert, wie Studien von Tao et al. auf dem DNA-Microarray zeigen konnte (Tao et al.,
2003). Je nach Lage der „Blocking“-Oligonukleotide, werden mit dsDNA ähnlich hohe
Hybridisierungssignale ermittelt, wie mit ssDNA. Die Strategie wurde in vorliegendem Arbeit
nicht verfolgt, da für jedes zu untersuchende Ziel-Molekül ein eigenes Paar von „Blocking“-
Oligonukleotiden in jeder Hybridisierung eingesetzt werden müsste.
Betrachtet man die beiden Hybridisierungsansätze, so ist deutlich zu erkennen, dass die
Hybridisierungssignale mit der Länge der Fragmente stark abnehmen (vgl. Abb. 8 und Abb.
9). Die Abnahme ist auf Grund der ausgeprägten Sekundärstrukturen der DNA zu erklären,
die mit der Länge der Fragmente zunehmen und so die Zugänglichkeit der Sonden
einschränken. Die Sekundärstruktur der nachzuweisenden Zielmoleküle wirkt sich daher
massiv limitierend auf die Effizienz der Hybridisierung aus, wie bereits in verschiedenen
Studien gezeigt werden konnte (Mir and Southern, 1999; Southern et al., 1999; Nguyen and
Southern, 2000). Auch selbstkomplementäre Sequenzbereiche der Fängeroligonukleotide
können zu entsprechenden Effekten beitragen (Riccelli et al., 2001). Es wurden aber bisher
keine systematischen Studien, die die Hybridisierungseffizienz unterschiedlicher
Fragmentlängen auf dem DNA-Microarray untersuchen, durchgeführt. Aus den erhaltenen
Daten des Modellsystems wird daher deutlich, dass die Fragmentlänge und die damit
verbundenen Sekundärstrukturen einen erheblichen Einfluss auf die Hybridisierungseffizienz
ausüben können, da für Fragmentlängen über 566 bp schwächere Hybridisierungssignale
detektiert wurden als für kleinere Fragmente. Für die Hybridisierung von endmarkierten PCR-
Produkten, sollte daher die Länge der zu hybridisierenden Fragmente eine Größe von 250 bp
4. Diskussion
86
nicht überschreiten, um starke Hybridisierungssignale detektieren zu können. Die
Größenlimitierung der Fragmente kann durch den Einsatz von „Helfer“-Oligonukleotiden
verringert werden, die gegen die flankierenden Sequenzbereiche einer Sondenbindungstelle
gerichtet sind, um deren Zugänglichkeit zu erhöhen (Fuchs et al., 1998; O'Meara et al., 1998;
Peplies et al., 2003). Deren Einsatz ist jedoch nicht unproblematisch, da zwar eine Steigerung
der Signalintensitäten gemessen werde konnte, gleichzeitig ließen sich aber unter den
Kontrollen der entsprechenden Sonden zusätzliche Signale detektieren (Peplies et al., 2003).
Des Weiteren zeigten sich deutliche Verschiebungen in den Intensitäten und Verhältnissen
aller gemessenen Signale, so dass von einer Reorganisation des Gesamtmoleküls ausgegangen
werden kann, die andere Sondenbindungsstellen einschränkt.
Die Computerunterstützte Vorhersage von Sekundärstrukturen könnte eine andere
Lösungsstrategie sein, die aber nur für die Hybridisierung von PCR-Produkten praktikabel ist,
da die korrekte Berechung der Sekundärstrukturfaltungen von genomischer DNA, bei
mehreren hundert Basenpaar langen Fragmenten, noch immer ein ungelöstes
bioinformatisches Problem darstellt (Dong et al., 2001). Somit kann die Faltung der Ziel-
DNA nur bedingt bei der Hybridisierung von genomischer DNA berücksichtigt werden.
Ein weiterer wichtiger Parameter, der die Sensitivität beeinflusst, ist die Markierung der Ziel-
DNA (Baggerly et al., 2004). Für die direkte Detektion von genomischer DNA, wurde zur
Steigerung der Sensitivität des Nachweissystems, die Psoralen-PEO-Biotin Markierung
etabliert und mit der Endmarkierung verglichen.
Die erfolgreiche Psoralen-PEO-Biotin Markierung der PCR-Produkte für das Modellsystem
ließ sich in einem Streptavidin-Gelshiftassay durch Bildung verschiedener Peaks nachweisen
(vgl. Abb. 10). Welche Aduktstufen die verschiedenen Peaks repräsentieren, konnte bei der
Auswertung des Gelshifts nicht beantwortet werden. Aufgrund der vier Bindungstellen des
Streptavidins, wären hochmolekulare Aggregaten, die aus bis zu vier DNA-Fragmenten und
einem Streptavidin-Molekül bestehen, möglich (Niemeyer et al., 1994). Die Markierung
deutete jedoch, unter den verwendeten Bedingungen, auf eine partielle Markierung der DNA
hin, die noch optimiert wurde.
Die Hybridisierung von Psoralen-PEO-Biotin markierten PCR-Produkten führte im
Modellsystem mit allen Fragmentlängen zu messbaren Hybridisierungssignalen (vgl. Abb.
11). Die Hybridisierungssignale der beiden Sonden nahmen im Gegensatz zur Hybridisierung
von endmarkierten PCR-Produkten mit der Länge des hybridisierten Fragmentes zu, wobei ab
einer Länge von 1077 Basenpaaren in diesem System die Signalintensitäten nicht mehr
gesteigert werden konnten und ein Plateau erreicht wurde. Studien von Wu et al. bestätigen
4. Diskussion
87
diese Ergebnisse, die aber aufgrund von unterschiedlich langen Sonden, gegen die ein PCR-
Produkt hybridisiert wurde, getroffen wurden (Wu et al., 2001). Die Hybridisierungssignale
erreichten ebenfalls bei einer Sondenlänge von ca. 1,2 kb ein Plateau. Die Ursache liegt
wahrscheinlich in der Ausbildung von starken Sekundär- und Tertiärstrukturen der DNA, die
längere DNA-Moleküle in ihrer Hybridisierung einschränken. Die nahezu identischen
Signalintensitäten für die Fragmente 1077 bp und 1308 bp sind durch die Anzahl der
Markierungen und der Hybridisierungseffizienz zu erklären. So trägt das 1308 bp Fragment
zwar mehr Markierungen als das 1077 bp Fragment, die Signalintensität des längeren
Produktes wird aber wiederum durch die eingeschränkte Hybridisierungseffizienz reduziert,
so dass die Signalintensitäten ähnlich hoch sind. Mit steigender Länge der Fragmente müsste
es demnach auch wieder zu einem Abfall der Signalintensitäten kommen. Diese These konnte
in einem späteren Abschnitt dieser Arbeit mit genomischer DNA bestätigt werden (vgl.
Abb. 27).
Die deutlich erhöhten Signalintensitäten bei der Psoralen-PEO-Biotin Markierung im
Vergleich zur Endmarkierung sind aufgrund der höheren Anzahl der Markierungen zu
erklären. Auffällig war, dass für die mittelständige Sonde S2 mit Psoralen-PEO-Biotin
markierten PCR-Produkten höhere Signalintensitäten ermittelt werden konnten, als mit der
endständigen Sonde S1. Für endmarkierte PCR-Produkte konnten hingegen für die Sonde S1
die stärkeren Hybridisierungssignale gemessen werden (vgl. Abb. 12). Dieses Ergebnis kann
darauf hinweisen, dass unterschiedliche Sekundärstrukturen für die Psoralen-PEO-Biotin
markierten und endmarkierten PCR-Produkte vorlagen, die alternative Sondenzugäng-
lichkeiten ermöglichen. Die Markierung der DNA mit Psoralen-PEO-Biotin würde so die
Hybridisierungseffizienz beeinflussen. Hybridisierungsuntersuchungen von Psoralen
markierten DNA-Molekülen, die in flüssiger Phase durchgeführt wurden, können diese These
aber nicht bestätigen (Johnston et al., 1981; Ussery et al., 1992; Bethea et al., 1999; Eichman
et al., 2001). Die Tatsache, dass der Nachweis der Hybridisierung indirekt erfolgte, könnte ein
Grund für die unterschiedlichen Verhaltensweisen der Sonden sein. Durch die zu geringe
Sondenanzahl von zwei Sonden ist diese Annahme aber eher spekulativ, könnte aber durch
die Ausweitung des Sondensatzes im Modellsystem überprüft werden. So könnten z.B. die
PCR-Produkte komplett mit Sonden abgedeckt werden, um generelle Aussagen über den
Einfluss der Markierung bzw. des Nachweissystems auf die Hybridisierungseffizienz zu
treffen.
Durch die Ermittlung des optimalen Verhältnisses zwischen Psoralen-PEO-Biotin und DNA-
Base, wurde die Markierungsreaktion optimiert. Der sigmoide Kurvenverlauf beider Sonden
4. Diskussion
88
erreichte bei einem Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basen Verhältnis von 15:1 eine Sättigung
für die drei untersuchten Fragmentlängen (vgl. Abb. 13 und Abb. 14). Die
Hybridisierungssignale der beiden Sonden konnten durch die Optimierung bis zu einem
Faktor 3 gesteigert werden und so eine Absättigung der DNA-Moleküle mit Psoralen-PEO-
Biotin erreicht werden. Die Messung der Markierungseffizienz erfolgte indirekt, über die
Signalintensität der hybridisierten PCR-Produkte. Eine direkte Messung war aufgrund der
überlappenden Emmissionsspektren von Psoralen-PEO-Biotin und DNA bei 260 nm nicht
möglich. Die Markierungseffizienz von einer Markierung pro 40 DNA-Basen bei einem
Verhältnis von 15:1 konnte aber später durch die Quantifizierung des Biotins und der DNA in
Eichreihen mit unterschiedlichen Farbstoffen, wie SYBR Green und HABA, bestätigt werden
(persönliche Mitteilung Stefan Weiß, AG Blohm). Einbauraten an jeder 20. Base, die von
Zhang et al. in der Biotinylierungsreaktion eines 236-mers ermittelt wurden (Zhang et al.,
2001), konnten mit dem verwendeten Protokoll nicht erreicht werden. Im Unterschied zu den
in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten und den Empfehlungen von Levenson et al.
(Levenson et al., 1990) orientiert sich Zhang jedoch bei der eingesetzten Psoralen-PEO-Biotin
Menge nicht an der Anzahl der eingesetzten Basen, sondern verwendet stets eine
Endkonzentration von 200 µM Psoralen-PEO-Biotin. Levenson hingegen empfiehlt ein
Psoralen-PEO-Biotin zu DNA-Basen Verhältnis von 2:1 und erzielte damit eine mit einer
Markierungsrate von 1 Label pro 40 Basen. Die erreichte Markierungsrate ist daher mit den
Literaturdaten durchaus vergleichbar, könnte aber durch den Einsatz einer stärkeren UV-
Lichtquelle verbessert werden. Ein weiterer Vorteil wäre die Reduzierung des Zeitaufwandes
von 25 Minuten mit der verwendeten Handlampe auf wenige Minuten.
Um eine weitere Steigerung der Signalintensitäten zu ermöglichen, wurde die einzusetzende
Streptavidin-Cy5 Menge variiert. Es wurde eine optimale Konzentration von 800 nM STV-
Cy5 ermittelt (vgl. Abb. 15). Die Abnahme der Signalstärke ab einer Konzentration von 1600
nM STV-Cy5 ist durch die unspezifische Bindung des Streptavidin-Cy5 an die Chip-
Oberfläche zu erklären. Das so erhöhte Hintergrundrauschen wirkte sich negativ auf die
absolute Signalintensität aus und überlagerte ab einer STV-Cy5-Konzentration von 6400 nM
das eigentliche Signal (vgl. Abb. 16). In der Literatur beschriebene Konzentrationen des
Streptavidin-Cy5 zur Detektion von biotinylierten DNA-Molekülen auf dem DNA-
Microarray sind sehr unterschiedlich und variieren je nach eingesetzter Chipoberfläche
zwischen einer 1:5 (Zhang et al., 2001) und einer 1:500 (Ramakrishnan et al., 2002)
Verdünnung. In dieser Arbeit wurde eine 1:20 Verdünnung (800 nM STV-Cy5) für optimale
Signalintensitäten ermittelt. Eine empirische Untersuchung wurde in den aufgeführten
4. Diskussion
89
Arbeiten aber nicht durchgeführt, da sich die eingesetzten Verdünnungen an die vom
Hersteller empfohlenen Werte orientieren, die auf Immunoassays optimiert wurden.
Ein weiterer Parameter, der die Effizienz einer DNA-Microarray Hybridisierung beeinflusst,
ist die Konzentration der immobilisierten Fängeroligonukleotide (Peterson et al., 2001). So ist
anzunehmen, dass mit steigender Sondenkonzentration die Menge an Bindungsstellen für die
Ziel-Moleküle zunimmt und so eine Steigerung der Signalintensität erreicht wird. Die Studien
von Relógio et al. zeigen, dass optimale Signalintensitäten mit Sondenkonzentrationem
zwischen 10 µM und 100 µM zu erreichen sind (Relogio et al., 2002). Die Bindungskapazität
der Sonden auf dem DNA-Microarrays wird durch die Oberflächenchemie beeinflusst, so dass
die Werte untereinander schwanken können (Benters et al., 2001; Taylor et al., 2003). In
dieser Arbeit wurden ausschließlich aktivierte Phenylendiisothiocynat-Objekträger (PDITC)
verwendet (Benters et al., 2001). Wie aus Abb. 17 zu entnehmen ist, nahm die Signalintensität
mit steigender Sondenkonzentration zu und näherte sich der Sättigung bei einer Konzentration
von 10 µM. Die ermittelten Daten korrelieren daher mit den Ergebnissen von Relògio et al.
Höhere Sondenkonzentrationen führten aber, im Gegensatz zu den Untersuchungen von
Benters et al., zu einer schnelleren Sättigung der Signale. Dieses ist aufgrund der
unterschiedlich eingesetzten Nachweissysteme zu erklären, da in der vorliegenden Arbeit der
Nachweis der hybridisierten PCR-Produkte indirekt über die Anbindung eines Streptavidin-
Cy5 Moleküls erfolgte. In der Studie von Benters et al. erfolgte der Nachweis direkt, über ein
gekoppeltes Fluoreszenzmolekül an den Oligonukleotiden. Aufgrund der hohen Dichte der
Sonden, ist anscheinend das Anbinden der 60 kDa großen Streptavidin-Moleküle an die
biotinylierte DNA eingeschränkt, so dass sich Sondenkonzentrationen mit 100 µM mit diesem
Nachweissystem nicht rentieren.
Durch die Optimierung der Fragmentlänge, Psoralen-PEO-Biotin-, der Streptavidin-Cy5- und
der Sonden-Konzentration konnte die Sensitivität des Nachweises von Psoralen-PEO-Biotin
markierten PCR-Produkten, im Vergleich zu endmarkierten PCR-Produkten, um den Faktor
100 gesteigert werden (vgl. Abb. 20). Endmarkierte PCR-Produkte konnten bis zu einer
Konzentration von 1 nM detektiert werden, während Psoralen-PEO-Biotin markierte PCR-
Produkte bis zu einer Konzentration von 10 pM nachgewiesen werden konnten (vgl. Abb. 18
und Abb. 19). Die Sensitivität der Psoralen-PEO-Biotin Markierung ist im Vergleich zu
anderen Markierungsmethoden um den Faktor 10 sensitiver, wie die Studie von Call et al.
zeigte, der eine Detektionsgrenze von nur 114 pM auf dem DNA-Microarray erreichen konnte
(Call et al., 2001a). Le Berre et al. konnte die Nachweisgrenze von 10 pM ebenfalls erreichen,
jedoch nur bei einer Oligo gegen Oligo Hybridisierung (Le Berre et al., 2003).
4. Diskussion
90
Um einen Ausblick für kommende Optimierungsstrategien zu geben, soll an dieser Stelle
noch auf weitere Parameter eingegangen werden, die in dieser Arbeit nicht berücksichtigt
wurden, mit der sich die Nachweisgrenze aber vermutlich auf Attomol-Mengen weiter
reduzieren ließe. So beeinflusst, neben den oben aufgeführten Parametern, auch der Abstand
zwischen der eigentlichen Sondensequenz und der Chipoberfläche, die
Hybridisierungseffizienz. Diese oberflächenvermittelte sterische Hinderung kann durch
Spacer-Moleküle, die zwischen der aktivierten Microarray-Oberfläche und dem
Fängeroligonukleotid eingeführt werden, vermindert werden kann (Southern et al., 1999).
Hierbei handelt es sich idealer Weise um ungeladene, auf Kohlenwasserstoffketten basierende
Verbindungen (Shchepinov et al., 1997). Dabei können auch Oligomere aus identischen
Nukleotiden verwendet werden, mit denen eine lineare Abhängigkeit der Signalintensität von
der Spacer-Länge nachgewiesen wurden (Guo et al., 1994). Eine Sättigung des Signals wurde
aber für verschiedene Sonden mit unterschiedlichen Spacer-Längen erreicht (Peplies et al.,
2003), so dass generell jede Sonde einzeln optimiert werden müsste. Durch den Einsatz von
modifizierten Chip-Oberflächen, konnten sterische Effekte ebenfalls reduziert werden
(Benters et al., 2001). Dendrimer-Slides erhöhen durch ihre vernetzte, baumartige
Oberflächenstruktur den Abstand von der Sonde zur Oberfläche und ermöglichen gleichzeitig
die Immobilisierung höherer Sondenkonzentrationen (Benters et al., 2002; Le Berre et al.,
2003). Die Herstellung derartiger Oberflächen ist aber sehr aufwendig und kostenintensiv,
könnte sich aber für sehr sensitive Anwendungen lohnen.
Auch die Orientierung der Sonde auf dem DNA-Microarray beeinflusst die
Hybridisierungseffizienz durch sterische Hinderungen. So untersuchten Mir und Southern die
Fähigkeit von 5’- und 3’-immobiliserten Sonden, rRNA effektiv zu binden (Mir and Southern,
1999). Die gezielte Invertierung von Fängersonden zu Signalsteigerung führte zwar zu
effektiveren Signalen, eine andere Untersuchung konnte dieses aber nur ansatzweise
bestätigten (Peplies et al., 2003), so dass sich keine generellen Rückschlüsse ableiten ließen.
Ein weiterer Ansatz für die Optimierung von Microarray-Experimenten beruht auf dem
Einsatz von Nukleinsäure-Analoga, wie PNAs (Peptide Nucleic Acids) (Nielsen et al., 1991)
oder LNAs (Locked Nucleid Acids) (Koshkin et al., 1998). Aufgrund ihrer Struktur und ihren
physikalischen Eigenschaften ermöglichen sie eine erhöhte Bindungskapazität mit
Nukleinsäuren und können die Spezifität des Nachweises deutlich steigern (Weiler et al.,
1997; Simeonov and Nikiforov, 2002). Der Einsatz von PNAs ist aber aufgrund der
schlechten Löslichkeit eingeschränkt (Simeonov and Nikiforov, 2002; Brandt et al., 2003).
LNAs dagegen haben mittlerweile ein breites Anwendungsgebiet gefunden (Braasch and
4. Diskussion
91
Corey, 2001; Jacobsen et al., 2002; Tolstrup et al., 2003). Durch die hohen Kosten für die
Synthese dieser Nukleinsäure-Analoga ist deren Einsatz, im Vergleich zu herkömmlichen
Oligonukleotiden, noch nicht konkurrenzfähig. In naher Zukunft wird aber sicherlich die
LNA-Technologie ihren Platz in der DNA-Microarray Technologie einnehmen.
Insgesamt gesehen, weisen diese Optimierungsparameter auf eine komplexe Interaktion zur
Steigerung der Signalintensitäten hin, die es noch weiter zu untersuchen gilt. Durch die
vorliegenden Daten konnte aber schon gezeigt werden, dass ein Equilibrium zwischen der
Hybridisierungseffizienz und der Signalintensität in diesem Modellsystem zwischen 800 –
1000 Basenpaaren erreicht wurde. Dieses Gleichgewicht führte zu einer enormen Steigerung
der Signalintensitäten.
4.2. Sondenauswahlverfahren für den Einsatz auf dem DNA-Microarray
Die größte Schwierigkeit in der Beantwortung biologischer Fragestellungen mit einem DNA-
Microarray besteht in der Notwendigkeit spezifische und einheitliche Sonden für die zu
untersuchende Probe auszuwählen. Hervorgerufen wird dieses Problem durch die parallele
Anwendung von Sonden mit unterschiedlichen Charakteristika, die unter identischen
Bedingungen, bezüglich Temperatur oder Ionenkonzentration, eine korrekte Analyse des
biologischen Probenmaterials ermöglichen müssen. Die Sondenauswahl ist daher ein
entscheidender Prozess in der DNA-Microarray Technologie, der über die Spezifität und
Sensitivität der Analyse entscheidet.
Mittlerweile gibt es eine Vielzahl von kommerziellen Software-Programmen, wie z.B. DNA-
Star, Oligo6, Omega, Jellyfish, ARB etc., die diese Auswahl ermöglichen. Die Spezifität und
Funktionstüchtigkeit der Sonden muss aber bei allen Programmen durch biologische
Experimente validiert werden, da noch nicht alle Hybridisierungsparameter vollständig und
korrekt am Computer simuliert werden können (Matveeva et al., 2003).
Je nach Fragestellung, werden unterschiedlich lange Sonden eingesetzt (Zhou, 2003). Für den
Nachweis von Organismen und Phagenresistenzgenen wurden in dieser Arbeit kurze
Oligonukleotide verwendet, da mit langen DNA-Sonden über 100 bp eine Diskriminierung
von sehr ähnlichen Sequenzen nicht gewährleistet werden kann (Gerhold et al., 1999;
Lipshutz et al., 1999; Call et al., 2001a; Li and Stormo, 2001). Die Spezifität der
Hybridisierung wird aufgrund der kurzen Sequenz erhöht, da einzelne Basen-Fehlpaarungen
das Hybridisierungs-Gleichgewicht stärker beeinflussen als lange Sonden (Guo et al., 1994;
Hacia et al., 1996; Urakawa et al., 2003). Zur Detektion von Bakterien wurden validierte
4. Diskussion
92
rRNA-Sonden aus der FISH, mit denen sich Low-GC, Eubaktieren, Lactococcus und deren
Subspezies abtrennen ließen, eingesetzt (Amann et al., 1990; Beimfohr et al., 1993; Meier et
al., 1999). Die Diskriminierung der beiden Subspezies L.l. ssp. lactis und L.l. ssp. cremoris
war mit den kurzen Sonden auf dem DNA-Microarray möglich (vgl. Abb. 28).
Für die Detektion von Phagenresistenzgenen wurden hingegen eigene Sonden entworfen.
Durch die Sequenzrecherchen in der GenBank am NCBI, konnten spezifische Sonden der
Phagenresistenzgene auf Grundlage der Sequenzinformationen konstruiert werden. Da sich
die größten frei zugänglichen Datenbanken GenBank, DDBJ und EMBL, die die
internationale „Nucleotide Sequence Database Collaboration“ bilden, täglich abgleichen
(Baxevanis, 2003), wurde auf eine Recherche in weiteren Datenbanken verzichtet. Der
einheitliche Schmelzpunkt, der für eine hochparallele Analyse auf dem DNA-Microarray
notwendig ist, wurde durch das Sondenauswahlprogramm Oligo 6 ermittelt und für die
Sondenauswahl der Phagenresistenzgene dementsprechend berücksichtigt. Oligonukleotide
mit Hang zur Bildung von inter- und intramolekularen Wechselwirkungen wurden
ausgeschlossen, um die Hybridisierungseffizienz der Sonden zu erhöhen. Andererseits wurde
bei der Selektion der Oligonukleotide die Sekundärstruktur der Ziel-Moleküle nicht beachtet,
da primär genomische DNA eingesetzt wurde, bei der die korrekte Vorhersage der Struktur
aus den schon genannten Gründen nicht sinnvoll war. In der Regel wird aber bei der
Hybridisierung von PCR-Produkten die Sekundärstrukturstabilität der Ziel-Moleküle bei der
Auswahl der Sonden berücksichtigt (Rouillard et al., 2003; Tolstrup et al., 2003). Fraglich ist,
inwieweit diese Vorhersage mit den nativen Strukturen übereinstimmen. Untersuchungen von
Glavac zeigen, dass die Vorhersage mit dem MFOLD-Faltungsalgorithmus (Zuker, 1989) nur
dann mit experimentellen SSCP-Analysen („single-strand conformation polymorphism“)
korrelieren, wenn relativ kurze DNA Fragmente zwischen 50 und 100 bp zur Berechnung
eingesetzt werden (Smith et al., 2000; Glavac et al., 2002). Dieses Ergebnis unterstützt daher
die in dieser Arbeit gewählte Vorgehensweise.
Die Spezifität der ausgewählten Sonden wird in vielen DNA-Microarray Publikationen durch
eine Datenbankanfrage, unter der Verwendung des BLAST-Algorithmus, abgeglichen (Li and
Stormo, 2001; Li et al., 2002; Rouillard et al., 2003; Tolstrup et al., 2003). Bei BLAST
handelt es sich um einen heuristischen Suchalgorithmus für einen Datenbankvergleich, der
zwar schnell, aber weniger sensitiv arbeitet (Altschul et al., 1990). Da bisher nur eine sehr
geringe Anzahl von Organismen sequenziert und in Datenbanken hinterlegt ist, stellt sich die
Frage, nach der „wirklichen“ Spezifität dieser Datenbankanfrage. Eine Datenbank-Anfrage ist
nur so spezifisch, wie die derzeitigen Datenbestände es ermöglichen. Für die Organismen und
4. Diskussion
93
Phagenresistenzgene, die in der Milchwirtschaft relevant sind, liegen diese Sequenzen
weitestgehend vor (Siezen et al., 2002), so dass die Abfrage der Datenbank durchaus Sinn
machte und für Kontrolle der Spezifität aller ausgewählten Sonden auch durchgeführt wurde.
Für den Nachweis der Phagenresistenzgene mit dem DNA-Microarray wurden insgesamt 2
Sonden für die Inhibition der Phagenadsorption, 2 Sonden für die Injektion der Phagen-DNA,
6 Sonden für den Nachweis des Restriktions- und Modifikationssystems (R&M) Typ I, 18
Sonden für den R&M Typ II und 2 Sonden für den R&M Typ III ausgewählt. Des Weiteren
wurden 36 Sonden für den Nachweis von Genen für die abortive Phageninfektion selektiert.
Die Spezifität und Funktionalität der Sonden wurde experimentell über die Hybridisierung mit
korrespondierenden PCR-Produkten getestet (vgl. Abb. 23 und Abb. 24). Die Ergebnisse der
BLAST-Anfrage für die Sonden konnte bestätigt werden, da Kreuzhybridisierungen der PCR-
Produkte mit den 68 Sonden im Experiment ausblieben. Es gab keine falsch positiven
Hybridisierungssignale.
Für die Hybridisierungssignale der Sonden war aber auffällig, dass trotz äquimolaren Mengen
an PCR-Produkt, die Signalintensitäten untereinander sehr heterogen waren. Die Ursache liegt
in den sehr unterschiedlichen Hybridisierungseffizienzen der PCR-Produkte mit ihren
korrespondierenden Sonden. Dieses Ergebnis ist zwar für die Beantwortung von qualitativen
Fragestellungen zu vernachlässigen, ist aber für quantitative Untersuchungen problematisch,
da in einem idealen Microarray-System die Hybridisierungseffizienz einer Sonde primär von
der Sequenz und der Konzentration des entsprechenden Zielmoleküls abhängig sein sollte
(Peplies, 2003). Wie können diese unterschiedlichen Hybridisierungseffizienzen und die
damit verbundenen Schwankungen in den Signalintensitäten erklärt werden?
Der Parameter Fragmentlänge, der die Hybridisierungseffizienz beeinflusst, kann nicht in
Betracht gezogen werden, da alle PCR-Produkte ungefähr die gleiche Länge besaßen. Ein
möglicher Parameter könnte die Sondenzugänglichkeit im PCR-Produkt sein. So kann
vermutet werden, dass die Sonden, die endständig zum PCR-Produkt binden, einen
effektiveren Zugang zum PCR-Produkt finden, als Sondenbindungsstellen, die mittelständig
sind. Diese These wurde mit den vorliegenden Daten untersucht, indem die
Hybridisierungssignale aller Sonden ausgewertet wurden. Dazu wurde die Sondenposition mit
der Signalintensität verglichen. Die Signalintensitäten und die Sondenpositionen zu den
jeweiligen PCR-Produkten sind in der Tab. 21 zusammengefasst. Die Sondenbindungsstelle
wurde in drei Gruppen eingeteilt:
4. Diskussion
94
Eine Sonde, die in den ersten 50 Basen des PCR-Produktes bindet, wurde als 3’endständig,
die ab der 51. Base bindet, wurde als mittelständig und die in den letzten 50 Basen bindet,
wurde als 5’endständig bezeichnet.
Die Signalintensität der Sonden wurde willkürlich in vier Signalgruppen unterteilt:
Hybridisierungssignale bis 1000 Signaleinheiten wurden als schwache Signale (3), bis 10000
als hohe Signale (2) und bis 650000 als sehr hohe Signale (1), definiert. Sonden, für die kein
Hybridisierungssignal detektiert werden konnte, wurden zur Gruppe (4) zugeordnet.
Sonde Bindungsstelle
im PCR-Produkt Signalgruppe Sonde Bindungsstelle
im PCR-Produkt Signalgruppe
EpsC S1 3’endständig 2 EpsC S2 3’endständig 2
Inj-Pip S1 mittelständig 2 Inj-Pip S2 3’endständig 4
LldI S1 3’endständig 2 LldI S2 mittelständig 1
LldI S3 3’endständig 2 LldI S4 mittelständig 1
Lla1403 S1 mittelständig 2 Lla1403 S2 mittelständig 3
ScrFI M S1 mittelständig 2 ScrFI M S2 mittelständig 2
ScrFI R S1 mittelständig 3 ScrFI R S2 5’endständig 2
LlaI M S1 mittelständig 2 LlaI R S1 mittelständig 3
LlaII S1 mittelständig 2 LlaII S2 mittelständig 2
LlaBI S1 mittelständig 2 LlaBI S2 mittelständig 2
LlaBII S1 3’endständig 3 LlaBII S2 5’endständig 1
LlaCI S1 mittelständig 2 LlaCI S2 mittelständig 2
LlaDII S1 mittelständig 3 LlaDII S2 mittelständig 2
AbiB S1 mittelständig 2 AbiB S2 mittelständig 3
AbiC S1 mittelständig 2 AbiC S2 mittelständig 2
AbiD S1 3’endständig 2 AbiD S2 3’endständig 2
AbiDI S1 mittelständig 1 AbiDI S2 mittelständig 2
AbiE S1 3’endständig 1 AbiE S2 mittelständig 1
AbiG S1 mittelständig 2 AbiG S2 mittelständig 2
AbiH S1 mittelständig 2 AbiH S2 mittelständig 2
AbiL S1 mittelständig 1 AbiL S2 mittelständig 2
AbiM S1 3’endständig 2 AbiM S2 3’endständig 1
AbiN S1 Mittelständig 2 AbiN S2 mittelständig 2
AbiP S1 3’endständig 2 AbiP S2 mittelständig 2
AbiQ S1 Mittelständig 2 AbiQ S2 mittelständig 2
Tab. 21. Zusammenfassung der Hybridisierungssignale.
4. Diskussion
95
Nach diesen Kriterien ergab sich, dass für
• 16 % der Sonden sehr hohe (3’end. 2 Sonden; mittel. 5 Sonden; 5’end. 1 Sonde)
• 70 % der Sonden hohe (3’end. 8 Sonden; mittel. 26 Sonden ; 5’end. 1 Sonde)
• 12 % der Sonden schwache (3’end. 1 Sonde; mittel. 5 Sonden; 5’end. 0)
• 2 % der Sonden keine (3’end 1 Sonde ; mittel. 0 ; 5’end. 0)
Hybridisierungssignale detektiert werden konnten.
Es konnten für 43 Sonden (86 %) hohe bis sehr hohe Signalintensitäten gemessen werden.
62,5 % der Sonden, für die sehr hohe Hybridisierungssignale gemessen wurden, waren
mittelständige Sonden. Die Sonde, für die kein Hybridisierungssignal detektiert werden
konnte, war eine 3’endständige.
Die von Chizhikov et al. aufgestellte These (Chizhikov et al., 2001), dass mittelständige
Sonden eine schlechtere Sondenzugänglichkeit besitzen, kann mit diesen Daten nicht bestätigt
werden. Zur weiteren Überprüfung der These müsste die Auswahl der Sonden aufgrund ihrer
Bindungsstelle getroffen werden, was in dieser Arbeit aber nicht in Betracht gezogen wurde,
da mit den Sonden genomische DNA detektiert werden sollte. So wurden 14 endständige
Sonden mit 36 mittelständigen Sonden verglichen. Fünf der 36 mittelständigen Sonden
zeigten nur schwache Hybridisierungssignale, während es bei den endständigen zwei der 14
Sonden waren.
Der Einfluss der Sondenbindungsstelle auf die Hybridisierungseffizienz konnte mit dem
Sondensatz und den PCR-Produkten demnach nicht schlüssig gezeigt werden. Insgesamt
weisen die vorliegenden Daten auf eine komplexe Interaktion unterschiedlicher Parameter
hin, die es weiter zu untersuchen gilt. Ein einfaches Modell für die Erklärung der
Hybridisierungseffizienz wird sicherlich in naher Zukunft nicht zur Verfügung stehen, da sehr
viele Parameter die Effizienz beeinflussen können. Liegen diese aber vor, könnten die
bioinformatischen Programme zur Sondenauswahl so optimiert werden, das zukünftig auch
quantitative Analysen mit dem DNA-Microarray möglich sein werden.
Mit dem in dieser Arbeit verwendeten Sondenauswahlverfahren konnte gezeigt werden, dass
die methodische Vorgehensweise beim Sondendesign erfolgreich war und qualitative
Analysen möglich sind. Da nur für eine Sonde kein Hybridisierungssignal gemessen werden
konnte, ist die angewandte Strategie zur Sondenauswahl für zukünftige Projekte
dementsprechend verfolgenswert.
4. Diskussion
96
4.3. Paralleler Nachweis von Organismen und Phagenresistenzgenen
4.3.1. Aspekte bei der Hybridisierung von genomischer DNA
Die Untersuchung von komplexem Probenmaterial auf dem DNA-Microarray kann durch die
Hybridisierung von PCR-Produkten, cDNA, rRNA oder genomischer DNA realisiert werden.
Bisher gelang der rDNA-Nachweis von Organismen über gDNA, aufgrund mangelnder
Sensitivität, nur mit vorheriger Amplifikation des Probenmaterials (Call et al., 2001a; Ye et
al., 2001). Dabei wurden Untersuchungen mit Escherichia coli (Gill et al., 2002),
Helicobacter pylori (Salama et al., 2000), Pseudomonas ssp. (Cho and Tiedje, 2001), Listeria
monocytogenes (Borucki et al., 2003) und Mycobacterium tuberculosis (Talaat et al., 2002)
durchgeführt. Für die Analysen wurde die genomische DNA per Nick Translation oder
Random Priming markiert und gleichzeitig amplifiziert. Der direkte Nachweis wird einerseits
durch die Komplexität der Zielmolekülfindung bei der Hybridisierung von Genomen
erschwert und anderseits durch die zu geringe Anzahl von Zielmolekülen beeinträchtigt.
Bevor die Ergebnisse der Hybridisierung von genomischer DNA aus Rein- und
Starterkulturen erörtert und diskutiert werden, soll an dieser Stelle einleitend auf die
theoretische Betrachtung der Hybridisierung von genomischer DNA ohne vorherige
Amplifikation eingegangen werden.
Die Genome der bislang identifizierten und sequenzierten Bakterien variieren vom kleinsten
Genom des Mycoplasma genitalium Bakteriums mit 580 kb (Peterson et al., 1993) bis zum
größten Genom des Bradyrhizobium japonicum Bakteriums mit 9,1 Mb (Kaneko et al., 2002).
Die für die Milchindustrie relevanten Bakterien, wie z.B. Milchsäurebakterien der Spezies
Lactococcus lactis, besitzen ein mittleres Genom von 2.4 Mb (Bolotin et al., 2001). Es stellte
sich die Frage, welche Menge an genomischer DNA in der Hybridisierung eingesetzt werden
müsste, um alle Gene dieser Milchsäurebakterien detektieren zu können?
Durch die Fragmentierung des 2,4 Mb großen Genoms in 1000 bp große Fragmente, entstehen
ca. 2400 Fragmente. Die Nachweisgrenze des DNA-Microarrays lag bei der Markierung von
DNA mit Psoralen-PEO-Biotin bei 1 fmol (siehe 3.2.4). Bei dieser Nachweisgrenze muss
folglich von jedem 1000 bp Fragment mindestens 1 fmol bzw. 660 pg vorhanden sein, um
dieses detektieren zu können. Für die Detektion von allen 2400 Fragmenten wird demnach
mindestens eine Menge von 1,6 µg genomischer DNA benötigt. Der direkte Nachweis aller
chromosomal codierenden Gene des Milchsäurebakteriums auf dem DNA-Microarray sollte
mit dieser DNA-Menge folglich möglich sein. Wie später in diesem Kapitel zu erkennen sein
4. Diskussion
97
wird, stimmt dieser theoretisch errechnete Wert mit dem praktisch gemessen Wert der
Nachweisgrenze größenordnungsmäßig überein.
Der Vorteil bei dem rDNA-Nachweis von Bakterien ist, im Gegensatz zur Detektion von
Plasmid-codierten Genen, das rDNA-Gene mehrfach im Genom vieler Bakterien vorkommen.
So besitzt das Bakterium Lactococcus lactis bis zu 10 Genoperons der rDNA (Bolotin et al.,
2001). Für die Detektion von Plasmid-codierenden Genen ist ein absoluter Wert nicht zu
berechnen, da es sich bei diesen Genen nicht um „housekeeping Genes“ handelt. Das
Vorhandensein und die Anzahl der Plasmide ist in Bakterien variabel und von biologischen
Faktoren abhängig. Die meisten Phagenresistenzgene, die in Lactococcus lactis gefunden
wurden, sind in den untersuchten Starterkulturen nicht vorhanden bzw. sind auf eine
Bakterienpopulation bezogen, nur in wenigen Bakterien zu finden. So wurde das Vorkommen
der 17 in der Starterkultur 8/0 enthaltenen Phagenresistenzgene anhand von Einzelisolaten
quantitativ per PCR-Nachweis untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die Gene für die
Adsorptionsresistenz ads, die beiden Gene für die Restriktionsenzyme des Typs I und das Gen
abiB in mehr als 40 % der untersuchten Isolate nachgewiesen werden konnten (Glöckner,
2002). Die Gene llaII, llaBI, llaDII und abiM spielen mit Prozentsätzen von 15 %, 16 %,
10 % und 7 % eine untergeordnete Rolle. Die restlichen Gene konnten nur in 2-3 % der
Starterkulturisolate nachgewiesen werden. Für den Nachweis der Phagenresistenzgene auf
dem DNA-Microarray stellt dies ein nicht zu unterschätzendes Problem dar. Die hier
aufgestellten theoretischen Überlegungen wurden durch Experimente evaluiert.
4.3.2. Direkter Nachweis von Bakterien aus Reinkulturen
Ein Protokoll, das den direkten Nachweis von genomischer DNA erlaubt, konnte durch die
Zusammensetzung der einzelnen Module erreicht werden. Zu diesen Modulen gehörten die
DNA-Extraktion, die Fragmentierung von gDNA in hybridisierbare Fragmente, die
Markierung mit Psoralen-PEO-Biotin, die Hybridisierung und der Nachweis. Ein ähnliches
Modul-System, das aber auf den Nachweis von rRNA beschränkt war, konnte Bavykin et al.
zur Diskriminierung der Bakterien Escherichia coli, Bacillus subtilis und Bacillus
thuringiensis erfolgreich einsetzen (Bavykin et al., 2001). Zur Fragmentierung der
Nukleinsäure wurde ebenfalls eine chemische Nuklease eingesetzt, die Fragmente zwischen
20 und 100 bp produzierte. Dagegen konnte in dieser Arbeit die Effizienz der Fragmentierung
von genomischer DNA so reproduzierbar optimiert werden, dass durch die Variation der Zeit
4. Diskussion
98
und der Temperatur, die Fragmentgröße der gDNA frei wählbar waren (vgl. Abb. 25 und
Abb. 26).
Das Modellsystem der Fragmentlängen konnte so mit gDNA an fünf verschiedenen Sonden
validiert werden. Das Modellsystem wurde nicht nur bestätigt, sondern konnte auch erweitert
werden, da mit Fragmenten um 1500 bp schwächere Signalintensitäten gemessen wurden
(vgl. Abb. 27). Die Abnahme der Intensität kann durch die fortschreitende Ausbildung von
sekundär bzw. tertiär Struktur der DNA erklärt werden, wodurch die Sondenzugänglichkeit,
wie angenommen, weiter erschwert wurde (siehe 4.1).
Wie zuvor erwähnt, gelang der Nachweis der genomischen DNA bisher nur mit vorheriger
Amplifikation des Probenmaterials. Dabei ermöglichte die Amplifizierung von 1 µg gDNA
mit anschließender Hybridisierung auf dem DNA-Microarray einen Organismennachweis von
24 unterschiedlichen Listeria monocytogenes Stämmen (Borucki et al., 2003) und 12
verschiedener Pseudomonaden (Cho and Tiedje, 2001). Durch die in dieser Arbeit
beschriebenen Optimierungsstrategien (siehe 4.1), konnte die Sensitivität der Analyse
demnach so gesteigert werden, dass die direkte Hybridisierung von genomischer DNA aus der
Starterkultur Probat 8/0 zu positiven Signalen für die rDNA-Sonden führte (vgl. Abb. 27) .
Da mit den ermittelten Daten aber nicht bewiesen werden konnte, ob es sich um eine
spezifische oder unspezifische Hybridisierung handelte, wurde die Spezifität der Methode
durch die Hybridisierung von genomischer DNA aus Reinkulturen der Subspezies Lactococus
lactis ssp. lactis und Lactococcus lactis ssp. cremoris überprüft. Aus den erhaltenen Daten
konnte entnommen werden, dass die Diskriminierung der zwei Subspezies durch die
Hybridisierung von genomischer DNA aus Reinkulturen möglich und eindeutig ist (vgl. Abb.
28). Die Hybridisierung von genomischer DNA aus Reinkulturen anderer Gattungen, wie
Bacillen, Salmonellen und Listerien, führte zu keinen Hybridisierungssignalen der Sonden
Lla271, Llc68 und Lll68 (Daten nicht gezeigt). Die Hybridisierungssignale der genomischen
DNA für die getesteten Reinkulturen waren somit spezifisch und ließen auf ein
funktionsfähiges Protokoll schließen.
Auffällig waren die unterschiedlich starken Hybridisierungssignale für die Sonden EUB338,
LGCc354 und Llc68 bzw. Lll68, obwohl diese das gleiche Ziel-Molekül, die 16S rDNA,
detektierten. So konnte bei der Hybridisierung von genomischer DNA aus Lactococcus lactis
ssp. cremoris für die Sonde Llc68 die höchsten und für die Sonde EUB338 die schwächsten
Hybridisierungssignale detektiert werden. Aus den Daten ist zu erkennen, dass eine
Quantifizierung des Probenmaterials aufgrund der unterschiedlich starken Signalintensitäten
nur schwer möglich ist. Jede Sonde müsste aufgrund ihrer Hybridisierungseffizienz normiert
4. Diskussion
99
werden, wie es schon Ansatzweise in der Arbeit von Cho et al. über eine mitgeführte
Kontroll-Sonde versucht wurde, die parallel zur eigentlichen Sonde mit auf einem Spot
immobilisiert wurde (Cho and Tiedje, 2002). Aufgrund des Quotienten der Referenz-DNA
und der zu untersuchenden Ziel-DNA konnten quantitative Aussagen getroffen werden (Cho
and Tiedje, 2002). Die Quantifizierung war aber nur mit PCR-Produkten möglich. Mit
biologischem Probenmaterial konnten keine Ergebnisse erzielt werden. Die Studie von Cho
verdeutlicht, wie schwierig es ist, komplexes Probenmaterial zu normieren. So lange
sämtliche Parameter, die die Hybridisierungseffizienz beeinflussen, nicht erkannt und
beschrieben sind, können quantitative Aussagen mit biologischem Probenmaterial nicht
getroffen werden. Bestenfalls sind momentan semiquantitative Aussagen möglich (Peplies,
2003).
Die Nachweisgrenze, die für die Milchindustrie ein wichtiges Kriterium für den Einsatz als
zukünftige Methode zur Organismenidentifizierung darstellt, wurde durch die Hybridisierung
von unterschiedlichen Mengen von genomischer DNA aus Lactococcus lactis ssp. cremoris
bestimmt. Die Nachweisgrenze lag in diesem System bei ca. 5 µg genomischer DNA (vgl.
Abb. 29). Da die Konzentrationsbestimmung der DNA nach dem Markieren mit Psoralen-
PEO-Biotin nicht mehr möglich war und somit der gesamte Ansatz auf dem DNA-Microarray
hybridisiert wurde, ist davon auszugehen, dass durch die anschließende Fällung und dem
damit verbundenen Verlust von DNA, eine geringere Menge zum Einsatz kam.
Der theoretisch errechnete Wert von 1,6 µg genomischer DNA stimmt demnach
größenordnungsmäßig ungefähr mit dem experimentell erhaltenen Wert überein. Für ein
Genom von Lactococcus lactis mit 2,4 Mb, welches 5,2*10-15 g wiegt (2,4 Mb dsDNA
entsprechen 1,58 * 109 Dalton), ergibt sich aus 1,6 µg genomische DNA eine Zellzahl von
etwa 108 Bakterien. Da zehn rDNA Genoperons in Lactococcus lactis vorkommen (Bolotin et
al., 2001), ist die Zellzahl um den Faktor zehn geringer. Infolgedessen ergibt sich eine
Zellzahl von ungefähr 107 Bakterienzellen, die in die Hybridisierung eingesetzt werden
müssen, um Hybridisierungssignale detektieren zu können. Diese Zellzahl wäre für die
Detektion potentieller Kontaminanten in Starterkulturen und Milchprodukten unrealistisch,
könnte aber durch eine kurze unspezifische Voranreicherung der Kultur erreicht werden. Die
Methode wäre ohne diese Schritte nicht sensitiv genug, da für PCR-Analysen schon 10
Bakterien ausreichend sind (Call et al., 2003). Da die PCR in der konventionellen
Produktüberwachung aber noch nicht integriert ist, kann sich die DNA-Microarray
Technologie, wenn sich die Sensitivität der Methode weiter steigern ließe, etablieren (siehe
4.3.4). Die DNA-Microarray Technologie stellt daher eine ideale Plattform für die
4. Diskussion
100
Milchindustrie dar, die den hochparallelen und kostengünstigen Nachweis von Bakterien
ermöglicht.
Es sei darauf hingewiesen, dass für die Detektion von pathogenen Bakterien in Starterkulturen
und Milchprodukten der Sondensatz erweitert und praktisch validiert werden muss. Die
vorliegende Arbeit zeigt jedoch jetzt schon das hohe Potential dieser Methode, Bakterien
spezifisch mit dem DNA-Microarray zu detektieren. Der Nachweis erfolgte über Nacht, ohne
vorherige Amplifikation des Probenmaterials und ermöglichte so eine schnelle Analyse. Die
benötigte Zeit für das komplette Protokoll könnte aber auf unter sechs Stunden optimiert
werden, wenn die Hybridisierungszeit auf zwei Stunden verkürzt würde. Die zweistündige
Hybridisierung führte ebenfalls zu spezifischen, aber schwächeren Signalen (Daten nicht
gezeigt). Die Unterscheidung zwischen einer unspezifischen und spezifischen Hybridisierung
kann aber durch kürzere Hybridisierungszeiten erschwert werden, wie die Studie von Dai et
al. belegt (Dai et al., 2002). Die Unterscheidungsschwierigkeit konnte mit den hier ermittelten
Daten nicht bestätigt werden, da eine eindeutige Diskriminierung möglich war. Um generelle
Aussagen über Hybridisierungskinetiken von gDNA treffen zu können, sollte zukünftig der
Sondensatz und das biologische Probenmaterial erweitert werden. Zur weiteren Verkürzung
des Protokolls könnten die Zeit für die Nukleinsäurefällung und das Markieren, durch den
Einsatz von kommerziellen Aufreinigungssäulen und einer starken UV-Lichtquelle, optimiert
werden. Eine hohe Datenanalyse im Laufe von nur wenigen Stunden wäre so zu erreichen.
Eine Unterscheidung, ob sich die detektierten Organismen in einem toten oder lebendigen
Stadium befanden, war mit diesem Sondensatz nicht möglich. Die Frage nach der
Teilungsfähigkeit ist für die milchverarbeitende Industrie von besonderem Interesse, da
ausschließlich teilungsfähige Organismen, sei es in positiver oder bei pathogen Organismen in
negativer Hinsicht, zu einer Veränderung des zu fermentierenden Produktes und damit zu
einem Qualitätsverlust/gewinn führen. Es ist daher für die milchverarbeitende Industrie von
entscheidender Bedeutung, eine zeitsparende Nachweismethode einzusetzen, die es
ermöglicht, lebende und teilungsfähige Organismen von den abgestorbenen, nicht mehr
teilungsfähigen Organismen zu unterscheiden und zu identifizieren.
Zur Identifikation aktiver, teilungsfähiger Organismen könnten sich die intergenetischen
Bereiche (internal transcribed spacer, ITS) des rRNA-Operons eignen, die artspezifisch sind
(Söller et al., 2000; Hassan et al., 2003). Während der Prozessierung der prä-rRNA wird die
ITS zu Nukleotiden abgebaut. Dieser Abbau findet ebenso nach dem Absterben der
Mikroorganismen statt. Da es in den toten Zellen zu keiner Transkription mehr kommt, sind
vier Stunden nach dem Zelltod die „internal transcribed spacer“ auf rRNA-Ebene nicht mehr
4. Diskussion
101
nachzuweisen. Im Gegensatz dazu lassen sich diese Bereiche der rDNA-Gene noch Tage nach
dem Zelltod nachweisen (Schmid et al., 2001). Somit stellt die ITS eine optimale Möglichkeit
zum Spezies-spezifischen Nachweis von lebenden, d.h. teilungsfähigen Organismen dar. Eine
eindeutige Identifizierung der Mikroorganismen anhand der ITS wird ebenfalls ermöglicht
(Gurtler and Stanisich, 1996).
Es wurde daher experimentell überprüft, ob sich die Psoralen-PEO-Biotin
Markierungsmethode, auch für die Markierung und den Nachweis von RNA eignet, die im
Gegensatz zur DNA zwar schneller degradiert, aber auf Grund ihrer Größe, von max. 2,3 kb,
direkt und ohne Fragmentierung in der Hybridisierung eingesetzt werden könnte. Guschin et
al. und andere Arbeitsgruppen konnten bereits zeigen, dass der Nachweis von nitrifizierenden
Bakterien mit dem DNA-Microarray möglich ist (Guschin et al., 1997). Die 16S rRNA wurde
zuvor über PCR amplifiziert und markiert. Andere Studien beschäftigten sich mit dem
Nachweis von Cyano- (Rudi et al., 2000) und sulfatreduzierenden Bakterien (Koizumi et al.,
2002; Loy et al., 2002) in ihrer natürlichen mikrobiellen Gemeinschaft. Darüber hinaus
konnte Wilson et al. aufgrund einer Vielzahl von Sonden verschiedene Organismen mit dem
DNA-Microarray diskriminieren (Wilson et al., 2002). Die aufgeführten Anwendungen waren
aber, wie oben erwähnt, auf PCR-Amplicons beschränkt.
In dieser Arbeit konnte die rRNA aus der Starterkultur Probat 8/0 mit dem DNA-Microarray
ohne Amplifikation nachgewiesen werden (vgl. Abb. 30). Der direkte Nachweis war somit
möglich und wäre eine Alternative zur Hybridisierung von gDNA. Die Identifizierung von
Bakterien, ohne Amplifizierung der rRNA, konnte bereits in Studien gezeigt werde. Dabei
wurden aber sehr unterschiedliche Markierungs- bzw. Nachweisstrategien verfolgt. Der
direkte Nachweis von rRNA konnte durch eine Sandwichhybridisierung mit biotinylierten
Proben (Small et al., 2001) bzw. durch den Einsatz von chemischen Markierungen (Bavykin
et al., 2001; El Fantroussi et al., 2003; Peplies, 2003) ermöglicht werden. Der Nachweis der
ITS könnte mit der kostengünstigen Psoralen-PEO-Biotin Markierung demnach erfolgreich
sein, muss durch ITS spezifische Sonden jedoch erst validiert werden, was nicht Ziel dieser
Arbeit war.
Im Gegensatz zum erfolgreichen Nachweis der rRNA gelang der Nachweis der wesentlich
instabileren mRNA der Phagenresistenzgene, über die ausgewählten Sonden, nicht. Die
Untersuchung des Expressionsmusters der Phagenresistenzgene stellte sich unter den
experimentellen Bedingungen als wesentlich schwieriger heraus, die ohne eine Amplifikation
nicht zu bewerkstelligen war. Um nicht nur das Vorhandensein, sondern auch die Expression
4. Diskussion
102
der Gene zu untersuchen, wird der direkte Nachweis der mRNA zukünftig ein weiteres
wichtiges Ziel sein, um Fermentationen präziser analysieren zu können (Siezen et al., 2002).
4.3.3. Direkter Nachweis von funktionellen Genen aus biologischem
Probematerial
Für den Nachweis von funktionellen Genen liegt im Falle einer direkten Detektion eine
reduzierte Verfügbarkeit der Zielmoleküle vor. Bisher wurde nur der PCR-basierte Nachweis
von Umweltgenen (Wu et al., 2001; Cho and Tiedje, 2002; Taroncher-Oldenburg et al., 2003)
bzw. der cDNA-basierte Nachweis von mRNA (Dennis et al., 2003) beschrieben. Die stark
eingeschränkte Verfügbarkeit der Zielmoleküle wird bei dem Nachweis der
Phagenresistenzgene in Starterkulturen noch erschwert, da die meisten Phagenresistenzgene,
die in Lactococcus lactis gefunden wurden, in den untersuchten Starterkulturen nicht
vorhanden bzw. bezogen auf eine Bakterienpopulation, nur in wenigen Bakterien zu finden
sind (Glöckner, 2002). Dieses konnte durch die experimentellen Daten dieser Arbeit bestätigt
werden.
Die direkte Hybridisierung der genomischen DNA aus der Starterkultur Probat 8/0 führt zu
positiven Hybridisierungssignalen für die rDNA-Sonden. Es konnten die Organismen
Lactococcus lactis ssp. lactis bzw. cremoris nachgewiesen werden. Dass Lactococcus lactis
ssp. cremoris der dominierende Organismus in der Starterkultur Probat 8/0 ist (vgl. Abb. 31),
konnte durch quantitative Untersuchungen mit der FISH bestätigt werden (Glöckner, 2002).
Eine semiquantitative Untersuchung der Organismenzusammensetzung in der Starterkultur
war folglich mit dem DNA-Microarray möglich. Wie Glöckner et al. zeigen konnte, ist die
Verschiebung der Populationszusammensetzung in einer Starterkultur ein möglicher Hinweis
auf eine Fehlfermentation und könnte daher für eine zukünftige Analyse verwendet werden
(Glöckner, 2002). Diese Daten müssen aber erst durch den Einsatz des DNA-Microarrays im
Laboralltag praktisch validiert werden.
Etwas anders verhielt es sich bei dem Nachweis der Phagenresistenzgene. Die in der
Starterkultur Probat 8/0 enthaltenen Gene der Gruppe I-III (siehe Tab. A1) konnten nach der
Festlegung des Schwellenwertes, um unspezifische Hybridisierungen auszuschließen, nicht
vollständig detektiert werden (vgl. Abb. 31). Es konnten 5 der 7 in der Starterkultur Probat
8/0 vorkommenden Phagenresistenzgene nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der
Hybridisierung korrelieren demnach nur teilweise mit denen, die über die PCR erzielt wurden
(siehe Tab. A1).
4. Diskussion
103
Die quantitativen Analysen von Glöckner et al. bestätigen die erwähnten Probleme, der zu
geringen Kopienzahl der Plasmide in der Starterkultur Probat 8/0, die mit dem DNA-
Microarray nicht mehr eindeutig nachzuweisen sind. Die Phagenresistenzgene ads-epsC, lldI
und lla1403, die mit dem DNA-Microarray detektiert werden konnten, kamen in mehr als
40 % Prozent der Einzelisolate der Starterkultur Probat 8/0 vor (Glöckner, 2002).
Die Hybridisierung der nicht quantitativ untersuchten Starterkultur Probat 505, führte zu
ähnlichen Ergebnissen. Auch hier konnte die rDNA eindeutig nachgewiesen werden. Für die
in dieser Starterkultur vorkommenden funktionellen Gene konnten vor der Festlegung des
Schwellenwertes Hybridisierungssignale gemessen werden (vgl. Abb. 32). Die Verdopplung
der hybridisierten Menge von 10 µg auf 20 µg genomischer DNA führte zu einer Steigerung
der Signalintensitäten bei den meisten Sonden um ca. 100 %. Nach Abzug des
Schwellenwertes konnten bei 20 µg genomischer DNA aber nur noch das Phagenresistenzgen
ads-epsC detektiert werden (vgl. Abb. 33). Für 10 µg gDNA konnten noch zusätzlich die
Gene lldI, lla1403, llaBI und llaBII schwach nachgewiesen werden. Die Verdopplung der
eingesetzten Menge an genomischer DNA führte demnach zu keiner Verbesserung der
Hybridisierungssignale, da in diesem Fall die unspezifische Hybridisierung mit den
Kontrollen zunahmen und die Signale damit unter dem Schwellenwert lagen. Es konnten nur
5 der 11 in der Starterkultur Probat 505 vorhandenen Phagenresistenzgene mit dem DNA-
Microarray direkt nachgewiesen werden (vgl. Tab. A1).
Die Sensitivität des DNA-Microarrays ist für den direkten Nachweis von
Phagenresistenzgenen folglich beschränkt und erreicht bei einer unbekannten Kopienzahl der
Plasmide seine Grenzen. Die Nachweisgrenze für Gene, die auf Plasmiden codiert sind, sollte
demzufolge durch die Hybridisierung von gDNA aus Bakterien, die eine genau definierte
Kopienzahl von Plasmiden beinhalten, experimentell bestimmt werden (Nordstrom et al.,
1984). Dieses ist für die Festlegung der Nachweisgrenze von Plasmid-codierten Genen
unumgänglich und müsste ergänzt werden.
Ein möglicher Lösungsansatz für die genannten Probleme, könnte die Isolierung der reinen
Plasmide aus den Bakterien sein, die zu eindeutigeren Signalen führen könnten, da eine
Vorauswahl bzw. Anreicherung der zu untersuchenden Zielmoleküle getroffen werden kann
(Wu et al., 2001). Der Nachteil dieser Vorgehensweise würde aber darin bestehen, dass nur
Gene die auf Plasmiden codiert sind, in diesem Schritt detektiert werden könnten. Somit
würden sich zwei Protokolle, eins für den Nachweis von chromosomal-codierten Genen und
eines für den Nachweis von Plasmid-codierten Genen ergeben. Wie dieser Schritt umgangen
werden kann, wird im folgenden Kapitel erörtert.
4. Diskussion
104
4.3.4. Methodische Aspekte zur Signal- und Targetamplifizierung
Es stehen eine Vielzahl von Methoden der Signal- und Targetamplifizierung für die
Untersuchung von biologischem Probenmaterial zur Verfügung, deren Anwendungen im
Bereich der Microarray-Technologie aber aufgrund methodischer Aspekte eingeschränkt sind
(Schweitzer and Kingsmore, 2001). Daher wurden in dieser Arbeit zwei unterschiedliche
Methoden für die DNA-Chiptechnologie getestet, um funktionelle Gene eindeutiger und
hochparallel detektieren zu können.
Die Multiplex-PCR hatte sich in den letzten Jahren zu einer idealen Ergänzung für die
Microarray-Technologie weiterentwickelt (Call et al., 2001a; Chizhikov et al., 2001). Sie
kombinierte die parallele Vervielfältigung von geringen Proben-Mengen in der Multiplex-
PCR mit der hohen Spezifität des DNA-Microarrays. Der Nachweis von 5 funktionellen
Genen, mit nur 10 fg gDNA-Template und fünf Primerpaaren, war so möglich (Call et al.,
2001a). Wie in Tab. 17 dargestellt, wurde der Nachweis der 28 Phagenresistenzgene der
Gruppe I-III durch die Verwendung von vier Primerpaaren in sieben Multiplex-PCRs
vereinfacht. Mehr als vier Primerpaare in einem Ansatz wurden nicht verwendet, da die
intramolekularen Wechselwirkungen mit der Anzahl der Primer deutlich zunahmen und
unspezifische Produkte entstanden (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse konnten auch in
anderen Multiplex-Experimenten erzielt werden (Elnifro et al., 2000; Labrie and Moineau,
2000; Chizhikov et al., 2001). Eine Identifizierung der Produkte im 3%igen Agarosegel war
aber nicht mehr eindeutig, da sich die PCR-Produkte nur um wenige Basenpaare
unterschieden (siehe Abb. 34). Die Amplifikation und somit der Nachweis der Gene in den
Starterkulturen, wurde mit dem DNA-Microarray überprüft. Die Hybridisierungsergebnisse
der Multiplex-PCR Ansätze der Starterkulturen Probat 505 und Probat 8/0 waren eindeutig
und spezifisch (vgl. Abb. 35 und Abb. 36). Es gab keine falsch-positiven oder falsch-
negativen Hybridisierungsereignisse.
Die in der Sondentestung mit PCR-Produkten nur schwach bzw. gar nicht funktionierenden
Sonden, Lla1403 S2, ScrFI R S1, LlaDII S2 bzw. Inj-Pip S2, zeigten in der Multiplex-
Hybridisierung stärke Signalintensitäten. Eine plausible Erklärung ist darin zu finden, dass bei
der Hybridisierung des Multiplex-Ansatzes die kompletten Multiplex-PCR Ansätze vereinigt
und hybridisiert wurden, während bei der Uniplex-PCR nur max. 2 pmol eingesetzt wurden.
Die Multiplex-Ansätze wurden komplett vereinigt, da ein möglichst einfaches Protokoll für
den Nachweis von Phagenresistenzgenen entwickelt werden sollte. Der Einsatz der
kompletten PCR-Ansätze wirkte sich positiv auf die Signalstärke der Sonden aus, da mehrere
4. Diskussion
105
Zielmoleküle für die Hybridisierung zur Verfügung standen. Die Etablierung der Multiplex-
PCR der Phagenresistenzgene der Gruppe IV, die nur sehr selten in Starterkulturen
vorkommen (siehe Tab. A1), konnte aus zeitlichen Gründen nicht mehr erfolgen und sollte
daher zukünftig noch ergänzt werden.
Da alle Gene erfolgreich in den 7 Multiplex-PCR Ansätzen amplifiziert und mit dem DNA-
Microarray nachgewiesen werden konnten, erwies sich der Einsatz der Multiplex-PCR als
eine sensitive Alternative zur direkten Hybridisierung von genomischer DNA, setzt aber eine
Amplifikation über die PCR voraus, die eigentlich umgangen werden sollte.
Um dennoch den direkten Nachweis von funktionellen Genen auf dem DNA-Microarray,
ohne eine Amplifikation der genomischen DNA, zu ermöglichen, wurde eine
Signalamplifikation auf dem DNA-Microarray etabliert. Diese Signalamplifikation beruhte
auf einer Enzym-Substrat Reaktion, die schon in der FISH eingesetzt wurde, um schwache
Signale zu verstärken (Schönhuber et al., 1999; Speel et al., 1999; Pernthaler et al., 2002). Da
nur das Streptavidin-Cy5 Molekül gegen die Streptavidin-HRP und die Tyramid-Cy5
Moleküle ausgetauscht werden musste, konnte das bestehende Protokoll der Module ohne
größere Schwierigkeiten erweitert werden. Durch den Einsatz der Signalamplifikation
konnten die Signalintensitäten im Vergleich zum Ansatz ohne Signalamplifikation für den
Nachweis der rDNA der Starterkultur Probat 505 um den Faktor 10 gesteigert werden (vgl.
Abb. 37). Der Nachweis der Phagenresistenzgene war hingegen nicht eindeutig. Es konnten
zwar mit TSA Signale für die Sonden der Phagenresistenzgene der Gruppe I-III detektiert
werden, die Intensitäten lagen aber im Bereich der Negativkontrolle, so dass ein eindeutiger
Nachweis der Phagenresistenzgene misslang (vgl. Abb. 38).
Die unspezifische Signalamplifizierung kann sicherlich durch die Optimierung der Methode
ausgeschlossen werden. So steigert z.B. die Erhöhung der Temperatur während der
Waschschritte die spezifische Signalamplifikation, wie es Volante et al. in FISH-
Experimenten zeigen konnte (Volante et al., 2000). Eventuell wird die Optimierung der TSA-
Reaktion auf dem DNA-Microarray aber auch andere Strategien erfordern, die jetzt noch nicht
abzusehen sind. So könnte durch die gleichzeitige Immobilisierung von Proteinen und Sonden
auf einem Spot, die Bindung der Tyramid-Cy5 Moleküle an den DNA-Microarray gesteigert
werden, da Tyramid Moleküle an Proteinreste, wie Tyrosin, binden können (Pernthaler et al.,
2002).
Die in dieser Arbeit vorgestellten Amplifikationstechniken bieten sich daher beide an
funktionelle Gene detektieren zu können. Die TSA-Reaktion auf dem DNA-Microarray wird
aber sicherlich zukünftig der Weg sein, um funktionelle Gene, die nur in sehr geringen
4. Diskussion
106
Mengen vorkommen, direkt nachzuweisen, da eine Target-Amplifizierung umgangen werden
kann.
4.4. Ausblick
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass DNA-Microarrays, die auf der
Anwendung von gerichteten Oligonukleotidsonden basieren, für den spezifischen Nachweis
von Organismen und Phagenresistenzgenen in Starterkulturen eingesetzt werden können. Das
entwickelte kostengünstige Protokoll erlaubte erstmalig eine Organismenanalyse von
Starterkulturen aufgrund der direkten Hybridisierung von genomischer DNA.
Auch andere Anwendungen können von der entwickelten kostengünstigen Methode
profitieren, da sie sich nicht nur auf den Nachweis von Milchsäurebakterien beschränkt,
sondern eine generelle Methode zur Detektion von genomischer DNA darstellt. Betrachtet
man die erzielten Fortschritte bei der Anpassung der Microarray-Technologie an den
komplexen Nachweis von genomischer DNA aus Starterkulturen, zeigt sich, dass dieses
Hybridisierungsformat in den nächsten Jahren für entsprechende Untersuchungen in der
Milchindustrie verfügbar sein wird. Durch eine Steigerung der Sensitivität der Methode, wie
z.B. die in dieser Arbeit noch nicht optimierte Signalamplifikation mit TSA, könnten die
Anforderungen der Milchindustrie, pathogene Organismen in geringen Mengen
nachzuweisen, erfüllt werden. Die Unterscheidung zwischen toten und lebendigen
Mikroorganismen könnte dabei durch den Einsatz von ITS-Sonden gelingen. Durch diese
Verbesserungen kann bei einem ausreichenden Umfang des Sondensatzes eine erhebliche
Verkürzung der zum Teil mehrtägigen Analyse, die mit hohen Lagerkosten verbunden ist,
erreicht werden.
Da der Nachweis von Phagenresistenzgenen nur bei den Genen gelang, die in mehr als 40 %
der untersuchten Starterkulturisolate vorkommen, wird die Optimierung der TSA-Reaktion
auf dem DNA-Microarray ebenfalls dazu beitragen, das komplette Phagenresistenzgen-
Spektrum in Starterkulturen detektieren zu können.
Aber auch ohne diese Veränderungen ist eine Analyse möglich, da die Funktionstüchtigkeit
des DNA-Microarrays in Verbindung mit der Multiplex-PCR in der vorliegenden Arbeit
bereits gezeigt werden konnte. Das Potential des „Milch-Chips“, Fehlfermentationen aufgrund
des vorhandenen Phagenresistenzgen-Spektrums in Starterkulturen zu unterbinden, muss noch
überprüft werden. In der Literatur sind bereits Studien beschrieben, in denen der
Zusammenhang zwischen der Art bzw. der Anzahl der vorhandenen Resistenzgene und dem
4. Diskussion
107
Verlauf der Fermentation untersucht wurden. Der synergistische Effekt bei der Abwehr der
Phagen sk1 und c2 konnte z.B. beim gleichzeitigen Vorkommen der Resistenzplasmide
pNP40 mit den Resistenzgenen abiE und abiF und pBF61, das das Gen für AbiD trägt,
gezeigt werden (McLandsborough et al., 1998). Auch die Kombination mehrerer
Phagenresistenzmechanismen in einer L. lactis-Zelle erhöhte deren Chance sich gegen Phagen
zu verteidigen (O' Sullivan et al., 2001). Während diese Resistenzgene zu verschiedenen
Zeitpunkten der Phageninfektion ansetzen, vermittelt die Kombination der "Abortive
Infection of Phages"-Gene abiG auf dem Plasmid pMU1311 bzw. abiE und abiF auf pNP40
ebenfalls ein breiteres Resistenzspektrum gegen Phagen der c2- und der 936-Spezies, als die
beiden Plasmide alleine (Pillidge et al., 2000). Liegt in der Starterkultur ein breites Spektrum
von Phagenresistenzgenen vor, könnten als Reaktion auf das Auftreten bestimmter
Phagenspezies die jeweils effektivsten Gene zur Abwehr aktiviert werden.
Die Auswahl der Starterkulturen, die ein breites Spektrum von Phagenresistenzgenen
besitzen, kann demnach von großem Vorteil für eine stabile Fermentation sein. Da die Anzahl
der Phagenresistenzgene in den untersuchten Starterkulturen begrenzt ist, könnte ein
konjugativer Gentransfer die Anzahl der Phagenresistenzgene erhöhen. Die meisten
Phagenresistenzgene befinden sich auf Plasmiden, deren konjugativer Transfer zwischen den
verschiedenen Lactococcus-Stämmen ausführlich beschrieben wurde (Neve et al., 1984; Neve
et al., 1987). Der konjugative Gentransfer findet dabei nicht nur zwischen
Starterkulturorganismen der gleichen Spezies sondern auch zwischen nahe verwandten
Spezies wie Lactococcus und Streptococcus (Gasson, 1983; Kleinschmidt et al., 1993) bzw.
zwischen Starterkulturorganismen und für die Starterkultur untypischen Organismen wie B.
subtilis statt (Gasson, 1983; Lorenz and Wackernagel, 1994; Heller et al., 1995; Zenz et al.,
1998). Nach wie vor gilt der konjugative Transfer von natürlich vorkommenden Plasmiden als
die vom Konsumenten am ehesten akzeptierte Art Starterkulturstämme mit multiplen
Phagenresistenzen zu erzeugen (Allison and Klaenhammer, 1998). Die in den letzten Jahren
von der Bevölkerung ablehnende Haltung gegenüber gentechnischen veränderten
Lebensmitteln wird so nicht beeinträchtigt, da durch den konjugativen Gentransfer nur
natürlich vorkommende Starterkulturen in der Fermentation eingesetzt werden (Pridmore et
al., 2000). Die Selektion der Starterkulturen, die über ein breites Phagenresistenzgen-
Spektrum verfügen, kann im Vorfeld über den in dieser Arbeit erstellen „Milch-Chip“
erfolgen. Das hohe Potential der DNA-Microarray Technologie wird daher sicherlich die
Analyse in der Milchindustrie in den nächsten Jahren grundlegend bestimmen und verändern.
5. Zusammenfassung
108
5. Zusammenfassung
Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung zur Einsetzbarkeit der Psoralen-PEO-Biotin
Markierung in der DNA-Microarray Technologie für die Analyse von Starterkulturbakterien
und ihren Phagenresistenzgenen, da bei der biotechnischen Produktion von Milchprodukten
Fehlfermentationen auftreten, die hauptsächlich durch Phagen verursacht werden.
Für die Untersuchung wurden verschiedene molekularbiologische Methoden ausgearbeitet
und optimiert, da die Einsetzbarkeit der DNA-Microarray Technologie in der Industrie durch
verschiedene methodische Defizite bisher eingeschränkt war. Durch die Zusammensetzung
der Methoden, wie der DNA-Extraktion, Fragmentierung, Markierung und Hybridisierung,
konnte ein Protokoll für den direkten Nachweis von genomischer DNA etabliert werden.
Die kostengünstige Psoralen-PEO-Biotin Methode wurde für die Markierung von
genomischer DNA optimiert, da herkömmliche Markierungsverfahren für den Routine-
Einsatz in der Industrie zu kostenintensiv waren. Die Markierungsmethode wurde anhand
eines Modellsystems mit unterschiedlich langen PCR-Produkten optimiert und deren
Signalintensitäten mit denen von endmarkierten PCR-Produkten verglichen. Dabei konnte
gezeigt werden, dass die Fragmentlänge bei PCR-Produkten einen großen Einfluss auf die
Hybridisierungseffizienz hat und die Hybridisierungssignale bei der Endmarkierung
dementsprechend mit der Länge abnehmen. Hingegen kommt es bei der Psoralen-PEO-Biotin
Markierung zu einer Konkurrenzsituation zwischen der sterischen Hinderung und der
Mehrfachmarkierung, so dass die Signalintensitäten bis zu einer Länge von ca. 1 kb
zunahmen und ein Plateau erreicht wurde. Die Sensitivität konnte im Vergleich zur
Endmarkierung durch Optimierung der Parameter um den Faktor 100 gesteigert werden.
Die Ergebnisse des Modellsystems wurden an genomischer DNA validiert, indem genomische
DNA mit einer optimierten chemischen Fragmentierungsmethode, der Fenton-Reaktion, in
unterschiedliche Fragmentgrößen sequenzunabhängig fragmentiert wurde. Die Ergebnisse des
Modellsystems konnte mit genomischer DNA bestätigt werden. Für genomische DNA stellt
sich bei der Psoralen-PEO-Biotin Markierung ein Equilibrium zwischen der Signalintensität
und der Hybridisierungseffizienz ebenfalls bei einer Fragmentlänge von ca. 1 kb ein.
Für den spezifischen Nachweis der 34 Phagenresistenzgene, die in Lactococcus lactis
beschrieben sind, wurden für jedes Gen zwei Sonden mit bioinformatischen Softwarepaketen
ausgewählt, so dass ein Sondensatz von 68 Sonden vorlag. Die Funktionalität der generierten
Sonden wurde experimentell über Psoralen-PEO-Biotin markierte PCR-Produkte auf dem
DNA-Microarray bestimmt. Dabei konnte gezeigt werden, dass alle generierten Sonden
5. Zusammenfassung
109
spezifisch für die PCR-Produkte waren und Kreuzhybridisierungen ausblieben. Der Nachweis
der Phagenresistenzgene durch Hybridisierung von PCR-Produkten auf DNA-Microarrays
war somit erfolgreich. Eine Korrelation zwischen der Lage der Sonde auf dem PCR-Produkt
und der Signalintensität konnte nicht hergestellt werden. So konnten sowohl für
mittelständige als auch für endständige Sonden starke Hybridisierungssignale gemessen
werden. Insgesamt weisen die vorliegenden Daten auf eine komplexe Interaktion
unterschiedlicher Parameter hin, die es weiter zu untersuchen gilt.
Nach erfolgreicher Sondentestung und Optimierung der Teilschritte des Protokolls, konnte in
der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass DNA-Microarrays, die auf der Anwendung von
gerichteten Oligonukleotidsonden basieren, für den spezifischen Nachweis von Organismen
und Phagenresistenzgenen in Starterkulturen eingesetzt werden können. Das entwickelte
kostengünstige Protokoll erlaubte erstmalig eine Organismenanalyse von Starterkulturen
aufgrund der direkten Hybridisierung von genomischer DNA. Der Nachweis von
Phagenresistenzgenen ohne deren Amplifikation, gelang nur bei den Genen, die in mehr als
40 % der untersuchten Starterkulturisolate vorkamen.
Aus diesem Grund wurde das Protokoll um zwei verschiedene Signalamplifikations-
Strategien erweitert, um funktionelle Gene, die nur in geringen Mengen in der Probe
vorkommen, eindeutig zu detektieren. 1.) Durch den Einsatz der Multiplex-PCR konnten alle
Phagenresistenzgene der Gruppe I-III der Starterkulturen Probat 8/0 und Probat 505 spezifisch
mit dem erstellten Sondensatz auf dem DNA-Microarray nachgewiesen werden. 2.) Der
Einsatz der Signalamplifikation mit TSA auf dem DNA-Microarray führte zu einer 10fachen
Verstärkung der Signale für die rDNA-Sonden. Der eindeutige Nachweis der
Phagenresistenzgene gelang aber nicht, da unspezifische Signalamplifikationen nicht
vermieden werden konnten. Durch die Optimierung der TSA-Methode kann der spezifische
Nachweis sicherlich verbessert werden, so dass es zukünftig möglich sein wird, alle
Phagenresistenzgene ohne Amplifikation über die Hybridisierung von genomischer DNA
nachzuweisen.
Betrachtet man die erzielten Fortschritte bei der Anpassung der Microarray-Technologie an
den komplexen Nachweis von genomischer DNA aus Starterkulturen, zeigt sich, dass dieses
Hybridisierungsformat in den nächsten Jahren für entsprechende Untersuchungen in der
Industrie verfügbar sein wird. Durch den in der vorliegenden Arbeit ausgearbeiteten „Milch-
Chips“ wird es zukünftig der Milchindustrie möglich sein, Starterkulturen aufgrund ihrer
Organismenzusammensetzung und ihres Phagenresistenzgen-Spektrums so auszuwählen, dass
sie zu einer stabileren Fermentation beitragen können.
6. Literatur
110
6. Literatur
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7. Anhang
129
7. Anhang
7.1. Ergebnisse der Analyse der Phagenresistenzgene Gen Starterkulturen Quark
Probat 8/0
97
Probat
505
Probat
M4
Probat
M7
Q1 D-NW 206
EWG
Adsorptionsresistenz
ads-EpsC + + + - +
Inhibition der Injektion
inj-pip - + - - +
Restriktion der Phagen-DNA
lldI + + + + +
lla1403 + + + + +
scrFI + + + + -
llaI - + - - +
llaII + + + + +
llaBI - + + + +
llaBII + + + + +
llaCI + + - - +
llaDII - + + + -
llaFI - - - - -
llaKRII - - - - -
Abortive Infektion der Phagen-DNA
abiA - - - - -
abiB + + + + +
abiC + - - - -
abiD - - - + -
abiDI - - - + -
abiE - + - - +
abiF - - - - -
abiG + - - - -
abiH - - - - +
abiI - - - - -
abiK - - - - -
abiL - - - + +
abiM + + + + -
abiN + - - - +
abiP - + + + -
abiQ - - + - -
abiT - - - - -
abiU - - - - -
Tab. A1 Phagenresistenzgene in den untersuchten Starterkulturen und Quarkprobe
7. Anhang
130
7.2. Alignment
Abb. A1 Alignment der 16S rDNA mit eingezeichneter Sondenbindungsstelle Lll68 hellgrün; Llc68 rot; EUB338 orange; LGCc354 dunkelgrün
Danksagung
Abschließend möchte ich einer Reihe von Personen danken, ohne deren Hilfe und Mitwirken diese
Arbeit in der vorliegenden Form nicht hätte entstehen können.
Beginnen möchte ich mit Herrn Prof. Dr. Dietmar Blohm, der mir die Möglichkeit eröffnet hat,
dieses spannende Thema in seiner Arbeitsgruppe zu bearbeiten. Er stand mir in kritischen Situationen
stets diskussionsbereit und helfend zur Seite. Hierfür, und für das große Maß an Freiheit, das er mir
gelassen hat, möchte ich mich herzlich bedanken.
Herrn PD Dr. Bernd Kazmierczak danke ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens.
Frau Dr. Christiane Glöckner hat als meine direkte Betreuerin maßgeblich zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen. Sie hat mir die Möglichkeit gegeben, mich zu entfalten, stand mir aber immer mit
Rat und Tat zur Seite. Ihre Sicht der Dinge hat mir sehr geholfen, niemals das Wesentliche aus den
Augen zu verlieren. Hierfür danke ich Ihr außerordentlich.
Als von unschätzbaren Wert haben sich Stefan Weiß und Chris Würdemann erwiesen. Ihre
wissenschaftlichen Ideen und geistigen Inspirationen haben maßgeblich dazu beigetragen, diese
Arbeit zu vollenden. Ihre freundschaftliche Art und außerordentliche Kollegialität werden mir stets in
Erinnerung bleiben. Vielen Dank „Jungs“.
Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Britta Becker für die wissenschaftliche sowie seelisch-moralische
Unterstützung, insbesondere in der doch recht langwierigen „Endphase“. Herzlichen Dank dafür.
Der gesamten Arbeitsgruppe Biotechnologie und Molekulare Genetik möchte ich für das sehr
angenehme und familiäre Arbeitsklima danken, an das ich mich noch sehr lange erinnern werde.
Unverzichtbar für diese Arbeit war die konstruktive Kritik von Frau Katja Nickolaus beim
Zusammenschreiben. Sie half auch dabei, den Fehlerteufel zu besiegen. Sie machte u.a. aus den
genierten Sonden, die generierten Sonden ☺. Vielen Dank hierfür.
Besonders bedanken möchte ich mich bei meiner Familie und meinen Freunden, insbesondere bei
Thomas Fuchs und Stefanie Meyerdierks, die viel Geduld während der letzten drei Jahre mit mir
hatten. Hierfür danke ich Euch allen außerordentlich.